In vitro
реклама
ИНСТИТУТ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ АГРАРНЫХ НАУК УКРАИНЫ На правах рукописи УДК 581.1: 633.854.78: 633.854.54 СОРОКА АНАТОЛИЙ ИВАНОВИЧ РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОСНОВ СОЗДАНИЯ СЕЛЕКЦИОННО-ЦЕННОГО МАТЕРИАЛА МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР 03.00.20 – биотехнология Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант: Лях Виктор Алексеевич, доктор биологических наук, профессор Запорожье – 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ стр. СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ........................................................ 7 ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................... 8 РАЗДЕЛ 1 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ ДЛЯ УСКОРЕНИЯ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА И РАСШИРЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У КУЛЬТУРНЫХ И ДИКОРАСТУЩИХ РАСТЕНИЙ ..................................................................... 20 1.1. Эмбриокультура и пути ее использования......................................... 20 1.1.1. Эмбриокультура при межвидовой и межродовой гибридизации ................................................................................................ 21 1.1.2. Эмбриокультура для получения дополнительных поколений и доращивания незрелых семян .................................................................. 28 1.1.3. Другие пути использования эмбриокультуры ........................ 29 1.2. Получение гаплоидов у разных видов растений ............................... 31 1.2.1. Получение гаплоидов у масличных культур........................... 34 1.2.2. Получение гаплоидов у видов рода Linum .............................. 38 1.3. Расширение генетической изменчивости с использованием технологий in vitro ....................................................................................... 39 1.3.1. Разработка систем каллусогенеза у масличных культур ....... 39 1.3.2. Изменчивость в культуре in vitro как путь получения новых генотипов растений ...................................................................................... 41 1.3.3. Разработка методов оценки и отбора in vitro на устойчивость 3 к различным факторам................................................................................. 48 1.3.4. Сочетание методов in vitro и мутагенеза для расширения генетической изменчивости ........................................................................ 49 РАЗДЕЛ 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................... 53 2.1. Условия проведения исследований..................................................... 53 2.2. Материал ................................................................................................ 54 2.3. Методика проведения исследований .................................................. 56 РАЗДЕЛ 3 ЭФФЕКТИВНОСТЬ КАЛЛУСОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ЭКСПЛАНТОВ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР.................................................... 69 3.1. Влияние типа экспланта и генотипа на образование каллуса у подсолнечника.............................................................................................. 69 3.2. Каллусообразование у некоторых однолетних видов льна .............. 83 РАЗДЕЛ 4 РАЗРАБОТКА МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ И УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО .. 91 4.1. Особенности подготовки материала и питательных сред для получения гаплоидов из пыльников льна.................................................. 93 4.2. Влияние температурной обработки пыльников и сроков их культивирования на индукцию каллусообразования............................... 97 4.3. Роль генотипа при образовании каллуса из пыльников льна......... 100 4.4. Влияние состава питательной среды на процессы каллусогенеза и органогенеза................................................................................................ 104 4 4.5. Влияние состава питательной среды на удлинение и укоренение побегов льна................................................................................................ 116 4.6. Исследования плоидности при получении удвоенных гаплоидов у льна .............................................................................................................. 121 4.6.1. Способ установления гаплоидной природы растений, полученных через культуру пыльников................................................... 121 4.6.2. Цитологический анализ числа хромосом у регенерированных растений льна.............................................................................................. 127 РАЗДЕЛ 5 РАСШИРЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ IN VITRO ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ И УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ РАПСА И ГОРЧИЦЫ......................................................................................................... 131 5.1. Подбор питательных сред для индукции новообразований в культуре пыльников рапса и горчицы ..................................................... 132 5.2. Действие температурного фактора на индукцию новообразований в культуре пыльников рапса ........................................................................ 141 5.3. Особенности развития женской генеративной сферы рапса и индукции новообразований в культуре семенных зачатков ................. 145 5.3.1. Связь между размером бутонов и семязачатков у рапса ..... 145 5.3.2. Влияние температурной обработки бутонов рапса на способность к индукции новообразований в культуре семенных зачатков........................................................................................................ 147 5.4. Идентификация гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса, полученных через культуру пыльников (цитологические и морфологические исследования).............................................................. 150 5 РАЗДЕЛ 6 ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА 165 6.1. Влияние возраста зародышей подсолнечника на частоту полученных из них растений в культуре in vitro .................................... 166 6.2. Проявление некоторых морфологических признаков у растений, полученных из зародышей разного возраста .......................................... 170 6.3. Эффективность метода незрелых зародышей в зависимости от генотипа экспланта .................................................................................... 174 РАЗДЕЛ 7 СОЧЕТАНИЕ МЕТОДОВ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ IN VITRO И ХИМИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА КАК ПУТЬ УВЕЛИЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА..................... 179 7.1. Выживаемость растений, полученных после обработки этилметансульфонатом зародышей подсолнечника разного уровня развития....................................................................................................... 184 7.2. Влияние обработки незрелых зародышей разного возраста и зрелых семян самоопыленных линий подсолнечника этилметансульфонатом на спектр наследуемых изменений ............................................................... 191 7.3. Частота наследуемых изменений при обработке незрелых зародышей и зрелых семян самоопыленных линий подсолнечника этилметансульфонатом.............................................................................. 208 7.3.1. Оценка мутантных линий методом электрофореза запасных белков семян ............................................................................................... 216 6 7.4. Наследование некоторых признаков у мутантных образцов подсолнечника, полученных с использованием эмбриокультуры и химического мутагенеза ............................................................................ 220 РАЗДЕЛ 8 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................... 235 ВЫВОДЫ .......................................................................................................... 247 РЕКОМЕНДАЦИИ .......................................................................................... 252 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ........................................ 254 ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................ 294 Приложение А. Таблицы экспериментальных данных.......................... 295 Приложение Б. Акты внедрения, патенты, свидетельства .................... 304 7 СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 2,4-Д 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота БАП 6-бензиламинопурин ГК3 гибберелловая кислота ИМК индолилмасляная кислота ИУК индолил-3-уксусная кислота КФ культуральный фильтрат МС питательная среда Мурасиге-Скуга НУК -нафтилуксусная кислота ПЦР полимеразная цепная реакция ЭМС этилметансульфонат ЯМР ядерный магнитный резонанс В-5 питательная среда Гамборга-Эвелега LMA-1 питательная среда Полякова-Пролетовой N6 питательная среда по Chu (1978) NLN-13 питательная среда Лихтера RAPD random ampliphied polymorphic DNA WPM питательная среда Ллойда-Мак-Коуна 8 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Ограниченность зародышевой плазмы, также как и значительная длительность селекционного процесса, являются до сих пор серьезными нерешенными проблемами на пути создания современных сортов и гибридов большинства масличных культур. В их решении биотехнология может сыграть определяющую роль, тем более, что ряд биотехнологических методов и приемов уже успешно апробирован на других культурах [45, 77, 204]. Масличные культуры занимают в мире значительные площади (около 100 млн. га), являясь одними из самых высокорентабельных и востребованных культур. Такая же закономерность справедлива и для Украины, в которой под этими культурами занято более 6 млн. га. Кроме Украины, странами, в которых сосредоточены основные площади возделывания масличных культур, являются Российская Федерация, США, Канада, Индия, Бразилия, Аргентина, Китай. Высокая проведение современных потребность в масличных широкомасштабных высокоурожайных культурах селекционных сортов и работ обусловливает по созданию гибридов, хорошо приспособленных к варьирующим условиям среды. Однако, эффективность селекционного процесса ограничивается целым рядом факторов, среди которых наиболее важными являются отсутствие доступной зародышевой плазмы и длительное получение константных образцов. В решении вопросов расширения имеющейся генетической базы сельскохозяйственных культур и ускоренного получения гомозиготного материала существенный вклад могут внести биотехнологические методы. Ряд биотехнологических приемов, таких, например, как эмбриокультура или экспериментальная гаплоидия, уже успешно используются в селекции некоторых культивируемых растений. Вместе с тем для многих масличных 9 культур, включая подсолнечник, лен, биотехнологические методы разработаны еще недостаточно. В силу этого усовершенствование либо разработка новых биотехнологических приемов, направленных на повышение эффективности селекции, применительно к масличным культурам, является актуальной задачей. Основной масличной культурой в Украине является подсолнечник, занимающий в последние годы площадь более 3,5 млн. га. Известно, что подсолнечник имеет довольно узкую генетическую базу, не позволяющую вести его эффективную селекцию [15, 40, 71]. Поэтому разработка любых приемов, в том числе с использованием биотехнологических методов, способствующих расширению генетической изменчивости этой культуры, является крайне необходимой и важной задачей. Подобные задачи успешно решаются с использованием биотехнологических приемов на других культурах [45, 153, 177, 243]. Для такой важной масличной культуры как подсолнечник биотехнологические подходы могут найти успешное применение и в других аспектах. Так, например, длительный период его вегетации не позволяет использовать несколько поколений в течение одного года и, таким образом, вести ускоренную селекцию. В то же время использование такого биотехнологического метода как культура зародышей дает возможность увеличить число поколений, что обеспечивает более быстрое создание нового селекционного материала. Несмотря на то, что для многих видов растений эмбриокультура является широко распространенным приемом [160], у подсолнечника до сих пор остаются вопросы, которые не решены или требуют доработки этого метода. В частности, не достаточно исследован вопрос влияния возраста зародышей на различные характеристики получаемых из них растений, например, число дней до начала цветения, высоту растений и другие. Также еще недостаточно разработаны вопросы каллусогенеза и 10 регенерации из каллусной культуры подсолнечника, что необходимо для получения новых генетических форм. Еще одной важной масличной культурой является лен масличный, площади под которым составляют в мире 7,5 млн. га и с каждым годом расширяются. С целью ускорения необходимо наличие константного генетического селекционного значительного материала. количества Таким процесса льна разнообразного биотехнологическим приемом, обеспечивающим желаемое разнообразие и гомогенность, может быть культура пыльников. Вместе с тем, несмотря на усилия ряда исследователей [144, 163, 257], многие вопросы получения удвоенных гаплоидов через культуру пыльников у льна масличного до сих пор остаются не выясненными. А вопросы ввода в культуру in vitro эксплантов диких видов льна практически не освещены в научной литературе. Для культур семейства Brassicaceae такой биотехнологический прием как культура пыльников и микроспор уже давно и успешно используется для получения константного генетического материала [60, 118, 175]. В то же время известно, что на процесс индукции гаплоидных новообразований и регенерации из них растений влияют многие факторы и, в первую очередь, состав питательной среды [23, 162, 182]. В связи с этим представляет интерес выяснение закономерностей индукции новообразований различного типа в зависимости от вида фитогормонов и их соотношения в питательной среде у таких крестоцветных культур как рапс масличный и горчица. Растения, получаемые через культуру пыльников, могут быть представлены как гаплоидами, так и удвоенными гаплоидами. В силу этого стоит проблема их своевременной идентификации, что часто затруднительно сделать визуально. И для рапса в настоящее время приемы такой идентификации еще недостаточно цитологический и морфологический уровни. разработаны, включая 11 При получении удвоенных гаплоидов в культуре пыльников, независимо от изучаемого объекта, важно знать плоидность клеток, являющихся источником их происхождения. Появляющиеся на пыльниках новообразования, либо в виде каллуса, либо в виде эмбриоидов, могут образовываться как из гаметофитной ткани, так и из спорофитной. Новообразования, полученные из спорофитной ткани, не представляют практического интереса, поскольку повторяют генетические свойства исходного родителя. При получении регенерантов в культуре пыльников важны растения, ведущие происхождение от гаплоидных структур (микроспор), поскольку именно они являются генетически уникальными и в случае удвоения набора хромосом обладают полной гомозиготностью. Ограниченность подходов, позволяющих определять плоидность клеток, являющихся источниками растений-регенерантов в культуре пыльников, предполагает поиск новых путей решения этого вопроса. Таким образом, обеспечение успеха в селекции масличных культур в значительной степени может быть достигнуто за счет разработки новых биотехнологических методов и усовершенствования уже имеющихся, что определяет целесообразность и актуальность данной работы. Связь с научными программами. Научные исследования по теме диссертации выполнены лично автором в секторе биотехнологии Института масличных культур Национальной академии аграрных наук Украины (ИМК НААН) за период 1996-2000 гг. согласно НТП ”Теоретичнi основи селекції та насінництва сільськогосподарських культур” и заданий тематического плана на 1996-2000 гг. 02.02.07 ”Розробити методи використання ембріокультури з метою залучення до селекційного процесу соняшника зародкової плазми 01950006480); за диких видiв” (№ период 2001-2005 ”Сільськогосподарська біотехнологія государственной гг. в регистрации соответствии 2001-2005 рр.” и с НТП заданиями тематического плана на 2001-2005 гг. 1.1 ”Створення цінного селекційного 12 матеріалу сільськогосподарських рослин з використанням культури in vitro” (№ государственной регистрации 0101U003991); за период 2006-2010 гг. в соответствии с НТП ”Сільськогосподарська біотехнологія 2006-2010 рр.” и заданиями тематического плана на 2006-2010 гг. 02.01.03.01 ”Розширення генетичної мінливості у олійних культур за допомогою біотехнологій in vitro” (№ государственной регистрации 0106U006467) ), а также за 20112013 гг. в соответствии с НТП №23 ”Розвиток сучасних біотехнологій і підвищення ефективності методів поліпшення господарсько корисних ознак рослин, тварин і мікроорганізмів” (”Сільськогосподарська біотехнологія”) и заданием тематического плана на 2011-2013 гг. ”Особливості одержання гаплоїдних рослин ріпака на базі експериментальної гаплоїдії” (№ государственной регистрации 0111U006017). Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка новых биотехнологий и усовершенствование традиционных приемов и способов культивирования in vitro органов и тканей для использования в сельском хозяйстве, в частности, для расширения генетической изменчивости и ускорения селекционного процесса масличных культур. Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи: – установить особенности каллусогенеза в зависимости от типа экспланта и генотипа у подсолнечника и ряда однолетних видов льна; – определить влияние возраста зародышей подсолнечника при их культивировании in vitro на частоту полученных из них растений и экспрессию некоторых морфологических признаков; – выявить эффективность метода культуры незрелых зародышей в зависимости от генотипа у подсолнечника; – установить режимы и условия культивирования пыльников льна масличного для получения гаплоидов и удвоенных гаплоидов; 13 – выяснить закономерности индукции новообразований различного типа в зависимости от класса фитогормонов и их соотношения в питательной среде у рапса и горчицы; – изучить цитологические и морфологические особенности гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса с целью их дифференциации; – разработать методику доказательства гаплоидной природы растений, полученных в культуре пыльников in vitro на основе расщепления по маркерным признакам; – выявить степень выживаемости растений, полученных после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей подсолнечника разного возраста; – разработать метод расширения спектра генетической изменчивости у подсолнечника на основе обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей, а также выявить эффективность данного приема в сравнении с обработкой зрелых семян. Объект исследований: биотехнологические методы и приемы, обеспечивающие ускорение селекционного процесса и расширение генетической изменчивости масличных культур. Предмет исследований: морфогенез в культуре эксплантов разного типа у подсолнечника и льна; эффективность метода культуры незрелых зародышей подсолнечника; характерные свойства культуры пыльников льна масличного, рапса и горчицы; цитологические и морфологические параметры дифференциации гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса; определение происхождения растений, полученных методом андрогенеза; особенности культивирования обработанных мутагеном незрелых зародышей подсолнечника и их влияние на генетическую изменчивость признаков. Методы исследований: культура клеток, тканей и органов для изучения процессов морфогенеза и каллусогенеза, культура незрелых 14 зародышей подсолнечника для установления эффективности данного метода, культура пыльников для получения андрогенных новообразований и удвоенных гаплоидов льна масличного, рапса и горчицы, химический мутагенез в культуре незрелых зародышей подсолнечника для получения индуцированных изменений, методы учета и выделения мутаций для установления их частоты и спектра, цитологические методы для оценки плоидности растительного материала, метод гибридологического анализа для установления расщепления растений-регенерантов, световая микроскопия для анализа микроскопических объектов, электрофорез запасных белков семян, статистические методы для анализа и оценки достоверности полученных результатов. Научная новизна полученных результатов. Впервые с целью расширения генетического разнообразия исходного материала подсолнечника разработан метод, в основе которого лежит обработка незрелых зародышей химическим мутагеном. Доказано, что использование данного метода приводило к появлению более высокой частоты мутаций, чем при обработке зрелых семян. Показано, что обработка мутагеном незрелых зародышей подсолнечника была, в зависимости от генотипа, в два-три раза эффективнее стандартной технологии. Установлено, что спектр мутаций в значительной степени зависит от возраста незрелых зародышей. Получены новые данные о зависимости каллусообразования от типа экспланта для дикорастущих видов льна. Установлено, что в отличие от культурного льна меристемы однолетних дикорастущих видов Linum angustifolium Huds., L.grandiflorum Desf., L.hispanicum Mill. и L.pubescens Banks & Solander были наименее пригодными для получения максимального количества каллуса. Показано, что с наибольшей частотой каллус образовывался у L.angustifolium Huds. и L.grandiflorum Desf. на 15 эксплантатах гипокотилей, а у L.hispanicum Mill. и L.pubescens Banks & Solander – семядолей. Впервые показано, что фитогормон 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 2-4 мг/л стимулирует в каллусной культуре льна масличного процессы гемогенеза, а в концентрации 4-6 мг/л – ингибирует пролиферацию каллуса. Установлены набор и концентрации фитогормонов, а также органических и неорганических добавок для эффективного удлинения и укоренения побегов льна в культуре in vitro, что позволило усовершенствовать технологию получения удвоенных гаплоидов льна масличного через культуру пыльников. Впервые в культуре пыльников рапса и горчицы установлена значительная роль фитогормона ауксиновой природы 2,4-Д в индукции новообразований как гаметофитного, так и спорофитного типов. Показано, что наличие в среде одного БАП тормозит формирование структур спорофитного типа на пыльниках. Получены новые данные о дифференциации гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса с использованием непрямых методов анализа. Выявлено, что параметрами цитологических отличий служат количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размер замыкающих клеток устьиц и количество устьиц на единицу площади, а морфологических – размер элементов цветка. Впервые разработан способ определения происхождения растенийрегенерантов в культуре in vitro, в котором для доказательства гаплоидной природы растений, полученных в культуре пыльников in vitro, используется анализ наличия или отсутствия в популяции расщепления по морфологическим маркерным признакам. Впервые установлено, что возраст зародышей подсолнечника при их культивировании в искусственных условиях влияет на некоторые морфологические и физиологические признаки полученных из них 16 растений. Показано, что с уменьшением возраста зародышей высота растений уменьшается и быстрее наступает цветение, что важно для более раннего проведения гибридизации. Научная новизна работы подтверждена тремя патентами на изобретение. Практическое значение полученных результатов. Разработан метод, основанный на обработке незрелых зародышей химическим мутагеном этилметансульфонатом с последующим их культивированием in vitro, который может быть использован для получения генетического разнообразия исходного материала у подсолнечника. Полученные в результате разработки данного метода мутантные образцы могут быть рекомендованы для включения их в селекционный процесс подсолнечника в качестве источников хозяйственно-ценных или маркерных признаков. Рекомендовано для увеличения количества дополнительных поколений у подсолнечника получать растения из зародышей, начиная с их однонедельного возраста, принимая во внимание способность таких зародышей формировать полноценные растения. Предложено для получения активно пролиферирующей каллусной культуры подсолнечника включать в состав питательной среды фитогормоны БАП и НУК, а в качестве эксплантов использовать гипокотили, а не меристемные зоны или семядоли. Рекомендовано для получения каллусной культуры льна масличного в качестве эксплантов использовать как семядоли, так и апикальные меристемы, тогда как для однолетних дикорастущих видов льна L.angustifolium Huds. и L.grandiflorum Desf. более предпочтительно использование эксплантов гипокотилей, а для L.hispanicum Mill. и L.pubescens Banks & Solander – семядолей. Предложено с целью получения гомогенного линейного материала льна масличного через культуру пыльников для индукции гемогенеза из 17 каллусной ткани добавлять в питательную среду цитокинин БАП в концентрации 2 мг/л, а для удлинения регенерированных побегов использовать в комплексе набор фитогормонов (БАП, α-НУК и ГК) и аминокислот (аспарагин, глутамин и серин). Рекомендовано для дифференциации гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса использовать и непрямые методы анализа, исследуя такие цитологические и морфологические характеристики как количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размер замыкающих клеток устьиц, количество устьиц на единицу площади, а также размер элементов цветка. Разработан способ выявления плоидности клеток – источников растений-регенерантов, который предлагается для доказательства гаплоидной природы образцов, полученных в культуре пыльников in vitro. Полученные в результате исследований 522 линии удвоенных гаплоидов льна и рапса, 5 мутантных образцов подсолнечника и 104 образца подсолнечника, созданные методом культуры зародышей, а также 150 растений подсолнечника из мутантной популяции М2 переданы в селекционные подразделения Института масличных культур НААН. Десять мутантных образцов подсолнечника переданы на кафедру садово-паркового хозяйства и генетики растений Запорожского национального университета. Семь образцов подсолнечника, полученных с использованием мутагенной обработки незрелых зародышей, передано в Национальный центр генетических ресурсов Украины (г. Харьков) и на два из них получены свидетельства. Личный вклад соискателя. Соискателем лично проведены все представленные в диссертации лабораторные и полевые исследования, анализ и статистическая обработка полученных результатов, обобщение результатов исследований и формулирование выводов. Вклад соискателя по монографии «Ботанические и цитогенетические особенности видов рода 18 Linum L. и биотехнологические пути работы с ними», опубликованной в соавторстве с д.б.н. В.А. Ляхом, в части биотехнологических исследований состоит в получении экспериментальных данных и обобщении результатов исследований и составляет 100%. В совместной с д.б.н. В.А. Ляхом и к.б.н. И.А. Поляковой монографии «Индуцированный мутагенез масличных культур» соискателем полностью подготовлен раздел по использованию индуцированного мутагенеза в культуре незрелых зародышей Основные положения подсолнечника. Апробация результатов диссертации. диссертации представлены и обговорены на заседаниях ученого совета и методической комиссии Института масличных культур НААН Украины (г. Запорожье, 1996-2012 гг.), на международной конференции ”Современные вопросы создания и использования сортов и гибридов масличных культур” (Запорожье, 2002), на I Всеукраинской научнопрактической конференции „Біотехнологія. Освіта. Наука.” (Киев, 2003), на I международном впровадження конгрессе „Національна інноваційно-інвестиційних перлина технологій Запорожжя: гармонiзацiї бiоекосистеми о. Велика Хортиця” (Запорожье, 2004), на международной научной конференции „Проблеми збереження, відновлення та збагачення біорізноманітності в умовах антропогенно зміненого середовища” (Кривой Рог, 2005), на "Современные международной проблемы научно-практической научного обеспечения конференции производства подсолнечника" (Краснодар, 2006), на Всеукраинской научно-практической конференции „Проблеми та перспективні напрями розвитку олійних культур в Україні” (Запорожье, 2007), на 4-й международной конференции молодых ученых и специалистов (Краснодар, 2007), на международной конференции „Сучасні проблеми біології, екології та хімії” (Запоріжжя, 2007), на IV международной научно-практической конференции „Біотехнологія. Наука. Освіта. Практика.” (Днепропетровск, 2008), на 19 международной научной конференции «Геном рослин V» (Одесса, 2008), на семинаре «Мастер-класс» по биотехнологии (Одесса, 2009), на международной научной конференции „Современные научные проблемы создания сортов и гибридов масличных культур и технология их выращивания” (Запорожье, 2009), на Всеукраинской выставке достижений народного хозяйства (Киев, 2009), на международной научной конференции „Modern biotechnology of agricultural plants and biosafety (Plant genome VI)” (Одесса, 2010), на IX съезде Украинского общества генетиков и селекционеров имени Н.И. Вавилова (Алушта, 2012), на международной научной конференции «Современные научные тенденции, достижения в генетике, селекции, технологии выращивания и переработке масличных культур» (Запорожье, 2014), на международной научной конференции «Стійкість соняшнику до біо- та абіотичних чинників» (Харьков, 2014). Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 52 научных печатных работах (29 без соавторов), включая две монографии (в соавторстве), две методических рекомендации, 33 статьи, а также в материалах 14 научных конференций, симпозиумов и съездов. 20 публикаций включены в перечень специализированных изданий (12 без соавторов). Получено 3 патента Украины на изобретение. 8 статей опубликованы в журналах, входящих в международные наукометрические базы. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела материала и методов, 5-ти разделов собственных исследований, анализа и обобщения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 316 страницах машинописного текста, включая 55 таблиц, 34 рисунка и приложение. Список цитированной литературы включает 331 источник (из них 212 на латинице). 20 РАЗДЕЛ 1 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ ДЛЯ УСКОРЕНИЯ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА И РАСШИРЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У КУЛЬТУРНЫХ И ДИКОРАСТУЩИХ РАСТЕНИЙ 1.1. Эмбриокультура и пути ее использования Одной из первых работ по культуре зародышей была работа Ханнига в самом начале ХХ столетия. Для межвидовых скрещиваний первое успешное применение эмбриокультуры было продемонстрировано Laibach в 1925-1929гг. у видов Linum perenne и L.austriacum [цит. по 293]. В настоящее время эмбриокультура используется не только при отдаленной гибридизации [307], но также для получения растений из ослабленных зародышей в пределах одного и того же вида [201] или для получения дополнительных поколений [96, 97, 155] с целью сокращения селекционного процессса. Кроме этого, R. Dolcet-Sanjuan et al. [173] и E. Kurtar c A. Balkaya [226] считают, что возможно использовать ее и при получении гаплоидов. Как отмечают А. Пушкаренко и др. [77], T. Nedev et al. [248], C.S. Catarina et al. [154], успешное получение растений из зародышей в значительной степени зависит от стадии их развития и состава питательной среды. Обычно, частота выхода взрослых растений тем выше, чем более дифференцированные зародыши используются для доращивания. Так, зародыши H.annuus выделяли на разных стадиях развития – в начале процесса дифференциации (4-5 суток после опыления), на стадии дифференцировки семядолей и окончания формирования корешка (7-8 суток после опыления) и перед окончательным формированием зародыша 21 (12-13 суток после оплодотворения) и культивировали их на искусственных питательных средах с разным набором фитогормонов. Было установлено, что наибольший выход растений наблюдался из наиболее зрелых зародышей, причем прорастание зародышей было тем энергичнее, чем меньшее количество рострегулирующих веществ добавлялось в питательную среду [77]. В работе C.S. Catarina et al. [154] показано, что лучшей средой для культивирования зародышей Ocotea catharinensis, находящихся на ранней стадии формирования семядолей была среда WPM, предложенная G. Lloyd and B. McCown в 1980г. [234], половинной концентрации с добавлением 400 мг/л глутамина и 1,5 г/л активированного угля. Несмотря на широкий спектр применения культуры зародышей, все же наиболее широко этот метод используется при отдаленной гибридизации у растений [76, 166, 180, 224, 282]. 1.1.1. Эмбриокультура при межвидовой и межродовой гибридизации Для передачи ценных признаков от дикорастущих сородичей культурным формам стандартным приемом является гибридизация. Отбирая среди потомков гибридов генотипы с необходимыми характеристиками и достигают поставленной задачи. Однако чем дальше в филогенетическом отношении отстоят скрещиваемые формы друг от друга, тем более вероятно, что вследствие презиготических или постзиготических барьеров такие скрещивания успешными не будут. В связи с этим возникает необходимость привлечения дополнительных методов, таких, например, как культура зародышей, способных более эффективно решать подобные задачи. Метод культуры зародышей или, иными словами, метод эмбриокультуры, заключается, вкратце, в том, что гибридные зародыши через определенное время после опыления переносят на искусственную 22 питательную среду, где и доращивают до момента формирования растения, которое уже возможно культивировать в естественных условиях. Особенно широко данный подход используется на подсолнечнике [180, 188, 302, 315]. Известно, что дикие виды pода Helianthus являются источником генов, ответственных за устойчивость к болезням, ЦМС, восстановление фертильности, урожайность и качество масла. Эти качества предопределяют их широкое вовлечение в гибридизацию с культурным подсолнечником. Например, с целью передачи генов устойчивости к заразихе культурному подсолнечнику S. Sukno et al. [302] проводили скрещивания с многолетними видами H.giganteus, H.laevigatus, H.resinosus, H.panciflorus и H.decapetalus, устойчивыми к заразихе. Использование культуры незрелых 5-суточных зародышей позволило получить до 28% взрослых гибридных растений во всех скрещиваниях, кроме H.decapetalus. Однако, межвидовые скрещивания в роде Helianthus не всегда удаются. Существенное влияние на эффективность культивирования зародышей при межвидовой гибридизации оказывает их возраст. В некоторых случаях результативны только работы по культивированию зародышей на самых ранних стадиях развития. В других случаях удаются гибриды и при доращивании зародышей более зрелого возраста. Так, опытами A. Benvenuti и G.P. Vannozzi [142] выявлено наличие ранней абортивности зародыша у комбинаций H.annuus × H.grosseserratus и H.annuus × H.mollis и более поздней абортивности у комбинаций H.annuus × H.giganteus и H.annuus × H.strumosus. Для этих комбинаций эмбриокультура оказалась необходимой. По мнению G. Jeannin и G. Hahne [212], также важно учитывать влияние условий роста донорных растений, особенно при культивировании незрелых зиготических зародышей, поскольку они могут оказывать существенное влияние на выход регенерантов. 23 Для культивирования незрелых зародышей подсолнечника при межвидовой гибридизации используются питательные среды разного состава. Чаще всего используют среды по МС, Гамборгу (B-5) и некоторые другие. T. Nedev с сотр. [248] сравнили результаты культивирования на средах МС, Гамборга, Рича зародышей подсолнечника 8-11-суточного возраста и установили, что лучшие результаты получаются на среде МС при концентрации сахарозы 5г/л. В других случаях хорошие результаты получены на модифицированной среде с минеральной основой среды B-5, предложенной J.M. Chandler и B.H. Beard [157]. Используемый состав среды определяется и возрастом культивируемых незрелых зародышей. В частности, для культивирования мелких зародышей более эффективной может быть среда B-5 Гамборга, а для более крупных (> 1,5 мм) – среда МС. Когда мелкие зародыши подрастают их переносят на среду МС [223]. А для прямого соматического эмбриогенеза и регенерации растений из незрелых гибридных зародышей J.J. Finer [191] предлагает среду с высоким содержанием сахарозы. В работе N. Faure с сотр. [187] сравнивалась эффективность естественных скрещиваний и эмбриокультуры и установлено, что использование эмбриокультуры существенно повышает уровень гибридизации, тогда как применение только естественного скрещивания дает значительно меньше гибридных комбинаций. Также при межвидовых скрещиваниях было проведено сравнение выхода растений-регенерантов, полученных путем соматического эмбриогенеза и адвентивного побегообразования и путем прямого доращивания 10-11-суточных зародышей in vitro. Установлено, что в последнем случае эффективность приема была ниже [74]. Некоторые авторы сообщают о влиянии культуры зародышей на отдельные характеристики гибридного потомства. Так, И.Н. Анисимова с сотр. [4] указывают, что в потомствах ряда скрещиваний Н.annuus с 24 многолетними диплоидными и полиплоидными видами возникали электрофоретические изменения спектра гелиантинина не связанные с генотипом отцовского родителя, а, по мнению авторов, были следствием способа получения гибридов. Известен также способ получения растений подсолнечника через культуру завязей. Этот подход также можно с успехом использовать для получения редких гибридных комбинаций. Например, A. Espinasse et al. [183] таким образом были впервые получены межвидовые гибриды H.annuus × H.maximiliani. Техника данного способа выглядела следующим образом. Завязи с семисуточными гибридными зародышами культивировали в течение недели на искусственной питательной среде, затем зародыши извлекали и доращивали еще в течение двух недель на среде того же состава, что позволяло получать до 60% жизнеспособных растений. Культура незрелых зародышей и даже завязей активно используется при отдаленной гибридизации не только подсолнечника, но и других масличных культур, например, крестоцветных. Связано это в первую очередь с тем, что ряд дикорастущих сородичей культивируемых крестоцветных видов являются донорами ценных для человека признаков, – масличности, определенного состава жирных кислот, устойчивости к стрессам, вредителям и болезням. Такого рода гибриды могут представлять как самостоятельную селекционную ценность, так и служить своеобразным «мостиком» для переноса нужных генов от дикорастущих сородичей [153]. Так, G.K. Ravi и др. [282] получили межродовой гибрид между диким видом Erucastrum caraminoides (n=9) и Brassica nigra (n=8). Гибридность потомков была подтверждена авторами при помощи методов RAPD и изоферментного анализа. G.Q. Zhang с сотр. [327] с помощью эмбриокультуры получали гибриды между горчицей сарептской и рапсом. Частота регенерации 25 растений в этом случае достигала почти 27%. При этом культура зародышей была эффективнее в плане регенерации при использовании зародышей после 15-ти суточного возраста, тогда как при культивировании зародышей 10-ти суточного возраста больше инициировался каллус. Установлена и среда, обеспечившая лучшие результаты культивирования — МС с добавлением 0,3 мг/л НУК и 1,5-2,0 мг/л БАП. Также L. Van Ripley и P.G. Arnison [311] и J. Brown et al. [151] скрещивали с рапсом и другой вид горчицы – горчицу белую. Этими авторами был разработан метод, основанный на использовании эмбриокультуры и позволяющий получать жизнеспособные гибриды данных видов, которые по морфологическим признакам оказались промежуточными по сравнению с родителями. Предпринимались также попытки получения межродовых гибридов применяя культуру изолированных завязей. В частности, M. Zenkteler [323] были получены развивающиеся до той или иной стадии зародыши в комбинациях B.napus × D.tenuifolia, B.napus × M.arvensis, B.o. italica × D.tenuifolia, D.tenuifiolia × B.napus, D.tenuifolia × M.arvensis и D.tenuifolia × S.loeselli. Успешным оказалось применение культуры незрелых зародышей для передачи генов устойчивости к черной гнили от резистентных образцов B.juncea к Brassica oleracea [307]. И хотя гибриды от этого скрещивания имели признак мужской стерильности, они успешно использовались в качестве материнского родителя для получения устойчивых к черной гнили потомков. Метод культуры изолированных зародышей нашел широкое применение и при отдаленной гибридизации других растений, в том числе и древесных [109]. Известно, что внутри родов Capsicum и Nicotiana межвидовая гибридизация сопровождается барьерами несовместимости на различных 26 стадиях, начиная от момента прорастания пыльцевой трубки и заканчивая формированием взрослого гибридного растения. И на отрезке где несовместимость проявляется в период формирования и развития зародыша данный подход может быть особенно эффективным. Так, V.M. Nikova et al. [252] зародыши от скрещиваний C.annuum × C.praetermissum, C.annuum × C.eximium, C.baccatum × успешно C.annuum доращивались при использовании питательной среды МС с добавлением гибберелловой кислоты, кинетина и НУК, если их выделяли на стадиях начиная от глобулярной, и заканчивая стадией образования семядолей. Успешным у этих же авторов было доращивание гибридных зародышей рода Nicotiana, хотя наиболее результативной в данном случае оказалась немного другая комбинация гормонов. Культура зародышей оказалась единственно возможным методом и для получения межвидовых гибридов проса. Однако по результатам исследований А.