Анализ аберраций хромосом и микроядер в потомках клеток

"Радиация и риск", 2006, Том 15, № 1-2
Анализ аберраций хромосом и микроядер в потомках клеток
китайского хомячка, облученных при различных дозах
и интенсивностях γ-излучения
Рябченко Н.И., Антощина М.М., Насонова В.А., Фесенко Э.В.
ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
Клетки китайского хомячка линии V-79 облучали γ-квантами в дозе 0,5 Гр и 3 Гр при мощностях доз, равных 0,48 Гр/мин (острое облучение) и 0,0485 мГр/мин (пролонгированное облучение). Острое и пролонгированное облучение в дозе 0,5 Гр увеличивает частоту появления микроядер (МЯ) и хромосомных аберраций (ХА). Последующее культивирование облученных клеток в течение 20 генераций увеличивает частоту МЯ, причем для пролонгированного облучения повышенная частота МЯ сохраняется в течение 40-60 генераций, а после
острого облучения число МЯ начинает снижаться после 20 генераций. Острое и пролонгированное облучение в дозе 0,5 Гр увеличивают частоту ХА сразу после облучения, которая постепенно снижается до контрольного уровня к 20-й генерации. Облучение в дозе 3 Гр сразу
после облучения увеличивает частоту ХА, которая снижается до контрольного уровня к 20-й
генерации, затем повышается к 40-й генерации и остается на этом уровне до 60-й генерации.
Введение
В работах многих авторов, обобщенных в обзорах [1, 2, 3], было показано, что плотно- и
редкоионизирующие излучения в высоких дозах вызывают нестабильность генома, которая
проявляется у отдаленных потомков, выживших после облучения клеток. Предполагается, что
основой нестабильности генома являются повреждения ДНК, которые не проявляются сразу
после облучения, но сохраняются у потомков облученных клеток и приводят в течение многих
делений к отсроченной гибели клеток, изменению их радиочувствительности, появлению мутаций, микроядер (МЯ) и хромосомных аберраций (ХА) [2, 4-7]. Повреждения генома у потомков
облученных клеток случайны, непредсказуемы по частоте и времени проявления [3]. Их выраженность зависит от качества излучения [6, 8, 9], вида анализируемых клеток [1, 6] и дозы излучения [5-7].
В последние годы появились данные о том, что редкоионизирующее излучение в малых
дозах также приводит к клеточным проявлениям нестабильности генома в потомках облученных клеток [7, 10, 11], однако при этом наблюдаются иные закономерности по сравнению с эффектами облучения в достаточно высоких дозах [10]. В экспериментальных исследованиях,
проведенных на загрязненной в результате чернобыльской аварии территории при длительном
воздействии ионизирующей радиации в малых дозах и низкой мощности дозы, было показано,
что в отдаленных поколениях клеток наблюдается отсроченная гибель, торможение роста, увеличение частоты микроядер и сестринских хроматидных обменов [12].
В настоящей работе предполагается исследовать нестабильность генома в потомках клеток китайского хомячка, облученных при различных дозах и интенсивностях γ-излучения. В качестве показателя нестабильности генома будет проведен анализ хромосомной нестабильности по тесту появления у потомков облученных клеток МЯ и ХА.
