синтетические пептиды и рекомбинантные белки в анализе

УДК 616.36-002.14: 578.891-078.33
СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ И РЕКОМБИНАНТНЫЕ
БЕЛКИ В АНАЛИЗЕ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ
АНТИТЕЛ, НАПРАВЛЕННЫХ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
ШИРОКО РАСПРОСТРАНЕННЫХ ИНФЕКЦИЙ
В. В. Новиков, В. К. Пименов, Е. С. Вязьмина
Нижегородский госуниверситет
С. В. Зубов
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ
Н. В. Фриго
Нижегородский НИКВИ Минздрава РФ
С использованием синтетических пептидов и рекомбинантных белков, воспроизводящих антигенные детерминанты белков возбудителей вирусного гепатита С и сифилиса, исследованы особенности антителообразования у лиц, пораженных данными инфекциями. Картированы иммунодоминантные эпитопы
белков возбудителей, обнаружены иммунодоминантные конформационные и линейные детерминанты белков вируса гепатита С. Выявлены характерные для
хронического и острого гепатитов С спектры антител, направленных против
разных белков вируса. Показаны возможности их применения для дифференциальной диагностики вирусного гепатита С. Определен эпитоп белка Тр41 бледной трепонемы, наличие антител к которому позволяет успешно проводить
скрининговое тестирование сифилиса и отсекать ложноположительные реакции. Результаты исследования картины антителообразования использованы для
конструирования иммуноферментных тест-систем для диагностики вирусного
гепатита С и сифилиса.
В основе гуморального иммунного ответа лежит выработка В-клетками специфических антител против антигенных детерминант (эпитопов) инфекционных
агентов. Наличие таких антител в сыворотке крови свидетельствует о том, что
организм, по крайней мере, встречался с инфекционным агентом. В ряде случаев
при вирусных и бактериальных инфекциях выявление сывороточных антител
служит важным диагностическим показателем. Так, иммунодиагностика вирусного гепатита С построена на определении в сыворотке крови антител к белкам вируса. Аналогичным образом иммунодиагностика другого широко распространенного заболевания – сифилиса – в настоящее время базируется на выявлении антител к возбудителю этого заболевания. Обе инфекции чрезвычайно широко распространены среди населения, в связи с чем всестороннее исследование механизмов антителообразования и разработка на этой базе новых методов иммунодиагностики является важной и актуальной задачей.
С целью определения участков аминокислотной последовательности белков
вируса гепатита С (HCV), формирующих иммунодоминантные антигенные детерминанты, использовали широкий набор синтетических пептидов, воспроизводящих фрагменты последовательности структурных и неструктурных белков
HCV, а также рекомбинантные копии этих белков. Синтетические пептиды были
143
любезно предоставлены А. А. Колобовым (НИИ ОЧБ, С.-Петербург) и Ю. А. Семилетовым (Институт вирусологии РАМН, Москва). Рекомбинантные копии белков были получены в АО «Капель», Москва.
Известно, что геном вируса гепатита С кодирует полипротеин, который процессируется на отдельные белки, одна часть которых является структурными вирусными белками и входит в состав зрелой вирусной частицы (core, Е1, Е2), а
другая часть является так называемыми неструктурными (NS3, NS4, NS5) белками (Соринсон, 1996). С помощью иммуноферментного анализа в крови HCVинфицированных лиц определяли антитела класса IgG и IgM, направленные к каждому из протеинов, используя для этого полноразмерные рекомбинанатные белки и синтетические пептиды, перекрывающие большую часть последовательности
белков вируса и имеющие длину от 6 до 92 аминокислот.
Ранее при изучении встречаемости в сыворотках крови антител класса IgG
против cоre белка HCV синтетические пептиды длиной 15–20 аминокислот дали
возможность выявить иммунодоминантный район на N-концевом участке этого
белка, состоящий из нескольких коротких линейных антигенных детерминант,
локализованных в интервале между 3 и 117 аминокислотой (Пименов и др., 1998).
