Фенотип и дифференцировка стволовых клеток амниотической
реклама
На правах рукописи ДАВЫДОВА ДАРЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА ФЕНОТИП И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO Специальность 03.03.05 – биология развития, эмбриология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научный руководитель: доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Григорян Элеонора Норайровна доктор биологических наук Мелехова Ольга Петровна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН Защита состоится 1 февраля 2012 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д.26 Сайт: http://idbras.comcor.ru e-mail: [email protected] C диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Автореферат разослан 23 декабря 2011 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук [email protected] Е.Б. Абрамова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Всестороннее исследование биологии стволовых клеток (СК) представляет большой интерес как для решения фундаментальных проблем биологии развития, таких как детерминация и дифференцировка, так и в связи с перспективами применения СК в регенеративной медицине. В настоящее время СК выделены практически из всех тканей взрослого организма, из эмбрионов и плодов, а также из внезародышевых тканей (Guillot et al., 2006; Mosna et al., 2010). К последним относятся и СК из амниотической жидкости (АЖ). Эти клетки способны к длительной пролиферации in vitro и дифференцировке в производные трех зародышевых листков. В отличие от других клеток из экстраэмбриональных структур, например, плаценты или пуповины, которые становятся доступны только после родов, СК АЖ получают в середине беременности (16-23 нед) в ходе амниоцентеза, проводимого для пренатальной диагностики. Эта процедура безопасна для матери и плода. Таким образом, исследование выделенных из АЖ клеток не сопряжено с этическими проблемами, которые неизбежно возникают при работе с эмбриональными СК (ЭСК) человека. При этом попадают СК в АЖ на самых ранних стадиях эмбриогенеза, т.е. эти клетки могут обладать более примитивным статусом, чем СК из плаценты, пуповины, пуповинной крови или дифференцированных тканей взрослого организма. Обнаружены СК АЖ были недавно и сейчас активно изучаются (In ‘t Anker et al., 2003; De Coppi et al., 2007а). В настоящее время получено множество данных относительно иммунофенотипа и потенций этих клеток к дифференцировке. Тем не менее, многие из этих данных противоречивы и однозначного определения, к какому типу клеток относить СК АЖ, пока нет. Целью исследования было изучение фенотипических свойств и дифференцировки стволовых клеток амниотической жидкости человека в условиях in vitro. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Получить культуры стволовых клеток из амниотической жидкости человека второго триместра беременности; 2. Охарактеризовать профиль экспрессии маркеров мезенхимных, нейральных и эпителиальных клеток, а также маркеров плюрипотентности в выделенных клетках; 3. Провести клональный анализ и определить степень гетерогенности популяции клеток из амниотической жидкости; 1 4. Оценить потенции стволовых клеток амниотической жидкости к дифференцировке в разные типы специализированных клеток; 5. Изучить поведение стволовых клеток амниотической жидкости в трехмерном матриксе и оценить их морфогенетический потенциал. Научная новизна и практическая значимость. Впервые выявлено, что СК АЖ характеризуются коэкспрессией маркеров мезенхимного и эпителиального типов дифференцировки, что отличает их от мезенхимных СК (МСК) из тканей взрослого организма. В условиях культуры эти клетки способны спонтанно и обратимо изменять свою морфологию с мезенхимной на эпителиоподобную. Впервые показано, что актиновые микрофиламенты формируют в цитоплазме СК АЖ не только типичные для МСК стресс-фибриллы, но и характерный для эпителиальных клеток кольцевой пучок под плазматической мембраной. Таким образом, особенности цитоскелета этих клеток позволяют характеризовать их как клетки смешанного фенотипа. Впервые получены данные о морфогенетических потенциях СК АЖ, проявляющихся при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки способны образовывать в геле эпителиоподобные структуры – трубочки и цисты. Между СК АЖ выявляются характерные для эпителиальных клеток адгезивные соединения, и одновременно с этим в них сохраняется экспрессия маркеров мезенхимного типа дифференцировки. В совокупности полученные результаты позволили заключить, что выделенные клетки не являются истинно мезенхимными, они проявляют также свойства эпителиальных клеток, т.