114
"Радиация и риск", 2006, Том 15, № 1-2
Материалы и методика
Работа выполнена на клетках китайского хомячка линии V-79, которые культивировали в
среде Игла c добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Для изучения действия
пролонгированного облучения на частоту хромосомных аберраций и микроядер клетки облучали при температуре 37 °С в течение недели при мощности дозы 0,0485 мГр/мин γ-квантами
137
Cs на установке «Панорама» (МРНЦ РАМН, Россия) в суммарной дозе 0,5 Гр. Острое облу-
чение клеток V-79 в дозах 0,5 Гр и 3 Гр проводили γ-квантами
60
Со на установке «Луч»
(«Изотоп», Россия) при мощности дозы 0,48 Гр/мин. Клетки после пролонгированного и острого
облучения пересевали каждые 3-4 дня и анализировали сразу после облучения и через 5, 10,
15 и 20 пассажей. В отдельных экспериментах было показано, что перед выходом в стационарную фазу во время каждого пассажа клетки проходят четыре митотических деления (генерации). Для определения частоты ХА клетки выращивали в течение 24 часов после пересева на
новую питательную среду. Для накопления делящихся клеток в стадии метафазы за два часа
до фиксации в культуральную среду вносили демеколцин. Клетки гипотонизировали, фиксировали смесью метанола и ледяной уксусной кислоты, наносили на предметные стекла и окрашивали азур-эозином. Для определения частоты МЯ клетки пересевали и выращивали в течение
30 часов, затем обрабатывали 0,125 М раствором KCl в течение 2 мин и фиксировали. Препараты готовили методом раскапывания на охлажденные предметные стекла, высушивали и окрашивали азур-эозином. Частоту МЯ учитывали в 1000 клеток с четкими границами
цитоплазмы [13, 14].
Результаты и обсуждение
Сразу после завершения пролонгированного облучения число МЯ на 1000 клеток увеличивается с 14 (контроль) до 70,7. При дальнейшем культивировании число клеток с МЯ продолжает возрастать вплоть до 40-й генерации и сохраняется примерно на том же уровне до
60-й генерации. К 80-й генерации частота клеток с МЯ падает, но остается по-прежнему на более высоком уровне по сравнению с контролем (рис. 1). При остром облучении в той же дозе
сразу после воздействия число МЯ на 1000 клеток увеличивается с 14 (контроль) до 45,3, потом
возрастает до 20-й генерации и при дальнейшем культивировании начинает уменьшается. Однако даже после завершения 80 генераций наблюдаемое число клеток с МЯ у потомков облученных клеток в два раза превышает частоту МЯ в контроле.
Таким образом, при действии пролонгированного облучения в дозе 0,5 Гр, а также острого облучения в той же дозе у отдаленных потомков облученных клеток наблюдается повышенная частота клеток с МЯ. Так как МЯ являются летальными событиями для клетки, то можно
полагать, что повышенная частота клеток с МЯ у потомков облученных клеток свидетельствует
о возникновении этих повреждений de novo, т.е. наблюдается типичное проявление нестабильности генома. Как для пролонгированного, так и для острого облучения после 20 генераций у
потомков облученных клеток в одинаковой степени повышена частота клеток с МЯ. Вместе с
115
"Радиация и риск", 2006, Том 15, № 1-2
тем, полученные данные свидетельствуют о том, что после пролонгированного облучения проявления нестабильности генома наблюдаются более длительное время и повышенный уровень
МЯ сохраняется вплоть до 60-й генерации, в то время как при остром облучении в той же дозе
после 20-й генерации частота клеток с МЯ начинает уменьшаться.
140
1
число МЯ на 1000 клеток
120
2
3
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
число генераций
Рис. 1. Изменение числа микроядер (МЯ) при различных сроках культивирования клетках клеток китайского хомячка V-79, облученных в дозе 0,5 Гр при различных мощностях дозы
γ-излучений.
60
137
1 – γ-излучение Со, мощность дозы 0,48 Гр/мин; 2 – γ-излучение
Сs, мощность дозы 0,047 мГр/мин;
3 – контроль. Абсцисса – число генераций облученных и необлученных клеток. Ордината – число МЯ
на 1000 клеток.
