загрузить автореферат

2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Использование различных методов экспериментальной отдаленной гибридизации, индуцированной агамоспермии, генетического, цитоэмбриологического, биохимического анализов делает возможным
изучение роли отдельных репродуктивных процессов в становлении и сохранении биоразнообразия, филогенетических взаимоотношений, ресинтеза видов.
Генетическая изученность репродуктивных признаков обеспечивает возможность прогнозирования появления новых генотипов с широкой нормой реакции
и позволяет осуществить моделирование комбинаций систем и способов репродукции в природных популяциях.
Двуродительский способ семенного размножения (слияние гамет двух особей) обусловливает сегрегацию и рекомбиногенез, то есть детерминирует изменчивость и создает материал для отбора наиболее приспособленных генотипов. Однородительское воспроизведение – вегетативное размножение, агамоспермия, инбридинг – дает возможность длительного сохранения и неограниченного воспроизведения генотипической и фенотипической относительной
однородности потомков (Малецкий и др., 2004). При апомейотической агамоспермии и вегетативном размножении возможно сохранение высокогетерозиготных полиплоидных генотипов (Петров, 1988; Nogler, 1984; Allard, 1999).
У дикорастущих представителей рода Fragaria L. (Земляника) из семейства
Rosaceae Juss. (Розоцветные) возможность прогрессивной эволюции определяет
сочетание полноценного семенного воспроизводства с интенсивным вегетативным размножением. Этот комплекс обеспечивает пластичность и быструю реакцию на изменение среды, поэтому они относятся к вегетативно-подвижным
(Серебряков, 1962). У Fragaria × ananassa Duch. (земляники крупноплодной)
при агамоспермии в матроморфном потомстве наблюдается генетическая изменчивость, обусловленная мейотическими процессами в мегаспорогенезе
(Шангин-Березовский, 1962, 1963; Батурин, 1997). Однако возможности этой
изменчивости в формообразовательном процессе вида до сих пор остаются слабо изученными. Эти обстоятельства обусловливают необходимость проведения
исследований, направленных на выяснение возможностей изменчивости у
F. × ananassa при агамоспермии для формообразовательного процесса.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение
формообразования при агамоспермии у сортов и гибридов Fragaria × ananassa,
2n = 8x = 56.
Были поставлены следующие задачи:
– получить агамоспермное потомство первого и второго поколений при чужеродном опылении;
– исследовать микроспорогенез у агамоспермных и гибридных сеянцев;
– оценить перспективы использования сеянцев агамоспермного происхождения в направленных скрещиваниях;
– произвести отбор и клонирование агамоспермных и гибридных сеянцев с
ценными признаками для селекционно-генетического изучения.
Научная новизна. При сравнительном анализе агамоспермных потомков
1
первого и второго поколений F. × ananassa установлена изменчивость по морфологическим и репродуктивным признакам, в том числе, по качеству пыльцы.
При этом выделены высокофертильные и полностью стерильные сеянцы. Выявленное варьирование значений фертильности пыльцы по годам у одного и того же потомка свидетельствует о зависимости генетических систем, ответственных за формирование полноценного мужского гаметофита, от метеоусловий
года. Изучение микроспорогенеза, проведенное у растений сорта Пурпуровая и
его агамоспермных потомков, показало, что ключевым периодом для формирования фертильной пыльцы является период после распада тетрад микроспор, то есть
увеличения цитоплазмы, деления ядра и быстрого роста оболочек пыльцевого
зерна. Показано, что всхожесть семянок у агамоспермных потомков при половом
процессе (инбридинге и аутбридинге) существенно выше, чем у сорта, от которого они произошли. Высокая всхожесть семянок у образцов F. × ananassa агамоспермного происхождения позволяет их использовать в селекции ремонтантной земляники, размножаемой семенами.
Защищаемые положения.
1. Индукция нередуцированного партеногенеза позволяет реализовать в семенном потомстве Fragaria × ananassa гаметическую изменчивость, в том числе по такому важному репродуктивному признаку как качество пыльцы.
2. Изменчивость в агамоспермном потомстве способствует появлению фенотипов, существенно отличающихся от исходной материнской формы, как в
первом, так и втором семенном поколении.
3. Изменчивость по фертильности пыльцы среди потомков агамоспермного
происхождения открывает перспективы отбора сеянцев, стабильно обладающих
гораздо лучшей фертильностью пыльцы, чем исходный материнский сорт, для
дальнейшего их включения в селекционные программы.
Практическая значимость работы. Изучение генетической изменчивости в
матроморфном потомстве перспективно для выяснения селекционно-генетических возможностей использования агамоспермии, обогащения генофонда земляники крупноплодной, генетического анализа по результатам гаметического расщепления. Так, агамоспермные сеянцы, имеющие ценные свойства исходной материнской формы, могут быть успешно использованы в гибридизации в качестве
опылителя, благодаря улучшенной фертильности пыльцы. Поскольку использование в гибридизации земляники крупноплодной сеянцев партеногенетического
происхождения с улучшенным качеством пыльцы снижает в гибридном потомстве количество самобесплодных сеянцев и увеличивает число сеянцев с высокой
мужской фертильностью, следует активно использовать этот методический прием
для оптимизации селекционного процесса Fragaria × ananassa.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на II Международной научной конференции «Биологическое разнообразие.
Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 1999), на 7-й Международной научной конференции «Международная встреча молодых ученых сельского хозяйства» (Ледница, 1999), на II съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000), на VII Молодежной конференции ботаников
в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2000), на Международной конференции
2
«Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск,
2000), на 2-й Международной конференции по апомиксису АПО2001 (Комо,
2001), на Молодежной конференции «Исследования молодых ботаников Сибири» (Новосибирск, 2001), на 9-й Международной сельскохозяйственной конференции (Ледница, 2001), на 2-й конференции Московского общества генетиков
и селекционеров имени Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), на научной конференции молодых ученых и аспирантов «Аграрная
наука России в новом тысячелетии» (Омск, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием «Ботанические сады и актуальные проблемы
интродукции растений на современном этапе» (Томск, 2010), на Международной конференции: «Биология развития: морфогенез репродуктивных структур и
роль стволовых клеток в онтогенезе» (Санкт-Петербург, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том
числе 4 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав,
выводов, списка литературы, включающего 197 источников, из них 78 – на иностранном языке. Работа изложена на 151 странице, содержит 34 рисунка и 17
таблиц. В работе имеется приложение. Общий объем работы, включая приложение, составляет 189 страниц.
ГЛАВА 1. ФОРМООБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ПРОЦЕСС ПРИ ПАРТЕНОГЕНЕЗЕ
У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА FRAGARIA L.
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
В данной главе представлен систематический обзор представителей рода
Fragaria, дана характеристика морфобиологических особенностей F. × ananassa.
Анализируются работы, посвященные изучению агамоспермного способа семенной репродукции, приведена классификация агамоспермии, рассмотрена
генетическая изменчивость при агамоспермии и возможности формообразования при нередуцированном партеногенезе. Дан обзор работ по пыльцевой стерильности у Fragaria, а также обсуждаются прикладные аспекты использования
агамоспермии у F. × ananassa.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исходный материал. В качестве материнских форм использованы обоеполые сорта F. × ananassa – Пурпуровая, Фестивальная, Бердский рубин и агамоспермные потомки сорта Пурпуровая первого (А1) и второго (А2) семенных
поколений. Потомством А2 считали сеянцы, возникшие из семянок, полученных индукцией партеногенеза у потомков первого поколения А1.
Методы исследований. Агамоспермное потомство А1 и А2 было получено
благодаря индукции нередуцированного партеногенеза при нанесении пыльцы
местных экотипов лапчатки гусиной (Potentilla anserina L., 2n = 4x = 28). Кастрацию обоеполых цветков проводили удалением андроцея вместе с околоцветником. Соцветия помещали в изолятор, вокруг основания цветоноса прокладывалась вата. Пыльцу для скрещивания извлекали из готовых к раскрытию буто3
нов и подсушивали при температуре воздуха 20-22°С без доступа прямых солнечных лучей. Пыльцу наносили мягкой кисточкой однократно. При опылении
нераскрывшиеся бутоны удаляли. Качество кастрации оценивали по не опыленным изолированным соцветиям.
Микроспорогенез изучали на постоянных препаратах пыльцевых зерен, извлеченных из недоразвитых пыльников. Соцветия фиксировали упрощенным
Карнуа (3:1). Состав фиксатора: 96% этилового спирта – 3 части, уксусной (ледяной) кислоты – 1 часть. Материал хранили в 70% этиловом спирте (Паушева,
1988). Окрашивание микроспороцитов проводили солянокислым спиртовым кармином по R.S. Snow (1965) и ацетогематоксилином (Чувашина, 1976). Для приготовления постоянных препаратов в каплю красителя помещали пыльники, которые извлекали из цветков под бинокулярной лупой. Оболочки пыльников удаляли. Каплю краски с пыльцой покрывали покровным стеклом, смазанным консервирующей и просветляющей жидкостью Смита (Абрамова, Карлинский, 1979).
Качество пыльцы изучали на постоянных препаратах, приготовленных из
смеси пыльцы 2-5 цветков различных порядков свежих или фиксированных по
Карнуа (3:1) и окрашенных солянокислым спиртовым кармином. Фертильность
пыльцы выражали долей нормальных (фертильных) зерен в процентах от общего числа изученных пыльцевых зерен.
Завязываемость семянок (семенификацию) в процентах подсчитывали как
отношение числа развившихся семянок к общему числу семязачатков в цветке,
участвовавших в опылении (Методические указания по семеноведению интродуцентов, 1980). Окончательную оценку жизнеспособности семянок проводили
после их проращивания, так как при этом определяется количество беззародышевых (партенокарпных) семянок, морфологически нормальных, но не всхожих
семянок и количество прорастающих семянок.
