практическим занятиям по дисциплине «Пищевая химия» по теме

ФГОУ ВПО
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Кафедра технологии хранения и переработки
растениеводческой продукции
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
к лабораторно - практическим занятиям по дисциплине
«Пищевая химия»
по теме: « Цветные реакции на аминокислоты и белки »
для студентов, обучающихся
по специальности 110305.65
Краснодар 2007
2
Одобрены на заседании методической комиссии факультета перерабатывающих технологий (протокол № 1 от «26» сентября 2007 г.)
Методические указания подготовили: профессор, д.т.н. Щербакова Е.В.
доцент, к.т.н. Кондратенко В.В.
ассистент Кондратенко Т.Ю.
соискатель Чубит Л.Ю.
Рецензент – профессор, д.т.н. Донченко Л.В.
3
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1 этап – предварительная подготовка. Заключается в изучении основных теоретических положений, лежащих в основе экспериментов, представленных в данной лабораторной работе, а также хода выполнения самих экспериментов. По окончанию изучения материала необходимо в устной форме отчитаться преподавателю о степени его усвоения. В случае успешного выполнения
данного этапа, по указанию преподавателя, осуществляется переход к следующему.
2 этап – проведение эксперимента. Найти на рабочем столе все приборы, реактивы и оборудование, необходимые для успешного проведения эксперимента. В случае, когда той или иной методикой предусмотрено использование едких кислот, щелочей, а также летучих, токсичных или горючих реактивов, следует определить их место расположения на рабочей поверхности вытяжного шкафа. Все запланированные эксперименты выполнять аккуратно, в
точности следуя соответствующей методике. Результаты эксперимента надо аккуратно заносить в рабочую тетрадь в форме, предложенной преподавателем.
По окончании эксперимента необходимо оценить полученные в ходе его выполнения результаты и сделать адекватные выводы по форме, предложенной
преподавателем. В случае успешного выполнения данного этапа осуществляется переход к следующему
3 этап – подготовка и защита отчёта о выполнении эксперимента. Во
внеурочное время следует полностью завершить оформление результатов эксперимента. Кроме того, в рабочей тетради необходимо в письменной форме
дать детальные развёрнутые ответы на контрольные вопросы, используя для
этого кроме методических указаний также дополнительные литературные источники. Защита отчёта проходит в устной или письменной форме, в соответствии с пожеланиями преподавателя.
4
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Общие положения
1. Студентам категорически запрещается работать в лаборатории одним
без присмотра преподавателя или лаборанта, а также проводить работы не связанные непосредственно с полученным заданием.
2. Работу в лаборатории необходимо выполнять в специальных халатах
из хлопчатобумажной ткани.
3. Рабочее место необходимо содержать в чистоте и порядке, не загромождать его посторонними предметами и личными вещами.
4. Нельзя брать принадлежности с другого стола, бросать в раковины
бумагу, вату, выливать химические реактивы.
5. Запрещается пить в лаборатории воду и принимать пищу.
6. По окончании пользования водой и источниками энергии необходимо
закрывать краны и выключать электроприборы.
7. Не приступайте к работе до полного уяснения всей техники её выполнения.
8. При замеченных неисправностях электрической проводки, водопроводной сети, лабораторной аппаратуры, вытяжного шкафа, приборов и
т.п. немедленно сообщайте дежурному лаборанту или преподавателю.
9. После выполнения работы и одобрения полученных результатов преподавателем рабочее место приведите в состояние, которое оно имело
к моменту начала работы.
10.Дежурный студент сдаёт лабораторию лаборанту и покидает её последним.
11.После ознакомления с правилами техники безопасности студент ставит свою подпись в журнале учёта.
12.В случае нарушения правил техники безопасности студент отстраняется от дальнейших занятий в лаборатории.
5
Правила работы со стеклянной посудой и оборудованием
Категорически запрещено работать с грязной и поврежденной химической посудой и оборудованием (пробирки с трещинами, ртутные термометры,
спиртовки). При перемешивании стеклянной палочкой нужно избегать ударов
по стенкам посуды. Кроме того, нельзя нагревать химическую стеклянную посуду на огне без асбестовой сетки, а также наливать горячую жидкость без
предварительного ополаскивания ею стенок и дна сосуда. При нагревании пробирок с растворами их следует держать специальными держателями открытым
концом от себя и от стоящих рядом людей.
Правила работы с реактивами
Все опыты с концентрированными кислотами, щелочами и органическими растворителями (спиртом, ацетоном, петролейным эфиром, этанолом и т.д.)
производить только под тягой (при проведении данной работы голова и корпус
тела должны оставаться вне вытяжного шкафа, а наблюдение за работой производится через стекло опущенной створки).
На всех склянках с реактивами должны быть этикетки с обозначением
(название реактива, дата изготовления, титр). При работе с концентрированными реактивами и другими растворами следует пользоваться резиновой грушей
или специальными градуированными шприцами и бюретками.
Запрещается пробовать химические вещества на вкус и выливать в раковину (их собирают в специальные сосуды).
При разбавлении или переливании концентрированных кислот и щелочей
необходимо пользоваться толстостенной посудой и вливать кислоту при помощи стеклянной палочки в воду, а не наоборот.
Разлитые кислоты и щёлочи необходимо нейтрализовать, а затем тщательно промыть водой (при попадании на кожу щёлочи обожжённое место
обильно промывают проточной водой, а затем протирают 2%-ным раствором
уксусной или борной кислоты). В случаях попадания на кожу кислоты обожжённое место обильно промывают проточной водой, а затем протирают 2%-
6
ным раствором аммиака или соды. При сильных термических ожогах кожу
смачивают крепким раствором перманганата калия или спиртовым раствором
танина, спиртом или жировой эмульсией.
