Изменение ультраструктуры бактерий родов Pseudomonas и Klebsiella

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального
образования
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Академия экологии, морской биологии и биотехнологии
Кафедра биохимии,
микробиологии и
биотехнологии
Изменение ультраструктуры бактерий родов Pseudomonas и
Klebsiella под действием тяжелых
металлов
Сhanges of ultrastructure bacteria the Pseudomonas and Klebsiella under the
influence of heavy metals
Еськова Алёна Игоревна
1
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение .......................................................................................... ..4
2. Обзор литературы.............................................................................7
2.1. Влияние факторов среды на изменение ультраструктуры
микроорганизмов ................................................................................................... 7
2.2. Действие тяжелых металлов на микробные клетки ......................….9
2.3. Механизмы металл –резистентности………………………………...12
2.4. Генетическая природа устойчивости к металлам у
бактерий ................................................................................................................. 16
3. Материал и методика..................................................................... 19
4. Результаты и обсуждение……………………………..22
5. Выводы ............................................................................................. 45
Список литературы ............................................................................ 46
2
1. ВВЕДЕНИЕ
Проблема взаимодействия металлов с клетками микроорганизмов
представляет практический и теоретический интерес. В теоретическом
отношении интересно изучение влияния высоких концентраций металлов на
микробную клетку и использование их микроорганизмами в качестве
источников микроэлементов, энергии или акцепторов электронов (Эрлих, 1981
- цит. по: Сенцова и др., 1985). В практическом плане изучение способности
бактерий накапливать тяжелые металлы (ТМ) из внешней среды, позволит
использовать перспективные штаммы для ремедиации среды. Металлы в виде
тонко дисперсных частиц и в растворенном состоянии обычно содержатся в
неочищенных стоках промышленных предприятий. Многие из них токсичны и
стабильны в течение длительного времени. В последние годы в биотехнологии
начаты исследования, направленные на использование микроорганизмов в
качестве инструмента для удаления, или концентрирования тяжелых металлов
из промышленных стоков, а также природных водоемов и почв. В основе
такой технологии лежит способность клеток некоторых микроорганизмов
аккумулировать тяжелые металлы в больших количествах из внешней среды.
Для разработки эффективных методов биоаккумуляции металлов исследуются
механизмы этого процесса, ведется выделение активных в этом отношении
штаммов микроорганизмов (Horicon et al., 1981 - цит. по: Сенцова и др., 1985;
Бекасова и др., 1999).
Важна
также
оценка
вклада
микроорганизмов
в
трансформацию
соединений тяжелых металлов и детоксикацию природной среды (Тушинский,
Щинкар, 1982).
В загрязненных средах могут присутствовать бактерии, проявляющие
устойчивость одновременно и к тяжелым металлам, и к антибиотикам. Гены
резистентности к ТМ и антибиотикам в условиях селективного пресса среды
передаются другим штаммам в процессе конъюгации, что способствует
увеличению количества резистентных форм в сообществах (Кондратьева и др.,
2002). Доминирующие полирезистентные формы бактерий могут играть
3
важную экологическую роль, так как имеют преимущества для выживания в
условиях высокой токсичности среды. Однако, как отмечает А.В. Цыбань,
процессы
адаптации
сопровождаются
микроорганизмов
попутно
к
накоплением
химическому
штаммов,
загрязнению
патогенных
для
гидробионтов, человека и проявляющих множественную устойчивость к
антибиотикам. При этом, возможен переход бактерий из разряда сапрофитов в
условно-патогенные, а условно- патогенных - в разряд патогенных, что может
создавать
непрогнозируемые
напряженные
экологические
и
эпидемиологические ситуации. Поэтому чрезвычайно актуально изучение
аллохтонной микрофлоры, поступающей в морскую среду со стоками и
имеющей преимущества для выживания в токсичном окружении (Цыбань,
1990 - цит.по.: Израэль, Цыбань, 1992).
Помимо этого микроорганизмы в последнее время рассматриваются и
изучаются как основной источник синтеза нанокристаллов. Изучением
наночастиц занимается одна из перспективных и развивающихся областей
науки - бионанотехнология. Наночастицы представляют огромный интерес
для многих технологий будущего в связи с их малыми размерами и
необычными
оптическими,
химическими,
фотоэлектрохимическими
и
электронными свойствами. В качестве таких частиц могут выступать
различные соединения металлов, образующиеся и накапливающиеся в клетках
микроорганизмов (Mandal et al, 2005).
Микроорганизмы,
благодаря
физиологическим
и
генетическим
особенностям, быстро реагируют на изменение качества среды и действие
стрессовых факторов (Израэль, Цыбань, 1992). На уровне организмов
адаптация реализуется за счет включения одного или нескольких механизмов
индивидуальной
резистентности
(Forol,
2000).
Изучение
отклика
на
присутствие в среде тяжелых металлов позволяет получить информацию об их
токсическом эффекте, установить механизмы адаптации и резистентности
бактерий (Pradhan, 2001).
4
В
связи
с
физиологическими
стрессовых
факторов,
микробной
клетки.
могут
Поэтому
перестройками,
происходить
одним
из
при
изменения
действии
морфологии
возможных
способов,
подтверждающих изменчивость бактерий под действием различных условий
обитания, является ультраструктурное исследование.
В литературе большое внимание уделено изменениям, происходящим
на физиологическом и биохимическом уровнях. Однако для полной оценки
состояния бактерий необходимо рассматривать наблюдаемые изменения в
их жизнедеятельности с учетом морфологических исследований на уровне
ультраструктур. В то же время ультраструктурные аспекты адаптации
микробных клеток к действию экстремальных факторов среды, в частности
высоких концентраций токсикантов, изучены еще сравнительно мало
(Израэль, Цыбань, 1992).
Тяжелые металлы являются одними из наиболее часто встречающихся
поллютантов, загрязняющих окружающую среду. Поэтому целью данной
работы было изучение изменений ультраструктуры клеток происходящих под
действием тяжелых металлов, на примере родов Pseudomonas и Klebsiella ,
являющихся доминирующими в прибрежных водах и легко адаптирующихся к
изменениям среды. w.B соответствии с заданной целью были поставлены
следующие задачи: • Изучить ультраструктурные изменения бактериальных
клеток на различных стадиях роста культуры: на стадии адаптации к факторам
среды, на стадии интенсивного роста и при длительном культивировании.
•
На примере бактерий рода Pseudomonas провести сравнительный
анализ ультраструктурных изменений, происходящих в клетках различных
штаммов, относящихся к одной таксономической группе,
•
Дать сравнительную оценку ультраструктурных изменений
микробных клеток под действием ТМ, происходящих у представителей
разных родов, на примере бактерий родов Pseudomonas и Klebsiella
5
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Влияние факторов среды на изменение ультраструктуры
микроорганизмов
В основе адаптации микроорганизмов лежит их способность к высокой
изменчивости, заключающаяся в физиологических, морфологических и
ультраструктурных
перестройках
адекватных
новым
условиям
их
существования.
Изменчивость микроорганизмов по тому или иному признаку можно
наблюдать даже в пределах одной популяции. Известно существование двух
вариантов колоний Neisseria meningitides: оранжевые (высоковирулентные) и
серые (авирулентные), различающихся серологическими свойствами. Помимо
различий в токсичности и вирулентности, существуют различия и в
ультраструктурной организации клеток двух колоний. Так, менингококки,
дающие оранжевое свечение, обладают извилистой клеточной стенкой,
цитоплазмой с большим количеством рибосом и вакуолей. Напротив,
менингококки, образующие колонии с серым типом свечения, обладают
сглаженной и истонченной клеточной стенкой, разреженной цитоплазмой, не
имеющей вакуолей (Дмитриев, 1986).
Для большинства бактерий характерна вариация формы и размеров в
зависимости от фаз роста культуры. Так, в лаг фазе наблюдается гигантизм
клеток с увеличением биомассы за счет накопления в них ДНК, белка и РНК.
Часто наблюдается увеличение числа нитевидных форм (Беликов и др., 1981;
Сурков и др., 2000), а также выявляется максимальное количество мезосом
(Кац, 1969). Все это направлено на сохранение и умножение фонда популяции
в период адаптации культуры к среде.
Экспоненциальная
(логарифмическая)
фаза
роста
культуры
характеризуется постоянной максимальной скоростью деления бактериальных
6
клеток. В этот период микроорганизмы наиболее ранимы, и у некоторой их
части могут развиться патологические изменения.
