Лиманцева Людмила Алексеевна ЗОЛОТИСТАЯ

На правах рукописи
Лиманцева
Людмила Алексеевна
ЗОЛОТИСТАЯ КАРТОФЕЛЬНАЯ НЕМАТОДА
GLOBODERA ROSTOCHIENSIS В СЕВЕРОЗАПАДНОМ РЕГИОНЕ РФ: СОСТАВ
ПОПУЛЯЦИИ, ИСТОЧНИКИ И ДОНОРЫ
УСТОЙЧИВОСТИ
Шифр и наименование специальности:
06.01.07 – Защита растений
Автореферат
диссертации на соискание учѐной степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург - 2010
2
Диссертационная работа выполнена в Государственном научном
учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт защиты
растений Россельхозакадемии (ГНУ ВИЗР)
Научный руководитель:
кандидат сельскохозяйственных наук
Гуськова Людмила Алексеевна.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Тютерев Станислав Леонидович
кандидат сельскохозяйственных наук
Гаджиев Надим Махиш Оглы
Ведущее учреждение:
Государственное научное учреждение Всероссийский
научно-исследовательский институт растениеводства
им. Н.И.Вавилова (ГНУ ВИР)
Защита состоится 28 октября 2010 г. в 14 часов на заседании
диссертационного совета Д 006.015.01 при Всероссийском научноисследовательском институте защиты растений по адресу: 196608, г.
Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д.3.
Факс: (812)4705110 e-mail: [email protected], web-сайт:
vizrspb.narod.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского
научно-исследовательского института защиты растений РАСХН
Автореферат разослан ……сентября 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Г.А.Наседкина
3
Актуальность работы. Картофель поражают два близких по морфологии и
биологии вида цистообразующих нематод: золотистая картофельная Globodera
rostochiensis (Wollenweber, 1923) Skarbilovich, 1959 и бледная картофельная
Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975. У первого вида известно пять
патотипов (Ro 1-5) у второго - три (Pa 1-3). Важное различие видов и патотипов
заключается в способности их поражать определѐнные клоны некоторых видов
Solanum. Это является основой селекции нематодоустойчивых сортов
картофеля и их пространственного размещения, что принципиально решило
проблему борьбы с этими карантинными патогенами в ряде зарубежных стран.
В Северо-Западном регионе, как и в России в целом, обнаружен лишь вид G.
rostochiensis, представленный обычным патотипом Ro1. Это было установлено
более 20 лет назад (Гуськова, Маковская, 1982), когда количество очагов
нематоды было сравнительно небольшим, и они
располагались
преимущественно на приусадебных участках (Жиглова, 2003).
Современная карантинная ситуация региона – это 33 тыс. очагов (13 тыс.
га), расположенных во всех типах хозяйств всех шести административных
территорий (Справочник... , 2006, 2010). Широкого изучения современного
состава видов и патотипов популяций в регионе не проводилось. Однако это
весьма актуально в связи с высокой вредоносностью нематоды и как объекта
карантина, и как причины потерь урожая; с активной селекцией
нематодоустойчивых сортов картофеля в селекценртах региона, началом их
семеноводства и широкого возделывания; с возможным заносом цист бледной
картофельной нематоды и разных патотипов из зарубежных стран и
вероятностью внутрипопуляционной изменчивости.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в
определении современного состава популяции золотистой картофельной
нематоды в Северо-Западном регионе РФ, установлении наличия или
отсутствия бледной картофельной нематоды в регионе и в выделении
источников и доноров нематодоустойчивости картофеля на основе
иммунологического анализа его генетических ресурсов.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие
задачи:
1. Изучить
видовой
и
внутривидовой
состав
картофельных
цистообразующих нематод (КЦН) в Северо-Западном регионе РФ комплексом
методов: морфометрическим, ПЦР и биотеста с использованием растенийдифференциаторов.
2. Выделить новые источники нематодоустойчивости среди сортов,
простых и сложных гибридов картофеля мировой коллекции ВИР.
3. Изучить донорские свойства у перспективных источников
устойчивости.
4. Выделить новые устойчивые к золотистой картофельной нематоде,
патотип Ro1 сорта и гибриды картофеля, созданные селекционными
учреждениями региона (ЛенНИИСХ, фирма «ЛиГа»).
Научная новизна исследований. Показано, что в настоящее время в Северо-
4
Западном регионе РФ распространѐн один вид КЦН - золотистая картофельная
нематода Globodera rostochiensis Woll. et Scarb., представленный только
обычным патотипом Ro1.
Впервые в мировой практике выделены 18 источников устойчивости к
золотистой картофельной нематоде (патотип Ro1) среди гибридов, созданных
на основе диких видов Solanum alandiae Card., S. doddsii Corr., S. okadae Hawkes
et Hjerting. Впервые в России источники устойчивости обнаружены среди
гибридов, созданных с участием видов S. abancayense Ochoa, S. ambosinum
Ochoa, S. gandarillasii Card.
По результатам иммунологической оценки более 200 образцов картофеля
мировой коллекции ВИР выделен 141 новый источник нематодоустойчивости.
У семи источников наиболее перспективных по хозяйственно ценным
признакам выявлена высокая способность передачи устойчивости потомству, то
есть они являются донорами.
Практическая значимость работы. Выявленные источники и доноры
нематодоустойчивости могут быть использованы селекциоными учреждениями
для создания новых устойчивых сортов картофеля применительно к условиям
Северо-Западного региона РФ.
Установлена нематодоустойчивость нового сорта картофеля Сударыня, что
позволило оригинатору сорта (ЛНИИСХ) обосновать возможность включения
его в 2009 г. в "Государственный Реестр селекционных достижений,
допущенных к использованию" как нематодоустойчивого для возделывания в
зонах распространения золотистой картофельной нематоды.
