иммуногистохимическая характеристика дуоденальной язвы у

ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
УДК 616.33002:611.018.2053.6
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ДУОДЕНАЛЬНОЙ ЯЗВЫ У ПОДРОСТКОВ
Л.А. Страшок, И.В. Сорокина, Н.И. Горголь
Харьковская медицинская академия последипломного образования
Харьковский государственный медицинский университет
Ключевые слова: язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, слизистая оболочка желудка,
слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки, иммуногистохимическое исследование, цитокины,
коллаген, подростки.
звенная болезнь двенадцатиперстной кишки
(ЯБДК) — хроническое заболевание с полицикли
ческим течением, характеризующееся возникновением
язвенного дефекта в слизистой оболочке двенадцати
перстной кишки. Согласно современной точке зрения
дуоденальная язва формируется в результате масси
рованного воздействия комплекса различных экзо и
эндогенных факторов: психоэмоциональных, психосо
циальных, генетических, конституциональных и др.
Морфологическим субстратом язвенной болезни
является хроническая рецидивирующая язва. Про
цесс формирования острой язвы чаще всего закан
чивается анатомическим излечением, сопровождаю
щимся маловыраженной тенденцией к развитию со
единительной ткани. Нарушение репаративных про
цессов ведет к хронизации язвенного дефекта. Оп
тимальным результатом репаративной регенерации
является реституция. Такое возможно при воспали
тельных, эрозивных повреждениях, но не может про
исходить при язвенном дефекте. Полнота регенера
ции определяется качеством заживления, то есть
степенью восстановления архитектоники слизистой
оболочки желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной
кишки (СОДК). Обновление и восстановление тканей
тесно связаны с явлениями апоптоза [1, 3].
Хроническая язва отличается от острой большим
развитием фиброзной ткани и более выраженной
клеточной инфильтрацией у основания и по краям
язвы, а также постепенным прогрессирующим уп
лотнением ее краев и дна. Обострение язвенной бо
лезни даже в условиях благоприятного исхода ведет
к усилению рубцовых изменений и усугубляет нару
шение трофики тканей, в том числе и вновь образо
ванной рубцовой, которая при очередном обост
рении легко разрушается. Качество заживления во
многом зависит от типа коллагена, синтезирующего
ся в месте повреждения. При повышенной активнос
ти фибробластов продуцируется интерстициальный
коллаген 1го типа, формируется рубец, выходящий
за границы язвы. Это определяет низкое качество
заживления. Более благоприятная морфологическая
картина заживления содержится, если в области яз
вы определяется коллаген 3го типа. То есть понятие
«качество заживления» определяет не только полно
ту регенерации, но и прогноз заболевания [1, 3, 5].
Характерные изменения при язвенной болезни
наблюдаются также в зонах, отдаленных от язвы.
При этом увеличивается лимфоидная, макрофагеаль
Я
20
ная и гранулоцитарная инфильтрация собственной
пластинки слизистой оболочки (СО). Это свидетельст
вует об активности иммунной системы и обуслов
лено антигенными свойствами продуктов распада
дна язвы, вирусов и микроорганизмов, а также обра
зованием аутоантител. Клетки воспалительного ин
фильтрата синтезируют медиаторы — цитокины. Это
белковые или полипептидные молекулы, вырабаты
ваемые преимущественно активированными клетка
ми иммунной системы, лишенные специфичности в
отношении антигенов и являющиеся медиаторами
межклеточных коммуникаций при иммунном ответе,
гемопоэзе, воспалении, а также межсистемных
взаимодействиях. К ним относятся интерлейкины
(ИЛ 1—16), колониестимулирующие факторы (КСФ),
интерфероны с противовирусной активностью (ИФНα,
β, γ), факторы некроза опухоли (ФНОα, β) [2, 4].
Гистологические и гистохимические особенности
СОЖ и СОДК зависят от формы заболевания, а степень
этих изменений возрастает при хроническом течении
заболевания. Таким образом, изучение морфологичес
ких и иммуногистохимических изменений в СОЖ и
СОДК при язвенной болезни раскрывает морфо, пато,
и саногенез язвенной болезни, подтверждает синер
гизм действия как повреждающих агентов, так и меха
низмов неспецифической и иммунной защиты.