Дальнейшее исследование этого района, проведенное в рамках данной работы,
показало, что титр антител к каждому из коротких пептидов был на порядок ниже
титра антител к 70-мерному пептиду, охватывающему ту же область аминокислотной последовательности, что и короткие пептиды. Титр антител к смеси коротких пептидов также был на порядок ниже титра антител к длинномерному
пептиду. Аналогичные данные были получены при сравнении титров антител к
коротким пептидам и рекомбинантному core-белку, несущему этот же участок
аминокислотной последовательности.
Таким образом, совокупность пептидов, охватывающих основные линейные
детерминанты, выявляет в крови на порядок меньшее количество IgG-антител к
N-концевой последовательности core-белка, в сравнении с длинными пептидами,
имитирующими ту же аминокислотную последовательность. Полученные данные
свидетельствуют о том, что при развитии иммунного ответа на core-белок HCV
наряду с антителами к коротким линейным детерминантам значительный вклад в
образование антител класса IgG вносят антитела, направленные к конформационной детерминанте, локализованной на N-концевом участке белка.
В сыворотке крови этих же больных исследовали наличие антител класса IgM,
дающих реакцию с пептидами, соответствующими различным участкам аминокислотной последовательности core-белка HCV. Результаты показали, что антигенные детерминанты, реагирующие со специфическими антителами класса IgM,
совпадают с эпитопами, узнаваемыми антителами класса IgG. Наиболее антигенно активным участком последовательности core-белка также явился N-концевой
участок.
Более детальный анализ обнаружил, что c помощью короткоразмерного пептида, соответствующего иммунодоминантному участку core-белка, выявляется
большее количество сывороток, несущих IgM, чем при использовании 70членного пептида, шире охватыающего эту же область последовательности coreбелка HCV. При этом количественное содержание IgM-антител, взаимодействующих с короткоразмерным пептидом, оказалось выше содержания IgM-антител
к длинноразмерному пептиду.
Следовательно, антитела класса IgM давали картину, противоположную той,
которая была зарегистрирована для антител класса IgG. К короткому пептиду,
144
несущему иммунодоминантную детерминанту, содержалось IgM-антител больше,
чем к длинноразмерному пептиду, несущему в своем составе несколько антигенных детерминант, в том числе и конформационную детерминанту. Объяснения
такому противоречию могут лежать в плоскости, касающейся различной природы
антигенных детерминант, моделируемых короткими и длинноразмерными пептидами.
Антитела класса IgM являются так называемыми «ранними» антителами, образующимися на начальных стадиях развития иммунного ответа. На последующих этапах чаще всего происходит переключение изотипа на антитела класса IgG.
При этом в В-клеточных зародышевых центрах лимфатических органов интенсивно осуществляется мутационный процесс, обозначаемый как соматические
гипермутации и приводящий к повышению аффинности антител, что важно для
повышения эффективности иммунного ответа (Ярилин, Добротина, 1997).
Поскольку короткие пептиды воспроизводят линейные детерминанты, а длинные пептиды формируют в дополнение конформационные эпитопы, то можно
сделать вывод, что развитие иммунного ответа на вирус гепатита С на ранних
стадиях характеризуется преобладанием среди антител класса IgM тех антител,
которые направлены к коротким линейным детерминантам. Дальнейшее «созревание» иммунного ответа, сопровождающееся переключением изотипа на IgG и
повышением аффинности антител, приводит к формированию пула антител класса IgG, взаимодействующих как с линейными, так и конформационными детерминантами core-белка HCV.
Представленный выше материал свидетельствует также в пользу того, что в
процессе соматических гипермутаций, приводящих к секреции антител с повышенной аффинностью, в первую очередь происходит отбор В-клеточных клонов,
продуцирующих антитела, направленные к конформационным детерминантам.