С. Кашина и др. [39] в случае использования зародышей 810-суточного возраста прямое их доращивание оказалось менее эффективным, чем получение регенерантов из каллусных тканей данных зародышей. Такого же мнения придерживаются и М.М. Талат с сотр. [106]. Эти авторы отмечают, что при отдаленной гибридизации пшеницы с эгилопсом можно использовать как прямую регенерацию, так и регенерацию из каллуса. Однако каллусная культура позволяет получать значительно большее число гибридных растений. В данном случае для успешного каллусообразования использовались зародыши размером 0,4-0,5 мм и среда с добавкой 0,3 мг/л 2,4-Д. Техника, основанная на культивировании зародышей и завязей, использовалась для получения межвидового гибрида нута Cicer arietinum × C.pinnatifidum [239]. Полученные гибридные растения по строению листьев и габитусу напоминали отцовскую форму. 27 Постзиготическую несовместимость при межвидовой гибридизации нута отмечали H.J. Clarke с сотр. [166]. В одних случаях (нут × C.bijugum) применение эмбриокультуры было успешным при культивировании глобулярных зародышей 2-7-суточного возраста, в других (нут × C.pinnatifidum) – более зрелых зародышей (до 15–20 суток). При отдаленных скрещиваниях можно использовать эмбриокультуру не для получения гибридов, а с целью получения гаплоидов. Этот подход оказался успешным в случае с такой культурой как цикорий, гаплоидные растения которого C. Dore et al. [174] получили после опыления пыльцой Lactuca tatarica и Cicerbita alpina и последующего культивирования зрелых зародышей. При использовании культуры незрелых зародышей для увеличения генетического разнообразия Rosa hybrida отмечали, что абортивные незрелые зародыши обладали большей каллусообразовательной способностью, чем нормально развитые [56]. Выращивание in vitro зародышей позволило М.И. Уралец и др. [69] увеличить выход и межвидовых гибридов томата, а M. Xianhong et al. [317] – гибридов Lilium dauricum. Однако если в первом случае наиболее высокая эффективность метода достигалась при культивировании зародышей самой ранней стадии, то во втором - более зрелые зародыши обеспечивали более высокий процент органогенеза. Межвидовые гибриды томата можно получать не напрямую из зародышей, а через эмбриогенный каллус. Этот подход оказался эффективным в случае скрещивания культурного томата Lycopersicon esculentum с дикорастущим видом L.peruvianum [30]. Стадия развития зародыша является одним из основных факторов, определяющих эффективность метода эмбриокультуры. Они специфичны для каждой культуры и используемой комбинации скрещивания. Например, по данным Л.В. Русиной и др. [82] для получения жизнеспособных 28 гибридов шалфея между культурным видом Salvia sclarea и дикорастущими видами S.scfbiosifolia, S.grandiflora и S.aethiopis торпедовидная стадия развития зародыша оказалась оптимальной. У нута же, как показано H.J. Clarke et al. [166] в некоторых случаях оптимальным было культивирование глобулярных зародышей. 1.1.2. Эмбриокультура для получения дополнительных поколений и доращивания незрелых семян Хотя метод эмбриокультуры изначально придполагал его применение для спасения слабых или недоразвитых зародышей при отдаленной гибридизации, в последнее время культура незрелых зародышей широко используется для получения дополнительных поколений с целью ускорения селекционного процесса у различных видов растений [54, 84, 278], в том числе и подсолнечника [107, 171]. F. Cecconi et al. [155] проводили исследования по использованию культуры незрелых зародышей для укорачивания биологического цикла подсолнечника и тем самым получения большего количества поколений за год. Результаты исследований позволили авторам сделать вывод, что растения подсолнечника, выросшие из незрелых зародышей и в дальнейшем растущих в камере искусственного климата, имеют более короткий вегетационный период по сравнению с полевыми растениями. Это обеспечивает успешное получение до четырех-пяти поколений подсолнечника в год. Аналогичные подходы использовались и другими авторами [171, 202, 242]. Подобные методы используются и для получения дополнительных поколений у других культур или для медленнорастущих видов [196, 222, 272, 291]. быстрого размножения 29 Другим направлением использования эмбриокультуры может быть доращивание незрелых или с пониженной жизнеспособностью семян. Многими авторами сообщается о том, что раносозревающие сорта плодовых и винограда из-за недоразвития зародыша образуют семена с низкой частотой прорастания в нормальных условиях и метод эмбриокультуры для них оказывается очень эффективным. Поэтому для плодовых и ряда других культур метод эмбриокультуры является обычным методом, начиная с 80-х годов прошлого столетия [186, 203, 280]. Семена некоторых растений, таких, например, как Colocasia esculentum, Musa balbisiana и некоторых других не прорастают в природе, однако нармальные растения этих видов могут быть успешно получены через культуру зародышей [121, 131]. Еще раньше было известно, что у ряда орхидных практически не образуется эндосперм, что вызывает трудности в их размножении. Поэтому была предложена простая питательная среда для доращивания зародышей орхидных и получения из них растений [220]. Эта технология в настоящее время превратилась в широко используемый промышленный способ выращивания многих видов орхидных. 1.1.3. Другие пути использования эмбриокультуры Растения можно получать не напрямую из зародышей, а посредством эмбриогенного каллуса. В данном случае культивирование зародышей является начальным этапом для получения каллуса и в последующем уже культуры каллусной ткани. Так, разными исследователями были предложены способы регенерации растений из каллуса, образовавшегося на незрелых зародышах. Применительно к подсолнечнику такой способ может состоять из трех стадий: образование эмбриогенного каллуса на среде, содержащей гормон типа цитокинина, индукция органогенеза и 30 культивирование ростков [129, 192]. По заключению W. Tang и F. Ouyang [303]такой подход особенно эффективен у древесных растений, поскольку предоставляет возможность существенно увеличить коэффициент выхода регенерантов. Как отмечают Т.Н. Чеченева и др. [115], зрелые зародыши также могут служить исходным материалом для индукции каллуса, особенно после отбора сомаклональных вариантов, обеспечивающих повышенный уровень каллусообразования. А модификацией состава питательной среды можно достичь еще большего результата. Имеются и другие подходы. Так, M. Popielarska и L. Przywara [268] предлагают культивировать зародышевые мешки подсолнечника. Авторами показано, что при культивировании зародышевых мешков на жидкой питательной среде с 9% сахарозы из них развивается до 10% глобулярных зародышей, хотя требуются дополнительные манипуляции в виде пересадки на среды другого состава для стимулирования дальнейшего роста этих структур или индукции органогенеза. Зародыши, особенно незрелые, могут служить эффективным типом экспланта для индукции эмбриоидов путем прямого соматического эмбриогенеза. Поскольку в данном случае стадия каллусообразования отсутствует, это дает дополнительные преимущества в скорости и генетической стабильности получаемых растений. Такой подход успешно используют у перца [146], паспалума [314]. Разрабатываются и методы создания устойчивых к болезням генотипов, используя зародыши в качестве объекта воздействия. Так, у льна методами in vitro на модифицированной селективной среде (MS или Sh-2) с добавлением культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini при культивировании незрелых зародышей возрастом 8-9 суток были получены устойчивые к антракнозу регенеранты [65]. 31 1.2. Получение гаплоидов у разных видов растений Большинство высших растений на нашей планете содержит в своих клетках двойной (соматический) набор хромосом, в связи с чем они и называются диплоидами. Однако естественным или искусственным путем могут быть получены растения, клетки которых содержат одинарный или половинный набор хромосом, характерный для гамет данного вида [84, 130]. Гаплоиды в зависимости от уровня плоидности исходного растения можно разделить на две группы: моногаплоиды (моноплоиды) - гаплоиды, которые происходят от особей с диплоидным числом хромосом в соматических клетках и полигаплоиды - гаплоиды, которые происходят от полиплоидных особей (имеющих более двух наборов хромосом в соматических клетках). Например, гаплоиды кукурузы (n=10), ржи (n = 7) являются моноплоидами, поскольку обычные растения этих культур имеют клетки, содержащие 20 и 14 хромосом соответственно. Гаплоиды же мягкой пшеницы (n = 21) и картофеля (n = 24), которые являются естественными полиплоидами, представляют собой тригаплоиды (n=21=3x) и дигаплоиды (n=24=2x) [218]. Спонтанные гаплоиды у растений возникают редко. Бывает, что в одном семени образуется два или несколько зародышей, один из которых может быть гаплоидным. Следствием этого природного явления является образование двойных проростков. Появление таких "близнецов" связывают с аномалиями в развитии зародыша, но окончательно природа этого явления не выяснена. У культурных растений гаплоидные близнецы описаны для злаковых (пшеница, рожь, рис, овёс, ячмень), технических (кукуруза, сахарная свекла, лён), овощных (картофель, перец, томат) и других культур [113, 114, 141]. Образование гаплоидов вызывают также 32 задержки при опылении, опыление пыльцой другого вида или опыление инактивированной пыльцой [208, 226, 227, 306, 310]. Явление гаплоидии было открыто в 1921г., когда А. Бергнер обнаружил первое гаплоидное растение, а в 1922г. он и другие сообщили об экспериментально полученном гаплоидном мутанте дурмана Datura stramonium [147]. Это открытие привлекло к себе внимание учёных и в скором времени появилось большое количество новых исследований в этом направлении, тем более, что буквально через несколько лет А. Блэксли и Дж. Беллинг впервые предложили использовать гаплоиды в селекции. Немного позже была высказана идея о важном значении гаплоидии для генетических исследований. И уже в 30-х годах ХХ столетия во многих странах были получены и изучены десятки гаплоидов у разных видов растений. Тогда же Г. Моррисон [244], используя гаплоиды, получил первую гомозиготную линию томатов, что подтвердило теоретические предположения. В 70-х годах, когда гаплоиды были получены практически у всех основных культурных растений, их начали использовать в селекционносеменоводческих работах с такими культурами как кукуруза, табак, томаты, картофель, хлопчатник и др. К концу ХХ столетия возможность получения андрогенных (иначе андроклинных) растений была установлена у более чем 250 видов, принадлежащих ко 100 родам и 40 семействам [258]. В настоящее время гаплоиды используют уже и у древесных растений, таких как плодовые, хвойные [208, 264, 265]. Как правило, гаплоиды вследствие невозможности нормального протекания мейоза являются стерильными. Чтобы получить фертильные растения, набор хромосом у гаплоидов удваивают. Чаще всего для этой цели используют колхицин, оризалин или другие вещества, воздействующие на веретено деления. Необходимо также отметить, что 33 удвоенные гаплоиды, полученные на базе диплоидных организмов, часто, хотя и не совсем верно, называют дигаплоидами. Интенсивное практическое использование экспериментальной гаплоидии связано прежде всего с тем, что обычно селекционный процесс занимает несколько лет, а иногда и десятилетий как, например, у древесных культур. В традиционной селекции вначале нужно скрестить между собой особей с желаемыми признаками. Затем, из-за того что поколение F1 при дальнейшем воспроизведении расщепляется, приходится проводить целый ряд самоопылений для достижения приемлемого уровня генетической однородности. У самоопыляющихся растений (например, пшеница, рис, томаты) с каждым последующим поколением гетерозиготность уменьшается на 1/2 и к поколению F5 растения уже гомозиготны на 97% [32]. Такой уровень гомозиготности достаточен для практического тестирования по разным признакам. Таким образом исследователь затрачивает значительную часть времени на воспроизводство нескольких поколений для того, чтобы достичь приемлемого уровня гомозиготности после каждого начального скрещивания родительских пар. Кроме того, гаплоидия предоставляет возможность обнаруживать растения с нужными комбинациями признаков уже в первом половом поколении F1, поскольку из-за того, что каждый признак представлен лишь одним аллелем, у них отсутствует явление доминантности. Так как фенотип соответствует генотипу, это значительно ускоряет отбор нужных форм. Гаплоиды могут использоваться для решения целого ряда задач в селекционно-генетических исследованиях: для получения гомозиготных диплоидных линий в селекции на гетерозис; для создания серий моносомиков (анеуплоидов) при изучении взаимодействия генов и их локализации по группам сцепления; для получения триплоидов у полиплоидных несовместимости; видов растений; в декоративном при преодолении цветоводстве, межвидовой поскольку из-за 34 стерильности гаплоиды декоративных культур обладают более продолжительным цветением; в мутационной селекции, в связи с тем что у гаплоидов отсутствует явление доминирования (т.е. генотип отвечает фенотипу); у полиплоидных видов для предварительной селекции на более низком уровне плоидности; для генетического анализа, поскольку расщепление у гаплоидов менее сложно, чем у диплоидов [60]. Поскольку гаплоиды имеют одинарный набор хромосом для их получения необходимы не соматические, а половые клетки, имеющиеся у растений в мужском или женском гаметофите. Получать гаплоиды можно различными путями – например, через культуру in vitro или методом гаплопродюсера. Такие работы проводятся в разных странах. В частности, в Украине Т.Н. Сатаровой и др. [83] изучены закономерности получения андрогенных и матроклинных гаплоидов у кукурузы, С.А. Игнатовой широко использовался метод гаплопродюссера для получения гаплоидов у злаковых культур [35]. В целом, имеются три основных пути получения гаплоидов: андрогенез – культура пыльников и микроспор; гиногенез – культура неоплодотворенных семяпочек или семязачатков; партеногенез – оплодотворение гаплоиндуктором (гаплопродюсером) [78, 130, 245]. Наиболее широко для получения удвоенных гаплоидов используют метод гаплопродюсера и культуру пыльников и микроспор. Культура пыльников позволяет получить гомозиготные линии за несколько месяцев, а не за несколько поколений, как при использовании стандартных подходов [130, 133, 245]. 1.2.1. Получение гаплоидов у масличных культур Среди масличных культур наиболее широко методы экспериментальной гаплоидии разработаны для рапса. Еще в 70-е годы ХХ 35 века канадским ученым W.A. Keller и K.C. Armstrong [214] удалось получить гаплоиды Brassica napus через культуру пыльников. В течение десятилетия схожие методы были успешно опробованы и на других культурах семейства Brassicaceae: S. Leelavathi et al. – на Brassica alba [230], L. George и P.S. Rao, а также K.K. Sharma и S. Bhojwani – на B.juncea [197, 294] и W.A. Keller et al. – на B.campestris [215]. Однако в этих работах констатировалась лишь возможность получения гаплоидов, практическое же использование гаплоидов в селекционной работе существенно сдерживалось низкой частотой эмбриоидогенеза и низким выходом гаплоидных растений. В связи с этим работы по совершенствованию данной технологии для культур семейства Brassicaceae продолжались [122, 125, 132, 322, 329]. В последние годы для получения гаплоидов у рапса более широко используется метод культуры изолированных микроспор [134, 168, 199]. J. Siebel and K.P. Pauls [296] сравнивали культуру пыльников и культуру микроспор Brassica napus в отношении формирования эмбриоидов посредством вышеупомянутых структур. Несмотря на то, наблюдалась высокая генотипоспецифичность, культура микроспор была в десять раз более эффективной, по сравнению с культурой пыльников. Данная методика разрабатывается и относительно применения к некоторым другим видам семейства Brassicaceae. Например, E. Abraha et al. использовали такой подход на Brassica carinata [120], M.R. Malik с сотр. на Brassica juncea [238], Y. Zhang с сотр. на Brassica rapa [328]. На других масличных культурах также пытаются применять методы экспериментальной гаплоидии. Это было продемонстрировано T. Nurhidayah et al. на подсолнечнике [256], R.W. Bergmann and W. Friedt на льне [144], B. Elbern на маке [178], хотя на данный момент времени вопрос получения константного материала у представителей данных семейств через культуру пыльников еще недостаточно изучен. 36 Долгое время подсолнечник считался «трудной» культурой в отношении получения гаплоидов через культуру пыльников. Тем не менее такие работы велись в различных научных учреждениях. О каллусогенезе в культуре пыльников подсолнечника сообщали С. Федоренко и Н.И. Никитина [110]. Другие авторы, в частности T. Nurhidayah et al. [256], отмечали высокую частоту регенерации в культуре пыльников ряда межвидовых гибридов подсолнечника, таких как H.annuus с H.tuberosus, и H.laetiflorus H.resinosus. При этом наблюдалась высокая генотипоспецифичность и различная реакция на разные виды воздействия. У полученных регенерантов для определения их плоидности и тестирования других признаков использовали молекулярно-генетические методы [255]. Иным путем получения удвоенных гаплоидов у подсолнечника является индуцированный партеногенез. Обрабатывая пыльцу гаммалучами и используя ее для опыления M. Todorova и P. Ivanov [306] успешно получали гаплоидные линии данной культуры. На выход гаплоидных новообразований в культуре пыльников и микроспор влияют различные условия. В первую очередь успех культивирования пыльников и микроспор зависит от состава питательной среды [232]. Большое влияние оказывают и внешние условия. По данным J.M. Dunwell с сотр. [176] выращивание донорных растений Brassica napus L. при температуре 15°С и обработка изолированных пыльников температурой 35°С в течение 2 дней способствуют наибольшему выходу регенерантов. Исследованиями J.B.M. Custers с сотр. [169] на рапсе было установлено, что именно температурный фактор является определяющим в моменте переключения развития микроспор с гаметофитного пути на спорофитный. Как указывают D.G. Charne и W.D. Beversdorf [159], различные фитогормоны и их комбинации оказывают значительное влияние как на частоту образования эмбриоидов из гаплоидных тканей, так и на их 37 морфологию и дальнейшее развитие. Не менее важна стадия развития пыльника и пыльцы, которые используются для инициации культуры пыльников и микроспор. Считается, что данная стадия является критической в индукции эмбриогенеза, от которой зависит успех получения гаплоидных структур [18, 269]. Повышенной частоте регенерации и более высокому выходу удвоенных гаплоидов способствует обработка микроспор колхицином еще на стадии культивирования in vitro. Такой прием приводит к повышению частоты эмбриоидогенеза и удвоению хромосом у 84-88% регенерированных растений озимого рапса [330, 331]. S. Albrecht с сотр. [127] отмечали, что эмбриоиды, полученные в культуре in vitro микроспор рапса содержали большое количество запасных липидов в семядолях, которое коррелировало с содержанием липидов в семенах, в связи с чем представляется возможность более раннего отбора генотипов с высокой масличностью и определенным содержанием жирных кислот в масле. Сообщается также о различиях в плоидности у получаемых методами экспериментальной A. Naleczynska, гаплоидии T. Cegielska регенерантов. в культуре Так, по пыльников данным рапса 50% регенерированных растений были гаплоидными, а остальные 50% были диплоидные, тетраплоидные и миксоплоидные [247]. Изучалось и наследование признака высокой способности индукции гаплоидных новообразований из микроспор в культуре in vitro. Как показал диаллельный анализ, аддитивные и доминантные эффекты были значительными в генетическом контроле данного признака. F.L. Zhang и Y. Takahata [326] предполагают, что эмбриогенная способность микроспор рапса контролируется двумя локусами с аддитивными эффектами. Однако, большинство молекулярных механизмов, лежащих в основе перехода микроспоры с гаметофитного пути на спорофитный, до сих пор не ясны. 38 Вместе с тем K. Boutilier et al. [149] установлено, что при формировании эмбриоидов из микроспоры Brassica napus L. идет экспрессия специфичных генов, например гена BBM, близкого к генам семейства факторов транскрипции AP2/ERF, а это может предполагать его участие в регулировании данных процессов. Культура пыльников может использоваться для анализа сортообразцов на наличие определенных веществ, например, жирных кислот. Так, на примере горчицы сарептской исследованиями D. Zhang с сотр. [325] показано, что эруковая кислота в достаточном для анализа количестве содержится в эмбриоидах, но отсутствует в каллусной ткани. Метод экспериментальной гаплоидии в комбинации с другими технологиями может применяться и для получения семян промышленных гибридов F1 у некоторых культур. Так, комбинируя метод получения удвоенных гаплоидов и свойство цитоплазматической мужской стерильности, основанное на метаболизме глутамина, А. Ribarits et al. [284] была разработана экологически безопасная технология получения семян гибридов табака. 