Правила работы с электрическими приборами
Перед началом работы с прибором, студентам необходимо изучить его
устройство и правила пользования.
Не пробуйте самостоятельно исправлять приборы, а сообщайте преподавателю или лаборанту.
По окончании работы не забывайте выключать приборы из электрической
сети.
7
ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ
Актуальность темы: Одной из главных задач специалистов пищевой отрасли является определение наличия и количество белков и аминокислот в пищевом продукте или сырье для его производства.
Белки и аминокислоты можно обнаружить по ряду характерных реакций,
которые основаны на физико-химических свойствах белков. Эти качественные
реакции получили название «цветные реакции на белки», так как дают окрашенные соединения (рисунок 6).
1. Нингидриновая реакция характерна для α-аминокислот (аминокислот,
у которых аминогруппа присоединяется к первому – α-атому углерода, идущему после карбоксильной группы).
1 этап: присоединение к молекуле нингидрина молекулы аминокислоты
по двойной связи с отщеплением молекулы воды (рисунок 1)
α-углерод
+
α-аминокислота
нингидрин
Рисунок 1 – I этап нингидриновой реакции
2 этап: водород карбоксильной группы уходит к двойной связи N и нингидрина и разрывает её, присоединяясь к углероду в пятичленном кольце. В результате образуется двойная связь между азотом и углеродом в остатке аминокислоты, а карбоксильная группа в виде углекислого газа (СО2) отщепляется и
улетучивается (рисунок 2).
8
Рисунок 2 – II этап нингидриновой реакции
3 этап: в присутствии воды идёт расщепление образовавшейся двойной
связи, водород воды присоединяется к азоту, а кислород к углероду, образуя
молекулу альдегида, которая уходит в окружающий раствор. В итоге, от исходной аминокислоты в соединении остался один азот (рисунок 3).
альдегид
Рисунок 3 – III этап нингидриновой реакции
4 этап: к образовавшемуся соединению через азот присоединяется вторая
молекула нингидрина, по тому же механизму, что и на первом этапе, происходит отщепление воды и образуется сложное соединение с азотом по середине.
+
нингидрин
Рисунок 4 – IV этап нингидриновой реакции
9
5 этап: водород при углероде отщепляется и присоединяется к кислороду, расщепляя двойную связь.
В результате двойная связь образуется в пятичленном кольце, а образовавшаяся ОН - группа диссоциирует, и катион водорода уходит в раствор, в результате чего кислород пятичленного кольца приобретает отрицательный заряд,
а реакция среды становится более кислой. В этих условиях двойная связь при
полностью замещённом третичном азоте приводит к окрашиванию (рисунок 5).
окрашенное соединение
Рисунок 5 – V этап нингидриновой реакции
Все эти этапы проходят очень быстро, сменяя друг друга при кипении. В
итоге, в ходе реакции аминокислоты окисляются и распадаются, образуя СО2,
соответствующий альдегид, и образуется всегда один и тот же пигмент.
Интенсивность окраски зависит от количества аминокислот в соответствующих растворах.
10
КАЧЕСТВЕННЫЕ
РЕАКЦИИ
универсальные
на
пептидные
связи
Биуретовая
сине-фиолетовое
специфические
общие
на
α-аминокислоты
Нингидриновая
Нингидриновая
сине-фиолетовое
гистидин
и тирозин
Сёренса
красное
особые
аргинин
Сакагучи
красное
Паули
вишнёвокрасное
тирозин
метионин
ФолинаФолинаЧокалтеу
красное
Милона
красное
глицин
Циммермана
зелёное
ГопкинсаГопкинсаКоле
синефиолетовое
триптофан
Ваузена
синефиолетовое
Эрлиха
синее
на
серосодержащие
аминокислоты
на
ароматические
аминокислоты
цистин
и цистеин
Ксантопротеиновая
жёлтое
Фоля
чёрный
осадок
цистеин
Нитропруссидная
красное
МакМак-Карти
и Салливана
красное
АдамкевичаАдамкевичаГопкинса
сине-фиолетовое
Рисунок 6 – Классификация основных качественных реакций на белки и аминокислоты
Салливана
красное
11
2. Биуретовая – реакция обнаружения пептидной связи. Эту реакцию
дают все белки, продукты их неполного гидролиза (пептоны, пептиды), а также
некоторые небелковые вещества (биурет, оксамид) и некоторые свободные
аминокислоты (гистидин, серин) – рисунок 7.
H
N
O
O
O
C
C
NH 2
NH2
O
C
C
H2 N
NH 2
биурет
оксамид
Рисунок 7 – Небелковые вещества, дающие биуретовую реакцию
1 этап: В щелочной среде каждая пептидная связь переходит в енольную
форму (т.е. атом водорода уходит от азота в пептидной связи, разрывая двойную связь между углеродом и кислородом, и присоединяется к кислороду, образуя спиртовую ОН - группу), из-за чего полипептид относится к категориям
спиртов (рисунок 8).
