На правах рукописи 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Тихонина
реклама
На правах рукописи Тихонина Елена Александровна ОЦЕНКА СИСТЕМЫ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», на кафедре клинической лабораторной и микробиологической диагностики Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Базарный Владимир Викторович Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Аклеев Александр Васильевич Доктор медицинских наук, профессор Смолягин Александр Иванович Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Защита диссертации состоится «21» декабря 2010 года в «….» часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Автореферат разослан «..…» …………………. 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Телешева Л.Ф. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) по данным популяционных исследований неуклонно растет (Lloyd-Jones D. et al., 2009; Rosamond W. et al., 2008). ССЗ попрежнему лидируют среди причин смертности людей во всем мире, и такая тенденция по прогнозам исследователей будет сохраняться ближайшие 15 лет. Это делает актуальным поиск принципиально новых подходов к профилактике, диагностике и лечению ССЗ. Решение данной проблемы невозможно без глубокого понимания механизмов патогенеза ишемической болезни сердца (ИБС). Известно, что в ее основе лежат развитие атеросклероза и нарушения коронарного кровотока (Гуревич В.С., 2006; Han S. et al., 2009; Stary H. et al., 1995). Вместе с тем, в последние годы убедительно доказана важная роль в формировании и прогрессировании ИБС иммунокомпетентных клеток и продуцируемых ими цитокинов (Danesh J., 2008; Hazen S.et al., 2005; Koenig W.et al., 2008). В частности, активация нейтрофилов способствует развитию атеросклеротического повреждения сосудистой стенки (Slijkhuis W. et.al., 2009; Stephen G. et.al., 2006), патогенетически связанного с развитием острого коронарного синдрома (ОКС). Эти данные существенно расширили имеющиеся на рубеже XX века представления о роли гиперхолестеринемии и гипертензии в патогенезе ИБС. Учитывая важную роль иммунного воспаления в формировании нестабильности атеросклеротической бляшки и прогрессировании ИБС, внимание исследователей привлечено к изучению иммунологических маркеров воспаления: С-реактивного белка, лиганда CD 40, интерлейкинов, металлопротеиназ и других (Красносельский М.Я. и др., 2007; ArroyoEspliguero R. et al., 2004; Welsh P. et. al., 2008). К их числу следует отнести и нейтрофилы, а также продуцируемые ими энзимы и медиаторы. В частности, показана активация нейтрофилов при «нестабильности» атеросклеротической бляшки и ОКС (Taylor D. et.al., 2008; Wang L. et. al., 2009; Zohlnhofer D. et. al., На 2006). этом основании ключевой фермент нейтрофильных гранулоцитов – миелопероксидаза (МПО) также заслуживает внимания как маркер сердечно-сосудистой патологии, уровень которого коррелирует с повышенным содержанием холестерина и наличием стенозов в коронарных артериях (Рулева Н.Ю. и др. 2007; Malle E. et.al., 2000). Однако, накапливающиеся в литературе данные о диагностической эффективности определения МПО в клинической практике немногочисленны, а подчас и противоречивы (Brennan M., et. al., 2003; Hazen S. et. al., 2005; Meuwese M. et. al., 2007; Schindhelm R. et. al., 2009; Zohlnhofer D. et al., 2006). Кроме того, не решены некоторые методические вопросы оптимизации определения МПО, значение данного показателя в мониторировании пациентов в процессе лечения ИБС. Таким образом, недостаток клинико-экспериментальных данных, их систематизации и осмысления ограничивает возможности разработки новых иммуноориентированных технологий профилактики, диагностики и лечения ИБС. Перспективным направлением в этой области нам представляется изучение возможностей использования тестов, характеризующих наиболее реактивное звено иммунной системы – нейтрофилов, в лабораторном иммунологическом мониторинге при ИБС. Цель исследования. показателей Оценить морфо-функционального клинико-диагностическое состояния значение нейтрофилов при ишемической болезни сердца. Задачи исследования: 1. Оценить морфо-функциональное состояние нейтрофилов при различных формах ишемической болезни сердца: остром инфаркте миокарда и стабильной стенокардии II-III функционального класса. 