е. обладают переходным эпителио-мезенхимным фенотипом. Впервые в культурах СК АЖ выявлены особые межклеточные соединения – нанотрубочки. Через них могут передаваться крупные белковые молекулы и даже целые органеллы. Полученные данные относительно фенотипических свойств и пластичности СК АЖ свидетельствуют о возможности и перспективности использования этих клеток в клеточных технологиях, в том числе и при лечении некоторых заболеваний in utero или сразу после рождения. Кроме того, СК АЖ могут быть трансфицированы с целью дальнейшего применения в генной терапии. Результаты настоящего исследования могут быть использованы в курсе лекций по биологии развития и клеточной биологии. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2008, 2009); Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных 2 технологий» (Санкт-Петербург, 2009); VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009); VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009); XVII и XVIII Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011); III Конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», посвященной памяти академика Н.Г. Хрущева (Москва, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 8. Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных результатов. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 21 рисунок, 8 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 215 источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование клеток из АЖ. Образцы АЖ (2,5 – 10 мл) от 12 доноров были любезно предоставлены клиникой акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирѐва Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва) и Центром планирования семьи и репродукции (Москва). АЖ получали в ходе амниоцентеза, проведенного на 16-23 нед беременности для кариотипирования плода. Клетки выделяли центрифугированием (10 мин, 220g) и культивировали в среде α-MEM с добавлением 15% ES-FBS (HyClone, США), 2мМ глутамина, 18% Chang B и 2% Chang C (Irvine Scientific, США), 1% пенициллина/стрептомицина при 37оС в атмосфере, содержащей 5% СО2. Первый раз смену среды проводили на 5-7 сут, после чего клетки пассировали 1:2, когда они достигали субконфлюэнтного слоя. В дальнейшем пассирование проводили 1:3 на 2-3 сут, когда клетки формировали монослой. Электронная микроскопия. Клетки АЖ фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере при +4 оС в течение 2 ч, дофиксировали 1% раствором осмиевой кислоты и дегидратировали в градиенте этанола и ацетоне (Миронов и др., 1994). Далее для сканирующей электронной микроскопии материал высушивали в критической точке возгонки 3 углекислоты, проводили напыление сплавом золота и палладия и получали микрографии при помощи сканирующего электронного микроскопа CamScan S2 (Великобритания) при ускоряющем напряжении 20кВ. Для трансмиссионной электронной микроскопии материал заливали в эпон, получали ультратонкие срезы, докрашивали их водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе H700 Hitachi (Япония). Проточная цитофлуориметрия. Экспрессию антигенов в клетках АЖ оценивали на проточном цитофлуориметре Becton Dickinson FACSCalibur (США). Клетки трипсинизировали и окрашивали в течение 30 мин при +4оС связанными с FITC или PE антителами против CD13, CD29, CD44, CD106, CD73, CD54, CD45, CD34, CD146, CD90, CD105, CD71, а также антителами против кератина 19 со вторыми антителами, конъюгированными с FITC. Иммуноцитохимия. Для иммуноцитохимического анализа клетки фиксировали 4% ПФА 30 мин и инкубировали с первыми антителами против маркеров разных типов дифференцировки, разведенными в блокирующем растворе (PBS, 5% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Triton X-100, 0,1% Tween 20) в течение ночи при +4оС. После этого клетки отмывали PBS и инкубировали со вторыми антителами Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 546 при комнатной температуре в течение 1 ч. Ядра клеток докрашивали DAPI. Для визуализации актиновых микрофиламентов использовали конъюгированный с флуорохромом фаллоидин (Alexa Fluor 488 Phalloidin, Invitrogen, США). Фиксацию и окраску проводили в соответствии с рекомендациями производителя. ОТ-ПЦР. Выделение тотальной РНК производилось с помощью TRI® Reagent (Sigma, США) согласно протоколу производителя. мРНК получали с использованием магнитных частиц (Силекс, Россия). Первая цепь кДНК синтезировалась на мРНК с помощью фермента M-MLV обратной транскриптазы. Библиотеки кДНК нормировали по гену домашнего хозяйства, кодирующему рибосомальный белок RPL19. ПЦР со специфическими праймерами проводили с использованием ColoredTaq-полимеразы на амплификаторе Mastercycler (Eppendorf, Германия). ПЦР-фрагменты разделяли электрофоретически в 1% агарозном геле и оценивали уровень экспрессии на УФ-анализаторе гелей (®BIO RAD, США). Клонирование СК АЖ осуществляли методом серийных разведений. По 100 мкл суспензии клеток (концентрация 1 клетка/мл) вносили в лунку 96луночного планшета. Через 16-20 ч просматривали планшет и отмечали лунки, содержащие по одной клетке. При достижении в них конфлюэнтного слоя 4 проводили