выделение и идентификация возбудителей микозно
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление: 06.03.01 (ОКСО 020400.62) - БИОЛОГИЯ ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОЗНОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ГНИЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ, ПОИСК АНТАГОНИСТОВ Работа завершена: Группа 01-102 « » _____________2015г. _________________ (А.З. Мухитова) Работа допущена к защите: Научный руководитель доцент, к.б.н. « » _____________2015г. _________________ (Н.С. Карамова) Заведующий кафедрой профессор, д.б.н. « » _____________2015г. _________________ Казань-2015 (О.Н. Ильинская) СОДЕРЖАНИЕ Стр . ВВЕДЕНИЕ 4 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 1.1 Фитопатогенные микроорганизмы 7 1.2 Биологический контроль фитопатогенов растений 11 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 18 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 18 2.1 Объект исследования 18 2.2 Питательные среды и условия культивирования 18 2.3 Выделение бактерий из клубней картофеля, пораженных микознобактериальными гнилями 19 2.4 Окраска по Граму 19 2.5 Идентификация на MALDI BioТyper (Bruker Daltonik) 19 2.6 Выделение микромицетов из клубней картофеля, пораженных микозно-грибными гнилями 20 2.7 Микроскопирование микромицетов 20 2.8 Выделение ДНК из мицелия микромицетов 20 2.9 Полимеразная цепная реакция амплификации ДНК микромицетов 20 2.10 Электрофорез продуктов амплификации ДНК 22 2.11 Методы биоинформатики 22 2.12 Проверка фитопатогенных свойств выделенных изолятов 22 2.13 Исследование фунгицидной активности бактерий методом агаровых блоков 22 2.14 Исследование антагонистической активности бактерий в 23 2 отношении фитопатогенных бактерий методом агаровых блоков 2.15 Статистическая обработка результатов 23 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 25 3.1 Выделение бактерий, возбудителей бактериальных гнилей из клубней картофеля 25 3.2 Идентификация выделенных изолятов на MALDI Bio Typer 26 3.3 Выделение и идентификация микромицетов, возбудителей микозных гнилей из клубней картофеля 27 3.4 Идентификация фитопатогенных микромицетов 29 3.5 Проверка фитопатогенных свойств выделенных изолятов 31 3.6 Антагонистическая активность бактерий в отношение фитопатогенных микромицетов р.Fusarium 32 3.7 Антагонистическая активность бактерии в отношении возбудителей 36 бактериальных гнилей картофеля ВЫВОДЫ 40 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 41 3 ВВЕДЕНИЕ В настоящее время картофель является третьей по значимости продовольственной сельскохозяйственной культурой в мире после пшеницы и риса [Ильяшенко. 2010]. При ежедневном потреблении 300 г картофеля можно восполнить суточные потребности в витамине C до 70%, в витамине B1 – 17.5% , в витамине B2 - 5%. Благодаря содержанию в картофеле незаменимых аминокислот его протеин считается особенно ценным. [Козлова с соавт., 2012]. Однако биологическая и потенциальная продуктивность культуры считается нереализованной. В среднем по России в 2011 году урожайность картофеля по всем категориям хозяйств составила 14.8 т/г, а площадь заняла – 2.1 млн. га. Широкое распространение болезней, возбудителей которых относят к получению группе почвенно–клубеньковых высоких и стабильных инфекций, урожаев препятствует качественных клубней. Ежегодные потери урожая картофеля от болезней могут достигать 45 - 80% . К основным инфекциям относят фузариозную, фомозную гнили, обыкновенную и серебристуяю паршу, ризоктониоз. [Макеева с соавт., 2006; Pérez-García et al., 2011; Du et al., 2012; Fisher et al., 2012]. В Республике Татарстан, в последние годы, изменение агроклиматических условий и ухудшение экономического состояния хозяйств, привели к массовому распространению фитопатогенных микромицетов - возбудителей корневых гнилей сельскохозяйственных культур. В частности, возросли численность и разнообразие грибов рода Fusarium. Микроорганизмы, которые являются фитопатогенами растений, способны синтезировать фитотоксины, подавляющие или задерживающие рост растений, а также способные привести их к гибели [Siddiqui, 2005, Дунаевский, 2005]. Растения также взаимодействует и с положительной микрофлорой, продуцирующей антибиотические вещества, которые обладают высокой антимикробной активностью и способны подавлять ряд фитопатогенных 4 грибов и бактерий, что, в свою очередь, способствует благоприятному росту и развитию растения. Также антибиотические вещества, синтезируемые почвенной микрофлорой способны достаточно быстро вытеснять патогенную микрофлору из грунтов или субстратов, что свидетельствует об их антагонистических особенностях [Lambers et. al., 2009]. Микроорганизмы, обладающие антагонистическими свойствами в отношении фитопатогенов, применяются при разработке и производстве биологических средств для защиты растений против заболеваний [Van Loon, 2007; Tilak et al., 2010]. В настоящее время, все больше внимание уделяется развитию экологических методов борьбы с заболеваниями культурных растений, как альтернативный вариант химическим методам [Штерншис с соавт., 2000]. Биологический контроль (биоконтроль) как научное направление возникло в 70-х годах XX века. В настоящее время оно представляет собой интенсивно развивающуюся область, значимость которой понимают не только специалисты, но и общественность [Pal, Gardener, 2006; Costa et al., 2013]. Исследования в области биоконтроля имеют особую значимость в связи негативными последствиями массового применения пестицидов [Starchak et al., 2009; Карамова с соавт., 2009; Cardoso et al., 2010]. Биопрепараты отличаются не только экологической безопасностью, но и избирательностью действия, они не вызывают резистентности у фитопатогенных микроорганизмов. Таким образом, исследования, направленные на поиск новых штаммов мокроорганизмов – антогонистов и разработка на их основе биопрепаратов, которые являются конкурентоспособными, эффективными, являются весьма актуальными высокоактивными и [Pal and Gardener, 2006; Mausam et. al., 2007; Huang et.al.,2013]. Целью настоящей работы явилось выделение и идентификация возбудителей микозно-бактериальных гнилей растений картофеля и поиск бактерий-антагонистов фитопатогенов. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: 5 1) Выделить в чистую культуру штаммы микроорганизмов – воздудителей микозно-бактериальных гнилей экономически важных сортов картофеля, возделываемых в Республике Татарстан. 2) Идентифицировать выделенные штаммы микроорганизмов - возбудителей микозно-бактериальных гнилей. 3) Оценить фитопатогенные свойства изолятов бактерий и микромицетов, выделенных из клубней картофеля, пораженных микозно-бактериальной гнилью. 4) Охарактеризовать антагонистическую активность бактерий, представителей эпифитной микрофлоры растений картофеля, в отношении фитопатогенных бактерий и микромицетов. 6 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Фитопатогенные микроорганизмы К возбудителям болезней и вредителей растений в настоящее время относятся более 600 вирусов и вироидов, около 250 видов микоплазм, бактерий, риккетсий и актиномицетов, около 20 тыс. грибов, более 7,5 тыс. видов вредных насекомых, около 1 тыс. видов нематод. Только на картофеле способны паразитировать около 300 видов возбудителей заболеваний [Желдакова, Мямин, 2006]. Наиболее серьезным биотическим воздействием, которым могут подвергаться растения, являются патогенные микроорганизмы [Richmond, 2000]. Фитопатогены различного вида – патогенные микроорганизмы, вызывающие заболевания растений, выделяющие биологически активные вещества и синтезируюющие различного типа ферменты, которые вызывают разрушение клеточных оболочек и тканей, что приводит к проникновению возбудителя внутрь клетки и нарушению ее физиологической активности. [Thordal, 2001]. Потери урожая сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами, могут составить от 30 до 50% и более [Иванюк с соавт., 2005; Du et al., 2012]. Бактериозы, вызываемые фитопатогенными бактериями, являются одной из основных причин потерь урожая сельскохозяйственных культур. В возникновении и развитии бактериозов играют роль два основных фактора: накопление большого количества фитопатогенных бактерий и наличие благоприятных условий для их развития и размножения. Ингибирующее действие почвенных бактерий в отношении сельскохозяйственных культур было показано в работе McCalla и Haskins [1964]. Из исследованных 560 спорообразующих штаммов бактерий, обитающих в почве и обладающих фитотоксичностью. 