МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ДВУМЕРНОГО ДИСПЛЕЯ КЛЕТОК В СЛИТЫХ ГЕЛЯХ
реклама
На правах рукописи Гордеев Александр Андреевич МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ДВУМЕРНОГО ДИСПЛЕЯ КЛЕТОК В СЛИТЫХ ГЕЛЯХ 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в лаборатории биохимии вирусных РНК Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института белка Российской академии наук. НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Четверин Александр Борисович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Северинов Константин Викторович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов, заведующий лабораторией; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, лаборатория регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот, заведующий лабораторией. Сергиев Петр Владимирович, доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», химический факультет, кафедра химии природных соединений, профессор. ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук Защита состоится 21 ноября 2013 года в ____ на заседании Совета Д.501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 1119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд. ___ С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций). Автореферат разослан «___» октября 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Под молекулярным клонированием понимают ряд методов молекулярной и клеточной биологии, обеспечивающих размножение молекул ДНК в таких условиях, что потомство каждой исходной молекулы (то есть молекулярный клон) отделено от прочих. Для получения молекулярных клонов, как правило, молекулы клонируемой ДНК в составе ДНК-вектора внедряют в клетки так, что в клетку с высокой вероятностью попадает не больше одной молекулы такой рекомбинантной ДНК. В процессе роста и размножения клеток размножаются и рекомбинантные ДНК. Собственно на этой стадии и осуществляется молекулярное клонирование. Таким образом, получение нужных молекулярных клонов сводится к поиску и отбору клеток, содержащих в себе требуемые рекомбинантные ДНК. Отбор обычно проводят на основании фенотипических признаков, обусловленных присутствием в клетках искомой ДНК. При скрининге огромных генных библиотек, когда искомые клетки находятся среди миллионов других, становится актуальным повышение эффективности молекулярного клонирования. Существующие методы скрининга клонов используют один из двух основных форматов презентации живых клеток: двумерный формат (2D), используемый, например, при выращивании бактериальных колоний на поверхности агара, или одномерный формат (1D) проточной цитометрии, когда клетки, выстроенные по одной в цепочку в струе жидкости, сканируют, пропуская через детектор. В случае 2D-формата клетки или клеточные колонии могут быть надежно идентифицированы по их морфологии или другим признакам; каждая из них занимает уникальное положение и поэтому может быть повторно исследована и извлечена для размножения. Однако у этого метода есть существенный недостаток – низкая пропускная способность. Высокую скорость скрининга (до 105 клеток в секунду) обеспечивает проточная цитометрия. Но идентификация клеток в этом случае не настолько полна и надежна, как при анализе клеток в 2D-формате, и к заинтересовавшей исследователя клетке нельзя вернуться. Также клеточная сортировка, основанная на проточной цитометрии, приводит лишь к обогащению исходной популяции клетками выбранного типа, но не к получению истинных клонов. Совмещение преимуществ 1D- и 2D-форматов скрининга клеток позволило бы существенно повысить эффективность молекулярного клонирования. При работе с эукариотическими клетками, помимо скорости и надежности скрининга, возникает проблема поддержания клеток в физиологическом состоянии, 1 максимально приближенном к условиям многоклеточного организма. Имитацию таких условий обеспечивают трехмерные (3D) культуры, где клетки «подвешены» в матриксе геля. Однако клетки в этом случае расположены на разной глубине от поверхности геля, из-за чего они находятся не только в разных физико-химических условиях, таких как скорость газообмена, поступления питательных веществ и удаления продуктов метаболизма, но и не доступны для одновременного наблюдения, что существенно затрудняет их быстрый скрининг. От этих недостатков избавлены традиционные двумерные (2D) культуры, где клетки выращивают на поверхности стекла или пластика. Однако окружение клеток в 2D-культурах существенно отличается от естественного, что препятствует правильному проявлению фенотипа. Это определяет актуальность совмещения преимуществ 3D- и 2D-культур. Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось повышение эффективности (быстроты и надежности) выделения клонов бактериальных и эукариотических клеток путем совмещения преимуществ одномерного и двумерного форматов скрининга, а также двумерного и трехмерного форматов культивирования клеток. Для достижения этой цели был применен метод слитых гелей, ранее изобретенный в лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН, и решены следующие задачи: - найти виды слитых гелей и способы их приготовления, обеспечивающие прочную иммобилизацию и жизнеспособность внедренных в гель бактериальных и эукариотических клеток, а также способность клеток размножаться в геле; - найти способы выстраивания внедренных прокариотических и эукариотических клеток в монослой; - найти способы регулирования глубины залегания клеточного монослоя; - определить максимально достижимую плотность монослоя для клеток разных типов; - оценить скорость скрининга клеток в монослое, максимально достижимую при ручном способе анализа; - найти способы извлечения из геля жизнеспособного потомства одиночных клеток; - использовать разработанные подходы для получения стабильных линий эукариотических клеток, продуцирующих заданный белок; - генетически охарактеризовать полученные чистые линии: определить копийность и место интеграции гена, кодирующего заданный белок. 2 Научная новизна и практическая значимость. Разработан метод анализа бактериальных клеток, совместивший производительность одномерной проточной цитометрии с преимуществами двумерного формата чашки Петри. Разработан метод культивирования эукариотических клеток, совместивший преимущества 3D- и 2Dкультур. Разработан метод быстрого и прямого (в отсутствие антибиотиков и иных способов химической селекции, способных влиять на физиологическое состояние клетки) выделения стабильных линий эукариотических клеток. Продемонстрирована способность метода выделять истинные клоны эукариотических клеток. Разработан способ точного определения мест случайной интеграции известной чужеродной ДНК в клеточных хромосомах в отсутствие какой-либо дополнительной информации, кроме того факта, что интегрирована часть этой ДНК, которая кодирует селективный признак. Разработанные методы могут быть использованы во многих областях молекулярной и клеточной биологии, а также в биотехнологии и медицине, в том числе с целью молекулярного и клеточного клонирования и белковой инженерии; исследования гетерогенных дифференцировки стволовых клеточных популяций клеток, морфогенеза и клеточной тканей, физиологии, злокачественной трансформации клеток, терапевтического и токсического действия лекарственных препаратов; клинической диагностики и выявления лекарственно устойчивых патогенных микроорганизмов. Апробация работы и научные публикации. Работа прошла апробацию на открытом семинаре лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН. Результаты работы опубликованы в 2 статьях в международных научных журналах и доложены на 5 российских и международных научных конференциях. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного методам скрининга и клонирования клеток, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ____ страницах и содержит ____ рисунков. Библиография включает ____ названий. 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Двумерный дисплей клеток Принцип метода слитых гелей. Этот метод позволяет иммобилизовать клетки в геле, одновременно выстроив их в тонкий слой. Например, суспензию клеток в гелеобразующем растворе (содержащем мономеры полиакриламида (ПАА) или расплавленную агарозу), наносят на поверхность высушенного ПАА геля. Разбухая, сухой гель вытесняет клетки и собирает их на своей поверхности (рис. 1). Разбухание вытесняющего геля прекращается после формирования иммобилизующего геля, и клетки фиксируются в окружающем матриксе. Если в качестве иммобилизующего геля используют агарозу, слитый гель называют ПАА/агарозным, а если полиакриламид, то ПАА/ПАА. Застывание агарозы обеспечивают охлаждением, а полимеризацию ПАА инициируют катализаторами, присутствующими в суспензии наряду с мономерами ПАА. Рис. 1. Технология слитых гелей позволяет выстроить клетки в тонкий слой. (А) Лунки предметного стекла на разных этапах приготовления слитого геля: (1) лунка с прикрепленным ко дну высушенным вытесняющим гелем; (2) лунка, частично заполненная суспензией клеток, содержащей компоненты иммобилизующего геля; (3) лунка под покровным стеклом, полностью заполненная суспензией. (Б) Схема формирования слитого геля. Глубина залегания клеток в слитом геле. Чем больше разбухает вытесняющий гель, тем сильнее концентрируются клетки, и тем ближе к поверхности слитого геля они должны оказаться. Следовательно, глубина залегания слоя клеток должна определяться тем, насколько разбух вытесняющий гель к моменту формирования слитого геля. Поэтому глубину залегания и степень концентрирования клеток можно 4 Рис. 2. Влияние скорости формирования иммобилизующего ПАА геля на глубину залегания клеток в слитом геле. Cлитые гели на основе 7% вытесняющего и 4% иммобилизующего ПАА гелей с соотношением акриламид: метиленбисакриламид – 100:1 содержали 105 GFPпродуцирующих клеток E.coli на 1 мм2 поверхности. Для полимеризации иммобилизующего геля использовали 0,04% ПСА и указанные концентрации ТЕМЕД. Показаны боковые