2. Оптимизировать алгоритм острого инфаркта миокарда. лабораторной иммунодиагностики 3. Определить значение состояния нейтрофильных гранулоцитов в ранней диагностике осложнений хирургического лечения ишемической болезни сердца. Научная новизна. В работе дана клинико-иммунологическая характеристика нейтрофилов, проведен комплексный анализ лабораторных параметров системы нейтрофильных гранулоцитов, определены референтные значения показателей морфо-функциональной активности нейтрофилов у жителей г. Екатеринбурга, а также при различных формах ИБС, и в процессе ее хирургического лечения. Теоретическая и практическая значимость. Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о морфо-функциональных свойствах нейтрофильных гранулоцитов при остром инфаркте миокарда и стабильной стенокардии II-III ФК, а также при осложнениях хирургического лечения ИБС. На основании полученных данных предложен алгоритм иммунологического мониторинга пациентов с ИБС, в том числе – при осложнениях хирургического лечения. Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры клинической лабораторной и микробиологической диагностики ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Росздрава». Иммунологический мониторинг пациентов с ИБС внедрен в практику отделения клинико-диагностической лаборатории ГУЗ «Свердловская областная клиническая больница № 1» г. Екатеринбурга. Методики определения показателей морфо-функциональной активности нейтрофилов у кардиологических больных используются в отделе общей патологии ЦНИЛ ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Росздрава». Положения, выносимые на защиту: 1. Ишемическая морфо-функциональных болезнь сердца характеристик сопровождается нейтрофильных изменениями гранулоцитов, зависящих от клинических особенностей заболевания. 2. Определение морфо-функциональных характеристик нейтрофильных гранулоцитов является новым методом лабораторного иммунологического мониторинга пациентов при хирургическом лечении ишемической болезни сердца. Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2009), на иммунологических чтениях, семинаре-тренинге «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике» (Челябинск, 2008, 2009), на научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009), на международной школе - тренинге «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике» (Челябинск, 2010), на конференциях ЦНИЛ ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Росздрава» (Екатеринбург, 2009, 2010). Публикации. По теме диссертации 9 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения с обсуждением полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 121 отечественный и 112 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 13 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика материала. Работа основана на анализе клинико-лабораторных и иммунологических данных 103 здоровых лиц без патологии сердечно-сосудистой системы, и 165 пациентов с различными формами ишемической болезни сердца, поступивших в областной центр «Сердце и сосуды» (руководитель центра д.м.н., профессор Идов Э.М.), кардиологическое кардиохирургическое отделение отделение №1 №2 (неотложной ГУЗ кардиологии) «Свердловская и областная клиническая больница № 1» г. Екатеринбурга (главный врач д.м.н., профессор Бадаев Ф.И.) за период 2005 - 2009 г.г.. Исследование ретроспективное по типу «случай-контроль». Все пациенты были разделены на группы в соответствии с установленным диагнозом. В первую группу вошли 123 пациента с диагнозом ИБС: стабильная стенокардия II-III функциональный класс, которым была выполнена операция маммарокоронарного и аортокоронарного шунтирования, 103 пациентам в условиях искусственного кровообращения, а 20 пациентам в условиях работающего сердца. У 79% пациентов проведено традиционное аортокоронарное шунтирование (АКШ), а у 21% пациентов – расширенное, альтернативное. Внутри группы I пациенты были подразделены на три подгруппы по течению послеоперационного периода: подгруппа