Началом стационарной фазы считается период, когда количество клеток
в культуре перестает увеличиваться. В данной фазе наблюдается накопление
запасного вещества - поли-|3-оксибутирата (ПОБ), что является признаком
старения культуры. Считается, что ПОБ аккумулируется в клетках, когда
процессы синтеза белка и нуклеиновых кислот ограничены, для обеспечения
клетки энергией и углеродом (Курода, Отаке, 2000).
Все изменения, происходящие в клетке в процессе роста культуры,
могут быть связаны с изменением субстратов питания, поскольку в среде
происходит увеличение концентрации метаболитов и уменьшение содержания
необходимых элементов питания.
Окружающая среда оказывает большое влияние на бактериальную
клетку посредствам действия абиотических (перепад температуры, рН среды,
влажности) и биотических факторов. Одни из них действуют длительно,
другие оказывают кратковременное влияние.
Так, одним из наиболее значимых факторов для микробных клеток,
является температурный фактор. При высоких температурах происходит
ингибирование синтеза РНК и ДНК, нарушение клеточного деления,
приводящее к появлению нитчатых форм, накопление в клетках фосфатов. О
морфологии бактерий при низких температурах имеются недостаточные
сведения. У микроорганизмов в данном случае увеличивается потребность в
питательных веществах, они могут увеличиваться в размерах, что показано на
примере бактерий рода Bacillus, а также наблюдаются изменения мембранного
аппарата, в частности, увеличение впячиваний (Сузина, 1999). В клетках
Klebsiella aerogenes, выращенных при низких температурах, наблюдается
повышенное содержание полифосфатов (Курода, Отаке, 2000 - цит. по:
Бузолева, Кривошеева, 2001).
Другим важным фактором, воздействующим на микробные клетки,
является
действие
сухого
воздуха,
которое
может
привести
к
их
7
обезвоживанию. На примере дрожжей Sacharomyces cerevisiae показано, что
при обезвоживании происходит уменьшение объема клеток и их удлинение.
Отмечены
выпячивания,
углубления
и
разрывы
цитоплазматической
мембраны. Клетки в условиях осмотического стресса накапливают запасные
вещества - гликоген, полисперы (Рапопорт и др., 1988; Зикманис и др., 1988).
К существованию бактерий в ингибированном состоянии приводят
низкие и высокие значения рН среды. Особенностью клеточных культур в
этих условиях является повышение содержания запасных веществ. В дрожжах
накапливаются липиды, в бактериях - поли-(3-оксибутират, иногда гликоген; а
также
наблюдается
большое
содержание
гипертрофированных
клеток
(Позмогова, 1991).
Таким образом, при любых изменениях абиотических факторов, не
оптимальных для бактериальной культуры, в ней появляются гигантские или
удлиненные формы, в результате чего популяция становится гетерогенной. И
в
большинстве
Наибольшую
случаев
роль
из
происходит
запасающих
накопление
веществ
запасных
играют
веществ.
полифосфаты,
участвующие в реакциях бактерий на стрессы и неблагоприятные условия
(Позмогова, 1991; Бузолева, 2001).
Приведенные литературные данные дают представление лишь о тех
изменениях, которые происходят под действием естественных факторов
среды.
Большое
воздействие
на
микроорганизмы
оказывают
также
антропогенные факторы, в частности присутствующие в среде токсиканты,
одними из которых являются тяжелые металлы. В литературе больше
внимание
уделено влиянию тяжелых металлов на биохимические и
физиологические процессы, чем на ультраструктуру бактериальной клетки.
2.2. Действие тяжелых металлов на микробные клетки
Тяжелые металлы (ТМ) играют двойственную роль в процессах
жизнедеятельности микроорганизмов. Некоторые из них являются жизненно
8
необходимыми в «следовых» количествах. Mo, Fe, Си, Mn, Zn, Ni и Со
участвуют в каталитическом ускорении биохимических процессов. Они могут
служить кофакторами или входить в состав ферментов (Ehrlich, 1997; Nies,
1999). Ионы Zn2+ стабилизируют структуру ДНК и протеинов клеточной
стенки бактерий (Nies, 1999). Значительное количество эубактерий и
архебактерий способны использовать ионы некоторых металлов (Fe, Mn, Сг) и
металлоидов (As) в качестве доноров или акцепторов электронов в
энергетическом метаболизме (Ehrlich, 1997). Установлена способность
бактерий рода Pseudomonas использовать Cr (VI) как акцептор электронов при
дыхании (Дмитренко и др., 2003).
К металлам, не выполняющим никаких биологических функций,
относятся Cd, Pb, Sn, Hg и Ag (Bruins, Kapil, 2000).
При высоких концентрациях все ТМ — и те, которые относятся к
необходимым, и те, которые не имеют биологической значимости, за счет
способности к комплексообразованию являются токсичными по отношению к
микробам и другим организмам (Gadd, 1990). Токсичность проявляется в
изменении конформационных структур нуклеиновых кислот и протеинов,
нарушении процессов окислительного фосфорилирования и поддержания
осмотического баланса, а также способностью тяжелых металлов замещать
физиологически значимые ионы (Nies, 1999). Ионы Cd2+, Hg2+, Ag+ имеют
тенденцию соединяться внутри клетки с сульфгидрильными группами,
ингибируя активность чувствительных
многих
приводит
энзимов.
Тяжелые металлы
во
случаях нарушают функцию цитоплазматической мембраны, что
к
потере
клетками
ионов,
аминокислот,
нарушению
концентрационных градиентов (Abelson et al., 1950 - цит. по: Сенцова,
Максимов, 1985). На примере Nostoc muscorum, было показано, что
аккумуляция Cd2+ и мелкодисперсных взвесей ТЮ2 и А1203 сопровождается
минерализацией
9
оболочки. Токсичность Cd , в данном случае, проявлялась в постепенном
изменении морфологии клеток (укорочение трихом и уменьшение размеров
клеток),
ингибировании
гидрогеназ
и
деструкции
фотосинтетического
аппарата, проявляющейся в выцветании пигментов. В присутствии А1203 и
ТЮ2 возрастала проницаемость клеточной оболочки, что приводило к выходу
каратиноидов в культуральную среду (Бекасов и др., 1999).
При
исследовании
культивируемых
в
морфологии
присутствии
различных
сублетальных
микроорганизмов,
концентраций
тяжелых
металлов, отмечается увеличение размеров клеток. Это связано с подавлением
клеточного деления. Токсическое действие тяжелых металлов сопровождается
нарушениями в структуре поверхностных слоев клеток, цитоплазматической
мембраны и других органелл, а также появлением включений, природа
которых может быть различной. В клетках E.coli под действием соединения
cis-Pt(NH3)Cl2 наблюдается уменьшение количества рибосом и появление
большого числа электронноплотных участков (Fisher et al., 1981).
Результатом действия ионов серебра на клетки P. aeruginosa является
патологическое изменение в строении поверхностных слоев клеток и
внутренней организации. Отсутствует электронно-прозрачный слой между
наружной и цитоплазматической мембраной, последняя почти не выявляется
на электронных микрофотографиях, равно как не выявляется область
нуклеоида (Richards, 1981 - цит. по: Сенцова, Максимов, 1985).
В приведенных работах не исследовали распределение металлов в
клетках, поэтому нельзя судить о том, насколько характер ультраструктурных
изменений коррелирует с локализацией металлов в клетках. Описание в
литературе изменений в морфологии клеток указывает на то, что процесс
клеточного деления более чувствителен к действию тяжелых металлов, чем
процессы, связанные с увеличением массы клеток.
Чтобы вызвать физиологический или токсический эффект большинство
ТМ должно попасть внутрь микробной клетки. У микроорганизмов
10
существует два основных типа транспортных систем для ионов ТМ. Один —
быстрый, неспецифический, по градиенту концентрации. Второй тип
транспортных систем относится к высоко субстрат-специфичным. Это
медленный транспорт, часто требующий расходования АТФ (Нао, Reiske,
1999).
Очевидно, что существование систем быстрого транспорта ионов по
градиенту концентрации является важным фактором, способствующим
проявлению токсичности ТМ, так как при «токсилогически опасных»
концентрациях металлов «проход в клетку» остается открытым (Nies, 1999).