пассирование сначала в лунку 24-луночного планшета, а затем в чашку Петри 35 мм2. Индукцию остеогенеза, адипогенеза и миогенеза проводили по стандартной методике (Киселева и др., 2009; Delo et al., 2006). Для дифференцировки в гепатоциты СК АЖ были посажены на коллаген I типа. Когда клетки достигли субконфлюэнтного слоя, среда культивирования была заменена на бессывороточную среду: Iscove's modified Dulbecco medium (IMDM) с добавлением 20 нг/мл EGF и 10 нг/мл bFGF. Через 2 сут ее сменили на среду следующего состава: IMDM, 20 нг/мл HGF, 10 нг/мл bFGF, 0,1% ДМСО, в которой клетки культивировали в течение 7 сут. После этого в течение 2 нед клетки культивировали в среде IMDM с добавлением 1µM дексаметазона, ITS (1:100), 20нг/мл HGF. Фиксацию осуществляли 4% ПФА и иммуноцитохимически определяли экспрессию маркеров гепатоцитарной дифференцировки: HNF4α, α-фетопротеина, альбумина и c-met. Дифференцировка в эпидермальные клетки. СК АЖ культивировали в среде для кератиноцитов: ДМЕМ/F12 с добавлением 10% FBS, 2мM Lглутамина, 10 нг/мл EGF, 5мкг/мл инсулина, 10-6 М изопротеренола. Смену среды проводили раз в три дня. Через 4 нед клетки фиксировали 4% ПФА и окрашивали антителами к кератину 14 (маркер базальных кератиноцитов). Культивирование СК АЖ в трехмерном коллагеновом геле. Коллагеновый гель готовили с использованием коллагена I типа, к которому последовательно добавляли смесь бикарбоната натрия и 0,34N NaOH (1:2), Lглутамина и концентрированной (×10) среды М199 (1:25), HEPES и ES-FBS (1:5). В лунку 12-луночного планшета вносили по 1 мл коллагенового геля, содержащего 100 тыс. СК АЖ (пассаж 10). После полимеризации на гель наслаивали 1 мл культуральной среды. Смену среды проводили раз в три дня. Пролиферацию клеток выявляли по включению в ДНК BrdU. Трансплантация СК АЖ иммунодефицитным животным. Для изучения способности СК АЖ формировать тератомы использовали мышей линии Nude (Питомник лабораторных животных «Пущино»). Экспериментальным животным подкожно вводили по 3×106 клеток в 100 мкл бессывороточной среды α-MEM. Контрольным животным вводили 100 мкл суспензии МСК из жировой ткани человека (45×106 клеток/мл) (отрицательный контроль) или 100 мкл суспензии ЭСК мыши (20×106 клеток/мл) (положительный контроль). В каждой группе было по 3 животных. Животных выводили из эксперимента по мере формирования опухолей (положительный контроль) или через 11 нед после инъекции (экспериментальная группа и отрицательный контроль). 5 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Культура клеток из амниотической жидкости. В работе были использованы 12 образцов АЖ от 12 доноров. По данным цитогенетического анализа, проведенного в лаборатории пренатальной диагностики, у 11 плодов кариотипы были нормальными (46, ХХ; 46, ХY), у одного плода был выявлен синдром Дауна (47, XY, +21). В результате центрифугирования АЖ получали гетерогенную популяцию клеток, большую часть которой представляли клетки плоского эпителия, которые не прикреплялись к пластику и после первой смены среды на 5-7 сут элиминировались из культуры. Мелкие округлые клетки, напротив, прикреплялись и формировали колонии фибробластоподобных (рис. 1а) и эпителиоподобных (рис. 1б) клеток. После первой смены среды фибробластоподобные клетки, в отличие от эпителиоподобных, начинали активно пролиферировать. В течение 4-6 сут они достигали субконфлюэнтного слоя и были пассированы, после чего образования колоний не происходило. Клетки равномерно распределялись по дну лунки и в течение 2-3 сут формировали монослой. После 2-3 пассирований получали морфологически гомогенную популяцию, представленную фибробластоподобными клетками (рис. 1в). Рис. 1. Клетки АЖ в культуре. (а) первичная колония фибробластоподобных клеток на 9 сут культивирования; (б) первичная колония эпителиоподобных клеток на 9 сут культивирования; (в) монослой клеток 8 пассажа. Фазовый контраст, прижизненные фото. Величина шкалы – 200 мкм. Электронно-микроскопический анализ показал, что клетки в культуре соединялись многочисленными нанотрубочками (рис. 2а), толщина которых составляла 0,02-0,1 мкм. В части нанотрубочек обнаруживались везикулярные расширения – «гондолы» (рис. 2б), являющиеся зонами межклеточного транспорта (Veranic et al., 2008). Через них могут передаваться как белковые молекулы, так и целые органеллы. Мы впервые выявили такой тип соединений в культурах клеток АЖ. 6 Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия. (а) СК АЖ соединяются в культуре многочисленными нанотрубочками (н); (б) везикулярные расширения (в.