проекции слитых гелей, реконструированные на основе оптических срезов, сделанных на разной глубине слитых гелей (А). Пример таких оптических срезов на разной глубине слитого геля для верхней боковой проекции панели А представлен на панели Б. Гели подкрашены флуоресцентным маркером. Оптические срезы получали при помощи конфокального микроскопа. регулировать, меняя скорость формирования иммобилизующего геля. При использовании ПАА в качестве иммобилизующего геля, скорость его формирования регулировали, меняя концентрацию катализатора полимеризации – ТЕМЕД (рис. 2). При повышении концентрация ТЕМЕД глубина залегания клеток увеличивалась. Максимального концентрирования клеток E.coli удалось достичь при 0,3 – 0,5% ТЕМЕД. В этом случае клетки, помещенные в лунку глубиной 400 мкм, концентрировались более чем в 200 раз, формируя слой толщиной менее 2 мкм. При использовании агарозы в качестве иммобилизующего геля глубину залегания клеток можно регулировать, меняя температуру расплавленной агарозы. Чем прохладнее будет суспензия клеток с расплавленной агарозой, тем она будет вязче и тем быстрее застынет при охлаждении камеры, что ограничит разбухание вытесняющего геля. Мы приготовили слитые гели, охлаждая агарозу с клетками до разной температуры (рис. 3). При 37°С клетки образовывали монослой у самой поверхности слитого геля (рис. 3А, изображение 1). Однако при температуре 25°С клетки распределялись в слое агарозы толщиной около 40 мкм (рис. 3А, 5 Рис. 3. Регулирование глубины залегания клеток в слитом ПАА/агарозном геле. Слитые гели на основе указанного вытесняющего ПАА геля и 0,5% агарозного иммобилизующего гелей содержали ~103 эукариотических клеток HeLa на 1 мм2 поверхности. Вносимая в камеру суспензия клеток с расплавленной агарозой имела температуру 37°С (1) или 25°С (2 – 5). Образцы 3 – 5 центрифугировали в течение 1 мин при 100 g до застывания агарозы. Показаны боковые проекции слитых гелей, реконструированные на основе оптических срезов, сделанных на разной глубине слитых гелей (А). Пример таких оптических срезов для геля (1) представлен на панели Б. Гели и клетки подкрашены флуоресцентным маркером. Оптические срезы получали при помощи конфокального микроскопа. изображение 2). Сконцентрировать клетки в монослой удалось, центрифугируя камеру с формирующимся слитым гелем, пока агароза еще не застыла (рис. 3А, изображение 3). Это вынуждает все клетки седиментировать на поверхность разбухающей ПАА подложки. При этом, в зависимости от состава вытесняющего геля (процент акриламида, соотношение акриламида к сшивающему агенту – метиленбисакриламиду), толщина слоя геля над клеточным монослоем составила от 10 до 25 мкм (рис. 3A, изображения 3 – 5). При понижении процента акриламида или повышении доли сшивки слой клеток залегал на большей глубине. Вероятно, понижение процента акриламида приводит к повышенной сжимаемости ПАА геля во время центрифугирования, тогда как повышение доли сшивки понижает скорость разбухания ПАА. Очевидно, центрифугирование могло бы помочь и в других случаях, когда желательно собрать клетки в монослой не у самой поверхности слитого геля; например, при использовании ПАА/ПАА геля и относительно высокой концентрации ТЕМЕД (>0,5%; рис. 2А). 6 Рис. 4. Иммобилизация клеток в слитом геле. Слитые гели с клетками промывали на качалке (при 200 об/мин) в течение указанного времени при 22°С. (А) Слитый ПАА/ПАА гель, содержащий GFP-продуцирующие клетки E.coli, промывали 0,9% раствором NaCl. Наблюдали за одним и тем же полем. Изображения получены при помощи микроскопа во флуоресцентном режиме. (Б) Слитый ПАА/агарозный гель содержащий клетки HEK-293, промывали фосфатносолевым буфером DPBS. Изображения получены при помощи микроскопа в режиме светлого поля. Прочность иммобилизации клеток в слитом геле. Клетки как прокариот, так и эукариот прочно иммобилизованы в слитом геле и не меняют ни своего положения, ни морфологии даже после многих часов интенсивного промывания геля в буфере (рис. 4). Важно отметить, что одинаково надежно удается иммобилизовать как адгезивные, так и типично суспензионные клетки (например, лимфобласты). Надежная иммобилизация всех клеток в слитом геле, а также то, что они находятся в одной плоскости, дает возможность присвоить каждой клетке уникальный двумерный адрес, по которому Иммобилизация она позволяет впоследствии легко с легкостью воздействовать может на быть клетки, найдена. например, синхронизировать, быстро изменяя состав среды, в которой они находятся, простым промыванием геля в подходящем растворе. Иммобилизация также дает возможность индивидуально следить в режиме реального времени или путем наблюдения через промежутки времени за многими клетками большой популяции, что может найти применение, например, в исследованиях внутриклеточной динамики. 