Вирус инфекционного панкреатического некроза (IPNV) наносит

УДК 578.597.2/5
UDC 578.597.2/5
ВЛИЯНИЕ IPNV НА АКТИВНОСТЬ INFLUENCE OF IPNV ON AST ACTIVITY IN
АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В THE FISH TISSUE CULTURES
ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
РЫБ
М.И.Майстренко, аспірант;
Maystrenko M.I., postgraduate student
Л.П. Драган, кандидат биол. наук;
Dragan L.P., Cand. Biol. Sci.
Ю.П. Рудь, кандидат биол. наук
Rud Y.P., Cand. Biol. Sci.
Институт рыбного хозяйства НААН Institute of Fisheries
Украины
NAAS of Ukraine
dragan_l@ukr.net
Определение
активности
АсАТ
в Determination of AST activity in the tissue
перевиваемых культурах клеток рыб cultures of fishes educed the considerable
выявило
значительное
повышение increase of activity of this enzyme under
активности
этого
фермента
под influence of IPNV as compared to control (not
влиянием IPNV по сравнению с infected cells).
контролем (неинфицированные клетки). On the results of ours experiments the most
По результатам проведенных нами informing test is AST. In the trout farms, in
опытов,
наиболее
информативной view of simplicity of analysis implementation,
является
тест
на
АсАТ.
В the determination of its activity can become an
форелеводческих хозяйствах, ввиду effective express-method of IPNV detections.
простоты
выполнения
анализа,
определение её активности может стать
эффективным
экспресс-методом
выявления IPNV.
Ключевые слова: вирус инфекционного Keywords: virus оf infectious рancreatic necrosis,
панкреатического
aspartataminotransferase, trout
некроза,aспартатаминотрансфераза,
форель
Вирус инфекционного панкреатического некроза (IPNV) наносит
значительный экономический ущерб форелеводческим хозяйствам.
Естественным хозяином вируса IPNV являются лососевые рыбы.
Механизмы
передачи
вирусной
инфекции
вертикальный
и
горизонтальный, переносчики вируса (векторы) не установлены. Вирус
распространен по всему миру, он может вызывать эпизоотии,
результатом которых являются огромные потери в инкубаторах мальков
лососевых
рыб.
Вирус
вызывает
некротические
поражения
поджелудочной железы, а также накапливается в других органах, таких
как печень, почки, гонады, кишечник и мозг при отсутствии некроза.
Взрослые рыбы, инфицированные IPNV, становятся пожизненными
носителями вируса без явных выраженных признаков заболевания [1].
IPNV способен инфицировать разные виды лососевых рыб,
включая такие роды, как Salmo, Salvalinus, Oncorhynchus. Симптомы
заболевания у различных рыб бывают разными. Например, у японского
угря вирус вызывает нефрит, у атлантического менхадена (Brevoortia
tyrannus) - нарушение координации при плавании, мальки рыб Seriola
quinqueradiata страдают от асцита и от значительных черепных
кровоизлияний, вызванных вирусом. У палтуса (Scophthalmus maximus)
IPNV вызывает некроз гематопоэтической системы, почечный некроз и
высокую смертность. Многие виды рыб являются бессимптомными
носителями этого вируса [2].
Биологические свойства IPNV, особенно его влияние на
ферментативные процессы в инфицированных клетках рыб, изучены
недостаточно. Поэтому целью настоящей работы было изучение
влияния этого вируса на активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ)
в перевиваемых клетках рыб. Известно, что активность этого фермента
служит одним из показателей поражения печени как у людей, так и у
животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
При работе in vitro с вирусом инфекционного панкреатического
некроза использовали культуры клеток RTG2 (trout rainbow gonad tissue)
- культура получена из ткани гонад радужной форели, культивируется
при температуре 4-24°C. Эта культура перевиваемых клеток рыб
является высокочувствительной к инфицированию IPNV. Клетки
культивировали на питательной среде MEM с 10% - ной
инактивированной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) с
добавлением антибиотика гентамицина (80 мкг/см 3). Клетки
выращивали в виде монослойных культур в пластиковых флаконах при
температуре 22 ° C с интервалом субкультивирования 6-7 дней. Перед
внесением вируса сливали питательную среду, а монослой клеток
промывали раствором Хэнкса для удаления остатков сыворотки.
Инкубацию с вирусом проводили в течение двух часов при комнатной
температуре. Затем вирус сливали, а клетки дважды промывали
раствором Хэнкса и добавляли питательную среду, содержащую
2% ЭТС. Проводили ежедневную проверку состояния опытных и
контрольных флаконов с целью выявления наличия или отсутствия
цитопатического действия (ЦПД) IPNV на клетки. Состояние культуры
клеток изучали под микроскопом по морфологическим признакам [3].
