Ученые еще на шаг приблизились к лечению Х

Ученые еще на шаг приблизились к лечению Х-сцепленных заболеваний
Герасимова Кристина
Развитие организма всех млекопитающих, в том числе и человека,
происходит
всего
из
одной
клетки—зиготы.
Зигота
в
результате
последовательного деления дает все типы органов и тканей, из которых состоит
человек, а их в нашем организме более 200 типов. Этот сложный и удивительный
процесс называется дифференцировкой, а клетки способные давать различные
типы тканей— стволовыми. Стволовые клетки обладают свойством
плюрипотентности, то есть способностью сформировать целый взрослый
организм. При делении каждой стволовой клетки образуется одна клетка
идентичная ей, так же обладающая плюрипотентностью и вторая клетка, уже
принадлежащая к определенному клеточному типу, из которой в дальнейшем
сформируются все ткани организма.
Стволовые
клетки
имеют
огромный
потенциал
применения
в
регенеративной медицине, а также при лечении других заболеваний. Если их
внедрить, например, в ткани сердца, поврежденные после инфаркта, то они
немедленно запустят программу, способствующую быстрому росту и
восстановлению клеток соответствующего типа. Это
приведет к практически полному восстановлению функций сердца у больного.
Однако, существуют очень серьезные проблемы, препятствующие такой практике.
Для эффективного лечения необходимо большое количество стволовых клеток,
взятых у конкретного пациента, а во взрослом организме они присутствуют в
ничтожном количестве. Огромный запас стволовых клеток находится в
эмбриональных тканях. Такой тип клеток, так называемых эмбриональных
стволовых клеток (ЭСК), возможно культивировать в лаборатории на пластике и
нарабатывать в неограниченном количестве, с дальнейшим их использованием в
клинической практике. Однако, для человека это не приемлемо по этическим
нормам.
Решение этой проблемы в 2006 году было предложено группой японских
ученых под руководством Синъя Яманака, за что он получил Нобелевскую
премию в 2012 г. Ими был разработан метод, позволяющий из
дифференцированных клеток взрослого организма, например из клеток кожи—
фибробластов, получать плюрипотентные стволовые клетки, то есть
поворачивать клеточную программу вспять. Яманака с сотрудниками добились
таких потрясающих результатов, посредством доставки в клетки нескольких
белков— транскрипционных факторов, запускающих работу генов, ответственных
за плюрипотентное состояние. Этот тип клеток получил название индуцированных
плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). ИПСК обладают практически всеми
свойствами эмбриональных стволовых клеток и имеют схожую с ними
морфологию.
Применение ИПСК в клинической практике будет эффективно при лечении
онкопатологии, последствий инсультов и инфарктов, хронических заболеваний
нервной системы (болезней Альцгеймера и Паркинсона), сахарного диабета, и
других широко распространенных болезней человека. Кроме этого исследования
ИПСК имеют большую научную ценность для понимания явления
плюрипотентности, а также молекулярных и генетических механизмов
преобразования соматических клеток к плюрипотентному состоянию.
Особое значение
имеет изучение
статуса
Х-хромосом в женских
человеческих линиях плюрипотентных стволовых клетках—ИПСК и ЭСК. У
человека, как и других млекопитающих, у представителей женского пола при
развитии эмбриона происходит инактивация одной из двух Х-хромосом, то есть
гены на одной хромосоме перестают работать. Таким образом, каждая Ххромосома имеет свой статус, она может быть активной либо неактивной.
Предполагают, что этот механизм возник у предков млекопитающих из-за
необходимости компенсировать дозы генов у самок. Так как женский пол
определяется сочетанием половых хромосом ХХ, а мужской—ХУ, но Y-хромосома
содержит лишь несколько десятков генов, а Х-хромосома – около тысячи генов.
Инактивация одной Х-хромосомы у женщин приводит к тому, что у
представителей обоих полов активной является только одна копия генов Ххромосом, и соответственно в клетках синтезируется приблизительно равное
количество продуктов Х-сцепленных генов.
На данный момент процесс инактивации Х-хромосомы изучен плохо.
Детальное изучение этого вопроса необходимо для выяснения вклада процесса
инактивации Х-хромосомы в клиническую картину заболеваний, гены которых
локализованы на Х-хромосоме. Описано более 370 таких болезней. Тяжесть
проявления этих заболевания зависит от пола. Полные формы болезни
проявляются преимущественно у мужчин, поскольку гены, ответственные за
проявление болезни локализованы на единственной Х-хромосоме. У женщин в
зависимости от того какая из Х-хромосом будет инактивирована течение болезни
будет проходить по-разному. Так как у женщин в каждой соматической клетке
случайным образом инактивируется одна из двух Х-хромосом, она может быть с
равной вероятностью отцовской или материнской. Инактивация стабильно
поддерживается в ряду клеточных поколений, поэтому все потомство исходной
клетки наследует те же активную и неактивную Х-хромосомы.