Цель исследования — изучение морфологических
и иммуногистохимических проявлений язвы двенад
цатиперстной кишки у подростков.
Материалы и методы исследования
Мы наблюдали 54 больных ЯБДК в возрасте от 15
до 17 лет (32 юноши, 22 девушки). Диагноз верифи
цирован на основании клиникоанамнестического и
эндоскопического исследований. У 18 из них эзофаго
гастродуоденоскопия проведена с забором гастро
биоптатов и биоптатов двенадцатиперстной кишки.
Депарафинированные срезы окрашивали гематокси
лином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону. Ри
бонуклеопротеиды (РНП) выявляли окраской по ме
тоду Браше. Для оценки состояния стромального
компонента и слизистого барьера СО исследовали в
биоптатах комплекс гликозамингликанов. Кислые
гликозамингликаны (ГАГ) выявляли с помощью окра
шивания альциановым синим. С помощью PASреак
ции выявляли нейтральные гликозаминогликаны.
Гистологический диагноз устанавливали на осно
вании модифицированной Сиднейской системы [1,
Сучасна гастроентерологія, № 2 (34), 2007 р.
ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
3]. Количественную оценку состояния СОЖ и СОДК в
биоптатах проводили морфометрически с помощью
компьютерного цитоанализатора Olympus BX41,
окуляра микрометра АМ9—2, окулярной линейки и
сетки Г.Г. Автандилова (1991), что позволило опреде
лить толщину слизи, высоту покровного эпителия и
степень обсемененности Helicolacter pylori (Н. pylori).
Иммуногистохимическое исследование проводили
на парафиновых срезах толщиной 5—6 мкм непря
мым методом Кунса по методике Brosman. Иммун
ные клетки дифференцировали с помощью монокло
нальных антител (МКА) к различным типам клеток
фирмы Chemicon, USA. Использовали МКА против
ИЛ1, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОα. Апоптоз определяли с
МКА CD95 (Novocastra Laboratories Ltd.). В качестве
люминесцентной метки использовали F (ab)2 —
фрагменты кроличьих антител против иммуноглобу
линов мыши, меченных ФИТЦ. Препараты изучали с
помощью люминесцентного микроскопа МЛ2 с ис
пользованием светофильтров: ФС1 и ФС2, СЗС
24, БС8 и БС2, УФС6 и УФС3. Коллагены типиро
вали моноклональными антителами (МКА) к коллаге
нам 1го и 4го типов (Novocastra Laboratories Ltd.).
Коллаген 3го типа определяли с использованием
МКА к коллагену 3го типа (Imtek, Ltd, Россия). Ин
тенсивность свечения коллагенов изучали на мик
рофлюориметре с ФЭУ35 и выражали в условных
единицах, равных току, протекающему через изме
рительный прибор (мка).
Результаты иммуногистохимического исследова
ния СОЖ и СОДК сравнивали с аналогичными пока
зателями у подростков при хроническом гастродуо
дените (ХГД).
Результаты и их обсуждение
Язвенному поражению двенадцатиперстной кишки
всегда сопутствовал поверхностный гастрит. При этом
антральный гастрит отмечен во всех наблюдениях, а
фундальный — у 11 пациентов (61%). Гистологически
в СО антрального отдела желудка глубоких морфоло
гических изменений не наблюдалось. Антральный гас
трит был поверхностным и характеризовался уме
ренно выраженной активностью: выявляли инфиль
трацию собственной пластинки лимфоцитами, плаз
матическими клетками, клеткамипродуцентами ИЛ1,
ИЛ4, ИЛ6, единичными клеткамипродуцентами
ФНОα и нейтрофильными гранулоцитами, выражен
ным лейкопедезом эпителиального пласта. Особен
ностью изменений СО желудка при локализации яз
венного дефекта в двенадцатиперстной кишке явля
лась интенсивная и распространенная лимфоиднок
леточная инфильтрация СО с образованием довольно
крупных лимфоидных фолликулов с зародышевыми
центрами. Степень инфильтрации СОЖ клетками —
продуцентами цитокинов представлена в табл. 1.