2.3. Механизмы металл-резистентности у бактерий
Так как ионы тяжелых металлов не могут подвергаться деградации или
существенной модификации, у микроорганизмов получили распространение
различные механизмы металл-резистентности: активное выведение (выброс)
металла из клетки, ограничение поступления металла за счет изменения
клеточной проницаемости, внутриклеточное и внеклеточное связывание
металла и его детоксикация, энзиматическая детоксикация металла в менее
токсичную форму (Алексеева и др., 1991).
Активный транспорт металлов из микробных клеток.
Микроорганизмы
используют
механизмы
активного
транспорта
для
выведения токсичных металлов из цитоплазмы. Обнаружено, что системы
активного выброса ионов могут быть как АТФ-независимыми, так и
использующими энергию АТФ. Все они являются высокоспецифичными для
катионов или анионов, которые экспортируются из клетки (Нао, Reiske, 1999).
Известно о существовании двух типов систем активного выведения ионов Cd2+
из бактериальной клетки. Ионы Cd2+ поступают в клетку через транспортную
систему для катионов магния и/или марганца (Нао, Reiske, 1999). У грамположительных бактерий система cad (система активного выведения Cd2+ из
клетки) использует протеины, относящиеся к Р-типу АТФ-аз, т. е. является
11
зависимой от использования энергии АТФ. Впервые эта система была описана
для Staphylococcus aureus. Позднее были найдены белки, относящиеся к Ртипу АТФ-аз и способные к активному транспорту из бактериальных клеток
ионов Cu2+, Pb2+, Zn2+ (Nies, 1999). У грам-отрицательных бактерий
существует другая транспортная система czc (кадмий/цинк/кобальт), которая
регулируется градиентом концентрации протонов Н+ через внутреннюю
мембрану и является АТФ-независимой.
Ограничение поступления металлов за счет изменения проницаемости
клеток.
В
условиях
повышенных
концентраций
ТМ
в
среде
у
микроорганизмов могут происходить структурные изменения в клеточной
стенке, оболочке, цитоплазматической мембране. Так, у псевдомонад
изменения в составе белков, вызванные действием ионов кадмия, затрагивают
главным образом внешнюю мембрану и периплазматическое пространство
оболочки
бактериальной
клетки
и
почти
не
наблюдаются
в
цитоплазматической мембране. Эти процессы не всегда являются результатом
токсического действия металлов. Они могут быть проявлением индуцируемых
защитных механизмов, обеспечивающих
токсичных
ограничение
поступления
ионов в цитоплазму клетки и воздействия на жизненно важные
клеточные компоненты (Алексеев и др., 1991).
Пример такого защитного механизма подробно описан для бактерий
Escherichia coli. Снижение поступления избыточных концентраций Си (II) в
клетку происходит за счет индуцированного нарушения синтеза белка порина,
участвующего в формировании мембранных транспортных каналов (Rouch et
al, 1995).
Известно
существование
явления
аккумулирования
Си
(II)
в
периплазматическом пространстве и в наружной клеточной мембране у
бактерий Pseudomonas syringae за счет связывания со специфическими
протеинами (Gadd, 1990).
12
Штамм P. putida характеризуются конформационными изменениями в
клеточной мембране, обусловленными экспрессией плазмидных генов. В
результате ограничивается поступление в клетку ионов Со
(Иванов,
Гаврюшкин, 1999).
Значительное преимущество для выживания в средах, содержащих
металлы, получают бактериальные штаммы, характеризующиеся наличием
полисахаридной
капсулы
и
(Иванова
др.,
1994).
Многие
бактерии
продуцируют большое количество внеклеточных полисахаридов, которые
обладают
анионными
свойствами
и,
таким
образом,
действуют
как
биосорбенты для катионов металлов. Установлено, что внеклеточный матрикс
является эффективным внешним барьером и предотвращает или существенно
ограничивает поступление ионов металлов в клетку (Gadd, 1990). При
сравнении степени Cd - и Си - устойчивости капсулированных и
некапсулированных
штаммов
Klebsiella
обнаружено,
aerogenes
что
выживаемость капсулированных форм бактерий в присутствии металлов была
на
несколько
порядков
выше
по
сравнению
с
выживаемостью
некапсулированных форм (Bitton, Freihofer, 1978). Предположительно,
высокая устойчивость к Cd у бактериальных штаммов, выделенных из
Дальневосточных морей, обусловлена наличием среди них большого числа
капсулированных форм (Иванова и др., 1994).
Внутриклеточное и внеклеточное связывание токсичных металлов и их
детоксикация. Аккумулирование металла в цитоплазме и его детоксикация
может происходить за счет связывания токсичных ионов со специфическими
протеинами, синтезируемыми клеткой. С помощью такого механизма могут
быть детоксицированы катионы Cd2+, Си и Zn . Связывающей способностью
по отношению к ионам ТМ обладают специфические внутриклеточные белки металлотионеины (Bruins, Kapil, 2000). Было установлено, что бактерии
Pseudomonas putida, изолированные из сточных вод, могли синтезировать три
низкомолекулярных белка, богатых цистеином, возможно родственные
13
металлотионеинам. Однако дальнейших экспериментальных подтверждений
этот факт не получил (Bruins, Kapil, 2000).
Ионы металлов, поступившие в цитоплазму бактериальной клетки,
могут быть связаны неорганическими анионами. Это также ведет к
детоксикации металла, поскольку образовавшиеся соединения являются
малорастворимыми. У бактерий рода Citrobacter показано внутриклеточное
аккумулирование Cd в форме фосфата и РЬ в форме гидрофосфата (Ford,
1992). Способность к внутриклеточному накоплению фосфата РЬ (П) в виде
гранул проявлял штамм Pseudomonas aeruginosa CHL-004, вьщеленный из
почвы, загрязненной свинцом.
Для
Mycobacterium
scrofulaceum
обнаружена
способность
к
внутриклеточной аккумуляции Си (II) в форме сульфида (Bruins, Kapil, 2000).
Внеклеточная изоляция токсичных металлов обеспечиваемся за счет
связывания их в малорастворимые соединения с продуктами метаболизма,
поступившими во внешнюю среду (Ehrlich, 1997).
Многие органические метаболиты бактерий играют важную роль в
обеспечении детоксикации ТМ, за счет способности связывать ионы металлов
в прочные комплексы (Ford, 1992). При токсичных концентрациях свободных
ионов Си2+ в среде цианобактерии продуцируют внеклеточные хелатирующие
лиганды, которые соединяются в прочные комплексы с ионами Си2+, снижая
их биодоступность (Moffett, Brand, 1996).
Микроорганизмы способны выделять в среду в качестве продуктов
метаболизма неорганические анионы (сульфид- , карбонат- или фосфат-ионы),
которые связывают катионы ТМ в малорастворимые соединения (Ford, 1992;
Gadd,
1990).
Например,
результаты
электронно-микроскопического
исследования показывают, что металл-резистентные штаммы Klebsiella
aerogenes способны осаждать Pb, Hg, или Cd в форме сульфидных гранул на
внешней поверхности клеток (Gadd, 1990). Способ
2+
14
аккумуляции ионов кадмия путем вовлечения Cd в биосинтез сульфида
кадмия на поверхности клеток известен для цианобактерии (Бекасова и др.,
1999).
Процесс осаждения металлов, как механизм
металл-резистентности,
является эффективным только в том случае, когда результирующая
концентрация растворенного металла в среде становится ниже минимального
ингибирующего уровня для бактерий (Ehrlich, 1997).
Энзиматическая детоксикация металлов в менее токсичную форму.
Устойчивость к металлам может быть связана с детоксифицирующими
ферментами. У Pseudomonas aeruginosa она обеспечивается повышением
концентрации Hg2+ - зависимой НАДФН-оксидоредуктазы. Происходит
восстановление Hg (II) до Hg (0), которая затем диффундирует через
клеточную мембрану наружу. Подобное явление наблюдается как у грамположительных
{Staphylococcus
aureus,
Bacillus
sp.)
так
и
у
грам-
отрицательных бактерий (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia
marcescens, Thiobacillus ferrooxidans) (Gadd, 1990; Bruins, Kapil, 2000).
Выживаемость Sacharomyces cerevisiae в присутствии меди коррелирует с
содержанием
супероксиддисмутазы,
которая
разрушает
перекиси,
образующиеся в результате взаимодействия меди с компонентом клетки
(Сенцова, Максимов, 1985).
Обнаружено,
что
бактерии
Pseudomonas
fluorescens
LB300
и
Enterobacter cloacae способны восстанавливать соединения Cr (VI) до менее
токсичных соединений Сг (III) (Ehrlich, 1997).