Таким образом, организм каждой женщины мозаичен, в одних клетках
работает отцовская Х-хромосома, а в других - материнская. Если одна из Ххромосом несет мутантный ген, то примерно половина клеток будет иметь
нормальный фенотип, а другая половина - измененный. Это соотношение может
стать иным, если вероятность выживания клеток, несущих нормальный ген на Ххромосоме выше, чем у клеток, несущих мутантный ген.
Таким образом, у
женщины наличие и степень тяжести болезни
определяется соотношением клеток с активными мутантными и нормальными Ххромосомами в каждой ткани. Установлено, что приблизительно у 22% женщин
выявляется ассиметричная (неравновероятная) инактивация Х-хромосом. В ряде
случаев она связана с мутациями генов, регулирующих выбор Х-хромосомы для
инактивации, что тоже вносит существенный вклад в проявление многих Хсцепленных болезней у женщин. Поскольку характер инактивации Х-хромосомы важнейший фактор, определяющий проявление многих Х-сцепленных болезней у
женщин, его необходимо учитывать при планировании клеточной терапии, в
особенности, когда речь идет о применении плюрипотентных клеток, в том числе
ИПСК.
В
различных
линиях
женских
человеческих
индуцированных
плюрипотентных стволовых клетках статус Х-хромосом может быть различным. В
некоторых случаях линия ИПСК может содержать две активные Х-хромосомы.
Подобные клеточные культуры невозможно применять в клинической практике.
Поэтому так важно проводить исследования с целью понять механизмы
инактивации Х-хромосомы и определить условия, влияющие на этот процесс.
Результаты последних исследований группы американских ученных
помогли приблизиться к ответу на эти вопросы. Они установили, что статус Ххромосом в линиях ИПСК человека зависит от условий их получения и
культивирования.
Авторы разработали эффективный метод получения стабильных линий
ИПСК человека с двумя активными Х-хромосомами.
При стандартном
культивировании линий ИПСК в лаборатории используются специальные
пластмассовые чашки Петри. Сначала на дно чашки высаживается «подложка»,
которая представляет собой человеческие либо мышиные фибробласты (клетки
кожи), обработанные особыми реагентами, препятствующими их дальнейшему
делению. Такая «подложка»— фидер, необходима для выработки факторов
способствующих активному росту ИПСК. После чего на фидер в специальную
культуральную среду высаживается нужная линия ИПСК. Суть эксперимента
заключалась в культивировании линий ИПСК на
SNL-фидере, в качестве
«подложки». SNL-фидер это особая линия фибробластов мыши, отличающаяся
способностью синтезировать дополнительный фактор LIF (Leukemia inhibitory
factor—фактор ингибирующий лейкемию), который является рекомбинантным
белком и относится к семейству интерлейкинов IL-6.
В ходе эксперимента использовалась культура эмбриональных стволовых
клеток человека—линия Н9. Об этой линии известно, что в ней одна из двух Ххромосом инактивирована, то есть экспрессии (работы) Х-сцепленных генов не
наблюдается. Данную линию при помощи особых условий культивирования
запускали в дифференцировку, с получением клеток, относящихся к различным
типам тканей. В ходе дальнейшего эксперимента использовались не все клетки, а
только фибробласты. Был проведен их молекулярный и цитогенетический анализ,
который
показал,
что
одна
из
Х-хромосом
по-прежнему
остается
инактивированной.
После
чего
культуру
фибробластов
подвергли
репрограммированию и получили несколько линий ИПСК. Дальнейшая работа
была направлена на изучение статуса Х-хромосом в полученных линиях ИПСК
после пересадки их на SNL-фидер. При пересадке линий ИПСК происходит смена
пассажа с первого на второй, и так далее. Анализ данных клеточных культур был
проведен на ранних пассажах, а также после длительного культивирования на
SNL-фидере, более чем десять пассажей.
Полученные результаты показали, что при культивировании линий ИПСК на
SNL-фидере действительно происходит реактивация второй Х-хромосомы и обе
Х-хромосомы являются активными. В ходе эксперимента авторы выяснили, что
реактивация Х-хромосомы происходит под воздействием фактора LIF, который
продуцирует
SNL-фидер,
а
также
что
именно
продолжительность
культивирования на SNL-фидере влияет на статус Х-хромосом. Реактивация
одной из Х-хромосом происходит не сразу после пересадки на SNL-фидер, а
необходимо культивирование в течение 10-15 пассажей, чтобы она произошла.
Данное исследование приближает нас к определению факторов, с помощью
которых возможно будет управление статусом Х-хромосом в человеческих
женских плюрипотентных стволовых клетках, что решит многие проблемы в
клинической практике и сделает возможным лечение многих заболеваний, гены
которых находятся на Х-хромосомах.