1.2.2. Получение гаплоидов у видов рода Linum Из масличных культур, для которых разрабатываются различные биотехнологии, лён представляет несомненный интерес, поскольку многие моменты (если не большинство) его культивирования в условиях in vitro с целью получения гаплоидов еще не разработаны [152, 257]. На льне Y. Chen et al. [163] и R. Bergmann и W. Friedt [144] апробирована технология получения гаплоидов через культуру пыльников, а K. Nichterlein и W. Friedt [250] – через культуру микроспор. Однако исследования, в которых объектом биотехнологических манипуляций являются микроспоры, пока не принесли значимого результата. Поэтому 39 культура пыльников в настоящее время остается единственным реальным путем получения удвоенных гаплоидов у этой культуры. Вместе с тем имеется ряд нерешенных задач, препятствующих широкому использованию данного метода. В частности, существуют трудности в индуцировании регенерации из каллусной ткани или в получении удлиненных побегов льна из регенерированных почек [144]. 1.3. Расширение генетической изменчивости с использованием технологий in vitro 1.3.1. Разработка систем каллусогенеза у масличных культур Известно, что каллусные ткани используют для решения целого ряда вопросов теоретического и практического характера. Ее используют для сохранения в активном состоянии разного рода мутантов, для получения большого количества биологически активных веществ, для инициации суспензионных культур. В теоретическом плане изучение каллусных тканей представляет интерес для выяснения отдельных аспектов физиологии клетки и ее биосинтетических возможностей. Каллусная культура имеет большое значение и для получения высокого уровня генетической изменчивости in vitro. Это объясняется тем, что в процессе дедифференциации тканей накапливается значительное количество генетических и эпигенетических изменений. При получении регенерантов из каллусной культуры эти изменения реализуются на организменном уровне и приводят к появлению генетически измененных растений. Каллусообразование зависит как от генетических факторов, так и от факторов среды, являясь таким образом результатом взаимодействия генотип-среда, что было продемонстрировано C.A. Quimio и F.J. Zapata у 40 риса [275] и ряда других культур [135]. У растений многих видов способность к каллусообразованию генетически детерминирована, у некоторых культур этот контроль осуществляется малым количеством генов, в том числе и моногенно, как, например, показано L.A. Lutova et al. [235] у редиса при индукции каллуса из семядолей. При этом рецессивные аллели генов часто угнетают рост каллуса, а доминантные, наоборот, его интенсифицируют, как указывают F. Etedal et al. для рапса [184, 185] или других видов [135], хотя при культивировании пыльников риса разных подвидов наблюдали и обратную ситуацию [275], когда высокая интенсивность каллусообразования обусловливалась лишь несколькими рецессивными генами. В связи с тем, что процесс каллусообразования находится под генетическим контролем, важна роль генотипа, – вида, подвида, а иногда и сорта, – из которого этот каллус получают. Несмотря на генетическую детерминацию каллусообразования, важную роль здесь играют факторы среды, в первую очередь количество и баланс фитогормонов, которые могут существенно менять ход этого процесса. Так, S. Ko Myong и S. Ro Myong [221] у сафлора красильного показано, что для усиления роста каллусных культур эффективным является добавление в питательную среду 1 мг/л 2,4-Д и 1 мг/л ИУК или соотношение ауксин : цитокинин в среде должно быть больше единицы, а для индукции каллуса с целью последующей регенерации из эксплантов гипокотиля, семядоли и листа оптимальным является концентрация гормонов в пределах 1,34-11,41 мкМ [251]. У льна лучшей для инициации каллусообразования оказалась комбинация фитогормонов 2,4-Д + зеатин, причем как установили A.C. Gomes da Cunha и M.F. Ferreira [200] увеличением концентрации 2,4-Д от 0,05 до 3,2 мг/л в индукционной среде можно сдвигать путь дальнейшего морфогенетического развития культуры в сторону гемогенеза. У подсолнечника для индукции каллуса, сохраняющего высокий регенерационный потенциал, в некоторых случаях 41 достаточна комбинация БАП и НУК (по 1 мг/л) с добавлением 0,1 мг/л гиббереллина [33] или одна 2,4-Д в той же концентрации с последующим пассированием на среду, содержащую БАП и НУК [261]. 1.3.2. Изменчивость в культуре in vitro как путь получения новых генотипов растений Растения-регенеранты, полученные из каллуса, могут заметно отличаться от исходного материала, причем частота таких изменений часто даже выше чем при действии искусственных мутагенных факторов. Широкий спектр вариантов, образующихся из культивируемого in vitro материала, является отражением глубокой клеточной и геномной дестабилизации, за которой следуют действие отбора и вторичные наследственные изменения в популяции клеток. Это явление используется для создания новых форм растений, так называемых “сомаклональных вариантов”. Сомаклональная изменчивость приводит к появлению особей с параметрами признака, выходящими за пределы естественной изменчивости данного сорта [79, 210]. И хотя впервые это явление было научно обосновано P.J. Larkin и W.R. Scowcroft лишь около 30 лет назад [228], в настоящее время полученная таким путем изменчивость имеет большое значение при применении культуры клеток и тканей для улучшения многих возделываемых человеком видов, в частности, масличных и технических культур, злаков, кормовых трав, декоративных и целого ряда других растений [64, 179, 210, 231]. Индукция сомаклональной изменчивости связана с этапом недифференцированного роста клеток в каллусной культуре. В частности, при неорганизованной пролиферации изолированных клеток и тканей происходит сбой в функционировании систем репарации генетических повреждений. При этом, как было показано О.А. Рожанской и др. [80] на 42 яровом рапсе, возникающие в популяции мутации могут накапливаться, особенно если присутствует даже слабый селективный фон. Такие перестройки генома возникают уже на самых ранних этапах культивирования, что, по данным И.О. Андреева и др. [3], проявляется в полиморфизме продуктов RAPD-ПЦР. И хотя часть этих индуцированных изменений имеет обратимый характер, этого достаточно для существенного повышения наследуемой изменчивости потомства растений-регенерантов пшеницы, льна, проса пальчатого, сои, нута, эфиромасличных растений [5, 26, 72, 79, 123]. Источником генетических изменений в культуре in vitro является, помимо других факторов, и сам процесс культивирования на искусственной питательной среде. Полученные сомаклоны, имеющие новые генетические характеристики, как установлено M. Rakoczy-Trojanovska [279] передают измененные признаки по наследству, т.е. могут существовать как генетически стабильные линии, которые представляют интерес в качестве источников нового исходного материала, например, у ржи, пшеницы, проса [5, 61]. В течение ряда лет ведется активная селекция в условиях in vitro устойчивых к различным грибным патогенам генотипов разных видов растений. В данном случае селекция осуществляется за счет внесения в среду культурального фильтрата (КФ) гриба определенной концентрации, что было продемонстрировано, в частности, С.Е. Масленниковым у люцерны [53], А.Л. Мазур и С.А. Игнатовой у пшеницы [52]. В работе Е.А. Калашниковой с сотр. [37] не только отработана методика получения стерильного КФ Altemaria radicina, но и разработана схема клеточной селекции на каллусной и суспензионной культурах устойчивых к альтернариозу линий моркови. В данном случае показано, что оптимальной была концентрация КФ 20-25%. Н.В. Соловых с сотр. [86], проведены также исследования и показана возможность отбора устойчивых 43 к Phytophthora cactorum каллусов яблони, а R.P. Kaushal et al. [213] – устойчивых к Cercospora canescens каллусов фасоли мунго, хотя растенийрегенерантов из пассируемых каллусов исследователи и не получали. Z. Yang [319] отобрал более устойчивые к парше регенеранты мягкой пшеницы, полученные из каллуса из незрелых зародышей, чем исходный устойчивый сорт Sumai 3. Эти линии к тому же оказались и более урожайными. В отношении другого патогена пшеницы, – Fusarium graminearum, А.А. Какжановой и А.П. Науновой [36] было показано, что для получения устойчивых к фузариозу регенерантов через культуру in vitro наиболее оптимальным является использование 30% КФ в питательной среде. В сходном исследовании Г.В. Мепаришвили [55] были отобраны устойчивые к действию фильтрата каллусы и получены растения-регенеранты оценка которых в полевых условиях на устойчивость к F. graminearum показала, что среди полученных in vitro линий пшеницы имеются формы, толерантные к фузариозу колоса. С.И. Волощук с сотр. [14] в плане исследования проблемы эффективности клеточной селекции на устойчивость к культуральным фильтратам Fusarium graminearum, Septoria tritici и Pseudocercosporella herpotrichoides изучили их действие на параметры роста и развития каллусных культур из незрелых зародышей озимой пшеницы и установили их влияние на морфогенный потенциал. На других культурах из этого же семейства данный подход также оказался результативным. Например, обрабатывая культуральным фильтратом патогена Piricularia oryzae каллусы из семян риса были получены устойчивые к данному возбудителю регенеранты [266]. В опытах S. Umesha et al. [309] на просе среди 201 регенеранта, полученного через культуру каллуса из семян линии PNMS 6B, культивируемого на среде с 44 культуральным фильтратом, 17 растений оказались устойчивыми, а 5 – высокоустойчивыми к Sclerospora graminicola. Интересные исследования в плане получения новых сомаклональных вариантов риса были проведены P. Bertin и J. Bouharmont в 1997 г [145]. Авторы получили из зародышей 4-х сортов риса, высеянных в высокогорье Бурунди, каллус и подвергли его температурной обработке. Одновременно у этих же сортов проводили стандартную массовую селекцию на холодоустойчивость. Регенеранты R3 вместе с растениями после массового отбора оценивали на холодоустойчивость. У всех сортов данный показатель был значительно выше у in vitro отобранных растений, тогда как при массовом отборе он не изменился. Были предприняты попытки получения устойчивых к болезням генотипов и у масличных культур. Незрелые зародыши и гипокотили подсолнечника F. Raducanu с сотр. [277] культивировали на среде с культуральным фильтратом Sclerotinia sclerotiorum, получали каллусную культуру и из нее регенерировали растения. J.V. Kumar и B.R. Kumari [225] получили устойчивые к Alternaria carthami растения сафлора, используя отбор регенерантов из каллусной культуры, культивируемой на фоне культурального фильтрата данного гриба. Для получения самой каллусной культуры использовали экспланты семядолей, выращенные также на среде с концентрациями данного культурального фильтрата 10-50%. В результате применения такой схемы селекции было получено 33 устойчивых к данному патогену растения. В работе F.A. Hammerschlag с сотр. [207] показано, что используя в качестве эксплантов листья ряда сортов клубники можно получать регенеранты, которые в 1,7-3,9 раз более устойчивы к грибному патогену Colletotrichum acutatum чем исходные сорта. Это не только указывает на различия в генетической стабильности изученных образцов, но и подтверждает тот факт, что сомаклональная изменчивость может служить 45 реальным инструментом увеличения устойчивости ягодных культур к данному заболеванию. Устойчивость к грибным патогенам имеет огромное значение для декоративных культур. В связи с этим проводятся исследования по использованию метода сомаклональной изменчивости для отбора устойчивых к грибным болезням форм различных декоративных растений. И в данном случае эти исследования показывают высокую эффективность. Например, M. Thakur с сотр. [305] показано, что в результате двукратного отбора в каллусной культуре гвоздики на среде с культуральным фильтратом Fusarium oxysporum, 32% из полученных регенерантов обладали существенно более высоким уровнем устойчивости к данному патогену чем исходные формы. Важно также то, что другие признаки, определяющие декоративные качества этой культуры, не изменились. Подобные работы проводятся и на других срезочных культурах, например, розе [287]. Успешным оказался отбор in vitro не только на устойчивость к грибной инфекции, но и к бактериальной. Так, Н. Губановой с сотр. [20] у кормовой свеклы были получены резистентные к токсину Pseudomonas syringae pv. aptata каллусные линии. Сходные исследования проведены по селекции на клеточном уровне устойчивых к кольцевой гнили линий картофеля [41]. Поскольку из-за несовершенства технологий полива площади земель с повышенными концентрациями солей неуклонно расширяются, проводятся интенсивные работы в области улучшения солевыносливости растений при помощи сомаклональных вариаций. Ряд исследований, проведенных в 90-е и 2000-е годы на люцерне [288] и эспарцете [318], показал перспективность создания устойчивых к засолению форм данных культур. Более того, A. Safarnejad et al. [288] установили, что устойчивые к повышенной концентрации хлоридов сомаклоны люцерны содержали 46 увеличенное количество пролина и антиоксидантных ферментов, а их молекулярные спектры характеризовались многочисленными копиями гена РА9, определяющего В.М. Бурдасов и синтез пролина. Л.В. Матюнина [9] Положительные получили и результаты при создании солеустойчивых форм древесных растений, таких как тополь и черемуха, при регенерации растений из каллусной ткани. Важной проблемой является устойчивость к засолению у риса и других злаков. Так, путем прямой и непрямой селекции сомаклонов A.B. Mandal et al. [241] и Н.В. Хадеевой с сотр. [111] удалось добиться улучшения солевыносливости у риса. А в опытах I. Zair et al. [321] регенеранты нескольких сортов пшеницы, полученные из культивируемого на среде с 1% NaCl каллуса, демонстрировали лучшие показатели роста колеоптиле и корней в условиях засоления. Еще ранее с помощью селекции сомаклонов проводились попытки увеличить солеустойчивость и у некоторых других культур, например у горчицы [209] и хлопчатника [136]. Хорошие результаты получают используя не только прямую, но и ступенчатую селекцию сомаклонов. Например, таким путем получены регенеранты, устойчивые к хлоридному и сульфатному засолению у кормовой свеклы [19, 20], картофеля [259] и чеснока [181]. Поскольку антропогенная нагрузка на окружающую среду с каждым годом лишь увеличивается, все больший спрос приобретают генотипы, способные эффективно функционировать в условиях повышенного загрязнения. В этой связи проводятся работы, направленные на отбор устойчивых к тяжелым металлам клонов растений. Такие исследования идут как на модельных [172], так и на широко возделываемых сельскохозяйственных регенерантов, культурах выросших из [85, каллуса, 205]. В частности, индуцированного в среди культуре пыльников риса на среде с 200 мг/л хлорида кадмия, Li Haimin и C. Ying 47 [205] получены растения, устойчивые к данному металлу. Сходным образом на селективной среде, содержащей 0,63 мМ ванадата натрия или 1,0 мМ вольфрамата натрия Л.Е. Сергеевой [85] получены клеточные линии табака, устойчивые к ванадию. На устойчивость к другим тяжелым металлам селекция также проводится, например к свинцу, цинку [249] или алюминию [289]. Например, E. Nehnevajova [249] через каллусную культуру уже получены сомаклональные варианты горчицы сарептской, как более устойчивые к действию свинца и цинка, так и обладающие повышенной способностью накапливать эти тяжелые металлы в корнях и стеблях, что предоставляет возможность восстановления использовать данные загрязненных сомаклональные указанными образцы химическими для элементами земель. Хорошо зарекомендовал себя метод отбора сомаклональных вариантов и при создании генотипов, устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды, таким как низкие и повышенные температуры, засуха. Так, методами клеточной селекции получены сомаклоны пяти сортов сахарного тростника [140] и 3 каллусные линии сахарной свеклы [42], устойчивые, соответственно, к засухе и низким температурам, отселектированы в условиях in vitro засухоустойчивые сомаклоны пшеницы [237], регенерированы растения с более высокой морозоустойчивостью листьев у картофеля [128]. Ведутся также работы по использованию культуры in vitro для отбора устойчивых к гербицидам [276, 304] и ретардантам [126] генотипов сои, подсолнечника, банана. Все эти исследования указывают на важность получения и поддержания каллусных культур разных видов растений, необходимость изучения закономерностей, характерных для процесса каллусообразования 48 и последующей регенерации, определения типов эксплантов, наиболее пригодных для индукции каллуса и пр. 1.3.3. Разработка методов оценки и отбора in vitro на устойчивость к различным факторам Культура изолированных тканей может служить и как тест для оценки устойчивости растений к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам. Правда, это возможно лишь в случае когда реакция на стресс в условиях in vitro совпадает с таковой у целых растений. Например, P. Boutsalis [262] разработана система тестирования растений, включающая бесполое размножение растений, либо без прохождения через каллусную фазу либо с использованием культуры клеток и протопластов, которая может быть использована для скрининга на гербициды, фунгициды, инсектициды. Имеются способы и методы, позволяющие оценить материал, проведенный через культуру in vitro на устойчивость к факторам внешней среды. Так, у разных сортов пшеницы, ячменя и овса установлена связь типов реакций клеточных систем на каллусогенной среде с устойчивостью растений к неблагоприятным абиотическим факторам среды, в частности засухе. При этом генотип характеризуется высокой устойчивостью если доля культур (культуральных пробирок) с растениями-регенерантами составляет больше половины оцениваемых культур данного генотипа [81] или повышенной устойчивостью, если на каллусогенной среде большинство оцениваемых культур данного генотипа имеет твердые по консистенции каллусы, относящиеся к типу каллусов с высокой регенерационной способностью [63]. R. Rodeva с сотр. [285] установили, что культивирование каллуса гороха совместно с инокулятом возбудителя аскохитоза может служить ценным подходом для работы по отбору 49 устойчивых образцов и изучения взаимодействия в системе хозяин – патоген. А.