I1 включала 104 (84,7%) пациента, послеоперационный период которых протекал без осложнений. Подгруппа I2 была представлена 7 (5,6%) мужчинами с послеоперационными осложнениями ишемического генеза (приступы стенокардии, нарушения ритма). Подгруппа I3 состояла из 12 (9,7%) пациентов с воспалительными осложнениями послеоперационного периода (нагноение швов). Летальных исходов в послеоперационном периоде не наблюдалось. Во вторую группу вошли 22 пациента с ИБС: стабильная стенокардия IIIII функциональный класс, вне приступа. Диагноз верифицировали с использованием стандартного комплекса клинико-инструментальных и лабораторных исследований. Выраженность стенокардии определялась по классификации ССS, определение сердечной недостаточности по стадиям осуществлялось согласно классификации Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA, 1964). Третью группу составили 20 пациентов с ИБС: острый инфаркт миокарда (ОИМ), диагноз был установлен согласно стандартным критериям (клинические симптомы, электрокардиографическое исследование, лабораторные маркеры) согласно классификации ВОЗ (1989). До начала медикаментозной терапии диагноз был подтвержден ангиографией. Четвертая группа (контрольная) – 64 мужчины и 39 женщин. Для отбора в данную группу использовались критерии исключения, предложенные Комитетом по референтным величинам Скандинавского Общества клинической химии и физиологии. На основании комплексного обследования эти лица были признаны практически здоровыми, без патологии сердечнососудистой системы. В группе контроля однократно выполнялись те же иммунологические исследования крови, что и у пациентов исследуемых групп. Пациенты всех групп были сравнимы по возрасту, полу, росту, массе тела и проведенным диагностическим исследованиям (с оценкой одинаковых функциональных показателей). Лабораторные исследования. Комплекс лабораторных тестов включал общеклинический анализ крови (Cell Dyne 3500), прежде всего – для подсчета абсолютного количества нейтрофилов. Для морфологического исследования форменных элементов крови и подсчета лейкоцитограммы готовили мазки из периферической крови, фиксировали и окрашивали азур- эозиновой смесью по Романовскому-Гимзе, используя стандартную методику (Меньшиков В.В., 1999). Оценка системы нейтрофильных гранулоцитов включала показатели «ранней» кислородзависимой активации – миелопероксидазу и «поздней» кислороднезависимой активации – лизосомальные катионные белки цитохимическими методами. Активность МПО определяли по методу Грэхема-Кнолля, основанном на том, что в присутствии пероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин, с использованием набора реагентов ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-МПО («Абрис-плюс», Россия). Лизосомально-катионный тест (ЛКТ) позволяет оценить уровень неферментных катионных белков (лизоцим, лактоферрин и другие), локализованных в лизосомах нейтрофилов, которые выявляли цитохимическим методом, с окрашиванием мазков крови бромфеноловым синим по В.Е. Пигаревскому (1987). Результат цитохимических реакции выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по L. Kaplow (1955). Поскольку цитохимические полуколичественный результат, реакции для позволяют определения получить содержания цитоплазматической МПО был использован метод проточной цитометрии. Для этого клетки периферической крови подвергались процедуре пермобилизации с использованием набора IntroPrep (Beckman Coulter, США), затем окрашивались четырехцветной комбинацией моноклональных антител к MPO/CD79a/CD3/CD45 коньюгированных с флуоресцентными красителями FITC/PE/ECD/PC5 соответственно (Beckman Coulter, США). Окрашенные образцы анализировали на проточном цитометре FC 500 (Beckman Coulter, США) с помощью мультипараметрического анализа (рисунок 1). Эритроциты удаляли из исследуемых образцов за счет прямого лизиса с использованием реагента Versalyse (Beckman Coulter, США). Популяцию нейтрофилов выделяли при помощи гетерогенного гейтирования (область событий, имеющих низкую флуоресценцию CD45-PC5 и высокий уровень сигнала светорассеяния под углом 90° (SS). Интенсивность флюоресценции от каждой конкретной