Вирус. IPNV был изолирован нами от радужной форели
Oncorhynchus mykiss из реки Сирет Черновицкой области [4].
Определение активности фермента. Активность АсАТ
определяли общепринятым колориметрическим методом Райтмана и
Френкеля [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Культуры клеток RTG2 оценивали каждые 24 часа. Уже на третий
день после инфицирования вирусом наблюдались характерные
изменения в монослое. На пятый день после инфицирования в опытных
флаконах наблюдалось классическое цитопатическое действие вируса
на культуру клеток: морфологическое изменение клеток (вакуолизация
цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Большая
часть клеток отслаивалась от поверхности флакона и свободно плавала
в среде, в результате этого процесса вместо сплошного клеточного
монослоя оставались лишь единичные клеточные островки. Флаконы с
культурой клеток, зараженных IPNV, ежесуточно сравнивали с
контрольными незараженными флаконами с одинаковым пассажем
культур.
Определение активности АсАТ в перевиваемых клетках рыб
выявило значительное повышение активности этого фермента под
влиянием IPNV по сравнению с контролем (неинфицированные клетки).
Так, уже на вторые сутки после инфицирования клеток вирусом IPNV
наблюдалось повышение активности АсАТ с 9,24 Ед/л до
18,48 Ед/л (рис).
Рисунок 1 — Активность аспартатаминотрансферазы в перевиваемых
клетках форели, инфицированных вирусом панкреотического некроза
На седьмой день после инфицирования активность АсАТ
достигала 106,31 Ед/л, т.е. более чем в одиннадцать раз по сравнению с
контролем. Активность этого фермента в неинфицированных клетках
практически не изменялась. Активность другого индикаторного для
оценки
функционального
состояния
печени
фермента,
аланинаминотрансферазы (АлАТ), в перевиваемых клетках рыб была
очень низкой, что не позволяло сделать выводы о её роли в процессе
репродукции IPNV.
Известно, что АсАТ является представителем класса трансаминаз
и катализирует перенос аминной группы с молекулы глутаминовой
кислоты. Этот фермент претерпевает значительные изменения при
различных поражениях печени, в том числе и при вирусных. Например,
при вирусных гепатитах активность АсАТ увеличивается до 30 раз [6]. В
медицине
определение
ее
активности
квалифицируется
как
«печеночный тест». Печень рыб, как центральный орган метаболизма,
характеризуется высокой интенсивностью процессов обмена. Она
раньше других органов реагирует на действие внешних и внутренних
неблагоприятных факторов, что отражается на ее функциональном
состоянии. Наряду с активными реакциями биосинтеза и катаболизма,
необходимо также отметить и постоянно протекающие в печени
активные процессы обезвреживания и биоаккумуляции широкого ряда
ксенобиотиков, в том числе и вирусов [7]. Для оценки физиологобиохимического статуса рыб и среды их обитания в качестве
индикаторов
может
быть
использован
тест
на
активность
аминотрансфераз. В этом отношении, по результатам проведенных
нами
опытов,
наиболее
информативной
является
аспартатаминотрансфераза (АсАТ). Ввиду простоты выполнения
анализа, определение её активности может стать эффективным
экспресс-методом выявления IPNV в форелеводческих хозяйствах
ЛИТЕРАТУРА:
1. Анализы. Полный справочник /под ред. М. Б. Герасиной. -М. :Изд-во Эксмо, 2006. – 768с.
2. Майстренко, М.И. Биологические свойства бирнавирусов /М.И. Майстренко // Научные Записки
ТНПУ.2013.№4.С.5-8.
1. Livingstone, D.R. Contaminant-stimulated reactive oxygen species production and oxidative damage in
aquatic organisms / D.R. Livingstone // Mar. Pollut. Bull. – 2001. – 42, № 8. – P. 656 – 666.
2. Reed, L. A simple method of estimating fifty percent endpoints / L. Reed, H. Muench // The American
journal of clinical hypnosis. – 1938. – V. 27. – P. 493-497.
3. Rodriguez, Saint-Jean S., Infectious pancreatic necrosis virus: biology, pathogenesis, and diagnostic
methods / S.S. Rodriguez, J.J. Borrego, S.I. Perez-Prieto // Adv. Virus Res. - 2003. – P. 113–165.
4. Rud, Yu., Detection of IPNV in the western Ukraine / Yu Rud, L.P. Buchatski // AQUA 2012, Prague,
Czech Republic, September 1- 5, 2012. Abstract book. P. 166.
5. Shulman, G.E., The Biochemical Ecology of marine Fishes.-Advances in Marine / G.E. Shulman, R.M.
Love // Biology. 1999, -San Diego.Acan.Press, p 36-351.