280 культур подавляли прорастание семян, 126 ингибировали обмен веществ и рост 7 растений, 154 штаммов замедляли образование семян у бобовых культур [McCalla, Haskins, 1964]. Бактериозы в основном вызывают увядания и гнили растений. Agrobacterium tumefaciens образует «корончатые галлы» и вызывает бактериальный рак у двудольных растений [Gohlke,Deeken, 2014]. Erwinia carotovora, син. Pectobacterium carotovorum вызывает такие заболевания картофеля, как черная ножка (подвид E. c. subsp. carotovora) и мягкая гниль (подвид E. c. subsp. atroseptica). Бактерии поражают как надземные части растения, так и подземные, в том числе и клубни, вызывая потемнение и гниение тканей, а также скручивание и пожелтение листьев [Charkowski, 2007]. Clavibacter michiganensis вызывает кольцевую гниль [Gartemann et al., 2003; Ильяшенко, 2010]. Актиномикозы - заболевания, которые вызывают актиномицеты. Характерным примером актиномикоза является обыкновенная парша у картофеля, вызываемая Streptomyces scabies. Заболевание представляет с собой небольшие вздутия в перидерме, которые в дальнейшем подсыхают и образуют мелкие трещинки, где создаются благоприятные условия для развития другой почвенной микробиоты, таким образом уменьшается содержание вид крахмала, питательных деформируется, становиться легче. щелочных веществ, внешний клубня Парша развивается в основном в почвах, профилактикой лечения является внесение кислых удобрений в почву. [Ryan et al., 2004]. Фитопатогенные вирусы вызывают многочисленную группу болезней – вирозы. Процесс метаболизма инфицированного растения напоминает нормальное состояние стареющего организма. При вирозе у растений усиливается дыхание это связано с разобщением дыхания и окислительного фосфорилирования. [Лазарев с соавт., 2011]. Один и тот же вид растения может поражать различное видоспецифичные вирусы. количество Вирусные вирусов, заболевания так же есть характеризуют следующие признаки: неравномерная окраска листовой пластинки, наличие 8 пятен, отмирание тканей, деформация различных органов, угнетение роста, образование опухолей на различных частях ткани. При поражении растения вирусами они уменьшают его продуктивную деятельность [Анисимов c соавт., 2009]. Вирусные заболевания в благоприятных для распространения условиях могут в среднем cнизить урожайность картофеля до 50%, а в отдельных случаях привести к полной гибели урожая [Иванюк с соавт., 2005; Maule et al., 2007]. Фитоплазмы – паразиты растений, занимающие промежуточное положение между бактериями и вирусами. Вызывают хлоротичность растений, так как фитопатогены нарушают функцию сосудистой системы растений. Так же характерно патологическое развитие генеративных органов (цветок с искаженным развитием) и веретеновидный рост побегов (нитевидные ростки клубней картофеля) [Иванюк, 2009]. К важнейшим фитопатогенам также относятся грибы, вызывая такие заболевания, как микозы. Многие грибы могут являться возбудителями болезней растений, значительная часть которых продуцируют микотоксины, заражая ими и сельскохозяйственную продукцию. Следует подчеркнуть, что в настоящее время именно фитопатогенные грибы признаны наиболее вредоносными и масштабными вредителями растений. Нарушение технологии возделывания культур, чрезмерное применение пестицидов, а также неблагоприятные факторы окружающей среды приводят к нарушению гомеостаза почвенных агроэкосистем и накоплению в почве большого комплекса патогенной микрофлоры, прежде всего грибов р. Fusarium, Rhizoctonia, Phomopsis, Verticillium, Rhizopus, Pythium, Alternaria, Cercosporella [Атрашкова, 2001; Starchak et al., 2009; Dean et al., 2012]. В настоящее время идентифицировано более 10000 видов грибов, вызывающих различные болезни у растений [Pérez-García et al., 2011]. Потери урожая важнейших культур - риса, пшеницы, кукурузы, соевых бобов и картофеля от вредного воздействия фитопатогенных грибов могут достигать до 125 млн. тонн ежегодно [Fisher et al., 2012]. 9 Грибы рода Fusarium, принадлежат к типу (отделу) Несовершенных грибов (Deuteromycetes (Hyphomycetales Fungi или imperfecti), Hyphales) порядок семейство Гифомицеты Туберкуляриевые (Тuberculariaceae). Это почвенные грибы, развивающиеся на различных растительных субстратах [Sumíková et al., 2013]. Они относятся к гемибиотрофными патогенам, которые распространяются на различных видах растений. В настоящее время к роду Fusarium относится несколько сотен видов грибов, многие из которых являются патогенами самых разных сельскохозяйственных растений [Du et al., 2012]. Видовая специфичность в отношении отдельных видов растений у грибов этого рода отсутствует [Попкова с соавт., 2001, Ryan et al., 2004 ]. Большинство видов этого рода причиняют большой ущерб сельскохозяйственным культурам, снижая качество и количество получаемого урожая. Также они поражают и дикорастущие, в том числе и сорные растения. Сорняки могут служить резерваторами инфекции культурных растений за счет своей распространенности и длительного периода вегетации. Грибы р. Fusarium относятся к числу наиболее опасных болезней картофеля. Fusarium spp. распространен в большинстве почв, где выращивается картофель. Их споры могут длительное время сохранять жизнеспособность в почве. Фузариозы, проявляющиеся в виде фузариозного увядания растений и сухой гнили клубней, представляют особую опасность для картофеля, вызывая потери урожая до 25% [Wharton et al., 2007]. Возбудители фузариозов попадают на клубни в виде мицелия и спор с почвой. В основном заражение происходит благодаря первичной сохранившейся инфекции или при раневых травмах. Доказано, что клубни с механическими повреждениями наиболее активно подтверждены заражению по сравнению с целыми и с клубнями с заживлением, у которых уже образовался субериновый слой [Du et al., 2012]. Заражая семена, грибы вызывает сухую гниль и образует впадины на поверхности клубней. Сухая гниль может быть вызвана несколькими видами микромицет рода Fusarium 10 [Du et al., 2012 ]. Наиболее распространенными патогенами, вызывающие сухую гниль являются F. oxysporum, F. Solani var.coeruleum, и F. avenaceum. Так же фитопатогены этого рода способны вызывать задержку роста, бесплодие и другие аномалии роста и развития у растений [Szczechura, 2013]. Многие микроскопические грибы являются продуцентами микотоксинов. Токсины грибов обладают канцерогенными, мутагенными свойствами. Они считаются термостойкими, следовательно, попадая в продукты питания человека и корма животных, способны проявлять свои токсические свойства. На сегодняшний день известны более 300 видов грибов, которые продуцируют свыше 500 разновидностей микотоксинов [YliMattila, 2011]. Токсические соединения, продуцируемые фитопатогенными организмами, способны изменять барьерно-транспортные характеристики мембраны растительной клетки. Экзогенные соединения могут взаимодействовать с компонентами мембраны. Кроме того, поступая в клетки, эти вещества способны нарушать нормальный ход метаболических процессов, что может отразиться на структуре и функциях мембран [Сидорова, 2006]. К наиболее распространенным микотоксинам относят токсины, продуцируемые грибами рода Fusarium. Один вид гриба может продуцировать различные микотоксины, служащие причиной разных симптомов отравления [Datsugwai et al., 2013]. Грибы рода Fusarium выделяют в ткани растения и при культивировании in vitro в культуральную среду большое количество токсических веществ (ликомаразмин, аспергилломаразмин А, аспергилломаразмин В, дегидрофузариевая кислота, фузариевая кислота и др.). 1.2 Биологический контроль фитопатогенов растений Растения сельскохозяйственных и лесных экосистем подвергаются частым повреждениям со стороны фитопатогенных микроорганизмов, различных видов микромицетов и насекомых – вредителей. Для борьбы с этими неблагоприятными факторами используют различные методы и 11 средства, направленные на защиту растений, которыми являются в основном химические пестициды. [Lemessa, Zeller, 2007] Химические препараты, считаются высокоэффективными средствами, но одновременно обладают рядом отрицательных свойств, которые неблагоприятно негативно сказываются на полезную микробиоту, также существует негативное последствие их использования. [Завалин, 2005; Карамова с соавт., 2009; Starchak et al., 2009;Cardoso et al., 2010]. Широкое применение химических средств приводит к их накоплению в почве, водоемах, грунтовых водах, в атмосфере, в растительной продукции, что негативно сказывается на здоровье человека. [Черкасов с соавт., 2000]. При частом использовании пестицидов у вредных организмов возникает устойчивость к ним, одновременно могут погибать полезные микроорганизмы. [Лысенко, 2006]. Все эти негативные факторы, служит огромным стимулом внедрения биологического метода в практику защиту растений, а именно применение биопрепаратов, созданные на основе природных микробных агентов их метаболитов, которые являются безупречной альтернативой химическим средствам. [Lemessa, Zeller, 2007]. Биологический контроль (биоконтроль) как научное направление возникло в 70-х годах XX века. В настоящее время оно представляет собой интенсивно развивающуюся область, значимость которой понимают не только специалисты, но и общественность [Pal, Gardener, 2006; Costa et al., 2013]. Действующие (biological control агенты agent, биопрепаратов BCA) или являются агенты биоконтроля компонентами природных