клетки, выражали средней интенсивностью флюоресценции популяции клеток (MFI), что служит количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность рецепторов) на клетке или внутри нее. Рис. 1. Двухпараметрическая гистограмма распределения нейтрофилов периферической крови, содержащих внутриклеточную миелопероксидазу, полученная в результате многоцветного анализа с использованием комбинации моноклональных антител MPO/CD79a/CD3/CD45. Анализ проводился с использованием гейтирования по CD45. Для оценки активности воспалительного ответа определяли концентрацию острофазовых белков - С-реактивного белка количественным иммунотурбодиметрическим методом с использованием наборов фирмы Hoffman la Roche (Швейцария) на биохимическом анализаторе Olympus 640 (Япония) и фибриногена хронометрически по методу Clauss с использованием наборов фирмы Технология стандарт (Россия). Верификация диагноза острого инфаркта миокарда требовала определения рутинных и современных маркеров повреждения миокарда. Активность изофермента креатинфосфокиназы МВ [КФК-МВ; КФ 2.7.3.2] лактатдегидрогеназы [ЛДГ; КФ 1.1.1.27] в сыворотке крови исследовали кинетическими методами, основанными на рекомендациях Международной федерации по клинической химии (IFCC), на биохимическом анализаторе Olympus 640 (Япония). Уровень тропонина оценивали иммунохроматографически (Hoffman la Roche, Швейцария) с использованием экспресс-анализатора Cardic Reader. Протокол обследования пациентов включал и определение концентрации холестерина ферментативным методом без осаждения на биохимическом анализаторе Olympus 640 (Япония). Кроме того, в крови исследовали содержание аминотерминального фрагмента мозгового натрийуретического пептида - NT-proBNP (Elecsys, Hoffman la Roche, Швейцария) и оксид азота (NOх) с помощью реакции Грисса. Статистический анализ. Математическая обработка полученных результатов проводилась при помощи персонального компьютера IBM PC под управлением операционной системы Microsoft Windows XP. Для ввода первичных данных использовался табличный процессор Microsoft Excel 2000, а для обработки – статистический программный пакет NCSS&PASS 2001. Поскольку гипотеза о том, что выборка извлечена из нормально распределенной совокупности, проверенная с помощью критериев ШапироУилка и Колмогорова-Смирнова, была подтверждена для всех исследуемых параметров, математический анализ проводили с использованием параметрических критериев статистики. Диагностические характеристики лабораторного теста (диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность) определяли на основе общепринятого подхода (Меньшиков В.В., 1999). Результаты собственных исследований и их обсуждение. Активность МПО в цитохимическом тесте у здоровых лиц составила 1,94 усл.ед., а уровень лизосомальных катионных белков (ЛКБ) – 1,61 усл.ед. При этом для изучаемых показателей не было выявлено половых различий, а уровень МПО достоверно увеличивался от зимы к осени, самое высокое значение наблюдалось в осенний период (p<0,05). При стабильной стенокардии количественные показатели системы нейтрофильных гранулоцитов не менялись (рисунок 2). При ОИМ отмечался нейтрофильный лейкоцитоз. 12 * 10 8 * 6 Лейкоциты Нейтрофилы 4 2 0 Контроль Ст.Стенокардия II-III ФК ОИМ Рис. 2. Сравнительная оценка показателей клеточного состава крови у пациентов с ишемической болезнью сердца Примечание: * р<0,05 по сравнению с группой контроля. Цитохимические показатели функционально-метаболического статуса нейтрофилов изменялись в зависимости от клинической формы ИБС. Так, при стабильной стенокардии (группа II) повышался СЦК МПО на 12 % (p≤0,05) (рисунок 3) по сравнению с группой контроля, а при ОИМ данный показатель не изменялся. У пациентов, как со стабильной стенокардией, так и с ОИМ отсутствовало изменение уровня ЛКБ в нейтрофилах. Поскольку заметное изменение при ИБС выявлено только в отношении МПО при стабильной стенокардии, то нами были определены диагностические характеристики данного теста. При значении СЦК МПО более 1,63 усл.