С. Лукаткиным [48] показано, что каллусные культуры огурца могут быть использованы в качестве модельного объекта при изучении стрессоустойчивости, в частности, холодового повреждения. В связи с тем что в условиях in vitro возможно появление разных по устойчивости генотипов, важно уметь отбирать из них нужные формы. Поэтому разрабатываются разные способы оценки и отбора, в том числе методы отбора в искусственных условиях устойчивых генотипов [63, 119]. Оценка устойчивости растений, как было продемонстрировано В.А. Лях с сотр. [57] на льне масличном, подсолнечнике, рапсе, клещевине, возможна и на уровне микрогаметофита, поскольку ряд генов, определяющих чувствительность клетки к факторам внешней среды экспрессируется на обеих фазах жизненного цикла [260, 290]. 1.3.4. Сочетание методов in vitro и мутагенеза для расширения генетической изменчивости В последние десятилетия получило развитие направление, основанное на совместном использовании методов биотехнологии и мутагенеза. Данная технология используется для увеличения генетического разнообразия у различных культур. Ее особеностью является то, что мутагенному воздействию подвергаются не привычные при таких исследованиях органы растений, прежде всего – семена, а иные структуры, которые поддерживают в культуре in vitro для обеспечения их жизнеспособности. При этом предполагается, что в данном случае экспрессируется иной набор генов. Это влечет за собой модификацию частоты и спектра наследуемых изменений. P. Venkatachalam и N. Jayabalan [313] из эксплантов листьев, восприимчивых к церкоспорозу растений арахиса, получали каллусные 50 культуры, которые обрабатывали химическими и физическими мутагенами. В результате ими были получены устойчивые к данному патогену растения. При этом гамма-облучение оказалось более эффективным, чем химический мутаген ЭМС. T.R. Sharma и B.M. Singh [295] из обработанных мутагеном семян горчицы сарептской получали экспланты гипокотилей и семядолей, из которых индуцировали каллус для последующей регенерации растений. Среди полученных регенерантов ими были выявлены устойчивые к альтернариозу и белой ржавчине растения. D.S. Kim с сотрудниками [217] получали из зародышей риса каллус и обрабатывали его мутагеном. Такая обработка позволила значительно увеличить наследуемую изменчивость по таким биохимическим признакам как содержание белка и незаменимых аминокислот. Например, были получены генотипы риса у которых общее содержание белка увеличилось на 32%, а суммарное содержание незаменимых аминокислот – на 71%. H. Bouman и G.-J. De Klerk [148] регенерировали растения бегонии из листовых эксплантов, обработанных различными концентрациями химического мутагена нитрозометилмочевины. Полученную изменчивость оценивали на трех уровнях – качественном, молекулярном (RAPD) и количественном. Показано, что наиболее приемлемым для оценки индуцированной изменчивости является количественный подход, поскольку молекулярная оценка не была достаточно чувствительна, а качественная требовала больших объемов работы. Кроме того, авторами проведено сравнение вариабельности, индуцированной мутагеном, и связанной с этапом каллусообразования и регенерации. Показано, что хотя изначальный уровень сомаклональной изменчивости был выше, однако он резко уменьшался в последующих поколениях, что говорит о ненаследственном, эпигенетическом характере таких вариаций. О возможности проведения исследований по одновременному использованию сомаклональной и мутационной изменчивости in vitro в 51 селекционно-генетических работах с кукурузой сообщали и Т.Н. Чеченева и Е.А. Ларченко [116]. Известны исследования и других авторов по применению индуцированного мутагенеза в культуре in vitro [2, 138]. Тем не менее работ по обработке каким-либо химическим мутагеном зародышей подсолнечника и поиска возможности таким способом влиять на генетический спектр регенерантов в литературе не обнаружено. Таким образом, приведенный выше обзор литературы свидетельствует об эффективном использовании различных биотехнологий у разных видов растений. У масличных культур примеров успешного использования биотехнологических приемов значительно мешьше. В частности, у подсолнечника широкое применение нашел метод эмбриокультуры для получения его межвидовых гибридов, используется этот метод и для получения дополнительных поколений. Для получения удвоенных гаплоидов капустных культур применяется метод культуры пыльников и микроспор. У этих же видов используют каллусную культуру для индуцирования изменчивости по различным признакам, прежде всего по устойчивости к абиотическим и биотическим факторам внешней среды. Вместе с тем для многих масличных культур, таких как подсолнечник, лен, рапс, биотехнологические приемы еще недостаточно разработаны. Так, практически отсутствует информация об особенностях ввода в культуру in vitro эксплантов диких видов льна. Ряд вопросов, связанных с получением удвоенных гаплоидов через культуру пыльников у льна масличного, остается нерешенным. Кроме того, стоит проблема идентификации удвоенных гаплоидов, поскольку новообразования из спорофитной ткани не важны для практического использования. Несмотря на то, что эмбриокультура является хорошо известным приемом, у подсолнечника не разработаны такие его методологические аспекты как влияние возраста зародышей на характеристики получаемых из них растений. Зародыши 52 также могут являться объектом мутагенного воздействия для получения оригинального спектра мутаций, что крайне важно для подсолнечника из-за его узкой генетической базы. Обобщая все вышесказанное, можно заключить, что успешное решение затронутых вопросов актуально для масличных культур, а разработанные и усовершенствованные биотехнологические приемы будут представлять биотехнологическую базу для создания современного селекционного материала. 53 РАЗДЕЛ 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Условия проведения исследований Исследования проводили в лабораторных и полевых условиях, а также в условиях фитотрона Института масличных культур НААН в течение 1996-2014 гг. Поля Института расположены на территории Запорожского района Запорожской области и относятся к южной подзоне Степи Украины. Согласно данным Запорожской зональной агрохимлаборатории грунты полей Института масличных культур представлены типичными обычными малогумусными среднемощными черноземами. Основные запасы почвенной влаги в этих почвах формируются в осенне-зимний и ранневесенний периоды. Климат южной степи Украины – умеренно-теплый с недостаточным увлажнением. Распределение атмосферных осадков в этой зоне как по количеству, так и по периодам вегетации, неравномерно. Засушливость климата наблюдается чаще летом и осенью и обусловливается не только недостаточным количеством осадков, но и неравномерным распределением их в течение года. Запорожская область относится к первому агроклиматическому району, который характеризуется как очень теплый, умеренно засушливый. Годовое среднее количество осадков по Запорожскому району составляет 420 мм, а сумма эффективных температур – 3000-3100°С. Среднемноголетние температуры воздуха и количество осадков по месяцам в период вегетации растений представлены на рис. 2.1. Полное оттаивание почвы отмечается во второй половине марта. Запасы продуктивной влаги в 54 метровом слое почвы к началу полевых работ составляют в среднем 139 мм. Устойчивое прогревание почвы на глубине 10 см до 10°С отмечается в середине апреля. 60 50 40 30 20 10 0 Апрель Май Июнь Июль Август Сентябрь Месяц Температура воздуха, °C Рис. 2.1. Среднегодовые Количество осадков, мм показатели температуры воздуха и количества осадков в период вегетации растений по Запорожскому району Запорожской области Вегетационные исследования проводили в условиях фитотрона Института масличных культур с температурным режимом 26/18°С (день/ночь) при 16-часовым фотопериоде и освещенности 10000 люкс. 2.2. Материал Материалом для проведения исследований служили линии, образцы, сорта и гибриды из коллекций лабораторий Института масличных культур НААН Украины. 55 При изучении эффективности каллусогенеза в культуре in vitro эксплантов подсолнечника, в частности выяснения влияния типа экспланта и генотипа на образование каллуса и роли питательной среды в поддержании стабильной каллусной культуры использовали пять образцов – гибрид F1 ЗЛ-22 × ЗЛ-678, его родительские линии ЗЛ-22А и ЗЛ-678, а также линии ЗЛ-102 и ЗЛ-165. В качестве материала для исследований каллусогенеза у льна использовали пять однолетних видов льна – четыре дикорастущих (L.angustifolium Huds., L.grandiflorum Desf., L.hispanicum Mill., L.pubescens Banks & Solander) и один культурный (L.usitatissimum L., сорт Айсберг) из коллекции лаборатории селекции и генетики льна ИМК НААН. В качестве материала для культуры пыльников льна использовали 17 гибридных комбинаций, в том числе 7 пар от прямых и обратных скрещиваний, а также гибриды F1 льна масличного МР485 × Авангард, 6-8 гнездный × М22 и М12 × М24, полученные от скрещивания линейного материала различного происхождения. Связь между размером бутонов и стадией развития пыльцы у льна исследовали на культурном льне L.usitatissimum L. (сорт Дебют) и дикорастущих видах L.austriacum L., L.perenne L., L.hirsutum L., L.grandiflorum Desf. Образование каллуса из пыльников изучали также на селекционных образцах Lin 1 – Lin 6. Для культуры пыльников рапса и горчицы материалом служили 5 сортообразцов рапса (сорта Анна, Наташа, Отелло, Отаман и Титан) и 5 образцов горчицы (Г2, Г5, Г11, Г15 и Г44), а также селекционные образцы рапса № 1, № 3, № 5, F1 53, F1 81, Д49. Индукцию новообразований в культуре семязачатков рапса исследовали на образцах № 3, № 5, № 8, № 53, № 81, № 111 и № 175. При изучении эффективности метода эмбриокультуры для оценки влияния возраста зародышей на частоту получаемых из них растений и их морфологические характеристики использовали линии ЗЛ-95, ЗЛ-103, ЗЛ- 56 131, ЗЛ-169, ЗЛ-809, ЗЛ-2554, межлинейные гибриды 1814 × 1811, 1812 × 1811, 1813 × 1811, а также сорт Прометей запорожской селекции. В исследованиях по расширению спектра генетической изменчивости за счет мутагенной обработки незрелых зародышей подсолнечника в качестве материала использовали зародыши двух линий культурного подсолнечника Helianthus annuus L. запорожской селекции – ЗЛ-809 и ЗЛ-95. 2.3. Методика проведения исследований Получение гаплоидов и удвоенных гаплоидов льна через культуру пыльников. Для получения гаплоидов льна через культуру пыльников донорные растения выращивали в открытых теплицах, весной, в благоприятных для культуры льна условиях, исключающих повреждения болезнями и вредителями. Для определения оптимальной стадии развития микроспор отбирали бутоны разного размера – от 2,5 до 9 мм, – в зависимости от вида льна, и готовили временные цитологические препараты. С этой целью бутоны фиксировали в фиксаторе Карнуа несколько часов на холоде, затем из них извлекали пыльники, раздавливали в капле красителя (ацетокармин или гематоксилин), накрывали покровным стеклом и просматривали препарат под микроскопом с общим увеличением × 200-400. В зависимости от количества ядер и состояния центральной вакуоли судили о стадии развития пыльцы. Кроме размера бутона принимали во внимание также соотношение длины лепестков и пыльников. После установления связи между размером бутона и стадией развития пыльцы в дальнейшем для культивирования пыльников отбирали бутоны соответствующего размера, время от времени проводя цитологический контроль. Для культивирования пыльников льна использовали агаризованные питательные среды МС [246], LMA-1 [62], N6 [165] и NLN-13 [232]. 57 Поскольку температурный фактор играет важную роль в индукции новообразований в культуре пыльников, проводили температурную пред- и пост-обработку материала. В качестве предобработки свежесобранные бутоны на 1-2 суток помещали в холодильник на температурный фон 3-5°C. Для температурной постобработки материала высаженные на питательную среду пыльники выдерживали при разных температурных режимах (5 суток при 33°C; 5 суток при 6°C; 5 суток при 20-25°C; 10 суток при 6°C). Впоследствии пыльники культивировали в искусственных условиях согласно стандартной методике при комнатной температуре. Учет новообразований, получаемых при культивировании in vitro пыльников, проводили через 30 и 45 дней после высадки. Учитывали общее число отзывчивых пыльников (т.е. пыльников, на которых образовался каллус либо эмбриоиды, независимо от природы их происхождения), число пыльников с андрогенными каллусом или эмбриоидами, долю пыльников с каллусом из тычиночной нити от общего количества пыльников с каллусом. Природу происхождения этих новообразований контролировали как цитологически (путем подсчета количества хромосом на метафазных пластинках временных препаратов кончиков корешков или оснований листочков растений-регенерантов, окрашенных пропионолакмоидом, ацетокармином или гематоксилином), так и с помощью разработанного нами метода, основанного на наличии или отсутствии рецессивного маркерного признака у растения-регенеранта (раздел 4.6). Для изучения влияния минерального состава питательных сред и концентрации фитогормона 6-бензиламинопурина (БАП) на индукцию регенерационных процессов пыльники двух генотипов ( МР485 × Авангард и 6-8 гнездный × М22) культивировали на питательных средах N6 [14] и LMA-1 [15] с содержанием БАП 2, 4 и 6 мг/л в стандартных условиях (16ти часовой фотопериод). Каждые 4-5 недель, проводили пассирование на свежую питательную среду, подсчитывая долю каллусов (в процентах), 58 давших начало регенерации корней или побегов, а также количество каллусов с разной степенью развития, выделяя из них хорошо развитые (активно пролиферирующие). О степени развития каллуса судили по изменению размера каллуса (диаметр основания), наличию некротических участков, цвету, структуре каллусной ткани (рыхлая, средней плотности, плотная). Каждую чашку Петри с 6-тью каллусами рассматривали как повторность. Рост побегов льна, регенерированных из каллусов, изучали на пяти средах с минеральной основой МС и добавкой аминокислот и фитогормонов в различных сочетаниях: № 29 – МС + БАП + НУК + аминокислоты + В1, № 30 – МС + БАП + НУК, № 31 – МС + БАП + НУК + аминокислоты + В1 + В, № 32 – МС + БАП + ИМК + ГК3 + аминокислоты + В1, № 33 – МС + БАП + НУК + ГК3 + аминокислоты + В1. Среды № 29, № 31–№ 33 содержали кроме фитогормонов аминокислоты серин, глутамин и аспарагин, а также витамин В1 (тиамин хлорид) и микроэлемент бор. Фитогормоны БАП, НУК и ГК3 использовали в концентрации 0,5-1 мг/л, 0,05 мг/л и 0,1-0,2 мг/л, а аминокислоты аспарагин, глутамин и серин – в концентрации 200, 30 и 100 мг/л, соответственно. Количество борной кислоты и витамина В1 увеличивали вчетверо по сравнению с основной средой. Культивирование проводили по стандартным методикам на протяжении двух пассажей. Учитывали количество каллусов с регенерированными побегами и долю каллусов с побегами, удлиненными не менее чем на 10 мм, от количества высаженных. После удлинения побегов их переносили на среду с уменьшенным в полтора-два раза содержанием макроэлементов и сахарозы и с другим набором фитогормонов – 1-2 мг/л НУК, 2 мг/л ИМК или по 1 мг/л НУК и ИУК. Концентрацию агар-агара в данной среде увеличивали на 0,1-0,2% [104]. 59 Индукция гаплоидных новообразований у капустных культур. С целью изучения закономерностей индукции новообразований в культуре пыльников у видов рода Brassica соцветия с бутонами рапса и горчицы выдерживали при пониженной температуре 6±2°C в течение 1-2 суток, отбирали бутоны размером 2,5-3,7 мм для рапса и 1,9-2,3 мм для горчицы, выделяли из них пыльники и высаживали на питательные среды на основе МС и В5, которые различались между собой содержанием фитогормонов. Пыльники выдерживали при повышенной температуре 32±1°C в течение 2-х суток, а затем – в комнатных условиях (температура 20-25°C). В дальнейшем культивирование пыльников проводили в темноте согласно стандартным методикам [267]. Учитывали следующие параметры: количество высаженных пыльников, долю (в процентах) пыльников с эмбриоидами и каллусом из микроспор и долю пыльников с каллусом из тычиночной нити. Взаимосвязь между размером бутонов и семенных зачатков у озимого и ярового рапса исследовали используя бутоны размером 2,0-7,0 мм, из которых выделяли семенные зачатки. С помощью окуляр-микрометра под микроскопом измеряли максимальную длину и ширину семязачатков. По каждому варианту изучали около 30 семенных зачатков. Для изучения влияния температурной обработки на способность семязачатков рапса к индукции новообразований соцветия с соответствующим размером бутонов выдерживали при пониженной температуре 4-6°C в течение 1-7 суток. Затем из бутонов выделяли семенные зачатки, высаживали на питательную среду и, после обработки повышенной температурой, культивировали в искусственных условиях при комнатной температуре. Анализировали количество и размер высаженных семязачатков, долю семязачатков с изменениями цвета и размера, а также их долю с наличием каллуса. 60 Идентификация гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса непрямыми методами. Для выявления различий между гаплоидами и удвоенными гаплоидами рапса, полученными через культуру пыльников, использовали цитологические и морфологические методы. Цитологические методы включали подсчет у анализируемых растений количества хромосом, количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и измерение их размера, а также подсчет количества устьиц на единицу площади [70]. После начала цветения растений в десяти повторностях анализировали такие морфологические характеристики цветков как диаметр цветка, длина и ширина лепестка и длина пыльника у гаплоидов, удвоенных гаплоидов и диплоидов. Временные давленые препараты готовили из точек роста и оснований молодых листочков. В качестве красителя использовали пропионолакмоид. Готовые препараты анализировали с помощью светового микроскопа ЛОМО с иммерсионным объективом при увеличении × 900. Оценка эффективности эмбриокультуры у подсолнечника. Во всех опытах при работе с зародышами подсолнечника руководствовались особенностями его биологии [75]. Поскольку цветение у подсолнечника дихогамное, то есть наблюдается разновременное созревание пыльников и рылец, при появлении в корзинке цветков рыльцевой фазы их принудительно опыляли вручную свежесобранной пыльцой того же генотипа. Остальные нераскрывшиеся цветки удаляли. До начала цветения растения изолировали индивидуальными изоляторами. В связи с тем, что промежуток времени от опыления до оплодотворения у сложноцветных не превышает нескольких часов, возраст зародышей отсчитывали со дня опыления. У 4-х суточного зародыша подсолнечника, который имеет длину около 1 мм, видны зародышевый корешок и семядоли. 9-11-ти суточный зародыш имеет длину 4-5 мм, 16-18-ти суточный – в два раза больше (8-9 мм). К 20-му дню после опыления зародыш уже полностью сформирован. 61 При изучении частоты выхода растений в зависимости от возраста культивируемых зародышей подсолнечника через 7-21 суток после принудительного самоопыления, в зависимости от представленного образца, из корзинок выделяли зародыши, поверхностно стерилизовали и высаживали в чашки Петри на искусственную питательную среду, представляющую собой модифицированную среду МС, в которой было вдвое снижено содержание макро- и микроэлементов и повышено содержание витаминов, в частности витамина B1. Зародыши культивировали в условиях 16-часового светового дня при температуре 2025°C. Через 7-14 суток культивирования учитывали долю зародышей (в процентах), которые образовали проростки от общего числа высаженных зародышей, а также долю зародышей, на которых сформировался каллус. После формирования проростков с наличием корневой системы растения переносили в почву и доращивали до стадии цветения. Перед цветением учитывали частоту растений (процент от числа высаженных зародышей), сформировавшихся из незрелых зародышей разного возраста. Для анализа проявления некоторых морфологических признаков у растений, полученных из зародышей разного возраста, в качестве материала использовали две линии подсолнечника ЗЛ-809 и ЗЛ-95, предоставленные лабораторией селекции межлинейных гибридов подсолнечника Института масличных культур. После принудительного самоопыления выделяли зародыши 8-10-суточного (1 неделя) и 14-16суточного (2 недели) возраста, промывали в растворе детергента 1-2 минуты, ополаскивали проточной водой 5-10 минут, стерилизовали 30 секунд в этиловом спирте и 20 минут в 5% растворе хлорамина, промывали стерильной водой и высаживали на искусственную питательную среду (1/2 МС) с добавкой витамина B1. Вначале зародыши культивировали 1 сутки в темноте, а затем на свету до их прорастания и формирования зеленых растеньиц (как правило, этот период составлял 7-10 дней). 