Наряду с МЯ, у тех же клеток после пролонгированного и острого облучения в дозе 0,5 Гр
в метафазах первого после пересева митоза анализировали аберрации хромосом. Как следует
из данных, приведенных на рис. 2, сразу после острого и пролонгированного облучения число
ХА, приходящихся на 100 метафаз, увеличивалось, однако динамика изменения частоты ХА в
процессе длительного культивирования потомков облученных клеток отличалась от динамики
частоты МЯ, наблюдаемой у этих клеток. В отличие от МЯ пролонгированное облучение по
сравнению с острым облучением индуцирует меньше ХА. Последующее длительное культивирование облученных клеток приводит к снижению выхода аберраций хромосом и через 20 генераций уровень ХА приближается к контролю. После пролонгированного облучения к 40-й генерации частота ХА несколько увеличивается, однако при дальнейшем культивировании уровень
ХА вновь снижается и через 60 генерации практически не отличается от контрольного уровня
(рис. 2). После острого облучения в дозе 0,5 Гр у потомков облученных клеток, прошедших более 20 генераций, частота ХА не отличается от контроля.
116
"Радиация и риск", 2006, Том 15, № 1-2
число аберраций на 100 метафаз
12
10
1
2
3
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
число генераций
Рис. 2. Изменение числа аберраций хромосом при различных сроках культивирования клетках
клеток китайского хомячка V-79, облученных в дозе 0,5 Гр при различных мощностях дозы
γ-излучений.
60
137
1 – γ-излучение Со, мощность дозы 0,48 Гр/мин; 2 – γ-излучение
Сs, мощность дозы 0,047 мГр/мин;
3 – контроль. Абсцисса – число генераций облученных и необлученных клеток. Ордината – общее число
аберраций хромосом на 100 метафаз.
Дальнейшее исследование закономерностей индукции хромосомной нестабильности,
оцениваемой по тесту ХА, было проведено после острого облучения клеток в дозе 3 Гр. Как
следует из данных, приведенных на рис. 3, сразу после облучения число ХА, приходящихся на
100 метафаз, увеличивается с 0,5-1,0 (контроль) до 29. Последующее культивирование облученных клеток приводит к тому, что наблюдаемый сразу после облучения высокий уровень ХА
снижается и после 8-16 генераций не отличается от контроля. Однако при дальнейшем культивировании облученных клеток уровень ХА, начиная с 20-й генерации, увеличивается и через 40
генераций у потомков облученных клеток число появившихся «de novo» ХА составляет 11 на
100 метафаз, что более чем в 10 раз превышает уровень ХА в контроле. Повышенный уровень
ХА сохраняется у потомков облученных клеток и через 60 генераций (рис. 3).
Изучение спектра аберраций хромосом показало, что сразу после облучения в дозе 3 Гр
из общего числа ХА 12 % составляют аберрации хроматидного типа и 88 % составляют аберрации хромосомного типа, из которых 22,5 % ХА составляют парные фрагменты и 65,5 % составляют обменные аберрации (дицентрики, трицентрики, ацентрические кольца). При анализе
спектра аберраций хромосом, которые появились de novo после прохождения потомками облученных клеток 40 генераций, было показано, что из общего числа аберраций 22,7 % представлено аберрациями хроматидного типа, а остальные аберрации (77,3 %) представлены обменными аберрациями хромосомного типа. Следует отметить разницу в структуре обменных абер117
"Радиация и риск", 2006, Том 15, № 1-2
раций хромосомного типа, появляющимися сразу после облучения и после продолжительного
культивирования облученных клеток. Так, все обменные аберрации хромосомного типа, появляющиеся сразу после облучения, содержат сопутствующие им парные фрагменты, в то время
как у обменных аберраций хромосомного типа, возникающих «de novo» после продолжительного культивирования облученных клеток, отсутствуют сопутствующие им парные фрагменты.
Одним из возможных механизмов образования у потомков облученных клеток дицентрических и
кольцевых хромосом может быть потеря теломерных участков хромосом и последующая аномальная ассоциация этих хромосом с образованием дицентрических и моноцентрических кольцевых структур без сопутствующих им парных фрагментов [9, 15].
35
число аберраций хромосом
на 100 метафаз
30
1
2
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
число генераций
Рис. 3. Зависимость выхода аберраций хромосом от продолжительности культивирования клеток китайского хомячка V-79, облученных в дозе 3 Гр γ-квантами 60Со при мощности дозы 0,48
Гр/мин.