р.) могут быть признаком межклеточного транспорта. Величина шкалы – (а) – 10 мкм; (б) – 3 мкм. Таким образом, клетки были выделены из всех образцов АЖ (АЖ 1 – АЖ 12). Четыре культуры к настоящему времени прошли 18-24 пассажа, остальные были криоконсервированы на 5-6 пассаже. II. Характеристика фенотипа по экспрессии молекулярных маркеров. II.1. Иммуноцитохимический анализ показал, что клетки АЖ (пассаж 2-3) экспрессировали маркеры МСК (CD105, CD73, STRO-1, CD49d), а также нейральные (β3-тубулин, нестин, NF, Pax6) и эпителиальные (кератин 19, кератин 18, кератин 7, транскрипционный фактор р63) маркеры (рис. 3). Кератин 14, являющийся маркером ороговевающего эпидермиса, в амниотических клетках не был обнаружен. Кроме того, была выявлена экспрессия маркера СК c-kit и эндотелиального маркера СD31, тогда как маркер гематопоэтических СК CD34 не выявлен. Рис. 3. Экспрессия маркеров разных типов дифференцировки в культивированных клетках АЖ. Иммуноцитохимия. Ядра клеток докрашены DAPI (синий). Величина шкалы – 100 мкм. II.2. По результатам проточной цитофлуориметрии клетки АЖ (пассаж 6-7) экспрессировали маркеры МСК: CD90 (Thy-1), CD73, CD105, CD13, CD29, CD44, CD146, CD54, CD71 и не экспрессировали CD106 и маркеры 7 гематопоэтических стволовых/прогениторных клеток CD34, CD45 (рис. 4), что совпадает с имеющимися данными по экспрессии этих антигенов в МСК и СК АЖ (In ’t Anker et al., 2003; Sessarego et al., 2008). CD73 Кератин 19 CD90 CD34 Рис. 4. Экспрессия маркеров в культивированных клетках АЖ. Проточная цитофлуориметрия. Из эпителиальных маркеров с помощью проточной цитофлуориметрии был выявлен кератин 19. Следует отметить, что его экспрессировали более 70% клеток и одновременно с этим более 80% экспрессировали маркер МСК CD105, и более 95% клеток – CD73 (рис. 5). Это свидетельствовало о том, что значительная часть популяции может одновременно экспрессировать два маркера – мезенхимный и эпителиальный. Рис. 5. Соотношение клеток, экспрессирующих маркеры мезенхимных и эпителиальных СК, в культурах от разных доноров. II.3. Чтобы это проверить, мы провели двойное иммуноцитохимическое окрашивание (рис. 6), результаты которого подтвердили наше предположение. Рис. 6. Двойное иммуноцитохимическое окрашивание маркеров мезенхимных и эпителиальных СК. Величина шкалы – 100 мкм. 8 Одновременная экспрессия кератина 19 и CD73 наблюдалась в 60,6-93,7% культивированных клеток, коэкспрессия кератина 19 и CD105 выявлялась в 67,8-100% клеток АЖ. II.4. Данные ОТ-ПЦР показали экспрессию в клетках АЖ (пассаж 5-6) генов, характерных для мезенхимного (THY-1), нейрального (TUBB3, NES, NS, PAX6) и эпителиального (KRT19, Р63) типов дифференцировки (рис. 7). Кроме того, с помощью ОТ-ПЦР в этих клетках были выявлены поверхностный маркер C-KIT, гомеобоксный ген PITX2 и некоторые маркеры плюрипотентности - OCT4, NANOG, REX1. В то же время экспрессия таких маркеров плюрипотентности, как SOX2 и STELLA, в клетках из АЖ не наблюдалась. THY-1 TUBB3 NES PAX6 KRT19 P63 OCT4 NANOG REX1 Рис. 7. Экспрессия маркеров дифференцировки и маркеров СК по данным ОТ-ПЦР. Таким образом, полученные нами клетки АЖ характеризовались экспрессией широкого спектра маркеров. Иммуноцитохимический анализ и проточная цитофлуориметрия выявили высокую степень сходства между культурами от разных доноров. В том числе и культура клеток с аномальным кариотипом (47, XY, +21) по морфологическим и иммунофенотипическим характеристикам не отличалась от остальных. В клетках АЖ были обнаружены маркеры мезенхимных и эпителиальных СК, а также маркеры плюрипотентности. Наши результаты во многом совпадают с данными других исследователей об экспрессии маркеров в СК из АЖ. Учитывая это, а также то, что использованный нами способ выделения клеток был основан на ранее описанных методах выделения СК (De Coppi et al., 2007a; Roubelakis et al., 2007) с модификациями, мы, как и другие исследователи, будем называть полученные клетки СК АЖ. В то же время необходимо добавить, что мы получили дополнительные данные по экспрессии маркеров в СК АЖ, в том числе эпителиальных, а также их коэкспрессии с мезенхимными маркерами. Это может свидетельствовать о том, что статус СК АЖ является более примитивным, чем считалось ранее. III. Трансплантация стволовых клеток амниотической жидкости иммунодефицитным животным. Поскольку по результатам ОТ-ПЦР анализа в СК АЖ была выявлена экспрессия маркеров плюрипотентности OCT4 и 9 NANOG, мы проверили, способны ли эти клетки формировать тератомы при трансплантации in vivo. Культивированные до 5 пассажа СК АЖ подкожно вводили 2 мес. мышам линии Nude. Через 11 нед после инъекции тератомы не были обнаружены ни у одного животного из экспериментальной группы, а также из группы отрицательного контроля (клетки стромы жировой ткани человека). В то же время при введении ЭСК мыши наблюдалось образование тератом уже через 3-4 нед. Эти результаты согласуются с имеющимися в литературе данными, согласно которым при трансплантации СК АЖ in vivo тератомы не формируются (De Coppi et al., 2007а; Trounson, 2007). IV. Клонирование стволовых клеток амниотической жидкости. IV.1. Морфологическая характеристика клонированных клеток. Поскольку