2.4. Генетическая природа устойчивости к металлам у бактерий
Установлено, что устойчивость бактерий к ТМ кодируется генами, чаще
всего локализованными в плазмидах, реже - в транспозонах и иногда - в
хромосомах. В больпгинстве случаев, плазмид-опосредованные системы
15
металл-устойчивости очень специфичны, и они найдены фактически у всех
групп изученных эубактерий (Cervantes, Silver, 1996).
Детально изучена и описана у бактерий структура и экспрессия
генетических
детерминант,
обеспечивающих
устойчивость
к
ртути.
Acinetobacter sp., Serratia marcescens, Pseudomonasputrefaciens, P. stutzeri,
Shigella sp. проявляли Hg-резистентность, обусловленную присутствием
различных плазмид. Бактерии Pseudomonas aeruginosa характеризовались
механизмом устойчивости, связанным с присутствием транспозона Тп 501 ~ у
Thiobacillus ferrooxidans и Bacillus sp. гены Hg-резистентности выявлены в
хромосомах (Cervantes, Silver, 1996).
Определены, и в некоторых случаях секвенированы, генетические
детерминанты
Cd-резистентности,
локализованные
в
плазмидах,
у
Staphylococcus aureus, Alcaligenes eutrophus (Diels et al., 1995) и Pseudomonas
putida (Cervantes, Silver, 1996).
Изучены механизмы устойчивости к повышенным концентрациям Си,
обусловленные присутствием плазмид у Pseudomonas syringae, Escherichia
coli,
Xanthomonas
campestris,
Pseudomonas
pickettii
US321.
Медь-
резистентность, связанная с экспрессией хромосомных генов, выявлена у
бактерий Thiobacilrus ferrooxidans. Установлено, что гены, обеспечивающие у
бактерий нормальный метаболизм меди, как микроэлемента, расположены в
хромосомах (Cervantes, Silver, 1996).
Выделены бактериальные плазмиды, несущие гены устойчивости к Сг
(VI), Со, Ni, Zn, As (III), As (V), Те, Ag и Pb (Cervantes, Silver, 1996; Diels et al.,
1995).
Установлено,
что
экспрессия
хромосомных
генов
определяет
устойчивость к чрезвычайно высоким концентрациям нитрата РЬ (II) у
штамма Pseudomonas sp,. а также резистентность к ионам Ag+ у Enterococcus
hirae и устойчивость к арсениту и арсенату у Thiobacillus ferrooxidans (Butcher,
1995).
Для
Acidithiobacillus ferrooxidans
2+
3+
показаны
изменения
в
2+
16
плазмидных профилях при адаптации к Zn , Fe и Си , выражающиеся в
изменении размеров плазмид или полном их исчезновении (Кондратьева и др.,
2002). Отмечена также амплификация одного из фрагментов хромосомной
ДНК, и появление наследуемых изменений в ее структуре (Kondratyeva et al.,
1995, 1999 - цит. по: Кондратьева, 2002).
Механизмы металл-устойчивости, связанные с наличием плазмид, более
мобильные, это системы быстрого отклика, например, выброса токсичных
катионов из клетки (Bruins, Kapil, 2000).
Металл-резистентность у бактерий часто связана с антибиотикорезистентностью (Сенцова, Максимов, 1985 - цит. по: Алексеев и др. 1991).
Штаммы бактерий, относящиеся к роду Klebsiella, проявляющие устойчивость
к Cd и Zn, резистентны к таким антибиотикам как гентамицин, стрептомицин,
хлорамфеникол, налидиксовая кислота. Плазмида R773, обеспечивающая
устойчивость Escherichia coli к As (III) и As (V), обуславливает резистентность
к
стрептомицину
и
тетрациклину
(Trevors,
1997).
Обнаружена
полирезистентность к тяжелым металлам, антибиотикам и ароматическим
углеводородам у бактерий, изолированных из сточных вод и относящихся к
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,
Proteus mirabilis, Staphylococcus sp. (Filali, 2000).
Было показано, что среды, загрязненные тяжелыми металлами,
содержат более высокий процент антибиотико-резистентных штаммов по
сравнению с незагрязненными средами (Alonso et al, 2001)
Устойчивость, как к ТМ, так и к антибиотикам, может передаваться от
одних микроорганизмов к другим за счет конъюгации или трансдукции
(Bruins, Kapil, 2000). Горизонтальный транспорт кодируемых плазмидами
генов может быть основной причиной распространения
резистентности
в
среде
и
проявлением
адаптивных
детерминант
возможностей
бактериальных популяций.
17
3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В качестве модельных объектов исследования были использованы три
штамма грамотрицательных бактерий: Pseudomonas putida 448, Pseudomonas
fluorescens 331 и Klebsiella pneumoniae 332. Штаммы были выделены из воды
бухты Золотой Рог, относились к доминирующим таксономическим группам и
специально не адаптировались к высоким концентрациям тяжелых металлов
(Димитриева, Безвербная 2002). Культуры штаммов хранились в полужидкой
питательной среде YK (Youchimizu, Kimura, 1976) под минеральном маслом
при температуре +4 °С.
Были
проанализированы
спектр
и
уровни
металлоустойчивости
штаммов. Минимальные ингибирующие концентрации определялись путем
посева штаммов в пробирки с жидкой средой YK с добавлением
возрастающих концентраций хлоридов Cd, Си, Со, Ni, Zn и нитрата РЬ.
Концентрации безводных солей металлов в среде изменялись в следующих
диапазонах: CdCl2 (10-200 мг/л), ZnCl2 (100 - 500мг/л), МС1(100 - 1500 мг/л),
СиС12 (100-500 мг/л), СоС12 (100-400 мг/л), PbN03 (80 - 1800). Для анализа
ультраструктурных изменений в клетках бактерий были подобраны такие
концентрации солей металлов в среде, которые не вызывают видимых
изменений в интенсивности роста и максимально близки к минимальным
ингибирующим концентрациям Си (300 мг/л), Со (200 мг/л), Ni (500 мг/л), Cd
(60 мг/л), Zn (200 мг/л), РЬ (1000 мг/л).
Кинетику роста штаммов оценивали в присутствии тяжелых металлов
на основе определения оптической плотности культур через определенные
промежутки времени при длине волны 600 нм. Измерения проводили с
использованием фотометра КФК-3-01. На основе полученных данных строили
графики кривых роста культур.
стадиях роста культуры в течение 48 часов. Для этого проводили анализ 5 мл
порции инокулята в начале лаг-фазы, конце экспоненциальной фазы роста
культуры и при длительном культивировании (3 месяца). Для осаждения
18
биомассы проводили центрифугирование в режиме 5000 об/мин в течение 20
мин.
Концентрацию металла определяли атомно-абсорбционным методом с
использованием спектрофотометра (модель АА-6601 F, пламенный вариант).
Для минерализации образцов использовали концентрированную HN03.
Концентрацию металла в сырой биомассе бактерий, определяли тем же
методом.
Отбор образцов биомассы штаммов для электронной микроскопии
проводился :
1. в лаг-фазе (по прошествии 1 ч.) для бактерий Pseudomonas putida 448
и Klebsiella pneumoniae 332, выращенных на средах с Cd и Си;
2. в конце логарифмической фазы кривой роста (через 42 ч после
начала культивирования) для всех штаммов бактерий;
3. при
длительном
культивировании
(через
три
месяца)
для
Pseudomonas putida 448, выращенной на Cd и Си .
Микробный осадок получали осаждением бактериальной массы путем
центрифугирования жидкой среды в режиме 5000 об./мин. в течение 20 мин.
Осадок промывали физраствором для освобождения его от остатков
питательной среды.
Затем
бактериальные
суспензии
фиксировали
фиксатором
Ито,
приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,3) в течение 1 часа, проводили
постфиксацию в 1% растворе OSO4 и дегидратировали в этаноле возрастающей
концентрации.
Приготовленные образцы, заливали в смолы SPURR - embedding
(SIGMA).
Из залитых в смолы бактериальных образцов были изготовлены
серийные срезы на ультрамикротоме «УЛЬТРАКАТ Е». Срезы толщиной
около 80 нм помещались на медные сетки, покрытые формваровой пленкой.
19
Ультратонкие срезы на сетках контрастировали водным раствором
уранилацетата и цитратом свинца (Миронов и др., 1994).
