Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
advertisement
Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ – МОСКОВСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ К.А. ТИМИРЯЗЕВА» __________________________________________________________________ На правах рукописи ЕГОРОВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА XANTHOMONAS, ПОРАЖАЮЩИХ РАСТЕНИЯ СЕМЕЙСТВА МЯТЛИКОВЫЕ (POACEAE) специальность 06.01.07. – Защита растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Игнатов Александр Николаевич Москва – 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 4 1.1 Видовой состав и распространенность возбудителей рода Xanthomonas на растениях семейства Мятликовые............................................................... 10 1.2. Биологические особенности возбудителей бактериальных заболеваний злаковых культур ............................................................................................... 18 1.2.1 Культурально-морфологические свойства возбудителей ................. 18 1.2.2 Симптомы проявления бактериозов .................................................... 20 1.3.Методы диагностики фитопатогенных бактерий ..................................... 29 1.4. Методы защиты от возбудителей бактериозов на злаковых культурах 35 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................. 38 ГЛАВАIII. ИЗУЧЕНИЕ ФИТОПАТОГЕННЫХ ВИДОВОГО БАКТЕРИЙ РОДА РАЗНООБРАЗИЯ XANTHOMONAS, ПОРАЖАЮЖИХ ЗЛАКОВЫЕ КУЛЬТУРЫ..................................................... 49 3.1.Видовой состав возбудителей рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые ...................................................................................... 50 3.2.Изучение генетического разнообразия исследуемой коллекции Xanthomonas spр. с помощью метода мультилокусного генотипирования (MLST) ................................................................................................................ 58 3.3. Оценка вирулентности штаммов ............................................................... 65 ГЛАВА IV. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА XANTHOMONAS, ПОРАЖАЮЖИХ ЗЛАКОВЫЕ КУЛЬТУРЫ..................................................... 68 4.1 Оптимизация метода выделения бактерий из семян ячменя и риса ....... 68 4.2. Идентификация возбудителей бактериозов методом классической ПЦР и прямого секвенирования ................................................................................ 72 3 4.3. Разработка методов выявления и идентификации Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени». .................... 78 4.4. Применение БИО-ПЦР и сравнение чувствительности данного метода с постановкой прямого ПЦР анализа .................................................................. 88 ГЛАВА V. ПОИСК ЭФФЕКТИВНЫХ ПРИЕМОВ ЗАЩИТЫ ОТ ВОЗБУДИТЕЛЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ОЖОГА ЛИСТЬЕВ РИСА ................ 93 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 97 ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 98 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................................................... 99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 100 ПРИЛОЖЕНИЕ ................................................................................................... 121 4 ВВЕДЕНИЕ Семейство Мятликовых (Poaceae) (Злаки) - наиболее важное в хозяйственном отношении семейство растений. К нему принадлежат культуры, обеспечивающие основную часть пищевых потребностей человечества. Злаковые культуры занимают примерно половину посевной площади мира и выращиваются практически везде, где живут люди. Основные растения - пшеница, рис, кукуруза, а также целый ряд других культур (рожь, ячмень, овес, сорго, просо и другие) возделываются на 699 млн. га, что составляет 46,44% обрабатываемых площадей в мире; в том числе на 41,9 млн. га, что составляет 59,65 % земель сельскохозяйственного назначения в РФ (FAOSTAT 2011). В настоящее время рынок зерна контролируют пять основных экспортеров: США, Австралия, Канада, ЕС, Аргентина. Суммарное количество зерна со стороны основной "пятерки" экспортеров составляют более 84 % всего объема мировой торговли. США, на долю, которой приходится 28 % объема торговли, занимает ведущее положение на рынке зерна, далее идут Канада – 17 %, Австралия и ЕС – по 15 % и Аргентина – 11 % (http://ria.ru/economy). На долю России приходится около 10% всех пахотных земель мира. Выращивание зерновых культур является одной из базовых составляющих России. На долю посевов в России в 2012 году приходилось 58% общей площади. Основные площади для выращивания зерновых культур традиционно принадлежат пшенице и ячменю. На их долю суммарно приходится более 75%. Вместе с тем, необходимо отметить, что максимальные посевные площади под посевом зерновых отмечались в 2001, 2002 и 2009 годах – более 47 млн. га, а в 2010 году они снизились до 43,2 млн. га и в 2011 году составили 44,2 млн. га (http://id-marketing.ru). Одним из сдерживающих факторов повышения продуктивности сельскохозяйственного производства является ряд опасных возбудителей 5 болезней. В последние годы нарастает вредоносность бактериозов на основных сельскохозяйственных культурах, включая зерновые (Игнатов и др., 2010). В полевых условиях их внешние признаки могут маскироваться либо проявлением минерального голодания элемента), либо растений (из-за симптомами дефицита вирусных какого-то или грибных инфекций. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas поражают наиболее важные злаковые, пасленовые, крестоцветные, цитрусовые, бобовые и другие сельскохозяйственные культуры, что приводит к серьезным экономическим потерям. Поскольку производство посадочного материала и семян различных сельскохозяйственных культур больше сосредоточено в странах с благоприятным для бактериозов климатом, фитопатогенные бактерии распространяются повсеместно. В связи с этим проблема диагностики и идентификации Xanthomonas spp. становится более актуальной и экономически значимой (Пунина и др., 2008). Наиболее вредоносным возбудителем бактериальных болезней зерновых культур считается возбудитель штриховатости листьев и черного бактериоза семян Xanthomonas translucens (Jones et al., 1917, Vauterin et al., 1995), вызывающий потери до 40% урожая на восприимчивых сортах пшеницы, ржи, ячменя и овса. Бактериальный ожог риса Xanthomonas oryzae (Swings et al, 1990) относится к числу наиболее вредоносных заболеваний во всем мире, унося ежегодно в странах Азии, от 22 до 81% урожая риса (OEPP/EPPO, 1990). В 2001-2008 гг. впервые в РФ был выделен и изучен новый бактериальный патоген злаков Xanthomonas arboricola (Игнатов и др., 2010), вызывающий поражение пшеницы, ржи, ячменя, овса, а также подсолнечника и крестоцветных культур. Следует отметить, что ранее патоварианты этого вида бактерии были отмечены на ряде многолетних растений: землянике (X. arboricola pv. fragaria), косточковых плодовых деревьях (X. arboricola pv. pruni), фундуке (X. arboricola pv. coryliva), грецком 6 орехе (X. arboricola pv. jglandis), тополе (X. arboricola pv. populi), и молочае (X. arboricola pv. poinsetticola) (Vauterin, 1995). Видовое разнообразие фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые в РФ практически не изучалось, и методы их диагностики не разрабатывались, в связи с чем актуальность и новизна исследований является очевидной. Целью нашей работы являлось изучение видового разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Мятликовые (Poaceae), разработка методов диагностики видов, регулируемых законодательством РФ и поиск эффективных мер борьбы с бактериальным ожогом риса. Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач: 1. Уточнить видовой состав и оценить распространенность фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Poaceae в Российской Федерации. 2. Создать коллекцию штаммов фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые злаки в РФ и типовых штаммов соответствующих видов патогена, а также определение их видового разнообразия по молекулярно-генетическим признакам, включая MLST (мультилокусное секвенирование). 3. Разработать методы диагностики зараженности растений и семян на основе ПЦР, ПЦР в реальном времени и БИО-ПЦР. 4. Найти эффективные препараты для протравливания семян в борьбе с бактериальным ожогом риса. Для решения данных задач были проведены ряд исследований и экспериментов, отвечающих требованиям к наблюдений, научному методу как способу получения новых знаний. Научная новизна. Впервые в России проведено исследование изучению видового разнообразия фитопатогенных бактерий по рода 7 Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Мятликовые, в ходе, которого были идентифицированы возбудители X. campestris, X. hortorum, X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri, ранее не выявляемые на данных культурах. Оптимизирован метод пробоподготовки семенного материала (рис, ячмень) для диагностики возбудителей бактериозов. На основе подобранных праймеров и зондов разработана диагностика карантинного вида Xanthomonas oryzae и наиболее часто встречаемого вида в семенном материале злаковых культур Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени». На основании модифицированной подобранных селективной праймеров среды и разработана предложенной диагностика карантинного вида X. oryzae методом БИО-ПЦР. Показана высокая эффективность применения фунгицида Максим, КЭ (компания «Сингента») для предпосевного протравливания семян от возбудителя бактериального ожога риса. Практическая значимость результатов исследований. В результате исследований была создана референтная коллекция российских штаммов фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Poaceae (40 штаммов). По материалам проведенных исследований разработаны методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителей карантинных бактериозов риса X. oryzae pv. оryzae и X. oryzae pv. oryzicola, которые могут быть использованы в практике научных исследований и при проведении досмотра и экспертиз подкарантинной продукции на наличие карантинных вредных организмов. В данную методику были включены собственные разработанные и модифицированные методы. В частности, предложена модифицированная селективная среда для изоляции патогенов из растительного материала. Подобраны специфичные праймеры и зонд для диагностики X.oryzae методом ПЦР «в реальном времени». 8 Усовершенствовано несколько вариантов классической ПЦР диагностики для выявления данного патогена. Разработанные методы диагностики успешно применяются при проведении фитосанитарной экспертизы в ФГБУ «ВНИИКР». Апробация работы. Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (г. Саратов, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2013); на 14-й научной конференции молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», (г.Москва, ГНУ ВНИИСБ, 16 апреля 2014 г.); на Международной научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты», (Большие Вяземы, ВНИИ фитопатологии,15-18 октября 2014 г.); на Международной научно-практической конференции «Научное и кадровое обеспечение продовольственной безопасности России» (г.Москва, ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2-4 декабря 2014). По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК. Личное участие автора. Сбор материала, экспериментальные лабораторные исследования, обработка полученных экспериментальных данных, написание текста работы и подготовка иллюстраций для диссертации подготовлены исключительно самим автором или при его непосредственном участии. Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах и состоит из введения, 5 глав, заключения, общих выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы из 219 источников (из них 172 - зарубежных авторов). В диссертации содержится 16 рисунков, 15 таблиц и 6 приложений. 9 Основные положения, выносимые на защиту: 1. Видовое и генетическое разнообразие фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Мятликовые; 2. Оптимизация молекулярно-генетических методов идентификации бактериозов (методы экстракции бактерий; разработка ПЦР «в реальном времени» для диагностики карантинного вида X. oryzae и X. arboricola; разработка модифицированной селективной среды для изоляции возбудителя бактериального ожога риса из растительного материала); 3. Поиск эффективных приемов защиты от возбудителя бактериального ожога риса. Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. А.Н. Игнатову за помощь и постоянное внимание к работе; заместителю директора ФГБУ «ВНИИКР», к.б.н. Мазурину Е.С. за полезные советы и оказанную помощь на протяжении всех этапов исследований. Автор искренне признателен сотрудникам лаборатории бактериальных болезней растений ВНИИ фитопатологии РАСХН за предоставленную коллекцию штаммов и растительный материал для проведения исследований; а также сотрудникам ФГБУ «ВНИИКР»: к.с.-х.н. М.Б. Копиной, Г.Н. Матяшовой, С.И. Приходько. 10 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Видовой состав и распространенность возбудителей рода Xanthomonas на растениях семейства Мятликовые Некоторые виды бактерий рода Xanthomonas являются наиболее опасными патогенами растений (Agrios, 2005; Swings, 1993). Xanthomonas spp. вызывают заболевания более чем у 124 однодольных и 268 двудольных растений, принадлежащих к 68 семействам и 240 родам (Hayward, 1993), включая наиболее важные сельскохозяйственные культуры семейств пасленовых (Solanaceae), сложноцветных (Compositae), злаковых (Poaceae), крестоцветных (Brassicaceae) и многих других (Leyns et al., 1984) (приложение 1). Xanthomonas spp. вызывают заболевания различной этиологии, включая некрозы, увядание, гуммозы и паренхиматозные или сосудистые болезни на листьях, плодах и стеблях растений. Симптомы проявления болезней зависят от рода, вида, сорта, возраста растения, условий окружающей среды, а также от генотипа и физиологического состояния фитопатогена (Schaad, 1981; Goto, 1992; Ignatov et al., 1999; Zhao et al., 2000). Бактериозы на зерновых культурах, вызываемые фитопатогенными бактериями рода Xanthomonas, являются одними из самых серьезных и вредоносных заболеваний, передающихся семенами. Одним из наиболее вредоносных видов бактерий рода Xanthomonas является внесенный в Список А1 Перечня ЕОКЗР (Европейская и Средиземноморская организация по карантину и защите растений) вид Xanthomonas oryzae, который включают два отсутствующих в Европе патогена риса – патовариант (pv.) oryzae (BLB) и pv. оryzicola (BLS) (Swings et al., 1990). Эти бактериальные патогены ранее были описаны как патовары типового вида Xanthomonas campestris. Основным растением-хозяином обоих патоваров является рис, который выращивается в нашей стране на Северном Кавказе, в Краснодарском крае на площади 110 тыс. га (здесь хорошие условия затопления и орошения) и в Приморском крае. Рис занимает около 11 45 тыс. га. Данные сельскохозяйственной бактериозы культуры во наиболее многих опасны рисосеющих для данной странах и представляют фитосанитарный риск для региона ЕОКЗР. Они являются отсутствующими вредными организмами для Российской Федерации. Обе бактерии поражают также ряд диких культур семейства Мятликовые (Leersia spp., Leptochloa spp., Oryza spp., Paspalum scrobiculatum, Zizania, Zoysia spp.), включая злаковые сорняки, которые могут служить переносчиками (Li et al., 1985). Данные бактериозы переносятся в свободные от заражения районы с семенным материалом. В связи с расширением торговых отношений и импортом в Российскую Федерацию семян из стран, где данные бактериозы широко распространены, увеличивается опасность их завоза в нашу страну. Впервые бактериальный ожог листьев риса (BLB) обнаружили в Префектуре Фукуока, Япония, в 1884 году (Ou, 1972) (рис.1.1.1). Это заболевание сейчас считается одним из самых серьезных заболеваний риса в мире (Zhao et al., 2007). Болезнь распространена почти во всех рисосеющих странах Азии: Бангладеш, Камбоджа, Китай, Индия, Корея, Малайзия, Мьянма, Лаос, Непал, Пакистан, Филиппины, Шри-Ланка, Тайвань, Таиланд, Вьетнам, Индонезия, Япония; в Африке: Буркина-Фасо, Камерун, Габон, Мали, Нигерия, Сенегал, Того, Мадагаскар; Латинской Америки: Мексика; Австралии (северные территории, Квинсленд); на территории стран Карибского бассейна (Mew et. al., 1993). В конце 80-х года сообщалось о вспышке заболевания в Соединенных Штатах, (Jones et al., 1989), но позднее было установлено, что заболевание не связано с X. oryzae pv. oryzae (RybaWhite et al., 1995). Заболевание распространено в регионе от 45 градусов с.ш. до 30 градусов ю.ш. в различных природных зонах: в экваториальном, субэкваториальном, тропическом и субтропическом поясах, которые не имеют аналогов в нашей стране. Однако, северная граница ареала находится в умеренном муссонном поясе (северо-восточные районы Китая, Япония - 12 острова Хонсю и Кюсю), в зонах переменно-влажных муссонных лесов и высотной поясности с годовым количеством осадков 500-1000 мм/год в Китае, 1000-2000 мм/год - в Японии и до 3000 мм/год - на острове Хонсю. Здесь мягкие зимы - около 0 градусов по Цельсию и теплое влажное лето, что создает хорошие условия для развития бактериоза. При сравнении агроклиматических факторов этих регионов с агроклиматическими факторами на территории нашей страны (Гольцберг И.А., 1972; Конюхова Л.Г. и др., 1971; Селянинов Г.Т., 1937; Сохрина Р.О. и др., 1959) был установлен потенциальный ареал акклиматизации данного бактериоза на территории РФ. В нашей стране на широте 40-47 градусов с.ш. расположены республики Северного Кавказа, Краснодарский и Приморский края, которые по климатическим параметрам могут быть сравнимы с северными районами ареала рассматриваемого вредного организма. Это - основные рисосеющие районы. Основные посевы риса сосредоточены в дельте реки Кубани на засоленных и солонцовых почвах. В Приморском крае климат умеренномуссонный с количеством осадков 500-1000 мм/год с достаточно увлажненным вегетационным периодом, мягкой зимой и теплым летом; Краснодарский край и республики Северного Кавказа (кроме равнинных засушливых районов) также находятся в умеренном поясе с количеством осадков от 500 до 2000 мм/год, мягкой зимой и теплым летом. Эти территории можно считать зонами, подверженными потенциальной опасности интродукции заболевания (Шнейдер, 2006). Бактериальную полосчатость риса (BLS) впервые обнаружили на Филиппинах в 1918 г. (рис. 1.1.1) (Ou, 1972). BLS широко распространена в тропической и субтропической Азии, включая Китай, Таиланд, Малайзия, Индия, Вьетнам, Филиппины и Индонезия, но не встречается в районах с умеренным климатом, таких как Япония и Корея (Awoderu et al., 1991; Moffett and Croft, 1983; Ou, 1985; Sigee, 1993; Singh et al., 1980). Кроме того, в последнее время данная болезнь стала серьезной проблемой в Западной 13 Африке, и достигло масштабов эпидемии в Китае (Notteghem, personal communication). В настоящее время не было данных о распространении данного заболевания в США. Рисунок 1.1.1. Географическое распространение бактериального ожога (BB) и бактериальной полосчатости листьев (BLS) риса. Карта мира. Регионы, где BB и BLS распространены и впервые были обнаружены, но также есть данные о распространении бактериального ожога в Южной Америке. BB был обнаружен в префектуре Фукуока Японии (белая звезда) в 1884 году, BLS на Филиппинах (желтая звезда) в 1918 году (David et al., 2006). Как уже было отмечено, рисосеющие районы нашей страны расположены в зоне умеренного климата на 40-47 градусах с.ш., то есть значительно выше фактического ареала X. oryzae pv. oryzicola. Маловероятно, что рассматриваемый вредный организм сможет акклиматизироваться в более северных широтах, чем его фактический ареал, так как он очень требователен к теплу и влаге (80-90% влажность и температура воздуха 26-30 градусов по Цельсию) в течение вегетационного сезона. В литературе не описано случаев интродукции вредного организма в умеренные широты. Таким образом, рисосеющие зоны нашей страны не могут считаться зонами, подверженными опасности в отношении X. oryzae pv. oryzicola (Шнейдер, 2006). Среди наиболее вредоносных бактерий-возбудителей бактериозов зерновых культур также выделяют бактериальную штриховатость листьев (Bacterial leaf streak, BLS), вызываемую различными патотипами 14 Xanthomonas translucens (Jones, 1917, Vauterin, 1995). Эта болезнь при поражении колоса носит название черный бактериоз (black chaff) и чаще поражает зерновые культуры в странах с влажным и теплым климатом (Duveiller, 1989, 1994, 1997). Существует много специализированных форм этого патогена, различающихся по кругу растений-хозяев, а именно: X. translucens pv.undulosa (патоген пшеницы), X. translucens pv. secalis (патоген ржи), X. translucens pv. hordei (патоген ячменя), но в последнее время их объединяют в один вид X. translucens. В последние годы появились сообщения о переходе данного патогена к поражению других растений вне семейства Мятликовые (Taylor et al., 2005). Информация о заболевании появилась в конце прошлого века; однако, иногда данные были противоречивы, так как симптомы на ранних стадиях часто путают с проявлениями абиотического стресса известного как псевдо черный бактериоз (Broadfoot and Robertson, 1933; Hagborg, 1936). Возбудитель был впервые выявлен на ячмене (Jones et al., 1917), позже на пшенице (Smith et al., 1919), ржи (Reddy et al., 1924), многолетних травах (Wallin, 1946a) и, наконец, на тритикале (Zillinsky and Borlaug, 1971). Бактериальная штриховатость листьев широко распространена по всему миру (Duveiller et al., 1997) (приложение 3). В Северной Америке бактериальная штриховатость листьев была зарегистрирована в нескольких штатах США (Heald, 1906; Jones et al., 1916; Smith, 1917; Johnston, 1929; Melchers, 1930; Milus and Kirkpatrick, 1990; Murray and Malloy, 1990). В последнее время вспышек заболевания в Канаде не наблюдалось (Hagborg, 1934; 1968; 1974). В Мексике болезнь была зарегистрирована на северовостоке в 1931 (Bamberg, 1936) и на сегодняшний день отмечена в районе умеренного и влажного центрального нагорья Толука (2650м над уровнем моря) (Duveiller, 1989). В Южной Америке, черный бактериоз чаще всего встречается на пшенице, хотя также его отмечали на злаковых сорняках (Mehta, 1990; Duveiller et al., 1991). Болезнь также встречается в Аргентине, Боливии, частично в Бразилии, Парагвае, Перу и Уругвае (Mehta, 1990; 15 Duveiller, 1989; Pereira et al., 1983; Luzzardi et al., 1983; Mohan and Mehta, 1985; Duveiller et al., 1991; Frommel, 1986; Tessi, 1949; Abadie, 1988). В Азии, болезнь была отмечена на пшенице в Китае (Chen and Ding, 1981; Sun and He, 1986), Пакистане (Akhtar and Aslam, 1985 and 1986) и Иране (Alizadeh and Rahimian, 1989; Alizadeh et al., 1995); и на тритикале в Индии (Richardson and Waller, 1974). На Ближнем и Среднем Востоке, патоген поражает твердые сорта пшеницы на орошаемых землях Сирии (Mamluk et al., 1990), Израиля (CIMMYT, 1977) и Турции (Sands and Fourest, 1989; Demir and Üstün, 1992). В Европе первые сообщения о черном бактериозе были получены из Франции, Бельгии и России (Millasseau, 1928; Hocquette, 1929; Marchal, 1930 и 1932, Горленко и др., 1939). Тем не менее, позже Маршаль Е. (1948) отрицал, что черный бактериоз был отмечен в Бельгии. В 1960 году Горленко В.М. отметил появление X. translucens and X. secalis в Омской области (Россия), также очаги отмечались в Красноярске (Добрецов, 1963) и Новосибирской области (Бушкова, 1966). Черный бактериоз распространен во всех регионах Российской Федерации, где культивируют пшеницу, и считается наиболее вредоносным бактериозом этой культуры. В настоящее время болезнь отсутствует в Западной Европе (Paul and Smith, 1989), вероятно, из-за неблагоприятных условий окружающей среды, в частности, низких температур. Тем не менее, встречаются периодические вспышки заболевания на ячмене в Испании (Noval, 1989), на тритикале и пшенице в Польше, что указывает на то, что риск эпифитотии в Западной Европе не следует недооценивать. В Африке, бактериальная штриховатость листьев была обнаружена в Кении (Burton, 1930), Эфиопии (Korobko et al., 1985), Южной Африке (Vervoerd, 1930; Smit and Van A, Bredenkamp, 1988), Танзании (Bradbury, 1986), Ливии и на Мадагаскаре (Bragard et al., 1995) и Марокко (Sands and Fourest, 1989). 16 В Австралии заболевание было зарегистрировано на пшенице и ржи (Moffett, 1983) в Новом Южном Уэльсе (Noble, 1935). Сотрудниками ВНИИ фитопатологии в 2001-2008 гг. впервые был выделен и изучен новый для Российской Федерации патоген Xanthomonas arboricola, вызывающий поражение пшеницы, ржи, ячменя, овса, подсолнечника и крестоцветных культур (Игнатов и др., 2010). Данный возбудитель стал главной причиной низкого урожая подсолнечника в Ростовской области в 2011 году. Из-за Xanthomonas arboricola средняя урожайность культуры составила 8-9 ц/га (при обычном урожае 24-28 ц/га) (Харченко, 2012). Бактериальная пятнистость, вызываемая патогеном Xanthomonas arboricola, является наиболее вредоносным заболеванием растений таких семейств, как молочайные, розоцветные, березовые, ореховые, ивовые и банановые. X. arboricola pv. pruni вызывает бактериальные пятнистости косточковых культур рода Prunus, как культурных и декоративных, так и дикорастущих. Симптомы данного заболевания проявляются на листьях, почках, ветвях и фруктах растений (EPPO, 1997). Бактериальная пятнистость впервые была зарегистрирована в Северной Америке (Мичиган) на японской сливе (P. salicina) в 1903г. (Smith, 1903). В настоящее время болезнь зафиксирована во многих европейских странах, где произрастают косточковые культуры рода Prunus spp: Италии, Словении, Франции. Если вначале XX в. бактериальные пятнистости, вызванные X. arboricola pv. pruni, были широко распространены преимущественно в южных регионах, то в последнее время, бактерии данного вида стали поражать культуры и в странах умеренного климата (Венгрия, Швейцария) (EPPO, 1997). Впервые бактериоз сливовых был обнаружен в центральной части России в конце 1970-х гг.. (EPPO, 1997). 