УДК 575.22. Тюлькин С.В Хатыпов И.И

УДК 575.22.
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПРОВЕДЕНИЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР ДЛЯ
ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И В ГЕНА
КАППА-КАЗЕИНА
*Тюлькин С.В. – к.с.-х.н., зав. отдела; **Муратова А.В. – руководитель отдела;
***Хатыпов И.И. – вед. Специалист; Ахметов Т.М. – д.б.н., доцент; Равилов Р.Х. – д.в.н.,
профессор, зав. кафедрой; *Вафин Р.Р. – д.б.н., науч. консультант
*Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория, г. Казань
**ООО «АМС Медиа», г. Москва
***ООО УК «Просто молоко», г. Казань
Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: АС-ПЦР, ДНК, аллель, генотип, ген каппа-казеина, CSN3.
Key words: AS-PCR, DNA, allele, genotype, kappa-casein gene, CSN3.
(CSN3) однозначно ассоциируется с
Основной
задачей
молочного
признаками
белковомолочности
и
скотоводства
является
получение
технологическими свойствами молока у
высокопродуктивных животных, дающих
крупного
рогатого
скота
[3,
1],
молоко с большим содержанием белка и
исследования, касающиеся этого гена
обладающее хорошими технологическими
являются актуальными. Наши исследования
свойствами. Однако селекционная работа,
построенная на традиционных подходах,
заключались в разработке способа АС-ПЦР
имеет, небольшой селекционный эффект. В
для генотипирования крупного рогатого
настоящее
время,
с
развитием
скота по аллелям А и В гена CSN3.
молекулярной генетики и биологии,
Материал
и
методика
становиться возможным идентификация
исследований. Экстракция нуклеиновой
огромного
числа
генов.
Выявление
кислоты из образцов цельной крови
предпочтительных с точки зрения селекции
крупного рогатого скота, консервированной
генотипов позволит дополнительно к
осуществлялась
10
мМ
ЭДТА-Na2,
традиционному
отбору
животных
сорбционным способом (коммерческий
проводить селекцию непосредственно на
набор
«ДНК-сорб
В»,
производства
уровне ДНК [2].
ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).
В связи с тем, что ген каппа-казеина
Генотипирование крупного рогатого скота по гену CSN3 проводили методом АС-ПЦР.
ПЦР проводили на программируемом 4-канальном амплификаторе «Терцик» (Россия) в объеме
20 мкл, содержащий буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5); 1,5 мМ MgCl2; 25 мМ KCl; 10 мМ
меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100); 0,25 мМ dNTP; 1,0 ед. Taq ДНК полимеразы; по 1,0
мкМ праймеров A-F-d: 5/-GGGGGCTGTTCACACACAAAAACAGTAGAG-3/, A-R-d: 5/B-F-d:
5 /GGGGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTCCG-3/,
/
/
CCCCCGTGAGCCTACAAGTACACCTACGAT-3 ,
B-R-d:
5 -CCCCCGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGCCC-3/, все реактивы производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и
1 мкл ДНК-пробы. Режим был следующий:
×1: 94 0С – 4 мин; ×40: 94 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек;
×1: 72 0С – 7 мин; хранение: 4 0С
310 нм).
Детекцию
результатов
АС-ПЦР
Размеры фрагментов ДНК оценивали
осуществляли методом горизонтального
по
подвижности
в
сравнении
со
электрофореза в 2% агарозном геле в
стандартными ДНК маркерами.
буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий
В
работе
были
использованы
бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с
продукты для молекулярно-биологических
последующей
визуализацией
амплифицированных
продуктов
в
исследований
производства
ООО
ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ =
«СибЭнзим», Россия.
221 отличающийся от ближайшего аналога
изобретения тем, что, используются другие
последовательности
олигонуклеотидных
праймеров, имеющие дополнительные
некомплементарные ни к одному из аллелей
гена CSN3
«mismatch-нуклеотиды» в
позиции
–2
от
3/-терминальных
нуклеотидов праймеров.
По
результатам
практических
исследований, направленных на апробацию
разработанного нами способа проведения
аллель-специфичной
ПЦР
для
генотипирования крупного рогатого скота
по аллелям А и В гена CSN3, нами получен
обеспечиваемый заявленным способом
технический результат, выраженный в
эффективной идентификации генотипов
ввиду
корректной
интерпретации
генерируемых аллель-специфичных ПЦРпродуктов (рисунок 1), сопоставимых с
расчётными данными (рисунок 2).
Результаты
собственных
исследований. К одним из подходов к
оценке аллельного полиморфизма гена
CSN3 крупного рогатого скота относится
изобретение «Способ проведения аллельспецифичной ПЦР для генотипирования
крупного рогатого скота по аллелям А и В
гена каппа-казеина» (Р.Р. Вафин и др.,
2008), являющееся ближайшим аналогом
предлагаемого способа.