1 – облученные в дозе 3 Гр клетки; 2 – необлученные клетки. Абсцисса – число генераций облученных и
необлученных клеток. Ордината – число аберраций на 100 метафаз.
Проведенные эксперименты свидетельствуют о проявлении хромосомной нестабильности у потомков облученных клеток после воздействия редкоионизирующей радиации в низких и
высоких дозах облучения. Интересным является факт выраженной индукции МЯ в потомках
клеток при пролонгированном облучении в низких дозах. Данные работ [16, 17] свидетельствуют о том, что образование МЯ являются следствием появления ацентрических фрагментов,
утраты хромосом, нерасхождения хромосом, а также наличия апоптотической фрагментации
хроматина. Анализ появления МЯ и ХА при воздействии на клетки различных факторов показал, что численные соотношения появления этих повреждений определяются механизмами
действия на клетки исследуемых факторов. Так, появление МЯ после первого деления облученных клеток в основном связано с индукцией ионизирующим излучением ацентрических
118
"Радиация и риск", 2006, Том 15, № 1-2
фрагментов [14, 18, 19]. Воздействие на клетки агентов, индуцирующих в основном аберрации
хроматидного типа, практически не приводит к появлению МЯ, в то время как агенты, например
винбластин, воздействующие на митотическое веретено и вызывающие анеуплоидию, увеличивают частоту клеток с МЯ и менее эффективны в отношении индукции ХА [14, 17, 18]. Полученные нами результаты (рис. 1 и 2) показали, что при низкой дозе облучения уровни хромосомной нестабильности, оцениваемые по тестам появления МЯ и ХА, различаются по динамике
их изменений в потомстве облученных клеток. Так, при действии острого и пролонгированного
облучения (доза 0,5 Гр) число клеток с МЯ в потомстве облученных клеток, совершивших 20
удвоений, увеличивается (рис. 1). В то время как проведенный нами анализ появления ХА у
этих же клеток показал, что повышенный уровень ХА, индуцированный в первом митозе облучением в дозе 0,5 Гр, через 20 генераций снижается и приближается к контрольному уровню.
Учитывая данные приведенных выше работ [14, 16-20], можно сделать вывод о том, что наблюдаемая разница в динамике изменения числа МЯ и ХА является следствием появления у потомков облученных клеток анеугенных повреждений (утрата и нерасхождение хромосом) и,
возможно, признаков апоптотической деградации хроматина. Эти повреждения практически не
учитываются при анализе ХА, но увеличивают число МЯ у потомков облученных клеток. Необходимо также отметить, что предложенный механизм увеличения числа МЯ в потомстве облученных клеток, наблюдаемого в настоящей работе и проведенных ранее исследовании [11, 12],
характерен для низких (0,5 Гр) доз облучения. Согласно данным работы [12], при высоких (6 Гр)
дозах число МЯ, индуцируемых излучением после первого деления, снижается при последующим культивировании облученных клеток и через 24-30 генераций уже не отличается от контрольного уровня. Видимо при высоких дозах излучения (более 3 Гр) хромосомная нестабильность, проявляющаяся в чреде поколений облученных клеток, связана в большей степени с образованием «de novo» хромосомных аберраций обменного типа. Поскольку появление таких
обменных аберраций не сопровождается появлением сопутствующих им парных фрагментов,
то проявления хромосомной нестабильности при высоких дозах облучения в большей степени
связаны с повышенным уровнем ХА у потомков облученных клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 06-04-48300).
119
"Радиация и риск", 2006, Том 15, № 1-2
Литература
1.
Little J.B. //Int. J. Radiat. Biol. - 1998. - V. 74, N 6. - Р. 663-671.
2.
Wright E.G. //Med. Confl. Surviv. - 2000. - V. 16, N 1. - Р. 117-133.
3.
Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. //Радиационная биология. Радиоэкология. - 2001. - Т. 41, № 3. - С. 272-
289.
