1 На правах рукописи РАМАЗАНОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСЕЕВНА

На правах рукописи
РАМАЗАНОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСЕЕВНА
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СОРТОВ СОИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
06.01.05 – селекция и семеноводство
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
1
Краснодар – 2008
Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательскоий
институт масличных культур им. В.С. Пустовойта» Россельхозакадемии
в 2005-2008 г.г.
Научный руководитель: доктор биологических наук,
АНТОНОВА Татьяна Сергеевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
ТРОШИН Леонид Петрович
кандидат биологических наук,
СУПРУН Иван Иванович
Ведущая организация:
ГНУ Краснодарский научно-исследовательский
институт сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко
Защита диссертации состоится «30» октября 2008 г. в 9 ч. 00 мин. на
заседании диссертационного совета Д 220.038.03 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044,
г. Краснодар, ул. Калинина, 13.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом – на
сайте http://www.kubagro.ru
Автореферат разослан и размещен на сайте « » _____________2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного
совета
Кравцов А.М.
2
1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Соя – это культурное растение, по последней классификации относящееся к семейству Бобовые (Leguminosae
(Fabaceae)), подсемейству Мотыльковые (Papilionaceae), трибе Фасолевые
(Phaseoleae), подтрибе Глициниевые (Glycininae Benth.), роду Соя (Glycine),
подроду Soja, виду G.max, подвиду(ssp.) manshurica. (Зеленцов, Кочегура,2006).
В мировом производстве белка соя является ведущей зернобобовой культурой. Среди всех сельскохозяйственных культур ей нет равных по богатству
и разнообразию содержащихся в зерне полезных химических веществ.
На современном этапе в успешной реализации селекционных программ большое значение имеет идентификация генотипов, поэтому актуальной задачей является паспортизация сортов, гибридов и исходных форм
в соответствии с международными нормами.
Для сои характерно большое разнообразие морфологических признаков. С их помощью в настоящее время оценивают генофонд популяций,
уровень изменчивости, генетическое разнообразие и др. Но иногда их бывает недостаточно для того, чтобы идентифицировать селекционный материал.
Наиболее удобными для описания генотипов являются молекулярногенетические маркеры, то есть запасные белки, изоферменты и полиморфные фрагменты ДНК. Они в меньшей мере подвержены фенотипической
изменчивости и, в большинстве случаев, имеют кодоминантный тип наследования. На их основе проводится биохимическая паспортизация сортов и
гибридов многих сельскохозяйственных культур. Данные биохимической
паспортизации можно использовать при регистрации сортов и гибридов, а
так же для защиты прав селекционеров.
В настоящее время наблюдается тенденция к увеличению посевных
площадей сои в Краснодарском крае. Во ВНИИМК в результате успешной
3
селекции созданы новые сорта этой культуры, разнообразные по своим характеристикам и назначению. Недалек выход на международный рынок, когда потребуется сертификация семенного материала в соответствии с международными требованиями. Поэтому актуально провести исследования по
подбору молекулярных маркеров для идентификации и паспортизации сортов сои селекции ВНИИМК на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов.
Микросателлитные последовательности ДНК являются наиболее доступными, простыми, удобными и относительно недорогими маркерами,
пригодными, прежде всего, для идентификации генотипов. Их преимущественно кодоминантное наследование позволяет отличать гомо- и гетерозиготные растения. Это имеет большое значение для раннего распознавания
ложных гибридов сои, что позволяет существенно экономить время, при
создании новых селекционно-значимых исходных форм.
Цель работы. Целью работы являлось создание системы маркеров
пригодной для идентификации и паспортизации генотипов сои на основе
молекулярно-генетического
полиморфизма
микросателлитных локусов
ДНК. В связи с этим для выполнения работы были поставлены следующие
задачи:
1. Оптимизировать условия проведения ПЦР-анализа ДНК для образцов
сои.
2. Апробировать праймеры на микросателлитные последовательности
ДНК сои.
3. Оценить степень полиморфизма микросателлитных локусов ДНК сои
и создать систему маркеров для дифференциации сортов сои селекции ВНИИМК.
4. Составить на основе созданной системы микросателлитных маркеров
генетические формулы сортов сои селекции ВНИИМК
4
5. Определить тип наследования выявленных полиморфных локусов
ДНК и выделить пригодные для идентификации гибридов сои.
Научная новизна. В результате проведенных исследований установлен уровень полиморфного информационного содержания 10 микросателлитных локусов ДНК у 58 генотипов сои разного происхождения. Показана
степень генетического родства этих генотипов на основе полиморфных локусов. Выделены 9 микросателлитных локусов ДНК с уровнем полиморфизма, пригодным для молекулярно-генетической дифференциации изученной группы генотипов, в том числе 24 сортов сои селекции ВНИИМК.