62 Сформированные укорененные растения переносили в стерильный грунт в небольшие емкости и после двухнедельной акклиматизации их высаживали на опытном участке Института масличных культур. Учитывали начало цветения, а по окончании периода вегетации – высоту растений и длительность вегетационного периода. Кроме этого анализировали еще ряд морфологических признаков, таких как диаметр корзинки, количество семян в корзинке, угол наклона корзинки, морфотип листа и растения. При изучении зависимости выхода растений при доращивании in vitro незрелых 2-х недельных зародышей разных линий, выращенные в полевых условиях растения изолировали, принудительно самоопыляли, а через 2 недели выделяли семянки и стерилизовали в растворе хозяйственного отбеливателя на основе гипохлорита кальция или натрия. Затем зародыши высаживали на агаризованную среду МС-3 (среда МС с половинной концентрацией макросолей) и культивировали в стандартных условиях, указанных выше. Укоренившиеся через 9-13 дней проростки высаживали в почву и в дальнейшем выращивали в условиях фитотрона. По каждому генотипу подсчитывали количество полученных растений и количество завязавшихся семян в корзинке (среднее и максимальное число семян на корзинку), а также анализировали другие селекционно важные признаки – высоту растений и длительность периода всходы-цветение. Изучение особенностей каллусогенеза у подсолнечника. При изучении влияния типа экспланта и генотипа на образование каллуса у подсолнечника для получения эксплантов семена проращивали в стерильных условиях на агаризованной среде В-5 [194] с уменьшенным вдвое количеством макро- и микроэлементов, без витаминов и с уменьшенной до 1% концентрацией сахарозы. Через 10-14 дней культивирования у проростков отделяли гипокотили, семядоли и верхушечную меристему. Перед посадкой на среду гипокотили разделяли на сегменты 5-7 мм длиной, семядоли разрезали продольно надвое. 63 Использовали верхушечные меристемы размером 1-2 мм. Все экспланты высаживали в чашки Петри диаметром 6 см по 5-6 штук на агаризованную модифицированную среду МС с добавкой фитогормонов БАП и НУК. Каждую чашку (в количестве не менее трёх на вариант) рассматривали как повторность. Культивирование проводили на свету при комнатной температуре. Через каждые 5-7 дней определяли частоту образования каллусов и степень их развития, которую выражали следующим образом: + – каллус слабо развит, только начинает образовываться, ++ – нормально развит, +++ – хорошо развитый каллус по всей поверхности экспланта. Для выяснения роли питательной среды в поддержании стабильной каллусной культуры подсолнечника, каллус, полученный с эксплантов гипокотилей, культивировали на питательных средах разного базового состава (МС, N6) с разным содержанием фитогормонов (БАП, ИУК, НУК, ГК3). Культивирование проводили согласно стандартным методикам [267]. Один раз в 3-4 недели каллусы пересаживали на свежие среды, анализируя их состояние. В отдельном эксперименте с линией ЗЛ-22А, каллус, образовавшийся на эксплантах типа гипокотиль и семядоли, переносили на питательные среды с базовым составом по МС, отличающиеся по составу фитогормонов. Среда №10 – среда МС без гормонов, №11 – МС + 0,5 мг/л кинетина и 0,05 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК), №12 – МС + 1 мг/л бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК). В каждой чашке (отдельная повторность) культивировали 6 эксплантов. Каллус культивировали в течение 35 дней и каждую неделю оценивали его состояние. Учитывали площадь основания каллуса (измеряя максимальную длину и ширину в миллиметрах), степень его развития в баллах (0 – погибший, 5 – хорошо развитый, естественного зеленоватого или беловатого цвета) и долю «здорового» каллуса. 64 Изучение особенностей каллусогенеза у льна. Для введения в культуру in vitro семена 5-ти видов льна промывали в тканевых мешочках несколько минут водой с добавкой моющего средства, ополаскивали и поверхностно стерилизовали – вначале одну минуту в 70% этаноле, затем 20 минут в разбавленном (1:3) растворе хозяйственного отбеливателя «Белизна». После стерилизации семена ополаскивали 5-6 раз стерильной водой и помещали на агаризованную среду Гамборга-Эвелега В-5 с половинной концентрацией макро- и микросолей и без витаминов и регуляторов роста. Культивирование проводили в термостате при 25°С. После прорастания семян через 4-6 дней проростки разделяли на экспланты (сегменты гипокотиля 5-10мм длиной, верхушечные меристемы 2-3мм длиной и разрезанные на две части семядоли) и высаживали на среду N6, обогащенную 100 мг/л серина, 500 мг/л гидролизата лактальбумина, 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и по 0,1 мг/л α-нафтилуксусной (НУК) и индолил-3-уксусной (ИУК) кислот с 0,7% агара и 3% сахарозы. В дальнейшем высаженный материал (по 8 эксплантов в каждой чашке Петри) культивировали первые 7 дней в темноте при 25±1°С, а затем – на свету. Еженедельно проводили визуальный учет. Учитывали количество разбухших, но еще не давших каллуса эксплантов; эксплантов, которые только начали образовывать каллус и эксплантов с хорошо видимым каллюсом рыхлого или плотного типа. Через три недели экспланты пассировали на среду MС с теми же добавками, что и в среде N6, кроме гидролизата лактальбумина, где их культивировали в течение еще трех недель. Частоту каллусообразования подсчитывали как отношение количества эксплантов, на которых образовался каллус, к общему числу высаженных эксплантов. Сравнение проводили как между различными эксплантами в пределах генотипа, так и между генотипами. Индуцирование генетического разнообразия при действии мутагена на незрелые зародыши и семена подсолнечника. Элементы 65 технологии такой мутагенной обработки были апробированы нами ранее на незрелых семенах [236]. Растения двух линий подсолнечника выращивали в условиях теплицы и перед цветением изолировали. Через 9-11 и 14-16 суток после принудительного самоопыления из корзинок выделяли незрелые семянки с зародышами соответствующего возраста, обрабатывали их 0,02%-ным водным раствором этилметансульфоната (ЭМС) в течение 16-ти часов, отмывали водопроводной водой и стерилизовали 70%-ным этиловым спиртом, а затем водным раствором хлорамина Б. Зародыши освобождали от внешней оболочки и высаживали на модифицированную питательную среду МС с уменьшенным в два раза содержанием макроэлементов и увеличенным содержанием витаминов (B1 – в 10 раз, B6 и PP – в 2 раза). В контрольных вариантах манипуляции были такими же, за исключением того, что при обработке вместо ЭМС использовали дистиллированную воду. Зародыши культивировали в чашках Петри при 16-часовом фотопериоде и комнатной температуре до момента прорастания. Сформировавшиеся зеленые проростки высаживали в рыхлую почву в пластиковые стаканчики. После появления двух-трех пар настоящих листьев растения пересаживали в поле. Перед цветением растения изолировали, а во время цветения искусственно доопыляли. В течение вегетационного периода за растениями М1 вели фенологические наблюдения. Учитывали начало зацветания, длину вегетационного периода, высоту растений, характер пигментации, нарушения роста. Для оценки изучения эффективности влияния мутагенного фактора на исследуемый материал (зародыши двух линий разного возраста) изучали выживаемость растений, подсолнечника. С этой полученных целью в из конце незрелых зародышей вегетационного периода подсчитывали количество выживших растений и количество растений, которые завязали семена и сравнивали с числом высаженных зародышей. 66 Учитывали также разницу между количеством высаженных на питательную среду зародышей и количеством высаженных в поле растений, подготовленных in vitro для высадки в поле. На следующий год семена растений М1 посемейно высевали в поле для получения поколения М2. Каждая семья М2 – потомство одного растения М1. В поле каждая семья М2 насчитывала около 30 растений. Во время вегетации растений поколения М2 анализировали показатели всхожести семян, сроки цветения и созревания и другие видимые морфологические и физиологические признаки, по которым растения опытных вариантов отличались от контрольных. Всего в поколении М2 было проанализировано 145 семей линии ЗЛ809 (из них 115 после мутагенной обработки зародышей 14-16-суточного возраста) и 127 семей линии ЗЛ-95 (из них 65 семей после мутагенной обработки зародышей 14-16-суточного возраста и 32 семьи после мутагенной обработки зародышей 9-11-суточного возраста). Общее количество растений в М2 составило больше 8000. Перед цветением растения с предполагаемыми мутациями изолировали тканевыми изоляторами. После окончания вегетации вручную проводили сбор семян отдельно с каждого растения. Предварительную частоту мутаций в М2 (в процентах) определяли по количеству семей с видимыми изменениями морфологических и физиологических признаков соотнесенному к общему числу исследованных семей. Окончательную частоту мутаций в М2 устанавливали после подтверждения наследования измененного признака. Наследование измененных признаков, – предполагаемых мутаций, – проверяли в следующем, третьем поколении (М3). Для этого семена отобранных в М2 возможных мутантов подсолнечника посемейно высевали в полевых условиях. Каждая семья М3 представляла собой потомство одного растения, отобранного из семьи М2. Каждая семья была представлена однорядковыми делянками по 10-20 растений в каждой. На 67 основании подтверждения мутантной природы выделенных признаков устанавливали окончательную частоту морфологических и физиологических мутаций в М2. После подтверждении мутантной природы признака изолировали по 2-3 растения для дальнейшей работы с мутантами. Для выявления биохимических мутаций (масличность семян) в семьях М2 изолировали по 1-2 растения как правило с какими-либо изменениями на морфологическом уровне, например, «деформированный лист». После сбора урожая проводили анализ на масличность при помощи ЯМР-анализатора, сохраняющему семена интактными. Оценку проводили по пробе семян в 10 г. После выявления изменений в содержании масла для подтверждения мутантной природы данного биохимического признака семена отобранных в М2 растений высевали для получения следующего поколения М3. Одна семья М3 – потомство одного растения из М2 с измененными показателями масличности семян. Одновременно с отбором в М2 возможных мутантов в каждой семье этого поколения отбирали по несколько растений (чаще всего с морфозами листьев) для оценки мутационной изменчивости в М3. Потомство каждого такого растения и формировало семью М3. В этих семьях вели поиск растений, изолируя их, с отличающимися от контроля морфологическими и физиологическими признаками. При этом изменение, обнаруженное в данной семье в более раннем поколении (М2), не принималось во внимание. Поиск возможных мутаций в М3 вели и в семьях, где проводилось подтверждение выделенных в М2 возможных мутантов. Окончательную частоту и спектр мутаций в М3 устанавливали после подтверждения мутантной природы выделенного признака в М4. Вместе с работой по подтверждению мутантной природы признаков, выделенных в М2, во всех семьях М3 проводили визуальный учет возможных морфологических или физиологических мутаций, которые 68 раньше в М2 не выделялись. Перед цветением выявленные возможные мутантные растения искусственно изолировали, а в период цветения самоопыляли. Сбор семян проводили отдельно по каждому растению, вручную. Всего в М3 проанализировано около 900 семей двух генотипов. Одновременно с обработкой незрелых зародышей этилметансульфонатом обрабатывали и зрелые семена тех же линий подсолнечника – ЗЛ-809 и ЗЛ-95. Их замачивали в водном растворе мутагена 0,1%-ной концентрации также в течение 16-ти часов, отмывали водопроводной водой и высевали в грунт. По нашим данным [236] такая концентрация мутагена была оптимальной при индукции наследуемых изменений при его действии на незрелые семена подсолнечника. В дальнейшем все работы, от поколения М1 до поколения М3, на основании анализа которого судили об окончательной частоте и спектре мутаций в поколении М2, проводили так же, как и при обработке незрелых зародышей. Для более корректных выводов об эффективности обработки мутагеном незрелых зародышей использовали два типа контролей – замачивая в дистиллированной воде зародыши 9-11-ти и 14-16-ти суточного возраста и зрелые семена. Статистическая обработка данных. Данные обрабатывали статистически, используя программу MSTAT-C для ПК [253], Statistica [8] и MS Excel [7]. В таблицах в большинстве случаев данные представлены как средние со стандартной ошибкой. Существенность отличий оценивали методом однофакторного или двуфакторного дисперсионного анализа, а также используя t-критерий Стьюдента [24]. 69 РАЗДЕЛ 3 ЭФФЕКТИВНОСТЬ КАЛЛУСОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ЭКСПЛАНТОВ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР 3.1. Влияние типа экспланта и генотипа на образование каллуса у подсолнечника Использование лишь традиционных приемов оценки и отбора не способствует быстрому созданию исходного материала, который является основой любой селекционной работы. Различные биотехнологические методы, включая методы молекулярной генетики, в настоящее время находят все более широкое применение в растениеводстве. Так, культуры клеток и тканей используются не только для теоретических исследований в области физиологии или генетики, но находят свое применение и для создания новых форм и генотипов, которые используются как исходный материал при создании сортов и гибридов сельскохозяйственных растений. Получение каллусных культур и их оптимизация являются важным и часто необходимым условием в разработке технологий с использованием культур in vitro. Данные исследования уже давно проводятся для ряда культур, в частности, и для подсолнечника [263, 312], продукты переработки которого интенсивно применяются в самых разных областях народного хозяйства. Подсолнечник – одна из наиболее важных и широко используемых масличных культур в мире. В связи с этим для данной культуры разрабатываются различные подходы, позволяющие создавать новые формы более используются быстрыми темпами. Биотехнологические на подсолнечнике достаточно широко, методы в частности, культура клеток, при помощи которой можно проводить отбор устойчивых 70 к различным стрессовым факторам генотипов [274, 276, 286]. Для того, чтобы проводить подобные исследования, необходимо иметь стабильную каллусную культуру с возможностью дальнейшей регенерации из нее полноценных растений. Условия культивирования каллуса подсолнечника изучались разными исследователями [242, 261, 271]. Однако, учитывая тот факт, что различные генотипы подсолнечника по-разному реагируют на культивирование на искусственной среде, приходится в каждом случае дорабатывать условия культивирования их эксплантов. В связи с этим вопросы оптимизации получения культуры регенерационного каллуса, потенциала ее поддержания, являются актуальными сохранения и требуют дальнейшей доработки для конкретных генотипов, представляющих интерес для селекции. Кроме того, различные типы эксплантов образуют каллус с разной частотой. Целью нашей работы было изучить частоту образования каллуса и степень его развития в зависимости от типа экспланта и генотипа у подсолнечника, а также установить подходящую искусственную питательную среду для получения каллуса подсолнечника из эксплантов селекционно-ценной линии ЗЛ-22А. В опыте по изучению частоты образования каллуса и степени его развития в зависимости от генотипа и от типа экспланта у подсолнечника в качестве материала использовали 5 образцов подсолнечника: гибрид F1 ЗЛ-22 × ЗЛ-678, его родительские линии ЗЛ-22А и ЗЛ-678, а также линии ЗЛ-102 и ЗЛ-165, имеющие селекционную ценность и использующиеся в качестве родительских компонентов ряда гибридов. Семена данных образцов проращивали в стерильных условиях на агаризованной среде В-5 с уменьшенным вдвое количеством макро- и микроэлементов, без витаминов и с концентрацией сахарозы, равной 1%. Через 10-14 дней культивирования у проростков отделяли гипокотили, семядоли и 71 верхушечную меристему. Гипокотили делили на сегменты 5-7 мм длиной, семядоли разрезали надвое, меристемы вычленяли размером 1-2 мм. Все экспланты высаживали в чашки Петри диаметром 6 см по 5-6 штук на агаризованную модифицированную среду МС с добавкой фитогормонов БАП и НУК в концентрациях, стимулирующих каллусообразование. По каждому варианту высаживали не менее трёх чашек, которые рассматривали как повторности. Экспланты культивировали на свету при комнатной температуре. Через каждые 5-7 дней производили учет эксплантов, образовавших каллусы, и определяли степень развития каллусов (+ – каллус слабо развит, только начинает образовываться, ++ – нормально развит, +++ – хорошо развитый каллус по всей поверхности экспланта). С целью определения наиболее подходящей питательной среды для получения и культивирования каллуса подсолнечника каллус линий ЗЛ22А, ЗЛ-102 и ЗЛ-165, полученный с эксплантов типа гипокотиль, культивировали еще и на питательных средах разного базового состава (МС [246], N6 [165]) с разным содержанием фитогормонов (БАП, ИУК, НУК, ГК3). Культивирование проводили согласно стандартным методикам [267]. При необходимости каллусы раз в 3-4 недели пересаживали на свежие среды, анализируя их состояние. Что касается линии ЗЛ-22А, то образовавшийся на эксплантах типа гипокотиль и семядоли каллус этой линии переносили на питательные среды с базовым составом согласно среды МС, но отличающиеся по составу фитогормонов. Среда №10 – среда МС без гормонов, №11 – МС + 0,5 мг/л кинетина и 0,05 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК), №12 – МС + 1 мг/л бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК). Каждую чашку, в которой культивировали 6 эксплантов, рассматривали как повторность. Каллус культивировали в стандартных условиях в течение 35 дней, проводя каждую неделю необходимые 72 измерения. Подсчитывали площадь основания каллуса, определяли степень его развития в баллах (0 – погибший, 1 – погибающий, с многочисленными некротическими участками, 2 – слабо развитый, с отдельными некротическими участками, 3 – среднего развития, без некротических участков или с отдельными участками неестественной окраски, 4 – нормально развитый, естественной окраски, иногда с отдельными участками желто-коричневатого цвета, 5 – хорошо развитый, достаточно плотный, естественного зеленоватого или беловатого цвета) и долю здорового каллуса. Данные по повторностям суммировали (исключая заразившиеся чашки некоторых вариантов) и обрабатывали статистически при помощи программ статистической обработки данных Statistica и MS Excel. При культивировании эксплантов гибрида F1 ЗЛ-22 × ЗЛ-678 и его родительских компонентов каллус начинал образовываться уже через 5 дней после посадки. Различия между генотипами лучше всего видны в период культивирования, не превышающий 7 дней. При этом у гибрида F1 частота каллусообразования на всех типах эксплантов, кроме семядолей, была существенно выше, чем у отцовской родительской формы ЗЛ-678 и незначительно выше, чем у материнской формы ЗЛ-22А (табл. 3.1). Вышесказанное может указывать на проявление гибридной силы по данному признаку. В дальнейшем (через 14 дней и более) практически все типы эксплантов у всех генотипов образовывали каллус. Исключение составила лишь линия ЗЛ-22А, у которой даже через 21 день культивирования каллус на меристемах образовывался в 60% случаев. Однако данные отличия можно объяснить в некоторой степени малой величиной выборки, которая в данном случае составила 5 эксплантов (1 повторность). 73 Таблица 3.1 Частота каллусообразования на эксплантах разного типа у гибрида подсолнечника и его родительских компонентов Дней в культуре ЗЛ-678 Всего эксплантов, шт Частота каллусообразования, % ЗЛ-22А Всего эксплантов, шт Частота каллусообразования, % F1 ЗЛ-22 × ЗЛ678 Всего эксплантов, шт Частота каллусообразования, % Гипокотиль 5 48 2,1±2,06 bc, 3 19 21,1±9,35 c 20 45,0±11,12 1 7 48 50,0±7,22 b, 3 19 68,4±10,66 c 20 85,0±7,98 1 14 48 100,0 19 100,0 20 100,0 21 48 100,0 19 100,0 20 100,0 28 48 100,0 19 100,0 20 100,0 Семядоли 5 49 79,6±5,76 ac, 3 21 42,9±10,80 c 28 50,0±9,45 1 7 49 98,0±2,02 ac, 3 21 66,7±10,29 c 28 64,3±9,06 c, 1 14 49 100,0 21 95,2±4,65 c 28 100,0 21 49 100,0 21 100,0 28 100,0 28 49 100,0 21 100,0 28 100,0 Апикальная меристема 5 19 26,3±10,10 ab 5 0,0 ab, 3 8 62,5±17,12 2 7 19 63,2±11,07 a, 3 5 0,0 ab, 3 8 100,0 b, 12 14 19 100,0 5 0,0 b, 3 8 100,0 2 21 19 100,0 5 60,0±21,91 8 100,0 28 19 100,0 5 80,0±17,89 8 100,0 Примечания: 1. 