Апробация работы и публикации результатов исследования. Результаты
работы были представлены: на втором всероссийском съезде по защите
растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем» (Санкт-Петербург, 2005);
на 1-ой научно-практической конференции "Проблемы энтомологии СевероКавказского региона" (Ставрополь, 2006); международной конференции
"Картофель России", (Москва, 2006); годичной научной сессии ВИЗР (СанктПетербург – Пушкин, 2007); I-ой Международной научной конференции
молодых учѐных и студентов «Медико-биологические и социальные проблемы
современного человека» (Тирасполь, 2007); международной научной
конференции молодых учѐных «Актуальные проблемы интегрированной
защиты растений» (Минск, 2007); VII международном нематологическом
симпозиуме «Нематоды естественных и трансформированных экосистем»
(Петрозаводск,
2007);
на
Всероссийской
научно-координационной
конференции «Использование мировых генетических ресурсов ВИР в создании
сортов картофеля нового поколения», посвящѐнной 100-летию со дня рождения
академика К.З.Будина (Санкт-Петербург, 2009); на научно-практической
конференции, посвящѐнной 120-летию со дня рождения А.Г.Лорха (МоскваКоренѐво, 2009); на Всероссийской научно-производственной конференции
"Современные иммунологические исследования, их роль в создании новых
сортов и интенсификации растениеводства" (Большие Вязѐмы, Московской
обл., 2009); на втором международном научно-практическом совещании
5
«Паразитические нематоды растений (биоразнообразие, изучение, коллекции)»
(Большие Вязѐмы, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в т.ч. 2 статьи в
реферируемом журнале.
Структура и объѐм диссертации. Диссертационная работа изложена на 102
страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, выводов и
списка литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 17 таблицами.
Библиография включает 217 источников, из них 132 на иностранном языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы
Приведены исторические и современные сведения по обнаружению,
распространѐнности, вредоносности и биологии золотистой и бледной
картофельных нематод. Дан анализ роли методов диагностики этих близких
видов в аспекте особого значения их для селекции устойчивых сортов
картофеля. Приведены сведения по успешному использованию их для борьбы в
зарубежных странах и СССР.
Глава 2. Материалы и методы исследований
Материалы. Для изучения состава популяций КЦН из 4 административных
областей Северо-Западного региона собраны 11 выборок: выборгская,
гатчинская, всеволжская, мшинская, волосовская, карташевская, суйдинская
(Ленинградская обл.), полесская, горбатовская (Калининградская обл.),
пыталовская (Псковская обл.), старорусская (Новгородская обл.). Кроме того,
использовали 1 выборку из самого восточного региона России (Камчатка) и 1 из
центральной части страны (Ивановской области). Морфометрические признаки
видов изучали на микропрепаратах срезов цист и личинок II возраста. Всего
изготовлено 650 микропрепаратов, из них 325 срезов анально-вульварной
(перенеальной) области цист и столько же личинок II возраста (по 25 для
каждого изолята). Всего проведено 1950 измерений и наблюдений
Вегетационные и полевые опыты проведены на искусственном инвазионном
фоне – почва с цистами вида G. rostochiensis патотипа Ro1 из лабораторной
смеси популяций.
Поиск источников устойчивости проведѐн среди материала ВИР с
различной степенью селекционной проработки - простые и сложные гибриды, а
также нематодоустойчивые сорта. Этот материал подобран и предложен для
испытания сотрудниками отдела генетических ресурсов картофеля Рогозиной
Е.В. и Костиной Л.И. Он был представлен клубнями.
Материалом для изучения донорских свойств гибридов служили сеянцы от
самоопыления 7 гибридов: 25-06, 28-06, 29-06, 24-1, 117-5, 135-4 (Оригинатор:
Колобаев В.А., ВИЗР) и 99-6-6 (Рогозина Е.В., ВИР). У последнего
дополнительно изучалось потомство от скрещивания с поражаемыми сортами.
Государственное испытание включает предварительное (вегетационное) и
основное (полевое). Нами оценено 45 перспективных гибридов селекции
6
ЛНИИСХ, ВИЗР и фирмы «ЛиГа» в предварительном испытании. Основное
государственное испытание прошли 3 гибрида и сорт Сударыня.
Методы работы с нематодами. Работу с нематодами (сбор популяций,
выделение цист из почвы, и нематод из корней, подготовка микропрепаратов,
определение плотности популяции) проводили классическими методами
(Гудей, 1959; Инструкция по выявлению…, 1988; Кирьянова, Кралль 1969;
Ryss, 2002; EPPO Bulletin 21, No. 30; EPPO Buletin PM 7/40 (2)).
Методы диагностики видов и патотипов. Для идентификации видов G.
rostochiensis и G. pallida организацией EPPO рекомендовано применять единые
методы для всех стран Европы: морфометрический, ПЦР и использование
растений-дифференциаторов. (EPPO Bulletin PM 7/40 (2), 2009). Последний из
них позволяет также разделять патотипы.
Метод
сравнительной
морфометрии
заключается
в
изучении
маловарьирующих внутри вида морфологических структур и сравнении их с
описаниями типовых образцов для данного вида. В этой работе мы
использовали шесть признаков у цист и личинок II возраста, рекомендованных
EPPO (EPPO Buletin PM 7/40 (2), 2009). У личинок это длина стилета и форма
его базальных бугров; у цист 4 признака: количество складок кутикулы между
анусом и фенестрой, диаметр фенестры, расстояние анус-фенестра, а также
индекс Гранека (отношение расстояния анус-фенестра к диаметру фенестры).
Для изучения анально-вульварной области цист и личинок готовили по 25
постоянных препаратов. Результаты измерений сравнивали с описанными
А.Стоуном (Stone, 1972). Все измерения и наблюдения проведены с
использованием микроскопов МБИ-15 и Carl Zeiss Axio Imager M1.
Микрофотографии получены с помощью микроскопа Carl Zeiss Axio Imager
M1. Статистическая обработка данных проведена методом главных компонент
(Karl Pearson, 1901; Пузаченко, 2004) с использованием пакета прикладных
компьютерных программ "Statistica, v.6.1".