Морфометрическое исследование показало, что
толщина слоя слизи, покрывающей эпителий СО
антрального отдела, в среднем составила (130,4 ±
1,07) мкм при норме (149 ± 6,6) мкм, а высота эпите
лия — (28,61 ± 0,49) мкм при норме (30,22 ± 0,87) мкм.
В муцине, располагающемся на покровном эпителии
СО, выявляли ослабление реакции на ГАГ с уси
ленной десквамацией поверхностного эпителия.
Кроме этого, снизился синтез мукополисахаридов
эпителиальными клетками. При окрашивании альци
ановым синим муцин обнаруживался в перинуклеар
ной зоне эпителиоцитов. Апоптозный индекс эпите
лиоцитов СОЖ составил 2,9 ± 0,9 (см. табл. 1).
Иммуногистохимически в базальной мембране
эпителия идентифицирован свойственный ей колла
ген 4го типа в виде свечения умеренной интенсив
ности. При нарастании активности гастрита наблю
далось неравномерное свечение этого коллагена,
когда участки слабого свечения чередовались с зо
нами умеренного и яркого. Кроме того, очагово от
мечалась «смазанность» структуры коллагена. В
строме собственной пластинки выявлены интерсти
циальные коллагены — коллаген 1го и 3го типов.
Они выявлялись в виде слабого, местами умерен
ного диффузного свечения (как сеточка). Средний
показатель интенсивности свечения этих коллагенов
приведен в табл. 2.
H. pylori обнаруживали в СОЖ у 12 (67%) больных.
Степень обсемененности Н. pylori была различной, у
20% — слабой, а в 40% — умеренной и выраженной.
В теле желудка Н. pylori выявлены лишь у 5 пациентов
Таблица 1. Относительное количество основных клонов клеток — продуцентов цитокинов —
и индекс апоптоза эпителиоцитов в воспалительном инфильтрате СОЖ
Патология
ИЛ81
ИЛ84
ИЛ86
ФНО8α
Индекс апоптоза
ХГД
14,2 ± 2,9
9,1 ± 1,5
13,5 ± 1,6
2,2 ± 0,9
2,5 ± 0,4
ЯБДК
17,5 ± 2,8
12,5 ± 3,0
18,7 ± 4,0
1,8 ± 0,7
2,9 ± 0,9
Примечание. Увеличение 400 в пересчете на 100 клеток.
Таблица 2. Интенсивность свечения коллагена в поле зрения в собственной пластинке СОЖ и СОДК, мкa
Патология
СОЖ
СОДК
Коллаген 18го типа Коллаген 38го типа Коллаген 18го типа Коллаген 38го типа
ХГД
18,55 ± 3,4
26,4 ± 5,8
13,0 ± 2,9
20,0 ± 4,4
ЯБДК
9,33 ± 1,9*
11,0 ± 2,9*
7,3 ± 1,8*
12,0 ± 3,0*
Примечание. Увеличение в 600 раз.
* Р < 0,05 по сравнению с ХГД.
Сучасна гастроентерологія, № 2 (34), 2007 р.
21
ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
(27%). Степень обсемененности чаще была слабой
(80%), а в 1 наблюдении — умеренной. Н. pylori лока
лизовались в толще слизи, покрывающей эпителий, и
на поверхности эпителия. Эпителиоциты, на поверх
ности которых располагались Н. pylori, уплощались,
содержание в них мукоида уменьшалось. Снижение
муцинообразующей функции покровноямочного эпи
телия снижало адаптационные возможности СО и в
сочетании с другими факторами способствовало яз
вообразованию. В желудочных ямках и железах
Н. pylori находились в слизи и не соприкасались с
покровным эпителием. Довольно редко выявляли
Н. pylori в межклеточных пространствах и чаще выяв
лялись у пациентов с более длительным язвенным
анамнезом. При локализации Н. pylori в расширенных
межклеточных пространствах изменения в покровном
эпителии были наиболее выражены. Они характери
зовались дистрофическими изменениями в виде ва
куолизации цитоплазмы эпителиоцитов, пикноза или
просветления ядер, сопровождались отторжением
эпителия, иногда с формированием микроэрозий. Су
бэпителиальная базальная мембрана в таких участках
утолщена, разрыхлена, неравномерно PASпозитивна.