После стратификации в течение 4 месяцев при температуре 2-3°С семянки
проращивали при температуре 20-23°С в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге, где оценивали всхожесть семянок в процентах и динамику
прорастания. Проростки переносили в теплицу в пикировочные ящики (выживаемость сеянцев учитывали через 30 сут.) и в августе (в возрасте 5-6 месяцев)
высаживали в открытый грунт. При проращивании семянок в пикировочных
ящиках посев производили в марте. Затем ящики помещали в помещение при
температуре от +3 до +5°С для стратификации семянок. В начале мая ящики
выносили в парник для получения всходов. В первой декаде августа сеянцы в
возрасте 2,5-3 месяцев высаживали в открытый грунт. Идентификацию сеянцев
проводили по межродовым различиям морфологических признаков и по числу
хромосом. При подсчете чисел хромосом применяли фиксацию молодых листочков смесью Карнуа (3 : 1) и окраску ацетофуксином (Чувашина, 1976). Зимостойкость сеянцев определяли весной в период отрастания листьев до цветения по 6-балльной шкале подмерзания растений (Зубов, 1990). Оценку основных апробационных признаков образцов проводили согласно общепринятой
методике описания сортов (Исачкин и др., 2001).
Для статистической обработки данных использовали стандартные методы
(Урбах, 1964; Зайцев, 1990).
4
ГЛАВА 3. ИНДУКЦИЯ НЕРЕДУЦИРОВАННОГО ПАРТЕНОГЕНЕЗА
У FRAGARIA × ANANASSA DUCH. ПРИ ПОМОЩИ ЧУЖЕРОДНОГО
ОПЫЛЕНИЯ
Способность к агамоспермному способу формирования семян была изучена
у 3 сортов F. × ananassa – Пурпуровой, Фестивальной и Бердского рубина. Завязывание плодов и семянок отмечалось у всех вовлеченных в эксперимент
сортов. Наибольшее количество плодов сформировалось у сортов Фестивальная
и Пурпуровая. Количество семянок на опыленный цветок было примерно одинаковым у исследуемых сортов. Проращивание семянок выявило их низкую
всхожесть. Семянки прорастали медленно, их всхожесть колебалось от 4.1% у
сорта Пурпуровая до 34.4% у сорта Бердский рубин. На стадии семядолей проростки часто погибали, и их гибель достигала 100%. Низкая всхожесть семянок,
возможно, обусловлена гибридностью зародыша, который в силу межродовой
несовместимости полноценно не развивается (Niemirowicz-Szczytt, 1984), а
также гомозиготным состоянием по летальным рецессивным аллелям генотипа
зародыша в результате диплоидизации редуцированной яйцеклетки (Asker,
1971). Показатель склонности к нередукции у изучаемых сортов составил 68
шт. агамоспермных сеянцев (АС) на 100 семянок. По количеству полученных
АС выделяются сорта Бердский рубин – 31 шт. АС на 100 семянок и Фестивальная – 28 шт. АС на 100 семянок. По числу матромофных сеянцев характерны различия и в пределах одного сорта в разные годы индукции.
Для изучения наследуемости тенденции к агамоспермии была проведена
повторная индукция нередуцированного партеногенеза у АС1 сортов Пурпуровая, Бердский рубин и Фестивальная. Плоды с семянками развились почти у
всех форм. Необходимо отметить, что проращивание семянок, полученных от
АС1, выявило еще более низкую всхожесть в сравнении с материнскими сортами. Всхожесть семянок колебалось от 0.9 до 10.5%. Большинство семянок оказались невсхожими. Также для образцов характерен высокий процент гибели
проростков от 40 до 100%. Число АС при повторной индукции партеногенеза
невелико, что следует из показателя числа сеянцев второго поколения на 100
развившихся семянок. Так, при повторной индукции показатель агамоспермии
составил 18 шт. АС2 на 100 семянок. Малое количество АС в этих комбинациях
обусловлено низкой всхожестью семянок и очень высокой гибелью проростков,
что, скорее всего, объясняется их гибридным происхождением.
Таким образом, эксперимент по индукции нередуцированного партеногенеза подтвердил, что все исследованные сорта и экспериментальные образцы F. ×
ananassa в большей или меньшей степени способны формировать матроморфное потомство. При повторной индукции агамоспермии наблюдается уменьшение количества матроморфных сеянцев. Варьирование количества АС, полученных в разные годы индукции, указывает на зависимость проявления агамоспермии от факторов среды, а также на зависимость от генотипа исходных родительских образцов.
5
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ АГАМОСПЕРМНЫХ СЕЯНЦЕВ
4.1. Агамоспермное потомство первого поколения
Сравнительный анализ агамоспермного потомства и исходных родительских сортов показал, что агамоспермные сеянцы отличаются по морфологическим признакам куста, листа, цветоносов, по отдельным хозяйственным свойствам плода. Полного совпадения с исходным сортом по изучаемым морфологическим признакам не выявлено ни у одного из обследованных агамоспермных потомков первого поколения. При агамоспермном способе воспроизводства семян не происходит полное копирование материнского генотипа. В агамоспермном потомстве наблюдается изменчивость.