Готовые препараты были просмотрены в трансмиссионный микроскоп
JEM-100В Института биологии моря ДВО РАН. Препараты снимали на
фотопленку. Полученные негативы сканировали с помощью сканера hp Scanjet
7400с
кафедры
клеточной
биологии,
после
чего
результаты
были
проанализированы в сравнении с литературными данными.
20
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для штаммов грамотрицательных бактерий (Pseudomonas putida 448,
Pseudomonas fluorescens 331 и Klebsiella pneumoniae 332) опытным путем были
подобранны максимально не ингибирующие концентрации (Дмитриева,
Безвербная, 2002) тяжелых металлов: Си (300 мг/л), Со (200 мг/л), Ni (500
мг/л), Cd (60 мг/л), Zn (200 мг/л).
Электронно-микроскопическое
изменение
ультраструктуры
исследование
бактериальных
показало
клеток
этих
резкое
штаммов,
выращенных на средах, содержащих металлы, по сравнению с клетками
культур, выращенных на питательных средах, не содержащих металлы и
адаптированных для культивирования морских бактерий. При этом разные
металлы не всегда вызывают одинаковые ультраструктурные изменения у
одного и того же штамма, что свидетельствует о различных механизмах
резистентности микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов.
Ультратонкое строение клеток Pseudomonas putida 448,
выращенных на средах содержащих Си, Pb, Со, Cd
Изучение ультратонких срезов штамма P. putida 448, культивируемого
на селективной среде с Си, в сравнении с клетками, выращенными на среде не
содержащей соли металлов (рис. 1), позволило выявить изменения в строении
клеток уже на ранних этапах роста культуры - в лаг-фазе (1ч после начала
культивирования)
(рис.
2).
В
цитоплазме
клеток
наблюдались
немногочисленные осмиофильные округлые включения (рис. 3). Количество
этих включений увеличивается в клетках бактерий через 42 ч после начала
культивирования (к концу экспоненциальной - начало стационарной фазы
роста культуры) (рис. 2). Они располагались на периферии клетки в виде
ожерелья (рис. 4а) или были в небольших количествах разбросаны в
цитоплазме (рис. 46). Основываясь на литературных данных, можно
предположить, что эти включения являются полифосфатами или сульфидами
(Курода, Отаке, 2000; Несмиянов, 2000; Вагабов и др., 2000).
21
Рис. 1. Тонкое строение клеток Pseudomonas putida, выращенных на
питательной среде. Увел. 30000. пп - периплазматическое пространство,
кс - клеточная стенка, нм -наружная мембрана, мк - микрокапсула.
Рис. 2. Кинетика роста куьтуры Pseudomonas putida 448 на Cu-содержащей
среде.
22
Рис. 3. Тонкое строение клеток Pseudomonas putida 448 в лаг-фазе,
выращенных на Cu-содержащей среде. Увел. 30000. вк -осмиофильные
включения.
Рис. 4. Тонкое строение клеток Pseudomonas putida 448 в
экспоненциальной фазе, выращенных на Cu-содержащей среде,, а клетка с включениями, располагающимися по периферии. Увел. 50000; б клетка с включениями, разбросанными в цитоплазме. Увел.30000. вк включения, мк - микрокапсула.
23
Наряду с этим в клетках начала стационарной фазы наблюдалось
большое количество вакуолеподобных структур - электронно-прозрачных зон
округлой формы (рис. 5), что не отмечалось в клетках лаг-фазы.
Рис. 5. Тонкое строение клеток Pseudomonas putida 448, содержащие
вакуолеподобные структуры. Увел. 20000. вк - включения, в вакуолеподобная структура, мк - микрокапсула.
Большое
количество
клеток
с
вакуолеподобными
структурами
характерно и для бактерий этого штамма в конце экспоненциальной -начале
стационарной фазы роста, культивируемых на Cd-содержащей среде (рис. 6).
Здесь обнаружено также утолщение ригидного слоя клеточной стенки (Кац,
1971) (рис. 7). Известно, что у P. putida конформационные изменения в
клеточной стенке обусловлены экспрессией плазмидных генов, отвечающих за
резистентность к Cd (Иванов, Гаврюшкин, 1999).
Образование
немногочисленных
электронно-прозрачных
зон
и
небольшое утолщение ригидного слоя в клетках наблюдается уже на ранних
стадиях культивирования - в лаг-фазе (рис. 8а). Нужно отметить, что в
24
цитоплазме этих же клеток наблюдались одиночные или немногочисленные
осмиофильные
включения,
которые
не
обнаруживались
в
клетках
стационарной фазы. В некоторых клетках эти включения окружены
электронно-светлой
зоной
(рис.
86),
или
же
находятся
рядом
с
вакуолеподобными образованиями (рис. 8в).
Рис. 6. Кинетика роста культуры Pseudomonas putida 448 на Cd-содержащей
Рис.
7.Тонкое
строение
клеток
Pseudomonas
putida
448
в
конце
экспоненциальной фазы, выращенных на Cd-содержащей среде. Увел.
50000.
в- вакуолеподобные структуры, кс - клеточная стенка с расширенным
ригидным слоем.
среде.
25
Рис. 8.Тонкое строение клеток Pseudomonas putida 448 в лаг-фазе,
выращенных на Cd-содержащей среде, а) Увел. 40000; б) включение в
клетке, окруженное электронно-сгетлой зоной. Увел.40000; в) клетка с
осмиофильными включениями около вакуолеподобной структуры. Увел.
50000. нм - наружная мембрана, эс -электронно-светлая зона, в вакуолеподобная структура, вк -включения, пп - периплазматическое
пространство.
26
При анализе тонкого строения бактериальных клеток из 3-месячной
культуры, отмечается большое количество клеток с резко выраженными
деструктивными изменениями: разрывы в цитоплазматической мембране,
клеточной стенке, лизис цитоплазмы и нуклеоида (рис. 9а). Лишь небольшая
часть бактерий была представлена морфологически целыми клетками без
видимых изменений на ультраструктурном уровне. В этих немногочисленных
клетках не было выявлено выше приведенных изменений, характерных для
клеток 1-часовой и 42-часовой культур (рис. 96).
Рис. 9. Тонкое строение клеток Pseudomonas putida 448 после
культивирования на Cd-содержащей среде в течение 3 месяцев, а)
клетки с деструктивными изменениями. Увел. 25000; б)
морфологически целые клетки. Увел. 30000. кс - клеточная стенка, н нуклеоид.
27
Это, по-видимому, связано с тем, что большее количество ионов
металлов находится уже в связанном состоянии и концентрация его в среде за
3 месяца значительно снизилась: с 37,655 мкг/мл до 22 мкг/мл, тогда как
содержание металла в осадке увеличилось - о чем говорят данные атомноабсорбционного анализа (табл. 1).
Таблица 1
Концентрация металлов в биомассе бактерий, отобранной на разных
стадиях роста культуры Pseudomonas putida 448 ( мкг/г сырой
биомассы):
Конц. через 1ч
Си
1606.67±14.5
Cd
450.8230±3.27
Конц. через 42ч
1170.0Ш.26
366.93±13.01
Конц. через Змее.
772.60±20.30
671.76*2.51
При культивировании этого штамма в присутствии Со, к концу
экспоненциальной фазы, появляется мощная капсула (рис. 10а, б), которая не
выявляется у клеток культивируемых на среде с Си и Cd.
Колонии P. putida 448, культивируемые на селективной Со-содержащей
среде, характеризуются изменением цвета. Они приобретают розоватый
оттенок,
соответствующий
ультраструктурном
уровне,
цвету
по
некоторых
сравнению
с
солей
кобальта.
контролем,
На
происходит
увеличение контрастности клеток, стационарной фазы роста, в результате
возможного связывания ионов металла с полифосфатами или с другими
органическими соединениями (рис. Па). В клеточной стенке хорошо выражено
периплазматическое пространство, имеются также более контрастные участки
в наружной мембране (рис. Па). Контрастность, в данном случае, можно
объяснить связыванием металла фосфатными или карбоксильными группами
мембраны. Подобный механизм резистентности известен для многих бактерий,
в том числе и для другого представителя этого рода P. syringae (Webb, 1970;
Gadd, 1990).
28
В клетках, культивируемых на среде с Со, появляются «вакуоли», но в
меньших количествах (рис. 116) по сравнению с клетками, культивируемыми
Рис.11.Тонкое строение клеток Pseudomonas putida 448 в конце
экспоненциальной фазы, выращенных на Co-содержащей среде, а) Увел.