17 X. arboricola pv. juglandis - возбудитель бактериального рака, вызывает поражения ветвей, листьев и плодов грецкого ореха (Juglans regia L.) (Scortichini et al., 2001). Патовариант X. arboricola pv. corylina является патогеном ломбардского ореха, фундука, лещины понтийской и лещины древовидной. X. arboricola pv. corylina внесен в Список А2 Перечня ЕОКЗР (ОЕРР/ЕРРО, 1986). Заболевание впервые было зарегистрировано в 1903 г. в США (Орегон) (Barss, 1913). Позже было также зафиксировано в Югославии (Sutic, 1956), Италии (Noviello, 1969), Турции (Alay et al., 1973), России (Koval, 1978), Франции (Prunier et al., 1976), Великобритании (Locke and Barnes, 1979), Австралии (Wimalajeewa and Washington, 1980) и в Чили (Guerrero and Lobos, 1987). Бактериозы растений, вызываемые фитопатогенными бактриями X. arboricola pv. pruni, X. arboricola pv. corylina, X. arboricola pv. juglandis и X. arboricola pv. populi ранее были зарегистрированы в России (CMI, 1987), но их распространение и возбудители заболеваний не изучались. Известно, что X. arboricola pv. celebensis может находиться как патоген или эпифит на растениях и семенах овса, пшеницы, ржи, ячменя, кукурузы, сахарной свеклы, подсолнечника, моркови, льна, люцерны, крестоцветных растений (PQS, 2008), а X. arboricola pv. juglandis при искусственном заражении способна поражать растения семейства Brassicaceae (Dye, 1968). Штаммы этого вида можно отличить от других представителей рода Xanthomonas молекулярно-генетическими методами или оценкой спектра поражаемых ими растений. Ключевой диагностический физиологический признак этого вида – утилизация хинной кислоты, одного из предшественников в биохимическом цикле синтеза фитоалексинов растений. Бактерия выживает и размножается как эпифит на поверхности листьев и побегов, проникает в растение через устьица и гидатоды и далее распространяется по побегам. Вероятно, бактерия также переносится с пыльцой при опылении. Пораженные почки служат главным источником 18 инфекции весной. На опавших листьях патоген выживает не более 4 месяцев и обычно не перезимовывает. На старых побегах бактерия вызывает гибель почек, а также пятнистость на листьях. Штаммы, принадлежащие к виду Xanthomonas arboricola, вызывают бактериозы злаков, преимущественно ячменя, и в меньшей степени – пшеницы, ржи и овса, часто сохраняя способность поражать растения грецкого ореха, фундука, тополя или груши. Симптомы заболеваний, вызываемые Xanthomonas arboricola, не отличались от симптомов, причиняемых другими видами рода Xanthomonas, специализирующимися на тех же растениях-хозяевах (Игнатов и др., 2010). 1.2. Биологические особенности возбудителей бактериальных заболеваний злаковых культур 1.2.1 Культурально-морфологические свойства возбудителей Бактерии рода Xanthomonas: Тип: Bacteria; Группа: Proteobacteria; Класс: Gammaproteobacteria; Порядок: Xanthomonadales; Семейство: Xanthomonadaceae Типовым представителем рода Xanthomonas является вид X. campestris (Pammel, 1895; Dowson, 1939). Синонимы: Bacterium campestre, Bacillus campestris (Pammel, 1895), Phytomonas campestris (Pammel, 1895; Bergey et al., 1984), Pseudomonas campestris (Pammel, 1895; Smith, 1897), Бактерии рода Xanthomonas – грамотрицательные, неспороносные палочки 0.4-0.7 x 0.7-1.8 мкм; с одним полярным жгутиком. Оптимальная температура размножения 25-30°С. Морфологическая неоднородность клеток может быть следствием изменения режима культивирования бактерий. 19 Облигатные аэробы. Хемоорганоторфы 1984). (Bergey, Многие представители являются патогенами растений (Hayward, 1993). Имеются обширные и, в ряде случаев, противоречивые данные о сохранении жизнеспособности и распространении Xanthomonas spp. в почве, ризосфере, воде, в насекомых, в филлоплане растений, на поверхности водорослей, грибов и простейших животных (Nyvall, 1999). Почва не представляет большой опасности как источник инфекции. Фитопатогенные бактерии быстро погибают, попадая в почву под воздействием микробов-антагонистов. До полного разложения бактерии сохраняются в растительных остатках - от 60 дней до двух лет, в зависимости от температуры и влажности почвы (Strandberg, 1973; Kocks and Zadocks, 1996; Ruissen et al., 1989; Dzalilov, 1995). Бактерии Xanthomonas spp. могут выживать в нестерильной почве до 43 дней зимой и 14 дней летом. Чем ниже температуры почвы и выше влажность, тем выживаемость бактерий выше (Santiranjan et al., 1986). Бактерии рода Xanthomonas способны сохрянять свою жизнеспособность в воде. Концентрация фитопатогенных бактерий в нестерильной воде со временем уменьшается, в стерильной воде они способны сохранять свою жизнеспособность до 15 лет (Игнатов, 2006). Caroline L. Monteil из Французского Национального института сельскохозяйственных ресурсов сообщила, что сотрудникам института удалось выделить штаммы фитопатогенных бактерий, в том числе Xanthomonas campestris, Xanthomonas arboricola из дождевых капель (личное сообщение). Воздух - среда, куда бактерии систематически попадают вместе с дождем, мелкокапельными туманами, пылью из почвы, с растительности и из водоемов (Hunter et al., 1975). Семена являются одним из важнейших источников заражения. Как правило, бактерии находятся на поверхности семян и при прорастании могут заражать всходы через гидатоды и устьица семядольных листьев или 20 повреждения первичного корня, а затем передвигаться в растения по проводящим сосудам и заражать в период вегетации взрослые растения. Зараженные семена переносят бактериальную инфекцию в районы, где ее раньше не было (Russel, 1898; Randhawa and Schaad, 1984; Schultz and Gabrielson, 1986). 1.2.2 Симптомы проявления бактериозов В настоящее время существует серьезная недооценка вредоносности бактериальных заболеваний сельскохозяйственных культур, в том числе и зерновых колосовых. В полевых условиях их внешние признаки могут маскироваться либо проявлением голодания растений (из-за дефицита какого-либо минерального элемента), либо симптомами вирусных или грибных инфекций. При поражении растений бактериозами часто возникают симптомы, напоминающие азотное, магниевое голодания или нехватку железа. На зерновых колосовых в фазе кущения возникают симптомы фосфорного голодания, которые проявляются в виде засыхания части листовой пластинки. В этом случае внесение тех или иных удобрений не даст никакого эффекта. Косвенные признаки заражения бактериальными болезнями злаковых культур: – Мозаичность полей, как при недостатке и неравномерном внесении элементов минерального питания. – Плохая морозостойкость растений. Без явных причин гибель растений в осенне-весенний период (особо подвержены этому посевы озимого ячменя). – Сильное ослабление растений при весенних заморозках. – Щуплое зерно, иногда с чёрным зародышем. – Плохое развитие вторичной корневой системы, что делает растения крайне уязвимыми к засухе и недостатку питания. – Засыхание кончиков листьев зерновых на стадии кущения. Это может проявляться и осенью и весной. 21 – Специфическая желтизна посевов, связанная с разрушением хлорофилла. – Синдром жёлтого флагового листа, при зеленых листьях нижних ярусов. – Слабое действие фунгицидных препаратов, иногда после временного улучшения вида растений после обработки, происходит ухудшение (это происходит тогда, когда системный препарат уничтожает грибной компонент инфекции, который заменяется бактериальным, на последний фунгицид не действует). – Понижение, а не повышение качества зерна при хранении (падение содержания клейковины). – Снижение хлебопекарных качеств муки, изготовленной из заражённого зерна. – Снижение расчетной динамики получения прибавки веса птицы, поросят и телят. В 2008-2010 гг. выявлено эпифитотийное распространение бактериальных болезней на посевах зерновых колосовых культур на Юге России, Украине, и других странах, что привело к падению урожайности. Бактериозы снижают урожайность за счет уменьшения кустистости, длины колоса и его озерненности, массы 1000 семян, содержания хлорофилла (Харченко, 2011). Основными причинами увеличения вредоносности бактериозов на основных сельскохозяйственных культурах в последние годы являются: -появление новых, более агрессивных видов и групп фитопатогенных бактерий, -изменение климатических условий, -нарушение технологий выращивания, уборки и хранения собранных семян, -отсутствие своевременной и достоверной диагностики возбудителей болезней (Игнатов, 2012). Вредоносность бактерий рода Xanthomonas известна повсеместно, так как они являются патогенами важных сельскохозяйственных, декоративных культур и дикорастущих растений (Williams, 1980). Заболевания, 22 вызываемые данными патогенами, снижают количество и качество урожая сельскохозяйственных культур и вызывают гибель растений (Mihail et al., 1993; Leite 1994; Swings et al., 1993). Бактерии распространяются с растительным материалом и семенами по всему миру, вызывая значительные экономические убытки. По данным FAO, потери урожая в сельском хозяйстве насчитывают 75 млрд. долларов ежегодно, из них от бактериальных болезней - 25 млрд. долларов, что составляет примерно 30% от потерь урожая по всему миру (FAO, 2006). Бактериальный ожог риса – наиболее вредоносное заболевание риса в Юго-Восточной Азии, особенно для широко распространенных низкорослых высокоурожайных сортов (Ray et al., 1970; Feakin, 1971). Бактерии проникают через гидатоды, устьица или поранения на корнях и листьях. Внутри сосудистой системы бактерии размножаются и продвигаются в обоих направлениях. Распространение происходит ветром и дождем, но преимущественно водой при орошении и при наводнениях (Nayak, 1985). Главными источниками бактериоза является зараженный растительный материал, растения-самосев риса, зараженная солома и хозяева-сорняки, хотя точная роль этих источников в природе не ясна. Сообщения о жизнеспособности бактерий весьма противоречивы. Существует много различных рас, или патотипов бактерий, различающихся своим поведением на различных сортах (Mew, 1987). Легко появляются новые расы, и бактерии очень вариабельны по вирулентности. Бактериальный ожог риса встречается в трех формах: листовой, “крезек” (увядание) и пожелтение. В случае листовой формы на концах и по краям листьев, а также вдоль центральной жилки растений риса через 3-4 недели после высадки появляются зеленые или серо-зеленые водянистые штрихи, со временем сливающиеся в желтовато-белые полосы, при этом край листа становится волнистым (рис.1.2.1а). При сильном поражении весь лист становится беловатым или сероватым и затем отмирает (Ou, 1972). На 23 пораженных листьях могут выступать капли экссудата желтого цвета (приложение 2). При сильном поражении рисовое поле приобретает желтовато-белый, а позже серовато-белый цвет из-за развития на пораженных растениях сапрофитных грибов. Поражаться могут как отдельные листья, так и все растение. У более чувствительных сортов могут поражаться листовые влагалища и соломины. При сильном поражении растения может наблюдаться пустозерность метелок риса. а б Рисунок 1.2.1. Листья риса, пораженные патоварами X. Oryzae. (а) – Лист со светлыми водянистыми пятнами вдоль срединной жилки, в результате проникновения X. Oryzae pv.oryzae через гидатоды в сосуды ксилемы. (б) Лист риса со светлыми штрихами, в результате проникновения через устьице в паренхимную ткань X. Oryzae pv. oryzicola (Mew, 1992) Системное заражение, известное как форма “крезек”, наиболее вредоносно (Reddy, 1984). Оно проявляется в увядании растений риса в возрасте от 1 до 6 недель после пересадки и их гибели в связи с закупоркой сосудов растения бактериальной массой. Больные стебли нередко ломаются от ветра, при сильном заражении могут полегать целые плантации. Форма пожелтения отмечается при позднем заражении на листьях созревающих растений, причем заболевание поражает, только молодые листья. В этой стадии болезнь трудно отличить от бактериальной полосатости риса. 24 Отличительным признаком бактериального ожога от физиологического нарушения, сопровождающегося пожелтением листьев, является выделение вязкой жидкости желтого цвета (экссудата) при срезе пораженного листа или растения. В странах тропической Азии потери от бактериального ожога риса достигают в зависимости от сорта от 60 до 81% урожая, в странах умеренного климата - до 30% (Ou, 1972). На Филиппинах потери составляют до 22,5% во влажные сезоны и до 7,2% - в сухие на чувствительных сортах, и 9,5 и 1,8% соответственно на устойчивых (Ou, 1985; Reddy et al., 1979). Азотное питание, как считают, увеличивает чувствительность растений. Потери обычно менее значимы на менее плодородных почвах и на урожаях, выращиваемых в летнее время (декабрь - апрель). Культуры, посаженные осенью (май - сентябрь) и зимой (июль - декабрь), испытывают более значительные потери. Больные растения содержат высокий процент пустых зерен (Ou, 1985; Reddy et al., 1979). Бактериальный ожог риса представляет серьезную угрозу для региона ЕОКЗР. Xanthomonas oryzae pv. oryzae – один из наиболее важных объектов в Списке А1 Перечня карантинных объектов для европейских стран. Есть сведения, что заболевание было зарегистрировано на территории бывшего СССР (Краснодарском и Приморском краях, Узбекской и Казахской ССР, Дагестанской АССР, на Украине в Крымской, Одесской и Херсонской областях, на Дальнем Востоке), но точного подтверждения не было (EPPO/CABI, 1997). Важными факторами для развития болезни являются климатические, почвенные условия и агротехнология рисоводства. Наиболее благоприятными для развития бактериоза являются районы с кислой почвой и высоким уровнем грунтовых вод. Повышенная температура (24-30) и до 200 мм осадков в месяц, дефицит фосфора, калия, а также высокий уровень азота благоприятно действуют на развитие болезни и способствуют быстрому распространению бактериального ожога риса. 25 В основном бактериальная полосчатость риса - менее значимое заболевание, чем бактериальный ожог риса. Вредоносность бактериальной полосатости риса гораздо ниже, чем ожога, однако в очень влажные сезоны при использовании высоких норм азота в Индии потери достигали 5-30% урожая. Бактерии проникают в лист через устьица или поранения. Распространение в поле происходит при механическом контакте с дождевой или ирригационной водой. Роль семян в переносе и сохранении бактерий известна, но роль сорных растений мало изучена. Бактерии могут сохраняться от сезона к сезону на зараженных листьях или их остатках, но не могут выжить в нестерильной почве (Devadath, 1970). Не описано различных рас или различной специфичности бактерий. X. oryzae pv.oryzicola вызывает появление на листьях между жилками узких темно-зеленых водянистых штрихов различной длины, которые с развитием болезни удлиняются, распространяясь по всей длине листа параллельно жилкам (рис.1.2.1б). Постепенно повреждения расширяются и могут сливаться, цвет меняется от оранжево-желтых до коричневых, в зависимости от сорта. На поверхности листьев может выступать экссудат. На последней стадии развития обе болезни трудно различить между собой, но главным отличительным признаком болезней является внешний вид повреждений. При бактериальном ожоге края листьев бывают волнистыми, в отличие от прямых краев при бактериальной полосчатости риса. Кроме того, возбудитель бактериального ожога риса поражает в основном сосудистую систему и листовые влагалища, а возбудитель бактериальной полосчатости риса - паренхимные ткани листа. Заражение бактериальной штриховатостью листьев, вызываемое X. translucens, происходит в разных условиях: на орошаемых полях в умеренном климате, при большом количестве осадков в субтропическом высокогорье, а также при часто изменяющемся температурном режиме ирезком перепаде температур. 26 Бактерии передаются через семена. Скорость передачи довольно низкая, но при оптимальных условиях является первооисточником серьезных вспышек. Распространение происходит ветром и дождем, а также при контакте здорового растения с больным (Boosalis, 1952). Бактерии могут сохранять жизнеспособность в семенах более 36 месяцев. Опыты показали (Sands et al., 1986), что растения во влажных условиях сильнее подвержены заражению. Бактерии сохраняют свою жизнеспособность в диапазоне температур от 15 до 300С (Duveiller et al., 1991), оптимальной является температура около 220С. Распространению патогена благоприятствует высокая относительная влажность. Бактериоз поражает листья, стебли и колосья. На первой стадии болезни на листьях появляются маленькие продолговатые водянистые, просвечивающиеся пятна светло-зеленого цвета. Затем эти пятна разрастаются и меняют окраску от желтой до коричневой (даже черной). На пятнах выступает клейкая слизь (экссудат). При высыхании экссудата образуется желтоватая пленка (рис.1.2.2а, б). При сильном поражении листья могут отмирать. На стеблях образуются черные или коричневые полосы, под колосом может возникнуть сплошное побурение. На колосьях отмечают почернение верхней части чешуй. Позднее появляются коричневые боковые полосы вдоль чешуй (рис.1.2.2в). Сильно пораженные растения не выколашиваются. Больные растения дают только щуплое зерно, на котором заметны желтые полосы (Sands and Fourest, 1989). У некоторых растений колос вообще может отсутствовать. При поражении грибной инфекцией, вызывающей схожие симптомы, нет резкой границы в изменении цвета больной ткани, а пигментация захватывает также и цветочные пленки. При бактериозе на стебле под узлами образуются темно-коричневые (даже черные) продольные полосы, в ряде случаев охватывающие всю соломину под колосом. Бактерии заполняют межклеточное пространство, сосудистые пучки, ткань паренхимы и даже флоэмы, вызывая их разрушение (это можно заметить на срезе стебля больного растения). Почернение 27 растительных тканей происходит в результате действия выделяемого патогеном фермента тирозиназы. Наибольшую вредоносность заболевания отмечают во время налива зерна при высокой влажности и температуре, что приводит к серьезному недобору урожая. При позднем проявлении бактериоза растения успевают завершить развитие и дать урожай, и болезнь не наносит значительного ущерба. При наличии скрытой формы инфекции патоген может переходить из года в год без проявления характерных внешних симптомов, но при благоприятных для возбудителя бактериоза погодных условиях из такого латентно-инфицированного семенного материала могут развиваться больные растения. В семенах пшеницы, при благоприятных условиях их хранения, патоген может сохраняться более 5 лет (Foster, Schaad, 1990). Другой источник инфекции – пораженные растительные остатки, в которых возбудитель болезни сохраняется длительное время. Точная оценка экономических потерь урожая от болезни затруднена ввиду отсутствия эффективного контроля. Но известно, что при 50 % поражении листовой поверхности флагового листа пшеницы они могут достигать 13–34 % (в зависимости от восприимчивости сорта и климатических условий). Масса зерна при 50 % поражении в молочную и восковую спелость зерна снижалась на 8–13 %, а при 100 % – на 23–34 % (Duveiller, 1994). X. translucens достаточно широко распространен в странах Европы и находится в Списке А2 Перечня карантинных объектов для европейских стран (EPPO/CABI Quarantine Pests for Europe, 1997). 28 а А в Б б Рисунок 1.2.2. Симптомы черного бактериоза: а, б - коричневые, водянистые пятна на листе, в - блестящие коричневые полосы на чешуйках и остях (McMullen, 2011) В 2008–2009 гг. штаммы, принадлежащие к виду X. arboricola (Vauterin et al., 1995), стали причиной заболеваний подсолнечника в некоторых районах Краснодарского края и Ростовской области. Частота встречаемости бактериальной гнили на отдельных полях достигала 80 %. Аналогичная картина была и на посевах данной культуры в пригородных хозяйствах г. Краснодара и в Брюховецком районе Краснодарского края. Вредоносность болезни заключается в частичной гибели всходов (то есть, изреженности посевов), проявлении преждевременного созревания растений (или корзинки), что приводит к легковесности семян, снижению высоты, диаметра стебля и корзинки. Кроме того, легковесные семена не теряют всхожести и при уборке выдуваются комбайном на почву, а затем прорастают в виде 29 падалицы, нанося ущерб последующей культуре (чаще озимой пшенице) (Котляров, 2010) 1.3.Методы диагностики фитопатогенных бактерий Среднегодовые потери урожая от бактериальных болезней составляет около 25% (FAO, 2010). Поэтому, ранняя диагностика бактериального заражения посадочного материала и семян является ключевым способом снижения вредоносности заболеваний, так как отсутствуют эффективные химические и агротехнические меры борьбы с бактериозами, а также устойчивые сорта и гибриды. А также своевременная диагностика возбудителей бактериозов имеет основополагающее значение для борьбы и предотвращения распространения этих возбудителей в условиях увеличения торговли между странами (Louws, 1995; Gabriel et al, 1989). Традиционно диагностика бактерий рода Xanthomonas проводилась методами культивирования на селективных питательных средах, искусственного заражения здоровых и методами микроскопического анализа (Gitaitis et al, 1987; Shaad, 1988; Lopez et al, 2006). Но данные методы не позволяют отличать эпифитные формы Xanthomonas spp. от патогенных видов, которые не отличаются между собой по бихимическим показателям и строению (Gitaitis et al., 1987), поэтому они не подходят для диагностики. Предварительно диагностировать бактериоз можно при визуальном обследовании растений и поиске симптомов заболевания, что в дальнейшем подтверждается выделением патогена в чистую культуру и проведением серологического анализа (Alvarez et al., 1985). Окончательное подтверждение требует обязательную инокуляцию восприимчивого тест-растения (Roberts and Koenraadt, 2002). Существует несколько способов проведения тестов на патогенность: заражение растений с поранением (методы: укола, инъекцийинфильтраций, заражения с применением карборунда); а также заражение растений без предварительного поранения (заражение почвы, семян, корней, рассады, опрыскивание растений бактериальной суспензией) (Бельтюкова и 30 др., 1968). Данные методы длительные (~2 недели) и не подходят для быстрого подтверждения результата анализа. При диагностике фенотипическое описание микроорганизмов дополняется перечнем основных физиолого-биохимических признаков, включая отношение к кислороду; способ получения энергии; зависимость роста от температуры и pH; места обитания; наличие симбиотических или паразитических взаимоотношений; используемые питательные вещества; серологическую дифференциацию; чувствительность к антибиотикам (Mooter and Swings, 1990; Shaad et al., 2002). Данный метод остается весьма трудоемким. В эпидемиологической практике широко применяются серологические методы для диагностики возбудителя инфекции на уровне подвида и ниже. Метод серотипирования основан на реакции преципитации (образование осадка) между специфичными антителами и белками (антигенами) возбудителя заболевания (Биргер, 1982). Набор моноклональных антител, разработанный в конце 1980-х широко используется для диагностики и различия некоторых видов рода Xanthomonas (Alvarez et al., 2004; Benedict et al., 1989; Bouzar et al., 1994). Чувствительность иммуноферментного анализа (ELISA) ограничена в пределах 106 кл/мл. Коммерческие наборы для Xanthomonas spp. часто дают ложноположительные результаты, так как в их основе – поликлональные антитела. Важным показателем является то, что с помощью этого метода нельзя отличить живые клетки от мертвых (Reddy and Reddy, 1989), а также невозможно определить латентные инфекции (Биргер, 1982). Вопросы эффективной идентификации видов микроорганизмов, а также изучения их филогенетических отношений вызывали интерес на всем протяжении развития биологической науки. Возможность отличать представителей близких видов друг от друга может быть осложнена высоким полиморфизмом внутри каждого из видов, или напротив высоким 31 межвидовым физиологическим сходством. В то же время важность данной процедуры не вызывает сомнений. Появление и внедрение в фитопатологию молекулярных методов стало значительным событием, так как оно радикально расширило возможности изучения возбудителей болезней, усовершенствовало диагностику и привело к возникновению новых методов исследования (Гагкаева и др., 2005). В последние десятилетия развитие молекулярных методов дало возможность применять молекулярные маркеры