Впервые предложена система маркеров и составлены молекулярногенетические формулы 24 сортов сои селекции ВНИИМК на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК. Установлен тип наследования
9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК гибридов сои в F1. Выделены три микросателлитных локуса ДНК с кодоминантным наследованием,
предложенные к использованию в качестве маркеров для идентификации
гибридов сои селекции ВНИИМК.
Практическая значимость работы. Предлагаемая маркерная система на основе микросателлитных локусов ДНК позволяет дифференцировать
генотипы сои, выявлять генетическую однородность сортов. Показана перспективность этой системы для идентификации, паспортизации и сертификации сортов сои. Предложен способ идентификации гибридов сои. Разработаны молекулярно-генетические формулы сортов сои, которые можно
использовать для их паспортизации и сертификации.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника» посвященной 120-летию со дня рождения академика В.С. Пустовойта (ВНИИМК,
Краснодар,
19-22
июля,
2006);
8-й
региональной
научно-
практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агро5
промышленного комплекса» (Краснодар, 7-8 декабря, 2006), 4-й международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур», посвященной
95-летию со дня основания ВНИИМК (Краснодар, 27-29 марта, 2007), 7-й
молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 4 апреля, 2007), VIII съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им Н.И. Вавилова (Алушта, Украина,
24-28 сентября, 2007), II Вавиловской международной конференции (СанктПетербург, 26-30 ноября, 2007).
Публикации по теме диссертационной работы. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе в реферируемых изданиях, утвержденных ВАК – одна.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения
результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах, содержит 16 таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 176
наименований, в том числе, 85 иностранных авторов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводились с 2005 г. по 2008 г. в лаборатории иммунитета и электрофореза ЦЭБ ВНИИМК.
Для идентификации и создания молекулярно-генетических паспортов
были изучены 61 образец, культурной и дикорастущей сои из коллекции
ВНИИМК и ВИР. В работе по изучению наследования микросателлитных
локусов использовались 11 гибридных комбинаций F1, созданные отделом
селекции сои ВНИИМК.
Для выделения ДНК использовали проростки семян сои, полученные
путем инкубации в рулонах фильтровальной бумаги в течение 7-ми суток
6
при комнатной температуре или фрагменты зеленых листьев с растений,
выращенных в поле или камере искусственного климата.
Выделение ДНК проводили по модифицированному методу SaghaiMaroof (1984). Концентрацию выделенной ДНК в полученном препарате
определяли визуально по интенсивности свечения окрашенной бромистым
этидием ДНК в 1% агарозном геле (Остерман, 1981).
Для амплификации выделенной ДНК были использованы 11 SSRпраймеров, отобранных из литературных источников (Morgante et al., 1995;
Rongven et al, 1995; Hossain et al., 2000). Пары праймеров были синтезированы фирмой ЗАО «Синтол», Москва.
Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме реакционной
смеси 25 мкл содержащем: 67 мМ трис- HCl, рН8.8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5-3 мM MgCl2; 0.01% Tween 20; по 0.2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пкМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 единицу рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы производства Госниигенетика (Москва). Амплификацию проводили в приборе Терцик (ДНКтехнология, Россия).
Для проведения полимеразной цепной реакции применяли следующие
температурные режимы: начальная денатурация при 96ºС в течении 2 мин;
следующие 32 цикла: 30 с – денатурация при 94 ºС; 40 с – отжиг праймера
при 45-60ºС (в зависимости от праймера); 1 мин – элонгация при 70ºС; заключительная элонгация при 70 ºС в течении 2 мин.
Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле
(2% агароза, ТАЕ-буфер, с добавлением 2мкл BrEt) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE.1, ДНК-технология, Россия).
Документировали результаты электрофореза с помощью видеосистемы (ДНК-технология, Россия) с программным обеспечением Gel Imager-2.
Размер аллелей микросателлитных локусов определяли с использованием программы Gel-Pro Analyzer 3.1. Статистическую обработку результа7
тов и построение дендрограмм проводили с помощью кластерного анализа
методом Уорда в программе STATISTICA 6.0.
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Апробирование и подбор оптимальных условий для анализа
микросателлитных последовательностей ДНК генотипов сои
При создании системы маркеров на основе микросателлитных локусов ДНК первоначальным этапом работы является проведение предварительных экспериментов по оптимизации методики ПЦР-анализа.
В ходе работы выяснилось, что в качестве материала для выделения
ДНК сои можно использовать зеленые листья растений любой фазы развития. Но наиболее пригодный материал для выделения ДНК – это примордиальные листья 5-7 дневных проростков, либо кончики корешков длиною
1-1,5 см, так как проростки можно вырастить в лабораторных условиях в
любое время года.
Для использованных, одиннадцати пар праймеров, была вычислена
теоретическая температура отжига. Но, как правило, она является приблизительной и требует оптимизации. Экспериментально были подобраны оптимальные температуры отжига. Реакции ПЦР проводились по четырем
программам с разными температурами отжига 45ºС, 50ºС, 55ºС, 60ºС.