Нами разработан способ проведения
аллель-специфичной
ПЦР
для
генотипирования крупного рогатого скота
по аллелям А и В гена CSN3, включающий
подготовку пробы нуклеиновой кислоты,
внесение указанной пробы в реакционную
смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ,
буферной системы, Taq ДНК полимеразы,
4-х
аллель-специфичных
праймеров;
проведение
ПЦР;
детекцию
амплифицированных фрагментов ДНК
методом
гель-электрофореза;
Рисунок 1 – Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения
аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена
CSN3
Обозначения:
М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим);
1-2) генотип AA гена CSN3 кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 242 bp);
3-4) генотип AB гена CSN3 кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 242/156 bp);
5-6) генотип BB гена CSN3 кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 156 bp).
222 Рисунок 2 – Участки посадки праймеров, используемых для генотипирования крупного
рогатого скота по аллелям А и B гена CSN3 предложенным способом проведения аллельспецифичной ПЦР
Вывод.
Разработанный
способ
приемлемым и эффективным способом
проведения аллель-специфичной ПЦР с
генотипирования гена каппа-казеина.
протоколом 2-х стадийной ПЦР является
ЛИТЕРАТУРА: 1. Ахметов, Т.М. Молочная продуктивность коров с разными
комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина / Т.М. Ахметов, С.В. Тюлькин,
Э.Ф. Валиуллина // Ученые записки КГАВМ. – Том. 207. – Казань, 2011.– С. 51-57.
2. Зиннатова, Ф.Ф. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина (CSN3) у коров холмогорской
породы татарстанского типа / Ф.Ф. Зиннатова, А.М. Алимов, Ф.Ф. Зинатов // Учёные записки
Казанской ГАВМ. – 2010. – Т. 204. – С. 93-98. 3. Калашникова, Л.А. Влияние полиморфизма
генов молочных белков и гормонов на молочную продуктивность коров чёрно-пёстрой породы
/ Л.А. Калашникова, Я.А. Хабибрахманова, А.Ш. Тинаев // Доклады РАСХН. – 2009. - № 3. – С.
49-52. 4. Патент РФ на изобретение № 2337141 Способ проведение аллель-специфичной ПЦР
для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина / Р.Р.
Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, Р.Р. Вафин. – Приоритет изобретения
25.09.2006. – Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 27.10.2008. – Бюл. № 30.
223 РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПРОВЕДЕНИЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР ДЛЯ
ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И В ГЕНА
КАППА-КАЗЕИНА
Тюлькин С.В., Муратова А.В., Хатыпов И.И., Ахметов Т.М., Равилов Р.Х., Вафин Р.Р.
Резюме
Целью данной работы являлась разработка способа генотипирования крупного рогатого
скота по гену CSN3 на основе аллель-специфичной ПЦР. Полученные результаты АС-ПЦР гена
CSN3 крупного рогатого скота с разработанными праймерами являются удовлетворительными
в плане точности идентификации генотипов.
AN INVENTION OF CATTLE GENOTYPING MEANS BY KAPPA-CASEIN GENE OF ALLELESPECIFIC PCR FOR ALLELES A AND B
Tyulkin S.V., Muratova A.V., Khatipov I.I., Ahmetov T.M., Ravilov R.H., Vafin R.R.
Summary
The aim of this work was an invention of cattle genotyping means by CSN3 gene on the basis of
allele-specific PCR. The derived results of AS-PCR by cattle CSN3 gene with invented primers are
satisfactory by exact identification of genotypes.
УДК 636.085.16:636.2
ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНАЯ СПОСОБНОСТЬ КОРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
КОРМОВЫХ ДОБАВОК «САПРОМИКС»
Файзрахманов Р.Н. - к.с.-х.н., доцент; *Шакиров Ш.К. – д.с.-х.н., профессор;
Файзрахманов Р.Н. - аспирант.
Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана,
* Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, г. Казань
тел.: (843)273-97-15
Ключевые слова: кормовая добавка, коровы, воспроизводство, молодняк.
Key words: the feed additive, cow, reproduction, young animals.
воспроизводства коров.
Материал и методы исследований.
Материалами исследований стали белкововитаминно-минеральный
концентрат
«Сапромикс» (БВМК) и амидо-витаминноминеральный концентрат «Сапромикс»
(АВМК),
изготовленные
на
основе
минерала сапропель месторождения оз.
Белое Тукаевского района Республики
Татарстан; коровы холмогорской породы.
Для решения поставленной цели
нами, был проведен научно-хозяйственный
опыт на базе ООО «Дусым» Атнинского
района Республики Татарстан. По принципу
аналогов были отобраны 3 группы коров по
10 голов в каждой с учетом породности,
возраста, живой массы, уровня молочной
продуктивности
и
физиологического
Одним из основных путей снижения
себестоимости продукции скотоводства
наряду
с
совершенствованием
существующих
пород,
внедрением
ресурсосберегающих
технологий
и
комплексной
механизации
основных
процессов является внедрение в кормление
крупного рогатого скота современных
кормовых добавок [2,3].
Перспективность
использования
биологически
активных
веществ
определяется тем, что данные добавки
улучшают усвояемость кормов, повышают
воспроизводительные
качества
и
сохранность молодняка[1,4].
Цель исследований заключалась в
изучении влияния кормовых добавок
«Сапромикс»
на
показатели
224