для видоидентификации и филогенетических исследований. Конечно, данные методы не могут полностью вытеснить классические подходы, но способны эффективно их дополнить. В основе молекулярных подходов лежит предположение, согласно которому степень родства между живыми организмами коррелирует с уровнем сходства в гомологичных последовательностях нуклеиновых кислот и белков (Матвеева, 2011). Молекулярные методы диагностики, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), являются наиболее распространёнными и сочетают в себе высокую чувствительность и специфичность (Cooke et al., 2007; Koprivica et al., 2009). Они основаны на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям (ограничен последовательностями, комплиментарными праймерам), и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце (Вартапетян, 1991). Исследования и публикации в области диагностики последние десять лет основаны на развитии ПЦР протоколов. На данный момент для бактерий рода Xanthomonas опубликовано более 50 протоколов. Одним из преимуществ ПЦР - диагностики является небольшое количество исследуемого материала, возбудителя, даже в латентном состоянии. необходимое для выявления 32 Для диагностики бактерий, которые требуют таксономической принадлежности к роду Xanthomonas подтверждения spp. обычно используют праймерные системы на основе гена 16S рРНК, который широко применяется для таксономической идентификации рода бактерий (Hauben et al., 1997; Moore et al., 1997). Наряду с геном 16S рРНК для таксономических изучений и идентификации бактерий применяется нуклеотидная последовательность 16S-23S рРНК внутреннего транскрибируемого межгенного региона (ITS) рибосомального оперона. Известно, что данный регион изменяется, примерно, до 10 раз быстрее гена 16S рРНК и позволяет изучать филогенетические связи на уровне вида бактерий (Пунина и др., 2008). Последовательность генов Хсс0006 и Хсс0007 обладают высокой видоспецифичностью, что было отмечено в работе Цыганковой С. В. (2004). Эти два функционально важных гена имеют вариабельный межгенный регион, выполняющие, вероятно, функцию промотора или регулятора транскрипции для региона Xcc0007-TonB (Пунина и др., 2009). На основе данного региона были созданы специфические для рода Xanthomonas праймерные системы. Ген gyrB был предложен в качестве диагностического маркера на родовом и видовом уровне, а также филогенетического маркера классификации и идентификации бактерий (Yamomoto et al., 1996; Yamomoto et al., 1999). На основе гена gyrase B (gyrB) (Parkinson et al., 2007), можно определить виды: X. fragariae , X. oryzae , X. vesicatoria , X. gardneri и три патовара X. translucens (X. translucens pvs. translucens, undulosa, cerealis), и несколько видов, которые представляют сложные группы видовкластеры: X. axonopodis , Х. citri и X. alfalfae . Метод мультилокусного генотипирования (Multilocus Sequence Typing / Analysis MLST/MLSA) позволил качественно улучшить диагностику и идентификацию бактериальных штаммов. В 1998 г. был предложен метод MLST в качестве доступного, универсального и подходящего метода для 33 диагностики бактерий (Maiden et al., 1998). MLST анализ был проведен для таких родов бактерий как Xanthomonas (Young et al, 2008; Schuenzel et al, не опубликовано), Xylella fastidiosa (Scally, 2005), Pseudomonas (Frapolli et al, 2007). Fargierand и Manceau (2006) исследовали 6 генов «домашнего хозяйства» (atpD, dnaK, glnA, gyrB, rpoD, tpiA) и структурный ген fyuA для дифференциации Xanthomonas. Мультилокусный анализ последовательностей всех известных опубликованных штаммов Xanthomonas (119 штаммов) был проведен с использованием четырех генов: dnaK, fyuA, gyrB и rpoD. последовательности гена были амплифицированы Все четыре для штаммов X. arboricola, X. axonopodis, X. bromi, X. campestris, X. cassavae, X. codiaei, X. cucurbitae, X. fragariae, X. hortorum, X. melonis, X. oryzae, X. pisi, X. populi, X. vasicola и X. vesicatoria. Все попытки использовать данные праймеры для амплификации генов dnaK and fyuA для X. albilineans, X. hyacinthi, X. sacchari, X. theicola и X. translucens оказались неудачными (Young et al., 2008). Преимуществом метода мультилокусного секвенирования является простота, воспроизводимость, аллельные профили можно легко сравнивать с последовательностями в базе данных (Urwin, 2003). Недостатком является высокая стоимость. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas подразделяются на >24 видов и >150 патовариантов, отличающихся по вирулентности к растениюхозяину и симптомам вызываемых болезней (Schaad et al., 2000; 2006). Ряд видов бактерий рода Xanthomonas достоверно разделяются по последовательности генов 16S-23S рРНК, gyrB, cytP450, hrpF, hrpC, и других. В то же время, большинство патовариантов и некоторые виды рода Xanthomonas не различимы от ближайших родственных групп по известным биохимическим и молекулярным признакам. Одним из методов 34 предварительного сравнения сходства геномной ДНК бактерий является метод ДНК-фингерпринта - AFLP. AFLP (или AFLP-PCR — Amplified Fragment Length Polymorphism PCR — полиморфизм длин амплифицированных фрагментов) — подход, разработан для ДНК-фингерпринтинга в начале 90-х годов ХХ века (Zabeau, Vos, 1993). В ходе процедуры AFLP проводят рестрикцию геномной ДНК двумя рестриктазами, далее лигируют два варианта адаптеров к продуктам рестрикции. После этого полученные фрагменты амплифицируют с использованием праймеров, один из которых радиоактивно, или флуоресцентно мечен. Каждый из праймеров комплементарен одному из адаптеров, последовательности рестрикционного сайта, а также содержит еще несколько произвольных нуклеотидов на 3’ конце. Амплифицированные фрагменты могут быть визуализированы после электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Достоинством метода является достаточно широкий спектр фрагментов ДНК, подлежащих анализу в результате эксперимента. При этом доля полиморфных фрагментов является существенной (Сулимова, 2004; Календарь, Глазко, 2004). В настоящее время широкое распространение получил метод мультиплексной ПЦР. Метод чувствительный и позволяет диагностировать смесь ДНК различных патогенов, находящихся на растении, в одной пробирке. Сложность в создании совместимых систем праймеров и подбор условий проведения реакции в «одной пробирке» является существенным недостатком (Johnson, 2000; Lopez et al, 2003). В настоящее время на смену визуальной оценке результатов ПЦР методом детекции электрофореза продуктов уверенно приходят амплификации. флуоресцентные Получать и методы интерпретировать результаты ПЦР становится быстрее, проще и надежнее. Одним из флуоресцентных методов является метод ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR). В основе метода лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе 35 амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или (http://www.lytech.ru). Обнаружение и проведении ПЦР «в реальном времени» крышку закрытой дифференциация пробирки. видов при основаны на использовании различных флуоресцентных красителей для каждого вида. Количество целевых видов, определяемых за одну амплификацию в режиме реального времени, как правило, ограничивается числом доступных красителей (Ребриков, 2009). В связи с интенсивным распространением бактериальных болезней на посевах зерновых в последнее время, важную роль играет надежная, чувствительная и своевременная диагностика, которая быстрому принятию фитосанитарных мер и способствует предотвращению распространения этих фитопатогенов. Применение методов на основе ПЦР для диагностики бактериозов имеет большое значение для решения многих проблем научной и практической бактериологии. Следует отметить, что применение метода ПЦР не исключает, а дополняет традиционные методы, используемые в фитосанитарной диагностике. Совмещение классических и современных методов исследования фитопатогенов способствует получению более достоверных и надежных результатов. 1.4. Методы защиты от возбудителей бактериозов на злаковых культурах Бактериальные болезни на посевах зерновых колосовых культур снижают урожай зерна и его качество (Котляров, 2011). Для защиты от наиболее вредоносных бактериальных заболеваний пшеницы и ячменя, вызываемых бактериями рода Pseudomonas и Xanthomonas, используются три разрешенных в России препарата: два химических препарата для протравливания семян – Витарос и ТМТД (на основе тирама), а также антибиотик Фитолавин 300. По мнению некоторых 36 ученых, Фитолавин 300 (фитобактериомицин - комплекс стрептотрициновых антибиотиков) – единственный эффективный препарат для защиты ряда культур от возбудителей бактериозов (Котляров, 2006, Котляров, 2011, Литвиненко, 2011). Антибиотик Фитолавин-300 разрешен к применению на озимой пшенице и озимом ячмене. Наибольшая эффективность препарата достигается при опрыскивании растений в фазе начала выхода колоса в трубку. При обработке семян препарат снижает инфицированность растений, повышает урожайность и значительно улучшает качество зерна. В борьбе с возбудителями бактериальных заболеваний зерновых культур эффективны некоторые антибиотики и антибактериальные препараты. В полевых опытах получены положительные результаты действия антибиотика касумина, синтетического полимера катапола и его форм на фитопатогенные бактерии родов Erwinia, Pseudomonas, Xanthomоnas, Clavibacter (Пасичник и др., 2011). По данным Пасичник Л.А. (2011) биологический фунгицид Микосан В, а также препараты Пенкоцеб, Татту, Ридомил Голд, Ацидан и Чемпион проявляют антибактериальную активность в отношении в рекомендованной, дозе и могут быть рекомендованы для использования против возбудителей бактериальных болезней на зерновых культурах. Также в борьбе с возбудителями бактериальных заболеваний зерновых культур важное значение имеют агротехнические мероприятия. Чтобы усилить защитные реакции растений, необходимо создать условия, оптимальные для их роста (особенно связанные с их перезимовкой) и неблагоприятные для жизнедеятельности возбудителей бактериозов. В частности, проводить предпосевные мероприятия, обработку растений в период вегетации, соблюдать условия хранения урожая. Так как фитопатогенные бактерии передаются через посевной материал, нужно заблаговременно проверять семена на наличие возбудителей заболевания и для посева использовать только здоровое полноценное зерно. 37 Биологизация земледелия включающая мероприятия по повышению биологической активности почвы, внесение органических удобрений, а также обработка пожнивных остатков микробными препаратами с функцией подавления патогенов как грибной, так и бактериальной природы, также способствует ограничению развития бактериозов в посевах. Глубокое чизелевание почвы – до 45-50см, а при необходимости и глубже, обеспечивает существенное снижение вредоносности бактериозов. По данным НИИ охраны плодородия почв (Луганск, Украина), наличие плужной подошвы, которая присутствует на 70% российских полей, способствует накоплению всех видов инфекции. 38 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») и на кафедре защиты растений Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева 2.1 Растительный материал. Для изучения видового состава фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas на растениях сем. Мятликовые было исследовано более 900 образцов зерновых культур (листья, колосья и стебли озимой и яровой пшеницы, ржи, ячменя и овса), собранных сотрудниками ВНИИ фитопатологии в 2004-2013 гг. в 113 точках сборах (приложение 4). А также 126 партий семян риса, поступивших в ФГБУ «ВНИИКР» из Респ. Дагестан, Краснодарского и Приморского края для установления фитосанитарного состояния. Совместно с испытательной лабораторией Российской академии наук Институт общей генетик им. Н.И. Вавилова РАН было проанализировано 70 партий семян пшеници, ячменя, ржи и овса (урожай 2010-2011 года) из 7 регионов РФ: Алтайский край, Воронежская, Курская, Рязанская, Тамбовская, Амурская, Омская области на наличии возбудителей бактериозов. Для лабораторного анализа отбирали щуплые, недоразвитые, серые, с засохшим экссудатом желтоватого цвета семена. 2.2. Коллекция штаммов, использованных в работе. В работе использовали коллекцию штаммов бактерий, предоставленную лабораторией бактериальных болезней ГНУ-ВНИИ фитопатологии РАСХН; типовые штаммы: Xanthomonas oryzae pv.oryzae, X. oryzae pv. oryzicola, X. arboricola pv. pruni, X.translucens pv. undulosa, X.campestris pv. campestris, X. campestris pv. raphani, а также штаммы бактерий, выделенные из семян пивоваренного ячменя и риса и депонированные в коллекцию ФГБУ «ВНИИКР» (табл. 2.1). Бактерии культивировали на среде YDC (Schaad ,2001): дрожжевой экстракт – 10 г, CaCo3 - 20 г, глюкоза – 10 г, агар – 18 г, дистиллированная вода - 950 мл при 27оC в течение 48 ч. 39 Таблица 2.1 - Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas, использованные в работе Название штамма Место происхождения Растение, с которого выделен штамм Коллекция NCPPB* NCPPB 3002 Xanthomonas oryzae pv.oryzae NCPPB 793 Xanthomonas oryzae pv.oryzae NCPPB 1585 X. oryzae pv. Oryzicola NCPPB 420 Xanthomonas arboricola pv. pruni NCPPB 1945 Xanthomonas translucens pv. undulosa NCPPB 45 Xanthomonas campestris pv. campestris NCPPB 1946 Xanthomonas campestris .pv. raphani Индия, 1977 Рис Индия, 1960 Рис Малайзия, 1964 Рис Новая Зеландия,1957 Черемуха Канада, 1966 Тритикале Великобритания, 1941 Рапс США, 1966 Редька посевная Коллекция ВКФПМ** Bel-5 X.sp J 1, X.sp J A W-11 Московская область, 2006 Можайский район Краснодарский край, с. Орбита, 2006 Респ. Белоруссия, 2006 Япония, 1998 Kaбардино-Балкария W-1009, W-1242 Саратовская область W-1251, W-1243,W-1244 W-1250,W-1252, W-1253 W-1268 W-1247, W-1248 W-2000, W-1300 6163, 8183,63, 8166,106, 8160,21, 6563, 8182, 1873,46,РУО-63 R-1007 R-212, R-415 R-1008 R140,R 141,R 3023,R 3024,R14, R149,R212,R171 R145, ,R3021 Краснодарский край B-1265 Смоленская область 1363 1395 Яровой рапс сорт «Луговской» Капуста Капуста б/к Капуста Пшеница Смоленская область Татарстан Башкортостан Рис Краснодарский край Московская область Башкортостан Калужская область Кировская область Рожь Рожь 40 B-3003, B-3004, B-3005 Брянская область Ят 27, Ят 30, Я 3013, B 3027 В3026, ,В42 S1,Ex 5-6, Ex Sf-5 НПО «Подмосковье» Ячмень Краснодарский край Подсолнечник Ов.3028, Ов.3031 Ленинградская область Овес Коллекция лаборатории защиты растений РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева Bel-5 Респ. Белоруссия, 2006 Капуста б/к Тlo-5 Тульская область, 2007 Dasch -2 Серпухов, р-н МО,2006 Коллекция ФГБУ «ВНИИКР» *** МХ27 Рис МХ36 Кизлярский р-н, Респ. Дагестан, МХ38 2012 МХ 93 Рис МХ 95 МХ 97 МХ 83 МХ 100 МХ 28 Казбековский р-н, Респ. Дагестан, Рис МХ 30 2012 МХ 32 МХ 34 МХ 86 Гунибский р-н, Респ. Дагестан, Рис 2012 МХ 88 Prim 1 Приморский край, 2011 Рис Prim 2 Prim 3 Кс 1 Воронежская область, 2011 Ячмень «Ксанаду» Кс 2 Кс 3 Ан 1 Рязанская область, 2011 Ячмень «Анабель» Ан 2 Ан 3 М1 Ячмень «Марни» Тамбовская область, 2011 М2 М3 *NCPPB – National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (Великобритания). **ВКФПМ – Всероссийская коллекция фитопатогенных микроорганизмов ***ФГБУ «ВНИИКР» - ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» 2.3. Выделение бактерий из семян растений семейства Мятликовые. Оценивалось пять различных методов выделения бактерий из семян. Для опыта использовали семена риса сорта Луговой (ООО «Агро Сангсэнг») из Приморского края, урожай 2011 года. Семена риса искусственно заражали штаммом Xanthomonas oryzae NCPPB 3002Т в концентрации 109 КОЕ/мл в 41 условиях вакуума (-1,01 бар, 1 мин), из расчета 100 мкл суспензии на 1000 семян. Зараженные семена хранили при +40 С. Для каждого метода повторность 3-х кратная. Метод №1. Партию семян помещали в PBS с добавлением Твин 20. Охлаждали при +40С в холодильнике 24 часа. Помещали на ротационный шейкер и встряхивали со скоростью 210 об/мин в течение 30 мин. Пропускали через грубый фильтр и высевали на чашки со средой YDC в разведении с 1 по 9. Метод №2. Партию семян помещали в PBS с добавлением Твин 20. Охлаждали при +40С в холодильнике 24 часа. Помещали на ротационный шейкер на 30 минут, 210 об/мин. Далее пробы помещали в одноразовый пакет с фильтром, и измельчали с помощью гомогенизатора до полной однородности (2 мин, скорость 8). После чего пропускали через грубый фильтр и высевали на чашки со средой YDC в разведении с 1 по 9. Метод № 3. Партию семян помещали в PBS с добавлением Твин 20. Охлаждали при +40С в холодильнике 24 часа. Пропускали через грубый фильтр и высевали на чашки со средой YDC в разведении с 1 по 9. Метод № 4. Партию семян стерилизовали в 10% гипохлорите натрия 2мин, промывали 3 раза в стерильной воде, помещали в PBS с добавлением Твин 20. Охлаждали при +40С в холодильнике 24 часа. Помещали на ротационный шейкер на 30 минут, 210 об/мин. Пропускали через грубый фильтр и высевали на чашки со средой YDC в разведении с 1 по 9. Метод № 5. Партию семян стерилизовали в 10% гипохлорите натрия 2мин, промывали 3 раза в стерильной воде, помещали в PBS с добавлением Твин 20. Охлаждали при +40С в холодильнике 24 часа. Помещали на ротационный шейкер на 30 минут, 210 об/мин. Далее пробы помещали в одноразовый пакет с фильтром, и измельчали с помощью гомогенизатора до полной однородности (2 мин, скорость 8). Пропускали через грубый фильтр и высевали на чашки со средой YDC в разведении с 1 по 9. 42 2.4. Выделение ДНК. ДНК бактерий выделяли набором «Проба ГС» кат. № Р-003/1 («ДНК – Технология», Москва), основанным на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента – гуанидина тиоцината (GuSCN), и с последующей сорбцией ДНК на носителе. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она снимается элюирующим раствором. Отбирали 1 петлю культуры и суспензировали в 1000 мкл стерильной воды. 2.5.Измерение концентрации ДНК. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000 для количественного определения НК и белка. Оценку качества экстрагированной ДНК проводили на основании измерения оптической плотности раствора ДНК при 280 и 260 и 230 нм. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей, полученных при 260/280 нм, должно быть около 1,8, при 260/230 нм 1,8-2,2. 2.6. Изучение генетического разнообразия фитопатогенных бактерий проводили с помощью метода MLST (мультилокусного генотипирования). ПЦР амплификацию фрагментов генов dnaK, gyrB, rpoD, fyuA (Young et al., 2008) (приложение 4) проводили в 25 мкл реакционной смеси: 5 х Master Mix, 80.0 нг ДНК-матрицы, по 20 пкМ соответствующих пар праймеров. Температурно-временные параметры амплификации включали преденатурацию 940С - 3 мин, далее 27 циклов состоящих из денатурации 940С-30 сек, отжига праймеров 540С -30 сек, элонгации 720С-1 мин; финальный досинтез 720С -10 мин; хранение при +40С. Состав смеси был оптимизирован по концентрации матричной ДНК, а также сравнивались результаты при использовании Master Mix компании ЗАО «Синтол» и Master Mix компании «Евроген». 2.7.Заражение растений-хозяев. Для проведения тестов на патогенность были взяты семена культур семейств Мятликовых, Капустных, Сложноцветных, Пасленовых (табл. 3.2.1). Растения выращивали до стадии 3-5 настоящего листа в 15-см вазонах. Растения семейства Мятликовые 43 инокулировали инфильтрацией суспензии бактерий в среднюю часть листа при помощи одноразового шприца. Растения других семейств инокулировались обрезанием кончиков листьев ножницами, смоченными в бактериальной суспензии (108 КОЕ/мл) и инкубировались при постоянных температурах 24°С и 28°С. Контроль — обрезка листьев ножницами, смоченными в воде. Суспензия представляла собой смыв 2-х дневной культуры бактерий, выращенной на агаризованной питательной среде YDC при 28°С, доведенный разведением до концентрации 106 КОЕ на мл. Через 21 день после заражения проводили учет симптомов по 2-х бальной шкале: 0 – нет поражения, 1 – сосудистое поражение в месте инокуляции или локальный некроз. 2.8. Постановка классической ПЦР. С выделенными образцами ДНК проводили классическую ПЦР. Для работы с коллекцией были использованы праймеры на разные участки генома (приложение 5). Синтез праймеров проводили в ЗАО «Синтол», Москва. Для таксономической локализации и идентификации рода бактерий использовали универсальные праймеры 16S рРНК. С помощью праймеров, специфичных к межгенному участку XCC0007-tonB, коллекция штаммов была проверена на принадлежность к роду Xanthomonas. Далее приведены условия амплификации для каждой пары праймеров. Для амплификации ДНК неизвестных штаммов использовали универсальные праймеры 8UA/519B на межгенный регион 16S рРНК, которые амплифицируют продукт 500 п.о. Праймеры Xnth804F/1405R, специфичные к межгенному участку XCC0007-tonB амплифицируют продукт размером 623 п.о., специфичный для Xanthomonas spp. Праймеры TXT/TXT-4R, подобранные для межгенного регион мобильного элемента IS1113, специфичного для Xanthomonas oryzae, амплифицируют продукт размером 964 п.о. 44 Для амплификации ДНК с праймерами 8UA/519B и Xnth804F/1405R, смесь реактивов для постановки одной реакции объемом 25 мкл содержала 5 мкл 10Х ПЦР буфера MagMix (ООО «Диалат Лтд», Москва), 20пМ каждого праймера, и 20 нг целевой ДНК. При проведении ПЦР с праймерами TXT/TXT-4R реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 10 х Master Mix (ООО «Диалат Лтд»), 25пкМ каждого праймера, 200нг целевой ДНК. Температурно-временные параметры амплификации для праймеров 8UA/519B включали пре-денатурацию 960С - 15 мин, далее 35 циклов состоящих из денатурации 950С-15 сек, отжига праймеров 550С -30 сек, элонгации 720С-30 сек; финальный досинтез 720С-10 мин; хранение при +40С. Для праймеров Xnth804F/1405R 960С -15мин, далее 35 циклов, 950С 30 сек, 600С - 30 сек , 720С- 1 мин, 720С -15 мин; хранение при +40С. Для праймеров TXT/TXT-4R 950С - 5мин, далее 30 циклов, 950С - 1мин, 560С 1мин, 720С - 1 мин, 720С - 10 мин; хранение при +40С. Состав смеси был оптимизирован по концентрации матричной ДНК, а также сравнивались результаты при использовании 10 х Master Mix и 5 х Master Mix. Объем реакционной смеси, температура отжига праймеров несколько варьировала в разных экспериментах в зависимости от пары используемых олигонуклеотидов. На всех этапах работы результаты регистрировали методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в гель-документирующей системе Quatum-ST-4-1500 (Япония). Размер продуктов ПЦР измеряли, используя маркеры молекулярного веса GeneRuler™ 100+ п.н. и Fast Ruler™ (Fermentas, Латвия). 2.9. Секвенирование нуклеотидных последовательностей. Секвенирование образцов проводили по методу Сэнгера. ПЦР - продукты предназначенные для секвенирования, очищали с помощью набора PCR GeneJET (Fermentas) арт. К0701. Реакцию секвенирования проводили с 45 применением BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems). Нуклеотидные последовательности участков генов изучаемых видов были проанализированы с помощью программного обеспечения «BioEdit» и базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 2.10. ПЦР «в реальном времени». Для разработки и проведения ПЦР «в реальном времени» для видов Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola проводили подбор олигонуклеотидов на основе гена gyr B. Из базы данных GenВank были (www.ncbi.nlm.nih.gov) выбраны нуклеотидные последовательности бактерий разных видов рода Xanthomonas по гену gyr B. Также при анализе использовали данные секвенирования Xanthomonas spp из нашей коллекции. Анализ последовательностей и выбор праймеров проводили с помощью программ «BioEdit» и «Primer 3». Нами были разработаны специфичные для Xanthomonas oryzae праймеры X.o.F/X.o.R и зонд X.or.-Р., содержащий флуоресцентную метку R6G на 5’ конце и гаситель флуоресценции RTQ2на 3’конце; и праймеры, специфичные для Xanthomonas arboricolaX.arb-F/ X.arb-R, зонд X.arb-P содержащий флуоресцентную метку ROX на 5’конце и гаситель флуоресценции BHQ2 на 3’конце. Синтез праймеров и зондов проводили в ЗАО «Синтол», Москва. Разработанные зонды и праймеры представлены в приложении 5. Амлификацию и детекцию в реальном времени проводили на амплификаторе iCycler iQ (Bio-Rad, США). В процессе оптимизации ПЦР в «режиме реального времени» для праймеров и зондов подбирали температурный режим, число и продолжительность циклов амплификации, концентраци зондов и праймеров. Для амплификации ДНК с праймерами X.o.F/ X.o.R объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал 2,5 мкл 10хПЦР буфера, 7,5 пкМ 46 праймеров, 5 пкМ зонда и 5 нг целевой ДНК и стерильную воду. Реакцию проводили при следующих температурно-временных условиях: 1 цикл 950C– 5 мин; 40 циклов 950C – 15 сек, 610C – 40 сек. Для амплификации ДНК с праймерами X.arb-F/ X.arb-R объем реакционной смеси для ПЦР в реальном времени для Xanthomonas arboricola составлял 25 мкл и включал 2,5 мкл 10хПЦР буфера, 20 пкМ праймеров, 5 пкМ зонда, 5 нг целевой ДНК и стерильную воду. Реакцию проводили при следующих температурно-временных условиях: 1 цикл 950C– 5 мин; 40 циклов 950C – 15 сек, 550C – 40 сек. 2.11. Оптимизация селективных питательных сред для выделения Xanthomonas oryzae. На первоначальном этапе была выбрана оптимальная среда, для роста и размножения целевой бактерии. Для выбора питательной среды был использован типовой штамм Xanthomonas oryzae 3002Т. Было предложено 5 сред различного состава (Schaad N., 2001), г/л: 1). YDС: глюкоза – 10 г; дрожжевой экстракт – 10 г; СаСО3 – 20 г; агар - 18 гр. 2).