1 2 3 – Различия между F1 и линиями значимы на уровне значимости 5%. 2. a b c – Различия между эксплантами внутри генотипа значимы на уровне значимости 5%. 74 Разные типы эксплантов имели различия по частоте каллусообразования также в основном в начальные периоды развития (5-7 дней). Здесь, как и в предыдущем случае, наблюдалась существенная зависимость от генотипа. Так, для родительских линий ЗЛ-678 и ЗЛ-22А лучше и быстрее всего каллус образовывался на семядолях, в сравнении с гипокотилями и меристемами. У гибрида же лучшим типом эксплантов оказались меристемы. Только на данном типе эксплантов через 7 дней каллус образовывался в 100% случаев. Гипокотили и семядоли образовывали каллус с такой частотой лишь на неделю позже (см. табл. 3.1). Что касается степени развития каллуса, то на нее существенно влиял тип экспланта (табл. 3.2). В течение первых 7-ми дней культивирования лучше всего каллус развивался на семядолях (табл. А.1 Приложения). Именно на данном типе экспланта у всех изученных генотипов было больше всего нормально развитого каллуса (очень хорошо развитого каллуса не было ни на одном типе экспланта). Однако в дальнейшем ситуация резко изменилась. В конце исследуемого периода (через 28 дней) больше всего хорошо развитого каллуса наблюдалось на гипокотилях и меристемах. Семядоли же оказались худшим из эксплантов в этом отношении. Особенно хорошо это видно у линии ЗЛ-678 и гибрида F1 ЗЛ-22 × ЗЛ-678. Влияние генотипа и здесь было сильно заметным. Так, например, на 28-й день культивирования меристем у линии ЗЛ-22А не отмечено образования очень хорошего каллуса, у линии ЗЛ-678 его было около 70%, а у гибрида весь каллус, который образовался, был хорошо развит. Данные таблицы 3.2, как и в отношении частоты каллусообразования, позволяют говорить о преимуществе гибрида над его родительскими формами по признаку «степень развития каллуса». Так, на 14-й день на гипокотилях 75 линии ЗЛ-22А доля каллусов с хорошим развитием составила 26%, на гипокотилях линии ЗЛ-678 – 2%, а у гибрида – 75%. Таблица 3.2 Доля каллусов с разной степенью развития на эксплантах разного типа у подсолнечника, % + ++ +++ 27,1±6,41 70,8±6,56 2,1±2,06 28 6,3±3,49 35,4±6,90 58,3±7,12 14 8,2±3,91 89,8±4,32 2,0±2,02 28 8,3±3,99 43,8±7,16 47,9±7,21 14 0,0 73,7±10,10 26,3±10,10 28 0,0 26,3±10,10 73,7±10,10 14 73,7±10,10 26,3±10,10 73,7±10,10 28 15,8±8,37 84,2±8,37 15,8±8,37 14 60,0±10,95 35,0±10,67 5,0±4,87 28 23,8±9,29 42,9±10,80 33,3±10,29 14 0,0 0,0 0,0 28 100,0 0,0 0,0 14 0,0 25,0±9,68 75,0±9,68 28 0,0 0,0 100,0 14 32,1±8,8 64,3±9,06 3,6±3,51 28 7,1±4,87 75,0±8,18 17,9±7,24 14 37,5±17,12 62,5±17,12 37,5±17,12 28 0,0 100,0 0,0 НСР0,05 14 дней 46,44 58,23 51,07 НСР0,05 28 дней 71,89 42,14 80,13 Генотип Тип экспланта ЗЛ-678 Гипокотиль Семядоли Меристема ЗЛ-22А Гипокотиль Семядоли Меристема F1 ЗЛ-22 Гипокотиль × ЗЛ-678 Семядоли Меристема @ Степень развития каллуса@ Дней в культуре 14 – + - каллус слабо развит, ++ - нормально развит, +++ - очень хорошо развит. 76 Лучшая способность к каллусообразованию эксплантов гибрида по сравнению с родительскими линиями может быть обусловлена тем, что, как указывают некоторые авторы [271], способность к высокой отзывчивости в культуре in vitro определяется аддитивно-доминантным действием генов. В частности у кукурузы установлено, что признак "регенерационная способность наследуется при межвидовых скрещиваниях, успешно поддается отбору и при скрещиваниях передается как доминантный [117]. По мнению Т.А. Ежовой [27], способность культивируемых клеток к каллусогенезу, органообразованию и соматическому эмбриогенезу зависит от активности генов, детерминирующих меристематическое состояние клеток и уровень фитогормонов в клетках, а также от активности генов, контролирующих различные этапы морфогенеза растений. В нашем случае, вероятно, обе родительские формы определенные, отзывчивости но разные, данных гены, генотипов благоприятствующие к индукции несут повышенной каллусообразования. Полученные данные согласуются с данными других авторов, указывающих на существующие различия в реакции генотипов на индукцию каллусообразования и регенерационные процессы [108, 112, 261]. Вместе с тем некоторые авторы отмечают, что генотип имеет меньшее влияние на процессы каллусогенеза чем состав питательной среды [108]. Поскольку при работе с гибридом F1 ЗЛ-22 × ЗЛ-678 и его родительскими линиями было установлено, что при использовании в качестве экспланта гипокотиля каллус развивался достаточно хорошо, одну из этих линий (ЗЛ-22А), а также две другие линии подсолнечника использовали для выяснения роли состава искусственной питательной среды при развитии каллуса. Результаты культивирования каллуса из гипокотиля трех самоопыленных линий подсолнечника (генотипы ЗЛ-22А, ЗЛ-169 и ЗЛ-102) на двух средах после первого и второго пассажей приведены в табл. 3.3. 77 Таблица 3.3 Влияние состава питательной среды на формирование каллуса из гипокотиля различных линий подсолнечника Пас- Всего Развитых каллусов Всего развитых саж каллусов, большого размера каллусов шт. шт. % шт. % Среда МС Генотип ЗЛ-102 I 60 0 0 0 0 II 54 0 0 16 29,6±6,21 Генотип ЗЛ-22А I 60 27 45,0±6,42 42 70,0±5,91 II 60 43 71,7±5,81 60 100 11 13,1±10,17 Генотип ЗЛ-169 I 84 0 0 Среда N6 Генотип ЗЛ-102 I 54 0 0 0 0 II 48 0 0 22 45,8±7,19 Генотип ЗЛ-22А I 60 21 35,0±6,15 35 58,3±6,36 II 60 21 35,0±6,15*** 60 100 17 21,8±10,01 Генотип ЗЛ-169 I 78 0 0 Примечание. *** – отличия между средами существенны при p<0,1%. Из данной таблицы видно, что развитие каллуса существенно зависело от генотипа. Так, у линии ЗЛ-22А во втором пассаже на обеих средах было 100% развитых каллусов. У линии ЗЛ-102 таких каллусов во втором пассаже было менее 50%, а в первом пассаже их не было совсем. 78 Выявлено также существенное различие между средами, которые использовали для культивирования каллусов. Так, на среде МС у линии ЗЛ22А было 71.7% каллусов большого размера, тогда как на среде N6 их было вдвое меньше. К каллусам большого размера относили те каллусные образования, которые по диаметру превышали 10 мм. Как правило, после двух пассажей регенерации из каллусов на исследованных средах не наблюдалось. Тем не менее, в единичных случаях на эксплантах типа гипокотиль отмечали регенерацию побегов подсолнечника даже в первом пассаже (рис. 3.1). Рис. 3.1. Регенерация побегов из каллусной ткани, развившейся на эксплантах гипокотилей подсолнечника Степень развития каллуса на различных питательных средах исследовали у линии ЗЛ-22А. Из данных, представленных в таблице 3.4, видно, что хотя каллус у линии ЗЛ-22А и образовывался на трех изученных средах, однако имелись определенные отличия по характеру роста каллуса. 79 Эти различия лучше заметны при более длительных сроках культивирования. Больше каллуса, судя по площади его основания, образовывалось на среде с добавлением фитогормонов, чем на базовой среде без гормонов. Данные закономерности были характерны для обоих типов эксплантов – гипокотилей и семядолей. Варианты сред, где фитогормоны присутствовали, также различались между собой. Более существенными эти различия были при культивировании эксплантов типа гипокотили и весьма незначительными при культивировании семядолей. В обоих случаях питательная среда, содержащая БАП и НУК, оказалась лучшей по сравнению со средой с кинетином и ИУК. Состав среды достаточно сильно влиял и на степень развития каллуса. Как и в предыдущем случае, среды с добавлением гормонов оказались предпочтительнее. В течение практически всего срока культивирования каллусы на данных средах были достаточно плотными, сильнее развитыми, без или с единичными некротическими участками, естественного зеленоватого цвета. Различия не наблюдались лишь на начальных этапах роста. Следует отметить, что с увеличением срока культивирования каллус начинал деградировать, появлялись темные участки, которые прекращали развитие, а в дальнейшем – отмирали. Это приводило к тому, что степень развития каллуса, оцениваемая в баллах, постепенно ухудшалась, начиная с четвертой недели культивирования. Вероятно, большая часть питательных веществ среды к этому времени была уже использована. Особенно это было заметно в случае культивирования семядолей. Каллус на гипокотилях даже через месяц выглядел значительно лучше. На рисунке 3.2 наглядно видно, что к концу изучаемого периода (35 дней) доля здорового (пролиферирующего) каллуса, без потемневших или отмирающих участков, существенно уменьшалась, причем особенно 80 резким это снижение было после 28 дней культивирования. Каллус, образовавшийся на семядолях через 35 дней, визуально выглядел значительно хуже, чем каллус, развившийся на гипокотилях. На среде с добавкой БАП и НУК доля каллуса из эксплантов типа гипокотиль без видимых признаков деградации оставалась почти на исходном уровне и в несколько раз превышала долю здорового каллуса на других испытывавшихся средах. 80 80 семядоли гипокотили 70 10 70 11 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 12 0 14 21 28 35 Срок культивирования, суток Срок культивирования, дней 14 21 28 35 Сроккультивирования, культивирования,суток дней Срок Рис. 3-2. Доля здорового каллуса в зависимости от срока культивирования гипокотилей и семядолей подсолнечника линии ЗЛ-22А на различных питательных средах (№ 10-12) 81 Таблица 3.4 Развитие каллуса подсолнечника линии ЗЛ-22А в зависимости от питательной среды и срока культивирования Среда (шифр) Площадь основания каллуса, Степень развития каллуса, мм2 балл (0-5) 14 дней 21день 28 дней 35 дней 14 дней 21день 28 дней 35 дней Семядоли 10 (a) 58,6±2,55 57,0±2,41с 57,8±2,60с 56,2±2,64с 3,0±0,07 3,0±0,11вс 2,3±0,13вс 1,7±0,15вс 11 (b) 61,3±2,67 59,8±3,16 61,0±3,37 60,4±3,51 2,9±0,08 3,4±0,13ас 3,1±0,15ас 2,2±0,13а 12 (c) 65,0±3,17 66,7±3,55а 67,4±3,66а 66,6±3,76а 3,1±0,04 3,8±0,09ав 3,6±0,09ав 2,5±0,16а Гипокотили 10 (a) 54,4±1,37с 52,0±0,78в 52,0±0,78вс 49,5±1,00с 3,4±0,09 3,6±0,10в 3,5±0,11 3,1±0,07с 11 (b) 51,8±1,21с 47,6±1,47ас 48,0±1,58ас 47,1±1,62с 3,4±0,10 3,4±0,09ас 3,4±0,10с 3,1±0,10с 12 (c) 62,3±2,03ав 57,0±2,49в 59,7±2,83ав 61,0±2,97ав 3,6±0,10 3,9±0,12в 3,8±0,14в 3,5±0,13ав Примечание. а,в,с – различия между средами в пределах экспланта значимы при p<5%. 82 Полученные данные вполне согласуются с результатами других авторов [108], показавших, что состав питательной среды является решающим фактором для успешной индукции каллусообразования. Поскольку каллус изученных образцов подсолнечника через 21-28 дней выращивания начинает деградировать, для нормальной работы с каллусными культурами его необходимо пассировать не позже чем через четыре недели. В противном случае доля здорового каллуса резко уменьшается, что в дальнейшем может негативно сказываться на его регенерационной способности. Таким образом, установлена генотип-специфическая реакция на начальном этапе развития каллуса подсолнечника, а также существенные различия по степени развития каллуса во время его дальнейшего культивирования на различных средах. Выявлено лучшее развитие каллуса из гипокотилей и семядолей подсолнечника на среде с добавлением фитогормонов БАП и НУК, чем на средах без гормонов или с содержанием других гормонов. Этот лучший каллус характеризовался большей площадью основания и более высоким баллом степени развития. Каллус подсолнечника, образовавшийся на гипокотилях, по сравнению с каллусом, образовавшимся на семядолях, дольше сохраняет высокую жизнеспособность на индукционной питательной среде – четыре недели по сравнению с тремя неделями. Как по частоте каллусообразования, так и по степени развития каллуса отмечено преимущество гибрида над его родительскими формами. Различия в каллусообразовании, как между генотипами, так и между разными типами эксплантов, наблюдались, в основном, в начальные сроки культивирования. 83 3.2. Каллусообразование у некоторых однолетних видов льна Род Linum L. известен в основном благодаря культурному льну Linum usitatissimum L., который выращивается во многих странах с умеренным климатом для получения волокна и масла. Известны и другие виды этого рода, в основном дикорастущие, привлекающие исследователей как источники ценных признаков, либо как высокодекоративные растения. Основными направлениями в селекции льна являются создание новых форм с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, измененным биохимическим составом, высокопластичных, с более высоким выходом волокна и масла. Улучшение селекционной работы с данной культурой предполагает проведение различных генетических манипуляций, основанных на использовании биотехнологических методов. Использование технологий in vitro позволяет значительно быстрее отбирать ценные генотипы вследствие возможности применить высокое селекционное давление в широкой популяции каллусных клеток или протопластов. Культура каллуса важна и с точки зрения проведения генетической трансформации (для прямого ввода нужной ДНК в исходный геном), что позволяет включать в уже готовые сорта лишь необходимые гены [139]. В культуре in vitro лен известен уже несколько десятилетий [144, 195], однако в большинстве работ материалом для экспериментов служили различные образцы льна культурного [6, 38]. Исследований, в которых изучались бы другие виды льна, значительно меньше [137, 233], хотя они имеют несомненную практическую значимость. В связи с этим, представляло интерес изучение процесса каллусообразования из эксплантов разного типа у культурного и ряда диких видов льна. В качестве материала для исследований использовали пять видов льна – четыре дикорастущих (L.angustifolium Huds. (n=15), L.grandiflorum Desf. (n=8), L.hispanicum Mill. (n=15), L.pubescens Banks & Solander(n=8)) и один 84 культурный (L.usitatissimum L. (n=15), сорт Айсберг), любезно предоставленные лабораторией селекции и генетики льна ИМК НААН. Семена данных видов промывали в марлевых мешочках несколько минут мыльной водой, ополаскивали, помещали на одну минуту в 70% этанол, а затем на 20 минут в разбавленный (1:3) раствор хозяйственного отбеливателя «Белизна». После стерилизации семена ополаскивали 5-6 раз стерильной водой и переносили для проращивания на агаризованную среду B-5 половинной концентрации без витаминов и гормонов. Через 4-6 дней в термостате при 25°С семена прорастали, образуя небольшой сеянец с раскрывшимися семядолями. Проростки разделяли на экспланты (гипокотили, разрезанные на сегменты 5-10мм длиной, верхушечные меристемы длиной 2-3мм и семядоли, каждую из которых разрезали на две части) и высаживали на среду N6, содержащую 100 мг/л серина, 500 мг/л гидролизата лактальбумина, 0,7% агара, 3% сахарозы, 1 мг/л 6- бензиламинопурина (БАП) и по 0,1 мг/л α-нафтилуксусной (НУК) и индолил-3-уксусной (ИУК) кислот. В каждую чашку Петри диаметром 60мм, которую рассматривали как повторность, помещали 8 эксплантов. В дальнейшем высаженный материал культивировали в темноте при 25±1°С первые 7 дней, а затем – на свету. Каждую неделю проводили визуальный учет. Учитывали количество разбухших, но еще не давших каллуса эксплантов; эксплантов, которые только начали образовывать каллус (в данном случае тип каллуса еще не был четко выражен) и эксплантов с хорошо видимым каллусом рыхлого или плотного типа. Через три недели культивирования экспланты пересаживали на среду МС с теми же добавками, что и в среде N6, кроме гидролизата лактальбумина, где их культивировали в течение еще трех недель. Частоту каллусообразования подсчитывали как отношение количества эксплантов, на которых образовался каллус, к общему числу высаженных эксплантов. Сравнивали между собой как различные экспланты в пределах генотипа, так и 85 генотипы, основываясь на критерии НСР, рассчитанном методом дисперсионного анализа ANOVA-2 [253]. Из полученных данных видно, что в первом пассаже на среде N6 в течение первых семи дней культивирования каллус не образовывался. Ни у одного из изученных генотипов на всех типах эксплантов не наблюдалось каллусообразования (табл. 3.5, табл. А.2 Приложения), хотя большинство эксплантов и сильно набухли. Различия между изучавшимися видами льна начали проявляться лишь на десятый день пребывания эксплантов в искусственных условиях, когда у большинства видов, кроме L.hispanicum Mill., начал образовываться каллус на семядолях, а, в некоторых случаях, и на гипокотилях и меристемах. Через 14 дней культивирования каллус начал формироваться уже на всех типах эксплантов, при этом были заметны отличия как между типами эксплантов, так и между генотипами. У всех видов в первом пассаже каллус лучше всего образовывался на семядолях и значительно хуже – на гипокотилях и меристемах. Что касается генотипов, то на семядолях через 14 дней процент каллусообразования был наивысшим у культурного вида льна L. usitatissimum L. (93,8%), причем он значимо отличался от других видов. Несколько хуже образовывался каллус у L. grandiflorum Desf. и L. hispanicum Mill., а самым низким процент каллусообразования был у видов L. angustifolium Huds. (35,0%) и L. pubescens Banks & Solander (30,0%). Пассирование эксплантов на модифицированную питательную среду МС благоприятно отразилось на их общем состоянии. Так, например, у L. pubescens Banks & Solander через семь дней культивирования семядолей эксплантов с незначительным количеством каллуса было 32,5%, а эксплантов с хорошо развитым каллусом – 67,5%. Через 14 дней доля эксплантов, на которых каллус был нормально развит, составила уже 92,5%, и лишь на 7,5% семядолей каллус оставался на начальной стадии развития. 86 Таблица 3.5 Частота каллусообразования на эксплантах разного типа у видов льна L.hispanicum Mill. и L.usitatissimum L. на модифицированной среде N6 Вид Тип экс- Кол-во Дней в Частота планта эксплан- куль- каллусообразования тов, туре шт. Гипокотиль L.hispanicum Семядо- Mill. ля Меристема Гипокотиль L.usitatissimum Семядоля L. Меристема шт. % 40 7 0 0,0 40 14 3 7,5 40 21 5 12,5 40 7 0 0,0 40 14 20 50,0 40 21 26 65,0 40 7 0 0,0 40 14 4 10,0 40 21 6 15,0 40 7 0 0,0 40 14 18 45,0 40 21 31 77,5 32 7 0 0,0 32 14 30 93,8 32 21 32 100,0 21 7 0 0,0 21 14 8 38,1 21 21 12 57,1 Примечания: НСР0,05 для эксплантов разного типа на 14-й день культивирования = 17,02%. НСР0,05 для эксплантов разного типа на 21-й день культивирования = 22,08%. К концу первой недели культивирования на среде МС количество эксплантов, которые образовали каллус, было довольно высоким и в ряде 87 случаев составляло 100%. В начале культивирования эксплантов льна во втором пассаже самая высокая частота каллусообразования была отмечена у видов L.angustifolium Huds., L.grandiflorum Desf. на гипокотилях, а у видов L.hispanicum Mill., L.pubescens Banks & Solander и L.usitatissimum L. – на семядолях, и лишь у вида L.usitatissimum L. – на меристемах. В дальнейшем, в процессе культивирования эксплантов гипокотилей количество тех эксплантов, которые не образовали каллус совсем, уменьшалось у таких видов как L. hispanicum Mill., L. pubescens Banks & Solander, L. usitatissimum L. На семядолях же и меристемах у всех изучавшихся видов каллус больше не образовывался, а лишь продолжалось его развитие (табл. 3.6, 3.7, А.3 Приложения). Образование каллуса быстрее всего проходило на гипокотилях у вида L.hispanicum Mill., у которого уже через 14 дней культивирования все экспланты образовали каллус. У L.usitatissimum L. 100%-ная частота каллусообразования отмечена после 21 дня роста на питательной среде. Хуже всего в этом отношении проявил себя вид L.pubescens Banks & Solander, часть гипокотилей которого (15%) так и не образовали каллус за время проведения эксперимента, они лишь сильно увеличились в размерах и разбухли (табл. 3.6). В итоге можно отметить, что с наименьшей частотой образование каллуса шло на эксплантах гипокотилей у вида L.pubescens Banks & Solander, на эксплантах типа «семядоли» – у видов L.angustifolium Huds. и L.grandiflorum Desf., на эксплантах типа «меристемы» – у видов L.angustifolium Huds., L.grandiflorum Desf., L.hispanicum Mill., L.pubescens Banks & Solander. Это свидетельствует о том, что меристемы являются наименее пригодным типом эксплантов, если стоит задача получить максимальное количество каллуса. Вероятно, гормональный статус клеток данного типа эксплантов препятствует быстрому дедифференцированию тканей, и для образования на них каллуса требуется либо более длительное 88 время культивирования, либо повышенный фон фитогормонов в среде культивирования. Гипокотили и семядоли в целом быстрее и лучше образуют каллус. Таблица 3.6 Состояние эксплантов гипокотиля у различных видов льна на модифицированной среде МС Состояние эксплантов, % Вид Дней в с небольшим разбухших, с рыхлым с плотным кульколичеством каллусом каллусом туре без каллуса каллуса 7 0,0 67,5 12,5 20,0 14 0,0 65,0 12,5 22,5 21 0,0 65,0 12,5 22,5 7 0,0 7,5 67,5 25,0 14 0,0 2,5 27,5 70,0 21 0,0 2,5 27,5 70,0 7 30,0 70,0 0,0 0,0 14 0,0 100,0 0,0 0,0 21 0,0 100,0 0,0 0,0 L.pubescens 7 20,0 67,5 0,0 12,5 Banks & 14 15,0 42,5 22,5 20,0 Solander 21 15,0 42,5 22,5 20,0 7 20,0 25,0 55,0 0,0 14 7,5 20,0 50,0 22,5 21 0,0 15,065 60,0 25,0 L.angustifolium Huds. L.grandiflorum Desf. L.hispanicum Mill. L.usitatissimum L. НСР0,05 между генотипами по плотному каллусу на 14-й и 21-й дни культивирования = 2,46%. 