7 Рис. 5. Зависимость толщины слоя клеток E.coli в слитом геле от плотности клеток. Показаны боковые проекции слитых ПАА/агарозных гелей, содержащих GFPпродуцирующие клетки E.coli при указанной плотности. Изображения получены при помощи конфокального микроскопа. Плотность монослоя клеток. Для повышения скорости скрининга важно было добиться максимально плотной упаковки клеток в монослое. Как видно из рисунка 5, практически все клетки E.coli находятся в одной плоскости при плотности до 105 клеток на 1 мм2 слитого геля. В этом случае толщина слоя находится в пределах 2 мкм, что примерно соответствует размеру клетки. Максимальная плотность монослоя клеток человеческой карциномы HeLa составила около 1300 клеток на 1 мм2; при этом клетки занимали большую часть площади слитого геля (рис. 3Б). 2. Применение двумерного дисплея для скрининга клеток Высокая плотность упаковки клеток, а также их расположение в одной плоскости позволяют проводить скрининг клеток с высокой производительностью, что иллюстрируется следующим примером. Монослой площадью 150 мм 2 состоящий из 15 миллионов бактериальных клеток E.coli или 200 тысяч человеческих эмбриональных клеток почки HEK-293, содержал единичные клетки, продуцирующие GFP (зеленый флуоресцирующий белок) (рис. 6). Чтобы найти эти клетки, вручную просматривали всю поверхность геля при помощи флуоресцентного микроскопа. В пределах 30 мин удавалось просмотреть весь гель. Было обнаружено семь бактериальных и восемь эукариотических GFP-продуцирующих клеток, которые 8 Рис. 6. Скрининг клеток в слитом геле. Смесь GFP-продуцирующих и не продуцирующих клеток E.coli (A) или HEK-293 (Б) внедряли в ПАА/агарозный слитый гель площадью 150 мм2 до плотности, соответственно, 105 и 1300 клеток/мм2. Слева: изображение слоя клеток в режиме светлого поля, видны все клетки. В центре: изображение во флуоресцентном режиме того же поля, что и на изображении слева; видны только GFP-продуцирующие клетки, составляющие ~1% (А) или ~40% (Б) от исходной популяции. Справа: изображение во флуоресцентном режиме поля, содержащего одну из семи (А) или одну из восьми (Б) GFP-продуцирующих клеток, найденных среди, соответственно, 1,5×107 или 2×105 клеток монослоя. составляли, соответственно, менее миллионной и менее десятитысячной доли клеточной популяции. Таким образом, скорость скрининга составила около 8 000 бактериальных и 100 эукариотических клеток в секунду. В случае бактерий достигнутая скорость ручного скрининга соответствует скорости автоматической проточной цитометрии. Столь высокая скорость скрининга в монослое достигается благодаря тому, что множество клеток двухмерного изображения поля зрения микроскопа доступно для анализа одновременно, в отличие от проточной цитометрии, когда клетки анализируются последовательно одна за другой. Хотя в случае эукариот достигнутая нами скорость скрининга ниже, чем при использовании проточной цитометрии, двумерный формат позволяет проводить анализ полученных изображений, тем самым повышая надежность детекции: каждую клетку можно отличить от других клеток и частиц неклеточного происхождения. Кроме того, поскольку каждая клетка имеет уникальный адрес в геле, заинтересовавшие клетки после быстрого первоначального скрининга могут быть легко повторно 9 найдены и детально проанализированы. Мы проводили вручную, но сканирование этот геля процесс можно существенно ускорить и сделать более информативным, если автоматизировать метод. Можно было бы, например, количественно обсчитать фенотипические характеристики определить их каждой клетки, среднее значение, разброс, получить аналогичные данные для интенсивности флуоресценции клеток и других интересующих Оборудование и параметров. программы для автоматического сканирования и анализа двумерных клеточных автоматизации уже чипов разработаны и коммерчески доступны (Conrad et al., 2011. Nat. Methods. 8, – 246 249; Henriksen, 2010, Nat. Methods. 7, i – ii; Ozaki et al., 2010, PLos One, 5, e9955). Рис. 7. Схема приготовления инвертированного слитого геля. 3. Размножение клеток в слитых гелях Помещая все клетки в гель на одинаковую глубину, технология слитых гелей обеспечивает для них одинаковые физико-химические условия, такие как скорости газообмена, поступления питательных веществ и удаления продуктов обмена. Важно, что клетки иммобилизованы в «мягких» условиях, без излишних механических и других неблагоприятных воздействий, поэтому почти все клетки остаются живыми и способны размножаться в геле, как показано ниже. В экспериментах по размножению клеток мы использовали инвертированные слитые гели (рис. 7). В серии предварительных экспериментов выяснили, что акриламид в виде мономера за то время и в той концентрации, в которой он используется для приготовления иммобилизующего геля, токсичен для клеток эукариот, но не влияет на размножение 10 Рис. 8. Формирование микроколоний клетками E.coli. GFP-продуцирующие клетки E.coli внедряли (А) в слитый ПАА/агарозный гель, содержащий среду LB, после чего гель заливали минеральным маслом или (Б) в ПАА/ПАА слитый гель, после чего гель промывали 0,9% раствором NaCl и заливали средой LB. Гели инкубировали в течение указанного времени при 