Известно, что чем выше температура отжига, тем меньше вероятность
неспецифичного связывания праймера с матричной ДНК, т. е. снижение
температуры отжига ведет к гибридизации праймера с не полностью комплементарной ему последовательностью нуклеотидов. При этом могут появляться дополнительные, невоспроизводимые фракции ДНК.
В таблице 1 показано сравнение теоретических и экспериментальных
температур отжига для выбранных праймеров. При экспериментально подобранных температурах практически со всеми праймерами количество
8
продуцируемых фракций равно количеству полиморфных или разница между ними минимальна.
При работе с молекулярными маркерами для селекционных задач
важным фактором является время, затрачиваемое на проведение анализа.
Поэтому для каждого праймера было подобрано свое время проведения
электрофореза.
Таким образом, была оптимизирована методика выделения ДНК из
листьев и проростков сои. Подобраны оптимальные условия амплификации
ДНК и электрофоретического разделения продуктов ПЦР с одиннадцатью
парами праймеров, фланкирующих микросателлитные последовательности
ДНК. В результате два праймера были исключены из работы (Sat43 и
138ct04), а остальные в дальнейшем использовались для идентификации и
паспортизации сортов и гибридов сои.
Таблица 1 - Оптимальные температуры отжига для праймеров, фланкирующих одиннадцать микросателлитных локусов
Температура отжига (Сº)
Локус
Satt 1
Satt 2
Satt 5
Satt 9
Suypr 1
Soygy 2
Sat 1
Sat 36
Sat 43
Soyhsp176
138ct04
теоретическая
60
63
58
61
68
66
70
72
64
67
60
экспериментальная
60
60
55
45
60
55
60
55
55
60
60
9
Количество
Количество
продуцируемых полиморфных
фракций
фракций
4
2
4
5
3
2
6
3
5
4
3
4
2
4
5
2
2
4
3
2
3
0
3.2. Полиморфизм сортов сои по микросателлитным локусам
Поскольку соя является самоопыляющейся культурой, предполагается,
что культивируемые сорта генетически однородны. Однако бывают исключения. Для проверки предположения о генетической однородности сортов
был исследован внутрисортовой
полиморфизм
сортов сои селекции
ВНИИИМК. Для этого были выбраны два сорта Фора и Лада и проведен
анализ ДНК, выделенной отдельно из 10 проростков, по девяти микросателлитным локусам.
У сорта Фора внутрисортовой полиморфизм отсутствовал по всем 9
локусам. А сорт Лада по четырем локусам оказался неоднороден, что свидетельствует о его внутрисортовом полиморфизме (рис. 2).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 М
11
Рисунок 2 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК сорта сои Лада по
локусу Satt 5. Дорожки 1-10 ДНК отдельных растений, 11-смесь ДНК, М –
маркер молекулярного веса 100 bp DNA Ladder
При создании молекулярно-генетического паспорта сорта сои требуется учитывать внутрисортовой полиморфизм. Но паспортизировать сорта
по выборке из 10 индивидуальных растений не представлялось возможным
по техническим причинам. Поэтому в целях экономии времени, ресурсов и
соответственно стоимости анализов на примере сорта Лада был проведен
эксперимент по оптимизации количества необходимых ПЦР для создания
паспорта сорта. В результате было установлено, что при наличии 30% и
более «нетипичных» растений на фореграммах выявляются две фракции
(рис.2, дорожка 11).
10
Таким образом, при создании молекулярно-генетического паспорта
сорта сои целесообразно анализировать смесь ДНК не менее 10 растений.
Если же на фореграмме обнаруживаются двойные фракции, при необходимости следует выполнять анализ ДНК отдельно по каждому растению чтобы определить степень внутрисортового полиморфизма.
3.3. Анализ генетического разнообразия коллекции генотипов сои
на основе полиморфизма микросателлитных локусов
Для культурной сои высокий уровень полиморфизма удалось обнаружить только по микросателлитным локусам (Keim et al., 1989; Глазко, 2000).
Этим и определяется ценность данного метода для оценки генетического
разнообразия и достоверной идентификации сортов.
Вся изученная коллекция генотипов была проанализирована по 9 локусам (табл.2). Дискриминационные возможности этой маркерной системы
были оценены отдельно для трех групп образцов сои. Это – сорта селекции
ВНИИМК; сорта и линии других Российских и зарубежных селекцентров и
образцы полукультурной и дикорастущей сои (G.gracilis) и (G. soya).