биоценозов, что объясняет их безопасность [Нугманова, 2002; Pal, Gardener, 2006]. Биопрепараты содержат живые культуры специально отобранных полезных бактерий, с заданными и контролируемыми свойствами. Показано, что благодаря препаратам, содержащим живые культуры специально отобранных полезных микроорганизмов, 12 прибавки урожая основных сельскохозяйственных культур могут составлять от 15 до 30 % [Завалин, 2005]. Биопрепараты более эффективны в малоплодородных почвах, где растения испытывают недостаток в минеральном питании [Дятлова, 2001]. Основой биологического контроля является природные явления антибиоза и паразитизма - антагонизм, фунгистазис, супрессивность, регулирующие взаимоотношения между сапрофитными и патогенными микроорганизмами [Flemming, 2002]. Однако эти регуляторные механизмы, направлены не на полное уничтожение фитопатогена, а лишь на ограничение его развития и снижение вредоносности [Lemessa, Zeller, 2007]. Антагонизм - это один из самых распространенных способов действия, при котором микроорганизмы одного вида может подавлять развитие других, а иногда и полностью уничтожают их. Бактерии-антагонисты выступают в роли продуцента антимикробных веществ, подавляют или уничтожают возбудителей через производство диффузных или летучих антимикробных веществ [Bonaldi et al., 2015]. Известно, что бактерии продуцируют различные антимикробные вещества, такие как антибиотики, бактериоцины, микоцины, литические ферменты (целлюлазы, хитиназы, β-гликозидазы, протеазы, амидазы), определяющие взаимодействие между микроорганизмами в ассоциации [Yan et al., 2003;Rasmussen et al., 2006, Семенов , 2007]. К низкомолекулярным антибактериальным субстанциям относят перекись водорода и диацетил, которые обладают антимикробной активностью по отношению к широкому кругу патогенных и условно патогенных микроорганизмов [Schleifer et al., 2001]. Бактерии-антагонисты используют также некоторые механизмы для улучшения роста растений, такие как синтез фитогормонов, фиксация азота, растворение фосфатов, улучшение водного и минерального баланса и увеличение доступности питательных веществ. Так же могут уменьшить стрессовые факторы, проявившиеся на неблагоприятные условия среды [Lugtenberg et al., 2002]. 13 Антагонизм широко распространен среди родов Bacillus spp, Pseudomonas spp.и Streptomyces spp. [Aliye et al., 2008]. Микроорганизмы рода Bacillus давно известны как штаммы обладающие антимикробной активностью, составляют около половины коммерчески доступных бактериальных агентов биологического контроля [Favel, 2005]. Важнейшими свойствами бацилл является их ингибирующая активность по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам. [Добрица c соавт., 2001]. Бактерии рода Bacillus, образующие споры, наиболее эффективны в качестве биоудобрений, так как считаются наиболее устойчивыми и жизнеспособными в отношении повреждающих факторов. Среди представителей данного рода, только некоторые виды являются патогенами и токсикогенными. (Bacillus anthrachis, B.cereus ) [Park et all, 2010]. B. subtilis производит различные биологически активные соединения с широким спектром действия по отношению к фитопатогенам [Bais et al., 2004]. Bacillus subtilis непатогенные почвенные бактерии, живут в ассоциации с корнями высших растений. B. subtilis способны формировать дремлющие споры, устойчивые к экстремальным условиям и, таким образом, могут храниться длительное время [Piggot, Hilbert, 2004]. Данный вид микроорганизма обладает ингибирующей активностью по отношению к фитопатогенным микробиотам, является продуцентом некоторых аминокислот, протеаз, полисахаридов, также полипептидных антибиотиков. В работе Branda [2001] показано, что различные штаммы B. subtilis способны образовывать многоклеточные структуры – биопленки. Биопленка это микробное сообщество, в котором популяции дифференцированных клеток заключены во внеклеточный матрикс [O'Toole et al., 2000]. В настоящее время признано, что большинство микробов способны связать абиотическую среду с биотической через поверхность биопленки [Davey et al 2000]. Исследования Bais показали [2004], что штамм B. subtilis (АТСС 6051) способен образовывать биопленки на корнях растений Arabidopsis, и 14 тем самым защищать от инфекций Pseudomonas syringae [Bais et al., 2004]. Установлено, что некоторые штаммы B.subtilis способны эффективно подавлять Ralstonia solanacearum, возбудителя бурого бактериоза картофеля [Lemessa, Zeller, 2007]. Штаммы Bacillus thuringiensis В – 382 и Bacillus vallismortis B-383 обладают антагонистической активностью по отношению к следующим фитопатогенным микромицетам: Biopolaris sorokiniana, Alternaria alternata, Fusarium graminearium. Штамм Bacillus В-476, subtilis обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам Alternaria alternata, Penicillum glaucum. Штамм Bacillus subtilis В-477, обладает фунгицидным действием по отношению к фитопатогенным грибам Fusarium oxysporum, Cephalosporium, Paecilomyces lilacinus [ Long, 2001]. Штаммы бактерии Bacillus thuringiensis продуцируют следующие биологически активные соединении: термостабильный β-экзотоксин. протеазы, хитиназы, лецитиназу, Важнейшим продуктом является δ- эндотоксины, которые обладают цитотоксическим действием по отношению к фитопатогенным микромицетам рода Fusarium, Bipolaris, Alternaria, Risoctonia [Favret,1997]. Показано, что B. thuringiensis также продуцирует высокоактивные антибиотики, эффективные в отношении Оомицетов, а также некоторых грамотрицательных бактерий [Zhou,2008]. Некоторые биопрепараты сельскохозяйственных Pseudomonas: растений Pseudomonas для защиты созданы putida, на и стимуляции основе Pseudomonas роста бактерий fluorescens. рода Данные бактерии, обладающие широким набором полезных свойств, благоприятно действующих на растения принято обозначать как PGPR (Plant GrowthPromoting Rhizobacteria) [Ngoma et.al., 2012]. PGPR Pseudomonas способны к эффективному растворению фосфорных соединений, за счет продукции кислот, что можно использовать для улучшения фосфорного питания растений, также при инокуляции корней растений некоторыми штаммами PGPR Pseudomonas возможно индуцировать устойчивость 15 растений к фитопатогенам[Couillerot et al., 2009]. Была установлена антимикробная активность штамма P. aurantiaca, синтезирующей антибиотические соединения феназинового ряда (1-оксифеназином, феназином и феназин-1,6дикарбоксилатом) и комплекса пирролнитрина [Stowell et all., 1997]. Также у этого вида были выделены и идентифицированы гиббереллины и индолил-3уксусная кислота (ИУК) - гормоны, регулирующие рост растений, и на основе этого свойства, были созданы мутанты, способных к сверхсинтезу данного фитогормна. [Gil, 2008]. Действие штаммов сверхпродуцентов антимикробных веществ оказывает на растения высокое ростостимулирующее и защитное действие [Thomson, 2000]. В настоящее время разработаны, запатентованы и введены биопрепараты Аурин – безвредный биопестицид, предназначенный для инактивации фитопатогенных грибов и бактерий, биопрепарат Стимул, представляющий собой суспензию живых клеток бактерий Pseudomonas fluorescens, который обеспечивает устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды и биофунгицид Псевдобактерин – 2, разработанный на основе P. aureofaciens, который продуцирует оомицин А, природный антибиотик, играющий основную роль в супрессии роста микромицетов. [Завалин, Бронин, 2005]. Активно ведутся исследования и разработка новых технологий, которые способствуют повышению эффективности биопрепаратов. Несмотря на антагонистические успехи в способности изучении бактерий механизмов в сообществах биоконтроля, определенн недостаточно. Не точно выявлена значимость активаторов антагонизма (сигнальные белки, вещества белковоподобной природы – пептиды, компоненты клеточной стенки и др.), обладающих специфическим действием на различные бактерии при осуществлении отношений антагонистического типа на межвидовом уровне. Для большинства противомикробных факторов не выявлена связь между выраженностью антагонистической активностью и изменением их продукции. 