Изучение качества пыльцы у агамоспермных аналогов сортов Фестивальная,
Бердский рубин и Пурпуровая проводилось для выявления их мужской фертильности, то есть для прогноза возможностей использования агамоспермных сеянцев
в качестве опылителей в дальнейших селекционных программах, а также для
формирования односортных насаждений. Качество пыльцы оценивалось по шкале, предложенной G.M. Darrow (1966), согласно которой растения с выполненностью пыльцы 0,0% относятся к мужскостерильным (МС), от 0.1 до 6.0% – к полустерильным (ПС), от 6.1 до 20.0% – к полуфертильным (ПФ), от 20.1 до 50.0% –
к фертильным (Ф) а от 50.1 до 100.0% – к высокофертильным (ВФ).
Вариабельность по качеству пыльцы, обнаруженная у АС изучаемых сортов, подтверждает наличие изменчивости в агамоспермном потомстве материнского сорта. Эта изменчивость создает основу для отбора наиболее фертильных
сеянцев при сохранении основных достоинств сорта.
Особый интерес по качеству пыльцы представляет матроморфное потомство сорта Пурпуровая. В режиме индукции партеногенеза от этого сорта было
получено 59 АС с различной выраженностью фертильности пыльцы. Изменчивость проявляется в наличии стерильных, полустерильных, полуфертильных,
фертильных и высокофертильных типов растений (рис. 1). Сорт Пурпуровая
заметно выделяется среди изученных сортов по высокой эффективности получения матроморфных потомств (Батурин, 1997). Выполненность пыльцы у сорта варьирует в разные годы вегетации от 6.2 до 27.8%. Среднее значение этого
показателя за 6 лет наблюдения составило 17.6%. По шкале оценки фертильности пыльцы сорт определен как полуфертильный (рис. 2).
Среди 13 агамоспермных потомков (А1) выявлено 2 высокофертильных сеянца, что составило 15%, фертильных сеянцев – 4 (31%), полуфертильных –
3 (23%), полустерильных 3 (23%) и мужскостерильных – 1 сеянец (8%). Следует отметить, что фертильность пыльцы у 46% сеянцев была выше, чем у материнской формы, что создает возможности отбора по качеству пыльцы среди
агамоспермного потомства земляники крупноплодной. У мужскостерильного
образца Ю-547 в пыльниках фертильные пыльцевые зерна отсутствовали, то
есть были полностью дефектны. Причем, мужская стерильность стабильно проявлялась в течение всех 6 лет наблюдений, что свидетельствует о полной генетической супрессии развития фертильных пыльцевых зерен (табл. 1).
6
МС
8%
ВФ
15%
ПС
23%
Ф
31%
ПФ
23%
Рис. 1. Распределение фенотипов по качеству
пыльцы в агамоспермном потомстве первого
поколения полуфертильного сорта Пурпуровая
Рис. 2. Пыльцевые зерна полуфертильного
сорта Пурпуровая
Таблица 1
Фертильность пыльцы в агамоспермном потомстве сорта Пурпуровая
Образец
Фертильность пыльцы, %
Пурпуровая (контроль)
17.6±4.8
Ю-436
27.0±9.7*
Ю-541
3.9±1.7*
Ю-542
19.2±8.9
Ю-543
48.2±12.2*
Ю-545
19.6±8.6*
Ю-546
51.8±12.0*
Ю-547
0*
Ю-555
32.0±12.0*
Ю-561
63.0±6.7*
Ю-564
14.3±8.9*
Д-344
49.5±13.6*
96/5-13-2
2.4±1.4*
96/5-13-5
5.8±1.8*
Коэффициент вариации (V), %
66.8±19.3
88.0±25.4
104.0±30.0
113.6±32.8
50.8±18.0
107.1±30.9
40.1±16.4
74.9±26.5
21.4±7.6
152.7±44.1
61.3±19.4
115.9±41.0
61.2±21.6
Примечание: *различие с контролем достоверно при P>0.99 по u-критерию Фишера.
Значения коэффициента вариации (V) по фертильности пыльцы позволяют
нам рассматривать влияние погодных условий на экспрессию генетических систем, ответственных за формирования фертильных пыльцевых зерен у конкретного
агамоспермного потомка. Так, из 12 изученных потомков А1 лишь у 2 отмечено
варьирование значений фертильности пыльцы в пределах нормы, у 3 потомков –
значительное варьирование, у 1 – большое, у 2 – очень большое и у 4 – аномальное. По фертильности пыльцы большая часть агамоспермных потомков проявляют высокие значения коэффициента вариации, что свидетельствует о зависимости
успешного протекания микроспорогенеза от погодных условий.