50000; б) Увел. 30000. вк - включения, в - вакуолеподобная структура, к капсула, нм -
наружная мембрана, пп -периплазматическое
пространство, цм - цитоплазматическая мембрана.
на среде с медью.
29
При культивировании P. putida 448 на селективной РЬ-содержащей
среде, не отмечено каких-либо, приведенных выше, видимых изменений в
ультраструктуре клеток (рис. 12). У клеток данной культуры четко выявлялся
нуклеоид с тонкими нитями ДНК, а также обнаружен большой процент сильно
удлиненных клеток в поле зрения микроскопа. Это изменение морфологии
может быть связано с преимущественным подавлением клеточного деления,
что также, как известно из литературных данных, наблюдается при действии
большинства ТМ и на другие виды бактерий (Perguson et al., 1979 - цит по:
Рис.12. Тонкое строение клеток Pseudomonas putida 448, выращенных на
РЬ - содержащей среде, а - Увел. 25000; б - Длинная палочковидная
клетка. Увел.20000. ц цитоплазма, н - нуклеоид, кс - клеточная стенка.
30
Сенцова, Максимов, 1985).
Следует отметить, что при воздействии Со, Cd и Си, наблюдаемые
электронно-прозрачные зоны, характерны для бактерий, запасающих поли-(3оксимасляную кислоту (ПОМК), которая присутствует у всех представителей
рода Pseudomonas и окружена однослойной белковой мембраной (Шлегель,
1987).
Считается,
что
ПОМК
служит
регулятором
окислительно-
восстановительных процессов в клетках и может выполнять функцию
электронного стока, то есть избыток восстановителей может быть накоплен в
осмотически и химически нейтральном соединении (Кулаев, 1996).
Другим запасным веществом, способным связывать ТМ, являются
полифосфаты (ПФ) и сульфиды (Pramod et al., 2000). Показано, что ПФ могут
31
принимать
участие
в
поддержании
тонкой
структурной
организации
клеточной стенки и мембраны, а также в транспорте ионов металлов в клетку
(Вагабов и др., 1998). В связи с тем, чтс ПФ присутствуют в клетках в виде
солей тех или иных ионов металлов, их можно рассматривать как резервы этих
ионов, регулирующие уровень тех или иных катионов в клетке (Кулаев, 1996).
Полученные
методом
атомно-абсорбционного
анализа
данные
о
концентрации металлов в бактериальной биомассе свидетельствуют о высокой
аккумулирующей способности штамма P. putida 448 по отношению к Си и Cd
(табл. 1). Таким образом, можно предположить, что при действии на P. putida
ионов Си и Cd, резистентность, главным образом, проявляется в связывании
тяжелых металлов с ПФ, сульфидами и ПОМК.
Необходимо также отметить, что осмиофильные включения у клеток,
выращенных на Cd-содержащей среде наблюдались лишь в лаг-фазе (в начале
стационарной - они отсутствуют), подобные включения встречаются и в
клетках лаг-фазы, выращенных на Cu-содержащей среде. Это может
свидетельствовать о включении общих механизмов резистентности для этих
металлов на ранних стадиях культивирования -на стадии адаптации к среде. В
экспоненциальной фазе наблюдаются различия в клетках, что говорит об
активации разных механизмов адаптации.
У клеток, выращенных на среде с Со, помимо связывающих гранул,
появляется мощная капсула. Известно, что значительное преимущество для
выживания в средах, содержащих металлы, получают бактериальные штаммы,
характеризующиеся
полисахаридной
капсулой (Иванова
и др., 1994).
Капсульные полисахариды обладают анионными свойствами и действуют как
биосорбенты для катионов металлов (Иванова и др., 1994).
Ультратонкое строение клеток Pseudomonas fluorescens 331,
выращенных на средах, содержащих Си и Cd
32
Сравнительный
различную
реакцию
анализ
у
электронных
представителей
фотографий
одного
рода
также
выявил
Pseudomonas
на
присутствие в среде одних и тех же металлов.
Так, изучение ультратонких срезов клеток штамма P. fluorescens 331,
культивируемых на среде, содержащей Си (рис. 14), показало наличие у них
хорошо развитой капсулы, отсутствующей у P. putida 448 культивированной
на среде с Си. У клеток P. fluorescens 331 контрольной культуры видны лишь
следы микрокапсулы (рис. 13). Также как и у Р. putida 448, культивируемой на
Co-содержащей среде, клетки отличаются большой контрастностью и хорошо
выраженным периплазматическим пространством. У некоторых клеток
имеются электронно-светлые участки, по-видимому, места локализации
запасных веществ, разрушившихся в результате обработки материала (рис.
14а). В клетках также имеется большое количество гранул и электронноплотных включений в цитоплазме (рис. 146). У некоторых клеток они
пронизывают клеточную стенку (рис. 146). Здесь также возможно связывание
металлов с полифосфатами, или со специфическими внутриклеточными
белками-металлотианинами,
или
же
нахождение
катионов
в
составе
сульфидных гранул (Baxter, Jensen, 1980 - цит. по Сенцова, Максимов, 1985;
Bruins, Kapil, 2000).
РисЛЗ.Тонкое строение клток Pseudomonasfluorescens 331, выращенных
33
на питательной среде не содержащей металлы. Увел. 50000. пп периплазматическое пространство, кс - клеточная стенка, н -нуклеоид, р рибосомы.
Cd
вызывает
у
P.
fluorescens
331
такие
же
изменения
на
ультраструктурном уровне как у P. putida 448 (рис. 15). В частности
происходит увеличение ригидного слоя клеточной стенки (рис. 15а). Известно,
что у псевдомонад действие ионов кадмия вызывает изменение состава белков
внешней
мембраны
и
периплазматического
пространства
оболочки
бактериальной клетки, и не наблюдается в цитоплазме (Алексеев и др., 1991).
Присутствие большого количества вакуолеподобных структур было
характерно для некапсулированных клеток P. Putida 448, выращенных на
среде с Си и Cd и P. Fluorescens 331, культивируемых на среде с Cd. В то же
время у капсулированных форм этих двух штаммов наблюдалось больше
гранул ПФ, чем в клетках, не имеющих капсулы.
34
Рис.14. Тонкое строение клеток Pseudomonas fluorescens 331,
выращенных на Си - содержащей среде, а - клетки с электроннопрозрачными зонами.Увел.40000; б - клетки с электронно-плотными
конгламератами, пронизывающими клеточную стенку. Увел. 40000. к капсула, квк - включения клеточной стенки, эвк - электронно-плотные
включения, эпз - электронно-прозрачная зона.
35
Рис. 15.Тонкое строение клеток Pseudomonas fluorescens 331.
выращенных на Cd - содержащей среде, а - Увел. 50000; б - Увел. 40000. кс клеточная стенка, в - вакуоль, н -нуклеоид.
Ультратонкое строение клеток Klebsiella pneumoniae 332,
выращенных на средах, содержащих Си, Pb, Ni и Cd
Иная реакция на присутствие в среде тех же металлов, наблюдается у
штамма другого рода грам-отрицательных бактерий Klebsiella pneumoniae 332.
Электронно-микроскопический анализ показал, что на поверхности
большинства
клеток
этих
микроорганизмов,
культивируемых
на
Cu-
содержащей среде в начале стационарной фазы (рис. 17), в сравнении с
36
контролем (рис. 16), имеются округлые, по-видимому, полифосфатные или
сульфидные гранулы (рис. 18а). Способность осаждать Pb, Hg или Cd в форме
сульфидных гранул на поверхности клеток, была описана Гаддом (Gadd, 1990)
для металл-резистентных штаммов К. aerogenes. Выявленные крупные
неоформленные конгломераты могут образовываться за счет связывания с
неорганическими анионами (Bruins, Kapil, 2000; Ford, 1992).
У большинства клеток обнаружены электронно-прозрачные зоны, не
Рис.16. Тонкое строение клеток Klebsiella pneumoniae 332, выращенных
на питательной среде не содержащей металлы. Увел. 50000. ц цитоплазма, кс - клеточная стенка.
имеющие резких границ (рис. 186).
37
Рис. 17. Кинетики роста культуры Klebsiella pneumoniae 332 на селективной
Cu-содержащей среде.
Рис. 18.Тонкое строение клеток Klebsiella pneumoniae 332 в конце
экспоненциальной фазы, выращенных на Cu-содержащей среде, а Увел. 40000; б - Увел. 30000. эвк - электронно-плотные конгломераты, эпз электронно-прозрачная зона, г - гранулы на поверхности клетки.