ед. можно судить о стабильной стенокардии (чувствительность теста – 78 %, диагностическая специфичность – 65%, диагностическая эффективность – 72%). Отсутствие выраженных изменений уровня цитоплазматической МПО при ОИМ, мы связываем с тем обстоятельством, что при ОИМ вследствие повышенной активационной дегрануляции содержимое гранул нейтрофилов частично выходит в плазму и показатель цитоплазматической МПО достоверно не отличается от группы контроля, и даже имеет тенденцию к снижению в сравнении со стабильной стенокардией. Полученные нами данные лишь на первый взгляд отличаются от представленных в литературе, поскольку мы определяли цитоплазматическое, а не сывороточное содержание МПО (Meuwese M. et. al., 2007; Schindhelm R. et.al., 2009; Zhang R. et. al., 2001). 2,5 * 2 1,5 МПО, СЦК ЛКБ, СЦК 1 0,5 0 Контроль Ст.Стенокардия II-III ФК ОИМ Рис. 3. Функционально-метоболическая активность нейтрофилов у пациентов с ишемической болезнью сердца Примечание: * р<0,05 по сравнению с группой контроля. Поскольку диагноз ИБС устанавливался на основании стандартных критериев, включающих определение биохимических маркеров повреждения миокарда, то нами был проведен корреляционный анализ кардиомаркеров и цитохимических характеристик нейтрофилов (таблица 1). Таблица 1 Сравнительная оценка парной корреляции признаков у исследуемых пациентов Параметры ЛДГ КФК Холестерин Тропонин Коэффициент корреляции Группа II Группа III (ИБС:Ст. II-III ФК) (ОИМ) n= 22 n=20 ЛКБ МПО ЛКБ МПО 0,72 0,46 0,21 0,29 р<0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05 0,44 0,73 0,03 0,42 р>0,05 р<0,05 р>0,05 Р >0,05 0,68 0,51 0,88 0,92 р>0,05 р>0,05 р<0,05 р<0,01 0,56 0,47 0,88 0,81 р>0,05 р>0,05 р<0,05 р<0,05 При стабильной стенокардии была установлена прямая связь сильной степени между миелопероксидазой и креатинфосфокиназой (r=0,73; р<0,05). У больных с ОИМ характер корреляционных связей менялся. По степени выраженности прямой корреляции выделялись пары признаков миелопероксидаза-холестерин (r=0,92; р<0,01) и лизосомальные катионные белки-холестерин (r=0,88; р<0,05). В группе III также выявлена сильной степени прямая корреляция изучаемых показателей с концентрацией тропонина и холестерина. Поскольку цитохимическое выявление МПО является простым и экономичным, но полуколичественным методом, не позволившим выявить заметное изменение активности фермента при ОИМ, мы провели оценку возможности иммунофенотипирования для выявления МПО при ИБС. Так, при цитометрической оценке внутриклеточной МПО показатели процента клеток, содержащих МПО в группах со стабильной стенокардией и ОИМ достоверно снижались по сравнению с контролем на 9% и на 22% (p≤0,05) соответственно (рисунок 4). Уменьшающийся показатель средней интенсивности флуоресценции (MFI) данного маркера также свидетельствует о снижении содержания МПО внутри клеток и достоверно отличается от группы контроля на 92% и 81% (p≤0,05) соответственно. Снижение уровня цитоплазматической МПО одновременно с повышением содержания в крови уровня pro-BNP и оксида азота косвенно указывают на наличие взаимосвязи между состоянием системы нейтрофильных гранулоцитов и механизмов регуляции функции миокарда и сосудистой стенки. 120 8 7 100 * 6 * 80 5 60 4 * * 3 40 2 20 1 0 0 МПО (цитометрически), % Группа IV, n=103 MFI, у.е. Группа II, n=22 Группа III, n=20 Рис. 4. Активность внутриклеточной миелопероксидазы с использованием метода проточной цитометрии в исследуемых группах Примечание. * - р <0,05 в сравнении с контрольной группой. MFI – средняя интенсивность флуоресценции, МПО цитометричеки, % клеток позитивных на внутриклеточную миелопероксидазу среди всех нейтрофилов Таким образом, при развитии ишемического повреждения миокарда изменяются показатели функционально-метаболической активности нейтрофилов, причем выраженность этих сдвигов зависит от характера повреждения миокарда при ИБС. Нейтрофильный лейкоцитоз у пациентов с ОИМ сопровождается выраженными изменениями функционально- метаболической активности нейтрофилов, определяемыми цитометрически, и коррелирующими с уровнем активности сывороточных маркеров кардиодеструкции. Широкое внедрение интервенционных технологий в лечение ИБС привело к необходимости разработки алгоритма лабораторного мониторинга пациентов, что