На правах рукописи МОРОЗОВА КСЕНИЯ ВЛАДИМИРОВНА
реклама
На правах рукописи МОРОЗОВА КСЕНИЯ ВЛАДИМИРОВНА ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ, АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И РЕПАРАЦИИ ДНК В ГЕНЕЗЕ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ 14.01.01 – акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения России Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук старший научный сотрудник Макаров Олег Васильевич Сальникова Любовь Ефимовна Официальные оппоненты доктор медицинских наук Волкова Елена Вячеславовна Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России, ведущий научный сотрудник первого акушерского отделения патологии беременных доктор медицинских наук Мурашко Андрей Владимирович Государственное бюджетное учреждение здравоохранение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, кафедра акушерства и гинекологии №1, профессор кафедры Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии" Защита диссертации состоится «23» марта 2015года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.12 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте http://rsmu.ru ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 Автореферат разослан «..........» ............................ 2015года Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна Список сокращений НБ – невынашивание беременности АФК- активные формы кислорода ПОЛ – перекисное окисление липидов ХГЧ - хорионический гонадотропин человека АФС - антифосфолипидный синдром HLA- Human leycocyte antigens ГП - генный полиморфизм СР - свободные радикалы СОД - супероксиддисмутаза КОМТ – катехол-О-метилтрансфераза ГП 4- глутатион пероксидаза 4 NRF2- ген транскрипционного фактора SOD2- ген супероксиддисмутазы 2 САТ- ген каталазы GCLC-ген глутатионцистеинлигазы GPX4-ген глутатион пероксидазы 4 CYP1A1-ген цитохром Р 450 СОМТ-ген катехол-о-метилтрансферазы OGG1-ген 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы SNPs-single nucleotide polymorphism- однонуклеотидный полиморфизм ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Невынашивание беременности является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения и современного акушерства, частота которой, по мнению разных авторов, составляет от 10% до 25%, причем в I триместре она достигает, по некоторым данным, 50% (Макаров О.В., Волкова Е.В., 2007; Сидельникова В.М., 2011). Известно множество причин, приводящих к ранним репродуктивным потерям (Макаров О.В., Волкова Е.В.,2011;Сидельникова В.М.,2011; Доброхотова Ю.Э., 2011). Многочисленные исследования антиоксидантной системы показали, что нарушения в данной системе могут лежать в основе практически всех мультифакториальных заболеваний (Кулаков В.И., 2002). За функционирование антиоксидантной системы в организме человека отвечают определенные гены, кодирующие активность ферментов антиоксидантной защиты. Ферменты антиоксидантной системы в структуре своих генов имеют функционально неравноценные аллели (Сидельникова В.М.,2011; Сальникова Л.Е., 2011). В генезе ранних репродуктивных потерь система редокс-гомеостаза, главным компонентом которой является сеть ферментов антиоксидантной защиты, также играет немаловажную роль (Мурашко А.В., 2010). Активные формы кислорода, вырабатываемые в ходе ферментативных реакций в тканях организма, находясь в физиологических концентрациях, регулируют важнейшие биологические процессы в клетках, но как только концентрация активных форм кислорода начинает превышать физиологический уровень, их действие может приводить к активации разрушающих процессов, сопровождающихся структурными повреждениями молекулы ДНК и возникновением генных мутаций (Мурашко А.В., 2010; Кулинский В.И.,Бочаров С.Н., 20114 Макаров О.В., Сальникова Л.Е., 2011). Помимо эндогенных свободных радикалов, существенный вклад в функционирование клеток организма вносит воздействие окружающей среды, в том, ксенобиотиков (Кулинский В.И.,Бочаров С.Н., 2011). В процессе метаболизма ксенобиотиков происходит накопление промежуточных веществ, обладающих токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами (Козлова Н.М.,2006). В норме элиминация ксенобиотиков осуществляется благодаря системе ферментативных реакций детоксикации, являющихся также генетически детерминированными. При наличии структурных вариаций генов, обуславливающих синтез ферментов со сниженной активностью, организм оказывается ослабленным перед постоянной атакой чужеродных экзогенных соединений (Меринова Н.