Частота выявления положительных результатов

Применение ультрафиолетового излучения
сплошного спектра для деконтаминации
продуктов ПЦР
Гапонов А. М., Тутельян А. В.
г. Москва
Схема эксперимента
В работе использовались диагностические наборы для PCR "AmplSens", производства
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора РФ.
Предварительный этап - наработка ампликонов.
1. Наработка ампликона в реакции PCR, согласно инструкции производителя набора, с
использованием ДНК- матрицы положительной контрольной пробы, входящей в состав
набора.
2. Очистка целевого продукта реакции (ампликонов) из реакционной смеси (50 мкл), методом
электрофореза в 1,7 % геле агарозы. После экстрации, выделенный продукт растворяли в
дистиллированной воде (1 мл.) и хранили до использования при -80 0 С.
Основной эксперимент.
1. 5 мкл. раствора ампликона помещали в 2 кварцевые кюветы, которые затем герметизировали
тефлоновой пробкой. Одну из кювет экранировали фольгой и использовали как внутренний
контроль условий эксперимента.
2. Кюветы (экранированную и неэкранированную) с ампликоном помещали на расстоянии 25 см
от источника импульсного ультрафиолетового излучения сплошного спектра и облучали в
течении различных периодов времени, в диапазоне от 1 до 16 минут.
3. После окончания облучения, в кюветы вносили 1 мл. дистиллированной воды, повторно
герметизировали и помещали на 12 часов холодильник, при 40 С и периодическом
встряхивании.
4. Полученные растворы из контрольной (экранированной) кюветы и опытной
(неэкранированной) кюветы использовали в качестве ДНК-матрицы в реакции PCR, с
набором той же специфичности, что и на этапе наработки ампликонов. В каждом
эксперименте ставили реакции с использованием положительных и отрицательных
контрольных проб, входящих в состав набора.
Влияние времени облучения на частоту положительных
реакций при использовании облученной УФИСС ДНК
ампликонов.
№
экспери
м.
1-2
2-4
4-6
6-8
8-10
10-16
1
+
+
+
-
-
-
2
+
+
-
-
-
-
3
+
+
-
-
-
-
4
+
+
+
+
-
-
5
+
+
+
-
-
-
Время облучения (мин)
Влияние времени облучения на частоту положительных реакций при
использовании облученной УФИСС ДНК ампликонов.
"+" - положительная реакция
"-" - отрицательная реакция
Кэ
О
К+
К-
На рисунке представлен снимок геля (негатив) где:
"Кэ" - раствор ампликона подвершегося облучению в экранированной кювете.
Время экспозиции - 8 минут.
"О" - раствор ампликона подвергшийся облучению в неэкранированной кювете.
"К+" - положительный контроль
"К-" - отрицательный контроль
Влияние времени облучения на частоту положительных
реакций при использовании частично обезвоженной и
облученной УФИСС ДНК ампликонов.
Время облучения (мин)
№
экспери
мента.
1-2
2-4
4-6
6-8
8-10
10-16
1
+
+
+
+
+
_
2
+
+
+
_
_
_
3
+
+
+
+
_
_
Влияние времени облучения на частоту положительных реакций при
использовании облученной УФИСС ДНК ампликонов.
"+" - положительная реакция
"-" - отрицательная реакция
О12
О16
К+
К-
На рисунке представлен снимок геля (негатив) где:
“О12” - облучение частично обезвоженной ДНК-ампликона, 12 мин.
“О16” - облучение частично обезвоженной ДНК-ампликона, 16 мин.
“К+” - положительный контроль
“К-” - отрицательный контроль
Кэ-ПС
О-ПС
О-Ак
Кэ-Ак
К+
К-
На рисунке представлен снимок геля (негатив) где:
«Кэ-ПС», «О-ПС» - ДНК ампликона, подвершегося облучению в экранированной
и неэкранированной полистироловой кювете, соответственно.
«Кэ-Ак», «О-Ак» - ДНК ампликона, подвершегося облучению в экранированной
и неэкранированной акриловой кювете, соответственно.
«К+» - положительный контроль
«К-» - отрицательный контроль
Время экспозиции – 12 минут.
Тестирование прибора «Альфа-05» проводилось в Лаборатории молекулярной биологии ФНКЦ ДГОИ им.
Дмитрия Рогачева с 23.09.13 по 23.10.13. В качестве периода сравнения использовался период с 10.06.13 по
06.08.13.
Количество используемых ПЦР - тестов
Более 50
Формат ПЦР-реакции
qPCR
Производитель тест-наборов
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора , РФ.
Аппаратура для проведения qPCR
Rotor Gene 3000*1
Rotor Gene 6000*1
Количество образцов, исследованных в
период тестирования, включая:
1436
Кровь
897
Остальное (стул, моча, мазки, ликвор,
лаважная жидкость, экссудаты, свежие
биоптаты и парафиновые блоки.)
539
Критерии контаминации
Появление сигнала в отрицательном контроле ПЦР (no template
control) на любом из каналов.*2
*1 - Серия, которая ставилась в каждый Rotor Gene, всегда включала в себя образцы пациентов, положительный
контроль ПЦР, отрицательный контроль ПЦР. В некоторых тестах, особенно для РНК-вирусов, в серию входил
положительный и отрицательный контроль выделения.
*2 - В случае появления сигнала на двух каналах, результат учитывался как равный 2.
Частота появления положительного сигнала в отрицательном
контроле qПЦР.
9
8
8
7
7
6
5
4
4
3
3
4
3
3
2
1
1
0
1
1
1
0 0
0
0
4
3
2
2
1
0
4
3
2
0
Стандартная
процедура
деконтамина
ции
5
2
1
0
0
0
1 1 1
0
2
1
2
УФ - ИСС
Спасибо за внимание!