Цель данной работы – создание ... для определения протективных антител на ...

Цель данной работы – создание лабораторной тест-системы
для определения протективных антител на основе твердофазного
иммуноферментного анализа (ИФА).
Описание принципа действия. В качестве ферментной метки в
наборе будет применяться пероксидаза хрена. В течение первой инкубации антитела пациента класса G против вируса краснухи связываются с антигеном вируса, адсорбированном на твердой фазе (в
лунках планшета). Данный антиген представляет собой рекомбинантный белок, содержащий только те последовательности, к которым вырабатываются протективные антитела. Несвязавшийся
материал удаляется с помощью промывки. В течение следующей
инкубации антитела против IgG человека, меченые пероксидазой
хрена, взаимодействуют с комплексом, образованным антигеном вируса краснухи и антителом. После цикла промывок в лунки добавляется раствор ТМБ, что приводит к появлению окрашивания раствора
под воздействием фермента. Реакция останавливается добавлением
Стоп-реагента (HCl). Интенсивность окрашивания раствора измеряется на спектрофотометре при длине волны 450 или 405 нм. Содержание антител класса G в образцах и калибраторах прямо
пропорционально измеренной интенсивности окраски раствора.
В. Н. Сухоруков
Проблема устойчивости растений картофеля
к патогенам и способы ее решения
Картофель (Solanum tuberosum) является самой важной незерновой продовольственной культурой в мире и четвертой самой важной после пшеницы, риса и кукурузы (Lang, 2001). Поэтому
проблема получения растений картофеля, устойчивых к различного
рода патогенам, по-прежнему остро стоит перед исследователями,
несмотря на успехи, достигнутые в последние годы. Такие патогены,
как род Phytophthora, вирусы, бактерии Erwinia spp., а также различные нематоды ежегодно наносят ощутимый ущерб урожаю картофеля. Помимо традиционных приемов селекции для отбора
устойчивых к тому или иному патогену растений, перспективным является использование биотехнологических методов. Как правило, в
отношении такого патогена растений, как P. infestans (возбудитель
фитофтороза), селекционные методы работы направлены на интродукцию в культурные растения генов устойчивости к заболеванию
(R-генов) от дикорастущих видов растений. R-гены являются необходимыми для развития так называемой вертикальной устойчивости, которая, однако, сравнительно быстро преодолевается
235
патогеном за один-два сезона. Более надежной представляется получение форм растений с горизонтальным типом устойчивости. Показано, что на устойчивость растений к патогенам (а также
абиотическим факторам среды) влияет физиологический статус
растения, например, гормональный баланс, содержание вторичных
метаболитов, фитостеринов и т. д.
Устойчивость растений к патогенам заключается в распознавании атакующего организма и запуска различных защитных реакций,
таких как укрепление клеточной стенки, программируемая клеточная
гибель (реакция сверхчувствительности) и производство активных
форм кислорода и других антимикробных веществ (фитоалексинов,
патоген-зависимых (PR) белков). Заражение патогеном также может
индуцировать системную приобретенную устойчивость, защищающую растение от последующих атак одних и тех же патогенов или
других их видов. На генетическом уровне устойчивость может быть
обусловлена единичными генами (вертикальная устойчивость) или
QTL (локусы количественной изменчивости) (горизонтальная устойчивость) (McDowell и Woffenden, 2003). Оба типа устойчивости используют для получения устойчивых к фитофторозу сортов
картофеля.
