Оптимизация технологической схемы получения препаратов

УДК 615.37.547
ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ
ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
ДЛЯ ВНУТРИМЫШЕЧНОГО ВВЕДЕНИЯ
Т.Б. Змачинская, В.В. Анастасиев
Нижегородское государственное предприятие бактерийных препаратов,
Нижегородский госуниверситет
Изменение условий классического спиртового метода фракционирования на стадии отделения IgG от β-глобулинов (стадия Б) и введение дополнительной очистки от высокомолекулярных и денатурированных белков позволило получить высокоочищенный препарат иммуноглобулина для
внутримышечного введения (ИГВМ) стабильного молекулярного состава,
не содержащий нежелательных белковых примесей, агрегированных молекул, а также примесей протеолитических ферментов. Исследовано действие натрия хлорида в составе препаратов иммуноглобулинов (ИГ). Использование натрия хлорида снижает стабильность препаратов ИГ при хранении.
Факторами реактогенности препаратов ИГ является наличие в препаратах специфических агрегатов, некоторых белков и биологически активных примесей.
Встречаются анафилактические реакции у больных с дефицитом IgA; образуются
анти-IgA-антитела против примесей этого белка в препаратах ИГ (Burks, Sampson,
Buckley, 1986). Дефицит IgA встречается приблизительно у 1 из 500 человек
(Кнутсен, Фишер, 2000). Агрегатам и димерам ИГ приписываются антикомплементарная активность (АКА), иммуногенность, антигенность, реактогенность и
другие побочные реакции (Barandun, Isliker, 1986). Агрегация ИГ приводит также
к снижению титров антител. Имеются данные о существовании гексамерных молекул IgM, которые в 15–20 раз более эффективно активируют систему комплемента (Brewer, Randall, Parkhouse, 1994). Под влиянием следов протеиназ происходит фрагментация IgG, приводящая к потере титров антител.
Существует несколько технологических схем выделения ИГ из плазмы крови
спиртовым методом (Cohn, Strong, Hughes, 1946; Oncley, Melin, Richert, 1949; Kistler, Nitschman, 1962). Существовавшая технологическая схема этанольного метода, применяемая на Нижегородском предприятии бак. препаратов, не обеспечивала получения высокоочищенного дезагрегированного препарата. ИГ содержал
до 5% полимеров, около 3% белковых примесей, примеси протеолитических ферментов, оказывающих влияние на стабильность ИГ при хранении. Поэтому необходимо было найти способы снижения содержания нежелательных примесей, повышения стабильности препарата. Это было достигнуто изменением некоторых
стадий спиртового метода фракционирования плазмы крови.
Изучение белкового и молекулярного состава по стадиям фракционирования
показало, что для получения очищенных препаратов ИГ необходимо внести изменения на стадии Б спиртового фракционирования (отделение IgG от β-глобулинов) и ввести дополнительную очистку от высокомолекулярных белков (рис. 1).
70
Оптимальная чистота препарата была достигнута при отделении комплексообразующих белков, IgA, IgM при рН 5.4, ионной силе 0.01, Т= –6°С, концентрации
этанола, равной 17%. При более низких значениях рН обнаруживались следовые
количества других белков, при более высоких значениях — снижался выход IgG.
Существовавшая технология приготовления ИГВМ предусматривала растворение
пасты в 0.9%-ном растворе NaCl, удаление остаточного этанола ультрафильтрацией, хранение препарата при нейтральном рН в изотоническом растворе в присутствии глицина. Без дополнительной очистки при физиологическом pH IgG самоассоциируется, становится термонестабильным (McCue, Johnson, 1986) и при
образовании агрегатов активирует систему комплемента. Поэтому была введена
дополнительная очистка на стадии пасты ИГ, основанная на низкой растворимости высокомолекулярных и денатурированных белков в водных растворах с низкой ионной силой. Пасту ИГ растворяли в водном растворе с ионной силой 0.01–
0.05, рН 6.8–7.2. Нерастворившиеся белки после выстаивания отделяли от раствора ИГ фильтрацией.
Рис. 1. Получение высокоочищенного препарата ИГВМ
Содержание примесей протеолитических ферментов в препаратах ИГ зависит
от значения рН, при котором осаждается IgM из γ-глобулиновой фракции (Painter,
Minta, 1969). Осаждение IgM на стадии Б при значении pH выше или ниже 5.4
приводит к существенным уровням активности протеолитических ферментов,
влияющих на стабильность IgG при хранении. Было проведено изучение изменения молекулярного состава препаратов ИГВМ в процессе хранения (рис. 2).