КАА: крахмал – 15 г; дрожжевой экстракт – 5 г; агар – 18 г. 3). YPGA: дрожжевой экстракт -5 г, пептон -5 г; глюкоза -10 г; агар -12 г. 4). КААмодифиц: крахмал – 15 г; дрожжевой экстракт – 5 г; агар– 18 г; NH4Cl, - 5 г; KH2PO4 - 2 г. 5).XAS medium: сахароза- 10г; пептон - 5 г; KH2PO4 X 3H2O - 0,5 г; МgSO4 X 7 H2O – 0,25г; агар – 15 г. Бактерии культивировали при 27оC в течение 24 ч. Далее подбирали антибиотики разного состава и в различных концентрациях для использования их в качестве селектирующего фактора для разработки BIO-PCR. При подборе селектирующего фактора при разработке BIO-PCR для карантинного вида Xanthomonas oryzae мы опирались на данные, полученные зарубежными исследователями, комбинации антибиотиков: а также использовали различные 47 1). Циклогексимид 25 мг/л + цефазолин 15 мг/л 2). Циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л (Gironde,2009) 3). Циклогексимид 100 мг/л + цефазолин 20 мг/л 4). Гентамицин 2 мг/л (Clafin, 1987) 5). Гентамицин 5 мг/л 6). Гентамицин 10 мг/л (Schaad, 1985) 7). Гентамицин 15мг/л 8). Циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л Семена риса искусственно заражали типовым штаммом Xanthomonas oryzae 3002Т, далее выделяли бактерии по методике, описанной выше. Семенной экстракт высевали на чашки со средой YPGA с разными антибиотиками и наблюдали за ростом целевой бактерии, а также сапротрофной микробиоты. Наблюдали за ростом типичных колоний, для подтверждения ставили ПЦР «в реальном времени. 2.12. Сравнение чувствительности прямого и БИО-ПЦР анализа. Для работы использовали семенной материал – партию семян риса сорта Дарий 23, полученную из Приморского края (урожай 2011 года), свободный от бактерий рода Xanthomonas. Семенной экстракт получали по методике, описанной выше. Готовили суспензию клеток X. oryzae. Для исследования был выбран типовой штамм X.oryzae 3002Т, концентрации полученный из коллекции NCPPB. Определение бактериальной суспензии проводили методом серийных разведений. Для этого готовили серию 10-ти кратных разведений. Из каждого разведения проводили посев по 100 мкл суспензии на среду YDC. Через двое суток проводили подсчет колониеобразующих единиц и рассчитывали концентрацию бактерий (КОЕ/мл). По 100 мкл бактериальной суспензии из каждого разведения вносили в 1 мл семенного экстракта. Таким образом, формировали различные варианты семенных экстрактов, различающихся концентрацией возбудителя. 48 Для сравнения чувствительности прямого и БИО-ПЦР анализа использовали ПЦР «в реальном времени» с разработанными праймерами X.o.F и X.o.R и пробой X.o.P. В первом случае ставили прямую ПЦР, при котором исследовали полученный семенной экстракт. Во втором случае проводили Био-ПЦР, т.е. семенной экстракт высевали на питательные среды. Через 18 часов после посева проводили смыв с поверхности чашек, добавляя в чашку 500 мкл стерильного физраствора. До проведения ПЦР-анализа пробы хранили при – 18оС. 2.13. Определение биологической эффективности препарата при предпосевном протравливании семян. Заражение семян проводили в условиях вакуума (-1,01 бар, 1 мин) суспензией типового штамма X.oryzae 3002Т в концентрации 109 КОЕ/мл, из расчета 100 мкл суспензии на 1000 семян. Зараженные семена хранили при +40 С. Инокулированные семена замачивали в рабочем растворе препаратов на 2 часа, используя следующие варианты – Максим, КС 0,2%, Максим, КС 1%, Максим, КС 2%. В качестве положительного контроля в воде замачивали зараженные семена, в качестве отрицательного контроля замачивали в воде здоровые семена (свободные от инфекции). Семена после обработки подсушивали на фильтровальной бумаге и раскладывали на средуYPGA. Опыт проводили в 4-х кратной повторности по 40 семян в каждой. Учет проводили на 2-е сутки, визуально оценивая число типичных колоний X. oryzae вокруг каждого семени. ГЛАВА III. ИЗУЧЕНИЕ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА XANTHOMONAS, ПОРАЖАЮЖИХ ЗЛАКОВЫЕ КУЛЬТУРЫ В последние годы в России происходит посевного материала основных нарастание зараженности сельскохозяйственных культур возбудителями бактериальных болезней растений. Причины этого явления — нарушение технологии выращивания, уборки и хранения собранных семян, в изменении климатических условий, в недостатке своевременной и достоверной диагностики фитопатогенов в поле и в посевном материале. Во многих случаях посев зараженными семенами приводит к развитию болезней растений в поле, особенно если неправильно подобран протравитель. Потери урожая от возбудителей бактериозов в значительной степени зависят от того какие фитопатогены являются причиной возникновения болезни. Поэтому определение характерных для конкретной территории видов или их комплексов при изучении бактериозов представляется актуальным исследованием. Достоверная информация о видовом составе патогенов позволяет построить эффективную систему защиты от бактериозов и предотвратить их распространение. Большое влияние на видовое разнообразие возбудителей на территории страны оказывает состав патогенов, поступающий с посадочным материалом из-за рубежа. На территорию Российской Федерации ввоз посадочного материала постоянно увеличивается, что связано с установлением рыночной экономики государства, появлением новых сортов зарубежной селекции. На территорию России импортный семенной материал поступает из более 26 стран мира, 58% из которых составляют страны-члены Евросоюза. Ввоз импортного растительного материала может повлечь за собой интродукцию новых вредных организмов, в том числе и возбудителей болезней, ранее отсутствовавших на территории нашей страны. В России потери урожая только зерновых культур от вредителей, болезней и сорняков достигают 25-30% валового сбора зерна. Поэтому, 50 основная задача учреждений, осуществляющих фитосанитарный надзор диагностировать и предотвратить распространение наиболее опасных объектов на этапе досмотра импортной продукции. 3.1.Видовой состав возбудителей рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые Для изучения видового состава фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas на растениях сем. Мятликовые было исследовано более 900 образцов зерновых культур (листья, колосья и стебли озимой и яровой пшеницы, ржи, ячменя и овса), собранных сотрудниками ВНИИ фитопатологии в 2004-2013 гг. в 113 точках сборах (приложение 4). Совместно с лабораторией бактериологии ФГБУ «ВНИИКР» было исследованы более 126 партий семян риса (урожай 2011-2012 года) отечественного производства на наличии бактериального ожога и бактериальной полосчатости риса, вызываемого бактериями Xanthomonas oryzae pv.oryzae и Xanthomonas oryzae pv.oryzicola, а также других видов Xanthomonas spp (табл. 3.1.1). Образцы пшеницы, ячменя и ржи с подозрением на наличие бактериальной инфекции были предоставлены испытательной лабораторией Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (табл.3.1.2). В результате проведенных обследований сотрудниками ВНИИФ в различных климатических зонах России было обнаружено повсеместное распространение бактериальных болезней на посевах зерновых культур, но наиболее распространенными были базальный (basal glume rot, возбудительPseudomonas syringae pv. atrofaciens) и черный бактериозы (black-chaff/leaf stripe, возбудитель Xanthomonas X. translucens/arboricola). Анализ соотношений вышеуказанных патогенов позволил предположить, что черный бактериоз чаще встречался в южных регионах России, таких как Краснодарский край, Кабардино-Балкария, Осетия и в 51 Центральной Черноземной зоне. По данным ГНУ-ВНИИ фитопатологии РАСХН потери урожая от этой болезни не превышали 10-15%. Кроме этих двух патогенов были обнаружены также возбудители порозовения семян Erwinia rhapontici и бактериальной мозаичности Clavibacter michiganense subsp.tessellarius. Возбудители бактериозов рода Xanthomonas были обнаружены в 30 из 113 местах сбора образцов, в основном в Северокавказском регионе, Саратовской и Московской областях. Из таблицы 3.1.1 видно, что 28 партий отечественного риса из 126 были заражены бактериями рода Xanthomonas: X. campestris, X. vesicatoria и X. arboricola. Возбудителя бактериального ожога риса, вызываемого X. oryzae, не обнаружили. Таблица 3.1.1 –Бактерии рода Xanthomonas, выделенные из семян риса отечественного происхождения Местонахождение Количество Процент встречаемости, % обследуемого проанализир. (фактическое число) объекта образцов X. oryzae X. campestris X. vesicatoria X. arboricola Краснодарский край (коллекция ВНИИФ) Кизлярский р-н, Респ. Дагестан Казбековский р-н,Респ. Дагестан 12 0 (0) 33 (4) 0 (0) 25 (3) 68 0 (0) 8,8 (6) 7,4 (5) 4,4 (3) 20 0 (0) 0 (0) 0 (0) 10 (2) Гунибский р-н, Респ. Дагестан Анучинский р-н, Приморский край В среднем Всего 10 0 (0) 20 (2) 0 (0) 0 (0) 16 0 (0) 12,5 (2) 0 (0) 6,3 (1) 126 0 0 14,9 14 1,5 5 9,1 9 Среди проанализированных 30 партий семян пшеницы, 12 партий ржи, 20 партий семян ячменя и 8 партий овса из 7 регионов России: Алтайского края, Воронежской, Курской, Рязанской, Тамбовской, Амурской, Омской областей, мы обнаружили несколько видов бактерий рода Xanthomonas в 50 52 партиях из 70, но X. translucens был обнаружен лишь в одной партии ячменя (табл. 3.1.2). Наряду с бактериями рода Xanthomonas, в семенах злаковых культур были обнаружены бактерии рода: Curtobacterium sp., Pantoea sp., Pseudomonas sp., Microbacterium sp (приложение 6). Впервые были выделены штаммы Pantoea ananatis из семян риса отечественного производства. В 2010-13 гг. отмечено появление в РФ нового возбудителя бактериозов риса, овса, кукурузы и других злаков, включая пшеницу – P. ananatis. Бактерии этого вида также вызывают заболевания (листовые пятнистости и ожог) лука, сорго, томата, дыни. При поражении восприимчивых сортов кукурузы потери урожая могут составить до 60%. Заболевания растений, вызванные P. ananatis широко распространены в Латинской Америке, на юге Европы и в Африке. В России отмечено его распространение на огурце в 2010 году, а в 2013 г. – эпифитотия бактериального ожога листьев на пшенице, рисе и ячмене (Игнатов, 2014). Количество проанализир. образцов Таблица 3.1.2 - Бактерий рода Xanthomonas, выделенные из семян некоторых злаковых культур Растение Процент встречаемости, %(фактическое число) -хозяин X. X. X. X. X.gard X. X. campes tris arboric ola Пшеница 30 6,6 (2) Ячмень 20 0 (0) Рожь 12 Овес 8 В среднем Всего 70 cynarae hortoru m eneri pisi 16,7 (5) 16,7 (5) 23,3 (7) 6,6(2) 6,6 (2) 0 (0) 55 (11) 0 (0) 10 (2) 0 (0) 5 (1) 16,7 (2) 0 (0) 33,3 (4) 33,3 (4) 0 (0) 8,3 (1) 0 (0) 0 (0) 25 (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 5,8 24,1 12,5 16,7 1,7 3,7 1,3 4 18 9 13 2 3 1 0 (0) translu cens Наиболее часто встречаемым видом в семенах злаковых культур был вид X. arboricola, 27 партий из 196 были заражены данным патогеном 53 (рис.3.1.2). Данный вид был обнаружен в исследуемых образцах риса, пшеницы и ячменя. Патовары X. arboricola (Vauterin et al, 1995) в различных странах вызывают болезни разных сельскохозяйственных культур: земляники, косточковых плодовых культур, фундука, грецкого ореха, тополя, бананов, молочая. Патовары pruni, corylina, juglandis, populi были отмечены и в Российской Федерации. В Северо-Кавказском, Поволжском и Южном регионах России (Ставропольский и Краснодарский края, Башкирия, Ростовская область) штаммы, принадлежащие к виду X. arboricola, вызывают бактериозы злаков, преимущественно ячменя, и в меньшей степени – пшеницы, ржи и овса. Данный возбудитель является также причиной поражения подсолнечника в Ставропольском и Краснодарском краях, Волгоградской и Ростовской областях РФ, а также на Украине и в Молдавии. В Московской области и в Северной Осетии X. arboricola поражает белокочанную капусту (Игнатов и др., 2010). Известно также, что симптомы вызываемых X. arboricola заболеваний не отличались от болезней, причиняемых другими бактериями рода Xanthomonas, специализирующимися на тех же растениях хозяевах. В частности, штаммы X. аrboricola, которые были выделены из растений зерновых злаков вместе с X. translucens – возбудителем черного бактериоза злаков (рис. 3.1.1.), а симптомы, вызываемые ими на растениях белокочанной капусты, были типичными для сосудистого бактериоза (возб. X. campestris pv. campestris). 54 1 2 3 4 6 7 8 9 Рисунок 3.1.1. - Симптомы поражения растений пшеницы сорта Московская 39 тремя штаммами: NCPPB 1945 Xanthomonas translucens pv. undulosa (листья 1-3); B3004 X. arboricola (листья 4-6); W3011 X. hortorum (листья 7-10). Из таблицы 3.1.1 видно, что вид X. аrboricola также обнаружен в исследуемых штаммах, выделенных из риса. Появление X. arboricola в России на новых видах растений одновременно с усилением вредоносности этого вида в зонах традиционного распространения патогена – Закавказских и Балканских странах, Турции, Средней Азии, Китае, Австралии, США и Африке, позволяет предположить дальнейшее увеличение числа поражаемых видов растений и расширение ареала патогена на север европейской части России. Следующим, наиболее распространенным был вид X. hortorum (рис.3.1.2). Патовары X. hortorum (Vauterin et al, 1995) в различных странах вызывают болезни растений плюща (pv. hederae), пеларгонии (pv. pelargonii), 55 одуванчика (pv. taraxaci), салат (pv. vitians). Данный вид был обнаружен в исследуемых образцах пшеницы, ячменя и ржи. Штаммы X. campestris были выделены из образцов риса, пшеницы и ржи со средней частотой 5,8%. К данному виду относятся патоварианты, обычно поражающие крестоцветные, пасленовые и тыквенные культуры (Schaad et al., 1997). Первые сообщения о сосудистом бактериозе появились в США в середине 1880-х г. (Williams, 1980). Сосудистый бактериоз является наиболее вредоносным и распространенным заболеванием в странах умеренного климата. В России сосудистый бактериоз был впервые обнаружен в 1905г. В настоящее время заболевание распространено в большинстве регионов возделывания крестоцветных культур (Bradbury, 1986). В последнее десятилетие из-за постепенного потепления климата X. campestris стали поражать и другие крестоцветные, включая B. rapa, B. napus, B. juncea, B. carinata и Crambe abyssinica (Игнатов и др., 2002). Следует отметить, что в 1998 году А.Н. Игнатов выделил штаммы бактерий из растений капусты, которая выращивалась на заливном поле в зимний сезон после летнего предшественника – риса. Данные изоляты, показавшые вирулентность по отношению к растениям риса (Игнатов А.Н., личное сообщение), были определены нами как X. campestris рv. сampestris. При проведении исследований впервые нами были идентифицированы возбудители X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri, которые ранее на злаковых культурах не выявлялись. Данные виды обычно поражают растения из сем. Астровые, Бобовые, Пасленовые. В литературных источниках нет данных о вредоносности X. hortorum, X. campestris X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri на растениях семейства Мятликовые, что говорит о том, что патогены перешли к паразитизму на новых растениях-хозяевах, как и X. arboricola. Было неожиданно, что только одна партия семян ячменя была заражена X. translucens (рис. 3.1.2). Но, предыдущий анализ фитопатогенных видов бактерий рода Xanthomonas (почти 100 штаммов), собранных в 1995- 56 2001 гг. на зерновых культурах и депонированных во Всероссийскую коллекцию фитопатогенных микроорганизмов также показал низкую частоту встречаемости данного вида на зерновых культурах в России - не более 10% (данные из резюме итогового отчета для проекта ISTC 1771p) (www.istc.ru). X. translucens, по современным данным, претендует на статус представителя отдельного рода в семействе Xanthomonaceae (Vautering et al., 1995), и вероятно, менее приспособлен к климатическим условиям России. Появление новых агрессивных штаммов фитопатогенных бактерий, которые поражают более широкий круг сельскохозяйственных культур, приводит к повсеместному усилению вредоносности бактериозов и серьезным экономическим потерям. Фитопатогенные бактерии, несвойственные для наших широт, активно распространяются в России, увеличивая число поражаемых ими видов растений. Появление новых нетипичных штаммов бактерий может быть следствием климатических изменений в РФ. Особенно важную роль в этом процессе играет увеличение длины безморозного периода. Поражение бактериозами усиливается весной и осенью. Кроме того, происходит переход бактерий с озимых на яровые культуры и наоборот. Экстремальные погодные условия способствуют распространению бактерий на большие расстояния и помогают заражать поврежденные засухами и заморозками растения. Насекомые-переносчики патогенов также вносят существенный вклад в распространение бактериозов. Появление неспециализированных патогенов, переходящих с культуры на культуру, затрудняет борьбу с ним агротехническими методами и снижает эффективность контроля чистоты семян и посевного материала. (Игнатов, 2012). 57 X. arboricola 1,7% 1,3 X. hortorum 3,7 % X. cynarae 7,6 % 21,1 % X. campestris 12,5 % X. pisi 16,7% X.gardeneri X. translucens Рисунок 3.1.2 – Процент встречаемости бактерий рода Xanthomonas в семенах злаковых культур, в долевом соотношении В результате проведенной работы было установлено, что большинстве случаев на зерновых культурах встречаются виды: в X. arboricola, X. campestris, X. hortorum, X. cynarae. В единичных образцах обнаружили виды X. pisi, X. gardeneri и X. translucens. Во всех проанализированных образцах риса возбудитель бактериального ожога риса и бактериальной полосчатости риса не выявлены, что было доказано методом прямого секвенирования, MLST, ПЦР с видоспецифичными праймерами, а также методом ПЦР «в реальном времени». Из чего можно сделать вывод, что данный вид по-прежнему является отсутствующим на территории РФ. 58 3.2. Изучение генетического разнообразия исследуемой коллекции Xanthomonas spр. с помощью метода мультилокусного генотипирования (MLST) В настоящее время молекулярно–генетических идентифицировать существует методов возбудителей множество разнообразных диагностики, позволяющих болезней растений. Данные методы основаны на исследовании ДНК в районе определенных генов, которые являются наиболее стабильным признаком организма в течение его жизни и жизни его потомства и обеспечивают точную диагностику. Такие методы информативнее других видов анализа, хотя они более сложны и трудоемки. В практической диагностике данные методы позволяют выявить наличие патогена в латентной форме в практической диагностике. В настоящее время, наряду со всеми известными методами для фундаментального изучения таксономии бактерий, применяется метод мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing - MLST), который является альтернативой, среди используемых в настоящее время методов диагностики. Мультилокусный анализ позволил качественно улучшить идентификацию и диагностику бактериальных штаммов. Данный метод был предложен в качестве доступного, подходящего и универсального метода для диагностики бактерий в 1998г. (Maiden et al., 1998). Более тридцати работ опубликовано к настоящему моменту, в основном для патогенных грибов и бактерий, необходимых в изучении популяционной биологии, эволюции и патогенности бактерий и в дальнейших эпидемиологических исследованиях (Maiden, 2006). Важнейшим типирования преимуществом является наличие метода мультилокусного международной базы сиквенсданных (http://www.mlst.net), позволяющей хранить информацию обо всех известных сиквенс-типах, пополнять ее и в режиме on-line сравнивать собственные данные с накопленными ранее. На их основе возможно изучение 59 генетического полиморфизма изучаемых генов патогена и выявление родственных связей. Метод заключается в секвенировании 6-7 фрагментов генов длиной от 450 до 800 п.о. или целых генов «домашнего хозяйства», имеющих достаточное число аллелей (более 10), характеризующихся медленным накоплением мутаций и селективно нейтральных. Настоящая глава, посвящена расшифровке последовательностей ДНК имеющейся у нас коллекции штаммов бактерий рода Xanthomonas, выделенных из растений семейства Мятликовые, а также установлению родственных связей и изучению изменчивости на основе нескольких хозяйственно-важных (house-keeping) генов. Для изучения генетического полиморфизма и проведения секвенирования бактерий рода Xanthomonas была использована коллекция штаммов, выделенных нами из растений и семян семейства Мятликовые, а также коллекция штаммов ВКФПМ и типовые штаммы из коллекции NCPPB (табл. 2.1). Коллекцию бактериальных штаммов хранили при -700С в 15% глицерине. Для получения биомассы бактерии высевали на среду YDC и выращивали в течение 48 часов. Выделение ДНК из бактерий проводили с помощью набора «Проба-ГС» («ДНК-технология», Москва), согласно рекомендациям производителя. Для анализа штаммов методом MLST были использованы ранее опубликованные праймеры (приложение 5) (Young et al., 2008). Для гена Тау и гамма субъединиц ДНК полимеразы 3 (DNA polymerase III tau and gamma subunits - dnaX), были использованы праймеры dnaXF/dnaXR. Для последовательности гена β-субьединица ДНК (gyrB) были использованы праймеры XgyrB1F/ XgyrB1R. Для последовательности гена σ-фактор РНК-полимеразы (rpoD) были использованы праймеры XrpoD1F/ XrpoD1R. 60 Для последовательности гена TonB-зависимый рецептор fyuA были использованы праймеры XfyuA1F/ XfyuA1R (приложение 5). Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных Генбанка проводили с помощью программы NCBI Blast (Altschul et al., 1997). Проверку и редактирование последовательностей вручную проводили с помощью редактора «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов изучаемых штаммов был проведен с помощью сервера BLAST. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В результате проведенного анализа секвенирования были расшифрованы последовательности ДНК бактерий рода Xanthomonas, (см. табл. 2.1) по четырем изучаемым генам. Все последовательности были выровнены и проанализированы на сходство с использованием сервер BLAST. 61 Рисунок 3.2.1. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 34 фрагментов гена rpoD бактерий рода Xanthomonas с использованием алгоритма NJ. 62 Рисунок 3.2.2. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 30 фрагментов гена gyrB бактерий рода Xanthomonas с использованием алгоритма NJ. 63 Рисунок 3.2.3. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 34 фрагментов гена dna K бактерий рода Xanthomonas с использованием алгоритма NJ. 64 Рисунок 3.2.4. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 37 фрагментов гена FyuA бактерий рода Xanthomonas с использованием алгоритма NJ. Филогенетический анализ последовательностей ДНК генов rpoD, gyr B, dnaK, fyuA бактерий, выделенных из растений семейства Мятликовые, проводился методом ближнего соседа (Neighbor-Joining method) (Saitou, 1987). Это самый распространенный дистанционно-матричный метод, основанный на сравнивании одной нуклеотидной последовательности NJ дедрограммы поочередно со всеми остальными. По результатам сравнений 65 определяется её «ближайший сосед». После этого определяется сходство между данной парой последовательностей и всей остальной выборкой. Далее такая же процедура производится для всех оставшихся последовательностей, но уже без определенной ранее пары. Таким образом, описанная схема повторяется до момента исчерпания выборки. Процент деревьев с повторяющейся группировкой образцов определен при бурстреп - анализе (500 повторений) возле соответствующих узлов дерева (Felsenstein J, 1985). Эволюциннные расстояния определены методом сложного наибольшего правдоподобия (Maximum Composite Likelihood method) (Tamura et al., 2004) и даны на шкале в виде числа замен нуклеотидов. Дерево построено при помощи программы MEGA4 (Tamura et al., 2007). Все исследованные штаммы кластеризовались в отдельные группы: группа Xanthomonas arboricola, X. hortorum, X. campestris, X. oryzae. Виды X. arboricola, X. hortorum, X. campestris отличались высоким внутривидовым разнообразием (были представлены патоварами из различных растений-хозяев). Возможно, гетерогенность генов «домашнего хозяйства», связана с фенотипическими различиями отдельных видов. Виды, X. cynarae, X. gardneri и X. hortorum, формировались в единую гетерогенную группу. В целом, MLST показал высокую степень сходства последовательностей штаммов рода Xanthomonas из российской коллекции с секвенированными последовательностями штаммов соответствующих видов из базы данных Генбанка (рис.3.2.1., 3.2.2, 3.2.3., 3.2.4.) 