38
Ультратонкое строение этих же бактерий в лаг-фазе кардинально не
отличается от строения клеток контрольной культуры, лишь у немногих
клеток в цитоплазме обнаруживались очень мелкие одиночные электронноплотные вкрапления (рис. 19).
Рис.19.Тонкое строение клеток Klebsiella pneumoniae 332 в лаг-фазе,
выращенных на Cu-содержащей среде, а) Увел. 40000; б) Увел. 30000. к капсула, н - нуклеоид, пп -периплазматическое пространство.
Электронно-прозрачные зоны у этого штамма также наблюдались при
культивировании на селективных средах, содержащих Ni и РЬ.
У клеток, выращенных на среде с Ni, была более выражена капсула и
отмечено небольшое количество электронно-плотных агрегатов (рис. 20).
39
Рис.20.Тонкое строение клеток Klebsiella pneumoniae 332, выращенных
н а № - содержащей среде.Увел. 30000. эвк - электронно-плотные
включения, эпз - электронно-прозрачная зона, к - капсула.
У бактерий, культивируемых в присутствии РЬ, наблюдались крупные
электронно-прозрачные зоны в центре клетки, в результате чего происходило
смещение цитоплазмы к клеточной стенке (рис. 21а). Обнаруживаемые
электронно-плотные конгломераты были немногочисленны и имели меньшие
размеры, в сравнении с клетками культуры, выращенной на Cu-содержащей
среде (рис. 216).
Следует отметить, что у клеток Klebsiella, выращенных на средах с Pb,
Ni,
Си,
цитоплазма
отличалась
высокой
электронной
плотностью
и
вакуолизированностью. Подобный эффект был описан при действии Ni на
морскую бактерию Arthrobacter marinus (Cobet et al, 1970 - цит. по:
Сенцова, Максимов, 1985). В ее клетках образовались огромные вакуоли, и
протоплазма отходила к стенкам. Авторы предполагают, что внутриклеточное
пространство заполняют некие высокомолекулярные соединения.
40
Рис.21.Тонкое строение клеток Klebsiellapneumonie 332, выращенных на
РЬ - содержащей среде, а - Увел. 20000; б - Увел. 40000. кс - клеточная
стенка, ц - цитоплазма, в - вакуолеподобная структура, эк - электронноплотные
конгломераты.
При действии на культуру К pneumoniae 332 Си, Ni и РЬ реализуются одни и
те же механизмы резистентности, заключающиеся в
связывании ТМ внутри клетки, образовании капсулы и появлении электроннопрозрачных зон, в которых, вероятно, содержатся высокомолекулярные
соединения. Причем электронно-плотных конгломератов отмечалось меньше в
тех клетках, где размеры и количество этих зон больше.
41
При действии на клетки К. pneumoniae 332 ионов Cd не выявлялось
каких-либо резких изменений в цитоплазме, приведенных выше, но
наблюдалось
расширение
ригидного
слоя
клеточной
стенки,
которая
приобретала неровную поверхность (рис. 22).
Рис.22.Тонкое строение клеток Klebsiellapneumonie 332, выращенных на
Cd - содержащей среде. Увел.50000. пп - периплазматическое
пространство, кс - клеточная стенка.
Методом
атомно-абсорбционного
анализа
получены
данные
об
адсорбирующей активности клеток К. pneumoniae 332, проявляющейся в
большей степени по отношению к ионам Си, чем к ионам Cd (Табл. 2).
Электронно-микроскопическое строение клеток свидетельствует о включении
разных механизмов резистентности
этого штамма в присутствии ионов этих
металлов в среде. Так, на ультратонких срезах клеток, культивированных на
Cu-содержащей среде, хорошо выявляются электронно-плотные конгломераты
- места вероятной аккумуляции ионов металла, отсутствующие в клетках,
выращенных в присутствии Cd.
42
Таблица 2
Концентрация металлов в биомассе бактерий, отобранной на разных
стадиях роста культуры Klebsiella pneumoniae 332 ( мкг/ г сырой
биомассы):
Си
Cd
Таким
Конц. через 1ч
209.33±5.39
34.74±2.47
образом,
граммотрицательных
Конц. через 42ч
1358.28±433.35
248.191±2.98
при
культивировании
бактерий:
Pseudomonas
штаммов
putida
трех
448,
видов
Pseudomonas
fluorescens 331 и Klebsiella pneumoniae 332, устойчивых к высоким
концентрациям
тяжелых
металлов,
происходит
реализация
различных
механизмов резистентности в зависимости от вида бактерии, природы металла
и его концентрации, что отражается в изменении ультраструктурной
организации клетки.
43
5. ВЫВОДЫ
1.
Действие
высоких
концентраций
тяжелых
металлов
на
металлоустойчивые штаммы бактерий p. Pseudomonas и р. Klebsiella вызывает
видимые изменения ультраструктуры клеток, проявляющейся в изменении
толщины и структуры клеточной стенки, появлении хорошо развитой капсулы,
формировании вакуолеподобных структур, образовании электронно-плотных
конгломератов на поверхности и внутри клеток.
2.
Ультраструктурные изменения под действием ионов меди и
кадмия отмечаются уже в лаг-фазе роста бактериальных культур и
проявляются в появлении мелких осмиофильных гранул внутри клеток, что
характерно для всех исследованных штаммов.
3.
Индивидуальность реакции штаммов на уровне ультраструктур по
отношению к тяжелым металлам выявляется на стадии интенсивного роста
культур (экспоненциальная фаза роста культуры).
4.
Паказано,
что
бактерии
p.
Pseudomonas
и
p.
Klebsiella
обнаруживают одинаковые ультраструктурные изменения при действии ионов
кадмия.
5.
Одними из возможных механизмов аккумуляции тяжелых
металлов в клетках P. putida 448, P. fluorescens 331 и К pneumoniae могут
являться накопление их в форме сульфидов и связывание с запасающими
веществами (полифосфатами, поли-[3-оксимасляной кислотой).
44
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алексеева Н.Т., Анисимов Д.А., Хоменко В.А., Калмыкова Е.Н.,
Беленова И.А., Шевченко Л.С. Изменение состава белков оболочки и
липополисахарида
у кадмийустойчивых псевдомонад // Биологические
мембраны. 1991. Т. 8, № 8. С. 800-804.
Бекасова О.Д., Орлеанский В.К., Никандров В.В. Аккумуляция кадмия,
титана и алюминия цианобактерией Nostoc muscorum I I Микробиология. 1999.
Т. 68, № 6. С. 851-859.
Бондаренко Т.Ф., Паников Н.С, Добровольская Т.Г. Изменения
морфологии почвенных бактерий в зависимости от скорости их роста //
Микробиология. 1985. Т. 54, № 5. С. 798-803.
Бузолева
Л.С,
Кривошеева
A.M.
Использование
полифосфатов
патогенными бактериями как резервных веществ в условиях голодания при
разных температурах // Тихоокеанский медицинский журнал. 2001, № 2 . С. 1113.
Димиетриева
Г.Ю.,
Безвербная
И.П.
Микробная
индукция
-
эффективный инструмент для мониторинга загрязнения прибрежных морских
вод тяжелыми металлами // Океонология. 2002. Т. 42, № 3. С. 388-395.
Дмитренко Т.Н., Коновалова В.В., Шум О.А. Восстановление Cr (VI)
бактериями рода Pseudomonas //Микробиология. 2003. Т. 72, № 3 . С. 370-373.
Зикманис П.Б., Круче Р.В., Аузиня Л.П., Маргевича М.В., Бекер М.Е.
Распределение
трегалозы
между
клетками
и
средой
регистрации
у
обезвоженных Saccharomyces cerevisiae I I Микробиология. 1988. Т. 57,
№З.С.491-493.
Иванова Е.П., Горшкова Н.М., Михайлов В.В. и др. Сравнительное
изучение трех штаммов морских бактерий рода
Alteromonas
и
характеристика
их
капсульных
полисахаридов
//
Микробиология. 1994. Т. 63, №3. С. 228-234.
45
Исаченко А.С., Исачкова Л.М., Бузолева Л.С, Пустовалов Е.В., Сомов
Г.П. Ультраструктура бактерий Yersinia pseudotuberculosis при длительном
обитании в почве // Иммунолгия и микробиология. 2000. Т. 130, № п.