значительная часть клеток популяции экспрессирует 2 типа маркеров, мы провели клональный анализ, для доказательства того, что потомки одной клетки могут экспрессировать маркеры мезенхимы и эпителия. Несмотря на то, что культуры СК АЖ были морфологически гомогенны уже к 2-3 пассажу и в основном были представлены фибробластоподобными клетками, мы выяснили, что эпителиоподобные клетки полностью не исчезали из культуры. При клонировании клеток 7-10 пассажей были получены клоны, различающиеся по морфологии клеток и пролиферативному потенциалу. Часть клонов состояла из крупных распластанных клеток (рис. 8а), которые, по всей видимости, соответствуют эпителиоподобному типу (Hoehn et al., 1974). Скорость пролиферации у таких клеток была низкой, максимальное количество пройденных пассажей составило 5. Другие клоны были представлены фибробластоподобными клетками с большим числом вытянутых отростков (рис. 8б); такие клетки активно пролиферировали и при формировании монослоя приобретали полигональную форму (рис. 8в). Характер роста этих клеток отличался от типичного для эпителиальных, в то же время в монослое они морфологически отличались от фибробластов. Скорее всего, такие клоны представлены специфическими клетками АЖ. Это согласуется с данными других авторов (Hoehn et al., 1974), согласно которым подобные клоны превалируют над остальными и обладают высоким пролиферативным потенциалом. К настоящему времени клетки с описанной морфологией прошли 13 пассажей. Эффективность клонирования составила 7,4%. Способность клеток к клональному росту служит показателем самоподдержания в культуре и еще раз подтверждает, что выделенные клетки являются стволовыми. 10 Рис. 8. Клоны СК АЖ. (а) эпителиоподобные клетки; (б) специфические клетки АЖ на 3-4 сут культивирования; (в) монослой специфических клеток АЖ. Фазовый контраст, прижизненные фото. Величина шкалы – 200 мкм. Отдельно следует отметить явление изменения морфологии клонированных клеток, которое неоднократно наблюдалось в процессе культивирования. Специфические клетки становились сильно распластанными и замедляли скорость пролиферации, т.е. напоминали эпителиоподобные клетки. В течение 7-10 сут они пребывали в таком состоянии и не были пассированы. Затем часть клеток снова вытягивалась, образовывала многочисленные выросты и начинала активно пролиферировать. В течение 2-3 сут такие клетки формировали монослой и далее продолжали делиться с высокой скоростью. IV.2. Иммуноцитохимический анализ клонированных клеток. Полученные нами клонированные клетки различались по экспрессии маркеров (таблица). Так в клетках клона 1 была выявлена экспрессия трех типов маркеров – мезенхимных, эпителиальных, нейральных. В противоположность этому в клетках клона 3 выявлялась экспрессия только некоторых из маркеров МСК (CD105, STRO-1), экспрессии же CD73 в них не было, так же как экспрессии маркеров эпителиальных и нейральных клеток. Следует отметить, что профиль экспрессии не зависел от морфологических характеристик клонированных СК АЖ. Таблица. Экспрессия маркеров в клонированных СК АЖ по данным иммуноцитохимии Маркер Клон 1 Клон 2 Клон 3 Клон 4 Морфология специфические эпителиоподобные специфические специфические клеток CD73 + + + СD105 + + + + CD29 + + н/о н/о CD44 + + н/о + STRO-1 ± н/о Нестин ± н/о Kератин 19 + + + Кератин 7 + н/о н/о н/о «+» - имеется экспрессия маркера, «-» - экспрессии маркера нет; н/о – не определяли 11 IV.3. Дифференцировка клонированных клеток. Мы показали, что в исходной неклонированной культуре СК АЖ способны дифференцироваться в типичные для МСК производные – остеоциты и адипоциты, но не в эпидермальные клетки. В следующей части своей работы мы сравнили дифференцировочные потенции двух клонов, максимально различавшихся по экспрессии маркеров – клона 1 и клона 3. Клетки культивировали в индукционных средах для реализации остеогенной и миогенной дифференцировок (производные мезодермы), а также в среде для дифференцировки в гепатоциты (производные энтодермы). Индукцию в эпидермальном направлении (производные эктодермы) мы не проводили, поскольку в исходной неклонированной культуре эта дифференцировка не реализовывалась. IV.3.1. Остеогенную дифференцировку проводили в течение 3 нед. В результате в культуре клеток клона 1 образовывались кальцификаты, окрашивающиеся красителем ализариновым красным (рис. 9а) и иммуноцитохимически выявлялась экспрессия белка внеклеточного матрикса остеопонтина (рис. 9б). В то же время образования кальцификатов в клетках клона 3 не происходило, хотя в них возрастала активность фермента щелочной фосфатазы, являющегося ранним маркером остеогенной дифференцировки (рис. 9в). Возможно, третий клон обладает меньшим остеогенным потенциалом, и для его терминальной дифференцировки требуется больше времени или иные индукторы. IV.3.2. Миогенез индуцировали добавлением в культуральную