Я. Н. Демурин, О. М. Борисенко, ГНУ ВНИИМК

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009
__________________________________________________________
Я. Н. Демурин,
доктор биологических наук, профессор
О. М. Борисенко,
научный сотрудник
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17
тел.: (861)274-55-94, факс: (861)254-27-80
e-mail:[email protected]
УСТОЙЧИВОСТЬ МУТАЦИИ ВЫСОКООЛЕИНОВОСТИ МАСЛА К ДЕЙСТВИЮ
СУПРЕССОРА В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА
Ключевые слова: мутация высокоолеиновости, супрессор, семена, гибридологический анализ
УДК 633.854.78:575.113
Введение. Изучение гибридных семян в скрещивании образцов мировой коллекции подсолнечника с
высокоолеиновыми тестерами показало, что мутация Ol была доминантной в 59 % комбинаций скрещиваний, неполностью доминантной в 38 % и рецессивной в 3 % 1 . Наблюдаемое варьирование содержания
олеиновой кислоты в отдельных семенах F1 от мутантного до нормального фенотипов объясняется как неполной пенетрантностью гена Ol в гетерозиготе при наличии супрессора 3 , так и потенциальной гетерозиготностью нормальных образцов по супрессору. Предполагается, что гомозиготное состояние супрессора
может идентифицироваться и контролироваться только на генотипической среде OlOl гомозиготы, вызывая
нормальный фенотип 4 .
Наследование мутации высокоолеиновости в семьях F2 при скрещивании высокоолеиновых и супрессорных линий соответствовало различным схемам расщепления: моногенной рецессивной, моногенной
доминантной, полигенной и без расщепления. Важно, что доля мутантных семян в популяции F2 положительно коррелировала с содержанием олеиновой кислоты в исходном семени F1 2 .
У высокоолеинового мутанта в период активного биосинтеза запасного жира в созревающих семенах
отсутствует активность фермента микросомальной олеат-десатуразы, катализирующего превращение олеиновой кислоты в линолевую 5 . Позже было установлено существенное уменьшение уровня накопления
в клетках м-РНК этого фермента 6 . Следовательно, с молекулярно-генетической точки зрения, мутация
высокоолеиновости вызывается нарушением регуляции транскрипции экспрессирующегося только в клетках
зародыша семени ФАД2 гена 7 .
Изучение эффекта супрессии мутации высокоолеиновости в ходе гибридологического анализа было
целью данной работы.
Материал и методы. В скрещиваниях использованы линии генетической коллекции подсолнечника
ВНИИМК: высокоолеиновые ЛГ26 и ВК508; линолевые ЛГ28, 83HR4, RIL100, К1587 и ВИР721. Гибридологический анализ выполнен принятыми в лаборатории генетики ВНИИМК методами.
Определение жирно-кислотного состава масла проводили с помощью газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот на хроматографе Хром-5 с пламенно ионизационным детектором.
Показатель степени доминирования признака рассчитывали как отношение h/d, где h – отклонение
фенотипа F1 от среднего (m) между ранжированными родителями P1 и P2, а d – половина разности между
родителями P1 и P2 или модуль разности любого родителя и m.
Результаты и обсуждение. В рамках международной программы изучения генетики мутации высокоолеиновости у подсолнечника нами была получена из INRA (г. Монпелье, Франция) в 2003 г. рекомбинантная инбредная линия RIL100. Эта линия представляла собой F6 (I5) поколение скрещивания
83HR4×RHA345. Главной особенностью RIL100 являлось необычное сочетание мутации высокоолеиновости, идентифицируемой по молекулярному маркеру, с нормальным низкоолеиновым фенотипом.
В задачи нашей работы входила проверка присутствия Ol мутации у RIL100 путѐм гибридологического анализа. В скрещиваниях участвовали три нормальные по жирно-кислотному составу линии: RIL100
(40 % олеиновой кислоты), 83HR4 (42 %) и ЛГ28 (27 %). Все семена F1 двух комбинаций скрещиваний
RIL100×83HR4 и ЛГ28×RIL100 обладали нормальным фенотипом. У семян F2 от скрещивания
RIL100×83HR4 и одной семьи ЛГ28×RIL100 наблюдались только нормальные фенотипы (табл. 1). В другой
семье ЛГ28×RIL100 обнаружено 9 мутантных семян (80-92 % олеиновой кислоты) из 120 штук.
Таблица 1 – Наследование мутации высокоолеиновости в F2 в скрещиваниях
с линией RIL100
Скрещивание
RIL100×83HR4
ЛГ28×RIL100
ВНИИМК, Краснодар, 2003 г.
Число семян F2, шт.
нормальных
мутантных
(27-71 % С18:1*)
(77-93 % С18:1)
30
0
80
0
111
9
* - С18:1 – олеиновая кислота
Факт появления рекомбинантных высокоолеиновых семян в F2 при скрещивании обычных по жирно-кислотному составу линий был обнаружен впервые и доказывает наличие мутации Ol у RIL100 в гипостатическом состоянии. Данные гибридологического анализа подтвердили предположение, высказанное
французскими учѐными в молекулярно-генетическом исследовании мутации 4 .