16 Известно, что многие растения могут синтезировать PR (pathogenesisrelated proteins) – белки, в ответ на стрессовые условия и атаке патогена. Вирусы, вироиды, грибы и бактерии могут вызывать индукцию PR – белков, при поражении растения [Chandran, 2007]. PR – белки выполняют многообразную функцию: участвуют в образовании сигнальных систем, укрепляют клеточные образование стенки вторичных растения (пероксидаза), мессенджеров, способны активируют повреждать цитоплазматическую мембрану патогенна. [Van Loon et al., 2006]. β-1,3эндоглюканазины- белки семейства PR-2 - служат медиаторами, накапливаются вокруг очага инфекции и взаимодействуют со здоровыми клетками, обладают фунгицидной активностью. Способны расщеплять клеточную стенку микромицетов и пептиноглюканы бактерий белки PR-3, PR-4, PR-8 и PR-11,которые обладают эндохитиназной активностью. Остальные белки обладают, протеиназной, лизоцимной, протеиназной, рибонуклеазной активностью [Scherer, 2007]. Многие белки обладают фунгицидной и бактерицидной активностями, и синтезируются при стрессовых условиях. Было доказано, что устойчивость Pectobacterium carotovorum у клубней к возбудителю картофеля связана с активным синтезом PR-белков, как защитный фактор [Третьякова ,2011]. Биологические препараты обладают рядом преимуществ перед химическими пестицидами. Биологические активные вещества, метаболиты, продуцируемые микроорганизмами, обладают позитивным действием и высокой эффективностью, что позволяет вносить биопрепараты в минимальных количествах. Они не накапливаются в природной среде и легко утилизируются в ней, так как являются природным веществом. [Дятлова, 2001]. Микроорганизмы в составе комплексных удобрений, вносимые в почву, положительно влияют на биологическую активность почвы, защищают от микробно – растительного взаимодействия, способствуют получению экологически чистой сельскохозяйственной продукции и высоких урожаев [Боронин,2000]. 17 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объект исследования Фитопатогенные бактерий и микромицеты выделяли из клубней растений картофеля, собранных с опытных полей ТатНИИСХ (Лаишевский район Республики Татарстан), пораженных микозно-бактериальными гнилями. Для выявления активных антагонистов в отношении выделенных фитопатогенов использовали бактерии, представителей эпифитной и ризосферной микрофлоры картофеля из коллекции кафедры микробиологии КФУ: Acinetobakter calcoaceticus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus subtilis, Lysinibacillus fusiformis, Pseudomonas putida. В качестве известных бактериальных фитопатогенов использованы штаммы Pectobacterium atrosepticum SCRI1043, Xantamonas campestris B5 46, любезно предоставленные лабораторией молекулярной биологии КИББ КНЦ РАН. 2.2 Питательные среды и условия культивирования Для культивирования и хранения бактерий использовали универсальную питательную среду МПА и среду Лоурия-Бертони (LB) следующего состава (г/л дистиллированной воды): триптон – 1.0, дрожжевой экстракт – 0.5, NaCl – 0.5, pH = 8.5 [Sambrook et al., 1989]. Для культивирования микромицетов использовали среду Чапека следующего состава (г/л дистиллированной воды): NaNO3 – 2.0 г, K2HPO4 – 1.0 г, MgSO4 × 7H2O – 0.5 г, KaCl – 0.5 г, FeSO4–0.01 г, сахароза – 30.0 г, агарагар (2%) – 20.0 г, pH = 7.2-7.4 [Гаузе с соавт., 1983]. Для выделения ДНК микромицетов использовали следующие буферы и растворы: TES-буфер (лизис буфер)- 3.15 г 1М Tris-HCl, 0.875г 1М EDTA, 0.44 г 1М NaCl, 0.5 г SDS на 50 мл H2O, pH=8.0; ацетат калия 60 мл 5 М 18 ацетата калия, 11.5 мл ледяной уксусной кислоты, 28.5 мл H2O, рН 4,8; TrisEDTA: 150 мкл 1М Tris-HCl, 20 мкл 1М EDTA, 9.88 мл H2O. Питательные среды стерилизовали автоклавированием при 112°С в течение 20 мин. Культивирование бактерий и микромицетов проводилось в термостате при температуре 37°С и 28°С соответственно. При необходимости бактерии культивировали в термостате-шейкере при 37 ºC и интенсивности качания 200 об/мин. 2.3 Выделение бактерий из клубней картофеля, пораженных микознобактериальными гнилями Для выделения бактерий кусочки клубня картофеля, предварительно обработанные спиртом, раскладывали на среде МПА с помощью стерильного скальпеля и культивировали в течение 24 часов, при температуре 37°С. Отбирали колонии бактерий, выросшие вблизи клубней. Чистые культуры получали многократным рассеиванием истощающим штрихом на твердом МПА. 2.4 Окраска по Граму Грампринадлежность и морфологию бактерий исследовали, окрашивая препараты по методу Грама [Burillo et all.,2014]. 2.5 Идентификация изолятов бактерий на MALDI BioТyper (Bruker Daltonik) Чистую 18-часовую культуру, выращенную при 37°С на среде МПА идентифицировали на MALDI BioТyper (Bruker Daltonik). Исследование с помощью MALDI BioTyper осуществляется на основе сравнения полученного ряда константных белков исследуемых бактерий с базой данных. Сложное программное обеспечение позволяет оценить достоверность видовой идентификации и штаммовой дифференциации бактерий по величине Score Values (вероятное определение значения) (таблица 1) 19 Таблица 1 - Интерпретация результатов идентификации на MALDI BioТyper Спектр Описание Символы Цвет 2.300 ... 3.000 высокая вероятность идентификации вида ( +++ ) зелёный 2.000 ... 2.299 надёжная вероятность идентификации рода ( ++ ) зелёный 1.700 ... 1.999 возможная вероятность идентификации рода ( + ) жёлтый 0.000 ... 1.699 не точная идентификация красный (-) 2.6 Выделение микромицетов из клубней картофеля, пораженных микозно-грибными гнилями Для выделения микромицетов кусочки клубней, предварительно обработанные спиртом, раскладывали на поверхность чашки Петри со средой Чапека с помощью стерильного скальпеля, культивировали в течение 3-7 дней при 28°С. Чистые культуры микромицетов получали многократно рассевая истощающим штрихом и методом укола. Чистоту выделенных культур контролировали микроскопрированием. 2.7 Микроскопирование микромицетов Морфологию фитопатогенных микромицетов, выделенных из клубней картофеля, исследовали методом «раздавленная» капля 2.8 Выделение ДНК из мицелия микромицетов * ДНК из штаммов микромицетов рода Fusarium выделяли по методике Don Liu [Liu, 2000]. Использовали мицелий микромицета, который культивировали на среде Чапека в течение 7 дней. Стерильной бактериальной петлей вносили 500 мг мицелия в 1.5 мл эпиндорф с 500 мкл TES-буфера (лизис-буфер), тщательно растирали мицелий до однородной взвеси и инкубировали в течение 15 минут при 25 – 30 °C. Затем добавляли 150 мкл раствора ацетата калия CH3COOK, осторожно перемешивали и центрифугировали в течение 1 мин при 10000 g. Полученный супернатант переносили в чистый эпиндорф, центрифугировали в течение 1 мин при 11000 g. Проделывали данную операцию несколько раз, только с 20 добавлением равного количества изопропилового спирта, центрифугировали в течение 2 мин, при 11000 g. Сливали водную фазу, полученный осадок ДНК промывали 300мкл 70% этанолом. Снова центрифугировали в течение 1 мин, при 11000 g. Надосадочную жидкость сливали, осадок ДНК выдерживали при комнатной температуре до полного высыхания и растворяли в 30 мкл ПЦР–смеси. 2.9 Полимеразная цепная реакция амплификации ДНК микромицетов* Филогенетический анализ микромицетов, выделенных из клубней картофеля проводили на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 5.8S рРНК, амплифицированных с использованием стандартных праймеров U1F-U1R компании Синтол (Россия, Москва). Полимеразную цепную реакцию осуществляли в реакционной смеси (25 мкл) следующего состава: H2O – 18.5 мкл, Taq буфер –2.5мкл, ITS1 fw – 1.0 мкл, ITS4 rev - 1.0 мкл, dNTP – 0.5мкл, матрица – 1.0 мкл, Taq - полимераза – 0.5 мкл. Для молекулярной идентификации микромицетов проводили амплификацию региона ITS из выделенной ДНК мицелия грибов с помощью термоциклера «MJ mini» (BioRad, США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 94 °С в течение 4 мин, далее 35 циклов с последовательной сменой температур: денатурация при 94 ºС в течение 30 сек, отжиг праймера при 55 ºС – 20 сек, элонгация при 72 ºС – 50 сек. Секвенирование ПЦР-продукта проводилось в Междисциплинарном центре коллективного пользования федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (МЦКП КФУ). * - Работа проведена совместно с Илюхиной Д. в лаборатории молекулярной биологии каф. микробиологии КФУ. 21 2.10 Электрофорез продуктов амплификации ДНК Для очистки ПЦР продукты разделяли путем электрофореза (BioRad perper Pac Basic) в горизонтальном агарозном геле (7x 4.5x0.5 см). Выделение из геля проводили с помощью набора EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction kit по методике производителя. Концентрация агарозы в геле составляла 1%. В агарозный гель добавляли раствор бромистого этидия в концентрации 0.5 мкг/мл. В качестве электродного буфера использовали 0.04М трис-ацетатный буфер (рН 7.5-7.8), содержащий 0.002М ЭДТА, рН 8.0. Пробу с краской смешивали в соотношении 3:1 (6 мкл пробы и 2 мкл краски). В лунки между пробами добавляли 5 мкл маркера и 2 мкл краски. Электрофорез проводили при силе тока 100 мА. Окрашенный гель просматривался в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. 2.11 Методы биоинформатики Для анализа использовали полные последовательности геномов микромицетов, доступные в базе данных бактериальных геномов GenBank [Benson et al., 1999]. Поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью программы BLAST [Altschul et al., 1997] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 2.12 Оценка фитопатогенных свойств микроорганизмов Проверку фитопатогенных свойств выделенных микроорганизмов и микромицетов проводили следующей схеме. В стерильные чашки Петри с фильтровальной бумагой, предварительно смоченной стерильной водопроводной водой для создания влажных условий раскладывались в стерильных условиях срезы из картофеля. Далее стерильной петлей с патогенными микроорганизмами делали укол на срезе картофеля и оставляли в термостате при 28° С на двое суток и при 37 °С на сутки для микромицетов и бактерий соотвтетственно. 