пептидная форма полипептида
ОН
-
ОН
-
ОН
-
ОН
ОН
-
-
ОН
O
… H
N
ОН
CH
ОН
-
ОН
-
ОН
ОН
-
H
N
CH
R1
C
-
ОН
ОН
-
-
ОН
-
H
N
C
R2
ОН
ОН
-
ОН
CH
R2
C
ОН
-
ОН
-
ОН
ОН
-
H
N
C
R3
ОН
ОН
-
CH
R3
ОН
-
-
-
ОН
-
ОН
-
CH
C
R4
ОН
ОН
-
OH
N
-
ОН
-
-
ОН
ОН
ОН
-
O
CH
OH
N
-
O
CH
OH
… N
ОН
O
C
R1
-
-
C
O
H
N
-
ОН
-
ОН
C
R5
ОН
-
ОН
OH
N
CH
R4
C
…
CH
-
-
ОН
-
OH
N
CH
C
R5
енольная форма полипептида
Рисунок 8 – Переход пептидной формы полипептидной цепи в енольную
в щелочной среде
…
12
В результате между углеродом и азотом образуется двойная связь, из-за
которой полипептид начинает относиться к неароматическим углеродсодержащим соединениям с двойной связью – алкенам, из-за чего входит в группу еновых соединений. Вместе со свойством спиртов (ольных соединений) данная
форма пептидной связи становится енольной.
В результате азот в такой связи является третичным, полностью замещённым с двойной связью. При таком азоте имеется неподелённая электронная
пара, благодаря которой он может вступать в донорно-акцепторное взаимодействие, что и происходит при наличии в растворе ионов двухвалентной меди.
2 этап: в растворе енольная форма полипептида (спиртовые группы этой
формы диссоциируют, что приводит к образованию отрицательных зарядов СО, которые при наличии в растворе ионов 2х валентной меди вступают с ними в
солевое взаимодействие). При этом не обязательно участвуют соседние спиртовые группы, в солевом взаимодействии могут участвовать диссоциированные
спиртовые группы из разных участков молекулы, что приводит к её изгибу, она
охватывает ион меди как бы в клещи (хелаты).
Прочности белково-медного комплекса способствует также координационная донорно-акцепторная связь между уже связанным по солевому механизму ионом меди и неподелённой электронной парой третичного азота. Такой
комплекс имеет фиолетово-синий цвет (рисунок 9).
R1
… N..
CH
R2
C
N
..
CH
O
Cu
C
Cu
CH N
C
R4
N
C
N
C
Cu
O
..
C
R3
Рисунок 9 – Биуретовая реакция
…
O
O
CH
CH
Cu
..
C
N
..
O
O
CH
CH
R5
Cu
..
C
N
..
O
O
R5
CH
R4
Cu
..
C
N
..
O
O
…
R3
CH N
R2
..
C
CH N
R1
…
13
3. Ксантопротеиновая реакция обнаруживает в белке ароматические
аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан).
Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой даёт жёлтое окрашивание. Реакция обусловлена нитрованием фенильного
кольца ароматических аминокислот с образованием нитросоединений жёлтого
цвета (рисунок 10).
При осторожном прибавлении к реакционной смеси аммиака или другой
щёлочи появляется красно-оранжевая окраска, обусловленная образованием
нитроновых кислот.
азотная
кислота
азотная
кислота
O
O
N
O
OH
OH
HO
N
OH
O
O
N
N
O
O
H 2O
H2O
CH 2
CH 2
H2 N
H2 N
CH
CH
C
C
HO
O
O
тирозин
HO
O
динитротирозин
Рисунок10 – Ксантопротеиновая реакция
4. Реакция на триптофан (реакция Адамкевича-Гопкинса, 1874 г)
Реакция обнаруживает в белке аминокислоту триптофан. При добавлении
к раствору белка незначительных количеств глиоксиловой кислоты в присутствии крепкой серной кислоты получается триптофана в кислой среде вступать
в реакцию с альдегидами, образуя при этом окрашенные продукты конденсации. В этой реакции из глиоксиловой кислоты под действием концентрированной серной кислоты сначала получается формальдегид (рисунок 11).
14
кислая среда
формальдегид
глиоксиловая
кислота
Рисунок 11 – Образование формальдегида
из глиоксиловой кислоты
Образовавшийся формальдегид затем конденсируется с триптофаном.
Продукт конденсации окисляется до бис-2-триптофанилкарбинола, который в
присутствии минеральных кислот образует соли, окрашенные в синефиолетовый цвет (рисунок 12).
O
HO
C
O
формальдегид
H2N CH
OH
C
CH NH2
H2C
CH2
N
H
N
H
триптофан
триптофан
O2-
бис-2-триптофанилметан
бис-2-триптофанилкарбинол
(сине-фиолетовый цвет)
Рисунок 12 – Реакция Адамкевича-Гопкинса
15
5. Реакция на серосодержащие аминокислоты (реакция Фоля)
Реакция Фоля открывает в белке серосодержащие аминокислоты цистин
и цистеин. Метионин этой реакции не даёт, поскольку сера в нём связана прочно. При добавлении к раствору белка крепкой щелочи, уксуснокислого свинца
и последующем кипячении раствор начинает темнеть.
Реакция обусловлена тем, что цистин и цистеин при нагревании с крепкой щелочью разрушаются, образуя сульфид натрия, который затем, при взаимодействии со свинцовокислым натрием, трансформируется в сульфид свинца,
окрашивающий раствор в тёмный цвет (рисунок 13).
H2N
SH
OH
CH2
CH2
CH
C
CH
C
HO
O
Цистеин
O
H3C
H2N
C
O
Na
S
Na
HO
O
Серин
Уксусная
кислота
O
HO
C
тёмный
цвет
CH3
Pb
O
H3C
C
O
Уксусная
кислота
Рисунок 13 – Реакция Фоля
6. Реакция Миллона – реакция на аминокислоту тирозин.