При исследовании сосудистого компонента СОЖ
обращали внимание на расширение сосудов микро
циркуляторного русла, их полнокровие, стазы, слад
жи и микротромбы. В периваскулярной ткани отме
чались отек, диапедезные кровоизлияния и некро
биотические изменения соединительной ткани.
В периульцерозной зоне в период обострения
ЯБДК наблюдался хронический поверхностный дуо
денит, который в 16 (82%) случаях имел умеренную
активность, а в 2 (18%) — был выраженным.
Хронический поверхностный дуоденит характери
зовался укорочением ворсинок и углублением крипт,
уплощением покровного эпителия, увеличением ко
личества бокаловидных клеток, а также диффузной
инфильтрацией собственной пластинки лимфоцита
ми, плазматическими клетками и нейтрофильными
гранулоцитами, образованием лимфоидных фолли
кулов, отеком стромы, полнокровием и стазами со
судов микроциркуляторного русла, появлением
очагов желудочной метаплазии покровного эпи
телия. Среди клеток воспалительного инфильтрата
выявляли клеткипродуценты цитокинов — чаще ИЛ1,
ИЛ4, ИЛ6, реже — ФНОα. Степень инфильтрации
СОДК клетками — продуцентами цитокинов — пред
ставлена в табл. 3.
Умеренно выраженный дуоденит характеризовался
уплощением эпителия, высота которого составила
(30,78 ± 0,84) мкм; в норме (32,22 ± 0,87) мкм. Гис
тохимическое исследование показало, что при уме
ренно выраженном дуодените в бокаловидных клет
ках было снижено содержание нейтральных глико
протеинов. В каемке энтероцитов была ослаблена
PASреакция, что также свидетельствовало об
уменьшении в ней нейтральных гликопротеинов. При
окраске альциановым синим выявляли снижение
уровней ГАГ в каемке энтероцитов. Апоптозный ин
декс энтероцитов составил 3,2 ± 0,9 (см. табл. 3).
В отличие от умеренно выраженного, выраженный
дуоденит характеризовался очаговым разрастанием
соединительной ткани в собственной пластинке СО.
При этом выявляли оба типа интерстициальных кол
лагенов. Преобладал коллаген 3го типа, выявляю
щийся в виде свечения умеренной интенсивности
очагового характера. Коллаген 1го типа выявлялся в
виде очагового яркого свечения (см. табл. 2)
Что касается обсемененности СОДК Н. pylori, то
она была у 6 (33%) больных с умеренно выраженным
дуоденитом и явлениями желудочной метаплазии. В
окрашенных по РомановскомуГимзе препаратах
Н. pylori, как правило, располагались на поверхности
метаплазированного эпителия в периульцерозной
зоне. В межклеточных пространствах их не наблюда
ли. Степень обсемененности Н. pylori варьировала от
слабой (25%) до умеренной (75%).
Таким образом, ЯБДК всегда сопутствовал поверх
ностный активный гастрит. При этом поражение ант
рального отдела отмечено в 100% наблюдениях, а
фундального — в 61%. В СОЖ выявлены: неравно
мерное истончение слоя слизи с уменьшением со
держания ГАГ и гликопротеидов; обсемененность
Н. pylori; интенсивная десквамация эпителиоцитов и
усиление в них апоптозных изменений; разрыхление
базальной мембраны эпителия; интенсивная и рас
пространенная лимфоидноклеточная инфильтрация
с образованием лимфоидных фолликулов и высоким
содержанием клеток — продуцентов цитокинов. В
100% наблюдений в СОДК сочетались язвенное по
ражение и хронический поверхностный активный
дуоденит. Постоянно обнаруживаемые нарушения
микроциркуляции подтверждали, наряду с обсеме
ненностью Н. pylori и снижением муцинообразова
ния, их роль в генезе изъязвлений СОДК.