Молекулярный метод видодиагностики нематод Для идентификации видов
нематод использовали ПЦР с видоспецифическими праймерами по Bulman,
Marshall (1997) (один из трѐх альтернативных, рекомендованых EPPO). Для
ПЦР-амплификации ДНК был использован один универсальный праймер ITS5
(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) и два специфических: PITSp4 для
Globodera pallida (5’-ACAACAGCAATCGTCGAG-3’) и PITr3 для G.
rostochiensis (5’-AGCGCAGACATGCCGCAA-3’).
Геномную ДНК выделяли кипячением из содержимого цист (яиц и
личинок). Сборка праймеров осуществлена фирмой «Бигль». Разделение
продуктов амплификации проведено методом электрофореза в 1,7% агарозном
геле в 0,5х ТБЕ буфере под напряжением 130V в течение 1,5 часа. Гели
окрашивали бромистым этидием. В качестве маркеров молекулярных масс
использовали GeneRulerTM 100kb DNA Ladder фирмы «Fermentas». Продукты
амплификации анализировали в ультрафиолетовом свете. Изображения
фотографировали цифровой фотокамерой Olympus EX-50 и переносили на
компьютер.
7
Метод использования растений-дифференциаторов. Патотипы нематод
определяют по их способности размножаться на соответствующих растенияхдифференциаторах (Kort et al., 1977). Для этого использовали международный
набор тест-растений, включающий 7 клонов видов картофеля c разной
степенью устойчивости: Solanum andigenum С.Р.С. 1673, S. kurtzianum КТТ
60.21.19, S. vernei G-LKS 58.1642/4, S. vernei (VTn)2 62.33.3, S. vernei 65.346/19,
S. vernei 69.1377/94, S. multidissectum Р 55/7 и восприимчивый вид S. tuberosum
(сорт Невский). Методика испытаний была следующей: в пластиковые сосуды
помещали 500см3 почвы, содержащей цисты изучаемых выборок. Инвазионная
нагрузка составляла 3 тыс. личинок/100 см3 почвы. В каждый сосуд
высаживали по одному клубню дифференциатора в трѐх повторностях.
Растения выращивали 65 дней (срок, достаточный для развития нового
поколения нематоды), после чего учитывали количество цист на корнях.
Испытание растительного материала. Поиск источников устойчивости и
изучение донорских свойств перспективных гибридов (сеянцев) проведѐны в
вегетационных опытах в трѐхкратной повторности. Клубни или сеянцы
картофеля высаживали по одному в полиэтиленовые сосуды объѐмом 500 см3.
Инвазионная нагрузка почвы составляла около 3 тыс. лич./100 см3. В качестве
поражаемого контроля был использован восприимчивый сорт картофеля –
Невский; устойчивым контролем служил сорт Латона. Растения
культивировали в течение двух месяцев. Учѐт цист новой генерации проведѐн
на "коме" корней (Понин, 1974). Применялась шкала, разделяющая растения по
устойчивости к картофельным цистообразующим нематодам на две группы:
устойчивые и поражаемые. К группе устойчивых относили растения, на корнях
которых цисты отсутствовали или было отмечено не более 5 пустых цист без
яиц и личинок. Остальные растения считались поражаемыми.
Государственное испытание 48 гибридов картофеля проведено в
соответствии с имеющимся Положением (1993). Работа выполнена на
экспериментальном участке опытного поля ВИЗР на фоне естественной
заселенности картофеля нематодой. Исходная заражѐнность почвы составляла
около 2500 лич./100 см3. Шкала оценки та же.
Методика изучения фенологии развития нематод в корнях.
Предназначенные для изучения новые нематодоустойчивые сорта картофеля
Сударыня, Лига, Наяда и поражаемый контроль Невский высаживали в
пределах естественного очага нематоды с инфекционным фоном около 3500
личинок на 100 см3 почвы. Каждые 3-4 дня выкапывали по 3 растения, корни
промывали и просматривали. У каждого растения брали по нескольку отрезков
корней общей длиной до 50 см. и выделяли нематод. Учитывали возраст
личинок, отмечали три градации: массовое заселение, единичные особи или их
отсутствие. С момента появления в корнях растений личинок III и IV возрастов
для анализа брали также почву из прикорневой зоны для выявления самцов
нематоды.
Глава 3. Состав популяции золотистой картофельной нематоды
8
3.1. Идентификация видов
Результаты
морфометрического
анализа.
Использовано
6
морфометрических признаков цист и личинок II возраста. Результаты изучения
цист по анализируемым признакам показывают широкие пределы видовой
нормы их варьирования. Выборки наиболее сильно различались между собой
по признакам диаметра фенестры и расстояния анус-фенестра. Однако из-за
большого разброса значений выборки по этим признакам нельзя чѐтко отнести
к одному из видов картофельных нематод – G. rostochiensis или G.pallida. Из
исследованных признаков у цист наиболее надежными для диагностики видов
цистообразующих нематод картофеля представляются индекс Гранека и
количество складок кутикулы между анусом и фенестрой. Это согласуется с
выводами С.А.Маковской (1976) и И.Н.Ананьевой (2005).
Для уточнения видовой принадлежности изученных особей по четырѐм
морфометрическим признакам цист использован статистический анализ по
методу главных компонент, позволяющий свести несколько признаков в один
совокупный признак. Результаты представлены на рис. 1. Показано, что по
комплексу изученных признаков популяции нематоды различаются между
собой, но все они относятся к виду G. rostochiensis.
По результатам анализа отмечены три выборки - старорусская, полесская и
горбатовская – как отличающиеся от остальных. Климатические и почвенные
условия Калининградской и Новгородской областей в сравнении с другими
областями Северо-Западного региона не имеют каких-либо резких отличий,
которые могли бы объяснить выявленные различия между популяциями.
Возможно, эти популяции имеют различное происхождение и были занесены с
других территорий.
Также проведѐн морфометрический анализ по 2 признакам личинок II
возраста. Установлено, что все особи каждой выборки имели плавный переход
от тела стилета, то есть форма базальных бугров стилета была типичной для
вида G. rostochiensis.
