Жумабаева Б.А. Главный специалист Республиканской иммунобиологической лаборатории РГП

Жумабаева Б.А.
Главный специалист Республиканской иммунобиологической лаборатории РГП
«Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского
назначения и медицинской техники», г. Алматы.
ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЗДОРОВЫХ
ДОБРОВОЛЬЦЕВ ПРИ ВВЕДЕНИИ ПРЕПАРАТА СУСПЕНЗИИ (ВЗВЕСИ)
ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ
Аннотация
Целью данного исследования явилось изучение влияния препарата Суспензия (взвесь)
гемопоэтических стволовых клеток пуповинно-плацентарной крови на основные
показатели иммунного статуса здоровых добровольцев методом проточной
цитометрии.
Ключевые слова: пуповинная кровь человека, гемопоэтические стволовые клетки,
проточная цитометрия, субпопуляции лимфоцитов
Keywords: human umbilical cord blood, hematopoietic stem cells, flow cytometry, lymphocyte
subpopulations
Впервые трансплантацию стволовых гемопоэтических клеток пуповинной крови
провели ребенку с тяжелой формой анемии Фанкони в 1988 году Gluckman E.et al [1,
1174]. Эти клетки были получены из пуповинной крови новорожденной сестры
(сиблинга). С тех пор интерес со стороны клиницистов и ученых к использованию ее в
качестве альтернативного источника стволовых клеток для лечения злокачественных,
незлокачественных и генетических заболеваний не ослабевает.
В настоящее время в мире заготовлено и помещено на хранение около 600 000
образцов пуповинной крови и около 200 000 образцов уже использовано для лечения
злокачественных и незлокачественных заболеваний у взрослых и детей [2, 3].
Способность гемопоэтических стволовых клеток поддерживать регенерацию крови
(гемопоэз) путем постоянной пролиферации и дифференцировки является очень важной
при трансплантации. Поэтому трансплантат должен содержать в себе незрелые
плюрипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в лимфоидном,
миелоидном и эритроидном направлениях.
Настоящее исследование проводилось в рамках гранта АО «Национальный
инновационный Фонд Республики Казахстан». Протокол 1 фазы клинического испытания
был утвержден приказом Комитета фармации МЗ РК №43 от 28 марта 2006 года «Об
утверждении перечня разрешенных к клиническим испытаниям препаратов».
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния препарата Суспензия
(взвесь) гемопоэтических стволовых клеток пуповинно-плацентарной крови на основные
показатели иммунной системы здоровых добровольцев в динамике.
По данным разных авторов [3, 798] приживление стволовых клеток наблюдается в
среднем на 16-50 сутки. Это послужило причиной определения сроков исследования
показателей иммунитета (количественного содержания основных иммунокомпетентных
клеток и их субпопуляций).
Исследование различных субпопуляций клеток иммунной системы осуществлялось
методом проточной цитометрии с использованием различных наборов моноклональных
антител, меченных такими флюорохромами, как флюоресцеинизотиоцианат (FITC),
фикоэритрин (PE), перидинин-хлорофилл протеин (Per CP) (производства фирмы «Becton
& Dickinson», США). После соответствующей пробоподготовки определяли процентное
содержание тех или иных популяций клеток на проточном цитофлуориметреметре (FACS
Calibur, «Becton & Dickinson», США). Позитивность окрашивания с любым антителом
оценивалась при наложении квадрантов, определенных с помощью отрицательного
изотипического контроля.
Проводилось определение количественного содержания следующих популяций
иммунокомпетентных клеток на фоне введения препарата ГСК здоровым добровольцам:
- определение содержания зрелых Т-лимфоцитов, несущих СD3+ маркер.
- определение содержания Т-хелперов, несущих СD4+ маркер, которые являются Тлимфоцитами, продуцирующими различные цитокины, участвующих в тонких процессах
регуляции иммунного ответа.
- определение содержания Т-супрессоров, несущих маркер СD8+;
- определение содержания NK-клеток, экспрессирующих СD16+СD56+маркеры,
обладающие противоопухолевой и противовирусной цитотоксичностью;
- определение активированных мононуклеарных клеток (МНК) СD25+, несущих
рецептор к ИЛ-2;
- определение уровня гемопоэтических стволовых клеток, несущих маркер СD34+.