37°С. Верхняя панель: изображение микроколоний клеток в режиме светлого поля. Средняя и нижняя панели: оптический срез растущей микроколонии и боковая проекция, соответственно, полученные при помощи конфокального микроскопа. бактериальных клеток E. coli. Поэтому за размножением бактериальных клеток наблюдали как в ПАА/ПАА, так и в ПАА/агарозном слитых гелях, за размножением эукариот только в ПАА/агарозном геле. Размножение бактериальных клеток. Клетки E.coli, иммобилизованные как в полиакриламиде, так и в агарозе, делились 2 – 3 раза в час, что соответствует нормальной скорости деления этих клеток в жидкости, и синхронно формировали эллипсоидные микроколонии (рис. 8). Так как питательные вещества препятствовали 11 Рис. 9. Формирование микроколоний клетками HEK-293. GFP-продуцирующие клетки HEK-293 внедряли в слитый ПАА/агарозный гель, заливали питательной средой и инкубировали при 37°С и 5% CO2. (А) Изображения выбранного поля слитого геля в режиме светлого поля, полученные через указанные промежутки времени. Все выросшие микроколонии пронумерованы на нижнем крайнем правом изображении. (Б) Оптический срезы через середину микроколонии (верхняя панель) и боковые проекции тех же микроколоний (нижняя панель), полученные при помощи конфокального микроскопа. полимеризации акриламида, их вводили в уже сформированный ПАА/ПАА гель путем его вымачивания в питательном растворе. В случае ПАА/агарозного геля, питательные вещества вводили в состав агарозы, а сформировавшийся слитый гель заливали минеральным маслом. В этом случае размножающиеся клетки были обеспечены питательными веществами и кислородом, содержащимися только в самом слитом геле. Размножение эукариотических клеток. Эукариотические клетки как адгезивных, так и супензионных культур размножались и микроколонии в слитом ПАА/агарозном геле (рис. 9, 10). 12 формировали сферические Рис. 10. Формирование микроколоний эукариотическими клетками различных типов. Внедряли в слитый ПАА/агарозный гель клетки либо адгезивных культур H1299 (A) или HeLa (Б), либо суспензионных культур DT40 (В) или K-562 (Г), заливали питательной средой и инкубировали указанное количество дней при 37°С и 5% CO2. Изображения получены в режиме светлого поля. Наблюдение за ростом GFP-продуцирующих клеток HEK-293 (рис. 9Б) не выявило lag-фазы в формировании колоний. Это свидетельствует о том, что низкая температура, используемая для застывания агарозы, не наносит заметного ущерба клеткам. Время деления клеток в слитом геле составляло примерно сутки, что соответствует их нормальной скорости роста при обычно применяемом культивировании на пластике. Семидневные колонии HEK-293 содержали в среднем по 200 клеток. Колонии такого размера все еще оставались иммобилизованными в агарозном матриксе, отделенные друг от друга и от жидкой питательной среды агарозной прослойкой. Благодаря этому, клетки, входящие в состав разных колоний, не перемешивались. В отличие от традиционных 3D-культур, здесь все исходные клетки и выросшие из них микроколонии погружены на одинаковую глубину, благодаря чему находятся в одинаковых физико-химических условиях и доступны для одновременно наблюдения. Помимо агарозы, для иммобилизации клеток можно использовать другие известные 3D-матриксы как натурального, так и синтетического происхождения, либо в агарозу можно добавлять компоненты внеклеточного матрикса для оптимального развития клеток выбранного типа. Например, 13 введение в состав агарозы Рис. 11. Зависимость формирование микроколоний клетками фибробластов от присутствия коллагена в матриксе геля. Клетки эмбриональных фибробластов SC-1 внедряли в слитый ПАА/агарозный гель, содержащий (верхний ряд) или не содержащий (нижний ряд) 0,5 мг/мл коллагена в составе агарозного геля. Гель помещали в питательный раствор и инкубировали в течение указанного времени при 37°С и 5% CO2. Изображения получены в режиме светлого поля. коммерческого коллагена (смесь коллагенов I и III типа) способствовало росту клеток фибробластов и влияло на морфологию их колоний (рис. 11). При этом коллаген удерживался в геле за счет механического включения в агарозный матрикс, без какой-либо ковалентной пришивки к нему. 4. Выделение клеточных клонов Выросшие микроколонии можно извлечь из геля и размножить. Полученные клетки являются потомством одной клетки, то есть клеточным клоном. Выделение бактериальных клонов. Клетки E. coli, продуцирующие GFP, извлекали из микроколоний при помощи иглы, установленной в микроманипулятор. Извлеченный материал переносили либо сразу на поверхность LB-агара, касаясь его иглой (рис. 12, А и Б), либо в жидкость, которую затем равномерно распределяли по поверхности LB-агара (рис. 12В). На рис. 12 показан результат эксперимента, в котором клетки высевали с низкой плотностью (200 клеток/мм2), так что образованные ими микроколонии были обособлены друг от друга; при этом доля GFP-продуцирующих колоний составляла 10%. Все клетки, изолированные из одной колонии, сохраняют выбранный фенотип (рис. 12В), что подтверждает, что они являются клоном. 