И., Козлова Н.М.,2012). Известно, что в организме человека все внутриклеточные взаимодействия осуществляются благодаря нейромедиаторам, выполняющим роль переносчиков импульсов от нервной системы к органам, имеющим в клетках специфические рецепторы (Сальникова Л.Е., 2009). Изменения структуры генов, отвечающих за выработку ферментов, неодинаково влияют на процессы метаболизма катехоламинов, что может сопровождаться различными негативными последствиями для организма, включающими, как предполагается, и нарушения нормального течения беременности (Баранов В.С., 2008). Научные исследования последних десятилетий доказали, что процессы перекисного окисления липидов и воздействие на организм ксенобиотиков оказывают мутагенное влияние на структурную основу молекулы ДНК, являющейся носителем генетической информации всего организма (Баранов В.С., Ефимова О.А., Пендина А.А., 2012; Василенко Н.Л., 2003; Макаров О.В., 2010). В случае неполноценной активности ферментов репарации ДНК нарастает концентрация дефектов, что приводит к формированию мутаций, которые получают свое фенотипическое проявление в развитии патологии различных органов и систем (Баранов В.С., 2012). В связи с этим, важное значение имеет комплексное молекулярногенетическое исследование генов, кодирующих комплекс ферментов описанных выше защитных систем организма функциональных полиморфных вариантов для выявления и определение активности соответствующих ферментов в зависимости от вариабельности аллелей. Такое исследование позволит оценить влияние полиморфных вариантов исследованных генов на формирование предрасположенности к невынашиванию первой половины беременности. Цель исследования Определить влияние полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы, системы обмена катехоламинов и системы эксцизионной репарации ДНК на невынашивание беременности, с целью профилактики потерь последующих беременностей. Задачи исследования 1. Провести комплексное обследование пациенток с невынашиванием беременности. 2. Провести генотипирование с целью определения частоты встречаемости функциональных полиморфных вариантов генов: NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1, COMT, OGG1 у пациенток с невынашиванием беременности и у женщин с физиологически протекающей беременностью. 3. Установить степень риска возникновения НБ у женщин – носителей аллелей генов, ассоциированных с невынашиванием. 4. В случае выявления ассоциации полиморфного варианта исследуемых генов с риском невынашивания беременности определить влияние генотипа на активность соответствующего фермента. 5. В случае выявления ассоциации полиморфных вариантов исследуемых генов с риском невынашивания беременности провести анализ взаимосвязи генотипов с развитием соматической патологии, негативно влияющей на течение беременности. Научная новизна Установлено, что полиморфизм генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не ассоциирован с невынашиванием беременности. Впервые выявлена ассоциация между носительством аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 и невынашиванием беременности. Установлено, что носительство вышеуказанных аллелей повышает риск НБ в 1,62 и в 1,72 раза. Показано значение снижения активности фермента катехол-О-метилтрансферазы у женщин с невынашиванием беременности. По результатам проведенной работы получено 2 приоритетные справки: № 2014116061 от 22.04.2014, № 2014110824 от 21.03.2014. Предлагаемые генетические предикторы невынашивания беременности позволят расширить возможности диагностики риска репродуктивных потерь на этапе предгравидарной подготовки. Практическая значимость На основании проведенных исследований установлено, что носительство аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 является фактором риска НБ. Генотипирование женщин с невынашиванием беременности может быть рекомендовано, при исключении других причин НБ, как способ формирования групп риска, с целью проведения специфической терапии как в качестве предгравидарной подготовки, так и в I половине беременности. Носителям аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 показано проведение дообследования на предмет своевременной профилактики развития анемии во время беременности. Положения, выносимые на защиту: 1. Полиморфные варианты генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не являются фактором риска НБ. 2. Неблагоприятным для нормального течения беременности является наличие аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии. 3. У женщин с аллелем А rs 4680 гена COMT и аллелем G rs1052133 гена OGG1, вероятность невынашивания беременности увеличивается в 1,61 и в 1,72 раза соответственно по сравнению с женщинами, имеющими альтернативные аллели. 