Реактив Миллона (раствор HgNO3 и Hg(NO2)2 в разбавленной HNO3, содержащей примесь HNO2) взаимодействует с тирозином с образованием ртутной соли нитропроизводного тирозина (рисунок 14), окрашенной в розоватокрасный цвет:
16
азотная
кислота
нитрат
ртути
O
O
O
O
N
N
OH
O
O
Hg
OH
N
N
O
O
O
O
O
O
O
N
N
OH
O
O
O
O
N
N
O
Hg
H2C
H2C
H2N CH
H2N CH
C
HO
O
динитротирозин
тирозин
H2C
C
HO
O
динитротирозин
H2N CH
C
HO
O
ртутная соль
нитропроизводного
тирозина
(красный цвет)
Рисунок 14 – Реакция Миллона
7. Реакция Сакагучи – реакция на аргинин
Белки, содержащие аргинин, в присутствии щёлочи дают красное окрашивание с гипобромитом и α- нафтолом.
Гуанидиновая группа аргинина окисляется гипобромитом, и окисленный
аргинин при взаимодействии с α- нафтолом образует продукт конденсации
красного цвета (рисунок 15).
α-нафтол
O
OH
O
O
H2N
гипобромит
натрия
HN
OH
CH2
CH2
NH
C
H2N
NH
аргинин
O
N
CH C
OH
CH C
CH2
CH C
гипобромит
натрия
OH
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH
NH
C
H2N
NH
нафтиларгинин
Рисунок 15 – Реакция Сакагучи
C
H2N
NH
нафтохинонимин
(красный цвет)
17
8. Реакция Ваузена – реакция на триптофан
Белки, содержащие триптофан, дают в кислой среде в присутствии нитрита натрия и формальдегида сине-фиолетовое окрашивание. В этой реакции
триптофан взаимодействует с формальдегидом с образованием продукта конденсации (бис-2-триптофанилметана), который окисляется нитритом натрия до
бис-2-триптофанилкарбинола.
Химизм реакции в целом подобен химизму реакции АдамкевичаГопкинса (рисунки 11, 12), но только формальдегид образуется не в присутствии серной, а в присутствии соляной кислоты, а окисление продуктов конденсации осуществляется нитритом натрия.
9. Реакция Гопкинса-Коле – реакция на триптофан
Ещё одна цветная реакция, обнаруживающая в составе белка аминокислоту триптофан. Химизм её в целом подобен химизму реакции АдамкевичаГопкинса (рисунок 12), отличаясь лишь ходом проведения. Цвет продуктов реакции тот же.
10. Реакция Паули (диазореакция Паули)
Данная реакция позволяет обнаружить в белке аминокислоты гистидин и
тирозин. Реакция проходит в два последовательных быстро сменяющих друг
друга этапа.
На первом этапе, при взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия (или калия) в кислой среде, образуется диазобензолсульфоновая
кислота (рисунок 16).
O
O S OH
NH2
сульфаниловая
кислота
нитрит
натрия
n-диазобензолсульфоновая
кислота
Рисунок 16 – I этап реакции Паули
18
На втором этапе, при взаимодействии образовавшейся n-диазобензолсульфоновой кислоты с гистидином или тирозином, в реакции диазотирования, образуются комплексные соединения вишнёво-красного цвета (рисунок 17).
CH3
H2N
CH
H2C
N
N
H
гистидин
2,5-бис-n-сульфобензолазогистидин
(вишнёво-красный цвет)
Рисунок 17 – II этап реакции Паули (диазотирование)
11. Реакция Шульца – Распайля
Эта реакция обусловлена взаимодействием триптофана с оксиметилфурфуролом, образующимся при действии концентрированной серной кислоты
на сахарозу, добавляемую к раствору белка. Отмечается вишнёво-красное
окрашивание.
12. Реакция Фолина – реакция на тирозин и цистеин
Реактив Фолина содержит соли фосфорно-18-вольфрамовомолибденовой кислоты. Это соединение легко восстанавливается в щелочной среде фенолами с образованием синего окрашивания. Реакцию даёт не только сам фенол,
но и другие соединения, содержащие фенольный гидроксил, в частности тирозин, фолликулин.
Реактив Фолина даёт синее окрашивание также и с цистином, однако
лишь после того, как цистин будет восстановлен с помощью сульфита натрия в
19
цистеин. Способностью восстанавливать реактив Фолина в синее соединение
обладает не только свободный тирозин, но и белок. Можно было бы ожидать,
что интенсивность окраски, возникающей при взаимодействии реактива Фолина с белком, пропорциональна содержанию в белке тирозина и цистеина. В действительности, оказалось, что если белок предварительно обработать солями
меди, то интенсивность окраски, даваемой им с реактивом Фолина, намного
превышает ту, которую могли бы дать только названные аминокислоты. Считается, что с реактивом Фолина взаимодействуют также и другие аминокислоты,
входящие в состав белковой молекулы, предварительно образовавшей медный
комплекс. Поэтому интенсивность возникающего окрашивания, в известной
мере, пропорциональна содержанию белка. Это один из случаев, когда качественный метод может стать основой количественного метода.
13. Реакция Серенсена – реакция с формальдегидом.
Эта
реакция
обусловлена
взаимодействием
аминокислоты
с
формальдегидом в ходе которого выделяется молекула воды, а образующееся
метиленовое соединение придает раствору красное окрашивание (рисунок 18).