При изучении фертильности пыльцы цветков различных порядков сорта
Пурпуровая и двух его агамоспермных потомков – фертильного Д-344 и полустерильного Ю-541 – в пределах одного соцветия выявлены различия, свиде7
тельствующие о снижении мужской стерильности с повышением порядка цветка. Максимальная жизнеспособность пыльцы установлена для цветков III порядка. Фертильность цветков IV порядка несколько ниже, чем в цветках III порядка, но она превосходит показатели цветков I и II порядков. Эта закономерность согласуется с результатами опытов W.D. Valleau (1918) и Н.М. Иркаевой
(1993) и подтверждает тенденцию к маскулинизации по мере повышения порядка цветков на соцветии. Явление маскулинизации терминальных цветков
соцветия земляники зависит от метеоусловий года и климатических особенностей региона (Darrow, 1966).
4.2. Агамоспермное потомство второго поколения
Сравнительное изучение агамоспермных потомков по морфологическим
признакам показало, что они не идентичны исходным образцам. Различия выявлены не только в сравнении с материнским образцом, но и в сравнении между собой. Таким образом, в агамоспермном потомстве второго поколения, также как и в агамоспермном потомстве первого поколения, наблюдается изменчивость, так как полного совпадения с материнским образцом по изучаемым
морфологическим признакам не выявлено ни у одного из обследованных агамоспермных потомков второго поколения.
Во втором агамоспермном поколении сорта Пурпуровая выявлена изменчивость по качеству пыльцы. От полустерильного образца Ю-541, фертильность
пыльцы которого варьирует от 0.0 до 16.1%, а в среднем составляет 4.7%, получено партеногенетическое потомство с хорошей мужской фертильностью (рис. 3).
100
90
80
70
60
2000 г.
2001 г.
2002 г.
2003 г.
%
50
40
30
20
контроль
4.7 %
10
98
/4
-5
23
98
/4
-5
25
98
/4
-5
31
98
/4
-5
32
98
/4
-5
33
98
/4
-5
34
98
/4
-5
35
98
/4
-5
36
98
/4
-6
13
98
/4
-6
15
98
/4
-7
65
98
/4
-7
66
0
образец
Рис. 3. Фертильность пыльцы у агамоспермных потомков второго поколения сорта Пурпуровая
8
Таким образом, агамоспермный способ семенной репродукции способствует фертилизации мужскостерильных и полустерильных форм. Выявленное в
эксперименте варьирование фертильности пыльцы по годам у одного и того же
потомка, свидетельствует о зависимости активности генетических систем, ответственных за формирование полноценного мужского гаметофита, от погодных условий.
4.3. Сравнительный анализ микроспорогенеза у агамоспермных потомков
сорта Пурпуровая
Изучение микроспорогенеза, проведенное у растений сорта Пурпуровая и
его потомков А1, показало, что процесс формирования дефектных пыльцевых
зерен у них протекает различно. Выявлены два пути образования дефектных
микроспор. В первом случае мейоз в пыльниках протекает нормально, включая
стадию формирования тетрад микроспор (рис. 4). Нарушения в формировании
мужского гаметофита становятся заметными после распада тетрад микроспор,
т.е. на стадии одноядерного пыльцевого зерна в период вакуолизации цитоплазмы. В этом случае ключевым периодом для формирования фертильной
пыльцы является период после распада тетрад микроспор, т.е. увеличения цитоплазмы, деления ядра и быстрого роста оболочек пыльцевого зерна (рис. 5).
15 мкм
Рис. 4. Тетрады микроспор полуфертильного
сорта Пурпуровая
Рис. 5. Дегенерация пыльцевых зёрен
Во втором случае наблюдаются нарушения в ходе мейоза при микроспорогенезе. Отклонения нормального течения мейоза выражаются в появлении унивалентов – отдельных сильно сокращенных хромосом в профазе I (лептотена –
пахитена), лежащих вне ассоциации хромосом. В дальнейшем в метафазе I они
располагаются беспорядочно по веретену деления. Вместо полноценной тетрады микроспор формируются различные варианты аномальных тетрад, диад,
монад. Причём, в аномальных тетрадах микроспоры разной величины. В последующем происходит образование микроспор разного размера – от мелких до
крупных (рис. 6). После распада тетрады микроспор, одноядерные пыльцевые
зерна деформируются, происходит лизис их содержимого (рис. 7).
9
10 мкм
10 мкм
Рис. 6. Аномальная тетрада мужскостерильного Рис. 7. Лизис микроспор у мужскостерильного
образца Ю-547
образца Ю-547
ГЛАВА 5. ПРОРАСТАНИЕ СЕМЯНОК У АГАМОСПЕРМНЫХ СЕЯНЦЕВ
СОРТА ПУРПУРОВАЯ
Результаты проращивания семянок, полученных при индукции партеногенеза
пыльцой Potentilla anserina и самоопылении, представлены в табл. 2. У образцов
Ю-545 и Ю-541, наблюдалось достоверно значимое снижение всхожести семянок
в варианте с использованием пыльцы P. anserina по сравнению с показателями
при самоопылении. То есть можно предположить, что при межродовой гибридизации семянки не прорастают вследствие постзиготической летальности гибридного зародыша (Ellis, 1962; Macfarlane, Jones, 1985; Marta et al., 2004).