сделало актуальной задачу оценки изменений содержания МПО и ЛКБ у пациентов с данной патологией при АКШ. В подгруппе пациентов с благоприятным исходом оперативного лечения отмечено достоверное увеличение числа лейкоцитов на 22% (p≤0,05), главным образом за счет увеличения нейтрофилов на 65% относительно исходного уровня. осложнениями В подгруппе воспалительного пациентов характера с послеоперационными достоверное увеличение лейкоцитов составило 28% также, в основном, вследствие прироста нейтрофилов на 51% (p≤0,05) по сравнению с дооперационным уровнем. Достоверное увеличение на 21% от общего количества лейкоцитов и нейтрофилов на 41% (p≤0,05) наблюдалось и в подгруппе с послеоперационными осложнениями ишемического генеза (рисунок 5). 12 10 * * * 8 * * * 6 Лейкоциты Нейтрофилы 4 2 0 До операции Группа без осложнений Ишемические осложнения Воспалительные осложнения Рис. 5. Нейтрофильная реакция крови при ишемической болезни сердца у пациентов после аортокоронарного шунтирования Примечание: *p<0,05 по сравнению с дооперационным уровнем При оценке системы нейтрофильных гранулоцитов в подгруппе с ишемическими осложнениями СЦК МПО был достоверно ниже контрольных значений на 47% (p≤0,05). Также отмечается достоверное увеличение СЦК ЛКБ на 60% (p≤0,05) (рисунок 6). Хотелось бы отметить тот факт, что все ишемические осложнения в ближайшем послеоперационном периоде были выявлены у пациентов, оперированных с использованием аппарата искусственного кровообращения. Снижение содержания МПО в клетке, вероятно, связано с дегрануляцией нейтрофилов. Таким образом, снижение активности МПО до операции по сравнению с группой контроля, и увеличение ЛКБ является вероятным фактором риска развития ишемических осложнений после АКШ. Следует отметить определенную простоту и скорость исполнения этих цитохимических тестов. 3 2,5 * 2 МПО, СЦК 1,5 ЛКТ, СЦК * 1 0,5 0 1 2 3 4 5 Рис.6. Функционально-метоболическая активность нейтрофилов при ишемической болезни сердца после аортокоронарного шунтирования с различным послеоперационным периодом 1 –пациенты с ИБС до операции АКШ 2 –пациенты с ИБС после операции АКШ, без осложнений 3 –пациенты с ИБС после операции АКШ, с ишемическими осложнениями 4 –пациенты с ИБС после операции АКШ, с воспалительными осложнениями 5 –контрольная группа (доноры) Примечание: *p<0,05 по сравнению с группой контроля На основании установленной зависимости между уровнем функционально-метаболической активности нейтрофилов и характером повреждения сердечной мышцы методом логистической регрессии было разработано решающее правило, которое позволяет выявить ОИМ и дифференцировать его от стабильной стенокардии II-III ФК. Оказалось, что достаточным для этого являются известный уровень нейтрофилов, совокупное содержание моноцитов, эозинофилов и базофилов (MID), а также известные концентрации АЛТ и фибриногена. Решающее правило для пациентов с ангинальной болью за грудиной: У= 5,05 – 0,48 × NEU – 0,03 × ALT + 1,33 × MID – 0,32 × ФИБР ± 0,09 при значении Y<0 (со знаком минус) пациента относят к группе ОИМ при значении Y>0 (со знаком плюс) пациента относят к группе стабильной стенокардии II-III ФК Чувствительность данного уравнения по группе ОИМ 90%, специфичность 83%, эффективность 86% . Следует отметить, что в данном уравнении наибольшее значение имеет общее содержание нейтрофилов, в то время как уровни МПО и ЛКБ не имели значения для построения решающего правила. Однако, это не исключает вероятности использования определения МПО и ЛКБ в лабораторном мониторинге при ИБС, в частности – цитометрическим методом. Таким образом, нейтрофильные гранулоциты являются клетками, участвующими в воспалении, и рассматриваются участниками прогрессирования ИБС. На этом основано и их применение в диагностике ИБС. Нами показана возможность использования цитохимической оценки нейтрофилов в иммунологическом лабораторном мониторинге, в частности – в ранней диагностике послеоперационных осложнений после АКШ. ВЫВОДЫ: 1. Нейтрофильный лейкоцитоз сопровождается при изменением остром инфаркте показателей миокарда функционально- метаболической активности нейтрофилов периферической крови, прежде всего снижением активности миелопероксидазы, что коррелирует с уровнем маркеров повреждения миокарда. 