аминокислота
формальдегид
метиленовое
соединение
Рисунок 18 – Реакция Серенсена
20
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
Тема: «Цветные реакции на аминокислоты и белки»
Цель занятия: изучить и освоить методы качественного и количественного определения аминокислот и белков.
Оборудование: пробирки на 10 мл; пипетки на 1 мл; водяная баня; спиртовки; держатели для пробирок; штативы для пробирок.
Нингидриновая реакция
Вариант №1
Реактивы: 1%-ный раствор яичного белка; 0,5%-ный раствор нингидрина; 1%-ный раствор глицина; 1%-ный раствор в-аланина.
Ход работы:
1. В одну пробирку вносят 1 мл 1%-ного раствора яичного белка, во вторую 1 мл 1%-ного раствора глицина и в третью 1 мл 1%-ного раствора
в - аланина.
2. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 0,5%-ного раствора нингидрина и нагревают до кипения.
Через 2…3 мин в пробирках наблюдают появление окрашивания и
объясняют разницу окрашивания в трёх пробирках.
Вариант №2
Реактивы: 10%-ный раствор яичного белка; 0,2%-ный раствор нингидрина; 0,1%-ный раствор гликокола.
Ход работы:
1. Смешивают в микрохимической пробирке по 2 капли растворов нингидрина и гликокола. Нагревают пробирку и отмечают появление синего
окрашивания.
21
2. Повторяют опыт, взяв вместо гликокола раствор белка. В этом опыте
окраска появляется медленно, она менее интенсивна, так как белок имеет
меньше свободных аминогрупп на единицу веса, чем аминокислоты.
Окраска, возникающая при взаимодействии аминокислот с нингидрином, варьирует в зависимости от строения взятой в опыт аминокислоты, от
рН раствора и ряда других условий опыта.
Биуретовая реакция
Реактивы: 1%-ный раствор яичного белка; 10%-ный раствор едкого
натра; 1%-ный раствор сульфата меди.
Ход работы:
1. В пробирку наливают 1 мл 1%-ного раствора яичного белка.
2. Добавляют 2 мл 10%-ного раствора едкого натра и 1…2 капли 1%-ного
раствора сульфата меди.
В пробирке появляется сине-фиолетовое окрашивание.
Ксантопротеиновая реакция
Реактивы: 1%-ный раствор яичного белка; 1%-ный раствор желатина;
1%-ный раствор триптофана; концентрированная уксусная
кислота; концентрированная серная кислота
Ход работы:
1. В одну пробирку вносят 1 мл 1%-ного раствора яичного белка, во вторую – 1 мл 1%-ного раствора желатина, в третью пробирку вносят 1 мл
1%-ного раствора триптофана.
2. В каждую пробирку вносят по 3 капли концентрированной азотной
кислоты, нагревают, затем охлаждают и добавляют несколько капель
30%-ного раствора NаОН.
Наблюдают появление окрашивания и объясняют разницу в окраске растворов в трёх пробирках.
22
Реакция Адамкевича – Гопкинса (1874)
Реактивы: 1%-ный раствор яичного белка; 1%-ный раствор желатина;
0,1%-ный раствор триптофана; концентрированная уксусная
кислота; концентрированная серная кислота.
Ход работы:
1. В одну пробирку вносят 1 мл 1%-ного раствора яичного белка, во вторую – 1 мл 1%-ного раствора желатина, в третью – 1 мл 0,1%-ного раствора триптофана.
2. В каждую пробирку добавляют в качестве источника глиоксиловой
кислоты по 1…2 мл концентрированной уксусной кислоты (глиоксиловая кислота всегда присутствует в небольших количествах в ледяной
уксусной кислоте).
3. Растворы нагревают, затем охлаждают и по стенке пробирок осторожно, не допуская смешивания жидкостей, приливают по 2 мл концентрированной серной кислоты.
При стоянии в пробирке с яичным белком, на границе двух слоёв жидкости наблюдается сине-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Появление
окраски можно ускорить, поместив пробирку в кипящую водяную баню на 3
минуты. Объясняют разницу в окраске растворов в трёх пробирках.
Реакция Фоля
Реактивы: 1%-ный раствор яичного белка и желатина; 30%-ный раствор
едкого натра; 5%-ный раствор уксуснокислого свинца.
Ход работы:
Вариант №1
1. В одну пробирку наливают 1 мл 1%-ного раствора яичного белка, во
вторую – 1 мл 1%-ного раствора желатина.
2. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 30%-ного раствора едкого
натра и 1 мл 5%-ного раствора уксуснокислого свинца.
23
3. Содержимое пробирок доводят до интенсивного кипения.
Жидкость в пробирке с яичным белком темнеет, образуя чёрный осадок
сульфида свинца. В пробирке с желатином осадка не образуется. Объясняют
разницу в окраске растворов.
Вариант №2
1. В одну микрохимическую пробирку вносят 3 капли 0,4 %-ного раствора цистеина, в другую – столько же 10%-ного раствора белка.
2. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 30%-ного раствора едкого
натра и осторожно нагревают в течение 2 мин.
3. После охлаждения добавляют каплю 5%-ного раствора ацетата свинца
(свинец уксуснокислый).
Жидкость окрашивается в тёмно-коричневый цвет.
Реакция Милона
Реактивы: концентрированный раствор тирозина; реактив Миллона;
Ход работы:
1. В пробирку наливают 2 мл концентрированного раствора тирозина
2. Прибавляют ~1 мл реактива Миллона, встряхивают и осторожно нагревают пробирки на пламени спиртовки.