Нужно заметить, что у больных хроническим гепатитом С в случае активной
репликации вируса с течением времени содержание анти-core-IgM закономерно
повышается (Афанасьев, 1996), т. е. несмотря на хронизацию процесса, иммунная
система постоянно рассматривает вирус как новый инфекционный агент. Это связано с высокой вариабельностью генома вируса, приводящей к сравнительно частым аминокислотным заменам в составе белков вируса, в том числе и в составе
core-белка. Вследствие аминокислотных замен белки узнаются иммунной системой как белки нового вируса. В результате, используя механизм сцепленного узнавания, иммунная система нарабатывает IgM-антитела не только к вариабельным, но и к консервативным иммунодоминантным участкам core-белка. В последнем случае антитела хорошо выявляются с помощью использованных нами
пептидов и могут быть использованы в качестве иммунологических маркеров в
диагностике вирусного гепатита С.
Однако использование короткоразмерных и даже длинных пептидов, моделирующих аминокислотную последовательность белков вируса, не всегда дает возможность эффективно выявлять в крови больных антитела к этим белкам. Так,
для анализа антигенных свойств NS-3 белка HCV нами был использован набор
пептидов длиной от 7 до 92 аминокислотных остатков, воспроизводящий возможные иммунодоминантные участки белка на протяжении всей его последовательности. Было обнаружено, что такие пептиды, примененные в иммуноферментном
анализе как по одному, так и в различных комбинациях, не позволяют выявлять
антитела к NS-3 протеину с той же эффективностью, что рекомбинантный полноразмерный белок.
145
Подобные результаты были получены в исследованиях других авторов
(Mondell e. a., 1994). Причина неудачи в использовании синтетических пептидов
кроется в том, что иммунодоминантные эпитопы NS-3 протеина имеют конформационную природу и построены из остатков, занимающих достаточно далекие
позиции в аминокислотной последовательности. Даже использование пептидов
длиной почти 100 аминокислотных остатков недостаточно для воспроизведения
таких конформационных детерминант. Практическим следствием, вытекающим
из данного факта, является необходимость использования в диагностических целях только рекомбинантного NS-3 белка. Синтетические пептиды в данном случае
не могут заменить антиген, построенный полноразмерным генно-инженерным
продуктом.
Обследование больных гепатитом С нередко ограничивается определением
лишь суммарных антител к вирусным антигенам. Такой подход не дает возможности разграничить острую и хроническую фазы болезни, прогнозировать течение
гепатита. Этим определяется необходимость повышения информативности диагностики гепатита С. Одна из возможностей совершенствования диагностики данного заболевания заключается в создании методов раздельного определения антител к различным протеинам HCV. Используя результаты анализа иммуногенных
свойств белков HCV, проведенного на панели синтетических пептидов и рекомбинантных белков, мы сконструировали иммуноферментную тест-систему, позволяющую в одном опыте одновременно определять антитела класса IgG, направленные против Е1/Е2, core, NS3, NS4 и NS5 протеинов.
С помощью разработанной тест-системы была проанализирована встречаемость в сыворотках больных IgG-антител к различным протеинам HCV. Обнаружено наличие 17 разных спектров антител, которые представляли собой комбинации антител к пяти белкам HCV. У разных больных обнаруженные антительные
спектры были построены как из антител только к какому-нибудь одному из указанных протеинов, так и из комбинации антител, направленных к разным белкам.
Диагностически важным показателем оказалось обнаружение антител, направленных только к core-протеину, у 66% из 160 больных острым гепатитом С. Был
обнаружен также набор спектров антител, характерных для хронического гепатита С. Он включал такие спектры как анти-NS4, анти-core+NS4, антиcore+NS3+NS5, анти-core+NS4+NS5, анти-E1/E2+core+NS3+NS4, анти-NS3+NS4.