2.13 Исследование антагонистической активности бактерий отношении фитопатогенных микромицетов методом агаровых блоков 22 в На поверхность среды Чапека в чашки Петри засевали микромицеты методом укола. Чашки помещали в термостат при температуре 28 °С на 5-7 суток. Бактерии-антагонисты также засевали газоном на поверхность среды МПА. Посевы инкубировали в течение 24 часов, при температуре 37 °С. Стерильным пробочным сверлом вырезали блоки микромицетов и помещали их в центр чашки Петри на среду Чапека. На расстоянии 2-2.5 см от блока с микромицетом размещали 3- 4 блока с бактериями-антагонистами. Культуры инкубировали при 28 °С в течение 3-10 суток. Антагонистическую активность оценивали по диаметру зоны подавления роста тест-культур. Исследование 2.14 антагонистической активности бактерий в отношении фитопатогенных бактерий методом агаровых блоков Исследуемые штаммы бактерий засевали газоном на поверхность среды МПА и культивировали при температуре 37°С в течение 24 часов. Таким же методом выращивали бактериальные тест – культуры. Стерильным пробочным сверлом вырезали блоки агара с выросшей культурой и помещали хаотичном порядке на поверхность чашек Петри со средой МПА, засеянной тест-культурой методом газона. Посевы инкубировали в течение нескольких суток и оценивали антагонистическую активность по величине зоны подавления роста тест-культуры вокруг блока с бактерией- антагонистом. 2.15 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку экспериментальных данных проводили путем определения средних арифметических значений и их стандартных ошибок в программе Microsoft Excel. Стандартное отклонение () рассчитывали по формуле: ( y y) n 1 2 , где y – повторность данного варианта; у – среднее арифметическое данного варианта; n – число повторностей. 23 Затем вычисляли значение 2 и исключали повторности, не входящие в интервал y 2. После этого снова находили значения , которое использовали для определения стандартной ошибки (m) по следующей формуле: m n 24 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Выделение бактерий, возбудителей бактериальных гнилей, из клубней картофеля Развитие бактериальных, грибных и вирусных болезней во время вегетации растений и хранения полученной продукции является актуальной проблемой растениеводства. Потери урожая от различных заболеваний могут составить от 30 до 50% и более [Иванюк с соавт., 2005; Du et al., 2012]. Большое значение в увеличении вредоносности играют изменения в биологии фитопатогенов, прежде всего связанные с их патогенными и адаптивными свойствами. Показано, что за последние 10 лет произошло резкое изменение в соотношении отдельных патогенов в агроэкосистемах. В связи с вышесказанным, экономически важных разработка комплексных сельскохозяйственных мер культур по защите обуславливает необходимость изучения таксономического состава фитопатогенов [Лазарев, 2010]. В данной работе мы исследовали клубни картофеля, пораженные бактериальными гнилями, собранные с опытных полей ТатНИИСХ (Лаишевский район Республики Татарстан) (рисунок 1.). Для выделения фитопатогенов кусочки клубня с гнилями раскладывали на поверхность чашки Петри со средой МПА и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С. Отбирали колонии бактерий, выросшие вблизи объекта. Для получения чистых культуры бактерии многократно рассевали методом штриха на поверхности МПА. Исследовали морфологию выделенных культур, определили грампринадлежность изолятов. Установлено, что клетки, выделенных изолятов, имеют палочковидную форму и морфотип клеточной стенки. 25 имеют грамотрицательный Рисунок 1 – Клубни растений картофеля, собранные с опытных полей ТатНИИСХ (Лаишевский район Республики Татарстан), пораженные бактериальными гнилями. Рисунок 2 - Морфология выделенных культур. Окраска по Граму. Citrobacter freundii, 2. - Myroides odoratus, 3. – Providencia alcalifacciens, 4. – Lisinibacillus sphaericus, 5. – Xanthomonas campestris B5 46, 6. – Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 3.2 Идентификация выделенных изолятов на MALDI Bio Typer MALDI Bio Typer (Bruker Daltonik) предназначен для быстрого осуществления идентификации микроорганизмов с высокой степенью точности. Исследование с помощью Maldi BioTyper осуществляется на основе сравнения полученного ряда константных белков с базой данных. Использование метода MALDI Bio Typer позволяет идентифицировать бактерии с высокой достоверностью 26 и скоростью. Результаты идентификации, выделенных из клубней изолятов, представлены в таблице 2. Таблица 2 - Идентификация бактерий на MALDI Bio Typer (Bruker Daltonik) Analyte Organism Score Value E12 (+++) Providencia alcalifacciens 2.356 E1 (++) Lisinibacillus sphaericus 2.272 F4(++) Lisinibacillus fusiformis 2.039 E2(++) Proteus hauservii 2.090 F6(+++) Citrobacter freundii 2.316 F6(+++) Enterobacter cloacae 2.249 F6(+++) Enterobacter asburiae 2.217 F7(+++) Enterobacter kobei 2.118 G1 (+++) Myroides odoratus 2.433 Name Таким образом, идентификация чистых культур бактерий, выделенных из зараженных клубней, с применением метода MALDITOF массспектрометрии позволило установить присутствие в гнилях бактерий Citrobacter freundii, Myroides odoratus, Providencia alcalifacciens, Lisinibacillus sphaericus, Enterobacter kobei, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Lisinibacillus fusiformis, Proteus hauservii. 3.3 Выделение и идентификация микромицетов, возбудителей микозных гнилей из клубней картофеля Для получения высоких стабильных урожаев картофеля и его сохранения препятствуют многочисленные болезни, уничтожая значительную часть урожая. Поэтому любой современный сорт картофеля должен обладать какой-то степенью устойчивости к наиболее распространенным и вредоносным патогенам [Лебедева, 2014]. Урожайность является одним из важнейших моментов развития растения и потому ей всегда уделяют большое внимание [Ертаева, 2014]. Мощным фактором, 27 влияющим на урожайность картофеля, являются болезни, вызываемые грибами рода Fusarium - фузариоз картофеля , ризоктониоз (возб. Rhizoctonia solani), серебристая парша (возб. Helminthosporium solani), фомоз картофеля (возб. Phoma exigua), альтернариоз (возб. Alternaria solani, Alternaria alternata) [Анисимов с соавт., 2009]. Микромицеты рода Fusarium широко распространены в почвах, некоторые виды считаются возбудителями фузариозного увядания и сухой гнили картофеля. Такие заболевания приводят к потере урожая до 50%, таким образом, фузариоз по своей вредоносности занимает второе место после фитофтороза [Huang et.al.,2012]. Проблема грибных заболеваний картофеля является актуальной в условиях Республики Татарстан. В связи свыше сказанным для сохранения урожая картофеля необходимо изучение видового состава местных представителей фитопатогенных микромицетов. В нашей работе объектом исследования служили клубни растений картофеля, собранные с опытных полей ТатНИИСХ (Лаишевский район Республики Татарстан), пораженные микозно-бактериальными гнилями (рис.3). Рисунок 3 – Клубни растений картофеля, пораженные микозно бактериальными гнилями. После инкубации кусочков клубней картофеля на среде Чапека мы наблюдали рост разных видов микромицетов. Для получения чистых культур микромицетов рода Fusarium делали многократный пересев методом укола на свежую среду Чапека. Чистоту культуры контролировали микроскопированием. В результате нами было выделено 5 изолятов микромицетов рода Fusarium : Из клубня I был выделен Fusarium sp. 2, из II клубня - Fusarium sp. 1, 9, из клубня III- Fusarium sp 6, 10 ( рисунок 4) 28 Рисунок 4 – Выделенные фитопатогенные микромицеты рода Fusarium. А.- Fusarium sp 1, Б. – Fusarium sp 2, В. – Fusarium sp 9, Г. – Fusarium sp 10, Д. – Fusarium sp 6. В препаратах, приготовленных из выделенных изолятов микромицетов, обнаружили характерный для рода Fusarium септированный мицелий, веретеновидно-серповидные конидии (рисунок 4). Рисунок 4 – Морфология выделенных микромицетов. А – септированный мицелий, В – конидии. 