3.3. Оценка вирулентности штаммов Для проведения данной работы были использованы штаммы, представленные в таблице 2.1. По результатам проведенного анализа, все бактерии вызывали реакцию восприимчивости на соответствующих растениях-хозяевах (табл. 3.3.1). Штаммы Xanthomonas oryzae были вирулентны только на рисе. Симптомы 66 наблюдались через 48-72 ч, появились водянистые штрихи в месте инокуляции. Штрихи со временем увеличились и пожелтели. Все штаммы X. campestris, были вирулентны для крестоцветных культур. Штаммы jA и j1, выделенные из капусты в Японии, поражали, кроме растения-хозяина также рис. Все штаммы XCC, выделенные из риса, поражали рис и капусту. В условиях теплицы при искусственном заражении растений различных видов большинство штаммов X. arboricola были вирулентными на соответствующих растениях-хозяевах, но также вызывали поражение растений других семейств, включая сложноцветные, злаки, пасленовые и крестоцветные. Типовые штаммы X. arboricola были вирулентными только на соответствующих растениях-хозяевах. Симптомы заболеваний, вызываемых X. arboricola практически не отличались от болезней, причиняемых другими Xanthomonas spp., специализирующимися на тех же растениях-хозяевах. На листьях злаков появлялись светло-зеленые водянистые пятна. На стеблях появлялись полосы черного или коричневого цвета. На колосьях - почернение верхней части чешуй. Для крестоцветных было характерно увядание, пожелтение и некроз тканей пораженных листьев между жилками листа в виде буквы V, потемнение сосудов стебля или кочерыги. На основании полученных результатов, можно сделать вывод, что исследуемые штаммы X. arboricola поражают более широкий спектр растений-хозяев (имеют широкую экологическую нишу) по сравнению с другими Xanthomonas spp. 67 Таблица 3.3.1 - Вирулентность типовых штаммов Xanthomonas sp. и выделенных штаммов на растениях-хозяевах различных семейств Штамм Растениехозяин Источник выделени я изолята NCPPB 3002T NCPPB 1585 T Рис NCPPB 45 jA j1 X.O. 8182 X.O 6163 X.O. 8183 X.O. 8160 Капуста Капуста Капуста R-3024 R-3023 R-1411 P-3012 P-3011 Ov -3032 Рис Рожь Пшеница Овес ICMP 5726 Фундук Xt-2 Пшеница Пеларго ния Капуста - HR - -HR - Рис Фундук Xanthomonas oryzae + + - Овес Пшеница Рожь Ячмень - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - Xanthomonas campestris pv. Campestris + + + + + + + + + + + + + Xanthomonas hortorum pv. Vitians + + + + + + + + + + + + X. arboricola pv. corylina - HR + - HR - HR - HR - HR - HR - HR - HR X. arboricola Y3004 30 - + Овес - + ± ± ± ± ± Подсолнеч ник Подсолнеч ник Подсолнеч ник Подсолнеч ник Подсолнеч ник Капуста Капуста Капуста - - - + - - - - - - - + - - - - - - - + - - - - - - - + - - - - - - - + - - - - - + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Ячмень 3027 3028 1340 S3 516 1329 1340 1392 1393 1394 X.O. 21 X.O.106 X.O. 8166 Рис - + - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + * (+) – вирулентен, (-) – не вирулентен, (±) – слабая вирулентность, HR- реакция сверхчувствительности. Растения: Капуста – сорт Wirosa F1, Рис – сорт Рассвет, Фундук сорт Местный, Овес – сорт Скакун, Пшеница - сорта Московская 39, и Московская 56, Рожь - сорт Пурга, Ячмень – сорта Пасадена и Жозефин. 68 ГЛАВА IV. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА XANTHOMONAS, ПОРАЖАЮЖИХ ЗЛАКОВЫЕ КУЛЬТУРЫ 4.1 Оптимизация метода выделения бактерий из семян ячменя и риса Единственным способом передачи бактериозов на дальние расстояния являются зараженные семена. Посев зараженными семенами может привести к снижению всхожести семян, энергии прорастания, и как следствие к серьезному недобору урожая. Поэтому, большое значение имеет выделение бактерий из зараженных семян с последующей их диагностикой. В настоящее время нет единой методики для экстракции бактерий из семян растений сем. Мятликовые. Поэтому, данная глава посвящена оптимизации выделения бактерий из семян. Для работы мы использовали семена ячменя и риса, так как данные культуры являются пленчатыми и бактерии могут находиться как на поверхности семени, так под оболочкой. Нашей задачей было подобрать оптимальный метод экстракции, при котором выделяется наибольшее количество разнообразных бактерий. А также убедиться, что данный метод пригоден для выделения бактерий рода Xanthomonas. Разные авторы приводят свои методы выделения бактерий. По мнению Xie Guanlin и соавторов (2003), а также Hassankiaden и др. (2011) для выделения бактерий из семян риса достаточно замочить семена в PBS с добавлением Твин 20 и высеять экстракт на среду. Cottyn и др. (1996) утверждает, что для выделения бактерий, в том числе Xanthomonas spp. необходимо разрушить оболочку семени. Также, согласно протоколу EPPO Bulletin 37, для выделения бактерий рода Xanthomonas из семян, необходимо разрушить семенную оболочку. В нашем опыте оценивалось пять различных методов выделения бактерий из семян риса. Все методы подробно описаны в Главе II «Материалы и методы». 69 В таблице 4.1.1 приведены результаты по количеству выросших колоний на чашках Петри по каждому методу. Для опыта использовали семена риса сорта Луговой (ООО «Агро Сангсэнг») из Приморского края, урожай 2011 года. Для каждого метода повторность была 3-х кратная. Таблица 4.1.1. - Эффективность экстракции бактерий из инокулированных семян риса сорта Луговой № 1 2 3 4 5 Описание метода Метод №1: PBS + шейкер + грубый фильтр Метод №2: PBS + шейкер, гомогенизатор + грубый фильтр Метод №3: PBS + грубый фильтр Метод №4: стерилизация семян в 10% гипохлорите натрия PBS + шейкер + грубый фильтр Метод №5: стерилизация семян в 10% гипохлорите натрия PBS + шейкер + грубый фильтр Повт орно сти 1 2 3 1-е разв >1000 >1000 >1000 Число колоний на чашке Петри, шт 2-е 3-е 4-е 5-е 6-е 7-е разв разв разв разв разв разв >1000 30 10 1 200 75 7 1 180 50 3 1 - 1 >1000 >1000 >1000 >1000 40 21 2 3 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 43 56 1 2 3 1 2 3 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 150 140 80 >1000 >1000 >1000 45 32 28 >1000 >1000 >1000 1 >1000 >1000 >1000 2 >1000 >1000 3 >1000 >1000 8-е разв - 9-е разв - 15 7 2 17 18 6 13 3 9 5 13 8 6 2 20 8 10 2 3 10 4 - - - >1000 75 68 20 13 5 >1000 >1000 55 50 5 3 2 >1000 >1000 >100 0 60 13 13 9 Кроме количества выросших колоний также оценивали видовое разнообразие бактерий. Для этого отбирали морфологически разные колонии, проводили амплификацию с универсальными праймерами 8UA/519B на бактерии с последующим секвенированием. Результаты представлены в таблице 4.1.2. 70 Таблица 4.1.2 – Видовой состав бактерий, выделенных из семян риса сорта Луговой, различными методиками № п/п Метод Морфология колоний Ярко-оранжевые круглые 1 PBS + шейкер + грубый фильтр 2 PBS + шейкер, гомогенизатор + грубый фильтр PBS + грубый фильтр 5 Бледно-кремовые выпуклые Ярко-оранжевые круглые Бледно-желтые Желтые конусовидной формы Ярко-оранжевые круглые 3 4 Ярко-желтые выпуклые Бледно-кремовые выпуклые Ярко-желтые выпуклые Темно-желтые выпуклые Светло-красные точечные стерилизация семян в 10% гипохлорите натрия PBS + шейкер + грубый фильтр стерилизация семян в 10% гипохлорите натрия PBS + шейкер + грубый фильтр Ярко-желтые выпуклые Бледно-кремовые выпуклые Ярко-желтые выпуклые Ярко-оранжевые круглые Ярко-желтые выпуклые Темно-желтые выпуклые Светло-красные точечные Бледно-кремовые выпуклые Ярко-оранжевые круглые Секвенирование с праймерами 8UA/519B Microbacterium testaceum Pantoea ananatis Pseudomonas poae Xanthomonas spp. Pantoea ananatis Curtobacterium flaccumfaciens Pseudomonas poae Microbacterium testaceum Plantibacter spp. Pseudomonas fulva Microbacterium testaceum Pantoea ananatis Pseudomonas poae Pantoea ananatis Microbacterium testaceum Xanthomonas spp. Pantoea ananatis Curtobacterium flaccumfaciens Pseudomonas poae Microbacterium testaceum Примечание: повторность опыта 3-х кратная. Из табл. 4.1.1 видно, что наиболее подходящим методом выделения является метод выделения №2 и №5 с использованием гомогенизатора для размола семян, так как семена риса содержат оболочку (пленку), под которой находится основное количество патогенной и сапротрофной микрофлоры. В ходе опыта было выделено 6 видов бактерий: Xanthomonas spp., Pantoea ananatis, Curtobacterium flaccumfaciens, Pseudomonas poae, Microbacterium testaceum, Plantibacter spp., Pseudomonas fulva. Три из них известны, как патогены растений: Xanthomonas spp., Curtobacterium flaccumfaciens, Pantoea ananatis. Остальные бактерии не 71 являются патогенами риса и могут жить на поверхности семян риса, как сапрофиты. Из табл. 4.1.2 видно, что способ экстракции также влияет на видовое разнообразие выделяемых бактерий. Использование гомогенизатора в методах №2 и 5 позволяет выделять наибольшее количество разных видов бактерий. В частности, бактерии рода Xanthomonas, Curtobacterium, Plantibacter удалось выделить только с применением гомогенизатора. Стерилизация семян с помощью 10% гипохлорита натрия повлияла только на некоторые виды бактерий, находящиеся на поверхности семени, и не отразилась на бактериях, которые находятся под оболочкой. Но стоит отметить, что чашки Петри меньше были загрязнены грибной микрофлорой после предварительной стерилизации семян. Аналогичный эксперимент также был проведен с семенами ячменя сорта Пасадена (Воронежская область, урожай 2011 года). Результаты оказались идентичные с опытом с семенами сорта Луговой (Таблица 4.1.3). В целом можно сделать вывод о том, что для экстракции бактерий рода Xanthomonas из семян риса, ячменя лучше всего использовать метод № 5 с предварительной стерилизацией и механическим разрушением зерновки. Таблица 4.1.3. - Эффективность экстракции бактерий из инокулированных семян риса сорта Пасадена № 1 2 3 4 Описание метода PBS + шейкер + грубый фильтр PBS + шейкер, гомогенизатор + грубый фильтр PBS + грубый фильтр стерилизация семян в 10% гипохлорите натрия PBS + шейкер + Повт орно сти 1 2 3 1 1-е разв >1000 >1000 >1000 >1000 2-е разв >1000 200 180 >1000 Число колоний на чашке Петри, шт 3-е 4-е 5-е 6-е 7-е разв разв разв разв разв 130 20 3 105 17 6 90 23 4 >1000 >1000 98 41 25 2 3 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 86 123 27 38 16 32 1 2 3 1 2 3 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 150 140 80 >1000 >1000 >1000 95 72 68 >1000 >1000 >1000 43 28 26 23 34 28 20 13 12 11 15 11 5 5 2 1 3 2 8-е разв 12 5 9-е разв 6 18 3 7 - - 72 грубый фильтр 5 стерилизация семян в 10% гипохлорите натрия PBS + шейкер + грубый фильтр 4.2. 1 >1000 >1000 >1000 >1000 134 28 10 2 >1000 >1000 >1000 >1000 145 34 15 3 >1000 >1000 >1000 >1000 >100 0 123 23 Идентификация возбудителей бактериозов 11 4 9 1 10 3 методом классической ПЦР и прямого секвенирования В настоящее время традиционные методы диагностики фитопатогенов далеко не всегда дают положительный эффект, что вызывает необходимость создания и постоянного усовершенствования чувствительных и специфичных тестов, пригодных для рутинной диагностики и не требующих большого количества материала для анализа. Поэтому более чувствительные молекулярные технологии приходят на смену традиционным методам. В настоящее время основу методов изучения возбудителей болезней растений во многих странах составляют молекулярно-генетические методы, из которых наиболее распространенным является ПЦР. Этот метод позволяет значительно сократить время между отбором исследуемого образца и определением конкретного вида возбудителя по сравнению с традиционными методами, выполнение которых может занимать от 5 и более дней. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) К.Муллисом и его сотрудниками в 1985 году революционизировало молекулярную медицину и молекулярную биологию (Saiki et al., 1985). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод биохимической технологии в молекулярной биологии, используемый для того, чтобы ферментативно амплифицировать (умножить) специфический участок ДНК, что позволяет создать от нескольких тысяч до миллионов копий определенной последовательности ДНК. Результат регистрируют после окончания реакции при помощи ряда методов, наиболее распространенным является метод электрофореза в агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. 73 Процедура молекулярно фитопатологической диагностики, как правило, состоит из следующих стадий, представленных на рисунке 4.2.1: сбор образцов, выделение ДНК возбудителей, амплификация локусов бактериальной ДНК методом электрофореза, расшифровка ПЦР, регистрация структуры продукта методом амплифицированных локусов (секвенирование), сравнительный анализ в базе данных (идентификация) (http://www.rcfh.ru/). Метод расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот принято называть методом секвенирования, который позволяет определить последовательность организма с точностью до каждой буквы генома. Это дает возможность сравнивать организмы по числу нуклеотидов от нескольких сотен (по отдельному гену или фрагменту ДНК) до многих миллионов (для полного генома). Сейчас созданы генетические базы данных, в которых хранится информация о генах проанализированных организмов. Эти данные находятся в базе данных GenBank и используются для сравнения полученных последовательностей ДНК. . Рисунок 4.2.1. - Схема проведения молекулярно-генетической диагностики патогенов в семенном материале В данном разделе нашей задачей было проверить коллекцию штаммов на принадлежность к роду Xanthomonas, оптимизировать специфичные праймеры для карантинноного вида Xanthomonas oryzae, а также 74 расшифровать последовательности ДНК бактерий, выделенных из семян злаковых культур (таблица 4.2.1). Таблица 4.2.1 – Специфичность праймеров при диагностике Xanthomonas sрp. Праймеры Вид X. oryzae pv.oryzae X. oryzae pv.orizicola X.campestris X.hortorum X arboricola X.cynarae X.pisi X.gardeneri X. translucens X. fragariae X.axonopodis Универсальные праймеры на бактерии 8UAF 27F 519B R 1492 R Xanthomonas spp. X. oryzae Xnth804F XnthR 1405 XdnaK1 F XdnaK1 R XfyuA1F XfyuA1R XrpoD1F XrpoD1R XgyrB1F XgyrB1R TXT TXT4R + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + + + + + + + + + + + + Примечание: «+» положительный результат ПЦР, «-» отрицательный результат ПЦР С образцами ДНК, выделенной из штаммов бактерий рода Xanthomonas, проводили постановку классической ПЦР. Всего было проанализировано 8 пар праймеров, из которых 2 пары олигонуклеотидов, специфичные к гену 16S рРНК были универсальны для всех бактерий. Одна пара праймеров, специфичная к межгенному участку XCC0007-tonB – универсальна для рода Xanthomonas. Четыре пары праймеров использованы для проведения анализа MLST. Одна пара олигонуклеотидов - специфичная для карантинного вредного организма Xanthomonas oryzae (табл. 4.2.1). Для каждой пары праймеров была проведена оптимизация состава реакционной смеси. На основе имеющейся коллекции референтных и коллекционных штаммов были испытаны праймеры Xnth804F/1405R, позволяющие идентифицировать известные бактерии рода Xanthomonas (табл. 4.2.2). Наличие продукта амплификации 623 п.о. свидетельствовало о присутствии в образце бактерий рода Xanthomonas. 75 Таблица 4.2.2 - Специфичность праймеров Xnth804F/1405R для диагностики Xanthomonas sрp. Название штамма X.oryzae pv.oryzae 3002Т X.oryzae pv.oryzae 793Т X arboricola pv. pruni 420Т X.translucens pv.undulosa 1945Т X.O 8182 X.O 6163 X.O 8183 X.O 63 X.O 1873 X.O 8166 X.O 106 X.O 46 X.O 8160 X.O PYO-63 X.O 21 X.O 6563 3002 Т П-2009 П-3016 П-1248 П-3010 П-2003 П-3006 П-3007 П-3015 П-14 П-3016 П-1244 П-3009 П-11 П-1242 П-3011 П-3012 П-3008 П-2000 П-1247 П-1248 П-1251 П-1253 П-1009 П-926.9 R-3024 R-1007 Морфология Желтые, блестящие колонии на среде YDC + Методы подтверждения Xnth804F/1405R 623 п.о. Название штамма Методы подтверждения Xnth804F/1405R 623 п.о. R-171 Морфология Желтые, блестящие колонии на среде YDC + + + + R-141 + + + + R-3022 - + + R-1007 + + + + + + + + + + + + + + + + R-3021 R-3023 B-3026 B-3027 Я – 3013 Я- 3004 П- 40 Ят-27 Ят-30 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Я 1268 1631.4 X.t 12 0552А 5219 X.p.207 Ов. 3031 Ов. 3028 Ов. 3029 Ов. 3032 512 X.t 2 X.t 7 324 В-1265 В-42 В3003 529 Ят 30 S1 Xt 28 X.ar 1391 Ex 5-6 Sf-5 X.ar 1363 X.sp J A X.O 793 X.ar 1395 X.sp J 1 R-149 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 76 При постановке ПЦР с праймерами, специфичными для рода Xanthomonas было установлено, что они реагировали только со штаммами рода, для которого они были синтезированы и не реагировали с другими бактериями. При выделении бактерии из семян риса и ячменя, отбирались подозрительные колонии, и проводилась ПЦР с праймерами Xnth804F/1405R на наличии бактерий рода Xanthomonas. Таким образом, данные праймеры могут быть предложены в качестве арбитрарных при проведении экспертизы на зараженность образцов бактериями рода Xanthomonas. Для специфической идентификации Xanthomonas oryzae были использованы праймеры TXT/TXT-4R. Праймеры TXT/ TXT-4R, приводят к образованию специфичных фрагментов размером 954 п.о. только у штаммов X. o. pv. oryzae и X. o. pv.oryzicola и не амплифицируют продукты у патогенных и сапротрофных бактерий других родов, а также у других видов рода Xanthomonas (George et al., 1994). Результаты амплификации представлены на рисунке 4.2.1. ПЦР с использованием праймеров TXT и TXT4R может быть использована для детекции штаммов Xanthomonas oryzae из различных географических зон (Sakthivel et al., 2001). Проведение ПЦР с парой праймеров TXT/ TXT-4R только в первой дорожке с типовым штаммом Xanthomonas oryzae pv.oryzae NCPPB 3002 показало наличие полосы размером 964 п.о. Отсутствие продуктов амплификации в остальных дорожках свидетельствует о том, что данные штаммы не являются X. oryzae. 77 Рисунок 4.2.1. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР с праймерами TXT/ TXT-4R: 1.К+ Xanthomonas oryzae 3002Т; 2. X. arboricola 3004; 3. X. hortorum; 4. X. campestris; 5. X. gardeneri; 6. X. cynarae ; К - вода; М - маркер GeneRuler™ Праймеры были оптимизированы по концентрации матричной ДНК типового штамма X. oryzae pv.oryzae 3002Т с использованием 5х Master Mix и 10х Master Mix. Результаты представлены на рисунке 4.2.2. Оптимальной концентрацией матричной ДНК для проведения ПЦР для идентификации X. oryzae является 0,2 ng/реакцию (рис.4.2.2). Для диагностики бактерий, которые выделяли из семян злаковых культур, использовали универсальные праймеры на бактерии 8UA/519B. Мультилокусный анализ последовательностей коллекционных и выделенных штаммов бактерий рода Xanthomonas был проведен с использованием четырех генов: dnaK, fyuA, gyrB и rpoD. последовательности гена были амплифицированы Все четыре для штаммов X. arboricola, X. axonopodis, X. campestris, X. fragariae, X. hortorum, X. oryzae, X. pisi, X. vesicatoria. Не удалось амплифицировать гены dnaK and fyuA для X. translucens. 78 Рисунок 4.2.2 - Электрофоретический анализ продуктов ПЦР с праймерами TXT/ TXT-4R: дорожка 1-5 Master Mix 10X: 1. X.О 3002Т (48,9 ng/ml ); 2. X.О. 3002Т (97,8 ng/ml); 3. X.О. 3002Т (146,7 ng/ml ); 4. X.О. 3002Т (195,6 ng/ml); 5. К- . дорожка 6-10 Master Mix 5X: 6. X.О. 3002Т (48,9 ng/ml) 1; 7. X.О. 3002Т (97,8 ng/ml); 8. X.О. 3002Т (146,7 ng/ml); 9. X.О. 3002Т (195,6 ng/ml); 10. К-; М - маркер GeneRuler™. Далее проводили прямое идентифицировать неизвестные секвенирование, которое позволяло образцы. Последовательности после секвенирования выравнивали при помощи программы BioEdit. Выровненные последовательности оценивали в приложении BLAST NCBI. 4.3. Разработка методов выявления и идентификации Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени». ДНК–диагностика, основанная на полимеразной цепной реакции новое направление, которое используют в защите растений. В настоящее время использование ПЦР для диагностики патогенов растений получило широкое применение. Данный метод имеет ряд недостатков, несмотря на высокую специфичность и чувствительность метода. При проведении классической ПЦР установливают наличие или отсутствие объекта, а регистрация результата реакции не дает информации об эффективности процесса. В связи с этим был предложен метод, позволяющий регистрировать накопление 79 ДНК непосредственно в ходе реакции – ПЦР в реальном времени (англ.Realtime PCR). При постанове ПЦР в реальном времени наличие целевой мишени в изучаемом образце определяется ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в реакционной смеси. Флуоресценция от каждого исследуемого образца начинает пересекать величину пороговой линии (threshold line) на определенном цикле амплификации (Сt - threshold cycle). Чем меньше исходное количество ДНК в анализируемом образце, тем больше необходимо количество циклов, для того, чтобы флуоресценция достигла порогового значения. И наоборот: чем меньше величина Ct, определенная для данного образца, тем выше изначальная концентрация ДНК-мишени (Ребриков и др., 2009). Использование этого метода в практической диагностике позволяет значительно снизить затраты времени на постановку и проведение эксперимента. ПЦР в реальном времени сокращает вероятность контаминации, т.к. детекция результатов проходит в закрытой пробирке и значительно упрощает требования к организации лаборатории. Данный раздел работы посвящен подбору и оптимизации праймеров и зондов с целью создания на их основе ДНК – диагностики, позволяющей методом ПЦР в реальном времени диагностировать бактерии Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola. Подбор праймеров и зондов, определение их специфичности. На начальном этапе исследований нами была проанализирована литература, характеризующая различия в пределах рода Xanthomonas на уровне нуклеотидных последовательностей определенных участков генома. Наиболее подходящим геном - мишенью для разработки видоспецифичных праймеров и зондов является ген субъединицы Б фермента ДНК-гиразы (gyrB) (Parkinson et al., 2007, Пунина и др., 2008). Выбранный участок генома бактерий эволюционируют быстрее от 4 до 10 раз, чем 16S рРНК, и является перспективным объектом для изучения 80 филогении бактерий и создания маркерной системы эффективной на уровне вида и даже штамма (Yamomoto et al., 1996; Yamomoto et al., 1999). Из базы данных GenВank (www.ncbi.nlm.nih.gov) были выбраны нуклеотидные последовательности гена gyrB бактерий рода Xanthomonas. Также при анализе использовали данные секвенирования данного гена у чистых культур Xanthomonas sрp. из коллекции ГНУ - ВНИИ фитопатологии РАСХН. Для анализа были выбраны последовательности, характерные для каждого вида ксантомонад. Всего было проанализировано около 48 нуклеотидных фрагментов. Анализ последовательностей и выбор праймеров проводили с помощью программ «BioEdit» и «Primer 3». Подбор праймеров, специфичных для X. oryzae и X. arboricola основывался на наименьшей комплементарности целевого участка гена gyr B гомологичным участкам других видов бактерий рода Xanthomonas (рис 4.3.1а, б; 4.3.2а, б). При подборе пар олигонуклеотидов учитывали количество G/C-оснований, которое должно быть не более 50% в последовательности. Температура отжига праймеров должна быть ниже температуры отжига зонда. Разница в температуре плавления каждого из праймеров не более 6°C Специфичность предложенных олигонуклеотидов была изучена с помощью приложения PrimerBLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). В результате, была показана специфичность подобранных маркеров по отношению к гену gyr B видов X. oryzae и X. arboricola, и не обнаружено гомологии с нуклеотидными последовательностями других близкородственных или сопутствующих патогенов. 81 а б в Рисунок 4.3.1. Подбор специфичных праймеров и зонда для Xanthomonas oryzae (а - прямой праймер X.or F, б - обратный праймер X.or. R, в – зонд X.OR.-P). 82 а б в Рисунок 4.3.2. Подбор специфичных праймеров и зонда для Xanthomonas arboricola (а - прямой праймер X.arb-F, б - обратный праймер X.arb-R, в – зонд X.arbP). 83 На основании анализа выровненных последовательностей гена gyr B бактерий рода Xanthomonas были подобраны меченные флуоресцентными красителями (НЕХ, ROX) зонды, специфичные для X. oryzae и X. arboricola. В анализируемых последовательностях выбирали участки с наибольшим количеством несовпадений по нуклеотидам между видами. При подборе зондов руководствовались общими требованиями к зондам, используемым в ПЦР: температура отжига зонда превышала температуру отжига праймеров примерно на 10°C, соотношение GC-оснований составляло не более 50%. При подборе праймеров и зонда для выявления X. oryzae pv.oryzae и X. oryzae pv. oryzicola учитывали, что разница между этими возбудителями по гену gyr B минимальна. Анализ двух видов показал, что, будучи выровненными, последовательности имеют практически гомологичные участки с разницей всего в несколько нуклеотидов. В связи с тем, что каждый из видов относится к возбудителю с одним растением-хозяином, выявление вида Xanthomonas oryzae проводили в целом. Для вида был подобран один зонд и одна пара праймеров. Анализ разных патовариантов Xanthomonas arboricola (pv. fragariae, pv. pruni, pv. corylina, pv. populi) показал, что данные последовательности по гену gyr B имеют практически гомологичные участки с разницей всего в несколько нуклеотидов. Поэтому, праймеры и зонд подбирались в целом для вида X. arboricola. Таким образом, на основании выровненных последовательностей гена gyr B, нами были подобраны праймеры и меченные флуоресцентными красителями (НЕХ и ROХ) зонды, специфичные для X. oryzae и X. arboricola соответственно. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходила в определенном для него диапазоне. Праймеры и зонды были проанализированы с помощью сервера Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) для определения специфичности подобранных олигонуклеотидов. 