Таблица 2 – Характеристика исследованных микросателлитных локусов
Локус
Satt1
Satt2
Satt5
Satt9
Soypr1
Soygy2
Sat1
Sat36
Soyhsp176
Повтор
(ATT)24
Последовательности фланкирующих Молекулярпраймеров 5’-3’
ный вес (п.н.)
f - AGT ACA TAG ATA TTA AAG TCT
141-150
r - AAA TGA TGA ACG TGA ATT ATT
f - AAT AAT GTG GAA ACT AAA TGG
r - TAA TGT GCC TAT CCT TGT CTT
f - TAT CCT AGA GAA GAA CTA AAA AA
(TAA)21 r - GTC GAT TAG GCT TGA AAT A
f - ATT ACT AGA GAA ATT AGT TTA
(AAT)12 r - CTT ACT AGG GTA TTA ACC CTT
AGA GCT ACG TGC CAA ATT
(TAT)20 fr -- CGA
GTT AGA AAA CTC CGC CCA CAC
ATT GAA AGT GTC ACA CCC C
(AT)9(ATT)6 rf -- AAA
TTA AAA TCG ATT AAT TGG CAT GA
f - CTG GTG GAC TAT TGA TAC GAC C
(AT)17
r - AAC TGC GAA GAT ACT ACC CTC C
f - AAA GTC ATA ACT GGC ACT CCA AGT TT
(AT)19
r - GAA CAT AAC AAT AAT AAA TAT AGC TC
f - TGT GGG CCA CAA AAC GTA TAG
(AT)15
r - CGT ACG TTC TAG CTA GTC TTC
(AAT)18
11
140-152
157-177
142-221
163-188
167-175
188-235
115-185
118-135
3.3.1. Анализ генетического разнообразия сортов сои
селекции ВНИИМК
Результаты амплификации ДНК 24 сортов сои селекции ВНИИМК
показали, что из девяти изученных SSR-локусов восемь оказались полиаллельными, а один – Soygy2 мономорфным. Всего в этой группе генотипов
было выявлено 26 аллелей. Среднее значение индекса полиморфного информационного содержания составило 0,50.
Аллели SSR-локусов представлены на фореграммах фрагментами
ДНК разного молекулярного веса (длины пар нуклеотидов). Нумерацию аллелей по каждому локусу проводили следующим образом: фрагмент ДНК с
максимальным значением молекулярного веса обозначали цифрой 1 и далее
по мере уменьшения молекулярного веса цифрами 2, 3, 4, 5 (рис. 3, табл. 3).
Рисунок 3 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК сортов сои по локусу
Satt9. Дорожки 1-9 фрагменты ДНК
сортов, М – маркер молекулярного веса
100 bp DNA Ladder
Рисунок 4 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК
сортов сои по локусу Satt1.
Дорожки 1-4 фрагменты ДНК
сортов, М – маркер молекулярного веса 100 bp DNA Ladder
У сортов сои Вилана и Лада, по нескольким локусам было обнаружено по две фракции разного размера (рис. 4), их обозначали двумя цифрами
через запятую (табл. 3).
12
Таблица 3 – Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК сортов
сои из разных селекцентров
Локусы
Сорта*
Soyhsp
Satt1 Satt2 Satt5 Satt9 Soypr1 Sat1 Sat36
Soygy2
176
Williams
2
2
4
5
1
1
2
3
2
Hood-75
2
2
2
1
2
1
1
3
2
Т-215
4
1
2
4
2
4
1
3
1
Т-201
1
1
4
1
1
2
2
3
2
Stine 52
2
1
4
5
2
2
1
3
2
Stine 01
2
2
4
5
2
1
1
3
2
Аldana
3
2
1
4
2
3
2
3
2
Goldor
1
2
3
5
1
1
2
3
2
Yieso
2
2
1
5
2
3
1
3
2
Petit Jaune de
3
2
4
1
1
3
2
3
2
Hongrie
Bomax
2
2
3
5
1
1
2
2
2
Е-шен-доу
4
1
2
4
2
4
2
3
1
Sari
2
1
2
5
2
2
1
3
2
Sepideh
2
1
3
5
1
1
1
3
2
Sahar
3
1
1
1
2
2
1
3
2
Safi-Abad 1
3
2
2
5
2
2
2
3
2
Shimabara wase
1
2
1
1
1
1
2
2
2
Orinoqua
3
2
2
4
2
1
1
3
2
Юг-30
3
2
2
5
2
3
2
3
2
Офелия
2
1
1
1
2
2
2
3
2
Припять
2
2
2
5
1
2
2
2
2
Ланцетная
2
2
1
2
2
2
2
3
2
Сибниисхоз 6
1
2
3
1
2
1
2
3
2
Приморская 56
1
1
4
3,5
1
2
2
3
2
К-10641
3
2
1
4
2
3
2
3
1
Куба
2
2
3
1
2
1
2
3
2
Селекта 301
4
2
2
1
1
1
2
3
2
Кубанская 4958
4
2
3
5
1
4
2
2
2
*
страна-производитель сорта табл.1, 11
Для изученных сортов сои селекции ВНИИМК были получены уникальные наборы аллелей и составлены молекулярно-генетические паспорта
13
(табл.4). Большими буквами латинского алфавита был обозначен код локуса, а нижний индекс – аллельное состояние данного локуса.