4. Снижение активности фермента катехол-О-метилтрансферазы ассоциировано с невынашиванием беременности. Внедрение результатов исследования Результаты проведенной работы внедрены в практику гинекологических отделений ГБУЗ «Городская клиническая больница №4» Департамента здравоохранения города Москвы и ГБУЗ «Городская клиническая больница №40» Департамента здравоохранения г. Москвы, а также используются в педагогическом процессе на лекциях и занятиях для курсантов, ординаторов и слушателей кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации. Апробация и личный вклад автора Основные положения диссертации доложены и обсуждены научнопрактической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации 18 июня 2014 года, протокол № 7. Публикации По материалам диссертации опубликовано 2 научных работы в изданиях, рецензируемых ВАК Минобрнауки РФ. Личное участие автора Автором лично проведена работа по клинико-инструментальному обследованию тематических пациенток, анализу клинико-лабораторных данных. Проведен сбор, а также статистическая обработка данных и анализ результатов исследования. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 129 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, клинической характеристики обследованных групп пациенток, описания полученных результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 84 отечественных и 82 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 21 рисунком. Материалы и методы исследования Сбор клинического материала для исследования проводился на базах кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой - заслуженный врач России, д.м.н., профессор О.В. Макаров). Материалы диссертационной работы получены в результате комплексного клинико-лабораторного обследования 274 женщин. Основную группу составила 151 пациентка с 2 и более потерями беременности в анамнезе на сроке более 7 недель. Критериями исключения из группы являлись случаи тяжелых аномалий кариотипа также беременности, наступившие (анэмбриония), а в результате ЭКО. Всем пациенткам, включенным в основную группу, было проведено кариотипирование абортусов, с целью исключения грубых аномалий кариотипа, как причины потери беременности. Для контрольной группы было отобрано 123 женщины с 2 и более беременностями в анамнезе, протекавшими без угрозы прерывания и закончившимися своевременными самопроизвольными родами. Из группы исключались пациентки с кровяными выделениями во время беременности, а также с эпизодами репродуктивных потерь в анамнезе. Пациенткам обеих групп было выполнено полное клинико- лабораторное обследование согласно современным медико-экономическим стандартам. Проведено генотипирование пациенток с целью выявления полиморфизма следующих генов: генов антиоксидантной системы CAT, GPX4, GCLC, SOD2, NRF2, системы детоксикации ксенобиотиков гена CYP1A1, гена, отвечающего за обмен катехоламинов COMT, гена репарации ДНК OGG1. Специальные генетические методы исследования выполняли на базе Учреждения Российской Академии Н.И.Вавилова, лаборатории Наук Института общей генетики им экологической генетики (заведующий лабораторией - д.б.н. Рубанович А.В.) [Таблица1]. Таблица 1. Специальные методы исследования Генотипирование Вид исследования (ПЦР-реакция) rs 6721961 (G617T) гена NRF2 Количество исследований 196 rs 17880664 (Т21С) гена CAT rs 713041 (С44Т) гена GPX4 188 176 rs 4880 (Т47С) гена SOD2 rs 17883901 (С129Т) гена GCLC 196 196 rs 1048943 (А4889G) гена CYP1A1 174 rs 4646903 (Т3801С) гена CYP1A1 rs 4680 (G1947А) гена COMT 196 174 rs 1052133 (С977G) гена OGG1 Определение активности фермента СОМТ 190 274 Кариотипирование 151 Всего 2113 В ходе исследования выделяли ДНК из образцов крови с использованием наборов реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab.Ltd, страна производитель Россия). Постановку реакции осуществляли согласно методу, заявленному производителем. Для проведения готовые наборы ПЦР реакции использовали Master Mix лиофилизированные (Фирма Изоген). Постановку реакции осуществляли согласно протоколу, заявленному производителем. Определение активности катехол-о-метилтрансферазы Определение активности фермента катехол-о-метилтрансферазы осуществляли согласно методике, описанной Zurcher.G.