Без изменения условий фракционирования препараты ИГ обнаруживали повышенную фрагментацию из-за контаминации протеолитическими ферментами
— содержание фрагментированных молекул в процессе хранения значительно
71
увеличилось — на 12.9% (с (3.6±1.6)% до (16.5±2.9)%). При изменении условий
проведения стадии Б спиртового фракционирования происходило незначительное
повышение содержания фрагментов IgG в процессе хранения (на 5.0%) — с
(0.8±0.1)% до (5.8±0.7)%.
% 18
15
12
После получения
Через 1 год 3 мес.
9
6
3
0
Без изменения условий
фракционирования
С изменением условий
фракционирования
Рис. 2. Изменение содержания фрагментов IgG в процессе хранения ИГВМ
Изменение параметров фракционирования и введение дополнительной очистки позволило снизить содержание IgА с 2.3 мг/мл до 0.41 мг/мл, т.е. в 5.6 раза;
IgМ — с 0.72 мг/мл до 0.2 мг/мл (в 3.6 раза).
В процессе фракционирования плазмы крови спиртовым методом имеют место
изменения структуры ИГ. Конечный продукт содержит агрегированные молекулы, имеет высокую АКА. Изменение технологии получения ИГ позволило значительно снизить содержание агрегированных молекул — в 9.8 раза (с (5.9±0.7)% до
(0.60±0.08)%). В половине исследованных серий установлено отсутствие связывания комплемента, в остальных сериях АКА колебалась от 0.17 до 0.74 СН50/мг
(0.13±0.04). В препаратах ИГ, полученных без изменений условий фракционирования, АКА составляла (1.9±0.5) СН50/мг.
Для стабилизации и создания изотонии в препаратах ИГ используют различные вещества: натрия хлорид, углеводы, глицин и др. Имеются данные о том, что
использование натрия хлорида в составе препаратов ИГ может приводить к агрегации, термонестабильности, потере титров антител (Oncley, Enders, Janeway,
1945). Для стабилизации ИГВМ мы использовали глицин с конечной концентрацией 0.3 М без добавления натрия хлорида. Было исследовано изменение молекулярного состава препаратов ИГВМ в процессе хранения, стабилизированных
0.3 М глицином+0.9% NaCl и только 0.3 М глицином. При использовании в качестве стабилизатора только 0.3 М глицина не происходило изменения в содержании фрагментированных молекул в процессе хранения; при стабилизации ИГ
0.3 М глицином+0,9% NaCl происходило увеличение количества фрагментированных молекул на 3.6% (рис. 3).
Таким образом, изменение технологии классического спиртового метода
фракционирования плазмы крови человека и введение дополнительной очистки
позволило получить высокоочищенный препарат ИГВМ стабильного молекулярного состава, не содержащий нежелательных белковых примесей, агрегированных
72
молекул, а также примесей протеолитических ферментов. Кроме того, выделенный осадок ИГ может служить основой для получения ИГВМ.
%4
3,9
2,8
3
2,7
2
1
0
0,3
ИГ+0.3 М глицин
После
получения
Через 5 мес.
ИГ+0.3 М глицин+
0.9%NaCl
Рис. 3. Изменение содержания фрагментированных молекул
в препаратах ИГ в процессе хранения в зависимости от способа стабилизации
ЛИТЕРАТУРА
Burks A.W., Sampson H.A., Buckley R.H. Anaphilactic reactions after gamma globulin
administration in patients with hypogammaglobulinemia // N. Engl. J. Med. 1986. V. 314. Р. 560–
564.
Кнутсен А., Фишер Т. Первичные иммунодефициты // Клиническая иммунология /
Под ред. Г. Лорор, Т. Фишер. М.: Практика, 2000. С. 542–581.
Barandun S., Isliker H. Development of immunoglobulin preparations for intravenous use //
Vox. Sang. 1986. V. 51. P. 157–160.
Brewer J., Randall R., Parkhouse R. IgM hexamers? // Immunol. Today. 1994. V. 15.
P. 165.
Cohn E., Strong L., Hughes W. Fractionation of proteins from plasma // J. Amer. Chem.
Soc. 1946. V. 68. P.459.
Oncley J., Melin M., Richert D. The separation of the antibodies // J. Amer. Chem. Soc.
1949. V. 71. P.541–550.
Kistler P., Nitschman H. Production of proteins from plasma // Vox. Sang. 1962. V. 7. P.414
– 424.
McCue J., Johnson A. Noncomparability among IgG products // Transfusion. 1986. V. 26.
P.489–450.
Painter R., Minta J. Stability of Immune serum globulin during storage: Effects of modifications of the fractionations scheme // Vox. Sang. 1969. V. 17. P.434–444.
Oncley J., Enders J., Janeway C. // A memorandum to the U.S. Navy Department of
Medicine and Surgery. 1945. P.123–124.
73