2. Снижение активности миелопероксидазы и увеличение активности лизосомальных катионных белков у пациентов с ишемической болезнью сердца является вероятным признаком развития кардиальных ишемических осложнений после аортокоронарного шунтирования. 3. Определение активности миелопероксидазы и лизосомальных катионных белков по диагностическим характеристикам не исключают применения стандартных маркеров повреждения миокарда, но характеризуются удовлетворительными диагностическими свойствами, а также простотой исполнения и экономичностью. 4. Иммунофенотипирование нейтрофильных гранулоцитов является адекватным способом оценки внутриклеточной миелопероксидазы и может быть использовано в лабораторном иммунологическом мониторинге пациентов с ишемической болезнью сердца. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При исследовании пациентов с ИБС рекомендуется определение уровня миелопероксидазы в нейтрофилах т.к. изменение ее активности коррелирует с уровнем маркеров повреждения миокарда в крови. 2. При подозрении ишемических на развитие осложнений у послеоперационных пациентов с ИБС кардиальных рекомендуется определение миелопероксидазы в нейтрофилах поскольку позволяет прогнозировать возможность развития данных осложнений. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Базарный В.В. Оценка функционально-метоболической активности нейтрофилов при ишемической болезни сердца / В.В. Базарный, Ю.В. Шилко, Е.А. Тихонина, О.В. Бердюгина, Н.К. Левчик // Медицинская Иммунология. - 2006. - Т.8. - № 2-3. - С.394. 2. Тихонина Е.А. Тропонин: современные взгляды на клинико- диагностическое значение его определения / Е.А. Тихонина // Вестник первой областной клинической больницы. - 2006. - выпуск XV. - №2. - С.2327. 3. Тихонина Е.А. Особенности функционально-метаболической активности нейтрофилов при ишемической болезни сердца / Е.А. Тихонина, Ю.В. Шилко, В.В. Базарный, О.В. Бердюгина // Материалы V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» Оренбург. - 2006. - №1(5). - С.75. 4. Базарный В.В. К вопросу об участии иммунной системы в восстановительных процессах / В.В. Базарный, П.И. Щеколдин, Е.А. Тихонина, И.Е. Валамина, А.И. Исайкин, О.Н. Селянина, А.В. Шешенина, Н.Б. Крохина, О.В. Бердюгина // Материалы V конференции Иммунологов Урала.- Иммунология Урала.- 2006.- № 1(5).-С.2. 5. Базарный В.В. Цитохимическая характеристика нейтрофильных гранулоцитов при различных вариантах ишемической болезни сердца / В.В. Базарный, Е.А. Тихонина, Ю.В. Шилко // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - №8. - С.48-49. 6. Базарный В.В. Новый взгляд на оценку лейкоцитарной реакции при ишемической болезни сердца / В.В. Базарный, Ю.В. Шилко, Е.А. Тихонина // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - №9. - С.4445. 7. Тихонина Е.А. Клиническое значение определения оксида азота в ряду диагностических тестов при ишемической болезни сердца / Е.А. Тихонина, К.В. Кондрашов, Ю.В. Шилко, Д.А. Мазеин, С.Я. Маларева, Н.С. Киселев, В.В. Базарный // Труды научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года». - 2009. - С.79. 8. Базарный В.В. Морфо-функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов при аортокоронарном шунтировании / В.В. Базарный, Е.А. Тихонина, К.В. Кондрашов // Труды научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года». - 2009. - С.100. 9. Базарный В.В. иммуноориентированных Экспериментальное технологий для обоснование коррекции восстановительных процессов / В.В. Базарный, О.Ю. Береснева, И.Е. Валамина, А.П. Исайкин, Н.С. Киселев, Н.Б. Крохина, Т.М. Мельникова, Д.С. Самойлов, О.Н. Селянина, Е.А. Тихонина, П.И. Щеколдин // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009.- № 2.- С.118-121. Тихонина Елена Александровна ОЦЕНКА СИСТЕМЫ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 17.11.2010г. Формат 60х84 1/16 Усл. п. л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 187. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «Ажур», 620000, г. Екатеринбург, ул. Нагорная, д. 12.