84 Проверку специфичности подобранных зондов и праймеров осуществляли на штаммах Xanthomonas sрp. из коллекции ГНУ - ВНИИ фитопатологии РАСХН, а также на штаммах из коллекции NCPPB. Для этого проводили ПЦР «в реальном времени» с использованием праймеров и зондов, специфичных для X. oryzae и X. arboricola с образцами ДНК разных видов бактерий рода Xanthomonas, а также других видов бактерий. При определении специфичности разработанных зондов установлено, что флуоресценция по красителю НЕX и ROX регистрировались только при исследовании ДНК данного возбудителя. При тестировании других бактерий рода Xanthomonas и других видов бактерий зафиксирован отрицательный результат, что свидетельствует об отсутствии ложноположительных результатов. Данные представлены в таблице 4.3.1. Таблица 4.3.1 - Специфичность ПЦР «в реальном времени» с зондом X.OR.-P и X.arb-P Значение Ct* с подобранными зондами ДНК возбудителя X. oryzae X.campestris X.axonopodis X.arboricola X.hortorum X.cynarae X.pisi X.gardeneri Erwinia amylovora Dickeya dianthicola Pantoea agglomerans Pseudomonas sp. Зонд X.OR.-P 23,96 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Зонд X.arb-P NA** NA NA 24,56 NA NA NA NA NA NA NA NA Примечание: *Ct-значение порогового цикла, **N/A - отсутствие сигнала флуоресценции Оптимизация ПЦР «в реальном времени». Для оптимизации ПЦР «в реальном времени» были учтены следующие факторы: температура отжига каждого из зондов и его концентрация необходимая для реакции. 85 На специфичность амплификации влияет правильно подобранная температура отжига зондов, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками целевого патогена. При температуре в пределах 50-60оС зонды гибридизуются с комплементарными последовательностями на матричных цепочках ДНК. Температура отжига зонда ниже или выше оптимальной, может привести к получению ложноположительных результатов. Это связано с гибридизацией зондов с неспецифичными последовательностями, которые могут обладать частичной гомологией с целевым участком ДНК. Поэтому на этапе оптимизации ПЦР «в реальном времени» очень важно правильно подобрать температуру отжига зонда (Ребриков и др., 2009). При разработке ПЦР «в реальном времени» эффективность метода зависит от вносимой в реакцию концентрации зонда которая влияет на температуру отжига и поэтому должна учитываться в процессе подбора зонда. Высокая или низкая концентрация зонда может приводить к повышению или понижению значения порогового цикла Ct и как следствие получение недостоверных результатов. Определение оптимальных условий ПЦР «в реальном времени» проводили на амплификаторе i-Cycler iQ 5, изменяя следующие параметры: температуру отжига зонда (от 550С до 650С); концентрацию зондов и праймеров (от 5 пМ до 10 пМ и от 7,5 пМ до 20 пМ), соответственно на реакцию, объемом 25 мкл. Количество остальных компонентов реакционной смеси не изменяли. Амплификацию проводили в следующем режиме: преденатурация 1 цикл 950C– 5 мин; 40 циклов: денатурация 950C – 15 с., элонгация и отжиг 560C – 40 с. Количество циклов амплификации не изменяли, т.к. это увеличило риск появления ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Экспериментальный подбор оптимальной температуры отжига каждого зонда проводили с использованием градиента температуры отжига (550C 650C). В таблице 4.3.2. представлены результаты ПЦР «в реальном времени» 86 с праймерами и зондами для X. oryzae, X.arboricola. Как видно из таблицы, значения порогового цикла детекции флуоресценции различались при использовании различных температур отжига зондов. Минимальное значение порогового цикла (Ct) для зонда X. oryzae соответствовала 61,43°C. С увеличением температуры отжига зондов начинало повышаться значение Ct, что означало уменьшение специфичности системы. Для этого зонда оптимальной температурой отжига зонда являлась 61°C. Для зонда X.arboricola оптимальной была выбрана температура отжига 55°C, так как при данной температуре регистрировалось минимальное значение порогового цикла (Ct). Таблица 4.3.2 - Определение температуры отжига зондов при постановке ПЦР «в реальном времени» для X. oryzae, X.arboricola Температура отжига,С° 65 64,46 63,27 61,43 58,8 57 55,8 55 Значение Ct X. oryzae 31,55 30,88 29,55 24,47 25,10 25,36 24,96 25,04 X.arboricola N/A N/A 30,20 27,37 26,97 26,75 27,44 24,73 Для определения оптимальной концентрации зондов и праймеров, были приготовлены реакционные смеси с разным количеством зонда от 2,5 пМ до 10 пМ и праймеров от 7,5 пМ до 20 пМ. Из таблицы 4.3.3. видно, что концентрация зонда и праймера для X.oryzae в составе реакционной смеси не оказывала сильного влияния на значение Ct. Однако при внесении зонда в концентрации 5 пмоль и праймеров в концентрации 7,5 пмоль значение Ct для зонда было наименьшим. Таким образом, наиболее подходящее количество зонда на реакцию составляло 5 пмоль зонда и 7,5 пмоль праймеров. Для X.arboricola концентрация зонда и праймера в составе реакционной смеси сильно влияла на значение Ct. Как видно из таблицы 87 4.3.3, наиболее оптимальным была концентрации зонда 5 пмоль/реакц и концентрация праймеров 20 пмоль/реакц. Таблица 4.3.3 - Определение оптимальной концентрации зонда и праймеров при постановке ПЦР «в реальном времени» Концентрация праймера и зонда, пмоль/ реакц 7,5+5 7,5+7,5 7,5+10 15+ 5 15+7,5 15+10 20+5 20+7,5 20+10 Значение Ct X.oryzae X.arboricola 22,36 26,66 26,49 26,49 26,65 26,15 26,05 26,5 26,15 28,88 N/A 30,32 N/A N/A N/A 23,68 25,67 31,91 Определение чувствительности ПЦР «в реальном времени» при диагностике X. oryzae и X.arboricola. При постановке ПЦР «в реальном времени» чувствительность каждого из подобранных зондов определяли путем внесения известного числа клеток возбудителя с последующей постановкой ПЦР в «реальном времени». Готовили суспензию клеток X. oryzae и X.arboricola. Определение концентрации бактериальной суспензии проводили методом серийных разведений. Подсчет колоний проводили через сутки и рассчитывали концентрацию бактерий (КОЕ/мл). Образцы ДНК каждого разведения возбудителей ставили с подобранными видоспецифичными зондами. Результаты исследования представлены в таблице 4.3.4. Таблица 4.3.4 - Значение Ct при разных концентрациях бактериальной суспензии при постановке ПЦР «в реальном времени» X. oryzae - зонд X.OR.-P К-ция X. 5,2х106 oryzae клеток/мл Значение 25,86 Ct* 5,2х105 5,2х104 5,2х103 5,2х102 5,2х101 5,2х100 5,2х10-1 26,03 27,39 29,05 32,18 33,15 35,14 N/A 88 X.arboricola – зонд и X.arb-P К-ция X. arboricola клеток/мл Значение Ct 4,3х106 4,3х105 4,3х104 4,3х103 4,3х102 4,3х101 4,3х100 4,3х10-1 26,01 26,9 27,34 28,32 30,06 34,25 N/A** N/A Примечание: *Ct-значение порогового цикла, **N/A - отсутствие сигнала флуоресценции Из таблицы видно, что концентрация бактериальной суспензии влияла на значение порогового цикла Ct. С уменьшением концентрации, увеличивалось значение порогового цикла, что указывало на снижение содержавшейся ДНК в образце. Таким образом, чем ниже был предел обнаружения возбудителей, тем выше была чувствительность подобранного зонда. В результате проведенных исследований были определены оптимальные условия для проведения ПЦР в режиме реального времени для видов X. oryzae и X.arboricola: выбран наиболее оптимальный температурный режим отжига специфичных зондов - 61°С и 55°С соответственно, и определены оптимальные концентрации праймеров и зондов, подобранных к гену gyr B, которые составили 7,5 и 5 пмоль для X.oryzae и 20 и 5 пМ для X.arboricola на реакцию. Применение таких условий при постановке ПЦР «в реальном времени» делают метод более чувствительным и специфичным для выявления X. oryzae и X.arboricola. Была также показана высокая специфичность разработанных методов, при которых только в положительных образцах наблюдалась детекция по соответствующему красителю. Чувствительность ПЦР в реальном времени составила не менее 5,2х100 клеток/мл для идентификации X. oryzae и 4,3х101 клеток/мл для X.arboricola. 4.4. Применение БИО-ПЦР и сравнение чувствительности данного метода с постановкой прямого ПЦР анализа В отличие от прямой ПЦР, в БИО-ПЦР анализируемый образец высевают на питательную среду и инкубируют, при температуре 89 оптимальной для роста целевой бактерии (рис. 4.4.1). При этом повышается чувствительность диагностики, во-первых, за счет снижения ингибирующего действия веществ растительного экстракта на процесс амплификации, вовторых, за счет селективного размножения целевой бактерии. Кроме того, за счет селективности питательной среды подавляется развитие сапротрофной микробиоты. Детекция продуктов амплификации Получение семенного экстракта Прямая ПЦР БИО-ПЦР Селективная питательная среда Рисунок 4.4.1-Схема прямой ПЦР и Био-ПЦР Настоящий раздел работы посвящен подбору питательной среды для проведения Био-ПЦР диагностики возбудителя бактериального ожога риса и сравнение чувствительности прямой и Био-ПЦР. В работе использовали партию семян риса сорта Дарий 23, которая была получена из Приморского края, урожай 2011 года, свободный от бактерий рода Xanthomonas. Семена искусственно заражали типовым штаммом X. oryzae pv. oryzae NCCPB 3002Т в условиях вакуума. Сравнение чувствительности прямого и БИО-ПЦР анализа проводили путем внесения известного числа клеток возбудителя в семенной экстракт с последующей постановкой ПЦР. Готовили суспензию клеток Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Определение концентрации бактериальной суспензии 90 проводили методом серийных разведений. Подсчет колоний проводили через сутки и рассчитывали концентрацию бактерий (КОЕ/мл). Далее проводили экстракцию бактерий по оптимизированной методике (глава IV). Из каждого разведения бактериальной суспензии вносили по 100 мкл к 1 мл семенного экстракта. Таким образом, формировали различные варианты семенных экстрактов с известным количеством клеток возбудителя. На первоначальном этапе была выбрана оптимальная среда, для роста и размножения целевой бактерии. Из 5 предложенных сред (описаны в главе II) была выбрана среда YPGA, рост бактерий был обнаружен через 17 часов. На средах YDC и КАА примерно через 48 часов, на средах КАА модифиц и XAS на 4 сутки, поэтому для дальнейшей работы была предложена среда YPGA. Далее подбирали антибиотики разных групп в различных концентрациях для использования их в качестве селектирующего фактора для разработки BIO-PCR. Семенной экстракт высевали на чашки со средой YPGA с антибиотиками разных групп и наблюдали за ростом целевой бактерии, а также сапротрофной микробиоты. Только в варианте с использованием комбинации антибиотиков: циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л был виден рост целевой бактерии через сутки. Гентамицин в концентрации больше 2 мг/л подавляет рост всей микрофлоры. На среде с использованием циклогексимида 25 мг/л + цефазолина 15 мг/л также наблюдали рост целевой бактерий, но загрязненной сапротрофной микробиотой, что приводило к снижению чувствительности диагностики. Поэтому, на основе полученных данных, была предложена среда YPGA, содержащая в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л (рис.4.4.2). 91 Рисунок 4.4.2.- Колонии X. oryzae pv. oryzae на среде mYPGA, содержащей в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л Для ПЦР анализа использовали праймеры XOF_XOR и зонд XOP, разработанные для последовательности ПЦР гена в gyr реальном B, – времени специфичность на основании которых была подтверждена на всей коллекции. ПЦР проводили двумя способами: в первом варианте полученный семенной экстракт сразу добавляли в реакционную смесь и ставили ПЦР. Во втором случае семенной экстракт сначала высевали на питательные среды, т.е. проводили Био-ПЦР, затем делали смыв с поверхности чашек через 24 часа после посева, добавляя в чашку 500 мкл стерильного физраствора, и ставили ПЦР. (рис. 4.4.1.). Пробы до проведения ПЦР-анализа хранили при …– 18оС. До постановки ПЦР суспензии предварительно нагревали 15 мин при 950С. Для постановки ПЦР в режиме реального времени брали 5 мкл суспензии. Суспензии 107 КОЕ / мл X. oryzae использовали в качестве положительного контроля, а чистая вода (ПЦР буфер) в качестве отрицательного контроля. 92 При сравнении прямого и БИО-ПЦР анализа было отмечено, что метод БИО-ПЦР оказался в 100 раз чувствительнее прямого ПЦР анализа без предварительного подращивания на твердой питательной среде (табл.4.4.1). Таблица 4.4.1- Чувствительность прямой ПЦР и оптимизированной БИО-ПЦР при диагностики семян риса, зараженных Xanthomonas oryzae. Праймеры X.or F_X.or. R, зонд X.OR.-P. Среда Концентрация Xanthomonas oryzae в семенном экстракте, клеток/мл 5,2х108 5,2х107 5,2х106 5,2х105 5,2х104 5,2х103 5,2х102 5,2х10 Прямая ПЦР 29,92* 30,92 31,54 33,21 34,28 35,61 N/A** N/A БИО-ПЦР 26,06 28,65 29,47 30,05 30,99 32,15 33,87 34,61 K+(ДНК 21,86 25,03 26,39 28,06 30,18 31,14 32,14 33,40 возбудителя) К- (здоровые семена) Примечание: *числовые значения – пороговые значения цикла (Ct) **N/A - отсутствие сигнала флуоресценции Таким образом, была разработана БИО-ПЦР в режиме реального времени для карантинного вида X. oryzae. В режиме реального времени БИОПЦР-анализ включает в себя короткий период инкубации 18-24ч на среде YPGA, содержащая в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин непосредственно ПЦР с 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л., и праймерами XOF_XOR и зондом XOP, специфичные для XOO. Чувствительность метода БИО-ПЦР с использованием разработанной селективной питательной среды составила около 50 КОЕ патогена в 1 мл семенного экстракта без этапа выделения ДНК и без воздействия веществ ингибиторов ПЦР. 93 ГЛАВА V. ПОИСК ЭФФЕКТИВНЫХ ПРИЕМОВ ЗАЩИТЫ ОТ ВОЗБУДИТЕЛЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ОЖОГА ЛИСТЬЕВ РИСА Основными мерами борьбы являются: агротехнические методы, применение химических и биологических средств защиты растений, составление прогноза развития болезни. Наиболее эффективным методом контроля бактериальных заболеваний является посев сортов риса, имеющих устойчивостьк данному заболеванию. (Gnanamanickam et al., 1999; Shenget al., 2005; Tang et al., 2000). Бактериальный ожог можно контролировать при помощи правильного внесения удобрений и соблюдения нормы высева, а также обработкой семян горячей водой. Важно проводить санитарную обработку полей. Необходимо уничтожать самосевные растения, оставшиеся после уборки для минимизации первоначального заражения в начале вегетации. Также рекомендуется вспашка под пар и хорошее просушивание почвы. Химические средства защиты риса от бактериального ожога начали применять на посевах в начале 1950-х годов. Сначала это были профилактические методы с использованием Бордоской жидкости (раствор медного купороса CuSO4 · 5H2O в известковом молоке Ca(OH)2) и тестированием нескольких антибиотиков, ртути и соединений меди. Лабораторные тесты показали, что производные стрептомицина и соединения ртути были наиболее эффективным, но было установлено, что они сильно повреждают зерно во время опрыскивания на стадии колошения (Mizukami and Wakimoto, 1969). В 1960-е годы, различные виды агрохимикатов были разработаны на основе повторных полевых испытаний и стали доступны в большом промышленном масштабе, в основном в Японии. Они были основаны на Lхлорамфениколе, никель-диэтилдитиокарбамате и дитианоне. Большинство из них были ненадежны, из-за изменчивости внутри популяции патогена (Gnanamanickam et al., 1999; Mizukami и Wakimoto, 1969; Ou, 1973). 94 Тем не менее, возбудитель в основном передается через семена – источник первичной инфекции, поэтому в ряде стран в тропической Азии проводят дезинфекцию семян риса ртутными соединениями, растворами антибиотиков или горячей водой. В регионах с умеренным климатом, химический контроль BB в питомниках и на рисовых полях включает применение пробеназол на рисовых плантациях до и после пересадки рассады, для ингибирования размножения бактерий и предотвращения или замедления болезни. Другими химическими веществами, такими как теклофталам, оксид феназина и никеля диэтилдитиокарбамат опрыскивают сами растения (Goto, 1992; Mizukami and Wakimoto, 1969). Тем не менее, химический контроль бактериального ожога риса в тропическом муссонном климате Азии непрактичен, и не обладает эффективным бактерицидным действием для борьбы с данным заболеванием (Lee et al., 2003; Ou, 1973). Xanthomonas oryzae pv. oryzae, X. oryzae pv. oryzicola являются отсутствующими вредными организмами на территории нашей страны. Но, анализ фитосанитарного риска (АФР) для данных возбудителей для территории РФ, проведенный в ФГБУ «ВНИИКР» (Шнейдер, 2006) показал высокий уровень риска заноса и дальнейшего распространения возбудителя бактериального ожога риса для отдельных регионов территории Российской Федерации. Возможное расширение ареалов бактериального ожога в нашу страну потребует усиления контроля над чистотой посевного и посадочного материала, разработки новых методов диагностики бактерий и поиска эффективных бактерицидных препаратов для обеззараживания семян и посадочного материала. Сегодня практически отсутствуют высокоэффективные препараты бактерицидного действия. Чаще всего для повышения качества семян и уничтожения запасов микрофлоры (возбудителей пирикуляриоза, фузариоза, 95 и др.) семена риса протравливают фунгицидами байтан-универсалом (триадименол + фуберидазол + имдзалил) и беломилом (фундазолом). Последнее время в литературе встречается информация о применении в качестве протравителей семян риса фунгициды на основе флудиоксонила, которые обладают не только фунгицидным, но и бактерицидным действием (Harada, Maeda, патент US7189677, 2002). В нашей стране компания «Сингента» предлагает на рынке химических средств защиты препарат Максим, КС - фунгицид для предпосевной обработки клубней семенного картофеля, семян зерновых колосовых и других культур против патогенов, передающихся через семена и почву. Действующее вещество флудиоксонил, которое входит в его состав, относится к новому химическому классу фенилпирролов. Флудиоксонил принципиально отличным от веществ из других химических групп и обладает особым механизмом воздействия на патогены. В нашей работе мы испытали эффективность данного препарата для предпосевного протравливания семян риса от возбудителя бактериального ожога риса. Изучение биологической эффективности препарата проводили на семенах риса инокулированных сорта Луговой возбудителем и Ханкайский бактериального 52, ожога предварительно риса. Семена заражали в условиях вакуума с добавлением чистой культуры возбудителя (глава II). Инокулированные семена замачивали на 2 часа в рабочем растворе препарата, используя следующие варианты – Максим, КС 0,2%, Максим, КС 1% и Максим, КС 2%. В качестве положительного контроля зараженные семена замачивали в воде, для отрицательного контроля замачивали здоровые семена (свободные от инфекции) в воде. После обработки семена подсушивали на фильтровальной бумаге и раскладывали на среду YPGA. Повторность опыта 3-х кратная по 40 семян в каждой повторности. Учет проводили на 2-е сутки, визуально оценивая наличие типичных колоний Xanthomonas oryzae pv. oryzae вокруг каждого семени (табл. 5.1). 96 Таблица 5.1 - Биологическая эффективность протравливания семян риса, зараженных Xanthomonas oryzae pv. oryzae препаратом Максим, КС Варианты Сорт Луговой Зараженность Биологическая семян, % эффективность, % сорт Ханкайский 52 ЗараженБиологичесность кая семян, % эффективность, % 0 - Контроль здоровые семена Контроль зараженные семена Максим 0,2% 0 - 22,5 - 25 - 12,5 44,4 6,0 76,0 Максим 1% 7,5 66,7 7,5 70,0 Максим 2% 2,5 88,9 3,5 86,0 НСР05* 4,1 - 3,3 - *НСР05 - наименьшая существенная разность Как видно из таблицы 5.1 зараженность семян по сравнению с контролем после обработки семян сорта Луговой снижалась в 2 раза при обработке препаратом Максим, КС с концентрацией 0,2%, и в 3 и 9 раз использовании препарата с концентрацией 1% и 2% соответственно. Биологическая эффективность протравливания препаратом Максим, КС 2% была наиболее высокая и составляла 88,9%. Аналогичную картину наблюдали при обработке семян сорта Ханкайский 52. Таким образом, в проведенных нами исследований на двух партиях семян риса, зараженных возбудителем бактериального ожога листьев риса, была показана высокая эффективность протравливания препаратом Максим, КС в концентрации 2%. 97 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В последние годы увеличивается вредоносность бактериозов на основных сельскохозяйственных культурах, включая зерновые злаки. Одной из основных причин является появление новых, более агрессивных видов и групп фитопатогенных бактерий. В нашей работе мы изучили видовой состав фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, культуры, а также оценили распространенность поражающих злаковые данных патогенов на территории РФ. Кроме известных возбудителей бактериозов зерновых культур, были выделены новые виды бактерий рода Xanthomonas, ранее не выявляемые на растениях сем. Мятликовые. Возбудители бактериозов рода Xanthomonas были обнаружены в основном в Северокавказском регионе, Саратовской и Московской областях. Эти сведения необходимы для создания комплекса мер, направленных на защиту зерновых культур от возможных потерь урожая от бактериальной инфекции. Одним из сдерживающих факторов распространения бактериозов является своевременная и точная диагностика семян и посадочного материала. В связи с этим, мы разработали методы диагностики карантинного вида X. oryzae и наиболее часто встречаемого вида в семенном материале злаковых культур - X. arboricola. Проблема быстрого распространения бактериозов усиливается крайне небольшим ассортиментом средств защиты растений. Среди трех разрешенных в России препарата, известны только два химических препарата для протравливания семян – ТМТД и Витарос, а также антибиотик Фитолавин 300. Кроме того, ТМТД представляет серьезную угрозу для экологии, оказывая влияние на видовой состав микрофлоры почвы, а также на здоровье человека, а Фитолавин 300 является достаточно дорогостоящим препаратом. Поэтому, одной из наших задач был поиск эффективных препаратов для протравливания семян в профилактической борьбе с бактериальным ожогом риса (карантинный объект). 98 ВЫВОДЫ Проведенная экспериментальная работа позволила сделать следующие выводы: 1. В результате проведенных исследований по изучению видового состава и распространенности возбудителей рода Xanthomonas на растениях семейства Мятликовые были впервые выделены следующие виды фитопатогенных бактерий: X. campestris, X. hortorum, X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri. Виды X. arboricola и X. translucens, ранее отмеченные на злаковых культурах, также встречались в исследуемых образцах риса, пшеницы и ячменя. 2. Изучение генетического разнообразия коллекции Xanthomonas с помощью метода мультилокусного генотипирования по четырем различным генам показало, что штаммы имели высокое генетическое сходство с секвенированными последовательностями соответствующих видов из базы данных Генбанка. В то же время, виды X. arboricola, X. hortorum и X. campestris отличались высоким внутривидовым разнообразием. 3. Используя несколько способов выделения бактерий из семян ячменя, и риса было установлено, что наибольшее количество бактерий и наиболее разнообразный видовой состав микробиоты, наблюдалось при применении механического разрушения зерновок. 4. На основе выровненных последовательностей гена gyr B бактерий рода Xanthomonas подобраны диагностики Xanthomonas специфичные oryzae и праймеры и зонды Xanthomonas для arboricola, позволяющие идентифицировать возбудителей с чувствительностью не менее 5,2х100 клеток/мл и 4,3х101 клеток/мл соответственно. 5. Оптимизированная среда mYPGA, содержащая в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л позволила диагностировать 99 возбудителя бактериального ожога риса с помощью метода БИО-ПЦР с чувствительностью не менее 50 КОЕ / мл семенного экстракта. 6. Показана высокая эффективность препарата Максим 2% на уровне 88,9% путем предпосевного протравливания семян риса, зараженных возбудителем бактериального ожога. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Исходя из результатов диссертационного исследования, можно сделать следующие практические рекомендации: 1. Для выявления и идентификации карантинного вида Xanthomonas oryzae рекомендуется Россельхозцентра полученных службам использовать данных ФГБУ Россельхознадзора разработанные «ВНИИКР» на и основе «Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителей карантинных бактериозов риса Xanthomonas oryzae pv. оryzae и Xanthomonas oryzae pv. oryzicola» (Утвержден и введен в действие приказом директора ФГБУ «ВНИИКР» У.Ш. Магомедова от 23.10.2014 г. №5). 2. Протравливание семян риса в 2% препарате Максим, КС против бактериального ожога риса рекомендуется включить в программу регистрационных испытаний. 100 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Гагкаева, Т.Ю. Выявление и идентификация токсигенных видов грибов из родов Fusarium и Alternaria с использованием полимеразной цепной реакции /Т.Ю. Гагкаева, Ф.Б Ганнибал, М.М Левитин, T. Yli-Mattila// Фитосанитарное оздоровление экосистем. Второй всероссийский конгресс по защите растений: материалы съезда. – СПб: ВИЗР, 2005. – С. 150-151. 2. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. пер. с англ. /Б. Глик, Дж. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 589 с. 3. Гольцберг И.А. Агроклиматический атлас мира.- 1972. 4. Егорова М.С., Игнатов А.Н., Мазурин Е.С. Усовершенствование методов диагностики возбудителя бактериального ожога риса на основе ПЦР// Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство.-2014a.-№2.-С.2228. 5. Егорова М.С., Игнатов А.Н., Мазурин Е.С. Видовое разнообразие фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающие растения семейства Мятликовые// Защита картофеля. Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты».- Москва,-2014b.-№2.- С. 35-39. 6. Егорова М.С., Игнатов А.Н., Мазурин Е.С. Диагностика нового бактериального патогенна злаковых культур Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени» // Защита картофеля, Материалы Междунар. научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты» Москва,-2014c.-№2.- С. 39-43. 7. Игнатов А.Н. Бактериозы в России: угроза реальна // Агро XXI, 2012. С. 10 - 12. Cited from http://www.agroxxi.ru/. 8. Игнатов А.Н., Сухачева М.В., Шевердина Е.И., Егорова М.С., Корнев К.П., Мазурин Е.С. Изучение геномного полиморфизма у 101 фитопатогенного реальность и рода бактерий перспективы Международной в Xanthomonas сельском научно-практической // Биотехнология: хозяйстве. конференции. Материалы – Саратов: «КУБиК», 2013. – С. 149-151. 9. Игнатов А.Н. Распространение возбудителей опасных бактериозов растений в Российской Федерации // Защита картофеля. Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты» Москва, -2014.-№2.- С. 53-57. 10. Игнатов А.Н., Кугинуки Я. Хида К. Возбудитель бактериозов капустных Xanthomonas campestris. О создании устойчивых к ксантомонадам растений семейства Brassiceae // Сельскохозяйственная биология. -2002. -№5. –С. 75-84. 11. Игнатов А.Н., Пунина Н.В., Матвеева Е.В., Пехтерева Э.Ш., Политыко В.А., Корнев К.П. Xanthomonas arboricola – бактериальный патоген сельскохозяйственных культур в России // Защита и карантин растений. - 2010.- № 4. С. 41-43. 12. Календарь Р. Н., Глазко В. И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. – 2002. -Т. 34. № 4.- С. 279–296. 13. Конюхова Л.Г., Орлова В.В., Швер Ц.А. Климатические характеристики СССР по месяцам. Л.: Гидрометеоиздат, 1971.-140с. 14. Костюк, С.А. Полимеразная цепная реакция - современный метод клинической лабораторной диагностики/ С.А Костюк, Г.Я. Хулуп, Н.А Бадыгина, Э.Н. Заборонок, Д.И. Страздин//Медицинские новости. – 2004. – №2. – С.34-38 15. Котляров В.В. Бактериальные болезни растений глобальная проблема современности/Котляров В.В. // Бактериальные болезни растений — глобальная проблема современности. Материалы Всероссийской научно-практической конференции - г. Краснодар, 2009. - С.75 102 16. Котляров В.В. Фитолавин 300 на службе агронома /В.В.Котляров, А.А. Дьяченко, Д.В. Котляров //Агроснаб форум,-2006.- №6(29). - C. 40. 17. Котляров В.В., А.Н. Игнатов, Е.А. Гаманцов. Бактериальная гниль – новая болезнь подсолнечника // Защита и карантин растений. –2010. – № 8. – С. 43–44. 18. Котляров колосовых Д.В. Совершенствование культур от способов бактериозов.// защиты Автореферат зерновых диссертации кандидата наук. Краснодар. – 2010. – 26с. 19. Котляров, В.В. Новые возбудители бактериозов на подсолнечнике / В.В. Котляров, А.Н. Игнатов // Поле деятельности. – Волгоград, 2010. – № 10/11. – С. 27–28. 20. Лазарев A.M. Бактериозы пшеницы и меры борьбы с ними. Методические рекомендации / А. М. Лазарев. - СПб., 2005. — 35 с. 21. Литвиненко Р. А. Рентабельность применения биопрепаратов на зерновых //Новый аграрный журнал.- 2011.- №3. 22. Мазурин Е.С., рекомендации Шнейдер по Е.Ю., выявлению и Егорова М.С. идентификации Методические возбудителей карантинных бактериозов риса Xanthomonas oryzae pv. оryzae и Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. – М.: ВНИИКР, 2014. – 37 с. 23. Матвеева Е. В. Бактериальные болезни злаковых культур / Е. В. Матвеева. - М.: Агро XXI, 1998. - С. 6 - 7. 24. Матвеева Т.В., Павлова О.А., Богомаз Д.И., Демкович А.Е., Лутова Л.А. Молекулярные маркеры для видоидентификациии филогенетики растений.//Генетика популяций и эволюция.-2011.-том 9 №1.- С.32-44 25. Орлинский А.Д. Фитосанитарные регламентации стран ЕОЗР// Защита и карантин растений .- 1999.- № 8.- С. 22-24. 26. Пасичник Л., Ходос С., Буценко Л., Патыка В.Бактериальные болезни пшеницы // Зерно, серия Земледелие, удобрения и средства защиты2011.-№2 103 27. Правила по охране территории Российской Федерации от карантинных вредителей, болезней растений и сорняков.- Москва.- 1996. 28. Пунина Н.В. Оценка генетического разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и разработка молекулярных маркеров для их диагностики. // Автореферат диссертации кандидата наук. Москва.2009.- 27 с. 29. Пунина Н.В., Зотов В.С., Кузнецов Б.Б., Игнатов А.Н. Оценка генетического разнообразия межгенного транскрибируемого региона 16S-23S рРНК, гена GYRB и разработка ПЦР диагностики фитопатогенных ксантомонад // Вестник Московского государственного областного университета. – 2008.- №2. - С. 3-17. 30. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» /Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семёнов, А.М. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 223 с. 31. Селянинов Г.Т. Мировой агроклиматический справочник. М. Гидрометеоиздат, 1937. 32. Сметник А.И. Специфические процедуры инспектирования различных грузов // Защита и карантин растений.- 2000.- № 1.- С. 29-30. 33. Смит И.М, Орлинский А.Д. Анализ фитосанитарного риска // Защита и карантин растений.- 1998.- № 1.- С.18-22. 34. Смит И.М. Требования Всемирной Торговой Организации (ВТО) в области карантина растений // Защита и карантин растений. 1999.- № 2.С. 7-11. 35. Смит И.М., Орлинский А.Д. Анализ фитосанитарного риска // Защита и карантин растений.- 1999.- № 8. – С.18-22. 36. Сохрина Р.О., Челпанова М., Шарова В. Давление воздуха, температура воздуха, атмосферные осадки. - М. – Гидрометеоиздат. - 1959. 37. Справочник по вредителям, болезням растений и сорнякам, имеющим карантинное значение для территории Российской Федерации.- Нижний Новгород.- Арника. - 1995. 104 38. Сулимова Г. Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Успехи соврем. Биологии, 2004.- Т. 124. № 3. - С. 260–271. 39. Харченко А.Г. Бактериозы: незримый враг атакует // Агропрактик.ru 2012. 40. Цыганкова С.В. Использование нового метода ПЦР-фингерпринтинга для дифференциации микроорганизмов на низших таксономических уровнях. // Кандидатская дисс. -2004. 41. Шнейдер Е.Ю. Анализ фитосанитарного риска возбудителя бактериозов риса Xanthomonas oryzae pv. oryzae и Xanthomonas oryzae pv. oryzicola для территории Российской Федерации / Шнейдер Е.Ю. – М.: ВНИИКР, 2006. – 40 с. 42. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия /С.Н. Щелкунов. - Новосибирск: Сибирское университетское изд-во, 2004. – 496 с. 43. Abadie, T. Item from Uruguay //Annual Wheat Newsletter. -1988. - №34.P.101-102. 44. Agrios, G.N. Plant Pathology // 2nd edition. Academic Press, Orlando, 1985.P. 26-27. 45. Akhtar, M.A., and Aslam, M. Bacterial stripe of wheat in Pakistan //Rachis.1985.-№. 4.-P. 49. 46. Akhtar, M.A., and Aslam, M. Xanthomonas campestris pv. undulosa on wheat // Rachis.-1986.-№ 5.- Р. 34-37. 47. Alay K., Altinyay N., Hancioglu O., Dundar F., Unal A. Studies on desiccation of hazelnut branches in the Black Sea region // Bitiki Koruma Bulteni. -1973. –V.13. –P. 202-213. 48. Alizadeh, A., and Rahimian, H. Bacterial leaf streak of gramineae in Iran// Bulletin OEPP/EPPO Bulletin.-1989.-№ 19.-Р. 113-117. 49. Alvarez, A. M. Integrated approaches for detection of plant pathogenic bacteria and diagnosis of bacterial diseases // Annu. Rev. Phytopathol. - 2004. № 42.-Р.339-366. 105 50. Anuratha C.S., Gnanamanickam S.S. Pseudomonas fluorescens suppresses development of bacterial blight symptoms// International Rice Research Newsletter. – 1987. - №12. - Р.1-17. 51. Atlas R. M. Handbook of Microbiological Media // 3rd Ed. CRC Press, 2004. 52. Awoderu, V.A., Bangura, N. and John, V.T. Incidence, distribution and severity of bacterial diseases on rice in West Africa// Trop. Pest Manag.1991.-№ 37. - Р.113–117. 53. Bamberg, R.H. Black chaff disease of wheat // Journal of Agricultural Research. - 1936. - № 52.-Р.397-417. 54. Barss H.P. A new filbert disease in Oregon. // Oregon Agricultural Experiment Station Biennial Crop Pest and Horticulture Report. -1913. –V. 14. –P. 213-223. 55. Benedict, A. A., Alvarez, A. M., Berestecky, J., Imanaka, W., Mizumoto, C. Y., Pollard, L. W.,Mew, T. W., and Gonzalez, C. F. Pathovar-specific monoclonal-antibodies for Xanthomonas campestris pv. oryzae and for Xanthomonas campestris pv. Oryzicola // Phytopathology.-1989.-№ 79.Р.322-328. 56. Bergey`s manual of Systematic Bacteriology. Baltimore: The Williams & Wilkins Co. (Co-edetor: Peter H.A. Sneath Noel R.Krieg), Ed. -1984. VIIIth, -№2, -P. 965-1599. 57. Bouzar, H., Jones, J. B., Stall, R. E., Hodge, N.C., Minsavage, G. V., Benedict, A. A., and Alvarez, A. M. Physiological, chemical, serological, and pathogenic analyses of a worldwide collection of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strains // Phytopathology.-1994.- №84.- Р.663-671. 58. Bradbury J.F. Guide to plant pathogenic bacteria. // Wallingford, UK. -С. CAB International. -1986—332 p. 59. Bragard C., Verdier V., and Maraite H. Genetic diversity among Xanthomonas campestris strains pathogenic for small grains //Applied and Environmental Microbiology.-1995.-№ 61.-Р. 1020-1026. 106 60. Broadfoot, W.C., and Robertson, H.T. Pseudo-black chaff of Reward wheat // Scientific Agriculture.-1933.-№ 13.-Р. 512-514. 61. Buddenhagen, I.W. Disease resistance in rice // In: Durable resistance in crops. Plenum, New York, USA, - 1983. - Р. 401-428. 62. Burton, G.J.L. Annual report of the senior plant breeder 1930 // Kenya Dept. Agr. Ann. Report.-1930. - Р. 228-243. 63. Bushkova L.N.. Bacterioses of cereals// In: Distribution of pests and diseases of agricultural crops in 1965 /Polyakov I.Ya, and Chummakov A.E. - eds. Trudy vses. Inst. Zashch. Rast, 1966.-№ 28.- 48р. 64. CABI/EPPO Distribution Maps of Quarantine Pests for Europe, CABI International, 1998. 65. Chen, D.R., and Ding, A.Y. Studies of Xanthomonas translucens f. sp. undulosa in wheat //Acta Phylophylacica Sinica. - 1981.-№ 8.-Р. 249- 254 (in Chinese). 66. Claflin, L.E., and Ramundo, B.A. Evaluation of the dot-immunobinding assay for detecting phytopathogenicbacteria in wheat seeds// Journal of Seed Technology. - 1987. - № 11. - P. 52-61. 67. Cooke, D.E.L. Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on ITS1 and ITS2 sequences of the ribosomal RNA gene repeat/D.E.L. Cooke, J.M. Duncan// Mycol. Res. –1997. – Vol.101, №6. – Р.667-677. 68. Cooke, D.E.L. Tools to detect, identify and monitor Phytophthora species in natural ecosystems /D.E.L. Cooke, L. Schena, S.O. Cacciola// Journal of Plant Pathology. – 2007. – №89. – Р.13-28. 69. Cottyn B., M.T. Cerez, M.F. Van Outryve, J. Barroga, J.Swings, T.W. Mew. Bacterial diseases of rice. I. Pathogenic bacteria associated with sheath rot complex and grain discoloration of rice in the Philippines // Plant Disease.1996.-№ 80. - Р.429–437. 70. David O., Niño-Liupamela C., Ronald and Adam J. Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop // Molecular Plant Pathology. 2006. - № 7.- P. 303-324. 107 71. Demir, G., and Üstün, N. Studies on bacterial streak disease (Xanthomonas campestris pv. translucens (Jones et al.) Dye) of wheat and other gramineae // Journal of Turkish Phytopathology.-1992.-№ 21.-Р.33-40. 72. Dobretsov, A.N. A short survey of bacterial diseases of agricultural crops in the Kansk forest steppes //Trudy Krasnoyar. Nouchno-issled. Inst Sel. Khoz, 1963. - № 2.-Р.165-169 (in Russian). 73. Durgapal J.C. Management of bacterial blight of rice by nursery treatment – preliminary evaluation// Indian Phytopathology. - 1983.-№ 36.-Р.146-149. 74. Duveiller E. Research of X. translucens on wheat and triticale at CIMMYТ — Bull. EPPO, 1989 — v. 19. — Р. 97—102. 75. Duveiller, E. Bacterial leaf streak or black chaff of cereals /Bull. EPPO, 1994 — v. 19. N24 — Р. 135—157. 76. Duveiller, E.L., Fucikovsky, L.and Rudolph, K. The bacterial diseases of wheat// In: Concept and methods of disease management. Mexico, D.F., CIMMYT, 1997 —Р. 1—78. 77. Dzhalilov, Fevzi S., and Ram D. Tiwari. Soil and cabbage plant debris as infection sources of black rot.//Archives of Phytopathology & Plant Protection. - 1995.-№ 29.5. - P. 383-386. 78. Egorova M.S., Mazurin E.S., Polityko V.A., Ignatov A.N. Diversity of phytopathogenic bacteria of genus Xanthomonas isolated from Poaceae plants in Russia. // Bulletin scientific journal of Peoples’ Friendship University of Russia.-2014. -№ 79. EPPO/CABI. Xanthomonas arboricola pv. pruni / In: Quarantine Pests for Europe, 2nd edn. // CAB International, Wallingford (GB). -1997. –P. 1096– 1100. 80. Fanelli V., Cariddi C., Finetti-Sialer M. Selective detection of Pseudomonas syringae pv. tomato using dot blot hybridization and real-time PCR // Plant Pathology.-2007.-№ 56.-Р. 683-691. 81. Fargier,C.Manceau. Pathogenic and genetic characterization of Xanthomonas campestris by plant inoculation and multilocus site analysis /In:J.Elphinstone, 108 S.Weller, R.Thwaites, N.Parkinson, D.Stead, G. Saddler // in:Proceedings of the11th International Conference On Plant Path. Bact. Edinburgh, Scottish Agricultural Science Agency//economic crop. International Maize and Wheat Improvement Center Research Bulletin, 2006. -№ 17.-Р. 18-21. 82. Fargier E. and Manceau C. Pathogenicity assays restrict the species Xanthomonas campestris into three pathovars and reveal nine races within X. campestris pv. Campestris // Plant Pathology.-2007.-№ 56.-Р. 805–818 83. Feakin S.D. Pest control in rice // PANS Manual. - 1971. - № 3.-Р. 69-74. 84. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap // Evolution. – 1985. №39. - P. 783-791. 85. Frommel, M.I. Xanthomonas campestris pv. translucens, causal agent of bacterial streak of wheat (Triticum aestivum)// Dirección de Sanidad Vegetal, Montevideo, Uruguay (in Spanish).-1986. 86. George M.L., Cruz W.T., Nelson R.J. DNA fingerprinting of Xanthomonas oryzae pv. oryzae by ligation-mediated polymerase chain reaction// International Rice Research Notes.-1994.-№19.-Р. 29–30. 87. Gnanamanickam S., Brindha Priyadarisini V., Narayanan N.,Vasudevan P. and Kavitha, S. An overview of bacterial blightdisease of rice and strategies for its management// Curr. Sci.-1999.-№ 77.-Р. 1435–1443. 88. Gorlenko, M.V., Naidenko, A.I., and Klykov, A.P. Study of wheats to detect the cause of black bacteriosis in field conditions // Proc. Len. Acad. Sci. Agric. USSR.-1939.-№ 14.-Р. 30-33 (in Russian). 89. Gorlenko, M.V. Pathogenicity of different strains of Bacterium translucens var. undulosum to wheat// Proc. Len. Acad. Sci. Agric. USSR.-1941.-№ 9.-Р. 26-28 (in Russian). 90. Gorlenko, M.V. Bacteriosis of cereal grasses // In: Bacterial Diseases of Plants, 2nd revised edition. Izrailsky, V.P., ed. Moscow, Sel’khozgiz.-1960. Р. 181-220 (in Russian). 109 91. Got, M. A technique for detecting the infected area of bacterial leaf blight of race caused by X. oryzae before symptom appearance // Annals of the Phytopathological Society of Japan.- 1965.-№ 30.-Р.37-41. 92. Goto M. Fundamentals of bacterial plant pathology // San Diego, USA. -С. Academic Press Inc. -1992. 93. Guerrero C.J. and Lobos A.W.. Xanthomonas campestris pv. corylina, causal agent of bacterial blight of hazel in region IX, Chile. //Agricultura Tecnica Santiago. -1987. –V. 47. –P. 422-426. 94. Hagborg, W.A.F. Wheat black chaff //14th Annual Report. Canadian Plant Disease Survey.-1934.-№ 4. 95. Hagborg, W.A.F. Black chaff, a composite disease //Canadian Journal of Research.-1936.-№ 14.-Р. 347-359. 96. Hagborg, W.A.F. The diagnosis of black chaff of wheat// Sci. Agr. -1946.№26.-Р.140-146. 97. Hagborg, W.A.F. Xanthomonas translucens on wheat in Manitoba in 1968// Canadian Plant Disease Survey.-1968.-№ 48. - 112 р. 98. Hagborg, W.A.F. A device for injecting solutions and suspensions into thin leaves of plants //Canadian Journal of Botany.-1970.-№ 48.-Р.1135-1136. 99. Hagborg, W.A.F. Notes on bacterial diseases of cereals and some other crop plants// Canadian Plant Disease Survey.-1974.-№ 54.Р.129-151. 100. Harada N., Maeda, N. Rice seed coated with an agriculture chemical // Патент US7189677. - Япония. -2002. 101. Hassankiaden A.A., Kazempour M.N., Dehkaei F.P., Rahimian H. Detection of Xanthomonas Oryzae pv.oryzae from rice seeds through BIO-PCR technique in paddy fields of Guilan province in Northern Iran // Agriculture tropica et subtropica.- 2011.- Vol.44 (2).- P. 71-76. 102. Hayward AC. The hosts of Xanthomonas // In: Swings JG, Civerolo EL. – London. -1993.-Р 1–18. 103. Heald, F.D. New and little-known plant diseases in Nebraska//Science.1906.-№23.-624 р. 110 104. Hocquette, M. Une nouvelle maladie du blé dans le nord de la France // Le “black chaff”. Compt. Rend. Soc. Biol. (Paris).-1929.-№ 100.-Р. 271-272. 105. Hossain M., Stevens C., M.A. Taher Mia M.A., Elliot S. Identification of rice seed associated bacteria and molecular standardization u sing denaturing gradient gel electrophoresis // Plant Disease . 2005. - Vol.88 P. 557-564. 106. Ignatov A., Hida K., Kuginuki Y. Race-specific resistance in brassicas to black rot and leaf spot caused by Xanthomonas campestris. New aspects of resistance research on cultivated plants. -С. bacterial diseases. // Beitrage zur Zuchtungsforschung – Bundesanstalt fur Zuchtungsforschung an Kulturpflanzen. -1999. –V.5. -P. 37-39. 107. Johnston, C.O. Diseases of wheat in Kansas // Plant Disease Reporter.-1929.№ 13. – 86 р. 108. Jones, L.R., Johnson, A.G., and Reddy, C.S. Bacterial blight of barley and certain other cereals// Science.-1916.-№ 44.-Р. 432-433. 109. Jones, L.R., Jonson, A.G., Reddy, C.S. Bacterial blight of barley// Journal of agricultural research — 1917. - №11. - Р. 625—643. 110. Koprivica M. Methods for detection of Phytophthora fragariae var. rubi on Raspberry/M. Koprivica, I. Dulić-Marković, R. Jevtić, D.E.L. Cooke// Pestic. Phytomed. (Belgrade). – 2009. – Vol. 24, №3. – Р. 177-184. 111. Korobko A.P., Wondimagegne E., and Anisimoff B.V. Bacterial stripe and black chaff of wheat in Ethiopia //Scientific Phytopathological Laboratory, Ambo, Ethiopia.-1985.-5 p. 112. Koval G.K. Diseases of hazel. // Zashchita Rastenii. -1978. –V. 8. –P. 44-45. 113. Lane D. J. 16S/23S rRNA Sequencing. E. Stacke-brandt and M. Goodfellow, Eds., Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. - Wiley, Chic ester. 1991. - P.115-175. 114. Lee, K.S., Rasabandith, S., Angeles, E.R. and Khush, G.S. Inheritance of resistance to bacterial blight in 21 cultivars of rice // Phytopathology.-2003. №93.-Р.147–152. 111 115. Lelliot R.A., Stead D.E. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plant // Oxford etc.: Blackwell sci.pul.-1987. -216р. 116. Li Z.Z., Zhao H., Ying. X.D. The weed carriers of bactrerial leaf blight of rice // Acta Phytopathologica Sinica. - 1985.-№ 15.-Р. 246-248. 117. Locke T. and Barnes D. New or unusual records of plant diseases and pests. Xanthomonas corylina on cob-nuts and filberts. // Plant Pathology. -1979. –V. 28. –P. 53. 118. Louws F.J., Rademaker J.L.W. and de Bruijn F.J. The three Ds of PCR-based genomic analysis of phytobacteria: diversity, detection, and disease diagnosis. // Annu. Rev. Phytopathol. -1999. –V. 37. –P. 81–125. 119. Luisetti J., Jailloux F., Germain E., Prunier J.P., Gardan L.. Caractérisation de Xanthomonas corylina responsable de la bactériose du noisetier récemment observée en France. // Comptes Rendus des Séances de l'Académie d'Agriculture de France. -1976. –V. 62. –P. 845-849. 120. Luzzardi, G.C., Douglas, R.A., Pierobom, C.R., and Luz, W.C. Occurrence of Xanthomonas campestris pv. undulosa in wheat in Brazil // Fitopatologia Brasileira.-1983.-№ 8.-Р. 381-386 (in Portuguese). 121. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E.. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1998. -V. 95. -P. 31403145. 122. Mamluk, O.F., Al-Ahmed, M., and Makki, M.A. Current status of wheat diseases in Syria // Phytopath. Medit. – 1990.-№ 29.-Р.143-150. 123. Marchal, E. Belgium: Health of crops in 1929// International Bulletin of Plant Protection.-1930.-№ 7.-97р. 124. Marchal, E. Recherches et observations effectuées à la station de phytopathologie de l’état pendant la période 1927-1931//Bull. Inst. Agr. et Sta. de Rech. (Gembloux).-1932.-№1-Р. 164-165. 125. Marchal, E. Elements de pathologie végétale appliquée à la phytotechnie //Duculot, Gembloux, Belgium.-1948. - 82 р. 112 126. Marcia McMullen. Bacterial Leaf Streak and Black Chaff of Wheat// Extension Plant Pathologist, NDSU Department of Plant Pathology. - 2011. 127. Mehta, Y.R. A quick method for detecting Xanthomonas campestris pv.undulosa in wheat, triticale and rye seed // RENAPET (Reunion Nacional de Pesquisa em Trigo).-1986а.-Р.52 (in Portuguese). 128. Mehta, Y.R. Transmission of Xanthomonas streak in wheat, triticale and rye seed // RENAPET (Reunion Nacional de Pesquisa em Trigo).- 1986b.- Р.54. (in Portuguese). 129. Mehta, Y.R. Effect of Guazatin Plus to control Xanthomonas campestris pv. undulosa in wheat //RENAPET (Reunion Nacional de Pesquisa em Trigo).1986c.-Р. 56 (in Portuguese). 130. Mehta, Y.R. Management of Xanthomonas campestris pv. undulosa and hordei through cereal seed testing //Seed Science and Technology.-1990.-№ 18.-Р. 467-476. 131. Mehta, Y.R., and Bassoi, M.C. Guazatine Plus as a seed treatment bactericide to eradicate Xanthomonas campestris pv. undulosa from wheat seeds //Seed Science and Technology.-1993.-№ 21.-Р. 9-24. 132. Melchers, L.E. Cereal diseases in Kansas // Plant Disease Reporter.-1930. - № 14.-145 р. 133. Mew T.W. Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice //Annual Review of Phytopathology. - 1987.-№ 25.-Р. 359-382. 134. Mew, T.W., Alvarez, A.M., Leach, J.E. and Swings, J. Focus on bacterial blight of rice// Plant Dis.-1993.-№ 77.-Р.5–12. 135. Mew TW & Mistra JK. A Manual of Rice Seed Health Testing //IRRI.Manila (PH).-1994. 136. Millasseau, J. Note préliminaire sur une maladie bactérienne du blé// Rev.Path. Vég. et Ent. Agr.-1928.-№ 15.-Р.279-284. 137. Milus, E.A., and Kirkpatrick, T.L. Epidemiology of seed borne Xanthomonas campestris pv. translucens in winter wheat // Phytopathology.-1990.-№ 80.Р.966. 113 138. Mizukami, T. and Wakimoto, S. Epidemiology and control of bacterial leaf blight of rice // Annu. Rev. Phytopathol.-1969.-№ 7.-Р. 51–72. 139. Moffett, M.L. Bacterial plant pathogens recorded in Australia // In:Plant Bacterial Diseases (A Diagnostic Guide) / P.C. Fahy and G.J. Persley, eds.Academic Press Australia, North Ryde.-1983.- 333 p. 140. Mondal K. K., C. Mani, J. Singh, J.-G. Kim, and M. B. Mudgett. A New Leaf Blight of Rice Caused by Pantoea ananatis in India// Plant Disease.- 2011.Vol. 95.-P. 1582. 141. Mortensen CN, Manandhar HK, Cahyaniati & Haryanti SE. Pathogenic bacteria associated with rice seed samples from Indonesia and Nepal // Plant Pathogenic Bacteria.- Versailles (France), 8th International Conference, June 9–12.- 1994. - V.66. 142. Murray, T.D., and Malloy, O.C. First report of black chaff of wheat caused by Xanthomonas campestris pv. translucens in Washington State // Plant Disease.-1990.-№ 74.-Р.183. 143. Nayak P., Reddy P.R. Spread pattern of bacterial blight disease in rice crop// Indian Phytopathology. - 1985.-№ 38.-Р. 39-44. 144. Noble R.J. Australia: Notes on plant diseases recorded in New South Wales for the year ending 30th June 1935.//Int. Bull. Plant Protection.-1935.-№12.Р. 270-273 (abstract: RAM 15, 280). 145. Noval C. Maladies bactériennes des graminées en Espagne // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin.-1989.-№19.-Р. 131-135. 146. Noviello C. Infectious diseases of hazel. // Annali della Facoltà di Scienze Agrarie della Università degli Studi di Napoli Portici. -1969. –V. 3. –P. 11-39. 147. OEPP/EPPO Xanthomonas oryzae. Data sheets on quarantine organisms. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. 148. OEPP/EPPO. Data sheets on quarantine organisms, Xanthomonas oryzae. // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. -1990. –V. 16. –P. 1-8. 149. OEPP/EPPO. Diagnostics Xanthomonas oryzae // Bulletin OEPP/EPPO. 2007. –V. 37. –P. 543-553. 114 150. Ou S.H. Rice diseases. CAB International, Wallingford, UK. 1972 151. Ou SH. Rice Diseases //Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey. England -1985. - V. 2 152. Parkinson N., Aritua V., Heeney J., Cowie C., Bew J. & Stead D. Phylogenetic analysis of Xanthomonas species by comparison of partial gyrase B gene sequences//International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. -2007.-№ 57.-P. 2881–2887. 153. Pereira A.L.G., Campacci C.A., Zagatto A.G., and Watanabe K. Occurrence of Xanthomonas campestris pv. cerealis on wheat (Triticum aestivum) in Paraná State // Biologico Sao Paulo.-1983.-№ 49.-Р. 9-13 (in Portuguese). 154. PQS (Plant Quarantine Service) of Indonesia. 