среду 5азацитидина на 24 ч, после чего в культурах обоих клонов наблюдалось образование многоядерных клеток. На 7 сут после индукции в клетках выявлялся транскрипционный фактор Myf-6, экспрессирующийся на ранних этапах миогенеза. IV.3.3. Дифференцировку СК АЖ в гепатоциты проводили в течение 3 нед. В результате в клетках обоих клонов резко возрастала экспрессия αфетопротеина (рис. 10а), тогда как в контроле этот маркер выявлялся только в отдельных клетках. В то же время маркеры поздних стадий дифференцировки HNF4α и альбумин выявлялись только в клетках клона 1 (рис. 10б-г). Экспрессия рецептора c-met возрастала также только в клетках клона 1, тогда как в клетках клона 3 слабая экспрессия, которая наблюдалась в контроле, после индукции никак не изменялась. Возможно, сниженный уровень 12 экспрессии c-met (рецептор HGF) в недифференцированных клетках приводит к тому, что клетки клона 3 в меньшей степени подвергаются индукции. Рис. 9. Дифференцировка клонированных СК АЖ в остеогенном направлении. (а) выявление кальцификатов, окрашивающихся красителем ализариновым красным; (б) окраска антителами против белка внеклеточного матрикса остеопонтина (красный), ядра докрашены DAPI (синий); (в) выявление активности щелочной фосфатазы. Величина шкалы – (а, б) – 200 мкм; (в) – 500 мкм. Рис. 10. Дифференцировка клонированных СК АЖ в гепатоцитарном направлении. Иммуноцитохимия. Окраска антителами против (а) α-фетопротеина (зеленый); (б) альбумина (зеленый); (в) HNF4α (красный); (г) то же поле зрения, ядра докрашены DAPI (синий). Величина шкалы – (а) 200 мкм; (б – г) 100 мкм. Несмотря на морфологические, иммунофенотипические различия, а также различия в степени дифференцировок, клонированные СК АЖ могут быть индуцированы в остеогенном, миогенном и гепатоцитарном направлениях. При этом клетки, характеризующиеся экспрессией широкого спектра маркеров (мезенхимных, эпителиальных и нейральных), обладают более выраженными потенциями, в то время как клонированные клетки, экспрессирующие только маркеры МСК, обладают меньшими потенциями. В последнем случае мы наблюдали только начальные этапы дифференцировки в разных направлениях, которые проявлялись в экспрессии ранних дифференцировочных маркеров. По всей видимости, таким клеткам необходима более длительная индукция или, возможно, модифицированные протоколы дифференцировки. 13 Вопрос о происхождении СК АЖ в настоящее время остается открытым. Экспрессия широкого спектра маркеров МСК, фибробластоподобная морфология и спектр возможных дифференцировок этих клеток позволяют предположить, что по своей природе СК АЖ являются мезенхимными. В то же время, этому противоречит экспрессия в них маркеров эпителиальных клеток. Дополнительные сведения, позволяющие уточнить тканевую принадлежность СК АЖ, представляют исследования цитоскелета, а также изучение поведения клеток в 3D условиях. V. Актиновые микрофиламенты в стволовых клетках амниотической жидкости. Одним из основных компонентов цитоскелета всех эукариотических клеток являются актиновые микрофиламенты. Известно, что они организуют разные структуры в разных типах клеток (Васильев, 2001): в эпителиальных клетках они формируют кольцевой пучок в цитоплазме под плазматической мембраной, в то время как в мезенхимных клетках, в том числе и фибробластах, выявляются стресс-фибриллы актина. В СК АЖ были обнаружены не только стресс-фибриллы, но и кольцевой пучок микрофиламентов (рис. 11). Фибробласты СК АЖ Кератиноциты Рис. 11. Организация цитоскелета разных типов клеток. Выявление актиновых микрофиламентов с использованием конъюгированного с флуорохромом Alexa Fluor 488 фаллоидина (зеленый). Ядра клеток докрашены DAPI (синий). Величина шкалы – 100 мкм. Таким образом, особенности организации цитоскелета характеризуют СК АЖ как клетки промежуточного эпителио-мезенхимного фенотипа. VI. Культивирование стволовых клеток амниотической жидкости в трехмерном коллагеновом матриксе. Известно, что клетки разного происхождения по-разному ведут себя в коллагеновом геле (Brinkmann et al., 1995; Sköld et al., 2000), поэтому мы решили изучить поведение СК АЖ в трехмерном матриксе и оценить их морфогенетический потенциал. 