Культурный картофель вывели из небольшого числа диких растений, т. е., он имеет относительно узкое экогеографическое происхождение, следовательно, культурный картофель получил
небольшую часть вариантов генов, определяющих устойчивость к
патогенам, приспособленность к факторам окружающей среды, и
именно поэтому культурные растения картофеля обладают ограниченной устойчивостью к различным патогенам и условиям окружающей среды. Тогда как дикорастущие виды картофеля растут в
различных климатических зонах и сохраняют устойчивость к широкому кругу патогенных организмов. Потеря устойчивости к патогенам культурного картофеля в частности и культурных растений в
целом закономерна и понятна, так как, сознательно и бессознательно ведя селекцию на протяжении сотен лет, человек в первую очередь отбирал полезные для себя свойства, такие как урожайность,
длительность хранения и питательные свойства. Становясь «вкуснее», растения частично или полностью утрачивали устойчивость к
патогенам (Mullins et al., 2006). И только в последние десятилетия
селекция картофеля направлена и на выведение устойчивых сортов
картофеля. При этом стоит заметить, что устойчивость к патогенам
далеко не самый главный признак, которому уделяется внимание
при выборе сорта для массового выращивания, гораздо большее
значение имеют такие признаки, как урожайность и способность к
хранению. По этой причине при выращивании картофеля очень ча236
сто пренебрегают его устойчивостью к патогенам, если потребительские свойства развиты лучше (Widmark, 2010).
Патогены не могут легко поражать растения, так как оно не пассивно к атакам извне, а имеет набор физических и химических преград, которые многие потенциальные патогены преодолеть не в
состоянии. Существуют два типа защиты от патогенов: активная и
конститутивная. В арсенал конститутивной защиты входят такие механизмы, как утолщение кутикул и постоянный синтез вторичных
механизмов. Конститутивная защита обеспечивает защиту растения
на протяжении всей его жизни. Активная же защита, напротив, не
запускается до момента атаки патогеном растения. Активная защита лежит в основе двух разных типов устойчивости растений: горизонтальной (полевой, основной) и вертикальной (расоспецифичной).
Вертикальная устойчивость, также называемая расоспецифичной устойчивостью, основана на взаимодействии «ген-на-ген». Концепция «ген-на-ген» Флора (Flor, 1971) основана на том, что
каждому хозяйскому гену устойчивости растений (R) соответствует
авирулентный ген патогена (Avr). Как результат включается реакция
сверхчувствительности (СВЧ) и инфицированные, а также расположенные рядом клетки подвергаются апоптозу, который может
предотвратить дальнейший рост биотрофных и полубиотрофных
патогенов, таких как P. infestans (Dangl et al., 2001). Существуют
разные биохимические интерпретации модели «ген-на-ген». Согласно модели «стража» (“guard”) (Dangl and Jones, 2001), R-белок
физически связывается с клеточными мишенями продуктов Avr-гена
(также называемые эффекторами) и защищает их от действия патогена. Каждое из связываний R-белка с белком-мишенью может происходить конститутивно, но высвобождение при связывании
эффектора с его мишенью приводит к активации R-белка и к началу
защитной реакции, или же взаимодействие между мишенью и эффектором может изменить конформацию мишени, увеличивая сродство комплекса к R-белку, приводящее к связыванию R-белка и
запускающее защиту. R-гены не так быстро эволюционируют и не
так полиморфны, как принято считать в случае с защитными рецепторами, некоторые из них, по-видимому, являются древними в эволюционном плане (Sliwka, 2004).
Второй тип устойчивости называется горизонтальной или полевой устойчивостью, и в отличие от первого типа она полигенна. Этот
тип устойчивости приводит к снижению эффективности инфицирования, понижая уровень колонизации хозяйских тканей и ограничивая рост патогена. Горизонтальная устойчивость считается более
долговечной, чем вертикальная, и она нерасоспецифична, следовательно, такой быстро эволюционирующий патоген, как P. Infestans,
не может легко ее преодолеть (Pieterse et al., 1992). Ее долговеч237
ность основана на том, что патогены испытывают меньшее селекционное давление, так как растение не является полностью невосприимчивым к патогенам. Еще больше снизить селекционное
давление и тем самым повысить стабильность устойчивости растений можно, высаживая вместе устойчивые и восприимчивые к патогенам растения. Сравнивая типы устойчивости, можно также
говорить о разных сторонах единого процесса. Специфичные Rгены необходимы и достаточны для устойчивости к определенной
расе патогенов, но когда эта защита не срабатывает, на первый
план выходят механизмы горизонтальной устойчивости. Если патогену удается преодолеть этот последний рубеж, то тогда можно говорить, что данное растение восприимчиво к данному типу
патогена. Есть несколько стратегий (Widmark, 2010), которые применяют патогены, чтобы заразить растение: избегание узнавания
защитными системами растения или же подавление защитного ответа растения.