Фактор F2 (32% дисперсии)
9
Фактор F1 (46% дисперсии)
Рис. 1 Взаиморасположение выборок по морфометрическим признакам цист в
сравнении со стандартами для видов G.rostochiensis (14) и G.pallida (15)
1 – волосовская; 2 - всеволожская; 3 - выборгская; 4 – гатчинская;
5 - карташевская; 6 – мшинская; 7 – суйдинская; 8 – горбатовская;
9 – полесская; 10 – псковская; 11 – старорусская; 12 – ивановская;
13 – камчатская
Анализ видовой принадлежности личинок по длине стилета показал, что все
исследованные выборки можно отнести к виду G. rostochiensis. Средние
значения длины стилета и пределы их варьирования, представленные на
рисунке 2, близки к среднему значению соответствующего признака G.
rostochiensis.
Рис.2 Средние значения и 95%
доверительные интервалы
варьирования длинны стилета
личинок II возраста картофельной
нематоды выборок:
1 – волосовской; 2 - всеволожской; 3 - выборгской; 4 – гатчинской;
5 - картошевской; 6 – мшинской; 7 – суйдинской; 8 – горбатовской;
9 – полесской; 10 – псковской; 11 – старорусской; 12 – ивановской;
13 – камчатской. 14 – G. rostochiensis , 15 – G. pallida.
Таким образом, суммируя полученные данные по морфометрии личинок II
возраста и цист, можно утверждать, что все изученные выборки картофельной
10
нематоды принадлежат к виду G. rostochiensis.
Результаты анализа популяций с помощью ПЦР со специфицескими
праймерами. Для уточнения видового состава нематод всех 13 изученных
выборок были проведены реакции с двумя наборами праймеров:
универсальный со специфическим для бледной картофельной нематоды
(ITS5+PITSp4) и универсальный со специфическим на золотистую
картофельную
нематоду
(ITS5+PITSr3).
Результаты
представлены
соответственно на рис.3 и 4.
М Pa Ro 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 K М
265
bp
Рис. 3. Результаты ПЦР-диагностики вида G. pallida
M – маркер 100kb; Pa - G.pallida (контроль); Ro – G.rostochiensis (контроль) К –
контроль
без
ДНК
(вода).
Цифрами
представлены
выборки:
1 – волосовская; 2 - всеволожская; 3 - выборгская; 4 – гатчинская;
5 - карташевская; 6 – мшинская; 7 – суйдинская; 8 – горбатовская;
9 – полесская; 10 – псковская; 11 – старорусская; 12 – ивановская;
13 – камчатская
В первом случае (рис.3), фрагмент размером 265 п.о. был получен только в
положительном контроле на G. pallida. Во всех других вариантах он
отсутствовал. Это позволяет заключить, что в исследованных выборках
нематод вид G. pallida не встречается. В эксперименте со второй комбинацией
праймеров (рис.4) во всех выборках был получен фрагмент, размером 434 п.о.,
что указывает на присутствие в них вида G. rostochiensis.
М Pa Ro 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 K М
434
bp
Рис. 4 Результаты ПЦР-диагностики вида G. rostochiensis.
Обозначения те же что и на рис.3.
11
Эти результаты согласуются с данными морфометрии и позволяют
заключить, что исследованные популяции нематод представлены только одним
видом – золотистой картофельной нематодой G. rostochiensis.
3.2. Идентификациия патотипов
Все имеющиеся выборки были протестированы с помощью стандартного
набора растений-дифференциаторов. Цисты образовались только на S.
multidissectum (клон Р 55/7) и на неустойчивом контроле (сорт Невский). Это
также позволяет утверждать, что рассмотренные популяции представлены
видом G. rostochiensis и только одним его патотипом - Ro1. В целом это
согласуется с данными, полученными Маковской С.А. (1976) о том, что в
Северо-Западном регионе РФ обнаружен только вид G. rostochiensis обычного
патотипа Ro1.
Глава 4. Результаты оценки образцов картофеля из коллекции ГНУ ВИР
на нематодоустойчивость
4.1. Гибриды и коллекционные сорта как источники
нематодоустойчивости
Простые гибриды. Испытанные гибриды были созданы в отделе
генетических ресурсов картофеля ВИР Рогозиной Е.В. Цель их создания –
расширение генетической базы селекции картофеля на устойчивость к
золотистой картофельной нематоде. Испытано 67 клонов межвидовых
гибридов, представляющих потомство от скрещивания 7 диких видов
картофеля: Solanum alandiae Card., S. doddsii Corr., S. okadae Hawkes et Hjerting,
S. abancayense Ochoa, S. ambosinum Ochoa, S. gandarillasii Card, S. famatinae Bitt.
et Wittm. с неустойчивыми к нематоде дигаплоидами сортов Atzimba, Kardula и
Delos или видом-посредником S. chacoense Bitt., которые, согласно
многолетней практике ВИР, хорошо скрещиваются. Эти гибриды картофеля
представляют собой небольшую часть потомства от 10 комбинаций
скрещивания, которые были выделены по способности формировать клубни
правильной формы, не менее 4-х на одном растении.
Среди испытанных 67 клонов межвидовых гибридов от 10 комбинаций
скрещиваний клоны, устойчивые к нематоде, были выявлены среди потомства 8
комбинаций скрещивания (табл. 1). Наибольшая доля устойчивых к нематоде
клонов (по 7 из 10 оцененных) получена в семьях с участием образца к-21240
вида S. alandiae и образца к-20921 вида S. okadae. Также значительный выход
устойчивых к нематоде гибридных клонов (10 из 22) получен с участием
образца к-23060 вида S. famatinae.
Таблица 1 Результаты оценки на устойчивость к нематоде клонов первого поколения
межвидовых гибридов от скрещиваний с дикими видами картофеля
Число
Из них
Комбинации скрещиваний
испытанных
устойчивых неустойчивых
клонов
Atzimba х S. alandiae k-21240
10
7
3
12
Kardula х S. alandiae k-19956
Delos х S.abancayense k-18064
Delos х S. ambosinum k-20883
Kardula х S. ambosinum k-20883
Delos х S. gandarillasii k-20698
Kardula х S.oplocense k-16674
S. okadae 20921 х S. chacoense k-19759
Kardula х S. famatinae k-23060
Kardula х S. doddsii k-20709
Всего
7
3
2
1
5
4
10
21
4
67
2
1
1
0
2
0
7
10
2
32 (47,8%)
5
2
1
1
3
4
3
11
2
35
В комбинации скрещивания с участием образца к-19956 вида S. alandiae
процент устойчивых клонов среди оцененного потомства низкий. О других
комбинациях скрещиваний (с видами S.ambosinum, S. abancayense, S. doddsii)
судить сложно в виду малого числа (1-4) испытанных клонов. Все потомство от
комбинации Kardula х S. oplocense оказалось поражаемым.