14 В течение первых суток культивирования в коллагеновом геле клетки располагались поодиночке и сохраняли округлую форму. На 3-4 сут часть клеток вытягивалась, после чего (на 4-6 сут или 9-14 сут) внутри геля происходило образование тубулярных структур, в составе которых обнаруживались как вытянутые, так и округлые клетки (рис. 12а, б). Кроме того, СК АЖ образовывали в геле цисты (рис. 12в). Тубулярные структуры постепенно усложнялись. Активная пролиферация клеток внутри геля подтверждалась включением в ДНК ВrdU. Рис. 12. СК АЖ в трехмерном коллагеновом матриксе. (а) тубулярные структуры, образующиеся в коллагеновом геле на 8-9 сут культивирования. В их составе обнаруживаются округлые и вытянутые клетки; (б) поздняя стадия тубулогенеза – 15-18 сут культивирования; (в) циста, сформировавшаяся на 8 сут культивирования; (г) ленточный адгезивный контакт; плотные зоны (пз), прилегающие к плазматической мембране в зоне контактов, соединены с пучками микрофиламентов (мф); плазматические мембраны соседних клеток формируют пальцевидные инвагинации (и). (а – в) фазовый контраст, прижизненные фото; величина шкалы – 200 мкм; (г) трансмиссионная электронная микроскопия. Параллельно с процессом тубулогенеза наблюдалась контракция (сокращение диаметра) коллагенового геля, которая завершалась к 15-20 сут. Известно, что фибробласты в коллагеновом геле прекращают пролиферировать и контрактируют его уже к 3-5 сут (Руднева и др., 1990). СК АЖ контрактируют гель позднее, таким образом, динамика процесса в данном случае более сходна с поведением в трехмерном матриксе эпителиальных клеток. На возможную эпителиальную природу СК АЖ также указывает формирование трубчатых структур и цист. Электронно-микроскопическое исследование выявило базоапикальную поляризацию клеток; на апикальной стороне между СК АЖ формировались типичные для эпителиев адгезивные соединения (adherent junction) (рис. 12г). 15 При этом по данным иммуноцитохимии при культивировании в геле в клетках сохранялась и экспрессия маркеров мезенхимного типа дифференцировки. Таким образом, по поведению в трехмерном матриксе, степени и скорости контракции коллагенового геля, выраженному морфогенетическому потенциалу мы можем заключить, что СК АЖ не являются истинно мезенхимными: эти клетки обладают особым эпителио-мезенхимным фенотипом. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Долгое время культивирование клеток АЖ использовалось только для пренатальной генетической диагностики. И лишь недавно было показано, что в АЖ присутствуют СК, которые экспрессируют многие маркеры мезенхимных клеток, обладают адгезией к пластику и способны дифференцироваться в разных направлениях, включая остеогенное, адипогенное и хондрогенное. В связи с этим многие исследователи относят СК АЖ к МСК (Tsai et al., 2004; Sessarego et al., 2008). Проведенное нами исследование показало, что СК АЖ по многим характеристикам действительно сходны с МСК, однако одновременно с этим и принципиально отличаются от них. В этих клетках выявляются маркеры не только мезенхимного, но и эпителиального типов дифференцировки, что не характерно для МСК, выделенных из тканей взрослого организма. Причем по результатам проточной цитофлуориметрии и иммуноцитохимии коэкспрессия двух типов маркеров наблюдается не в единичных клетках, а в значительной части популяции (вплоть до 100% клеток). Проведенный нами клональный анализ подтвердил эти данные: в потомках одной клетки были выявлены маркеры разных типов дифференцировки. Клонированные СК АЖ способны дифференцироваться в остеогенном, миогенном и гепатоцитарном направлениях. Мы впервые получили данные о морфогенетических потенциях СК АЖ, проявляющихся при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки сохраняют в геле пролиферативную активность и способны формировать многоклеточные цисты и тубулоподобные структуры – это свойственно эпителиальным клеткам. Кроме того между СК АЖ выявляются типичные для эпителиев адгезивные соединения. При этом в трехмерном 16 матриксе сохраняется экспрессия маркеров МСК и происходит значительная контракция (сокращение диаметра) коллагенового геля. Мы также провели исследование особенностей цитоскелета СК АЖ и выявили в них как характерные для мезехимных клеток стресс-фибриллы актина, так и типичный для эпителиальных клеток кольцевой пучок микрофиламентов под плазматической мембраной. Впервые было показано, что СК АЖ в культуре соединяются нанотрубочками, которые обеспечивают тесную взаимосвязь клеток в условиях in vitro. При проведении клонального анализа мы наблюдали явление изменения морфологических характеристик СК АЖ. Клетки c многочисленными отростками (мезенхимной морфологии) в ходе культивирования становились эпителиоподобными, что сопровождалось резким снижением их пролиферативной активности. В течение нескольких суток они пребывали в таком состоянии, после чего вновь меняли свою морфологию и начинали активно делиться. Таким образом, наблюдаемый нами процесс был обратимым. При этом клонированные клетки разной морфологии экспрессировали маркеры как мезенхимного, так и эпителиального типов дифференцировки. Предположительно СК АЖ могут находиться в состоянии эпителиомезенхимного перехода, который активно протекает в эмбриогенезе. Полученные нами результаты в целом опровергают существующее мнение о том, что СК АЖ являются МСК. Эти клетки проявляют многие свойства мезенхимных клеток, в том числе экспрессируют специфические маркеры и способны дифференцироваться в соответствующих направлениях. Однако СК АЖ демонстрируют и свойства эпителиальных клеток. В них выявляются маркеры эпителиального типа дифференцировки, адгезивные соединения, они проявляют морфогенетические потенции эпителиальных клеток в 3D условиях. Кроме того, мы обнаружили, что в условиях культуры СК АЖ способны изменять свою морфологию. Таким образом, выделенные нами клетки обладают особым эпителио-мезенхимным фенотипом и не могут быть отнесены к одному из типов тканей. По всей видимости, эти клетки возникают на самых ранних этапах эмбриогенеза, могут сохраняться в АЖ и в условиях культуры проявлять свою двойственную природу. 