Таблица 4 – Формулы сортов сои селекции ВНИИМК
Сорт
Лань
Лира
Фора
Валента
Дельта
Парма
Рента
РВБ
РВФ
Веста
Вилана
Лакта
Ника
Дива
Диана
Памелла
Д-6
Д-4
Альба
Трембита
Лиана
Лада
Б-2
Дуар ( ВНИИМК,Армавир)
Формула*
А2B2C2D1E1F1G2H3
A1B1C1D3E2F1G2H2
A2B1C2D2E1F4G1H3
A3B2C2D4E1F2G2H3
A3B2C2D5E1F1G2H3
A3B1C1D4E2F2G2H2
A3B2C2D2E1F2G2H3
A3B2C2D3E1F2G2H3
A2B2C2D2E1F2G2H3
A2B1C3D3E1F1G2H3
A3A4B2C2D1E1F2G2H3
A2B2C2D2E1F1G2H3
A2B2C2D1E2F1G2H3
A2B2C1D5E1F1G2H3
A2B1C2D2E3F2G2H3
A3B1C2D3E1F4G2H3
A1B2C1D3E2F1G2H2
A1B2C1D3E2F2G2H2
A2B2C2D3E2F4G2H3
A3B2C4D3E2F3G2H2
A3B2C4D2E2F2G2H2
A3B2C3C2D4E2F2G2H2
A2B2C3D1E1F1G2H3
A4B2C3D1E1F2G2H3
* Примечание: код локуса A-Satt1; B-Satt2; C-Satt5; D-Satt9; E-Soypr1;
F - Sat1; G-Sat36; H-Soyhsp176.
14
Для всех выявленных аллелей по каждому локусу были вычислены
частоты их встречаемости в изученной выборке сортов (рис. 5 и 6).
Рисунок 5 – Частота встречаемости аллелей микросателлитных локусов
Satt1, Satt2, Satt5, Satt9 у сортов сои селекции ВНИИМК
Рисунок 6 – Частота встречаемости аллелей микросателлитных локусов
Soypr1, Sat1, Sat36, Soyhsp176 у сортов сои селекции ВНИИМК
15
У четырех локусов Satt2, Satt5, Sat1, Sat36, Soyhsp176 выявлялись аллели с частотой встречаемости более 50% (аллели – B2, C2, F1, G2 и H3). Это
может свидетельствовать об относительной генетической близости сортов,
создаваемых во ВНИИМК, что, по-видимому, является следствием того,
что сорта создавались на основе небольшого числа исходных популяций.
3.2 Анализ генетического разнообразия сортов сои из разных селекцентров
Анализ 28 сортов сои из разных российских и зарубежных селекцентров по девяти микросателлитным локусам показал, что в этой группе генотипов полиморфны все локусы. Всего было выявлено 27 полиморфных аллелей. Локус Soygy2 в данной коллекции полиморфен, у него обнаружено 2
аллеля. Среднее значение PIC, так же как и у сортов селекции ВНИИМК составило 0,50.
В этой группе генотипов не было получено идентичных наборов аллелей по 9 изученным микросателлитным локусам. На основании этих данных для каждого сорта был создан индивидуальный молекулярногенетический паспорт, по аналогии с сортами селекции ВНИИМК (табл. 5).
В этой группе сортов по локусу Satt9 редкими оказались аллели D2
(Ланцетная) и D3 (Приморская 56). Это сорта российской селекции. У иностранных сортов эти аллели не выявлены. А у сортов селекции ВНИИМК
они имели частоту встречаемости 19,2% и 34,6% соответственно (табл. 4,
рис. 5, 6). Эти аллели, по-видимому, могут характеризовать общий тип сорта сои селекции ВНИИМК.