Образуется красное окрашивание.
Реакция Сакагучи
Реактивы: 1%-ный раствор белка или желатина; 10%-ный раствор едкого
натра; 0,1 %-ного спиртового раствора а– нафтола; 2%-ный
раствор гипобромита натрия, 0,1%-ный раствор аргинина
(приложение 2).
Ход работы:
Вариант №1
24
1. В пробирку наливают 0,5 мл 1%-ного раствора белка (яичного белка,
желатина).
2. Добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора щёлочи и 3 капли 0,1%-го спиртового раствора а - нафтола, после чего получившуюся смесь встряхивают для перемешивания.
3. Приливают 2…3 капли 2%-ного раствора гипобромита натрия.
Появляется красное окрашивание.
Вариант №2
1. В одну микрохимическую пробирку вводят 1 каплю раствора аргинина,
в другую – 1 каплю 10%-ного раствора яичного белка.
2. Добавляют в каждую пробирку по 1 капле растворов а – нафтола и гипобромита натрия, после чего получившуюся смесь встряхивают для
перемешивания. В результате, свободный аргинин даёт кирпичнокрасное окрашивание, а аргинин в составе белка – малиново-красное
окрашивание.
Реакция Ваузена
Реактивы: 1%-ный раствор яичного белка; 2,5%-ный раствор формальдегида; концентрированная серная кислота; 0,5%-ный раствор
нитрита натрия.
Ход работы:
1. В пробирку наливают 2 мл 1%-ного раствора яичного белка и добавляют 1 каплю 2,5%-ного раствора формальдегида.
2. К полученной смеси, тщательно перемешивая, добавляют осторожно
по каплям 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом.
3. Через 10 минут добавляют, при постоянном перемешивании, 10 капель
0,5%-ного раствора нитрита натрия.
Появляется сине-фиолетовая окраска.
25
Реакция Паули
Реактивы: 1%-ный раствор сульфаниловой кислоты; 0,5 %-ный раствор
нитрита натрия; 1%-ный раствор яичного белка; 10%-ный
раствор карбоната натрия; 0,1%-ный раствор гистидина.
Ход работы:
1. В пробирку наливают 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты,
прибавляют 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия и тщательно перемешивают.
2. К полученной смеси добавляют 2 мл 1%-ного раствора яичного белка и
после перемешивания приливают 6 мл 10%-ного раствора карбоната
натрия. Смесь тщательно перемешивают.
После перемешивания смесь окрашивается в вишнёво-красный цвет.
Проделывают эту же реакцию с 0,1%-ным раствором гистидина, сравнивают полученные результаты и делают вывод.
Реакция Гопкинса – Коле
Реактивы: 0,005%-ного раствора триптофана; глиоксиловая кислота
(приложение); 0,04 М раствора сульфата меди (II); концентрированная серная кислота;
Ход работы:
1. В пробирку наливают 1 мл 0,005%-ного раствора триптофана, затем
добавляют 1 мл глиоксиловой кислоты.
2. Смесь тщательно перемешивают, после чего прибавляют 10 капель
0,04 М раствора сульфата меди (II).
3. Затем небольшими порциями (по несколько капель) добавляют 2…3 мл
концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку после приливания очередной порции кислоты в потоке холодной воды (или в ванночке со льдом).
26
4. Полученную смесь оставляют на 10 мин при комнатной температуре,
после чего ставят на 5 мин в кипящую водяную баню.
Наблюдается образование сине-фиолетового окрашивания.
Реакция Мак-Карти и Салливана
Реактивы: 0,02 н раствор метионина; 14,3 н раствор гидроксида натрия;
10%-ный раствор нитропруссида натрия; смесь соляной и
фосфорной кислоты.
Ход работы:
1. В пробирку наливают 5 мл 0,02н раствора метионина.
2. При непрерывном перемешивании прибавляют сначала 1 мл 14,3н раствора гидроксида натрия, а затем 0,3 мл свежеприготовленного 10%-го
раствора нитропруссида натрия.
3. Смесь нагревают в течение 10 минут на водяной бане при температуре
35…40 °С., затем в течение 2 минут охлаждают в ледяной воде.
4. К смеси при помешивании добавляют 5 мл смеси соляной и фосфорной
кислот. Полученный раствор взбалтывают 1 минуту, после чего охлаждают водой комнатной температуры в течение 10 минут.
Образуется яркая красно-фиолетовая окраска.
Реакция Циммермана
Реактивы: 1%-ный раствор глицина; 10%-ный раствор едкого натра; раствор о-фталевого диальдегида.
Ход работы:
1. К 2 мл 1 % - ного раствора глицина, доведённого добавлением 10%ного раствора щелочи до рН =8, приливают 0,5 мл водного раствора офталевого диальдегида.
Реакционная смесь начинает медленно окрашиваться в ярко-зеленый
цвет. Через несколько минут выпадает зеленый осадок.
27
Реакция Шульца-Распайля
Реактивы: 0,1%-ный раствор сахарозы; концентрированная серная кислота; 10%-ный раствор яичного белка; 0,3%-ный раствор
триптофана.
Ход работы:
1. В одну микрохимическую пробирку вносят 4 капли раствора триптофана, а в другую 3 капли раствора белка.
2. В каждую пробирку добавляют по капле раствора сахарозы и встряхивают.
3. Осторожно вводят в пробирку по стенке 10 капель концентрированной
серной кислоты. При этом верхний слой в пробирке с триптофаном
окрашивается в желтый цвет продуктами окисления сахарозы, а на границе с опустившейся на дно серной кислотой возникает вишнёвокрасное кольцо. В пробирке с белком на границе раствора белка и серной кислоты также отмечается вишнёво-красное кольцо.