17 ВЫВОДЫ 1. Получены культуры клеток из амниотической жидкости человека второго триместра беременности. Выделенные клетки соответствуют критериям стволовых: способны к самоподдержанию, экспрессируют маркеры СК, дифференцируются в разные типы клеток. 2. В условиях in vitro стволовые клетки амниотической жидкости человека экспрессируют маркеры мезенхимного, нейрального и эпителиального типов дифференцировки, а также маркеры плюрипотентности. В культуре доминируют клетки (от 60,6% до 100%), одновременно экспрессирующие маркеры мезенхимной и эпителиальной дифференцировки. 3. Клонированные клетки сохраняют способность к коэкспрессии двух типов маркеров – мезенхимных и эпителиальных. Актиновые микрофиламенты формируют в цитоплазме структуры, характерные как для мезенхимных, так и для эпителиальных клеток. Стволовые клетки амниотической жидкости обладают промежуточным эпителио-мезенхимным фенотипом. 4. Клонированные клетки способны дифференцироваться в остеогенном, миогенном и гепатоцитарном направлениях. 5. Стволовые клетки амниотической жидкости обладают морфогенетическими потенциями, которые проявляются при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки пролиферируют в геле и формируют в нем многоклеточные цисты и тубулоподобные структуры. 6. В культуре стволовые клетки амниотической жидкости контактируют с помощью особых межклеточных соединений – нанотрубочек. Обнаруженные в них везикулярные расширения могут быть признаком межклеточного транспорта. 18 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи: 1. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Смирнова Ю.А., Зиновьева Р.Д., Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Терских В.В., Васильев А.В. Характеристика фенотипа клеток из амниотической жидкости человека // Acta Naturae. 2009. № 2. С. 112-119. 2. Давыдова Д.А. Стволовые клетки в амниотической жидкости человека // Известия РАН. Сер. биол. 2010. № 5. С. 517-526. 3. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Брагина Е.Е., Терских В.В., Васильев А.В. Культивирование стволовых клеток амниотической жидкости человека в трехмерном коллагеновом матриксе // Цитология. 2011. Т. 53. № 4. С. 325-331. Тезисы конференций: 1. Давыдова Д.А. Характеристика клеток из амниотической жидкости человека // Онтогенез. 2009. Т. 40, № 4. С. 310-311. 2. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Смирнова Ю.А., Романов Ю.А., Васильев А.В., Терских В.В. Амниотическая жидкость – перспективный источник клеток для клеточной терапии // Цитология. 2009. Т. 51, № 9. С. 760. 3. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Терских В.В. Клетки из амниотической жидкости в разных системах культивирования // VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород, 2009. Сборник тезисов конференции. С. 70. 4. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Смирнова Ю.А., Романов Ю.А., Васильев А.В., Терских В.В. Клетки амниотической жидкости человека: профиль экспрессии генов и поведение в трехмерном матриксе // VI Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Москва, 2009. Сборник тезисов конференции. С. 75-76. 5. Давыдова Д.А. Дифференцировочный потенциал клеток из амниотической жидкости человека // Онтогенез. 2010. Т. 41, № 6. С. 468. 6. Давыдова Д.А. Тубулогенез клеток амниотической жидкости в коллагеновом геле // XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Москва, 2010. Сборник тезисов конференции. С. 298. 19 7. Давыдова Д.А. Типы межклеточных контактов в культуре стволовых клеток амниотической жидкости: нанотрубочки и адгезивные соединения // XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва, 2011. Сборник тезисов конференции. С. 287. 8. Васильев А.В., Роговая О.С., Петракова О.С., Давыдова Д.А., Киселева Е.В., Гвазава И.Г., Дашинимаев Э.Б. Пластичность стволовых клеток – границы и возможности // III Конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», посвященная памяти академика Н.Г. Хрущева. Москва, 2011. Сборник тезисов конференции. С.26-28. Работа выполнена на оборудовании Центра коллективного пользования «По биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов» на базе Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-12132-офи-м) и Минобрнауки России (государственный договор №13.G25.31.0080 от 22 октября 2010). 20