16
Таблица 5 – Формулы сортов сои разных селекцентров
Сорт
Williams (США)
Hood-75 (-//-)
Т-215 (-//-)
Т-201 (-//-)
Stine 52 (-//-)
Stine 01 (-//-)
Аldana (Польша)
Goldor (Франция)
Yieso (-//-)
Petit Jaune de Hongrie (-//-)
Bomax (Канада)
Е-шен-доу (Китай)
Sari (Иран)
Sepideh (-//-)
Sahar (-//-)
Safi-Abad1 (-//-)
Shimabara wase (Япония)
Orinoqua (Бразилия)
Юг-30 (Украина)
Офелия (-//-)
Припять (Белоруссия)
Ланцетная (Россия, Орел)
Сибниисхоз 6 (Россия, Омск)
Приморская 56 (Приморский край)
Селекта
К-10641 (ВИР)
Кубанская (КОС ВИР)
Формула*
A2B2C4D5E1F1G2H3I2
A2B2C2D1E2F1G1H3I2
A4B1C2D4E2F4G1H3I1
A1B1C4D1E1F2G2H3I2
A2B1C4D5E2F2G1H3I2
A2B2C4D5E2F1G1H3I2
A3B2C1D4E2F3G2H3I2
A1B2C3D5E1F1G2H3I2
A2B2C1D5E2F3G1H3I2
A3B2C4D1E1F3G2H3I2
A2B2C3D5E1F1G2H2I2
A4B1C2D4E2F4G2H3I1
A2B1C2D4E2F2G1H3I2
A2B1C3D5E1F1G1H3I2
A3B1C1D1E2F2G1H3I2
A3B2C2D5E2F2G2H3I2
A1B2C1D1E1F1G2H2I2
A3B2C2D4E2F1G1H3I2
A3B2C2D5E2F3G2H3I2
A2B1C1D1E2F2G2H3I2
A2B2C2D5E1F2G2H2I2
A2B2C1D2E2F2G2H3I2
A1B2C3D1E2F1G2H3I2
A1B1C4D3D5E1F2G2H3I2
A4B2C2D1E1F1G2H3I2
A3B2C1D4E2F3G2H3I1
A4B2C3D5E1F4G2H2I2
A2B2C3D1E2F1G2H3I2
Куба (-//-)
* Примечание: код локуса A-Satt1; B-Satt2; C-Satt5; D-Satt9; E-Soypr1;
F- Sat1; G-Sat36; H-Soyhsp176, I-Soygy2.
17
3.3.3. Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК
дикорастущей сои
Дискриминационный потенциал описанной выше маркерной системы
изучался в выборке дикорастущих генотипов сои. В эту группу вошли три
образца, принадлежащих дикорастущему виду G.soya и промежуточному
между дикорастущей и культурной соей подвиду G.gracilis.
В этой выборке генотипов всего было выявлено 25 аллелей. Среднее
значение PIC , было немного выше, чем в обеих группах культурных сортов
0, 52.
По двум локусам Soygy2 и Soyhsp176 выявлены аллели, не встречающиеся у культурных сортов. Это аллель 3 в локусе Soygy2 и аллель 1 в локусе Soyhsp176. Несмотря на достаточный дискриминационный потенциал
изученной маркерной системы, наборы аллелей у дикорастущих генотипов
Соя-93 и Соя-133 оказались идентичны (табл.6).
Таблица 6 – Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК дикорастущих генотипов сои
Локусы
Генотипы
Satt1 Satt2 Satt5 Satt9 Soypr1 Sat1 Sat36
Soyhsp
Soygy2
176
К-4947 (G.gracilis) 2,4
К-5683 (G.gracilis) 2
1
2
1
2
2
2
1
1
1
3
4
2
4
2
3
1
К-5142 (G.gracilis)
2
2
2
5
2
4
1
1
2
К-1007(G.soya)
4
1
1
3
1
4
2
3
2
Соя-93 (G.soya)
4
2
1
2
2
3
2
2
3
Соя-133 (G.soya)
4
2
1
2
2
3
2
2
3
18
3.3.4. Анализ исходных сортов и их полиплоидных и реплоидных форм
по микросателлитным локусам
При создании разнообразного исходного селекционного материала
сои в селекционной практике используется такое явление, как полиплоидная рекомбинация генома.
Анализ микросателлитных локусов ДНК у исходных сортов Вилана и
Фора, а также их тетраплоидных и реплоидных форм показал, что всего из
девяти микросателлитных локусов в процессе полиплоидной рекомбинации
генома изменения произошли в шести. У трех локусов Soygy2, Sat36 и
Soyhsp176 не произошло изменений ни у тетраплоида, ни у реплоидов
(табл. 7).
Таблица 7 – Полиморфизм микросателлитных локусов у исходных
сортов Вилана и Фора и их полиплоидных и реплоидных форм
ПлоидОбразец
Вилана
Локус
ность
Satt1 Satt2
Satt5
Satt9 Soypr1 Soygy2 Sat1 Sat36
Soyhsp
176
2n=40
3,4
1
2
1
1
2
2
2
3
2n=80
1
2
4
5
1
2
2
2
3
2n=40
2
2
2
1
2
2
1
2
3
Фора
2n=40
2
1
2
2
1
2
2
2
3
СП-1422-1461
2n=40
2
2
2
2,4
1
2
4
2
3
Вилана
тетраплоид
Вилана
реплоид
Возможно, это связано с положением микросателлитного локуса в
хромосоме.
Известно,
что
при
сцеплении
локуса
с
центромерой
расщепление идет по хромосомному типу, т.е. гомологичные хромосомы
ведут себя как случайно комбинирующиеся единицы. При отсутствии
19
сцепления случайно комбинируются не хромосомы, а хроматиды (ИнгеВечтомов, 1989).
Полученные данные показали, что микросателлитные локусы в процессе полиплоидизации и затем реплоидизации претерпевают изменения, в
частности, увеличивается или уменьшается число повторов. По-видимому,
это является еще одним подтверждением гипотезы о полиплоидной рекомбинации генома.