Все обследуемые были поделены на три группы:
1. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 2,5-2,9 х 105/кг
2. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 3,4-3,8 х 105/кг
3. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 4,2-4,8 х 105/кг
Оценка иммунного статуса проводилась до введения препарата, на 15, 30 и 45
сутки после введения препарата.
Во всех трех группах на 15 сутки после введения препарата отмечалось достоверное
повышение уровня СD 3+ в 1,2 раза в первой и второй группах и в 1,3 раза в третьей
группе; CD 4+ в 1,3 раза в первой и второй группах и в 1,46 раза в третьей группе; CD 8+ в
1,6 раза в первой группе, в 1,4 раза и в 1,5 раза во второй и третьей группах,
соответственно. К 45 дню после введения препарата уровень этих клеток вернулся к
исходному.
Отмечалось незначительное повышение уровня NK-клеток во всех трех группах на
15 сутки.
Наиболее существенное влияние препарат оказал на изменение уровня ГСК (СD 34+)
(рис.1) и активированных МНК (мононуклеаров) СD25+ , несущих рецептор для
интерлейкина -2.
Рис.1
Содержание СD 34+ у добровольцев
1,2
1,1
0,94
1
0,88
0,83
0,8
0,88
0,75
1 группа
% 0,6
0,4
0,38
0,18
0,31 0,33
3 группа
0,2
0
До
2 группа
15 сут
30 сут
45 сут
Сроки исследования
Отмечалось увеличение уровня ГСК в 4,8 раза в первой группе, в 5,2 раза во второй
группе и в 4,5 раза в третьей группе на 15 сутки. К 30 дню уровень ГСК достиг
максимального в 3 группе (1,1%). Через 45 дней с момента введения препарата уровень
ГСК в первой группе снизился вдвое по сравнению с показателями через 30 дней
исследования, в 2,8 раза во второй группе и в 3,3 раза в третьей группе обследуемых.
Необходимо отметить, что содержание СD34+ клеток и через 45 дней с момента введения
Суспензии ГСК пуповинной крови было выше исходного уровня.
Значительно изменилось содержание клеток, несущих маркер СD25+ в первой
группе после введения препарата ГСК пуповинной крови (рис.2).
Рис.2
Содержание СD 25+ у добровольцев
1,2
1,06
1
0,8
0,75
0,69
0,75
0,63
% 0,6
1 группа
0,5
2 группа
0,4
0,2
0
0,19
0,13
3 группа
0,08
0
До
15 сут
30 сут
45 сут
Сроки исследования
Уровень СD25+ в первой группе к 15 дню после введения препарата достоверно
повысился в 4,8 раза в первой, в 5,3 раза во второй и в 3,8 раза в третьей группах,
соответственно. К 30 дню после введения препарата уровень СD25+ достиг
максимального уровня во второй группе (1,06%) и вернулся к исходному через 45 дней
наблюдения.
Таким образом, введение препарата Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых
клеток пуповинной крови оказало выраженное стимулирующее влияние на основные
показатели иммунной системы у обследованных лиц всех трех групп. При этом можно
отметить высокую дозозависимость полученных показателей. Препарат Суспензия
(взвесь) гемпоэтических стволовых клеток (ГСК) плацентарно-пуповинной крови в
исследуемых дозах (2,4-2,9 х 105 / кг массы, 3,4-3,9 х 105 / кг массы, а также 4,4-4,9 х 105 /
кг массы является безопасным и эффективным стимулятором иммунной системы.
Наиболее выраженным иммуноcтимулирующим действием обладает доза препарата
4,4-4,9 х 105 / кг массы при общей безопасности для организма условно здоровых лиц.
Литература
1. Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, Friedman HS, Douglas GW, Devergie A, et al.
Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical cord
blood from an HLA-identical sibling. //N Engl. J.Med. – 1989. – 321: 1174-1178.
2. Wagnera J.E., Gluckman E. Umbilical cord blood transplantation: the first 20 years.
//Hematology. – 2010. – 47: 3 – 12.
3. С.И.Моисеев, К.М.Абдулкадыров. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток
костного мозга, периферической и пуповинной крови при заболеваниях системы
крови. //Гематология: новейший справочник. – 2004. - СПб.- С.770 – 813.