14 Рис. 12. Выделение клеточных клонов из раздельно растущих микроколоний E.coli. Смесь клеток E.coli, 10% из которых продуцировали GFP, внедряли в слитый ПАА/агарозный гель до плотности 200 клеток/мм2, выращивали в течение 5 ч при 37°С. (А) Выбранное поле геля в проходящем белом свете. (Б) То же поле во флуоресцентном режиме. Материал из зеленых (1 – 5), белых (6 – 10) микроколоний и пустой области геля (11 – 12) переносили на LB-агар, инкубировали в течение ночи при 37°С и наблюдали (нижняя панель) в белом (А) или УФ-свете (Б). (В) Результат высева на чашки Петри с LB-агаром материала из индивидуальных зеленых (з) или белой (б) колоний. Верхний ряд: изображения чашек Петри с колониями в белом свете. Нижний ряд: изображение тех же чашек в УФ-свете. На рис. 13 показан результат эксперимента, в котором плотность посеянных клеток была в 500 раз больше, а доля GFP-продуцирующих колоний в 100 000 раз меньше. В этом случае колонии росли столь плотно друг к другу, что невозможно было сразу отобрать индивидуальный клон (рис. 13, А и Б). Однако отдельные клоны удалось получить, посеяв отобранный материал на LB-агар (рис. 13В). В этом случае, для обнаружения и выделения GFP-продуцирующих клонов клеток, составляющих миллионную долю исходной популяции, потребовалось меньше суток. Хотелось бы отметить, что в этом эксперименте не применялись никакие селективные условия, 15 Рис. 13. Выделение клеточных клонов из густо растущих микроколоний E.coli. Смесь клеток E.coli, в которых одна из миллиона была GFP-продуцирующей, внедряли в слитый ПАА/агарозный гель до плотности 105 клеток/мм2, выращивали в течение 4 ч при 37°С. (А) Выбранное поле геля в проходящем белом свете. (Б) То же поле во флуоресцентном режиме. (В) Результат высева на чашки Петри с LB-агаром материала из области зеленой микроколонии. Изображение получено в УФ-свете. дающие преимущество в росте и размножении GFP-продуцирующим клеткам над непродуцирующими клетками E.coli. Выделение клонов эукариотических клеток. В слитый гель площадью 300 мм2 внедряли около 30 тысяч клеток HEK-293, трансфецированных плазмидой, кодирующей GFP, и из выросших микроколоний (рис. 14А) выделяли клоны клеток, стабильно продуцирующие GFP. Для этого при помощи закрепленного в микроманипуляторе капилляра из геля извлекали равномерно окрашенные ярко флуоресцирующие микроколонии. В отличие от бактериальных микроколоний, микроколонии HEK-293 удается извлечь целиком. Клетки внутри микроколонии прочно сцеплены между собой, лучше, чем с клетками других колоний, поэтому даже соприкасающиеся колонии могут быть извлечены раздельно. Каждую из 48 извлеченных GFP-продуцирующих колоний перенесли в отдельную лунку и далее культивировали на поверхности пластика. Из тех колоний, что продолжили размножаться, выбрали 6 однородных, но различающихся между собой по интенсивности флуоресценции вариантов (рис 14Б). Все шесть сохранили свой фенотип после 30 пассажей. Таким образом, за два раунда селекции, занявших 2 недели, удалось получить 6 стабильных клеточных линий. Первый и наиболее эффективный раунд заключался в извлечении крупных флуоресцирующих однородных колоний, что отсеяло клетки, которые не размножались или не продуцировали GFP. Во втором раунде были проверены жизнеспособность и гомогенность колоний, отобранных в первом раунде. При этом 16 Рис. 14. Получение GFP-продуцирующих линий клеток HEK-293. (А) Изображение фрагмента слитого геля в режиме светлого поля (слева) или флуоресцентном режиме (справа), содержащего микроколонии, выросшие из трансфецированных GFP-кодирующей плазмидой клеток HEK-293, внедренных в слитый гель до плотности 100 клеток/мм2 после 7 дней инкубации геля в питательной среде при 37°С и 5% CO2. Стрелки указывают на типичные колонии, которые извлекали из геля. (Б) Полученные шесть различных клеточных линий, стабильно продуцирующих GFP. Флуоресцентные изображения клеток, распластанных на стекле, получены при помощи конфокального микроскопа. мы не использовали антибиотики или какие-либо другие методы химической селекции, которые могли бы повлиять на физиологию клеток или привести к нестабильности клеточной линии. В данном эксперименте колонии отбирали вручную на основании визуальной оценки их гомогенности и интенсивности флуоресценции. Потенциально, производительность и достоверность этой процедуры может быть существенно повышена путем автоматизации анализа изображения колоний и процедуры их отбора. Инструменты и программное обеспечение, способные осуществлять эту задачу, уже разработаны и коммерчески доступны (Haupt et al. 2009. Nat. Methods 6, iii – iv). Получение чистых клонов эукариот до сих пор остается трудной задачей. Ни один из описанных в литературе методов клонирования не может гарантировать, что полученная с его помощью популяция происходит из одной клетки (Clarke et al. 2011. In Davis, Animal Cell Culture: Essential Methods, 231 – 254). Предложенный нами подход