При дуоденальной язве у всех больных отмечалось
неравномерное свечение коллагена 4го типа в ба
зальной мембране, что отражает нарушение форми
рования коллагенового каркаса и способствует раз
витию дистрофических процессов. При ЯБДК, осо
бенно, в lamina propria двенадцатиперстной кишки,
выявлено снижение коллагенообразования. При этом
преобладал коллаген 3го типа над 1м. Коллаген 3го
типа считается «молодым», то есть созревающим.
Снижение синтеза и изменение соотношения интер
стициальных коллагенов, входящих в состав стро
Таблица 3. Относительное количество основных клонов клеток — продуцентов цитокинов —
и индекс апоптоза в воспалительном инфильтрате СОДК
Патология
ИЛ81
ИЛ84
ИЛ86
ФНО8α
Индекс апоптоза
ХГД
16,2 ± 2,0
13,2 ± 2,5
11,3 ± 2,6
1,5 ± 0,9
2,5 ± 0,6
ЯБДК
18,6 ± 3,5
16,65 ± 3,5
15,7 ± 3,6
1,7 ± 0,8
3,2 ± 0,9
Примечание. Увеличение 400 в пересчете на 100 клеток.
22
Сучасна гастроентерологія, № 2 (34), 2007 р.
ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
мальнососудистого компонента пищеварительного
канала, играет большую роль в обеспечении трофики
эпителиального компонента. Нарушение созревания
стромы СОЖ и СОДК приводит к усилению дистро
фических процессов в эпителии и активации апоп
тоза. С другой стороны, преобладание в базальной
мембране коллагена 3го типа может способствовать
более качественному заживлению язвенного дефек
та. Действительно, у подростков реже наблюдаются
выраженная рубцовая деформация луковицы двенад
цатиперстной кишки и стенозирование.
В ульцерогенезе, повидимому, определенную
роль играет и цитокиновая система. Нами выявлена
тенденция к увеличению относительного количества
клетокпродуцентов ИЛ1, ИЛ4, ИЛ6 в составе вос
палительных инфильтратов при ЯБДК, по сравнению
с ХГД. Интересные результаты получены в отноше
нии клетокпродуцентов ФНОα. Относительное их
количество невелико по сравнению с количеством
клетокпродуцентов ИЛ1, ИЛ4 и ИЛ6. Некоторое
противоречие возникает при сопоставлении коли
чества клетокпродуцентов ИЛ1 и ФНОα. Обще
признан тот факт, что эти цитокины продуцируются
одной и той же популяцией клеток. Это типичные
провоспалительные цитокины. В то же время, если
основными клеткамипродуцентами ИЛ1 являются
активированные макрофаги, то ФНОα синтезируют
в основном CD8лимфоциты, реже — CD4лимфоци
ты. Более того, среди CD4лимфоцитов ФНОα про
дуцируют Th1, а Th2 продуцируют преимущественно
ИЛ4. В наших исследованиях продукция ИЛ4 повы
шена. Повидимому, это можно объяснить именно
CD4Th2 лимфоидной инфильтрацией СОЖ и СОДК.
С другой стороны, для детей и подростков характер
ны особенности эндокринного гомеостаза. В отно
шении эндокринной регуляции цитокиновой системы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологичес
кая диагностика болезней желудка и кишечника.— М: Триа
даХ, 1998.— 483 с.
2. Игнатьева Г.А. Иммунная система и патология // Па
тол. физиол. и экспер. терап.— 1998.— № 1.— С. 35—41.
3. Di Leo V., Yang PC., Berin M.C., Perdue M.H. Factors re
gulating the effect of IL4 on intestinal epithelial barrier function
// Int. Arch. Allergy, Immunol.— 2002.— 129 (3).— Р. 219—227.