Второй аспект изучения особенностей супрессорного эффекта был связан с проведением гибридологического анализа мутации в скрещивании с предварительно отобранными из мировой коллекции подсолнечника линиями, существенно снижающими содержание олеиновой кислоты у гетерозиготных семян.
Так, в скрещивании высокоолеиновой ВК508 с двумя супрессорными линиями К1587 и ВИР721 в F1
доминировал признак нормального содержания олеиновой кислоты со значениями h/d 0,05 и 0,25. Этот факт
подтвердил ингибиторный эффект супрессорных линий. Тем не менее, высокоолеиновая ЛГ26 в скрещивании с супрессорами показала полное доминирование мутации в F1 с h/d, равным 1,12 и 0,96 (табл. 2).
Таблица 2 – Степень доминирования высокоолеиновости в семенах F1
ВНИИМК, Краснодар, 2003 г.
Скрещивание
K1587 ВК508
ВИР721 ВК508
K1587 ЛГ26
ВИР721 ЛГ26
НСР05
Содержание олеиновой кислоты,
% (n = 20)
♀
F1
♂
53
71
91
32
54
91
53
89
87
32
86
87
4
8
1
Степень доминирования,
h/d
НСР05
-0,05
-0,25
1,12
0,96
5
6
2
3
Смена доминирования признака в различных скрещиваниях F1 может объясняться взаимодействием
супрессора и мутации Ol по типу доминантного эпистаза. Более парадоксальным представляется феномен
отсутствия единообразия гибридов F1, заключающийся в существенном варьировании содержания олеиновой
кислоты в отдельных семенах по всем фенотипическим классам от нормального до мутантного для двух первых комбинаций скрещиваний. Очевидно, что дигетерозиготное состояние мутации Ol и супрессора может
сопровождаться неопределѐнностью значений признака у семян F1, тогда как гомозигота по супрессору приводит во всех случаях к нормальному фенотипу (RIL100).
В шести семьях F2 с участием ВК508 наблюдалось дигенное расщепление на фенотипические классы
нормальный и высокоолеиновый в модельном отношении 13 (9 Ol-Sup-, 3 olol Sup-, 1 olol supsup): 3 (Ol- supsup). Кроме того, в одной корзинке все семена оказались фенотипически нормальными. При скрещивании
ЛГ26 с супрессорами, однако имело место моногенное расщепление 1 нормальный : 3 высокоолеиновых
(табл. 3).
Таблица 3 – Расщепление в F2 по мутации высокоолеиновости масла в отдельных семенах
при скрещивании с супрессорными линиями
Скрещивание
ВИР721×ВК508
К1587×ВК508
ВИР721×ЛГ26
К1587×ЛГ26
Фенотип F1,
%
29
35
35
72
85
55
70
85
85
85
85
85
85
Число семян F2, шт.
норма
мутация
40
0
34
6
37
3
34
6
33
7
33
7
30
10
10
30
15
25
5
35
14
26
8
32
9
31
ВНИИМК, Краснодар, 2003-2004 гг.
χ2
Доля
мутантов
13:3
1:3
0,00
0,15
0,37*
76,80
0,08
3,32*
97,20
0,15
0,37*
76,80
0,18
0,04*
70,53
0,18
0,04*
70,53
0,25
1,03*
53,33
0,75
83,08
0,00*
0,63
50,25
3,33*
0,88
124,10
3,33*
0,65
56,16
2,13*
0,80
98,50
0,53*
0,78
90,62
0,13*
* – р > 0,05, χ2st = 3,84
В полевых условиях 2005 г. из отдельных семян F2 с известным жирно-кислотным составом получено 79 семей F3 в трѐх комбинациях скрещиваний ВИР721×ЛГ26, К1587×ВК508 и ВИР721×ВК508. В каждой
корзинке проанализировано по 10 отдельных семян для оценки гомогенности потомства (табл. 4).
Первое скрещивание ВИР721×ЛГ26 характеризовалось в F3 классическим типом моногенного наследования 1:2:1 по числу нормальных, расщепляющихся и мутантных семей. Кроме того, мутантные семена F2
дали потомство в F3 двух видов: или мутантное, или расщепляющееся, тогда как нормальные семена F2 –
только нормальное. Следовательно, мутация Ol наследовалась в F3, как моногенный доминантный признак.
Во втором скрещивании К1587×ВК508 не обнаружено ни одной гомогенной семьи F3 с мутантными
семенами. При этом расщепление в F2 на 30 нормальных : 10 мутантных соответствовало схеме 13:3, согласно которой класс мутантных семян должен давать в самоопылѐнном потомстве два вида семей F3 – мутантные и расщепляющиеся в отношении 1:2. Из шести полученных семей F3 четыре показали расщепление, а
две были гомогенными, но с нормальными семенами. Следовательно, в F3 не удалось получить рекомбинантный гомозиготный мутантный фенотип после пребывания мутации Ol в гетерозиготном сочетании с супрессором.