можно рассматривать как вариант клонирования при помощи микроманипуляторов. В классическом исполнении этого метода клетки отбирают из суспензии, в которой они могут свободно плавать на разной глубине. Возникает опасность не заметить, из-за небольшой глубины резкости микроскопа, постороннюю клетку, которая, «налипнув» на внешнюю часть капилляра, может быть захвачена вместе с отобранной клеткой. Наш метод позволяет преодолеть эту проблему благодаря выстраиванию всех клеток в монослой и их прочной иммобилизации в 17 геле. Кроме того, давая возможность наблюдать за процессом формирования индивидуальных колоний, наш подход позволяет находить колонии, выросшие из гарантировано одиночных клеток. Эта особенность проиллюстрирована на рисунке 9A: видно, что колонии 2 – 7 произошли каждая из одной клетки, тогда как колонии 1 и 9 – из двух и четырех клеток соответственно. На основании этого мы полагаем, что предложенный нами подход позволяет, по крайней мере потенциально, получать истинные клоны эукариотических клеток. 5. Определение числа копий и местоположения вставок гена GFP в хромосомах клеток HEK-293 Стабильные GFP-продуцирующие линии мы выделяли из популяции клеток HEK293, трансфецированных GFP-кодирующей плазмидой, которая не содержит элементов, обеспечивающих ее репликацию в эукариотических клетках или интеграцию в геном. В таких условиях продукция GFP в течение 30 пассажей может быть только результатом случайной (не сайт-специфической) интеграции гена GFP в хромосомную ДНК. В данной работе была определена копийность гена GFP в клетках полученных стабильных линий. Для показанных на рис. 14Б линий 3 и 4 также было определено местоположение этого гена в хромосомах. Число копий гена GFP определили при помощи метода молекулярных колоний. Оказалось, что для всех линий число колоний приблизительно равно числу клеточных эквивалентов препаратов ДНК, взятых для анализа (рис. 15). Таким образом, во всех линиях на одну клетку приходится по одной копии последовательности GFP. Для определения мест интеграции мы не могли использовать стандартные приемы, так как не было известно, каким участком плазмида встроилась в хромосому и какие ее участки были при этом утрачены; наверняка можно было сказать лишь то, что встроилась практически вся последовательность гена GFP, так как в клетках синтезировался функционально активный белок. Чтобы определить местоположения вставок, мы разработали следующий подход (рис. 16). Выделенную хромосомную ДНК полностью расщепляли при помощи эндонуклеазы рестрикции, для которой есть сайт в гене GFP и нет сайтов в последовательности плазмидного вектора (pEGFP-c3, Clontech). Два из полученных фрагментов ДНК имели на одном конце последовательность гена GFP, на другом – последовательность хромосомы, а внутри – область стыка хромосомы со вставкой. Самолигирование фрагментов приводило к образованию кольцевых структур А и Б, в которых последовательности хромосомы 18 A MspI MspI MspI MspI ген GFP – места отжига праймеров, используемых для ПЦР. Б 1 2 3 4 5 6 K Рис.15. Определение числа копий гена GFP в клетках GFP-продуцирующих линий. (А) Положение сайтов рестрикции MspI в гене GFP. (Б) Молекулярные колонии, образовавшиеся при проведении ПЦР в ПАА гелях, содержащих по 33 клеточных эквивалента препаратов ДНК, выделенных из нетрансфецированных клеток HEK-293 (К) и клеток GFP-продуцирующих линий 1 – 6, и расщепленных эндонуклеазой рестрикции MspI. Колонии выявляли посредством гибридизации с FRET-зондами. оказывались рядом с последовательностями гена GFP. Каждое кольцо использовали в качестве матрицы в ПЦР, используя пару направленных врозь праймеров, комплементарных к вошедшему в состав кольца участку гена GFP. Этот подход мы применили для анализа линий 3 и 4. Для обеих линий удалось получить специфический ПЦР-продукт с каждого из колец (рис. 16, вставка). Секвенирование продуктов с использованием праймеров, комплементарных последовательностям гена GFP, показало, что в обеих линиях плазмида интегрирована в хромосому 7, однако, в разных её областях (рис. 17). В линии 3 плазмида встроилась своей векторной частью, в районе гена устойчивости к канамицину и неомицину. Интеграция плазмиды произошла в некодирующем участке хромосомы между нуклеотидами 77 157 991 и 77 158 019 (по версии сборки человеческого генома GRCh37/hg19, UCSC) с делецией 29нуклеотидного фрагмента. В хромосому оказалась интегрирована почти вся последовательность плазмиды с делецией 31-нуклеотидного фрагмента. В линии 4 интеграция прошла так, что в хромосому встроилась одна полная копия плазмиды, а также дуплицированным оказался её фрагмент (между 2485 и 3215 нуклеотидами). Интеграция произошла в районе последовательности ori f1 (левая граница вставки), и районе гена устойчивости к канамицину и неомицину (правая граница вставки). В хромосоме встраивание произошло в области интрона 4 гена 19 Рис.16. Схема определения местоположения вставки плазмиды pEGFP-AE в хромосоме. В результате расщепления вставки