4. Dixon M., Genta R., Yardley J. Classification and grading of
в литературе есть лишь единичные работы. В част
ности, кортизол способен блокировать рецепторы
клетокпродуцентов ФНОα, оставляя открытыми ре
цепторы к ИЛ1. Возможно, и другие гормоны спо
собны видоизменять секрецию цитокинов, повышая
экспрессию одних и понижая других [4, 7].
В наших исследованиях доказано усиление апоп
тоза в эпителии СОЖ и СОДК при ЯБДК по сравнению
с хроническим гастродуоденитом. При воспалении
апоптоз эпителиоцитов может активизироваться ци
токиновой системой. Имеются сведения об усилении
апоптоза под влиянием ИЛ1, ИЛ4 и ФНОα [2, 6, 7].
Выводы
1. При ЯБДК у подростков отмечаются выражен
ные нарушения в коллагенообразовании — как коли
чественного, так и качественного характера. Это мо
жет быть одной из основных причин возникновения и
прогрессирования деструктивных процессов.
2. В СОЖ и СОДК при ЯБДК среди элементов воспа
лительной инфильтрации возрастает относительное
количество клетокпродуцентов ИЛ1, ИЛ4, ИЛ6, тог
да как клеткипродуценты ФНОα немногочисленны.
3. Следствием выраженного воспалительного про
цесса и активации цитокиновой системы является
усиление апоптоза эпителиоцитов как в СОЖ, так и в
СОДК.
4. ЯБДК у подростков сопровождается в 100% слу
чаев хроническим поверхностным антральным гаст
ритом. Пангастрит выявляют у 61% больных. У ос
тальных пациентов выявлен хронический поверх
ностный дуоденит с явлениями желудочной метапла
зии и умеренной активностью.
5. Обсемененность H. pylori выявляют у 67% боль
ных, чаще в антральном отделе желудка. В СОДК
H. pylori выявлены у 30% больных.
gastritis // Am. J. Surg. Pathol.— 1996.— Vol. 20.— Р. 1161—1181.
5. Gillessen A., Voss B., Rauterberg J. Distribution of collagen
types I, III, and IV in peptic ulcer and normal gastric mucosa in
man // Scand. J. Gastroenterol.— 1993.— 28 (8).— Р. 688—689.
6. Majori M., Caminati A., Nokamura Y. et al. Tcell cytokine
pattern at three time points during specific immunotherapy for
mitesensitive asthma // Clin. Exp. Allergy.— 2000.— Vol. 30,
N 3.— P. 341—347.
7. Tommeras K., Cabero J.L., Mardh S. Expression of extra
cellular matrix proteins in the fetal rat gastric mucosa. // Anat.
Embryol. (Berl).— 2000.— 201 (3).— Р. 149.
ІМУНОГІСТОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДУОДЕНАЛЬНОЇ ВИРАЗКИ У ПІДЛІТКІВ
Л.А. Страшок, І.В.Сорокіна, Н.І. Горголь
У підлітків з виразкою дванадцятипалої кишки виявлено якісні та кількісні порушення синтезу колагену у сли
зовій оболонці шлунка та дванадцятипалої кишки. У запальному інфільтраті зростає кількість клітин — проду
центів інтерлейкінів ІЛ1, ІЛ6 та ІЛ4. Клітин — продуцентів фактора некрозу пухлин — небагато. Виразка
дванадцятипалої кишки у підлітків супроводжується посиленням апоптозу.
IMMUNE HISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE DUODENAL ULCER IN ADOLESCENTS
L.A. Strashok, I.V. Sorokina, N.I. Gorgol
The qualitative and quantitative derangements of the collagen synthesis in the mucous membrane of the stomach
and duodenum were found in the adolescents with the duodenal ulcer. The number of the cell — producers IL1,
IL6 and IL4 increases in the inflammatory infiltration. TNF cellproducers are not numerous. Juveniles' duodenal
ulcer is accompanied by the apoptosis intensification.
Сучасна гастроентерологія, № 2 (34), 2007 р.
23