(1982). Статистическая обработка данных Для статистической обработки всех полученных результатов использовали программу «STATISTICA v.7.0». 1) Проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (адрес свободного доступа http://www.nsu.ru/mmf/tvims/chernova/ms/lec/node45.html) 2) Для оценки критерия значимости в двух независимых группах, представленных непараметрическими ранговыми величинами, использовали критерий χ2 (Хи- квадрат) и критерий Фишера (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html). 3) Для групп, представленных параметрическими величинами, использовали t-тест Стьюдента 5) В ряде случаев для оценки достоверности различий частот бинарных показателей использовали также трендовый тест Армитажа свободного доступа http://www.biomedcentral.com/1753-6561/3/S7/S37). (адрес 6) Вклады различных генотипов в заболеваемость определяли с помощью традиционного для таких исследований показателя «odds ratio» (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html). (OR – мера коррелятивной связи), равного OR Pбол (1 Pздор) Pздор(1 P бол) , где Pбол - частота генотипа среди больных, Pздор - частота генотипа среди здоровых. При отсутствии корреляций между генотипом и заболеванием OR=1. При OR>1 говорят о повышенном риске заболевания при данном генотипе. 7) Все обследованные популяции были проверены на соответствие критерию Харди-Вайнберга. 8) Оценку корреляционной зависимости для непараметрических ранговых величин проводили по методу Спирмена (R). Клиническая характеристика групп По результатам проведенного анализа установлено, что группы пациенток были практически однородны по антропометрическим показателям, профессиональному и социальному статусам. У пациенток основной группы достоверно чаще наблюдались такие вредные привычки, как табакокурение и употребление алкоголя. Очевидной является патогенетическая связь высокого уровня стресса с формированием не только соматических заболеваний, но и патологического течения беременности, что подтверждается результатами нашего исследования. Так, пациентки основной группы значительно чаще отмечали у себя признаки хронического стресса по сравнению с женщинами контрольной группы, проживающими в более благоприятных психоэмоциональных условиях. На течение беременности прямое влияние оказывает общее соматическое здоровье матери (Макаров О.В., Волкова Е.В., 2007; Сидельникова В.М., 2011). Связь пониженного уровня здоровья с неблагоприятным течением беременности имела место и в нашем исследовании. По результатам сравнений в группе пациенток с невынашиванием чаще наблюдались такие мультифакториальные патологии, как нарушение жирового обмена, артериальная гипертензия, эутиреоидный зоб, заболевания желудочнокишечного тракта. Немаловажную роль в характеристике здоровья организма играет персистенция очагов хронической инфекции экстрагенитальной локализации (Сидельникова В.М.,2011; Доброхотова Ю.Э., 2011). При обследовании пациенток было установлено, что женщины основной группы чаще страдали воспалительными заболеваниями лор-органов, бронхолегочной системы и мочевыделительной системы (хронический цистит), чем группа контроля. Среди основополагающих характеристик репродуктивного здоровья женщины следует выделить уровень фертильности. Статистически большее число беременностей в данной группе связано с наличием в анамнезе у пациенток не только самопроизвольных выкидышей, но и абортов, при этом число родов оказалось намного ниже. Напротив, контрольная группа была сформирована из здоровых женщин с низким числом абортов, при большом количестве самопроизвольных нормальных родов и исключением эпизодов невынашивания. Что касается гинекологической патологии, то такие распространенные заболевания как миома матки, аденомиоз в основной группе наблюдались значительно чаще, что может свидетельствовать о повышенном содержании эстрогенов в организме у пациенток данной группы. Такие заболевания, как цервицит, эндометрит и сальпингоофорит, в анамнезе у пациенток основной группы встречались также значительно чаще. Терапия, направленная на пролонгирование беременности, значительно чаще назначалась пациенткам основной группы, что было связано с отягощенным течением беременности. Результаты проведенного генотипирования Хорошо известно, что необходимым условием для поддержания на физиологическом уровне концентрации катехоламинов является выработка данного фермента с нормальной активностью (Патрушев Л.