Проделывая реакцию Шульца-Распайля, следует избегать введения избытка сахарозы, так как в этом случае возникает коричневая окраска, маскирующая реакцию на триптофан.
Реакция Сёренса
Реактивы: 1%-ный раствор глицина; индикатор метиловый красный;
40%-ный раствор формалина.
Ход работы:
1. В пробирку наливают 5 капель 1%-ного раствора глицина + 1 каплю
индикатора метилового красного. Раствор окрашивается в жёлтый цвет
(нейтральная среда).
2. К полученной смеси добавляют равный объём 40 %- ного раствора
формалина (формальдегида).
Появляется красное окрашивание (кислая среда).
28
Реакция Фолина
Реактивы: реактив Фолина; 10%-ный едкий натр; 2%-ный фенол; 0,05% ный тирозин; белок яичный (приложение 2).
Ход работы:
1. Подготавливают 3 микрохимические пробирки. В первую пробирку
вносят 2 капли раствора фенола, во вторую – 2 капли тирозина, в третью – 2 капли белка.
2. Добавляют в каждую пробирку по 2-3 капли раствора едкого натра и по
капле реактива Фолина.
Отмечают появление синего окрашивания.
Реакция с нитропруссидом натрия
Реактивы: 10%-ный раствор яичного белка; 0,1%-ный раствор цистина;
30%-ный раствор едкого натра; 10%-ный раствор нитропруссида натрия;
Ход работы:
1. Берут 2 микрохимические пробирки. В одну из них вносят 3 капли раствора белка, в другую 3 капли 0,1%-ного раствора цистина.
2. В обе пробирки добавляют по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра
и осторожно нагревают в течение 2 мин.
3. После охлаждения добавляют в каждую из пробирок по 1 капле раствора нитропруссида натрия.
Отмечают появление красно-коричневого окрашивания.
29
ОФОРМЛЕНИЕ РАБОТЫ
Результаты работы оформить в виде таблицы.
№
п.п.
Название
реакции
Материал
исследования
Употребляемые
реактивы
Окраска
продукта
Чем обусловлена
реакция
Выводы:
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Назовите универсальные реакции на белки
2. Укажите специфические реакции на белки и аминокислоты.
3. Какая химическая группа в белках и аминокислотах обусловливает
нингидриновую реакцию?
4. Какой химической группировкой обусловлена биуретовая реакция?
5. Какую аминокислоту в белке открывают реакцией Милона?
6. Какие химические превращения протекают в процессе ксантопротеиновой реакции?
7. Какие вещества дают окрашенные продукты при взаимодействии с
триптофаном в кислой среде?
8. Какие химические превращения происходят при кипячении цистина и
цистеина в щелочной среде?
30
ПРИЛОЖЕНИЕ
31
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 – Подготовка к проведению занятия
Оборудование и реактивы (на 1 рабочее звено):
Нингидриновая реакция:
пробирка на 10мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл
секундомер
спиртовка
карандаш по стеклу
1%-ный раствор яичного белка
1%-ный раствор глицина
1%-ный раствор в - аланина
0,5% -ный раствор нингидрина
0,2%-ный раствор нингидрина
0,1%-ный раствор гликокола
3 шт.
3шт.
1шт.
1 шт.
3шт.
1шт.
1шт.
1шт.
1мл.
1мл.
1мл.
0,5мл.
0,5мл
0,5мл
Биуретовая реакция:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1мл
пипетка градуированная на 2 мл
секундомер
карандаш по стеклу
1%-ный раствор яичного белка
10%-ный раствор едкого натра
1%-ный раствор сульфата меди
1шт
1шт
1шт
1шт
2шт
1шт
1шт.
1шт
1мл
2мл
0,5мл
Ксантопротеиновая реакция:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл
спиртовка
карандаш по стеклу
1%-ный раствор яичного белка
1%-ный раствор желатина
1%-ный раствор триптофана
3шт.
3шт.
1шт.
1шт
4шт
2шт
1шт.
1мл
1мл
1мл
32
концентрированная азотная кислота
30%-ный раствор едкого натра
0,5мл
1мл
Реакция Адамкевича-Гопкинса:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл
пипетка градуированная на 2 мл
спиртовка
карандаш по стеклу
1%-ный раствор яичного белка
1%-ный раствор желатина
0,1%-ный раствор триптофана
концентрированная уксусная кислота
концентрированная серная кислота
3шт
3шт
1шт
1шт
4шт
1шт
2шт
1шт
1мл
1мл
1мл
1-2мл
2мл
Реакция Фоля:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл
спиртовка
карандаш по стеклу
2шт
2шт
1шт
1шт
4шт
2шт
1шт
1%-ный раствор яичного белка
1мл
1%-ный раствор желатина
1мл
30%-ный раствор едкого натра
5%-ный раствор уксуснокислого свинца
0,4% раствор цистеина
10%-ный раствор яичного белка
1мл
1мл
0,5мл
0,5мл
Реакция Милона:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл; 2мл
спиртовка
карандаш по стеклу
2шт
2шт
1шт
1шт
1шт
2шт
1шт
33
концентрированный раствор тирозина
реактив Миллона
Реакция Сакагучи:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл; 2мл
карандаш по стеклу
1%-ный раствор яичного белка
2мл
1мл
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
0,5мл
1%-ный раствор желатина
0,5мл
10%-ный раствор едкого натра
0,1%-ный спиртовой раствор а- нафтола
2%-ный раствор гипобромита натрия
0,1%-ный раствор аргинина
10%-ный раствор яичного белка
0,5мл
0,5мл
0,5мл
0,5мл
0,5мл
Реакция Ваузена:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл; 2мл
пипетка градуированная на 10мл
сосуд со льдом
1%-ный раствор яичного белка
2,5%-ный раствор формальдегида
0,5%-ный раствор нитрита натрия
концентрированная серная кислота
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
2мл
0,5мл
1мл
6мл
Реакция Паули:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл; 6 мл
пипетка градуированная на 2мл
карандаш по стеклу
1%-ный раствор сульфаниловой кислоты
1%-ный раствор яичного белка
10%-ный раствор карбоната натрия
0,1%-ный раствор гистидина
0,5%-ный раствор нитрита натрия
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
2шт
1шт
1мл
2мл
6мл
….