3.4 Идентификация фитопатогенных микромицетов В ходе исследования не всегда удается по морфологическим признакам определить видовую принадлежность некоторых изолятов. Для достоверной идентификации таких изолятов до вида необходимо использование современных молекулярных методов анализа ДНК гриба. Данные трудности помогает преодолеть метод полимеразной цепной реакции. Однако эффективность этого метода напрямую зависит от качественного выделения ДНК из клеток. Сложность экстракции ДНК гриба зависит от состава клеточной стенки [Тютерев, 2001]. Экстракцию ДНК из мицелия микромицетов осуществляли по методике Don Liu [Liu, 2000]. Для определения нуклеотидной последовательности проводили амплификацию гена 5.8 S рРНК грибов со 29 стандартных праймеров ITS 1 и ITS 2. Электрофорез ПЦР продуктов представлен на рисунке 5. После положительных результатов амплификации ПЦР – продуктов в агарозном геле, образцы ( смесь ДНК с праймерами) были переданы для секвенирования. Результаты секвенса представлены в таблице 3. Рисунок 5 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК грибов рода Fusarium с праймером ITS1 dir :М – маркер молекулярного веса; 1 – Fusarium sp. 1; 2 – Fusarium sp. 2; 3 – Fusarium sp. 9; 4 – Fusarium sp. 10; 5 – Fusarium sp. 6. Таблица 3 – Видовая принадлежность микромицетов, выделенных из клубней картофеля. № Исходное Перекрытие, Идентичность, обозночение % % 1. Fusarium sp. 1 97 99 2. Fusarium sp. 2 94 99 3. Fusarium sp. 9 95 100 4. Fusarium sp. 10 97 99 5. Fusarium sp. 6 97 99 30 Вид Fusarium sambucinum КОС 146. Fusarium oxysporum С-2 1 Fusarium oxysporum TBCui 2 Fusarium redolens Ppf2 Fusarium oxysporum Z9 3 Таким образом, на основе проделанных исследований была определена видовая принадлежность выделенных изолятов микромицетов. Изолят микромицета, выделенный из клубня картофеля I, идентифицирован как Fusarium oxysporum, два изолята из клубня II - Fusarium sambucinum, Fusarium oxysporum и два изолята из клубня III - Fusarium oxysporum, Fusarium redolens. Таким образом, три микромицета, выделенные из разных клубней, принадлежат к одному виду - Fusarium oxysporum. Из литературы известно, что данный вид является возбудителем сухой гнили клубней картофеля [Иванюк, 2005; Du et al., 2012]. 3.5 Проверка фитопатогенных свойств выделенных изолятов Инфекционность паразитарных болезней обусловлено способностью фитопатогенных организмов вызывать заражение, а также быстрым и массовым размножением и распространением их от больных растений к здоровым [Dean, 2012]. На рисунке 6 и 7 представлены результаты оценки фитопатогенных свойств штаммов бактерий и микромицетов. Рисунок 6 – Заражение клубня картофеля фитопатогенными бактериями: 1 - Citrobacter freundii, 2 – Myroides odoratus, 3 – Providencia alcalifacciens, 4 – Lisinibacillus sphaericus, 5 – Xanthomonas campestris, 6 – Pectobacterium carotovorum. 31 Рисунок 7 – Заражение клубня фитопатогенными микромицетами: 1 Fusarium sambucinum, 2- Fusarium oxysporum 1, 3 - Fusarium redolens. После заражения инфекционным материалом здоровых клубней и последующей инкубацией, наблюдали картину развития заболевания картофеля, характерную для бактериальных и грибных инфекций. 3.6 Антагонистическая активность бактерий в отношение фитопатогенных микромицетов рода Fusarium Антагонистические отношения представляют наиболее выраженный интерес среди разнообразных форм взаимоотношений микроорганизмов. Это обусловлено тем, что один вид микроорганизмов может подавлять развитие, либо ингибировать рост микроорганизмов другого вида. [Егоров, 2004]. Многие бактерии обладают антагонистической активностью, но большей способностью ингибировать рост патогенов обладает бактериям рода Bacillus. Это обусловлено тем, что микроорганизмы данного рода способны продуцировать ряд антибиотиков, таких как субтилин, тиротрицин, полимикцин. [Liu et al., 1995]. Различные микроорганизмы, в том числе и не спорообразующие, биоконтроля. могут Таким быть использованы в качестве образом, биологически активные агентов вещества, продуцируемые бактериями, выделенными из растительной микрофлоры, играют важную роль в подавление роста фитопатогенов [Егоров, 2004]. В нашей работе исследовали антагонистическую активность штаммов бактерий Acinetobakter calcoaceticus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus subtilis, Lysinibacillus fusiformis, Pseudomonas 32 putida, выделенных из эпифитной микрофлоры картофеля, в отношении выделенных фитопатогенных микромицетов Fusarium sp. Из таблицы 4 видно, что все исследованные штаммы бактерий проявили антагонистическую активность в отношение разных видов микромицетов рода Fusarium. Зона подавления роста микромицетов варьировала от 10 до 38 мм. Наиболее сильную антагонистическую активность в отношении выделенных фитопатогенных микромицетов показывают штаммы бактерий Bacillus subtilis и Pseudomonas putida в отношении Fusarium redolens (38 мм) и Fusarium sambucinum (25 мм) соответственно. Следует отметить что Bacillus thuringiensis обладает антагонистической активностью в отношении всех исследованных тест- культур выделенных микромицетов. Acinetobakter calcoaceticus, Bacillus weihenstephanensis, Lysinibacillus. fusiformis активны в отношении Fusarium sambucinum и Fusarium redolens, но не ингибируют рост микромицета Fusarium oxysporum ( таблица 4). Таблица 4 – Влияние бактерий–антагонистов на рост фитопатогенных микромицетов рода Fusarium методом агаровых блоков № Бактерии– Зона подавления роста фитопатогенных антагонисты 1. Acinetobakter микромицетов, мм Fusarium Fusarium Fusarium sambucinum oxysporum redolens 12±0.35 - 20±1.23 calcoaceticus 2. Bacillus thuringiensis 22±1.2 10±1.8 19±0.31 3. Bacillus 23±0.8 - 17±0.34 weihenstephanensis 4. Bacillus subtilis 31±2.25 28±2.4 38±0.56 5. Lysinibacillus 21±2.1 - 23±1.4 fusiformis 33 6. Pseudomonas putida 25±0.11 20±1.53 21±1.85 Антагонистическую активность наиболее эффективных бактерийантагонистов B. subtilis и P. putida выражали в %, относительно контроля. (таблица 5). В качестве контроля использовали диаметр роста колонии микромицетов на среде Чапека без внесения бактерий антагонистов. Бактерии рода Bacillus уже применяются на практике в качестве агентов биоконтроля, так как они обладают широким спектром антагонистической активности в отношении различных фитопатогенов. Показано, что некоторые штаммы Bacillus mycoides, B. pumilus 203-6, B. subtilis GB03 и IN937 способны индуцировать системную устойчивость растений к широкому кругу возбудителей болезней [Bargabus et al., 2002; 2004; Ryu et al., 2004; Huang et.al, 2012]. В результате наших исследований показано, что штамм B.subtilis обладает высокой антагонистической способностью, что характеризует высокий процент подавления роста всех фитопатогенных микроорганизмов(65 – 80%) (рисунки 8, 10). Антагонистическая активность P. putida по сравнению с B.subtilis была ниже (42-53%) (рисунки 9,10). Таблица 5 - Исследование антибактериальной активности бактерий в отношении фитопатогенных микромицетов в процентном соотношении № Бактерии Подавление роста колонии микромицетов, % от контроля Fusarium Fusarium sambucinum oxysporum Fusarium redolens 1 B. subtilis 65±0.15 59±0.5 80±1.6 2 P. putida 53±0.28 42±1.2 44±0.85 34 B. subtilis Антагонистическая активность,% 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Fusarium sambucinum Fusarium oxysporum Fusarium redolens Рисунок 8 –Антагонистическая активность Bacillus subtilis в отношении выделенных фитопатогенных микромицетов р. Fusarium. Антагонистическая активность,% P. putida 60 50 40 30 20 10 0 Fusarium sambucinum Fusarium oxysporum Fusarium redolens Рисунок 9 – Антагонистическая активность Pseudomonas putida в отношении выделенных фитопатогенных микромицетов р. Fusarium. 35 Рисунок 10 – Подавление роста микромицетов: I – F. sambucinum II – F. oxysporum, III – F. redolens, бактериями-антагонистами: 1 – B. subtillis, 2 P. putida. 3.7 Антагонистическая активность бактерии в отношении возбудителей бактериальных гнилей картофеля Микроорганизмы, продуцирующие различные биологически активные вещества, способны подавлять возбудителей болезней растений. Для выживания в одной экологической нише с патогенами, антагонисты подавляют или уничтожают возбудителей, бактериисинтезируя диффузные или летучие антимикробные вещества[Branda et al., 2001, PérezGarcía et al., 2011]. Такие антагонистические способности микроорганизмов используются при создании биопрепаратов для биоконтроля фитопатогенов экономически важных сельскохозяйственных культур [Fisher et al., 2012]. В данной работе исследовали способность бактерии Acinetobakter calcoaceticus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus subtilis, Lysinibacillus. fusiformis, Pseudomonas putida подавлять рост 36 выделенных фитопатогенных бактериальных изолятов, которые имели наибольшее значение по величине Score Values по результатам MALDI TOF масс-спектроскопии: Citrobacter freundii, Myroides odoratus, Providencia alcalifacciens, Lisinibacillus sphaericus. Также нами были использованы известные лабораторные штаммы фитопатогенов Xanthomonas campestris В 546, Pectobacterium atrosepticum SCRI1043. При совместном культивировании бактерий потенциальных антагонистов клетки штамма фитопатогенов и антагониста, который продуцирует антибактериальные вещества, образуют зоны ингибирования роста вокруг агаровых блоков с фитопатогенами. (рисунок 11). Величина зоны подавления роста всех тест-культур находится в диапазоне 10-25 мм, при этом диаметр агарового блока составлял 9 мм. В результате исследования наблюдали высокую антагонистическую активность в отношении всех выделенных фитопатогенных бактерий у штаммов B.thuringiensis и B.weihenstephanensis. Диаметр подавления роста B.weihenstephanensis в отношении Pectobacterium atrosepticum SCRI1043и Myroides odoratus составил 20 мм, Citrobacter freundii, Providencia alcalifacciens SCRI1043 - 18 мм, и наименьшая активность в отношении штаммов Xanthomonas campestris B546 - 14мм и Lisinibacillus sphaericus – 13мм. Диаметр подавления роста B.thuringiensis в отношении Citrobacter freundii составил 20 мм, Xanthomonas campestris B546 – 18 мм, Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 – 17мм, Providencia alcalifacciens и Myroides odoratus 16мм и Lisinibacillus sphaericus – 11 мм. Acinetobakter calcoaceticus обладает невысокой антимикробной активностью в отношении Xanthomonas campestris B546, Pectobacterium atrosepticum SCRI1043. B.subtilis обладает средней ингибирующей активостью в отношении всех выделенных фитопатогенов(12-15). Наименьшей активностью в подавлении роста фитопатогенных бактерий обладал штамм Pseudomonas putida ( таблица 6). 