И., 2012). Резко возрастающая под воздействием стресса концентрация вырабатываемых катехоламинов может крайне негативно влиять на организм беременной женщины, особенно при недостаточности процессов их обмена и элиминации (Feng Y. et.all, 2013). Ранее было показано, что носительство вариантных аллелей rs 4680 гена COMT сопряжено с выработкой фермента с разным уровнем активности (Lin G.et.all,2013). Так, наличие аллеля G в гомозиготном состоянии сопровождается секрецией активного фермента катехол-о-метилтрансферазы, тогда как в гетерозиготном состоянии (генотип G/А) активность фермента снижается вдвое, а гомозиготность по аллелю А коррелирует с 3-4 кратным снижением активности катехол-о-метилтрансферазы (Feng Y. et.all, 2013). По результатам проведенного нами генотипирования наиболее интересные данные получены при сравнении пациенток с невынашивнием беременности на сроке более 10 недель с группой контроля. Здесь наблюдалось значительное превалирование дикого аллеля G в гомозиготом состоянии у здоровых пациенток (χ²=10,31, р=0,0013), что говорит о протективной роли данного аллеля G. С целью выяснения характера проявления наследуемого признака нами был проведен аддитивный тест Кохрана-Армитажа. По результатам наибольший эффект получен для доминантной модели наследования аллеля А, из чего следует что оба генотипа А/А и G/А являются рисковыми по развитию невынашивания беременности у данных пациенток (χ²=5,47, установлено, что у пациенток-носителей аллеля А р=0,02). Также нами имеется повышенный шанс потери беременности в первой половине гестации (OR=1,61, р=0,02, 95% df= 1,06-2,43) [Рис.1]. * 60% 50% 40% Основная группа 30% 20% Контрольная группа * 10% 0% СОМТ G/G СОМТ G/A СОМТ А/А *Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.1 Распределение генотипов rs 4680 (А1947G) гена СОМТ у пациенток при потере беременности на сроке более 10 недель. По результатам проведенного исследования установлено, что у носителей минорного генотипа А/А наблюдалась самая низкая активность фермента 226,52±79,18 мкмоль /мг; у женщин с гетерозиготным генотипом активность фермента была достоверно выше и составила 335,88 ± 82,74 мкмоль /мг; а у носителей генотипа G/G активность фермента была самой высокой 564,67± 156,77 мкмоль /мг [Рис.2]. 800 Основная группа Контрольная группа 700 * мкмоль гвоякола/мг 600 500 400 300 * * 200 100 0 СОМТ А/А СОМТ A/G СОМТ G/G * Различия статистически достоверны, р<0,05. Рис.2. Средняя активность катехол-О-метилтрансферазы у женщин основной и контрольной групп в зависимости от генотипа rs 4680 (А1947G) гена СОМТ. Таким образом, установлена статистически достоверная ассоциация носительства аллеля А rs 4680 гена COMТ со снижением активности фермента катехол-о-метилтрансферазы и невынашиванием беременности у обследованных нами пациенток. Один из механизмов, описанных ранее, связан с прямым воздействием катехоламинов на рецепторы миометрия и стенку маточных сосудов, приводящих к повышению тонуса матки и нарушению маточно- плацентарного кровотока, что, как известно, сопровождается недостаточной трофикой и создает условия для прерывания беременности (Cavalieri E. et.all, 2008). Метаболизм эстрогенов включает процессы гидроксилирования, приводящие к образованию катехолэстрогенов, семихинонов и хинонов. Катехолэстрогены обладают высокой эстрогенной активностью и являются основой для образования хинонов, несущих мощное прямое мутагенное и генотоксическое воздействие на ДНК (Cavalieri E. et.all, 2008). Процессы инактивации катехолэстрогенов протекают при обязательном участии катехол-о-метилтрансферазы, однако катехоламины сами по себе угнетают активность СОМТ, что влечет за собой недостаточную инактивацию 4гидроксиэстрогенов, характеризуемых высокой генотоксичностью. Таким образом, генетически фермента СОМТ, опосредованная может приводить недостаточная к каскаду эффективность цепных реакций, активирующих процессы