Выявленные нами устойчивые к нематоде клоны межвидовых гибридов
картофеля являются источниками признака устойчивости картофеля к патотипу
Ro1 золотистой нематоды. Генетическая природа нематодоустойчивости
выделенных клонов межвидовых гибридов пока не известна.
Сложные гибриды. Это гибриды, полученные от серии целенаправленных
скрещиваний. Они были отобраны в ВИРе среди 220 гибридов картофеля,
полученных в потомстве 18 комбинаций скрещиваний специально
подобранных родительских форм, обладающих комплексом ценных признаков:
хорошими агрономическими качествами клубней, фертильностью и
устойчивостью к патогенам. Например, родители-гибриды: 190-4, 88-59-5, 89-112, 180-1, 90-7-7 являются донорами устойчивости к фитофторозу, вирусу Y,
золотистой картофельной нематоде Ro1 (Будин, Рогозина, 1998).
В качестве потенциальных источников устойчивости нами оценен 31 такой
гибрид (табл. 2).
Таблица 2. Результаты оценки на устойчивость к нематоде клонов сложных
межвидовых гибридов картофеля
В том числе:
Количество
Комбинации скрещиваний
испытанных устой- неустойклонов
чивых
чивых
24-2 (F1 Atzimba х S. alandiae к-21240) х Свитанок
5
2
3
Киевский
Свитанок Киевский х 24-2 (F1 Atzimba х S. alandiae
2
1
1
к-21240)
Загадка Питера х 99-6-6 (90-6-2 х Hertha)
3
3
Загадка Питера х 99-6-1 (90-6-2 х Hertha)
1
1
Петербургский х 99-6-1 (90-6-2 х Hertha)
1
1
90-7-7 х 90-21-1
2
2
F2 90-7-7 (91-15-2 х CIP 1035)
2
1
1
88-59-5х S. berthaultii k -7635
3
1
2
13
190-4 х S. berthaultii k-7635
97-162-2х190-4
231 х 97-162-2
180-1 х 190-4
95-23-3х180-1
F2 180-1 (Runo х F2(Sunia x S. stoloniferum k-2490)
89-1-12 х S. berthaultii k -7635
(Umbra х S. commersonii ) х Steffi
[Kardia х (S. acaule х S.megistacrolobum)] х
Хибинский ранний
F2 57-2 (F2 39-973х S. chacoense k-19759)
Всего
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
-
1
2
1
1
1
1
1
1
-
1
1
31
-
1
24
7 (22,6%)
Выделено 7 источников устойчивости к золотистой картофельной нематоде
Ro1, два из которых включают малоиспользованный в селекции дикий вид S.
berthaultii. Преимущество этих источников устойчивости в сравнении с
выделенными среди простых гибридов заключается в высокой степени их
селекционной проработки. Включение их в селекцию позволит ускорить
создание нематодоустойчивых сортов.
Нематодоустойчивые сорта. В коллекции ВИР имеется около 200
зарубежных и отечественных сортов картофеля, устойчивых к золотистой
картофельной нематоде (Каталог Мировой коллекции ВИР, 2005). Признак
устойчивости у них установлен относительно популяций из стран и регионов их
происхождения. Однако известны факты, когда устойчивые сорта поражались
патогеном, происходящим из другого региона (Guskova, Al-Bakur, 1996).
Поэтому целесообразна оценка нематодоустойчивых сортов картофеля из
коллекции ВИР к популяции из Северо-Западного региона РФ для включения
их как источников устойчивости в процесс селекции сортов селекционных
центров региона. Испытано 102 сорта, и все они подтвердили свою
устойчивость (табл. 3).
Таблица 3 Нематодоустойчивые сорта картофеля коллекции ГНЦ РФ ВИР,
подтвердившие свою устойчивость к популяции G. rostochiensis Ro1 из СевероЗападного региона Российской Федерации.
Вероятные
источники
КолиИспытанные сорта
нематодоустойчи- чество
вости
Angela, Ania, Atlantic, Bobr, Concorde, Dorisa, Dunajec,
Impala, Katja, Latona, Perkoz, Sagitta, Skutella, Tempora,
Thomana, Victoria, Xenia, Аврора, Аспия, Даренка,
adg
31
Дельфин, Дина, Живица, Марс, Рождественский,
Расинка, Рябинушка, Скарб, Холмогорский,
Шушарский, Радонежский
Proton, Sante, Symjonia, Жуковский ранний, Журавинка,
adg, vrn
10
Загадка, Малиновка, Наяда, Падарунак, Россиянка
Allegro, Amalia, Britta, Baszta, Granola, Frila,
adg, dms
6
Miranda,
adg, spg
1
14
Cinja, Sanetta, Пролисок
adg, chi, dms
3
Pontо, Fiesta,
adg, dms,vrn
2
Alwara, Cordia,
adg, spg, acl
2
Aguti,
adg, dms, acl.
1
Ute,
adg, vrn, acl, sto
1
Franzi,
adg, acl, dms, spg, sto
1
Алмаз, Альпинист, Альтаир, Ариадна, Архидея, Атлант,
Белорусский-3, Белорусский-5, Буран, Вихола,
Не известны
44
Ладожский, Лань, Лига, Милавица, Нарочь, Пригожий2, Русалка, Velox
Итого
102
Условные сокращения названий видов картофеля: acl – Solanum acaule Bitt., adg – S.
andigenum Juz. et Buk., chi – S. chilotanum Howkes, dms – S. demissum Lindl., spg – S.
spegazzinii Bitt., sto – S. stoloniferum Schlechtd., vrn – S. vernei Bitt. et Wittm.