4.
Готлиб В.Я., Топонайнен Н.Я., Пелевина И.И. //Радиобиология. - 1985. - Т. 25, Вып. 4. - С. 435-443.
5.
Jamali M., Trott K.R. //Int. J. Radiat. Biol. - 1996. - V. 70, N 6. - P. 705-709.
6.
Kadhim M.A., Marsden S.J., Wright E.G. //Int. J. Radiat. Biol. - 1998. - V. 73, N 2. - P. 143-148.
7.
Пелевина И.И., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В. и др. //Онтогенез. - 2001. - Т. 32, № 1. - С. 51-57.
8.
Ponnaiya B., Cornforth M.N., Ullrich R.L. //Radiat. Res. - 1997. - V. 147, N 3. - Р. 288-294.
9.
Sobatier L., Lebeau J., Pommier J.P. et al. //Radiat. Res. Congress Proc. - 1995. - V. 2. - P. 509-512.
10. Biological Effects at Low Radiation Doses - Models. Mechanisms and Uncertainties. Report to General Assembly. 48 session of UNSCEAR. Vienna, 12-16 April, 1999.
11. Антощина М.М., Рябченко Н.И., Насонова В.А. и др. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. - Т. 45. № 3. - С. 291-293.
12. Пелевина И.И., Алещенко А.В., Антощина М.М. и др. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. - Т. 43, № 2. - C. 161-166.
13. Heddle J.A., Carrano A.V. //Mutat. Res. - 1977. - V. 44, N 1. - P. 63-69.
14. Македонов Г.П., Цвовребова Л.В. //Радиационная биология. Радиоэкология. - 2003. - Т. 42, № 5. - C.
469-474.
15. Sobaties L., Lebeau J., Dutrillaux B. //Int. J Radiat. Biol. - 1994. - V. 66, N 5. - Р. 611-613.
16. Fenech M., Crott J., Turner J. et al. //Mutagenesis. - 1999. - V. 14, N 6. - Р. 605-612.
17. Kirsch-Volders M., Vanhauwaert A., De Boeck M. et al. //Mutat. Res. - 2002. - V. 504, N 1-2. - Р. 137-148.
18. Salassidis K., Huber R., Zitzelsberger H. et al. //Environ. Mol. Mutagen. - 1992. - V. 19, N 1. - Р. 1-6.
19. Keshava C., Ong T., Nath J. //Mutat. Res. - 1995. - V. 328, N 1. - P. 63-71.
20. Ponza I., Barquinero J.F., Egozcue J. et al. //Radiat. Res. - 2001. - V. 155, N 3. - Р. 424-431.
Analysis of chromosome aberrations and micronucleus in the descendants
of Chinese hamster cells, irradiated at various doses and intensities of γ-radiation
Ryabchenko N.I., Antoschina M.M., Nasonova V.A., Fesenko E.V.
Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk
The Chinese hamster cells V-79 were irradiated by Fγ-rays in doses 0.5 Gy and 3 Gy at dose rate
of 0.48 Gy/min (an acute irradiation) and in dose 0.5 Gy at dose rate of 0.0485 мGy/min (a prolonged irradiation). The acute and prolonged irradiation in a dose 0.5 Gy enlarges frequency of appearance of micronucleus. Subsequent cultivation of the irradiated cells during 20 generations
enlarges frequency of micronucleus, and for a prolonged irradiation the boosted frequency of micronucleus is saved during 40-60 generations. After an acute irradiation the number of micronucleus starts to be reduced after 20 generations. An acute and prolonged irradiating in a dose 0.5 Gy
enlarge frequency of chromosome aberrations at once after an irradiating, which is gradually reduced up to a control level to 20 generating. The irradiating in a dose 3 Gy enlarges frequency of
chromosome aberrations at once after an irradiating, which is reduced up to a control level to 20
generating, then increases to 40-th generating and remains at this level before 60-th generating.
120