Механизмы горизонтальной и вертикальной устойчивости используют для получения устойчивых к фитофторозу сортов картофеля. В современной науке существуют два принципиальных
подхода к селекции устойчивых сортов (Mullins et al., 2006).
Первый подход заключается в селекции новых сортов на основе
скрещивания растений с полезными признаками. Причем на основе
классической селекции время выведения нового сорта картофеля
занимает до пятнадцати лет. Тогда как селекция с применением генетических маркеров к генам, отвечающим за устойчивость, урожайность и другие полезные свойства, помогает сократить время
селекции нового сорта до нескольких лет.
Второй подход заключается в получении трансгенных растений
картофеля. Для этого используют агробактериальную трансформацию листьев, клубней или междоузлий, или прямую доставку гена в
ткани растения путем бомбардировки микрочастицами. Трансформации подвергается как ядерный, так и пластидный геном картофеля. Устойчивость достигается путем переноса в геном растения как
гомологичных генов устойчивости из дикорастущих видов картофеля, так и путем переноса гетерологичных генов. Например, устойчивость к колорадскому жуку (Leptinotarsa decemlineata) достигается
путем постоянной экспрессии гена Bt-токсина (Perlak et al., 1993;
Adang et al., 1993). В связи с ограниченным количеством и малой
эффективностью R-генов для борьбы с бактериями и грибами были
разработаны различные генетические конструкции, влияющие на
различные этапы взаимодействия патоген-хозяин, такие как: вызывание защитного ответа растений, ингибирование факторов вирулентности грибов или вирусов, а также конструкции для экспрессии
антимикробных соединений растительного и нерастительного
238
происхождения (Melchers and Stuiver, 2000; Osusky et al., 2005;
Rivero et al., 2012). Последний подход также используют и как один
из способов для борьбы с нематодами – создание трансгенного растения картофеля, экспрессирующего белок, блокирующий хеморецепцию цист нематод, что предотвращает поражение клубней
нематодами (Green et al., 2012). Для борьбы с вирусами наиболее
эффективно использование РНК-интерференции. Для этого в растения в составе специальных векторов вводят фрагмент какоголибо гена вируса (например, ген белковой оболочки вируса PVY
(Bravo-Almonacid et al., 2012). При экспрессии данных векторов в
клетках растений нарабатываются миРНК (малые интерферирующие РНК), посредством которых происходит запуск РНКинтерференции при попадании РНК вируса в растительную клетку.
Поиск и разработка методов по созданию растений картофеля,
устойчивых к патогенам, позволит не только получать растения,
устойчивые к целому ряду паразитических организмов, но и значительно снизить объемы фунгицидов и инсектицидов, активно используемых в настоящее время для борьбы с вышеупомянутыми
вредителями сельскохозяйственных культур. Более того, как известно, патогенные организмы довольно быстро приобретают
устойчивость к тем или иным химическим веществам, направленным на борьбу с ними, и необходимо постоянно искать альтернативные препараты, как правило, довольно вредные для
окружающей среды и даже самих растений. Производство же растений, устойчивых к средствам химической борьбы, не устраняет
неизбежное наличие ядов в тканях растений. Выращивание же
устойчивых растений картофеля позволит отказаться от использования вредных химических веществ, что в итоге положительно скажется на окружающей среде и здоровье людей.
Е. А. Чистякова, А. А. Сазанов
Создание программного обеспечения
для геномной диагностики и персонализованной медицины
Наследственная патология – отклонение от нормы с установленным фактом наследования, т. е. передачи от поколения к поколению.
Следует
различать
врожденную
патологию
–
присутствующую от рождения индивидуума – от наследственной.
Врожденная патология может быть обусловлена действием факторов внешней среды – недостатком питательных веществ и кислорода во время внутриутробного развития, родовыми травмами,
инфекциями и т. д. Установление в соответствии с требованиями
239