Таким образом, все испытанные сорта картофеля являются источниками
устойчивости к патотипу Ro1 G. rostochiensis северо-западной популяции и
могут быть рекомендованы для использования в селекции новых сортов в
Северо-Западном регионе России.
4.2. Сложные межвидовые гибриды как доноры нематодоустойчивости.
Не каждый источник устойчивости может передать желаемые генетические
свойства потомству. Поэтому необходим поиск среди них доноров – тех сортов,
видов и межвидовых гибридов, которые обладают искомым признаком и могут
передавать этот признак потомству при гибридизации (Будин, 1997).
Изучены донорские свойства 7 гибридов: 25-06, 28-06, 29-06 (селекция
ВИЗР, автор Колобаев В.А.), 135-4, 24-1, 117-5 и 99-6-6 (селекция ВИР, автор
Рогозина Е.В.). Для этого определяли долю устойчивых сеянцев от их
самоопыления; а для гибрида 99-6-6 - также и долю сеянцев от скрещивания с
поражаемыми сортами Петербургский и Загадка Питера (табл. 4, рис. 5) .
Изучена способность передавать признак нематодоустойчивости потомству
от самоопыления у 6 ранее выделенных источников устойчивости (табл. 4). Они
отобраны и предложены для испытания как наиболее перспективные их
авторами. Во всех комбинациях признак нематодоустойчивости несѐт только
один родитель (виды S. alandiae k-21240, S. chacoense k-19759, сорта Гранола и
Наяда). Предполагается, что нематодоустойчивость гибриды наследуют от них
или признак проявляется при взаимодействии генов обоих родителей.
Таблица 4 Результаты изучения донорских свойств у 6 перспективных
нематодоустойчивых гибридов картофеля селекции ВИР и ВИЗР
Доля от общего количества сеянцев, %:
Гибрид
Комбинация
СлабоусНеустой(родословная)
скрещивания
Устойчивые
тойчивые
чивые
Оригинатор: Рогозина Е.В. (ВИР)
24-1 (Atzimba х S. alandiae
24-1 x 24-1
87,3
5,4
7,3
k-21240)
117-5 (Atzimba х S.
117-5 х 117-5
82,8
1,7
15,5
15
alandiae k-21240)
135-4 (S. okadae 20921 х
S. chacoense k-19759)
25-06 (13-01 х Гранола)
28-06 (Наяда х 28-02)
29-06 (Наяда х 109-02)
Наяда
135-4 х 135-4
90,3
Оригинатор: Колобаев В.А. (ВИЗР)
25-06 х 25-06
58,8
28-06 х 28-06
60,0
29-06 х 29-06
64,1
Контроль (устойчивый сорт)
Наяда х Наяда
84,2
2,4
7,3
2,0
4,0
7,7
39,2
36,0
28,2
0
15,8
Все испытанные гибриды имели высокую долю устойчивых потомков (6092%). При этом у двух из них (№№135-4 и 24-1) этот показатель превышал
уровень контроля, а у гибрида 117-5 почти равнялся ему. Примечательно, что в
отличие от эталонного устойчивого сорта Наяда, устойчивость которого к
нематоде контролируется одним доминантным геном H1 (Бирюкова и др.,
2008), в потомстве всех образцов выделилась группа слабоустойчивых. Их доля была
незначительной и колебалась в разных вариантах от 1 до 7%.
Гибрид 99-6-6 получен в первом гибридном поколении от скрещивания двух
нематодоустойчивых форм: образца 90-6-2 селекции ГНЦ РФ «ВИР им.
Н.И.Вавилова» и голландского нематодоустойчивого сорта Hertha. В свою
очередь, гибридный клон 90-6-2 создан на основе культурных видов S.
andigenum Juz. et Buk. и S. rybinii Juz. et Buk., межвидового гибрида I-1039,
интродуцированного из международного центра картофеля (CIP, Перу), и ряда
возделываемых сортов картофеля.
Анализ генеративного потомства клона 99-6-6 выявил преобладание
устойчивых сеянцев во всех трѐх вариантах. Так, в первый год испытаний доля
сеянцев с разной степенью устойчивости к нематоде колебалась от 70 до 90%,
во второй год от 51 до 80%. Доля неустойчивых растений была невысокой в
первых двух вариантах (самоопыление и скрещивание с сортом Загадка Питера)
- 10-28%. В варианте 99-6-6 на Петербургский она составляла 30-49% (рис. 5).
Доля от вс ех испытанных, %
16
100
10
12,7
27,7
20
80
60
29,8
48,8
50
47,6
40
40,4
47,3
23
40
20
39,7
40
40
I
II
25
29,8
28,2
I
II
0
I
II
неустойчивые
(более 6 цист)
слабоустойчив
ые (1-5 пустых
цист)
устойчивые
(0 цист)
Год испытаний
99-6-6 х 99-6-6 99-6-6 х
99-6-6 х
(самоопыление) Загадка Питера Петербургский
Рис. 5. Доля различных по устойчивости растений среди генеративного потомства
гибрида 99-6-6 (2005, 2006 гг).
Доля слабоустойчивых потомков у донора 99-6-6 (23-50%) была
значительно выше, чем у остальных испытанных доноров (1-7%). Это может
свидетельствовать о полигенной природе его устойчивости. Полученные факты
будут полезны при дальнейшем изучении этих гибридов для объяснения
генетической природы их устойчивости.
Анализ генеративного потомства клона 99-6-6 по устойчивости к патотипу
Ro1 Globodera rostochiensis из северо-западного региона показал преобладание
устойчивых сеянцев во всех трѐх вариантах. Полученные результаты позволяют
считать гибрид 99-6-6 эффективным донором устойчивости картофеля к
золотистой картофельной нематоде. На основании этих данных гибрид внесѐн в
список доноров ВИР.
Глава 5. Результаты государственной оценки
образцов картофеля из селекцентров
5.1. Испытание перспективных гибридов
Большое практическое значение имеет работа по государственному
испытанию перспективного селекционного материала. Результаты оценки
гибридов ЛНИИСХ, ВИЗР и фирмы «ЛиГа» за 2004-2009 гг представлены в
таблице 5.
