Методы создания генетически модифицированных организмов

SCIENCE TIME
МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ
МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ
Шарипова Алсу Рустамовна,
Башкирский государственный
университет, г. Уфа
E-mail: [email protected]
Аннотация. Данная статья посвящена некоторы м методам создания
генетически модифицированных организмов.
Ключевые слова: трансгенны е организмы , генетика, трансформация.
Новые организмы, которые созданы различными методами генной
инженерии, могли бы очень широко использоваться в различных сферах нашей
жизни.
При создании трансгенных растений возникают некоторые трудности. Это
получение нового растения с такими генами, которые от природы не даны ему.
Во- первых, необходимо выделить нужный ген из чужой ДНК; во-вторых, нужно
встроить его в молекулу ДНК данного растения. Основные этапы создания
генетически модифицированных организмов:
- получение изолированного гена;
- введение гена в вектор для переноса в организм;
- перенос вектора с геном в модифицируемый организм;
- преобразование клеток организма;
- отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех,
которые не были успешно модифицированы.
Существует несколько методов для внедрения чужеродной ДНК в геном
растения. Рассмотрим наиболее распространенные.
1. Трансформация растений Ti-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens.
Грамотрицательная почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens —
фитопатоген, который в процессе своего жизненного цикла трансфор-мирует
клетки растений. Эта трансформация приводит к образованию корончатого
галла — опухоли, нарушающей нормальный рост расте-ния. Этой болезни,
имеющей серьезные агрономические последствия, подвержены только
622
SCIENCE TIME
двудольные растения, в частности виноград, косточковые фруктовые деревья.
Образование корончатого галла начинается с проникновения, интеграции в
геном растительных клеток и экспрессии специфического сегмента
бактериальной плазмидной ДНК — так называемой Т-ДНК (от англ. transferred
DNA). Т-ДНК — это часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (tumorinducing plasmid, Ti-плазмиды); ее несут большинство штаммов A. tumefaciens.
Инфекционный процесс начинается с прикрепления A. tumefaciens к
клеткам растения в месте повреждения, часто у основания стебля (у корневой
шейки). Все дело в специфических фенольных соединениях, ацетосирингоне и
гид роксиацетосирингоне, которые выделяет поврежденное растение. Эти
соединения сходны с некоторыми продуктами основного пути синтеза у
растений вторичных метаболитов, таких как лигнины и флавоноиды.
Ацетосирингон и гидроксиацетосирингон активируют гены вирулентности (vir),
которые локализова-ны в участке Ti-плазмиды длиной 35 т. п. н., находящемся за
пределами Т-ДНК.
После присоединения A. tumefaciens, несущей Ti-плазмиду, к растительной
клетке и активации wV-генов Т-ДНК транспортируется в клетку, по-видимому, с
помощью механизма, аналогичного механизму переноса плазмидной ДНК из
донорной клетки в реципиентную в процессе конъюгации.
Переход Т-ДНК в одноцепочечную форму начинается с внесения в нее
разрывов по обеим фланкирующим ее последовательностям. Предполагается,
что интеграция Т-ДНК в геном растения зависит от специфических
последовательностей,
локализованных
в
правой
фланкирующей
последовательности, которая содержит повтор длиной 25 п. н. Аналогичный
повтор присутствует и в левой последовательности, однако, как показывает
делеционный мутагенез, она не принимает участия в интеграции.
Большинство генов Т-ДНК активируются только после ее встраивания в
геном растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Гены
iaaMiA iaaH, известные также как tmsl и tms2 соответственно, кодируют
ферменты, принимаю-щие участие в синтезе растительного гормона ауксина
(индолилуксусной кислоты). Ген iaaM кодирует фермент триптофан-2монооксигеназу, которая катализирует превращение триптофана в индолил-3ацетамид,
а
ген
iaaH
—
фермент
индолил-3-ацетамидгидролазу,
катализирующую образование индолилуксусной кислоты из индолил-3ацетамида. Кроме того, Т-ДНК несет ген tmr (известный также как ген itp),
кодирующий изопентилтрансферазу — фермент, который катализирует
присоединение к 5'-AMP изопреноидной боковой цепи с образованием
цитокининов изопентениладенина и изопентениладенозинмонофосфата. При
гидроксилировании этих соединений растительными ферментами образуются
цитокинины трансзеатин и трансрибозилзеатин соответственно. И ауксин, и
623
SCIENCE TIME
цитокинины регулируют рост и развитие растительной клетки, но, присутствуя в
избытке, могут вызывать у растений образование опухолей, таких как
корончатый галл [1].
2. Физические методы. Системы переноса генов с помощью A.
tumefaciens эффективно работают только в случае некоторых видов растений. В
частности, однодольные растения, включая основные зерновые культуры (рис,
пшеницу и кукурузу), практически не трансформируются A. tumefaciens. Тем не
менее, модифицировав методики и тщательно контролируя условия, удалось
трансформировать кукурузу и рис агробактериями A. tumefaciens, несущими
векторы — производные Ti- плазмид [2].
Так, например, незрелые зародыши кукурузы помещали на несколько
минут в суспензию клеток A. tumefaciens, а затем инкубировали несколько дней
в отсутствие селективного давления. После этого зародыши переносили в среду
с антибиотиками, в которой могли расти только трансформированные
растительные клетки. Эти клетки выдерживали в темноте в течение нескольких
недель, затем переносили массу трансформированных растительных клеток на
другую питательную среду и инкубировали на свету, чтобы произошла
регенерация целого трансгенного растения.
3. Бомбардировка микрочастицами. Бомбардировка микрочастицами,
или биолис-тика, — наиболее многообещающий метод введения ДНК в
растительные клетки. Золотые или вольфрамовые сферические частицы
диаметром 0,4—1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной СаС12, спермидином или
полиэтиленгликолем, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья»,
приводимого в действие газами, образующимися при сгорании пороха, сжатым
воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300—600 м/с и
пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их
плотность такова, что клетки практически не повреждаются.
Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, каким-то неизвестным
способом интегрируется в растительную ДНК. Метод бомбардировки
микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в
том числе однодольные и хвойные, в которые не удается ввести ДНК с помощью
Agrobacterium [2].
Бамбардировку микрочастицами можно использовать также для введения
чужеродной ДНК в суспензию растительных клеток, культуры клеток,
меристематические ткани, незрелые зародыши, протокормы, колеоптили и
пыльцу широкого круга растений. Кроме того, с помощью этого метода были
транспортированы гены в хлоропласт и митохондрии. На поверхность
микрочастиц можно осадить плазмидную ДНК, растворенную в буфере. Это
позволяет повысить частоту трансформации путем увеличения количества
плазмидной ДНК; однако следует иметь в виду, что слишком большие ее
624
SCIENCE TIME
количества могут оказаться губительными для клетки.
В трансформированных таким способом клетках, идентифицируемых по
экспрессии маркерного гена, введенная ДНК зачастую экспрессируется лишь
кратковременно. Пока чужеродная ДНК не встроится в геном растения, она с
большой вероятностью утрачивается при делении трансформированных клеток.
Как интеграция, так и экспрессия чужеродных генов может зависеть от
конфигурации вектора, используемого для их введения. Например, частота
трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК.
Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды
(>10 т. п. н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных
генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера [1].
Литература:
1. Б.Глик, Дж. Пастернак Молекулярная биотехнология. Принципы
применение, М.: Мир, 2002.-585 с.
2. Маниатис Т. Методы генетической инженерии, М.: Мир, 2001.- 479 с.
625
и