генотоксического повреждения ДНК. Мы предполагаем, что этот механизм может реализоваться на всех этапах гестации от момента имплантации и эмбриогенеза. Возникающая в таких условиях генотоксическая нагрузка, вероятно, вносит немалый вклад в прерывание беременности. Данная гипотеза подтверждается большей предрасположенностью пациенток с невынашиванием беременности в нашем исследовании при наличии аллеля А rs 4680 гена COMT к таким эстрогенозависимым заболеваниям, как миома матки, аденомиоз и фибрознокистозная мастопатия [Рис.3]. Данная гипотеза подтверждается большей предрасположенностью пациенток с невынашиванием беременности в нашем исследовании при наличии аллеля А rs 4680 гена COMT к таким эстрогенозависимым заболеваниям, как миома матки, аденомиоз и фиброзно-кистозная мастопатия [Рис.3]. 100% * * * 80% 60% А/А +G/А 40% G/G 20% 0% Миома матки Аденомиоз ФКМ * Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.3. Распределение частоты встречаемости эстрогензависимых заболеваний в зависимости от генотипа rs 4680 гена СОМТ. В ходе нашего исследования мы выявили взаимосвязь риска развития анемии во время беременности с носительством аллелей rs 4680 гена COMT. Установлено, что у носителей аллеля А (генотип G/A и А/А) шанс возникновения анемии в 1,93 раза выше, по сравнению с аллелем G, (OR=1,93, р=0,02, 95% df= 1,34-2,8) [Рис. 4]. Полученный результат может объясняться возможным снижением уровня эритропоэза у данных пациенток в связи с наличием у них гиперэстрогении, что также подтверждено нашим исследованием. Принимая во внимание тот факт, что и катехолэстрогены, и множество других эндогенных и экзогенных метаболитов оказывают мощное генотоксическое влияние на молекулу ДНК, крайне важным механизмом поддержания ее нормальной структуры являются восстановительные процессы репарации. Одним из основных звеньев является система эксцизионной репарации, гены которой и являются предметом нашего исследования. * 60% 50% Группа пациенток с анемией 40% 30% 20% Группа пациенток с нормальным гемоглобином * 10% 0% СОМТ G/G СОМТ G/A СОМТ A/A * Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.4 Распределение генотипов rs 4680 (А1947G) гена COMT у пациенток с анемией во время беременности. Под контролем гена OGG1 происходит синтез фермента 8-оксогуанинДНК-гликозилазы, обеспечивающего вырезание окисленных оснований из молекулы ДНК, однако у вариантных аллелей гена может иметь место ослабление ферментативной активности, а, следовательно, и уменьшение эффективности процессов репарации с накоплением структурных повреждений. Давно известно, что особенно в ранние сроки беременности, в период эмбрио- и органогенеза процессы мутагенеза приобретают особенную значимость. По результатам проведенного нами генотипирования на предмет распределения аллелей rs1052133 гена OGG1 установлено, что неблагоприятный аллель G в гомозиготном состоянии, по данным ранее проведенных исследований ассоциированный с выработкой менее активного фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (Maga G. еt.all, 2007) в основной группе наших пациенток наблюдался значительно чаще: χ² =5,09, р=0,02. Наибольший эффект получен для доминантной модели наследования минорного аллеля G, на основании чего можно утверждать, что и гомозиготный генотип G/G и гетерозиготный С/G являются рисковым по невынашиванию беременности: χ²=4,29, р=0,03 [Рис.5]. Аллель G в 1,61 раза повышает риск потери беременности в первой половине гестации (OR=1,62, р=0,04, 95%, df= 0,38-0,99). Также в ходе нашего исследования мы выявили ассоциацию носительства минорного аллеля G с риском развития анемии во время беременности, (OR=1,65, р=0,04, 95%, df= 0,38 – 0,96) [Рис.5]. 80% 70% 60% 50% Основная группа * 40% Контрольная группа 30% 20% * 10% 0% OGG1C/C OGG1C/G OGG1 G/G *Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.5 Распределение генотипов rs1052133 (С977G) гена OGG1 у пациенток основной и контрольной групп. Полученные результаты свидетельствуют о наличии множества опосредованных механизмов, способных нарушить нормальное течение гестации, и дальнейшее их изучение позволит в большой степени снизить их пагубное проявление. Возможность практического применения полученных нами результатов, заключается в формировании группы повышенного риска невынашивания беременности. Известно, что многие эндогенные процессы в организме протекают с образованием АФК и свободных радикалов, в норме инактивируемых ферментами антиоксидантнй системы (Зенков Н.