Указанные спектры регистрировались у половины больных хроническим гепатитом С и не встречались или встречались очень редко у больных острым гепатитом
С, т. е. среди 17 зарегистрированных спектров антител было выявлено 8 спектров,
несущих информацию о фазе инфекционного процесса. Таким образом, дифференциальный подход к определению антител к разным белкам HCV, основанный
на предварительном детальном анализе эпитопной специфичности антител, позволил сформировать новый методический подход к дифференциальной диагностике вирусного гепатита С и сконструировать новую иммунодиагностическую
иммуноферментную тест-систему для нужд практического здравоохранения.
Другим примером важности и эффективности анализа антигенных свойств
возбудителей инфекционных заболеваний в целях совершенствования методов
иммунодиагностики являются проведенные нами исследования по созданию тестсистемы для выявления ложно-положительных реакций на сифилис. Для диагностики сифилиса в настоящее время применяется набор традиционных серологических тестов, а также иммуноферментный метод определения антител к мембранным белкам возбудителя сифилиса. В качестве антигена при выявлении антител
146
обычно используют культуральный лизат или полноразмерные рекомбинантные
белки. Важной проблемой в диагностике сифилиса является наличие ложноположительных реакций, обусловленных близостью в строении антигенов
Тreponema pallidum и инфекционных агентов, не вызывающих сифилиса, но индуцирующих образование перекрестно реагирующих антител (Дмитриев, Брагина,
1996).
С помощью синтетических пептидов нами исследовано антителообразование к
одному из основных поверхностных антигенов Tr. pallidum – мембранному липопротеину Тр41. Выявлено наличие как минимум трех независимых антигенных
сайтов в молекуле Тр41. Иммунодоминантным явился N-концевой эпитоп, локализованный в пределах первых 50 аминокислот белка. Пептид, воспроизводящий
данный участок аминокислотной последовательности, позволял определять антитела у больных сифилисом с той же эффективностью, что и полноразмерный рекомбинантный белок, соответствующий Тр41. Однако в отличие от рекомбинантного белка, при тестировании сывороток лиц с ложно-положительными серологическими реакциями на сифилис пептид Тр41 ни в одном из 25 случаев не дал положительного результата. Это связано с отсутствием в его структуре эпитопов,
сходных с антигенными детерминантами, дающими перекрестные реакции, т. е.
иммуноферментная тест-система, основанная на применении такого пептида позволит проводить не только скрининговое диагностическое тестирование, но и
отсекать ложно-положительные реакции на сифилис.
Таким образом, применение синтетических пептидов наряду с генноинженерными белковыми продуктами позволяет проводить подробный анализ
антигенной специфичности белков возбудителей вирусных и бактериальных инфекций, а также механизмов антителообразования в ответ на внедрение в организм инфекционных агентов. Детальное молекулярно-биологическое исследование антителопродукции служит необходимой основой для последующего конструирования новых, более эффективных диагностических иммуноферментных
тест-систем, необходимых отечественному здравоохранению.
ЛИТЕРАТУРА
Афанасьев А. Ю. Индикация антител к вирусу гепатита С с разделением на классы IgM
и IgG и ее клиническое значение // Клин. лаб. диагностика. 1996. № 2. С. 43-44.
Дмитриев Г. А., Брагина Е. Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса // Вестник дерматологии. 1996. № 3. С. 33-38.
Пименов В. К., Зубов С. В., Колобов А. А. и др. Антигенные свойства синтетических
пептидов, воспроизводящих основные детерминанты структурных и неструктурных протеинов вируса гепатита С // Биотехнология. 1998. № 4. С. 34-38.
Соринсон С. Н. Вирусные гепатиты в клинической практике. СПб., 1996.
Ярилин А. А., Добротина Н. А. Введение в современную иммунологию. Н. Новгород,
1997.
Mondell M. e. a. Significance of the immune response to a major, conformational B-cell
epitope on the hepatitis C virus NS3 region defined by human monoclonal antibody // J. Virol.
1994. V. 68, № 8. P. 4829-4836.
147