Таблица 2
Показатели прорастания семянок у образцов земляники крупноплодной
сорта Пурпуровая при разных вариантах опыления (лабораторный опыт)
№
п/п
1
2
3
Комбинация
опыления
Д-344 × PA*
Д-344 S*
Ю-545 × PA
Ю-545 S
Ю-541 × PA
Ю-541 S
Семянки,
шт.
473
48
80
40
371
38
Проросшие семянки
шт.
%
308
65.1
42
87.5
12
15.0
36
90.0
54
14.6
29
76.3
χ2
1.7
24.0
38.6
Примечание: *PA – Potentilla anserina, *S – самоопыление, χ20.05 = 3.84.
Результаты сравнения частоты гибели проростков при различных вариантах
опыления подтвердили это предположение (табл. 3). Как при чужеродном опылении, так и при самоопылении, доля погибших проростков существенно не
различалась, из чего следует, что причина летальности проростков не в гибридном (межродовом) происхождении, а в проявлении генетических факторов, вызывающих их гибель.
10
Таблица 3
Летальность проростков при проращивании семянок у образцов земляники
крупноплодной сорта Пурпуровая при разных вариантах опыления
№
п/п
1
2
3
Комбинация
опыления
Д-344 × PA*
Д-344 S*
Ю-545 × PA
Ю-545 S
Ю-541 × PA
Ю-541 S
Семянки,
шт.
473
48
80
40
371
38
Погибшие проростки
шт.
%
206
43.5
26
54.2
9
11.3
9
22.5
48
12.9
4
10.5
χ2
0.72
1.90
0.14
У всех трех изученных образцов F. × ananassa наименьшей всхожестью характеризовались семянки, полученные при чужеродном опылении (агамоспермное происхождение семянок) (рис. 8). Их конечная всхожесть для образцов
Ю-545, Ю-541 и Д-344 составила соответственно 11.3, 12.7 и 62.6%. У семянок,
полученных при инбридинге и аутбридинге, всхожесть была значительно выше,
а динамика прорастания имела общий характер. Тем не менее, обнаруженные
различия в энергии прорастания у семянок, полученных при инбридинге и аутбридинге, оказались существенными.
Рис. 8. Динамика прорастания семянок образцов Ю-545 (А), Ю-541
(Б) и Д-344 (В) земляники крупноплодной сорта Пурпуровая, полученных при разных способах
опыления: 1, 6 и 8 – самоопыление; 4, 7 и 10 – скрещивание с
P. anserina (чужеродное); 2, 5 и 9 –
скрещивание с линией Л-1-17-2;
3 – контроль (сорт Пурпуровая,
открытое опыление)
11
Сеянцы агамоспермного происхождения, полученные от сорта Пурпуровая, при половом процессе (аутбридинг и инбридинг) формировали семянки со
всхожестью не ниже 73.0%, в то время как у сорта Пурпуровая всхожесть семянок составила лишь 17.9%. Возможно, улучшенная всхожесть семянок у
агамоспермных образцов обусловлена гомозиготизацией генотипа материнского сорта. При этом семянки с набором генетических комплексов, вызывающих гибель зародыша, не прорастают, а если и прорастают, то проростки
вскоре погибают, что и было показано в нашем эксперименте. Сеянцы партеногенетического происхождения, которые выжили, по характеру своей семенной репродукции близки к чистым линиям. Таким образом, однократная реконструкция генотипа сорта посредством агамоспермии, позволяет существенно увеличить эффективность семенного размножения партеногенетических
потомков, что открывает перспективы для использования их в новом селекционном направлении – создании сортов земляники крупноплодной с ремонтантным типом плодоношения, размножаемой семенами (Bentvelsen, 1997).
ГЛАВА 6. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
НЕРЕДУЦИРОВАННОГО ПАРТЕНОГЕНЕЗА В СЕЛЕКЦИИ
ЗЕМЛЯНИКИ КРУПНОПЛОДНОЙ
Получение сеянцев с генотипом, близким материнскому, может быть реализовано только при агамоспермном размножении (Bauer, 1961; Шангин-Березовский, 1962; Батурин, 1997). Агамоспермный способ формирования семян
способствует устранению признаков возрастной депрессии, накапливающейся
при длительном вегетативном размножении благодаря периоду покоя семян и
репарационным процессам, протекающим при мегаспорогенезе (Richards, 1986;
Батурин, 1997), а также существенно упрощает и сокращает селекционный
процесс. Этому же способствуют отселектированность генотипа исходного
сорта и ограниченность генотипической изменчивости (Батурин, Сухарева,
1995; Батурин, 1997).
В гибридизацию в качестве материнских форм были включены два матроморфных образца сорта Пурпуровая: Д-344 – фертильный клон (средняя фертильность пыльцы 49.5%), Ю-541 – полустерильный клон (средняя фертильность пыльцы 3.9%), которые выделяются по селекционно-значимым характеристикам, а также полуфертильный сорт Пурпуровая – контроль (средняя фертильность 17.6%). В качестве отцовской формы использовали высокофертильный сорт иностранной селекции Bounty (фертильность пыльцы 76.3%), который
является донором приятного вкуса, высокой товарности плодов.