17
На этапе предваритель-ного
государственного испытания 1-го
года
было
выделено
14
устойчивых гибридов из 34
испытанных, что составило 41%.
На
следующем
уровне
государственного испытания –
предварительном 2-го года –
доля устойчивых была выше (7
из 11) и составила 63%.
Основное
государственное
испытание (полевое) прошли 3
гибрида, и все они подтвердили
свою устойчивость.
Тот факт, что 36% гибридов
при повторном вегетационном
испытании
устойчивости
к
нематоде
не
проявили,
подтверждает
рациональность
существующей
схемы
государственного испытания, согласно которой трудоемкому полевому
испытанию, предшествует двукратная вегетационная оценка.
5.2. Испытание нового нематодоустойчивого сорта
картофеля Сударыня
Проведено основное государственное испытание нового сорта картофеля
Сударыня, по результатам которого он признан устойчивым. На основании этой
оценки он внесѐн в Госреестр селекционных достижений как
нематодоустойчивый. В связи с перспективой широкого возделывания данного
сорта в регионе, проведены его дополнительные сравнительные исследования с
двумя другими устойчивыми сортами – Лига и Наяда, в ходе которых изучена
фенология развития нематоды в их корнях и показано снижение заражѐнности
почвы при их возделывании. Было установлено, что инвазионные личинки II
возраста внедрились в корни всех сортов. Самки на устойчивом сорте
Сударыня отсутствовали, в то время как на других устойчивых сортах было
отмечено образование единичных самок. Однако развития яиц и личинок
нового поколения в них не происходило. Цисты отсутствовали на корнях всех
устойчивых сортов, тогда как на поражаемом сорте Невский они образовались в
массе.
Изучена способность сорта Сударыня снижать заражѐнность почвы
нематодами при его возделывании. Полученные данные свидетельствуют о его
эффективности. В условиях 2004 года заражѐнность почвы при его
возделывании снизилась на 92%, что не уступает показателям устойчивых
сортов Наяда (89%) и Лига (96%). В то же время при возделывании
восприимчивого сорта Невский заражѐнность почвы увеличилась на 44,3%
Таблица 5 Результаты государственного
испытания гибридов картофеля на устойчивость
к золотистой картофельной нематоде
Предварительное Основное Оригинаторы
(2004-2008)
(2009)
1 года
2 года
Устойчивых
7
6
2
ЛНИИСХ
2
1
1
Фирма ЛиГа
5
ВИЗР
Всего (доля от испытанных на данном этапе)
14
7 (63,5%)
3 (0%)
(41,2%)
Неустойчивые
9
3
ЛНИИСХ
2
1
Фирма ЛиГа
9
ВИЗР
Всего (доля от испытанных на данном этапе)
20
4 (36,5%)
0
(58,8%)
18
Таким образом, новый нематодоустойчивый сорт картофеля Сударыня
является эффективным средством снижения численности нематоды в почве за
счѐт прерывания цикла развития нематод.
ВЫВОДЫ
1.
Установлено, что в Северо-Западном регионе распространѐн вид G.
rostochiensis (патотип Ro1) в результате изучения 11 выборок нематоды
методами морфометрии, ПЦР и биотеста с использованием растенийдифференциаторов.
2.
Широко распространенный в Европе вид G. pallida на Северо-Западе
РФ не обнаружен.
3.
По результатам иммунологического изучения коллекционного
материала ВИР выделен 141 источник нематодоустойчивости среди новых
гибридов и сортов картофеля.
4.
Впервые в мировой практике выделены 18 источников устойчивости к
золотистой картофельной нематоде (патотип Ro1) среди гибридов созданных на
основе диких видов Solanum alandiae Card., S. doddsii Corr., S. okadae Hawkes et
Hjerting;
5.
Впервые в России источники устойчивости обнаружены среди
гибридов полученных с участием видов S. abancayense Ochoa, S. ambosinum
Ochoa, S. gandarillasii Card.
6.
Выделено 7 доноров нематодоустойчивости, эффективно передающих
это свойство потомству. Донор 99-6-6 зарегистрирован в сборнике паспортов
ВИР.
7.
При селекции картофеля на нематодоустойчивость методом
межвидовой гибридизации доля гибридов устойчивых к патотипу Ro1 G.
rostochiensis была высокой: среди простых гибридов около 40%, среди сложных
с высокой степенью селекционной проработки - более 20%.
8.
Устойчивость к патотипу Ro1 G. rostochiensis из Северо-Западного
региона РФ подтверждается у 100% отечественных и зарубежных
нематодоустойчивых сортов.
9.
Установлена нематодоустойчивость 24 перспективных гибридов из 48
испытанных и доказана устойчивость нового сорта Сударыня. На основании
полученных результатов сорт Сударыня включѐн в Госреестр селекционных
достижений как нематодоустойчивый.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Для практической селекции подтверждена целесообразность использования
основного источника нематодоустойчивости Solanum andigenum в современной
селекции картофеля, обоснована необходимость возделывать сорта картофеля
устойчивые именно к патотипу Ro1 золотистой картофельной нематоды на
заражѐнных участках в хозяйствах различных форм собственности.
Выявленные 141 источник (39 гибридов и 102 сорта) и 7 новых доноров
нематодоустойчивости могут быть рекомендованы для использования в
19
селекции новых устойчивых сортов картофеля для Северо-Западного региона.
Установлена нематодоустойчивость нового сорта картофеля Сударыня, что
позволило оригинатору (ЛенНИИСХ) обосновать возможность его включения в
2009 г. в "Государственный Реестр селекционных достижений, допущенных к
использованию» как нематодоустойчивый. Показано, что сорт картофеля
Сударыня, является средством снижения численности нематоды в почве за счѐт
прерывания цикла развития нематод. Это позволяет рекомендовать
использовать его наряду с другими нематодоустойчивыми сортами как
средство борьбы с нематодой на сильно заражѐнных очагах, например на
приусадебных участках и в фермерских хозяйствах.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах,
рекомендованных Перечнем ВАК РФ.