3.3.5 Анализ дискриминационного потенциала маркерной системы для коллекции генотипов сои
Дискриминационный потенциал изученной маркерной системы оказался достаточно высоким для того, чтобы использовать ее для идентификации и паспортизации сортов культурной сои. Были идентифицированы
52 сорта, для каждого из них получены уникальные наборы аллелей, на основании которых составлены их генетические формулы.
По данным о частоте встречаемости аллелей и их размере была
проведена оценка степени генетического родства изученных генотипов сои.
Для этой цели был использован кластерный анализ (метод Уорда) (рис. 6).
Анализ полученного иерархического дендрита позволил выделить в
выборке исследованных генотипов сои два основных кластера.
Как уже отмечалось выше, не удалось различить два дикорастущих
генотипа Соя-93 и Соя-133, а также сорт Ника селекции ВНИИМК и реплоидную форму, полученную из сорта Вилана. Генетическая дистанция между
ними по изученным локусам близка к 0 (рис.6).
20
Рисунок 6 – Дендрограмма генотипов сои
3.4. Анализ типа наследования микросателлитных локусов
В селекции сои при искусственной гибридизации необходимо контролировать образование гибридов. Идентификация гибридов во ВНИИМК
в настоящее время проводится либо согласно разработанной Мякушко с соавторами (1979) методике, либо рулонным способом по цвету гипокотиля
(Трембак, 2001). Первая подразумевает посев семян с пониженной плотностью в поле или в теплице, вторая - проращивание семян в рулонах фильтровальной бумаги в лабораторных условиях. При этом должно соблюдаться
основное условие – родительские формы должны отличаться по морфологическим признакам, которые легко различимы визуально.
Микросателлитные маркеры, если они имеют кодоминантный тип наследования, позволяют легко выявить гибридность в скрещиваниях, когда
родительские формы не отличаются по морфологическим признакам. Из
21
литературных источников известно, что SSR - локусы имеют, как правило,
кодоминантный тип наследования (Кожухова и др., 2004; Солоденко и др.,
2004). Однако нередки исключения. Учитывая это, был проведен анализ типа наследования всех изученных микросателлитных локусов.
Для этого было отобрано 12 гибридных комбинаций родительские
формы, которых отличались друг от друга размером аллелей и проведены
реакции амплификации ДНК родительских форм и гибридов F1.
Анализ наследования показал, что шесть изученных локусов Satt2,
Satt5, Sat1, Soygy2, Sat36 и Soyhsp176 не могут использоваться для распознавания ложных гибридов, так как наследуются доминантно. К тому же, из
них три локуса: Soygy2, Sat36 и Soyhsp176 показали самый низкий уровень
PIC, то есть большинство использованных в скрещиваниях родительских
форм имели аллели одного размера, что не позволило их различить.
Три локуса Satt1, Satt9 и Soypr1 имели кодоминантный тип наследования. У всех гибридов на фореграмме присутствовали как отцовская, так и
материнская фракции ДНК (рис.7).
Рисунок 9 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК
сортов и гибридов сои по локусу Satt9. Дорожки: 1 – Вилана; 2 – F1 (Вилана
х Валента); 3 – Валента; 4 – Офелия; 5 – F1 (Офелия х РВБ); 6 – РВБ; 7 –
Дива; 8 – F1 (Дива х РВФ); 9 – РВФ
Несмотря на то, что выявлено только три локуса с кодоминантным
наследованием, с их помощью можно было оценить все двенадцать, анали22
зированных гибридных комбинаций. Таким образом, их можно использовать для определения гибридности потомств, при создании гибридов сои.
Благодаря проведенным исследованиям, мы можем предложить селекционерам еще один метод идентификации гибридов.
Выводы
1.
Для ПЦР определены оптимальные температуры отжига 11 пар
праймеров на микросателлитные последовательности ДНК сои. Для праймеров Satt1, Satt2, Soypr1, Soygy2, Sat36 Soyhsp176 и 138ct04 оптимальные
температуры отжига в сравнении с теоретически ожидаемыми составляют
60 °С, Для Satt5 и Sat1 – 55°С, для Sat43 – 50°С, для Satt9 – 45°С.
2.
Из одиннадцати пар праймеров, фланкирующих микросател-
литные последовательности ДНК сои, 9 выявили полиморфизм у 52 изученных культурных сортов сои разного происхождения.
3.
Количество выявленных полиморфных аллелей в изученной
группе генотипов по разным локусам варьировало от 2 до 5, Общее количество полиморфных аллелей – 29, среднее – 3,2 на локус.
4.
Уровень полиморфного информационного содержания (PIC)
для изученной группы культурных сортов составил – 0,50, для дикорастущих – 0,52. Дискриминационный потенциал созданной маркерной системы
на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК определен как
достаточный для четкой дифференциации сортов сои селекции ВНИИМК.
5.