с. 561-
565.
Кац Л.Н. Цитологическое и цитохимическое исследование капсулы и
оболочки клетки Bacillus anthracis I I Микробиология. 1964. Т. 33, № 5 . С. 836843.
Кац
Л.Н.,
Волкова
Н.А.
Цитохимическое
и
электронномикроскопическое исследование капсул некоторых бактерий //
Микробиология. 1966. Т. 35, № 4. С. 660-666.
Кац
Л.Н.,
Римкунас
А.
Об
ультраструктуре
стрептококка
//
Микробиология. 1971. Т. 40, № 3. С. 522-527.
Кишко Я.Г., Рубан В.И. Необычные структуры у бактерий Pseudomonas
vignae //Цитология и генетика. 1976. Т. 10, № 3. С. 237-239.
Кондратьева Т.Ф., Агеева С.Н., Мунтян Л.Н., Пивоварова Т.А.,
Каравайко Г.И. Штаммовый полиморфизм профилей у Acidithiobacillus
ferrooxidans I I Микробиология. 2002. Т. 71, № 3. С. 373-380.
Красикова И.Н., Баколдина СИ., Хотимченко СВ., Соловьев Т.Ф.
Влияние температуры роста и плазмиды pVM 82 на жирнокислотный состав
липида A Yersinia pseudotuberculosis I I Биохимия. 1999. Т.64, № 3. С. 404-411.
Кулаев И.С, Ваганов В.М., Кулаковская Т.В., Личко Л.П., Андреева
Н.А., Трилисенко Л.В. Развитие идей А.Н. Белозерского по биохимии
полифосфатов // Биохимия. 2000. Т.65, № 3. С. 325-333.
Кулаев И.С. Неорганические полифосфаты и их роль на разных этапах
клеточной эволюции // Соросовский образовательный журнал. 1996, № 2 . С.
28-35.
Курода А., Отаке X. Молекулярный анализ накопления полифосфатов у
бактерий // Биохимия. 2000. Т.65, № 3. С. 362.
46
Миронов А.А., Комисарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной
микроскопии в биологии и медицине. - СП.б: Наука, 1994. 400 С.
Несмеянова М.А. Полифосфаты и ферменты полифосфатного обмена у
Е. coli I I Биохимия. 2000. Т.65, № 3. С. 368-374.
Петрикевич СБ., Литвиненко Л.А. Морфоцитологические изменения
дрожжей Candida utilis при нестационарном непрерывном культивировании с
лимитом по фосфору // Микробиология. 1988. Т. 57, № 3 . С. 415-419.
Позмогова
И.Н.
Воздействие
физико-химических
факторов
на
микроорганизмы // Культивирование микроорганизмов. Позмоговой. 1991. Т.
24. С. 3-70.
Рапопорт А.И., Пузыревская О.М., Саубенова М.Г. Полиолы и
устойчивость дрожжей к обезвоживанию // Микробиология. 1988. Т. 57, № 2.
С. 329-332.
Рош Р.Н. Транспорт ионов через мембрану посредством полифосфат /
поли-(К)-3-гидроксибутиратных комплексов // Биохимия. 2000. Т. 65, № 3. С.
335-352.
Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. Действие тяжелых металлов на
микроорганизмы // Успехи микробиологии. 1985, № 20. С. 227-251.
Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н, Шорохова А.П., Дмитриев
В.В., Баринова Е.С, Мохова О.Н., Эль-Регистал Г.И., Дуда В.И. Тонкое
строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий //
Микробиология. 2004. Т. 73, № 4. С. 516-529.
Сузина Н.Е., Северина Л.О., Сенюшкин А.А. Ультраструктурная
организация мембранного аппарата Sulfobacillus thermosulfidooxidans I I
Микробиология. 1999. Т. 68, № 4. С. 491-499.
Сурков А.В., Митюшина Л.Л., Дубинина Г.А. Особенности морфологии
и ультраструктуры бактерий рода Dethiosulfovibrio I I Микробиология. 2000. Т.
69, № 3. С. 389-394.
47
Четина Е.В., Сузина Н.Е., Фихте Б.А., Троценко Ю.А. Цитохимическое
выявление
локализации
ферментов
энергетического
метаболизма
у
Methylomonas methanica I I Микробиология. 1988. Т. 57, № 1. С. 125-131.
Alonso A., Sanchez P., Martinez J.L. Environmental selection of antibiotic
resistance genes // Environ.Microbiol.2001. Vol. 3, № 1. P. 1-9.
Anderson G.L., Williams J., Hille R. The purification and characterization of
arsenite oxidaze from Alcaligenes faecalis, a molibdencontaining hydroxylase // J.
Biol. Chem.1992. Vol. 267, № 33. P. 23674-23682.
Bruins M.R., Kapil S., Oehme F.W. Microbial resistance to metals in the
environment // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2000. Vol. 45. P. 198-207.
Butcher B.G., Dean S.M., Rawlings D.E. The chromosomal arsenic resistance
genes of Thiobacillus ferrooxidans have an unusual arrangement and confer
increased arsenic and antimony resistance to Escherichia coli I I Appl. Environ.
Microbiol. 2000. Vol. 66, № 5. P. 1826-1833.
Cervantes C, Silver S. Metal resistances in Pseudomonads: Genes and
Mechanisms // Molecular Biology of Pseudomonads Ed. by T.Nakazawa et. al.
Washington: ASM Press, 1996. P. 398-415.
Diels, Q L., Dong D., van der Lelie et. al. The czc operon of Alcaligenes
eutrophus CH34: from resistance mechanism to the removal of heavy metals //J. of
Indust. Microbiol. 1995. Vol. 14. P. 142-153.
Ehrlich H.L. Microbes and metals // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. Vol.
48. P. 687-692.
Ford Т., Mitchell R. Microbial transport of toxic metals // Environmental
Microbiology Ed. by R.Mitehell.-N.-Y.: Wiley-Liss. Inc., 1992. P. 83-101.
Gadd,G.M. Metal tolerance // Microbiology of extreme environments / Ed. by
C.Edwards.-Philadelphia: Open University Press, 1990. P. 178-210.
48
Hao Z., Reiske H.R., Wilson D.B. Characterization of cadmium uptake in
Lactobacillus plantarum and isolation of cadmium and manganese uptake mutants //
Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, № 11. P. 4741-4745.
Malik A. Metal bioremediation through growing cells // Environment
International. 2004, № 30. P. 261-278.
Mandal D., Bolander M.E., Sarkar G., Mukhopadhyay D., Mukherjee P. The
use of microorganisms for the formation of metal nanoparticles and their application
// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. Vol. 69. P. 485-492.
Moffett J.W., Brand L.E. Production of strong, extracellular Cu chelators by
marine cyanobacteria in response to Cu stress // Limnol. Oceanogr. 1996. Vol. 41,
№ 3. P. 388-395.
Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol.
1999. Vol. 51. P. 730-750.
Pazirandeh M., Wells B.M, Ryan R.L. Development of bacterium-based
heavy metal biosorbents: enhanced uptake of cadmium and mercury by Escherichia
coli expressing a metal binding motif // Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64, №
10. P. 4068-4072.
Pramod К. Sharma., David L.B., Anatoly F., Murthy A.V. A new Klebsiella
planticola strain (Cd-1) grows anaerobically at high cadmium concentrations and
precipitates cadmium sulfide // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66, № 7. P.
3083-3087.
Rosen D.P. Bacterial resistance to heavy metals and metalloids // JBIC. 1996.
Vol. 1 . P. 273-277.
Rouch D.A., Lee В. T. D., Morby A. P. Understanding cellular responses to
toxic agents: A model for mechanism choice in bacterial metal resistance //J of
Indust. Microbiol. 1995. Vol. 14. P. 132-141.
Suzina N.E., Duda V.I., Anisimova L.A., Dmitriev V.V., Boronin A.M.
Cytological aspects of resistance to potassium tellurite conferred on Pseudomonas
cells by plasmids // Arch. Microbiol. 1995. Vol. 163. P. 282-285.
49
Trevors J. Т., Oddie К. M., Belliveau В. H. Metal resistance in bacteria //
FEMS Microbiol. Rev. 1985. Vol. 32. P. 39-54.
Filali В. K., Taoufik J., Zeroual Yet. al Waste water bacterial isolates
resistante to heavy metals and antibiotics. // Cur. Microbiol. 2000. Vol. 41. P. 151156.
50