2008. (http://karantinalampung.deptan.go.id/) 155. Preston C.D., Pearman D.A., Dines T.D. New Atlas of British and Irish Flora. // Oxford University Press, Oxford, UK. -2002 156. Prunier J.P., Luisetti J., Gardan L., Germain E., Sarraquigne J. La bactériose du noisetier (Xanthomonas corylina). // Revue Horticole. -1976. –V. 170. –P. 31- 40. 157. Ray P.R., Sengupta T.K. A study on the extent of loss in yield in rice due to bacterial blight // Indian Phytopathology. – 1970.-№ 23.-Р. 713-714. 158. Reddy M.T.S., Reddy A.P.K. A new pathotype of Xanthomonas campestris pv. Oryzae // International Rice Research.-1989.-№ 14.-Р. 17–18. 159. Reddy P.R., Ou S.H. Differentiation of Xanthomonas translucens f. sp. oryzicola (Fang et al.) Brudbery, the leaf-streak pathogen, from Xanthomonas oryzae (Uyeda and Ishiyama) Dowson, the blight pathogen of rice, by enzymatic tests // International Journal of Systematic Bacteriology.- 1974.№24.-Р. 450-452. 160. Reddy C.S., Godkin, J., and Johnson, A.G. Bacterial blight of rye // Journal of Agricultural Research.-1924.-№ 28.-Р.1039-1040. 161. Reddy P.R. Kresek phase of bacterial blight of rice // Oryza. - 1984.-№21. Р. 179-187. 115 162. Richardson, M.J. & Waller, J.M. Triticale diseases in CIMMYT trial locations // In Triticale: Proc. Int. Symp., El Batan, Mexico, Monograph 024e.- Ottawa, Canada, 1974.- P. 193-199. 163. Roberts S.J. and Koenraadt H. Proposal for a revised method for detection of Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica seed // Seed Science and Technology -2002. -V. 30. Cited from http. -С.//www.worldseed.org/pdf/WSxcc-brassica-cabbage.pdf 164. Ruissen N.A., Gagg Van der M., Toruno L.. Release of soil-borne Xanthomonas campestris pv. campestris in the phyllosphere of cabbage plants. // In. -С. Klement Z, ed. Proceedings 7th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Budapest, Hungary, -1989. –P. 299-303. 165. Saitou N. & Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. – 1987. -№4. - P. 406-425. 166. Saiki, R.K., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. Enzymatic amplification of Я-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science.1985.-Vol. 230.- 1350p. 167. Sakthivel N, Mortensen CN & Mathur SB. Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in artifi cially inoculated and naturally infected rice seeds and plants by molecular techniques// Applied Microbiology and Biotechnology.2001. - V.56. - P.435–441. 168. Sands, D.C., and Fourest, E. Xanthomonas campestris pv. translucens in North and South America and in the Middle East // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin.- 1989.- Vol. 19.- P. 27-130. 169. Schaad N.W., Jones J.B. and Lacy G. Xanthomonas. In: Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, 3rd edition. Schaad N.W., Jones J.B. and Chun W. (eds.). //APS Press, St. Paul, MN. -2001. 116 170. Schaad N.W., Franken A.A. Xanthomonas campestris pv. campestris Working Sheet 68 // ISTA Handbook On Seed Health Testing. Zurich, Switzerland. - С. International Seed Testing Association. -1997. 171. Schaad, N.W., and Forster, R.L. A semi-selective agar medium for isolating Xanthomonas campestris pv. translucens from wheat seeds// Phytopathology.- 1985.-Vol. 75.-P. 260-263. 172. Schaad, N.W.; Gabrielson, R.L; Mulanase, M.W. Hot acidified cupric acetate soaks for eradication of Xanthomonas campestris from crucifer seeds // Applied and Environmental Microbiology.-1981.-Vol.39.-P. 803-807. 173. Scortichini M. and Simeone A.M.. Review of the bacterial diseases of apricot // Rivista di Frutticoltura e di Ortofloricoltura. -1997. –V. 59. –P. 51–57. 174. Scortichini M., Marchesi U., Di Prospero P.. Genetic diversity of Xanthomonas arboricola pv. juglandis (synonims: X. campestris pv. juglandis; X. juglandis pv. juglandis) strains from different geographical areas shown by repetitive polymerase chain reaction genomic fingerprinting. // J. of Phytopathology. -2001. –V. 149. –P. 325-332. 175. Shane W.W., Baumer, J.S. Population dynamic of P. syringae pv. syringae on spring wheat// Phytopathology. — 1987.- Vol. 77 —P. 1399—1405. 176. Sheng, Z.-J., Zhen, L.-Y. and Jun, F.-X. Detection of QTL conferring resistance to bacterial leaf streak in rice chromosome O. sativa L. spp. Indica// Scientia Agric. Sinica.- 2005.- Vol. 38.- P. 1923–1925. 177. Sigee, D.C. (1993) Bacterial Plant Pathology // Cell and Molecular Aspects. Cambridge, UK.-1993. 178. Singh, D.V., Banerjee, A.K., Kishun, R. and Abidi, A.B. Effect of bacterial leaf streak on the quantitative and qualitative characters of rice// Indian J. Mycol. Plant Pathol.-1980.-Vol. 10.-P. 67–68. 179. Smit, I.B.J., and Van A. Bredenkamp, T. Items from South Africa: International nurseries// Annual Wheat Newsletter. - 1988.-Vol. 34.-84p. 180. Smith, E.F. A new disease of wheat// Journal of Agricultural Research.-1917.Vol. 10. - P.51-54. 117 181. Srivastava DN & Rao YP. Seed transmission and epidemiology of bacterial blight disease of rice in North India // Indian Phytopathology.-1964. - V.17. P.77–78. 182. Srivastava A.K. and Schlessinger D. Mechanism and regulation of bacterial ribosomal RNA processing. // Annu. Rev. Microbiol. -1990.-V. 44. –P. 105129. 183. Stall R.E., Gottwald T.R., Koizum M., Schaad N.W. Ecology or plant pathogenic xanthomonads. // In. -С. Swings J.G., Civerolo E.L., eds. Xanthomonas, 1st ed. London, UK. -С. Chapman and Hall. -1993. -P. 265299. 184. Stefani E., Bazzi C., Mazzucchi U. and Colussi A. Xanthomonas campestris pv. pruni in Friuli peach orchards. // Informatore Fitopatologico. -1989. –V. 39. –P. 60–63. 185. Sun Fuzai, and He Liyuan. Studies on determinative techniques for resistance of wheat to black chaff (Xanthomonas translucens f. sp. undulosa) // Acta Phytophylacica Sinica.-1986.-Vol. 13.-P. 109-115 (in Chinese; English summary). 186. Sutic D. Bacterioze Crvenog Patlidzana (Tomato bacteriosis). // Posebna Izd. Inst. Zasht. Bilja, Beograd (Spec. Edit. Inst. Plant Prot., Beograd). -1957. –V. 6. –P. 1-65. 187. Swings J. G., Van Den Mooter M., Vauterin L., Hoste B., Gillis M., Mew T.W. and Kersters K.. Reclassification of the causal agents of bacterial blight Xanthomonas campestris pathovar oryzae and bacterial leaf streak Xanthomonas campestris pathovar oryzicola of rice as pathovars of Xanthomonas oryzae new species Ex Ishiyama. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990.-V. 40. -P. 309–311. 188. Swings J.G. and Civerolo E.L. Xanthomonas. // Chapman and Hall, London. 1993 189. Taguchi F., Shimizu R., Nakajima R., Toyoda K., Shiraish T., Ichinose Y. Differential effects of flagellins from Pseudomonas syringae pv. tabaci, 118 tomato and glycinea on plant defense response // Plant Physiol Biochem.2003.-Vol. 41.- P. 165–174. 190. Tamura H. Pathogenicity of aseptic Bursaphelenchus xylophilus and associated bacteria to pine seedlings // Jpn J Nematol. - 1983.-Vol. 13. - P. 1– 5. 191. Tamura K., Dudley J., Nei M. & Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. – 2007. – Vol.10. - P. 1092 – 1093. 192. Tamura K., Nei M. & Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method // PNAS. – 2004.-Vol. 101. - P. 1103011035. 193. Taylor C., Emmett R.W., Facelli E., Scott E.S., Sedgley M. Spread and control of pistachio dieback in Australia // In : Oliveira M.M. (ed.), Cordeiro V. (ed.). XIII GREMPA Meeting on Almonds and Pistachios . Zaragoza: CIHEAM. - 2005. - P. 183-185. 194. Tang, D., Wu, W., Li, W., Lu, H. and Worland, A.J. Mapping ofQTLs conferring resistance to bacterial leaf streak in rice // Theor. Appl. Genet. 2000. - Vol. 101.-P. 286–291. 195. Tessi, J.L. Current status of work on Xanthomonas translucens var. cerealis // Presented at the 4th Wheat, Oats, Barley and Rye Meeting. - Castellar, Argentina, 1949. - 200 p. 196. Tsygankova, S.V., A.N. Ignatov, E.S. Boulygina, B.B. Kuznetsov, E.V. Korotkov. Genetic intraspecies relationships in Xanthomonas campestris pv. campestris revealed by novel rep-PCR primers // European J. Plant Pathol. – 2004. - V.110. - №8. - Р.845-853. 197. Vauterin L., Hoste B., Kersters K., Swings J. Reclassification of Xanthomonas // International Journal of systematic bacteriology. — 1995. – Vol. 45. —P. 472—479. 198. Vera Cruz CM, Gossele F, Kersters K, Segers P, Van Den Mooter M, Swings J et al. Differentiation between Xanthomonas campetris pv.oryzae, 119 Xanthomonas campestris pv. oryzicola and the bacterial ‘brown blotch’ pathogen on rice by numerical analysis of phenotypic features and protein gel electrophoregrams // Journal of General Microbiology.- 1984.- V.130. –P. 2983–2999. 199. Vervoerd, L. Preliminary report on the occurrence in South Africa of black chaff disease in wheat// Annals Univers. Stellenbosch.-1930.-Vol. 8(6).- 4p. 200. Waller, J.M. The influence of climate on the incidence and severity of some diseases of tropical crops// Rev. Plant Pathol.-1976.-Vol 55.-P. 185-194. 201. Wallin, J.R. Parasitism of Xanthomonas translucens (J.J. and R.) Dowson on grasses and cereals// Iowa St. Coll. J. Sci.-1946.-Vol. 20.-P. 171-193. 202. Wang, G. J., X. D. Zhu, Y. L. Chen, and G. L. Xie. A rapid ELISA method for the identification of rice seeds infected by Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola // Jiangsu J. Agric. Sci.-1993.-Vol. 9.-P. 36-39. 203. Weller SA, Beresford-Jones NJ, Hall J, Thwaites R, Parkinson N, Elphinstone JG. Detection of Xanthomonas fragariae and presumptive detection of Xanthomonas arboricola pv. fragariae, from strawberry leaves, by real-time PCR//Journal of Microbiological Methods. -2007. - V. 70, - P. 379–83. 204. Williams P.H. Black rot: a continuing threat to world crucifers // Plant disease. –1980. V. 64, № 8. P.736-742. 205. Wimalajeewa D.L.S., Washington W.S. Bacterial blight of hazel-nut. Australasian. // Plant Pathology. -1980. –V. 9. –P. 113-114. 206. Xie Guan Lin. Diversity of Gram negative bacteria antagonistic against major pathogens of rice from rice seed in the tropic environment// Institute of Biotechnology, Zhejiang University.- Hangzhou 310029, ChinaJ Zhejiang Univ Sci.-2003.- Vol. 4.-P. 463. 207. Xie, G. L. and T. W. Mew. A leaf inoculation method for detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola from rice seed// Plant Dis. – 1998.-Vol. 82.-P. 1007-1011. 208. Yamamoto S. and Harayama S. Phylogenetic analysis of Acinetobacter strains based on the nucleotide sequences of gyrB genes and on the amino acid 120 sequences of their products // Int. J. Syst. Bacteriol. -1996. -V.46.- P. 506511. 209. Yamamoto S., Bouvet P. J. and Harayama S. Phylogenetic structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences: comparison with the grouping by DNA–DNA hybridization. // Int. J. Syst. Bacteriol. -1999. –V. 49. –P. 87– 95. 210. Yan H., S. H. Yu, G. L. Xie, W. Fang, T. Su, and B. Li. Grain Discoloration of Rice Caused by Pantoea ananatis (synonym Erwinia uredovora) in China// Plant Disease.- 2010.-Vol. 94.-P. 482. 211. Young J.M., Park D.C., Shearman H.M., Fargier E. A multilocus sequence analysis of the genus Xanthomonas. // Syst. Appl. Microbiol. -2008. –V. 31 (5). –P. 366-377. 212. Zabeau M., Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting // European Pattent Office, publication 0 534 858 A1, bulletin 93/13.-1993. 213. Zhao W.J., Zhu S.F., Liao X.L., Tan T.W. Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in seeds using a specifi c TaqMan probe//Molecular Biotechnology. - 2007. - V.35. - P. 119–127. 214. Zhao Y.-F., Damicone J.P., Demezas D.H., Bender C.L., Zhao Y.F. Bacterial leaf spot diseases of leafy crucifers in Oklahoma caused by pathovars of Xanthomonas campestris // Plant Disease. -2000. -V. 84. -P. 1008-1014. 215. Zhu W., MaGbanua M. M., and White F. F. Identification of two novel hrpassociated genes in the hrp gene cluster of Xanthomonas oryzae pv. oryzae // J. Bacteriol. -2000. –V. 182. –P. 1844-1853. 216. Zillinsky, F.J., and Borlaug, N.E. 1971. Progress in developing triticale as an economic crop// Int. Maize Wheat Improv. Cen. Res. Bull.-1971.-Vol. 17.-P. 18-21. 217. http://ria.ru/economy 218. http://id-marketing.ru 219. http://rosselhoscenter.com 121 Приложение 1 Таблица 1 - Спектр поражаемых покрытосеменных растений бактериями рода Xanthomonas Фитопатоген X. albineans X. transluceans X. theicola X. hyacinthi X. sacchari X. codiaei X. cassavae X. hortorum pv. hederae pv. рelargonii pv. taraxaci pv. vitians X. cucurbitae X. fragariae X. pisi X. arboricola pv. celebensis pv. corylina pv. fragariae pv. juglandis pv. poinsettiicola pv. pruni pv. populi X. populi X. cynarae X. melonis X. smithii pv. malvacearum X. axonopodis X. citri X. fuscans X. vasculorum X. bromi X. vasicola X. ozyzae X. euvesicatoria X. alfalfae X. perforance X. gardneri X. vesicatoria X. campestris рv. campestris Растение – хозяин (Род) сахарный тростник ячмень, овес, рожь, пшеница чай гиацинт сахарный тростник кротон маниок, маниот, Семейство Злаки, или Мятликовые Злаки Чайные, Камелиевые Гиацинтовые Злаки, или Мятликовые Молочайные Молочайные плющ пеларгония одуванчик салат тыква земляника горох Аралиевые Гераниевые Сложноцветные Сложноцветные Тыквенные Розовые Бобовые банан лещина земляника грецкий орех молочай слива тополь тополь артишок дыня (огурец) Банановые Берёзовые Розовые Ореховые Молочайные Розоцветные Ивовые Ивовые Астровые Тыквенные хлопчатник Мальвовые спаржа, молочай гибискус, хлопчатник, мальва, цитрусовые бобовые, фасоль сахарный тросник костерь сорго, гаолян рис томаты аксонопус люцерна, бобы, горох Томаты (паслен), перец Томаты (паслен),перец капуста, брокколи, кольраби, репа, турнепс, редька, Спаржевые Молочайные Мальвовые, Рутовые Бобовые Злаки, или Мятликовые Овсянцевые Злаки Злаки Пасленовые Злаки, или Мятликовые Бобовые Паслёновые Паслёновые Капустные 122 Фитопатоген pv. raphani pv. armoraciae Растение – хозяин (Род) горчица белая подсолнечник редис, капуста, брокколи, кольраби, хрен, томат, тыква Семейство Сложноцветные Капустные, пасленовые 123 Приложение 2 А Б В Симптомы бактериального ожога риса Xanthomonas oryzae pv. oryzae (T.W. Mew): А - Экссудат на листовой пластинке; Б – полегание пораженных стеблей риса; В – хлоротичные полосы на листовых пластинках 124 Приложение 3 Зоны распространения и вредоносности черного бактериоза пшеницы Xanthomonas campestris pv. translucens (Jones, Jonson and Reddy) Dye. (http://www.agroatlas.ru) Зона высокой вредоносности определена в тех регионах, где переодически возникают эпифитотии и могут поражаться более 20% растений. Регионы, где по опубликованным зарегистрирован черный бактериоз пшеницы. научным материалам, 125 Приложение 4 Распространение бактериозов на зерновых в 2006-13 году (данные ГНУВНИИ фитопатологии РАСХН) N п.п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16. 17. 18. Культура Сорт Возбудитель СРЕДНЕВОЛЖСКИЙ РЕГИОН Самарская область, Безенчукский р-н Озимая пшеница Безенчукская-380 Pseudomonas(P.) atrofaciens Озимая пшеница Искра P.atrofaciens P.atrofaciens, X. Озимая пшеница Мироновская-808 translucens/arboricola Озимая пшеница Заря P.atrofaciens Pantoea(P.) agglomerans, Яровая пшеница Саратовская-42 P.atrofaciens Яровая пшеница Ирень P.atrofaciens Яровая пшеница Тулайковская-1 P.agglomerans Яровая пшеница Лютесценс-165 P.atrofaciens,P.agglomerans Xanthomonas(X.) Яровой ячмень Прерия translucens/arboricola X. translucens/arboricola, Овёс P.аtrofaciens Озимая пшеница, ЗАО Безенчукская-380 P.atrofaciens «Семена» Республика Мордовия, Ромадановский район P.аtrofaciens,P,agglomerans, Озимая пшеница Мироновская-808 Erwinia(E.) rhapontici Яровая пшеница Самсар P.atrofaciens Пензенская область Яровая пшеница, СПК P.atrofaciens им. Тимирязева Яровой ячмень.Шемышейский Харьковская – 99 P.atrofaciens район Ячмень, СПК P.agglomerans, «Башмаковский» Овёс, Кузнецкий р-н Мирный P.atrofaciens, P.agglomerans НИЖНЕВОЛЖСКИЙ РЕГИОН Саратовская область, НИИСХ«Юго-Востока» P. atrofaciens, X. Яровая пшеница Саратовская-58 translucens/arboricola 19. Яровая пшеница Саратовская-70 P. atrofaciens 20. Яровая пшеница Саратовская-55 21. 22. Озимая пшеница Озимая пшеница Саратовская –90 Губерния P. atrofaciens, X. translucens/arboricola P. atrofaciens P.atrofaciens 126 Культура Сорт Возбудитель 23. Озимая пшеница Смуглянка 24. Озимая пшеница Лютесценс-230 25. Озимая рожь P.atrofaciens, X. translucens/arboricola P.atrofaciens, X. translucens/arboricola P.atrofaciens N п.п 26. 27. 28. 29. Саратовская-5 10548Яровая пшеница №11+T.dicoccum 10544Яровая пшеница Cтекловидная-1 Яровая пшеница 10541-U-56-2 10530Яровая пшеница Коллективная-3 ВОЛГО-ВЯТСКИЙ РЕГИОН P.atrofaciens Clavibacter spp. P.agglomerans Clavibacter spp. Кировская область 33 Озимая рожь.СХА«Луч» Озимая рожь Озимая рожь Куменский р-н Озимая рожь 34 Озимая рожь.НИИСХ Волна 35 Озимая рожь Кировская-89 36 Ячмень.СХА «Заря» Массовая репродукция 30 31 32 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Эстафета P.atrofaciens E.rhapontici Фаленская 4/2 P.arofaciens, Сlavibacter spp. Бахта Сlavibacter spp. Фаленская-4 Clavibacter spp., E.rhapontici P.atrofaciens, X. translucens/arboricola , Clavibacter spp. X. translucens/arboricola ,, P.atrofaciens. Clavibacter spp, P.atrofaciens Яровой ячмень.СХА Эколог X. translucens/arboricola «Нива» Овёс. Фаленская OC Аргамак P.atrofaciens Республика Марий Эл. Медведовский р-н. СПК»Пригородный» P.atrofaciens, X. Озимая рожь. Эстафета translucens/arboricola X. translucens/arboricola , Озимая рожь. Чулпан E.rhapontici Яровой овёс. Лос-3 P.agglomerans ЦЕНТРАЛЬНЫЙ РЕГИОН Московская область.ВНИИФ Озимая пшеница Мироновская-61 P.atrofaciens Озимая пшеница Мироновская-61 P.atrofaciens Озимая пшеница Мироновская-61 P.agglomerans X. translucens/arboricola Озимая пшеница Мироновская-808 ,P.atrofaciens Озимая пшеница Мироновская-61 Clavibacter spp., P.atrofaciens Озимая рожь Крона P.atrofaciens Озимая рожь Крона P.atrofaciens, E.rhapontici Озимая рожь Пурга E.rhapontici, E.rhapontici 127 Культура Сорт Возбудитель 50 Озимая рожь Вересень 51 Озимая рожь Саратовская-6 52 53 54 55 56 57. 58 Озимая рожь Озимая рожь Яровой ячмень Яровой овёс Яровой овёс Яровой овёс Яровой овёс P.atrofaciens X. translucens/arboricola , E.rhapontici Clavibacter spp. Ps.atrofaciens P.atrofaciens, Clavibacter spp, P.atrofaciens P.atrofaciens P.atrofaciens P.atrofaciens 59 Озимая рожь 60 61 Озимая рожь Яровой ячмень 62 Яровой ячмень 63 Яровой ячмень 64 Ячмень Яровой ячмень (ур.2000г.) N п.п 65 Крона Альфа Зазерский-85 Скакун Скакун Скакун Скакун НПО«ПОДМОСКОВЬЕ» Clavibacter spp., P.atrofaciens,E. Крона rhapontici Альфа карликовая E. rhapontici Риск X.translucen E.rhapontici, X. Суздалец translucens/arboricola Clavibacter spp., X. Зазерский-85 translucens/arboricola Московский -121 P.atrofaciens Эльф X. translucens/arboricola 66 Яровой овёс Привет X. translucens/arboricola , P.atrofaciens 67 Яровой овёс Скакун P.atrofaciens ЦЕНТРАЛЬНО-ЧЕРНОЗЁМНЫЙ РЕГИОН 68. 69 70 71 72 73 74 Воронежская область. Рамонский р-н Яровой ячмень. ОдесскийP.atrofaciens, X. ВНИИСС 100(элита) translucens/arboricola Яровой ячмень.Учхоз ОдесскийP. atrofaciens «Березовское» 100(1репр.) Яровой ячмень Учхоз «Березовское Гонар P.atrofaciens, Clavibacter spp. ВГАУ» Белгородская область.Белгородский р-н.Октябрьское ГСУ Озимая пшеница Чернозёмка-88 P.atrofaciens Озимая пшеница Центос Clavibacter spp., P.atrofaciens СЕВЕРО-ЗАПАДНЫЙ РЕГИОН Ленинградская область Яровой овёс. Приозёрский ЗАО Боррус P.atrofaciens, Clavibacter spp «Первомайское» Яровой овёс. Кингисеппский рн, Боррус P.atrofaciens ЗАО «Агробалт» 128 N п.п 75. 76. 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87. 88. 89 Культура Сорт Возбудитель X. translucens/arboricola , P.atrofaciens, Clavibacter spp. СЕВЕРО-КАВКАЗКИЙ РЕГИОН Краснодарский край. Озимая пшеница. Новопокровский рДельта P.atrofaciens н.СПК «Нектар» Пшеница.СПК Дея P. fuscovaginae «Незамаевский» Озимая пшеница.Тбилисский Крошка X. translucens/arboricola р-н. АОЗТ «Песчаное» Озимая пшеница. Новопокровский рРусса P.fuscovaginae, P.atrofaciens н.СПК «Незамаевский» Озимая пшеница.Новопокровс Дельта P.atrofaciens кий р-н.СПК «Нектар» Озимая пшеница.Тбилисский Крошка P.atrofaciens р-н.АОЗТ «Песчаное» Озимая пшеница.Новопокровс Купава Clavibacter spp., P.agglamerans кий р-н. СПК« Незамаевский» Озимая X. translucens/arboricola , пшеница.Новопокровс Крошка P.atrofaciens кий р-н.СПК«Нектар» Ячмень.Отрадненский P. atrofaciens, X. р-н. ГСУ translucens/arboricola Озимый ячмень.Отрадненский P.agglamerans, P.atrofaciens р-н Озимый ячмень.ПриморскоX. translucens/arboricola , Михайло Ахтырский р-н.АО P.atrofaciens, P.agglamerans «Бейсук « Озимый ячмень.Отрадненский X. translucens/arboricola , Михайло р-н.СПК P.atrofaciens «Растениевод» X. translucens/arboricola , P. Ячмень Павел atrofaciens Озимый ячмень Павловский р-н. ЗОО Михайло P.atrofaciens «Незамаевский» Яровой овёс.-“- Аргамак 129 N п.п 90 91 92. 93 94 95 96 97. 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 Культура Сорт Возбудитель Овёс. Отрадненский р-н, с-з «Кавказ» Козырь Clavibacter spp., P.atrofaciens Ростовская область Озимая пшеница Сlavibacter spp. Северная Осетия. Пригородный р-н,ОПХ»Михайловское»,СКНИИГПСХ P.atrofaciens, X . X. Озимая пшеница Михайло translucens/arboricola Озимая рожь Саратовская-5 P.atrofaciens УРАЛЬСКИЙ РЕГИОН Оренбургская область.Бузулукский р-н Яровой ячмень. СХА Донецкий-8 Clavibacter spp. «Тутиковская» Яровой ячмень.СХА Донецкий-8 P. atrofaciens «Родина» Яровой ячмень.ООО Донецкий-8 P. atrofaciens «Шахматовское» Челябинская область Яровой ячмень. Донецкий-8 P.atrofaciens Октябрьский р-н Овёс. Сосновский р-н Зенит P. atrofaciens ЗАПАДНО-СИБИРСКИЙ РЕГИОН Алтайский край, г.Барнаул,НИИСХ Яровая пшеница Лютесценс-70 P.atrofaciens Омская область Яровая пшеница. Омская –28 P.fuscovaginae, P.atrofaciens Николенский р-н Яровая пшеница. P.atrofaciens X. Марьяновский р-н. Черняво-13 translucens/arboricola АО «Сибиряк» Яровой овёс. Иртыш Clavibacter spp.,P.atrofaciens Марьяновский р-н Томская область Яровой ячмень. Кожевниковский р-н. Соболёк P .atrofaciens, E.rhapontici ф/х «Осипов и К» Овёс. Томский рX. translucens/arboricola , н.СПК«Родина» P.atrofaciens Тюменская область Яровая пшеница. Ишимский р-н. ЗАО Омская-20 Clavibacter spp.. «Атон-Агро» Яровая пшеница. Ишимский р-н. ЗАО Омская-20 P.atrofaciens «Опёновское» Яровой ячмень. Ишимский р-н. УПХ Кедр Clavibacter spp. «Мичуринское» 130 N п.п 107 108 109 110 111 112 113 Культура Сорт Возбудитель Яровой овёс. Ишимский р-н. ЗАО Перона P.atrofaciens, «Искра» Яровой овёс. Ишимский р-н. ОПХ Перона P.atrofaciens. «Ишимское» ВОСТОЧНО-СИБИРСКИЙ РЕГИОН Республика Бурятия Селенгинский р-н. X. translucens/arboricola «Тахай» Пшеница. Зайгравский р-н. Лютесценс Clavibacter spp. «Унэгэтэй» Яровой овёс. Иволгинский р-н. Скакун X. translucens/arboricola «Иволга» Яровой овёс. Тарбагатайский рн. Скакун Clavibacter spp, P.atrofaciens ЗАО «Десятниково» Иркутская Область Яровая пшеница СХПК «Байкал» - P. atrofaciens 131 Приложение 5 Праймеры и зонды, использованные в работе Название праймера 8UA forward 519B reverse 27f Мишен ьв геноме 16S Классическая ПЦР AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 16S Длина продукта , п.о. Литературный источник Lane D. J.,1991 500 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Классическая ПЦР IS1113 Классическая ПЦР TXT4R Xnth804 F XnthR 1405 Xbal 1 Adapter Xbal 1 Adapter Xbal Pr. Xbal XdnaK1 F XdnaK1 R XfyuA1F XfyuA1R Последовательность 5’→3’ GTATTACCGCGGCKGCTG 1492 TXT Вариант ПЦР диагностики XCC00 07-tonB - Классическая ПЦР 1500 Fanelli et al., 2007 964 Sakthivel et al., 2001 TACGGTTACCTTGTTACGACT T GTCAAGCCAACTGTGTA CGTTCGTTCGGCACAGTTG CGC(M)G(S)(S)GTGATGGACA A GC CCCTGGTTCCCGGCATCRTAG TCA CTGGAATCGATTCCAGctaga ctagCTGGAATCGATTCCAG AFLP Tsygankova et al.,2004 623 Rob J.L., Willliams, 2000 - ctagCTAAAACGACGGCCAG GGCCGTCGTTTTAGctaga GGTGGAAGACCTGGTCAAGA dnaK fyuA TCCTTGACTTCGGTGAACTC 940 AGCTACGACGTGCGTTACGA GTTCACGCCCAACTGGTAG 698 TGGAACAGGGCTATCTGACC CATTCAAGGTTGGTCTGCTT 875 ACGAGTACAACCCGGACAA CCCATCARGGTGCTGAAGAT 865 MLST XrpoD1F XrpoDR rpoD XgyrB1F XgyrB1R gyr B GGC AAY CAG CAT CCG GC X.o.F X.o.R X.or.-P X.arb-F Young et al., 2008 gyr B Real-Time PCR CTT CGC CCA TAT GAC GGC R6G-CAC CGA GAA CGC GCC TGC C-RTQ2 Real-Time PCR GGTGCATCCCACCCTGG X.arb-R GCGCTTGGCCTCTTCCA X.arb-P ROX – CTCGGCGTCGCTGGBHQ2 Егорова и др., 2014a,c 132 Приложение 6 Виды бактерий, выявленные в семенах риса и ячменя Вид или Род возбудителя Sphingomonas yabuuchiae Curtobacterium citreum Curtobacterium flaccumfaciens Curtobacterium herbarum Stenotrophomonas maltophilia Pantoea sp. Pantoea agglomerans Pantoea ananatis Pantoea septica Pantoea vagans Pantoea conspica Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas koreensis Pseudomonas fulva Pseudomonas japonica Pseudomonas syringae Paenibacillus illinoisensis Paenibacillus sp. Microbacterium testaceum Erwinia persicina Enterobacter cowani Saccharibacillus sacchari Kocuria palustris Chryseobacterium sp. Leclercia adearboxylata Процент выделения, % Рис Ячмень 16 19 12 15 12 14 20 26 24 21 20 15 2 12 9 15 4 7 2 4 3 5 22 15 13 17 20 15 23 27 25 32 2 1 2 1 12 17 14 3 5 6 7 2 2 1 1 3 5 5