эндонуклеазой рестрикции PstI, образуется два фрагмента – А и Б, которые затем подвергают самолигированию, последующей ПЦР, продукты ПЦР – секвенируют. На вставке – электрофоретический анализ продуктов ПЦР. Гель окрашен бромистым этидием. HEATR2. При этом произошла дупликация участка хромосомы длиной 20 нуклеотодов (между 789 122 и 789 141 нуклеотидами). В обеих линиях существенной гомологии между плазмидой и хромосомой в месте интеграции выявить не удалось. Но те факты, что при интеграции в линии 3 произошла делеция приблизительно равных по длине фрагментов рекомбинирующих молекул ДНК, а в линии 4 произошла дупликация и плазмиды и участка хромосомы, вероятно, отражает механизм или механизмы интеграции. Для более определенных выводов необходимо набрать статистику, изучив положение вставки в других клеточных линиях. В обеих линиях вставка произошла в неконденсированном хроматине (области гиперчувствительности к ДНК-азе I согласно базе UCSC). Вероятно, такой хроматин наиболее доступен для включения чужеродной ДНК. 20 Рис. 17. Схема местоположения плазмидной вставки в хромосомах линий 3 и 4. (A) Последовательность плазмиды, написана в верхнем регистре, хромосомы – в нижнем регистре. Основания, участвующие в стыке, отмечены полыми (хромосома) или закрашенными (плазмида) треугольниками, положение этих оснований указано над или под треугольникрами. Пары оснований, образующие стык, соединены пунктирными стрелками (Б) Cхема всей хромосомы 7 человека (изображение взято с http://www.ncbi.nlm.nih.gov) с указанием мест интеграции вставки линий 3 и 4 (отмечено стрелками). 21 ВЫВОДЫ 1. На основе технологии слитых гелей разработаны способы получения монослоя полностью жизнеспособных клеток: – бактерий, иммобилизованных в агарозном или полиакриламидном матриксе с плотностью до 100 000 клеток/мм2, – эукариотических клеток, иммобилизованных в агарозном матриксе с плотностью до 1 300 клеток/мм2. 2. Показано, что такой способ презентации клеток позволяет: – используя обычный флуоресцентный микроскоп с ручным управлением, осуществлять скрининг со скоростью до 8 000 бактерий или 100 эукариотических клеток в секунду; – в течение длительного времени одновременно следить за каждой из клеток большой популяции; – размножать клетки в условиях трехмерной культуры; – регистрировать процесс деления клеток и формирования микроколоний; – быстро получать клеточные популяции, каждая из которых гарантированно происходит из одной клетки и – в силу этого – является генетически однородной; то есть, выделять клеточные клоны. 3. На примере зеленого флуоресцентного белка показано, что разработанный метод позволяет прямо, без использования антибиотика или иного селективного фактора, клонировать бактериальные и эукариотические клетки, продуцирующие заданный белок, непосредственно из популяции клеток, трансформированных кодирующей этот белок ДНК. 4. Разработан подход, позволяющий определить точное место случайной интеграции чужеродной ДНК в эукариотическом геноме. 22 Список публикаций по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ: 1. Gordeev A.A., Samatov T.R., Chetverina H.V., Chetverin A.B. 2D format for screening bacterial cells at the throughput of flow cytometry // Biotechnol Bioeng. 2011. V. 108. № 11. P. 2682 – 2690. 2. Gordeev A.A., Chetverina H.V., Chetverin A.B. Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures // Biotechniques. 2012. V. 52. № 5. P. 325 – 331. Тезисы докладов: 1. Gordeev A.A., Samatov T.R., Chetverina H.V., Chetverin A.B. Hight-throughput cell screening in two-dimensional format // Abstracts of the 6-th international PhD student symposium «Horizons in molecular biology». Göttingen, Germany. 2009. P. 82. 2. Гордеев А.А., Саматов Т.Р., Четверина Е.В., Четверин А.Б. Высокопроизводительный скрининг клеток в двумерном формате // Сборник тезисов ежегодной научной конференции Института белка РАН. Пущино. 2010. С. 15. 3. Гордеев А.А., Саматов Т.Р., Четверина Е.В., Четверин А.Б. Высокопроизводительный скрининг клеток в двумерном формате // Сборник тезисов научно-практической конференции «Системная биология». Пущино. 2010. С. 58 – 60. 4. Гордеев А.А., Четверина Е.В., Четверин А.Б. Двумерная 3D-культура эукариотических клеток // Сборник тезисов ежегодной научной конференции Института белка РАН. Пущино. 2012. С. 16. 5. Гордеев А.А., Четверина Е.В., Четверин А.Б. Определение числа и положения мест случайной интеграции известной последовательности в клеточный геном // Сборник тезисов 16 международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино. 2012. С. 102 – 103. 6. Четверина Е.В., Гордеев А.А., Четверин А.Б. Монослойная 3D-культура эукариотических клеток // Сборник тезисов III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань. 2012. С. 229 – 230. 7. Гордеев А.А., Четверина Е.В., Четверин А.Б. Как определить точное место интеграции чужеродной ДНК в клеточный геном?// Сборник тезисов ежегодной научной конференции Института белка РАН. Пущино. 2013. С. 17. 23