2мл
34
Реакция Гопкинса-Коле:
водяная баня со штативом для пробирок
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл
пипетка градуированная на 5мл;
сосуд со льдом
0,005%-ный раствор триптофана
раствор глиоксиловой кислоты
0,04 М раствор сульфата меди (II)
серная кислота (конц.)
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
3шт
1шт
1шт
1мл
1мл
1мл
2-3мл
Реакция Мак-Карти и Салливана:
водяная баня (со штативом для пробирок)
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка градуированная на 1 мл
пипетка градуированная на 5мл
секундомер
сосуд со льдом
0,02н раствор метионина
14,3 н раствор гидроксида натрия
10%-ный раствор нитропруссида натрия
смесь соляной и фосфорной кислоты
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
2шт
2шт
1шт
1шт
5мл
1мл
0,3мл
5мл
Реакция Циммермана:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
штатив для пипеток
пипетка, градуированная на 1 мл; 2мл
1%-ный раствор глицина
10%-ный раствор едкого натра
раствор о- фталевого диальдегида
индикаторная бумага
1шт
1шт
1шт
1шт
1шт
2мл
….
0,5мл
1шт
Реакция Шульца-Распайля:
пробирка на 10 мл
штатив для пробирок
штатив для пипеток
2шт
1шт
1шт
35
пипетка градуированная на 1 мл;
карандаш по стеклу
0,1%-ный раствор сахарозы
серная кислота (конц.)
10%-ный раствор яичного белка
0,3%-ный раствор триптофана
3шт
1шт
0,5мл
1мл
0,5мл
0,5мл
Реакция Сёренса:
пробирка на 10 мл
штатив для пробирок
пипетка градуированная на 1 мл;
штатив для пипеток
1%-ный раствор глицина
раствор метиловый красный (индикатор)
40%-ный раствор формалина
1шт
1шт
3шт
1шт
1мл
1мл
1мл
Реакция Фолина:
пробирка на 10 мл
штатив для пробирок
пипетка градуированная на 1 мл;
штатив для пипеток
карандаш по стеклу
реактив Фолина
10%-ный раствор едкого натра
0,05%-ный раствор тирозина
раствор яичного белка
2%-ный раствор фенола
3шт
1шт
5шт
1шт
1шт
0,5мл
0,5мл
0,5мл
0,5мл
0,5мл
Реакция с нитропруссидом натрия:
пробирка на 10 мл
держатель для пробирок
штатив для пробирок
пипетка градуированная на 1 мл;
штатив для пипеток
секундомер
спиртовка
карандаш по стеклу(разного цвета)
10%-ный раствор яичного белка
0,1%-ный раствор цистина
30%-ный раствор едкого натра
10%-ный раствор нитропруссида натрия
2шт
2шт
1шт
4шт
1шт
1шт
1шт
2шт
0,5мл
0,5мл
0,5мл
0,2мл
36
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ермаков А.Н, Арасимович В.В, Смирнова-Иконникова М.И, Мири И.К. Методы биохимического исследования растений. – М.: 1976. – 520 с.
2. Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. –
с.59.
3. Гамаюрова А.А., Ржечицкая Л.Э. Пищевая химия / Лабораторный практикум. – М.: 2006. – 136 с.
4. Полянская А.С, Шевелева А.О. Аминокислоты и белки / Методическая разработка по лабораторным работам. – Л.: 1976. –37 с.
5. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. – М.: Феникс, 1999. – 544 с.
6. Розанцев Э.Г. и др. Пищевая химия / Цупак Л.Е., Симбирева Е.И., Макарова
М.П., Чернышёва Т.И., Бойко В.В., Брусникина Л.И. / Методические указания. – М.: 1993. – 63 с.
7. Комов В.П. Биохимия: учебник для вузов – М.: Дрофа 2004. – 638 с.
8. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е, Кочеткова А.А. Пищевая химия / Под ред.
А.А. Нечаева. Издание 3-е испр. – СПб: ГИОРД, 2004. – 640 с.
9. Филлипович Ю.Б, Егорова Т.А, Севастьянова Г.А. Практикум по общей
биохимии. – М.: 1982. –311 с.
10. Чиркин А.А. Практикум по биохимии. – М.: Новое знание, 2002. – 512 с.
11. Шарпенак А.Э, Конышев В.А. Практикум по биологической химии. – М.:
Высшая школа, 1969. – 304 с.
12. Яковлева М.Н., Осташкова В.В. Биохимия белков / Методические указания
к лабораторным занятиям по биологической химии. – Петрозаводск: 1999. –
27 с.
37
38
39
40