Использование агамоспермных сеянцев в контролируемых скрещиваниях
оказалось вполне успешным. Во всех вариантах опыления завязываемость семянок была выше 20%, что характеризует совместимость компонентов скрещиваний, и составила 31.7 и 45.9% у Ю-541 и Д-344, соответственно. Наиболее
дружное прорастание семянок отмечено в комбинациях Пурпуровая × Bounty
(70.0%), Д-344 × Bounty (61.5%).
Всего в результате гибридизации получено 1392 гибридных сеянца (F1),
12
которые в дальнейшем были подвергнуты оценке на наличие ценных признаков. Для всех сеянцев характерна хорошая зимостойкость. У сеянцев комбинации Ю-541 × Bounty в целом отмечается меньшая подмерзаемость (табл. 4).
Таблица 4
Зимостойкость гибридных сеянцев Fragaria × ananassa (2004-2007 гг.)
Происхождение
гибридов
Пурпуровая × Bounty
Д-344 × Bounty
Ю-541 × Bounty
Учетных
растений, шт.
19
19
15
Подмерзание,
баллы
1.3±0.2
1.7±0.2*
1.3±0.2*
Сеянцев без подмерзания (0-1 балл), %
64
49
60
Примечание. *Средняя арифметическая достоверна при P < 0.001 по t-критерию
Стьюдента.
Изучение пыльцы у гибридов показало наличие ее изменчивости по качеству (рис. 9). При использовании в гибридизации полустерильного клона Ю541 получено мужскостерильное потомство и потомство с хорошей мужской
фертильностью. Гибридизация с использованием фертильного клона Д-344
позволяет существенно снизить в F1 появление мужскостерильных сеянцев,
сокращая объем селекционной работы и повышая шансы выделения в гибридном потомстве сеянца – кандидата в новый сорт. При этом помимо улучшения качества пыльцы создается возможность передачи гибридам ценных
свойств сорта Пурпуровая (зимостойкость, устойчивость к земляничному
клещу и грибным заболеваниям).
Рис. 9. Распределение сеянцев по качеству пыльцы в гибридных семьях:
a) 2002 г., б) 2003 г.
Наблюдаемые различия в качестве пыльцы у одних и тех же гибридов свидетельствуют о влиянии погодных условий на активность генетических систем,
контролирующих этапы формирования пыльцы.
Для оценки полученных сеянцев по самоплодности был проведен анализ
13
завязываемости плодов. Наибольшее количество сеянцев с высокой самоплодностью (завязываемость плодов от 66.9 до 100%) отмечено в комбинации Д-344 × Bounty (59.7%). В этой же комбинации отмечено не значительное по сравнению с контролем (11.0%) количество самобесплодных сеянцев –
2.6%. В комбинации Ю-541 × Bounty наблюдается аналогичная тенденция.
Сеянцев с высокой самоплодностью – 43.5%, а самобесплодных сеянцев –
9.8%. Следует отметить, что в этой комбинации зарегистрировано наибольшее количество сеянцев со средней самоплодностью – 39.0% (завязываемость плодов варьирует от 16.8 до 66.8%).
Использование в гибридизации агамоспермных потомков полуфертильного
сорта Пурпуровая – Ю-541 и Д-344 – оказалось успешным и позволило выделить в гибридных потомствах сеянцы с хорошей мужской фертильностью и самоплодностью. Высокофертильные и продуктивные гибриды: 00/2-39-6, 00/250-6, 00/2-65-6 (получены от скрещивания Д-344 × Bounty) и 00/2-4-6, 00/2-8-4,
00/2-8-6, 00/2-19-3 (получены от скрещивания Пурпуровая × Bounty) переданы
для эколого-селекционной оценки на Новосибирскую зональную станцию садоводства РАСХН (Федеральное государственное унитарное предприятие,
г. Бердск) и в НИИ им. М.А. Лисавенко СО РАСХН (г. Барнаул).
Таким образом, использование в гибридизации сеянцев агамоспермного
происхождения с улучшенным качеством пыльцы позволяет оптимизировать
селекционный процесс в результате снижения в гибридном потомстве количества самобесплодных сеянцев и увеличения числа сеянцев с высокой мужской фертильностью. Кроме того, агамоспермные сеянцы, имеющие ценные
свойства исходной материнской формы, могут быть успешно использованы в
гибридизации в качестве опылителя благодаря улучшенной фертильности
пыльцы.
ВЫВОДЫ
1. Индукция нередуцированного партеногенеза способствует формообразованию у Fragaria × ananassa. Сравнительный анализ агамоспермных потомков
с материнскими формами выявил изменчивость по морфологическим и репродуктивным признакам.
2. Среди агамоспермных сеянцев первого поколения полуфертильного сорта Пурпуровая выявлена изменчивость по качеству пыльцы, которая проявляется в наличии стерильных, полустерильных, полуфертильных, фертильных и высокофертильных типов. При этом выделены высокофертильные и полностью
стерильные сеянцы.