К.,2009). При неэффективности защитных функций в организме происходит накопление генотоксикантов, воздействующих на все органы и системы, что особенно актуально во время беременности (Золотухин П. В.,2010г). Чужеродные вещества, попадающие в организм из загрязненной окружающей среды, именуются ксенобиотиками. Для их нейтрализации также активно функционирует система детоксикации, благодаря слаженному взаимодействию ряда ферментов. Так же как и от антиоксидантной системы, от системы детоксикации зависит поддержание нормального гомеостаза организма, что эффективной становится невозможным защитной функции в (Золотухин условиях недостаточно П. В.,2010). Учитывая генетическую детерменированность данных процессов, связь изменений в структуре генов с предрасположенностью к различным заболеваниям, а также отсутствие данных об изучении их в контексте невынашивания беременности, нам представлялось интересным проследить влияние носительства аллелей полиморфных вариантов генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC и CYP1A1 на риск невынашивания беременности. На основании однонуклеотидных результатов полиморфных изучения вариантов выбранных генов нами ферментов антиоксидантной системы и системы детоксикации ксенобиотиков мы пришли к выводу, что наличие рассмотренных однонуклеотидных замен rs 6721961 гена NRF2, rs 17880664 гена CAT, rs 4880 гена SOD2, rs 713041 гена GPX4, rs17883901 гена GCLC и rs1048943 и rs4646903 гена CYP1A1 не ассоциировано с риском потери беременности в первые 20 недель гестации. Выводы 1. Шанс НБ I половины беременности при наличии аллеля А rs 4680 гена COMT у женщин в 1,61 раза выше, чем при наличии альтернативного аллеля G rs 4680 гена COMT в сроке более 10 недель гестации. 2. Риск НБ I половины беременности при наличии аллеля G rs1052133 гена OGG1 на течение беременности у женщин в 1,72 раза выше, чем при наличии альтернативного аллеля С rs1052133 гена OGG1 вне зависимости от срока гестации. 3. Полиморфные варианты генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не являются фактором риска НБ. 4. Средняя активность фермента катехол-О-метилтрансферазы у женщин с НБ на 25% ниже, чем у женщин, не имеющих репродуктивных потерь. 5. Средняя активность фермента катехол-О-метилтрансферазы отличается у носителей различных генотипов соответствующего гена; она минимальна у носителей генотипа А/А rs 4680 гена COMT, имеет промежуточное значение у носителей генотипа G/A и максимальна – у носителей генотипа G/G. 6. Аллель А rs 4680 гена COMT ассоциирован не только с риском невынашивания беременности, но и с развитием анемии, миомы матки, фиброзно-кистозной мастопатии и аденомиоза. Практические рекомендации 1. У женщин с НБ в анамнезе необходимо включить в комплексное обследование генотипирование для выявления наличия неблагоприятных аллелей rs1052133 гена OGG1 и rs 4680 гена COMT с целью прогнозирования возможного риска НБ. 2. У женщин, имеющих аллель А rs 4680 гена COMT, особенно в гомозиготном состоянии, показано профилактическое назначение седативных препаратов с целью снижения выработки естественных катехоламинов. 3. Носителям аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 показано проведение дообследования на предмет своевременной профилактики развития анемии во время беременности. 4. С целью предгравидарной подготовки и во время беременности женщинам, имеющим аллель G rs1052133 гена OGG1, проводить курсы антиоксидантной терапии для снижения генотоксического эффекта. Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Морозова, К.В. Гены оксидативного ответа как предикторы привычного невынашивания беременности /М.Б. Хаджиева, К.В.Морозова К.В./ /Материалы V Всероссийского с международным участием медикобиологического Конгресса молодых учѐных «Симбиоз-Россия 2012».- 2012.С. 2. Морозова К.В. Роль полиморфизма генов ферментов системы обмена катехоламинов и эксцизионной репарации ДНК в генезе невынашивания беременности /О.В.Макаров, Н.Н.Луценко, К.В.Морозова // Вестник Российского Государственного медицинского университета.- 2014.- №1С.31-36. 3. Morozova K.V. Association of oxidative stress-related genes with idiopathic recurrent miscarriage/ Lutcenko N.N., Salnikova L.E. et all// Free Radical Research.- 201448(5):534-41