37 Таблица 6 - Антагонистическая активность бактерий в отношении возбудителей бактериальной гнили картофеля № Бактерии - Диаметр подавления роста фитопатогенных антагонисты микроорганизмов, 1. А.calcoaceticus - - - - 12±0.1 15±1.5 5 2. B.thuringiensis 20±0.4 16±0.6 5 3. B.weihenstephanensis 18±0.2 16±0. 11±1.2 18±0.2 17±2.3 13±1.8 14±0.8 20±0.4 6 20±0.4 18±0. 2 4. B.subtilis 15±1.2 12±2.5 15±0. 5 15±2.2 38 5. L. fusiformis, 22±2.2 18±0.2 5 6. P.putida 13±2.4 12±1.6 20±2. 15±0.2 5 18±0.2 13±0.4 5 5 11±1.0 - - 8 38 13±0.2 17±1.65 12±1.45 SCRI1043 atrosepticum Pectobacterium campestris B546 Xanthomonas sphaericus Lisinibacillus alcalifacciens Providencia odoratus Myroides freundii Citrobacter мм Рисунок 11 – Антагонистическая активность микроорганизмов в отношении выделенных фитопатогенов. 1 - Acinetobakter calcoaceticus, 2 - Bacillus thuringiensis, 3 - Bacillus weihenstephanensis, 4- Bacillus subtilis, 5- Lysinibacillus. fusiformis, 6Pseudomonas putida. I - Citrobacter freundii, II - Myroides odoratus, III – Providencia alcalifacciens, IV - Lisinibacillus sphaericus, V – Xanthomonas campestris B5, VI -. Pectobacterium atrosepticum SCRI1043. 39 ВЫВОДЫ 1) Из клубней картофеля, пораженных микозно-бактериальными гнилями, выделено 9 изолятов бактерий и 5 изолятов микромицетов. 2) Выделенные изоляты бактерий были идентифицированы как: Providencia alcalifacciens, Lisinibacillus sphaericus, Lisinibacillus fusiformis, Proteus hauservii, Citrobacter freundii, Myroides odoratus, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Enterobacter kobei. 3) По гомологии генов 5.8S рРНК установлена видовая принадлежность изолятов микромицетов: Fusarium sambucinum, Fusarium oxysporum 1, Fusarium oxysporum 2, Fusarium redolens, Fusarium oxysporum 3. 4) Все выделенные изоляты бактерий вызывают умеренное развитие мокрой гнили, а изоляты микромицетов - сухой гнили в клубнях растений картофеля. 5) наиболее Штаммы Bacillus subtilis и Pseudomonas putida обладают высокой антагонистической активностью в отношении выделенных видов фитопатогенных микромицетов рода Fusarium. 6) обладают Штаммы Bacillus thuringiensis и Bacillus weihenstephanensis высокой антагонистической активностью в отношении бактериальных фитопатогенов. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1) Анисимов, Б. В. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков [Текст] / Б. В.Анисимов, Г. Л. Белов, Ю. А. Варицев, С. Н. Еланский, Г. 40 К. Журомский, С. К. Завриев, В. Н. Зейрук, В. Г. Иванюк, М. А. Кузнецова, М. П. Пляхневич, К. А. Пшеченков, Е. А. Симаков, Н. П. Склярова, З. Сташевски, А. И. Усков, И. М. Яшина // Москва: Издательский дом Ивана Корытова, 2009. —272 с. - ISBN 978-5903906-02-4. 2) Атрашкова, А.В. Влияние пестицидов на микрофлору дерновоподзолистых почв Беларуси [Текст] / А.В. Атрашкова // Известия Акдемии аграных наук Республики Беларусь. - М.: Биология – 2001. №2. – С. 61-64. 3) Баснакьян, И.А. Стресс у бактерий [Текст] / И.А. Баснакьян // Вестник Российской Академии медицинских наук. - М.: Медицина.- 2003. – 136 с. 4) Боронин, А. М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений[Текст] / А.М. Боронин // М.:Биология. - 1998, № 3. - С. 25- 1. 5) Бухарин, О. В. Способ определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий [Текст] / О. В. Бухарин, А. В. Семенов, С. В. Черкасов, А. В. Сгибнев //Патент РФ № 2376381. - 2009. Бюл. № 35. 6) Быков, В. Ю. Успехи медицинской микологии[Текст] / В.Ю. Быков, Е.В. Богомолова // М.: Национальная академия микологии. - 2005. - С. 12-13. 7) Дятлова, К. Д. Микробные препараты в растениеводстве [Текст] / К. Д. Дятлова // Соросовский образовательный журнал. — 2001. — Т. 7, № 5. — С. 17–22. 8) Желдакова Р. А.Фитопатогенные микроорганизмы[Текст] / Р. А. Желдакова, В. Е. Мямин// Учеб.- метод.комплекс для студентов биол. фак. спец. «Биология». – Мн. : БГУ, 2006. – С. 19 – 35. 9) Завалин, Ф.Ф. Биопрепараты, удобрения и урожай [Текст] / Ф. Ф. Завалин // М.: Издательство ВНИИА. - 2005. - 302 с. 41 10) Иванюк, В. Г. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков [Текст] / В.Г. Иванюк, С.А. Банадысев, Г.К. Журомский // Вестник национальной академии наук Белоруссии – Минск. - 2009. №1. – С. 56-61. 11) Ильяшенко, Д. А. Методические указания по оценке картофеля на устойчивость к клубневым гнилям [Текст] / Д.А. Ильяшенко// РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству. - , 2010. – 52 с. 12) Карамова Н.С. Мутагенное действие экстрактов растений картофеля S. tuberosum L., обработанных пестицидами[Text] / Н.С. Карамова, З.Сташевски, А.П. Денисова // Ученые записки Казанского университета. - Сер.: Естеств. Науки. – 2009. – Т. 151. кн.1. С. 155-163 13) Лазарев, А. М. Бактериальные болезни картофеля: диагностика и меры борьбы [Текст] / А.М. Лазарев, Т.П. Борисова // Сельскохозяйственные вести. – С.- Петербург, - 2010. - №4. – С. 48-50. 14) Макеева А.М. Болезни клубней картофеля и меры борьбы с ними в лесостепи Самарской области [Текст] / А.М. Макеева, В.Г. Каплин, Н.В. Салманов. – Самара: РИЦ СГСХА, 2012. – 3 с. 15) Маханько, В.Л. Настольная книга картофелевода [Текст] / С.А. Турко, В.А. Козлов, В.Л. Маханько, Л.Н. Козлова, И.И. Бусько, Е.В. Радкевич, Г.А. Яковлева, А.О. Бобрик / РУП «Науч.-практ. центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству». – Минск, 2012. – С. 37-40. 16) Монастырский, О. А. Современные проблемы и решения создания биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных культур от возбудителей болезней [Текст] / О. А. Монастырский // Агро XXI. 2009. - Т.7. - С.3-5. 17) Mоргун, В. В. Ростстимулирующие ризобактерии и их практическое применение [Текст] / В. В. Моргун, С. Я. Коць, Е. В. 42 Куценко // Физиология и биохимия культ. растений. - 2009. - Т.41. С.187-207. 18) Попкова, К. В. Болезни картлфеля [Текст] / К.В.Попкова, Ю.И.Шнейдер, А.С.Воловик, В.А.Шмыгля // – М.: Колос. – 1980. – 304 с. – С. 13-30. 19) Семенов, А. В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий [Текст] / А. В. Семенов, А. В. Сгибнев, С.В. Черкасов, О.В. Бухарин// Бюл. эксп. биол. и мед. - 2007 – Т. 15, № 11. С. 545–548. 20) Третьякова О. М. Экспрессия PR-генов при бактериальной инфекции [Текст] / О.М. Третьякова, А.И. Евтушенков // Труды БГУ. 2011. – Т. 6, №1. – С. 163-167. 21) Тютерев, С. Л. Биохимические методы и сследования индуцированной болезнеустойчивости растений[Текст] / С.Л. Тютерев, Т.А. Евстигнеева// СПб: ВИЗР. - 2001. – 67 с. 22) Черкасов, С. В. Бактериальные механизмы колонизационной резистентности [Текст] / С. В. Черкасов, А. В. Сгибнев // Журн. микробиол. - 2006.- Т. 5, № 4. - С. 100–105. 23) Штерншис, М. В. Тенденции развития биотехнологии микробных средств защиты растений в России [Текст] / М.В. Штерншис // Вестник Томского государственного университета. – М.: Биология. - 2012. – 92 с. 24) Afzal, M. Endophytic bacteria: prospects and applications for the phytoremediation of organic pollutants [Text] / M. Afzal., Q. Khan. M., A.Sessitsch // Chemosphere. - 2014. - V. 11, No. 7. - P. 232 – 242. 25) Baldi, E. Mineralization dynamics of different commercial organic fertilizers from agro-industry organic waste recycling: an incubation experiment. [Text] / E. Baldi, M. Toselli // Plant Soil Environ - 2014. V.60, No. 3. – P. 93–99. 43 26) Bargabus, R. Characterization of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiol [Text] / R. L. Bargabus, N. K. Zidack, J. W. Sherwood, B. J. Jacobsen // Mol. Plant Pathol. – 2002 – V.61. – P.289298. 27) Bargabus, R. Screening for the identification of potential biological control agents that induce systemic acquired resistance in sugar beet [Text] / R. L. Bargabus, N. K. Zidack, J. W. Sherwood, B. J. Jacobsen // Biological Contr. 2004. – V. 30. – P.342-350. 28) Berg, G. Unraveling the plant microbiome: looking back and future perspectives [Text] / G. Berg, M. Grube, M. Schloter, K. Smalla // Front Microbiol. - 2014. - V. 5, No. 148. - P. 1-7. 