Таблица 4 – Гомогенность семей F3 по мутации высокоолеиновости масла в отдельных
семенах при скрещивании с супрессорными линиями
Скрещивание
ВИР721×ЛГ26
К1587×ВК508
ВИР721×ВК508
нормальных,
без расщепления
7
18
25
ВНИИМК, Краснодар, 2005 г.
Число семей F3, шт.
мутантных,
расщепляющихся
всего
без расщепления
15
7
29
7
0
25
0
0
25
В третьем скрещивании ВИР721×ВК508, начиная с нормального cемени F1, у 40 нормальных семян
F2 и 25 гомогенных семей F3 с 250 нормальными семенами наблюдалось полное отсутствие семян с мутантным фенотипом. Это "исчезновение" мутации не может быть отнесено к артефакту за счѐт отсутствия гибридизации отдельного трубчатого цветка корзинки материнской формы ВИР721 и его самоопыления. Прямым
доказательством успешной гибридизации явилось моногибридное расщепление в F2 по гену антоциановой
окраски всего растения T (121 антоциановых : 36 зелѐных, χ2(3:1)=0,36; р > 0,05) и дигибридное расщепление
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009
__________________________________________________________
по гену T и гену-локализатору антоциановой окраски в лепестках язычковых цветков G (78 антоциановых :
79 не антоциановых, χ2(9:7)=2,75; р > 0,05). Рецессивные аллели этих маркерных генов находились у отцовской формы ВК508.
Заключение. В результате гибридологического анализа установлено наличие у нормальной по жирно-кислотному составу линии RIL100 мутации Ol в гипостатическом состоянии. При скрещивании нормальных линий ЛГ28×RIL100 в F2 обнаружены рекомбинантные высокоолеиновые фенотипы с частотой около
8 %.
Наследование мутации высокоолеиновости в скрещивании линии ЛГ26 с супрессорами К1587 и
ВИР721 соответствовало моногенной доминантной схеме в F1, F2 и F3. Это явление указывает на устойчивость мутации Ol в генотипической среде линии ЛГ26 к действию супрессора. С другой стороны, наследование мутации высокоолеиновости в скрещивании линии ВК508 с супрессорами в F1 и F2 описывалось
дигенной моделью по типу доминантного эпистаза Sup над Ol в отношении 13 нормальных : 3 мутантных.
Комбинация К1587×ВК508 показала в F3 отсутствие гомозиготных высокоолеиновых семей, а
ВИР721×ВК508 – отсутствие не только гомозиготных высокоолеиновых, но и расщепляющихся семей, т.е.
полное исчезновение мутантных семян. Подобное явление реверсии признака к дикому типу, вероятно, может объясняться репарационным механизмом действия супрессора.
Благодарности. Данная работа поддержана грантом № 08-04-99109 регионального конкурса РФФИ.
Литература
1. Демурин, Я. Н. Поиск супрессорных генотипов по мутации высокоолеиновости масла семян подсолнечника / Я. Н. Демурин, О. М. Борисенко, С. Г. Ефименко // НТБ ВНИИМК, Краснодар, 2004. – Вып. 2
(131). – С.31-34.
2. Демурин, Я. Н. Наследование мутации высокоолеиновости в семенах F2 у подсолнечника / Я. Н.
Демурин, О. М. Борисенко // Наука Кубани. – 2005. – № 4. – С. 108-111.
3. Demurin, Ya. Unstable expression of Ol gene for high oleic acid content in sunflower seeds / Ya. Demurin, D. Skoric // In: Proc. 14th Int. Sunflower Conf., Beijing. Shenyang, China, 12-20 June 1996. – 1996. – Р. 145150.
4. Lacombe, S. An oleat desaturase and a suppressor loci direct high oleic acid content of sunflower (Helianthus annuus L.) oil in the Pervenets mutant / S. Lacombe, F. Kaan, S. Leger, A. Berville // Life Sciences (Paris). –
2001. – 324. – Р. 1-7.
5. Garces, R. In vitro oleate desaturase in developing sunflower seeds / R. Garces, M. Mancha // Phytochemistry. – 1991. – Vol. 30. – No.7. – Р. 2127-2130.
6. Lacombe, S. Analysis of desaturase transcript accumulation in normal and in high oleic oil sunflower development seeds / S. Lacombe, A. Berville // In: Proc. 15th Int. Sunflower Conf., 12-15 June 2000, Toulouse,
France: A1-A6.
7. Martinez-Rivas, J. M. Spatial and temporal regulation of three different microsomal oleat desaturase
genes (FAD2) from normal-type and high oleic varieties of sunflower (Helianthus annuus L.) / J. M. Martinez-Rivas,
P. Sperling, W. Luhs, E. Heinz // Molecular Breeding. – 2001. – 8. – Р. 159-168.