Лиманцева Л.А. Новые источники и донор устойчивости картофеля к золотистой
картофельной нематоде Globodera rostochiensis Woll. патотип Ro1/ Л.А. Лиманцева, Е.В.
Рогозина, Л.А. Гуськова // Вестник защиты растений. - 2008. - .№1. - С.39-44.
Рогозина Е.В. Исходный материал для селекции сортов картофеля с групповой
устойчивостью к патогенам./ Е.В.Рогозина, Л.А. Лиманцева, А.В. Хютти // Вестник
защиты растений. - 2008. - №4. - С.62-64.
Статьи, опубликованные в других научных журналах и сборниках,
материалах международных и всероссийских съездов и конференций
Рогозина Е.В. Гибрид картофеля 99-6-6 – донор устойчивости к золотистой
картофельной нематоде Globodera rostochiensis (Woll.) Ro1./ Е.В. Рогозина, Л.А.
Гуськова, Л.А. Лиманцева// Фитосанитарное оздоровление экосистем: Материалы
второго Всерос. съезда по защите растений. - СПб, 2005. - Том1. - С.555-556.
Лиманцева Л. А. К вопросу об опасности для картофелеводства Северного Кавказа
картофельной нематоды/ Л. А. Лиманцева// Проблемы энтомологии северо-кавказского
региона: Материалы 1-й научно-практической конференции. – Ставрополь: Агрус, 2006.
– Вып. 2. – C. 53-54.
Гуськова Л.А. К вопросу о составе популяции золотистой картофельной нематоды
Globodera rostochiensis (Woll., 1923) Behrens, 1975 в Северо-Западном регионе РФ/ Л.А.
Гуськова, Л.А Лиманцева.// Актуальные проблемы интегрированной защиты растений:
Материалы междунар. науч. конф. молодых учѐных. - Минск, 2007. - С.130-134.
Лиманцева Л.А. Состав популяции золотистой картофельной нематоды Globodera
rostochiensis (Woll., 1923) Behrens, 1975 в Северо-Западном регионе РФ/ Л.А. Лиманцева,
Л.А Гуськова // Медико-биологические и социальные проблемы современного человека:
20
I-ая Междунар. науч. конф. молодых учѐных и студентов: тезисы - Тирасполь, 2007. С.306-308
Рогозина Е.В. Использование генетического разнообразия видов картофеля в селекции
на устойчивость к патогенам./ Е.В. Рогозина, М. В. Патрикеева, Л. А. Гуськова,
Лиманцева Л. А. и др.// Картофелеводство России: актуальные проблемы науки и
практики: Материалы Международ. конгресса «Картофель, Россия-2007». - М. 2007. - С.
27-32.
Лиманцева Л.А. Новые источники устойчивости картофеля к Globodera rostochiensis
Woll., Ro1. / Л.А.Лиманцева, Л.А.Гуськова, Е.В.Рогозина // Нематоды естественных и
трансформированных экосистем: сборник науч. статей 7-го Междунар. симпозиума
российского общества нематологов. – Петрозаводск: ПИН, 2007. – С.58-61.
Рогозина Е.В. Использование коллекции диких видов картофеля ГНЦ РФ ВИР для
расширения генетической базы селекции./ Е.В. Рогозина, Л. А. Гуськова, Л. А.
Лиманцева и др.// Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства:
Тез. докладов. - М. 2008. - С. 64-72.
Гуськова Л.А. Новые нематоустойчивые сорта сорта картофеля/ Л.А. Гуськова,
З.З.Евдокимова, В.А.Лебедева, Л.А. Лиманцева// Использование мировых генетических
ресурсов ВИР в создании сортов нового поколения: Тез. докл. Всерос. науч.-координац.
конференции. - СПб., 2009. - С.193.
Гуськова Л.А. Нематодоустойчивые сорта из коллекции ВИР как источники этого
признака для селекции в северо-западном регионе РФ./ Л.А. Гуськова, Л.И. Костина,
Л.А. Лиманцева.// Картофелеводство: Сб. науч. трудов: Материалы координац
совещания и науч.-практич. конф., посвящ. 120-летию со дня рождения А.Г. Лорха. - М.,
2009. - С.88.
Гуськова Л.А. К вопросу о составе популяций золотистой картофельной нематоды из
северо-западного региона РФ./ Л.А.Гуськова, Л.А.Лиманцева, Г.Е.Сергеев //
Современные иммунологические исследования, их роль в создании новых сортов и
интенсификации растениеводства: Материалы Всерос. науч.-производ. конф. (18 ноября
2009); ВНИИФ. - Большие Вязѐмы, Москов. обл., 2009. - С.156-161.
Гуськова Л.А. Нематодоустойчивые сорта картофеля как фактор стабилизации
фитосанитарного состояния по Globodera rostochiensis Woll. в Северо-Западном регионе
РФ./Л.А. Гуськова, Н.В. Назарова, Л.А. Лиманцева, А.Н. Созонов // Паразитические
нематоды растений (биоразнообразие, изучение, коллекции): Материалы второго
Междунар. науч.-практич. совещания. - Большие Вязѐмы, 2010. - C. 12-15
Сергеев Г.Е. К применению компонентного анализа при идентификации
фитопатогенных нематод./ Г.Е. Сергеев, Л.А. Лиманцева.// Паразитические нематоды
растений (биоразнообразие, изучение, коллекции): Материалы второго Междунар. науч.практич. совещания. - Большие Вязѐмы, 2010. - C. 56-61.
Limantseva L.A. Potato new sources and donors of stability to Globodera rostochiensis
Woll., Ro1. / L.A. Limantseva, L.A.Guskova, E.V. Rogozina // Abstracts of the 7 th
International Symposium of the Russian Society of Nematologists (Russia, Petrozavodsk, 9-14
July, 2007) Russian Journal of Nematology. – 2007. - V.15. - №2. - P. 166-167.
21
__________________________________
Научное издание. RIZO-печать
ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ
Лицензия ПЛД № 69-253. Подписано к печати 24 сентября 2010 г., тир. 100 экз.
22