По принципу наибольшего сходства при кластерном анализе
изученные генотипы сои группируются в два основных кластера. При этом
сорта селекции ВНИИМК попадают в оба кластера, а пары генотипов Соя93 и Соя-133, Ника и RP Вилана имеют высокий уровень сходства.
6.
Cоздана маркерная система на основе 9 полиморфных микроса-
теллитных локусов ДНК и составлены молекулярно-генетические формулы
52 генотипов сои, в том числе, 24 сортов селекции ВНИИМК. Предложено
23
использовать эти формулы, как соответствующие паспорта для идентификации и сертификации сортов сои.
7.
Установлен тип наследования полиморфных фракций 9 микро-
сателлитных локусов ДНК у гибридов сои первого поколения. Шесть локусов Satt2, Satt5, Soygy2, Sat1, Sat36 и Soyhsp176 имеют доминантный тип
наследования, а три Satt1, Satt9 и Soypr1 – кодоминантный .
8.
Локусы с кодоминантным наследованием, апробированные на
выявление ложной гибридизации, показали эффективность в идентификации гибридов сои селекции ВНИИМК. Предложен метод определения гибридности селекционного материала в F1.
9.
Определен уровень внутрисортового полиморфизма у сортов
сои Фора и Лада селекции ВНИИМК. Показано, что Фора – неполиморфен,
а сорт Лада является генетически неоднородным.
Рекомендации для селекционной практики
1. Применять в селекционном процессе метод идентификации гибридов
сои с использованием трех микросателлитных локусов ДНК: Satt1,
Satt9 и Soypr1, имеющих кодоминантный тип наследования.
2. Использовать созданную маркерную систему на основе 9 полиморфных SSR-локусов ДНК для паспортизации сортов сои селекции ВНИИМК и определения их генетической однородности.
3. Применять для паспортизации и сертификации сортов сои селекции
ВНИИМК молекулярно-генетические формулы, созданные на основе
полиморфных микросателлитных локусов ДНК
Список работ, опубликованных по материалам исследований
1. Рамазанова С.А. Перспективы использования молекулярных маркеров в
идентификации сортов сои // Сборник докладов 3 международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы се24
лекции, технологии и переработки масличных культур». – Краснодар,
28-30 марта 2005г. – С. 102-106.
2. Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Челюстникова Т.А., Антонова Т.С. Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК сортов сои селекции
ВНИИМК // Сборник докладов международной научно-практической
конференции « Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника» посвященной 120-летию со дня рождения академика В.С. Пустовойта. – Краснодар, 19-22 июля 2006. – С. 234-239.
3. Рамазанова С.А. Генетическое разнообразие сортов сои // Материалы
8-й региональной научно-практической конференции молодых ученых
« Научное обеспечение агропромышленного комплекса» - Краснодар,
7-8 декабря 2006 г. – С. 60-61.
4. Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Челюстникова Т.А. Использование анализа микросателлитных последовательностей ДНК в решении проблем
селекции сортов сои // Сборник материалов 4-й международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур», посвященной 95летию со дня основания ВНИИМК – Краснодар, 27-29 марта 2007 г. –
С.233-242.
5. Рамазанова С. А. Использование микросателлитных локусов ДНК для
идентификации генотипов сои // Сборник материалов 7-й молодежной
конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» - Москва, 4 апреля 2007 г. – С.31-33.
6. Рамазанова С.А., Антонова Т.С., Гучетль С. З., Челюстникова Т.А. Анализ микросателлитных локусов (SSR) ДНК для идентификации генотипов сои // Збiрник наукових праць «Досягнення I проблеми генетики,
селекції та біотенології» – Київ, 2007. – Т.2 – С. 279-283.
7. Антонова Т.С., Челюстникова Т.А., Гучетль С.З., Рамазанова С. А. Генотипирование подсолнечника и сои селекции ВНИИМК на основе
25
микросателлитных маркеров // Генетические ресурсы культурных растений в ХХI веке. II Вавиловская международная конференция – СанктПетербург, 26-30 ноября 2007г. – С. 236-237.
8. Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Антонова Т.С. ДНК-генотипирование
на основе SSR-маркеров. Апрбирование и подбор оптимальных условий для Glycine max (L.) Merr // НТБ ВНИИМК Масличные культуры
– Краснодар, 2007. – №2 (137). – С.78-80.
9. Рамазанова С.А. Идентификация генотипов сои разного происхождения с использованием полиморфизма девяти микросателлитных локусов ДНК // Современные проблемы селекции и технологии возделывания сои. Сб. статей 2-й международной конференции по сое –
Краснодар, 9-10 сентября 2008г. – С.129-136.
10. Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Челюстникова Т.А., Антонова Т.С.,
Мошненко Е.В. Идентификация гибридов F1 сои с использованием
микросателлитных локусов ДНК // Современные проблемы селекции
и технологии возделывания сои. Сб. статей 2-й международной конференции по сое – Краснодар, 9-10 сентября 2008г. – С.137-141.
26