3. Во втором агамоспермном поколении сорта Пурпуровая также выявлена изменчивость по качеству пыльцы, которая позволяет выделять сеянцы с
хорошей мужской фертильностью. Таким образом, агамоспермный способ
семенной репродукции способствует фертилизации мужскостерильных и полустерильных форм.
4. Наблюдаемые различия в качестве пыльцы у одних и тех же гибридов
в разные годы вегетации свидетельствуют о влиянии погодных условий
14
на активность генетических систем, контролирующих этапы формирования
пыльцы.
5. Фертильные и высокофертильные матроморфные сеянцы, имеющие ценные свойства исходной материнской формы, можно успешно использовать в
селекции в качестве опылителей, что позволяет увеличить в гибридном потомстве долю сеянцев с высоким качеством пыльцы.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Батурин С.О., Сухарева Н.Б., Амброс Е.В. Апомиктическое размножение в
формировании биоразнообразия растений // Биологическое разнообразие.
Интродукция растений / Матер. 2-й Межд. науч. конф. СПб., 1999. С. 29-30.
2. Ваturin S.О., Аmbrоs Е.V. Тhe use of intergeneric crosses in strawberry breeding
// Inter. meeting of young scientists in horticulture / Mater. of the 7th Inter. Conf.
Lednice. Czech Republic, 1999. Р. 13-17.
3. Ваturin S.O., Sukhareva N.B., Trajkovski K., Аmbrоs Е.V. Тhe rоlе оf 2п
gametes in Fragaria biodiversity formation and storing // Вiodiversity and
dynamics of ecosystems in North Eurasia / Mater. of the Inter. Conf. Novosibirsk,
Russia. 2000. V. 2. Р. 32-34.
4. Амброс Е.В. Возможности использования межродовых гибридов Fragaria ×
Роtentilla в интродукции и селекции // Тез. VII молод. конф. ботаников в
Санкт-Петербурге. СПб., 2000. С. 213-214.
5. Амброс Е.В. Мужская стерильность у Fragaria × ananassa Duch. при апомиксисе // Тез. докл. II съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. СПб., 2000. Т. 1. С 138.
6. Амброс Е.В. Генотипическая изменчивость в апомиктическом потомстве
Fragaria × ananassa Duch. // Исследования молодых ботаников Сибири /
Сборник докл. молод. конф. Новосибирск, 2001. С. 86-93.
7. Аmbros Е.V., Ваturin S.O. Using of apomixis for manipulation of garden
strawberry pollen quality // Mater. of the 9th Inter. conf. of horticulture. Lednice,
2001. V. 1. Р. 8-14.
8. Аmbros E.V. Is apomixis in Fragaria really the “asexual reproduction through
seeds”? // 2nd Inter. apomixes conf. APO2001. Соmо, 2001. Р. 136.
9. Амброс Е.В. Использование индуцированного партеногенеза в селекции
крупноплодной земляники // Вестник Омского гос. аграр. ун-та. 2003. Т. 2.
С. 4-7.
10. Аmbros Е. Роllen sterility in Fragaria × апапаssа // Вiologia. Вratislava, 2003.
V. 58. № 1. Р. 103-107.
11. Амброс Е.В. Использование индуцированного партеногенеза для улучшения
мужской фертильности крупноплодной земляники // Актуальные проблемы
генетики / Матер. 2-й конф. Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. М., 2003. Т. 1. С. 10-11.
12. Амброс Е.В., Батурин С.О. Генотипическая изменчивость по качеству пыльцы в агамоспермном потомстве Fragaria × ananassa Duch. // Биология разви15
тия: морфогенез репродуктивных структур и роль соматических, стволовых
клеток в онтогенезе и эволюции / Матер. межд. конф. СПб., 2010. С. 14-16.
13. Амброс Е.В. Возможности использования агамоспермии для увеличения генотипического разнообразия по качеству пыльцы у Fragaria × ananassa
Duch. // Труды Томского государственного университета. Сер. биологическая: Ботанические сады. Проблема интродукции. 2010. Т. 274. С. 43-47.
14. Амброс Е.В., Батурин С.О. Перспективы использования сеянцев агамоспермного происхождения в селекции крупноплодной земляники (Fragaria ×
ananassa Duch.) // Сиб. вестник с.-х. науки. 2010. № 9. С. 36-42. (Реценз.)
15. Батурин С.О., Амброс Е.В. Особенности прорастания семян агамоспермных
потомков Fragaria × ananassa Duch. при различных способах семенной репродукции // Сельхоз. биология. 2010. № 5. С. 87-91. (Реценз.)
16. Батурин С.О., Амброс Е.В. Изменчивость в агамоспермном потомстве крупноплодной земляники (Fragaria × ananassa Duch.) по фертильности пыльцы
// Научные ведомости БелГУ. 2011. Вып. 15/1. № 9 (104). С. 204-209.
(Реценз.)
17. Амброс Е.В., Новикова Т.И. Перспективы использования межродовых гибридов Fragaria ananassa × Potentilla nepalensis в интродукции и селекции //
Вестник ИрГСХА. 2011. Вып. 44. №4. С. 7-13. (Реценз.)
16