29) Branda, SS. Fruiting body formation by Bacillus subtilis [Text] / Branda SS, Gonzalez-Pastor JE, Ben-Yehuda S, Losick R, Kolter R. Proc Natl Acad // Sci USA. / 2001. - V.98. - P.11621–11626. 30) Cardoso, R. Mitotic crossing-over induced by two commercial herbicides in diploid strains of the fungus Aspergillus nidulans [Text] / R. Cardoso, L. Pires, T. Zucchi // Gen Mol Res. – 2010. – V. 9. – P. 231-238. 31) Chandran, P. Scope of horticultural land-use system in enhancing carbon sequestration in ferruginous soils of the semi-arid tropics[Text] / P. Chandran, S.K. Ray, S.L. Durge, P. Raja, A.M. Nimkar, T. Bhattacharyya // Curr. Sci. - 2009. – V. 97. – P. 1039-1046. 32) Charkowski, A. 2007. The soft rot Erwinia. The Plant Associated Bacteria Gnanamanickam, Samuel S Eds [Text] / A. Charkowski //. Kluwer Academic Publishers. – 2007. V.23. - P. 21–35. 33) Costa, F. Biological Control of Phytopathogenic Fungi by Endophytic Actinomycetes Isolated from Maize (Zea mays L.) [Text] / F. Gh.Costa, T.D. Zucchi //Brazilian archives of Biology and technology. – 2013. - V.56, N6. – P. 948-955. 44 34) Dean, R. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology [Text] / R. Dean, A. Jan, L. Van Kan, A. Zacharias, A. Di Pirtro // Molecular plant pathology. – 2012. – V.13. – P. 415 – 421. 35) Du, M. Characterization of Fusarium spp. сausing potato dry rot in China and susceptibility evaluation of Chinese potato germplasm yto the pathogen [Text] /.M. Du, X. Ren, Q. Sun, Yi.Wang, R. Zhang//Potato Research. – 2012. - V. 55. – P. 175-184. 36) Favel, D. Commercialization and implementation of biocontrol [Text] / D. Favel // Annual review of phytopathology. – 2005. Vol.43. — P.337. 37) Favret, M. Thuricin: the bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis [Text] / M.E. Favret, A.A. Yousten // J. Invertebr. Pathol. – 1989. – V.53. – P. 206-216. 38) Fermor, T. Bacteriolysis by Agaricus bisporus [Text] / T.Fermor // J.Gen. Microbiol.- 1991.- V. 130. - P. 761–769. 39) Fisher, M. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health [Text] / M. C. Fisher, D. A. Henk, Ch. J. Briggs, J. S. Brownstein, L. C. Madoff, S. L. McCraw // Gurr Nature. – 2012. – V. 484. - P. 186–194. 40) Flemming, H. Biofouling in water systems – cases, causes and countermeasures [Text] / H. C. Flemming // Appl. Microbiol. Biotechnol. − 2002. − Vol.59. – P. 629–640. 41) Gill, S. Identification, isolation and cloning of a Bacillus thuringiensis Cry-IAc toxin-binding protein from midgut of the lepidopteran insect Heliothis virescens [Text] / S.S Gill, L. Ray, S.L. Durge, P. Raja, A.M. Nimkar, T. Bhattacharyya // Curr. Sci. - 2009. – V. 97. – P. 39-56. 42) Gartemann, K. Lavibacter michiganensis subsp. michiganensis: first steps in the understanding of virulence of a Gram- positive phytopathogenic bacterium [Text] / K.H. Gartemann, O. Kirchner, J. Engemann, I. Grefen, R. Eichenlaub, A. Burger// Journal of Biotechnology,. - 2003. - V. 106. - P. 179-191. 45 43) Gohlke, J. Plant responses to Agrobacterium tumefaciens and crown gall development [Text] /J. Gohlke, R. Deeken // Front Plant Sci. 2014. - V. 20. - P. 1-11. 44) Huang, T. DNA polymorphisms and biocontrol of Bacillus antagonistic to citrus bacterial canker with indication of the interference of phyllosphere biofilms [Text] / T. Huang, D. Tzeng, A. Wong, C. Chen, K. Lu, Y. Lee, , W. Huang, B. Hwang, K. Tzeng // PLoS One. - 2012. - V.7, No.7. - P.1 - 11. 45) Lambers, H. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: an evolutionary perspective [Text] / H. Lambers, Ch. Mougel, B. Jaillard, Ph. Hinsinger //Plant Soil. - 2009.- Vol. 321.- P. 83-115. 46) Leeman, M. Induction of systemic resistance against Fusarium wilt of radish by lipopolysaccharides of Pseudomonas fluorescens [Text] / M. Leeman, A. Van Pelt, F. Den Ouden, M. Heinsbroek, A. Bakker, B. Schippers // Phytopathology. - 1995. - V.85. - P.1021 - 1027. 47) Liu, D. Rapid Mini-Preparation of Fungal DNA for PCR [Text] / D. Liu, S. Coloe, R. Baird, J. Pedersen // J. Clin. Microbiol. January 2000vol. 38 no. 1 471 48) Liu, D. Biological control of potato scab in the field with antagonistic Streptomyces scabiei [Text] / Liu D., Anderson N.A., Kinkel L.L. // Phytopathology. - 1995. - V8.5. – P.827-831. 49) Long, R. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria[Text] / R. Long, F. Azam // Appl. Environ. Microbiol. – 2001.− Vol. 67, N 11. – P. 4975−4983. 50) Mausam,V. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: Panoply of biological control [Text] / V.Mausam, S.K. Brar, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, J.R. Val'ero // Biochemical Engineering Journal. – 2007. – V. 37. – P. 1-20. 46 51) Maule, A. Sources of natural resistance to plant viruses: Status and prospects [Text] / A.J. Maule, C. Caranta, M.I. Boulton / Mol. Plant Pathol. – 2007. - V.8. - P. 223-231. 52) Pal, K. Biological Control of Plant Pathogens [Text] / K.Pal, B.Gardener //The Plant Health Instructor. 2006. – P. 5-25. 53) Park, J. Bolan N., Mallavarapu M. Enhancing the solubility of insoluble phosphorus compounds by phosphate solubilizing bacteria [Text] / J. Park, N. Bolan, M. Mallavarapu // 19-th World Congres of Soil Science. – Brisbane, 2010. - Р. 65-68. 54) Pérez-García, A. Biological control of phytopathogenic fungi by aerobic endospore-formers[Text] / A. Pérez-García, D Romero, H. Zeriouh, A ,de Vicente // Endospore-forming soil bacteria // Soil Biology - 2011. – V. 27. - P. 157-180. 55) Rasmussen, T. A Bargain of Effects[Text] / T.Rasmussen, M. Givskov // Microbiology.- 2006. - Vol. 152. – P. 895–904. 56) Reino, J.Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma [Text] / J. L. Reino, R. F. Guerriero, R. Herna'ndez-Gala', I. G. Collado // Phytochem Rev. - 2008. — V. 7. — P. 89–123. 57) Richmond, Т.Chasing the dream: plant EST micro-arrays[Текст] / Т.Richmond, S. Somerville// Plant Biol. - 2000. - V.3. - P.108-116. 58) Ryan, A. Effect of pathogen isolate, potato cultivar and antagonist strain on potato scab severity and biological control [Text] / A.D. Ryan, L.L.Kinkel,; J.L. Schottel // Biocontrol Science and Technology. - 2004. – V.14. – P.301-311. 59) Ryu, C. Bacterial volatiles induce systemic resistance in Arabidopsis[Text]. / C. M. Ryu, M. A.Farag, C. H.Hu, M. S.Reddy, J. W. Kloepper, P. W. Pare // Plant Physiol. – 2004. V. 134. –P.1017-1026. 60) Schleifer, K. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications [Text] / K. Schleifer, O.Kandler // Bacteriol. Rev. – 1972. - V. 36, № 4. – Р. 407–437. 47 61) Slusarenko, A. Resistance to Plant Diseases [Текст] / A.J. Slusarenko, R.S.S. Fraser, L.C. Van Loon // Dordrecht - 2000. - P. 77-100. 62) Starchak,V. Agro-ecological problems of protection environment [Text] / V. Starchak, I. Puschkaryova // Machulski G Agroecological journal. — 2009. — № 1. — Р. 11–15. 63) Stowell, L.The bacteriostatic activity of fluorescent pigment on Pseudomonas fluorescens [Text] / L.J. Stowell, M.E. Stanghellini, I.J. Misaghi // J. Phytopathology. - 1981. - N8. - P.906. 64) Sumíková, T. Mycotoxin Production, Chemotypes and Diversity of Czech Fusarium graminearum Isolates on Wheat [Text] / T. Sumíková, L. Gabrielová, L. Kučera, M.Žabka, J. Chrpová // Czech J. Food Sci. 2013. V.31.- No.4. 65) Szczechura, W. Fusarium oxysporum f. Sp. Radicis-lycopersici – the cause of fusarium crown and root rot in tomato cultivation [Text] / W. Szczechura, M. Staniaszek, H. Habdas //Journal of plant protection research. – 2013. – V. 53, No. 2. – P.172-176. 66) Thomson, N. Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is under quorum sensing control [Text] / N.R. Thomson, M.A. Crow, SJ. McGowan // Mol. Microbiol. - 2000. - N.36. - P. 539-556. 67) Tilak, R. Mycotic keratitisin India: afive-year retrospective study. [Text] / R.Tilak, S. Abhisek, O. Prakash, A. Chandra, A.Kumar2010. // J Infect Dev Ctries. – 2010. - V. 4(3). - P. 171-174. 68) Van, L. Significance of Inducible defense-related proteins in infected plants [Text] / L.Van, C. Loon, M. Rep, C. Pieterse // Annu. Rev. Phytopathol. - 2006. – V. 44. – P. 135- 162. 69) Vinale, F. Trichoderma-plant-pathogen interactions [Text] / F. Vinale, K. Sivasithamparam, E.L. Ghisalberti, R. Marra,M. Lorito // Soil Biology & Biochemistry. – 2008. – V. 40. - P. 1-10. 70) Wharton, P. Seed treatment application-timing option for control of Fusarium decay and sprout rot of cut seedpieces [Text] / P. Wharton, W. 48 Kirk, D. Berry, P. Tumbalam // American Journal of Potato Research. 2007.V. 84. - P. 237-244. 71) Yasmin, H. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from rhizosphere soil of weeds of khewra salt range and attock [Text] / H. Yasmin, A. Bano // Pakistan Journal of Botany. – 2011. - № 3. Р. 1663-1668. 72) Zhou, Y. Novel roles of Bacillus thuringiensis to control plant diseases [Text] /Y, Zhou, Y.L, Choi, M // Appl Microbiol Biotechnol. – 2008. - V.80. – P 563–572. 49