89 Таблица 3.7 Состояние эксплантов от семядолей у различных видов льна на модифицированной среде МС Состояние эксплантов, % Вид Дней в с небольшим куль- разбухших, количеством с рыхлым с плотным каллусом каллусом туре без каллуса каллуса 7 2,5 10,0 72,5 15,0 14 2,5 10,0 22,5 65,0 21 2,5 10,0 22,5 65,0 7 2,5 77,5 10,0 10,0 14 2,5 77,5 5,0 15,0 21 2,5 77,5 5,0 15,0 7 0,0 17,5 72,5 10,0 14 0,0 32,5 20,0 47,5 21 0,0 32,5 20,0 47,5 L.pubescens 7 0,0 32,5 37,5 30,0 Banks & 14 0,0 7,5 45,0 47,5 Solander 21 0,0 7,5 45,0 47,5 7 0,0 68,8 31,3 0,0 14 0,0 62,5 37,5 0,0 21 0,0 62,5 37,5 0,0 L.angustifolium Huds. L.grandiflorum Desf. L.hispanicum Mill. L.usitatissimum L. НСР0,05 между генотипами по плотному каллусу на 14-й и 21-й дни культивирования = 2,30%. Анализируя состояние каллуса после повторного пассирования, следует отметить, что по сравнению с семядолями и гипокотилями каллус от меристем характеризовался наилучшим развитием, при этом доля эксплантов с плотным каллусом составляла 90% и более у всех изученных 90 видов. Каллус, образовавшийся на эксплантах семядолей и гипокотилей, был более рыхлым. При сравнении изученных видов льна видно, что у L.usitatissimum L. на момент окончания эксперимента экспланты всех типов образовали каллус с частотой 100%. У вида L.hispanicum Mill. каллус не образовывался в некоторых случаях лишь на меристемах (5%). У видов L.angustifolium Huds. и L.grandiflorum Desf. каллус лучше всего образовывался при использовании в качестве эксплантов гипокотилей, а у вида L.pubescens Banks & Solander – семядолей. Такая специфическая реакция разных генотипов на культуру in vitro неоднократно отмечалась исследователями [34, 73, 161] и свидетельствует о необходимости в ряде случаев подбора индивидуальных условий культивирования для отдельных генотипов. В целом установлено, что у всех изученных видов льна на первичных эксплантах семядолей, в отличие от гипокотилей и меристем, инициация каллусообразования происходит быстрее. При этом у дикорастущих видов частота каллусообразования различна и значительно меньше чем у культурного льна. В то же время каллус, полученный из эксплантов апикальных меристем, был более плотным, т.е. характеризовался наилучшим развитием, тогда как каллус семядолей и гипокотилей, был рыхлого типа. Длительное культивирование эксплантов всех типов значительно увеличивало частоту каллусообразования у изученных видов льна. Результаты, представленные в данной главе, отражены в монографии «Ботанические и цитогенетические особенности видов рода Linum L. и биотехнологические пути работы с ними» [49], а также в других публикациях автора [11, 12, 28, 88, 92, 99]. 91 РАЗДЕЛ 4 РАЗРАБОТКА МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ И УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО Лен является важной культурой во многих странах с умеренным климатом и возделывается как для получения натуральных волокон, так и для производства льняного масла, особенно широко применяющегося в промышленности [31, 143]. Новые сорта льна с уменьшенным количеством линоленовой кислоты представляют большую ценность как продукт питания. И хотя в настоящее время на Украине лен еще не возделывается так широко, как он того заслуживает, однако из года в год посевы льна расширяются и на 2012 г они составляли около 50 тыс. га. Селекция льна могла бы быть значительно ускорена при использовании биотехнологических приемов и, в частности, за счет получения гаплоидов или удвоенных гаплоидов, а из них – ценных гомозиготных линий. У льна масличного гаплоиды и удвоенные гаплоиды можно получать с помощью ряда методов, таких, как полиэмбриония (с использованием близнецовых растений), опыление чужеродной пыльцой, отдаленная гибридизация, культура пыльников [25, 73]. При этом стабилизация генома, на которую при традиционной селекции уходит обычно 4-6 лет, с применением биотехнологии достигается в течение одного поколения [60, 175] и в дальнейшем можно сосредоточиться уже на оценке и отборе форм с нужными характеристиками, а не тратить усилия на получение константного нерасщепляющегося материала. В случае использования в качестве доноров гаплоидных клеток гибридов F1, получаемые удвоенные гаплоиды сразу представляют собой нерасщепляющиеся селекционные линии, которые при наличии ряда хозяйственно-важных признаков могут использоваться и как готовые сорта. 92 Особенно перспективен такой подход для получения сортов с измененным биохимическим составом масла и шрота, устойчивых к неблагоприятным температурным воздействиям, гербицидам, тяжелым металлам, засолению и ряду других факторов [144]. Одним из наиболее интенсивно используемых методов получения гаплоидов является культура пыльников и изолированных микроспор (незрелой пыльцы). Тем не менее, исследования, посвященные культуре микроспор льна, единичны и существенного прогресса в этом направлении пока не наблюдается [163]. В настоящее время у данной культуры более реально получать гаплоиды через культуру пыльников. Однако и в этом случае гаплоиды (или удвоенные гаплоиды) льна сложно получить напрямую [152, 257]. Процесс осложняется тем, что в культуре пыльников льна чаще всего образованию гаплоидных проростков предшествует промежуточная стадия, на которой образуется каллус из микроспор, которые стали на спорофитный путь развития вместо привычного гаметофитного. Из этого гаплоидного каллуса еще только предстоит регенерировать растения. Так, некоторые авторы [144] отмечают, что прямой эмбриогенез из микроспор в значительной степени затруднен и до настоящего времени все регенерированные растения льна получены только через каллус. Другими исследователями также установлено, что в культуре пыльников довольно часто индуцируются и каллусные ткани. Более того, в определенных условиях культивирования пыльников прямой эмбриоидогенез не всегда приводит к регенерации и формированию гаплоидного проростка. Эмбриоиды на исходной среде могут пролиферировать каллус и в этом случае регенерация растений происходит уже через дифференциацию вторичных меристематических зон (вторичный эмбриоидогенез), либо путем органогенеза [18]. 93 Инициация регенерации в каллусной культуре у многих видов зачастую требует особых усилий, поскольку не все генотипы обладают одинаковой способностью к регенерации [1, 162, 270]. Кроме того, процесс регенерации подвержен влиянию ряда факторов, в первую очередь, таких как состав питательной среды и набор фитогормонов [23, 162, 182]. Так, при изучении влияния цитокининов зеатина и тидиазурона на регенерацию побегов из каллуса льна было показано, что зеатин, по сравнению с тидиазуроном, обеспечивает несколько больший (6.4 и 4.3% соответственно) процент регенерации [162]. Образующиеся на среде с зеатином побеги в дальнейшем меньше гибли и лучше укоренялись, однако, невысокий процент регенерации предполагает необходимость дальнейшей доработки и оптимизации условий регенерации. Таким образом, получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор (незрелой пыльцы) на сегодняшний день является одним из общепризнанных способов для создания коммерческих линий удвоенных гаплоидов льна, также как и других сельскохозяйственных культур [60, 190, 198, 245]. Однако многие аспекты получения удвоенных гаплоидов у льна через культуру пыльников до сих пор остаются невыясненными. В частности, существуют трудности в индуцировании регенерации из каллусной ткани или в получении удлиненных побегов из регенерированных почек. Поэтому любые исследования в этом плане представляются важными и своевременными. 4.1. Особенности подготовки материала и питательных сред для получения гаплоидов из пыльников льна Получение удвоенных гаплоидов льна с использованием культуры пыльников предусматривает правильное выращивание донорных растений. Условия роста и развития для этих растений должны быть максимально благоприятными, при этом, по возможности, следует исключить любые 94 повреждения болезнями и вредителями. Особое внимание следует уделять температурному режиму [216, 316]. Оптимальной для льна в период формирования бутонов является среднесуточная температура 16-18°C [47], тогда как температуры выше 22°C отрицательно сказываются на конечном результате. В первую очередь очень важно найти оптимальную стадию развития пыльцы в бутонах в момент их сбора, для посадки пыльников на питательную среду. Исследования, проведенные на других культурах, показали, что лучшие результаты достигаются, когда микроспоры находятся на одноядерной стадии развития [60, 175, 316]. Именно в этот период необходимо собирать бутоны. Контролировать это можно либо цитологически, либо по размеру бутонов. Согласно нашим данным для цитологического контроля можно готовить временные препараты, окрашивая их ацетокармином или гематоксилином. Предварительно бутоны фиксируют в фиксаторе Карнуа несколько часов на холоде. Микроспоры льна на одноядерной стадии развития представлены на рис. 4.1. Можно обойтись и без приготовления цитологических препаратов, учитывая, что согласно полученным нами данным существует корреляция между размером бутона и стадией развития пыльцы (табл. 4.1). Как видно из табл. 4.1, бутоны льна масличного, в которых пыльца находится преимущественно на одноядерной стадии развития, имеют длину около 4,0-4,5 мм и толщину около 1,8-2,5 мм. Для установления стадии развития пыльцы у льна можно определять и соотношение длины лепестков и пыльников, при этом лепестки должны быть короче пыльников приблизительно на 1/2-1/4, хотя эта закономерность может и нарушаться. 95 Рис. 4.1. Микроспоры льна масличного на стадии тетрады (а), одноядерной (б) и двуклеточной (в) стадиях развития 96 Таблица 4.1 Связь между размером бутонов и стадией развития пыльцы у некоторых видов льна Дли- Тол- Длина Длина Преоблада- Вид, на щина пыль- лепест- ющая сорт бу- бутона, ников, ков, мм стадия тона, мм мм развития мм L.usitatissimum, 4,5 пыльцы 2,5-3,5 1,0 0,7 сорт Дебют Зрелая пыльца 4,0 2,0-2,5 0,7 0,5 Одноядерная пыльца L.austriacum 3,0 - 1,0 1,0 Зрелая пыльца 2,5 - 0,5 0,5 Одноядерная пыльца L.perenne 4,0 - 1,2 1,1 Зрелая пыльца 3,0 - 1,3 1,0 Одноядерная пыльца L.hirsutum 5,0 - 1,5 2,1 Зрелая пыльца L.grandiflorum 9,0 - 1,5 1,0 Зрелая пыльца 7,0 - 1,5 0,8 Одноядерная пыльца Питательные среды, на которых культивируют пыльники, имеют исключительное значение для индукции эмбриоидогенеза или 97 каллусогенеза. Состав среды должен способствовать переключению пути развития микроспор с обычного гаметофитного на спорофитный. При выборе питательной среды кроме состава неорганических ингредиентов важно учитывать, что для образования и роста эмбриоидов или каллуса могут быть необходимы определенные органические вещества, особенно аминокислоты и витамины. Кроме того важна концентрация сахарозы (для регулирования осмотического давления среды), баланс регуляторов роста и прочее. Даже агар (в случае приготовления твердых сред) может содержать вредные вещества, которые будут оказывать в культуре пыльников ингибирующее действие. Большое значение имеет чистота воды, на которой готовят среду, поскольку ее доля по сравнению с другими компонентами среды значительно больше. С целью адсорбции ингибирующих веществ, которые могут образовываться стенками пыльника, иногда в питательную среду добавляют активированный уголь. В наших опытах, однако, он не был эффективен. Для культивирования пыльников льна были использованы агаризованные среды МС [246], LMA-1 [62] и NLN-13 [232]. По предварительным данным из испытанных сред, среда LMA-1, модифицированная нами путем увеличения в ней количества сахарозы (на 2-3%), обеспечивала наиболее стабильный выход каллуса. Развивался каллус и на питательной среде МС с некоторыми модификациями. На среде NLN-13, часто используемой для культивирования пыльников и микроспор рапса, каллус образовывался реже. 4.2. Влияние температурной обработки пыльников и сроков их культивирования на индукцию каллусообразования Температурный фактор играет немаловажную роль в индукции новообразований в культуре пыльников. Для некоторых культур, в частности рапса, он может иметь даже ключевое значение [169]. Важна как 98 температура предобработки бутонов, так и температура культивирования пыльников. Согласно нашим данным бутоны льна следует выдерживать при пониженной температуре 1-2 суток, поскольку более длительная обработка часто приводит к их повреждению. Для определения оптимальной температуры культивирования выделенные пыльники высаживали на питательную среду (типа LMA-1) и выдерживали при разных температурных режимах (5 суток при 33°C; 5 суток при 6°C; 5 суток при 20-25°C; 10 суток при 6°C). Впоследствии пыльники культивировали в искусственных условиях согласно стандартным методикам при комнатной температуре. Через 45 дней подсчитывали количество пыльников, которые образовали каллус (табл. 4.2). Следует отметить, что андрогенные образования эмбриоидного типа в процессе культивирования пыльников не выявлялись, а формировался лишь андрогенный (иначе, андроклинный) каллус. Как видно из таблицы 4.2, лучше всего каллус на пыльниках образовывался при температуре культивирования 25°С. У большинства генотипов на данном температурном фоне процент пыльников с новообразовавшимся каллусом был большим, чем при действии температуры 33°С и 6°С. Пониженная температура в отдельных случаях также была довольно эффективной для индукции развития каллуса, однако лишь тогда, когда продолжительность температурного влияния составляла 5 суток. С увеличением длительности ее действия до 10 суток она сильно ингибировала каллусообразование. Следует также отметить, что температура 33°С в большей степени приводила к образованию каллуса из основы тычиночных нитей. Практически у всех изученных генотипов процент образования каллуса из тычиночных нитей (т.е. спорофитного происхождения) и невыясненной природы в этом случае был существенно выше, чем из самих пыльников 99 (т.е. гаметофитного происхождения). Подобная закономерность наблюдалась на всех изученных средах. Таблица 4.2 Влияние различных температурных режимов при культивировании пыльников на инициацию новообразований у льна масличного Общее число Генотип Темпе- отзывчивых ратура, пыльников (с °С (дни) каллусом), Число пыльников с андрогенным каллусом, % % F1 4 × 5 F1 4 × 6 25 19,5±3,65 8,5±2,56 33 17,5±3,38 4,0±1,74 6 (5) 16,6±2,91 6,1±1,88 6 (10) 12,1±2,84 1,5±1,06 25 28,0±8,98 16,0±7,33 33 4,6±2,25 0,0 6 (5) 2,9±1,64 2,9±1,64 6 (10) 0,0 0,0 Каллус на пыльниках льна начинает образовываться через 10-15 дней после начала культивирования. Однако даже через месяц в условиях in vitro он еще появляется с достаточно высокой частотой. В связи с этим мы исследовали процесс образования каллуса при культивировании пыльников льна в течение 50 дней. Так, был изучен выход каллуса через 30 и 45-50 дней культивирования пыльников у ряда генотипов льна (табл. 4.3). В данном случае новообразовавшийся каллус не дифференцировали по типу происхождения. 100 Из данных табл. 4.3 видно, что через 30 дней культивирования из пыльников практически всех образцов образовывался каллус, хотя частота отзывчивых пыльников сильно различалась. Более длительный срок культивирования пыльников во всех случаях оказался благоприятным для увеличения количества отзывчивых пыльников. Таблица 4.3 Образование каллуса из пыльников льна в разные сроки Генотип Выса- Через 30 дней Через 45-50 дней жено Каллу- Отзывчивых пыль- сов, пыльников, ников, шт. % Каллусов, Отзывчивых шт. пыльников, % шт. 5 × 15 88 41 46,6±5,32 74 84,1±3,90 15 × 14 273 68 24,9±2,62 195 71,4±2,73 14 × 5 72 12 16,7±4,39 43 59,7±5,78 15 × 6 56 25 44,6±6,64 59 100 5×6 100 61 61,0±4,88 104 100 4×5 35 29 82,9±6,37 35 100 4.3. Роль генотипа при образовании каллуса из пыльников льна Общеизвестно, что в культуре in vitro различные образцы характеризуются различного типа или разного уровня отзывчивостью. Это справедливо и для культуры пыльников льна. Нами было изучено образование каллуса из пыльников различных образцов льна, представляющих селекционную ценность. В данном случае использовали 101 среду LMA-1 (табл. 4.4). Для исследований использовали температуру инициации 35°С (1 сутки) как такую, продолжительность влияния которой меньше в сравнении с 32°С (2-3 суток). Из двух испытанных сред – LMA-1 и NLN-13, первая среда обеспечивала более стабильный выход каллуса в предварительных исследованиях. Таблица 4.4 Образование каллуса из пыльников у различных генотипов льна Доля Выса- пыльников жено Генотип Пыльников с каллусом пыль- с каллусом из ников, тычиноч- шт. В т.ч. из Всего тычиночной нити ной нити, шт. % шт. % % Lin 1 255 60 23,5±2,66 37 14,5±2,21 61,7 Lin 2 108 10 9,3±2,79 9 8,3±2,66 90,0 Lin 3 137 52 38,0±4,15 27 19,7±3,40 51,9 Lin 4 92 36 39,1±5,09 18 19,6±4,14 50,0 Lin 5 281 71 25,3±2,59 55 19,6±2,37 77,5 Lin 6 64 11 17,2±4,72 6 9,4±3,64 54,5 Установлено, что общее количество пыльников с образовавшимся каллусом (разного происхождения) варьировало от 9,3 до 39,1% в зависимости от генотипа. Однако при этом у довольно большой их части (не менее 50%) каллус формировался из тычиночной нити. У некоторых 102 генотипов доля пыльников с каллусом, образовавшимся из тычиночной нити, по отношению к общему числу пыльников составляла даже 90%. Интересно отметить, что, чем меньше в целом отзывчивых пыльников, тем больше среди них доля тех, которые индуцируют каллус из ткани тычиночной нити, т.е. каллус, который имеет диплоидную природу. Для оценки большего количества генотипов по параметру каллусообразование из пыльников в качестве материала использовали 17 гибридных комбинаций, в том числе 7 пар от прямых и обратных скрещиваний. Начальная температура инициации развития каллуса в данном случае составляла 35°С. Через 30 дней анализировали наличие андрогенного каллуса (табл. 4.5). Установлено, что пыльники практически всех гибридов образовывали каллус, хотя процент таких пыльников у разных генотипов сильно отличался. Лишь у одного генотипа (6 × 14) через 30 дней культивирования почти не наблюдалось образование каллуса (менее 3% отзывчивых пыльников). Также отличались между собой по частоте каллусообразования гибридные комбинации от прямого и обратного скрещиваний, причем отличия в ряде случаев составляли два раза и больше. Особенно выделяется в этом плане отрицательное влияние цитоплазмы генотипа № 6. Практически во всех комбинациях скрещивания, где данный образец выступал в образовывался качестве материнской значительно реже формы, чем тогда, каллус из когда пыльников генотип №6 использовался как источник пыльцы. Например, у гибрида 6 × 14 каллус через 30 дней образовывался в 2,4±2,35% случаев, тогда как в обратной комбинации 14 6 – в 22,4±5,48%. Подобное влияние цитоплазмы давно известно в литературе и может быть обусловлено различными цитоплазматическими компонентами, как синтезированными в самих 103 половых клетках, так и унаследованными от материнских диплоидных тканей. Таблица 4.5 Образование каллуса из пыльников гибридов льна разных комбинаций скрещивания Высажено Генотип пыльников, Пыльников с каллусом через 30 дн. шт. шт. % 5 × 15 88 41 46,6±5,32 15 × 5 21 12 57,1±10,80 14 × 15 63 30 47,6±6,29 15 × 14 273 68 24,9±2,62 5 × 14 28 8 28,6±8,54 14 × 5 72 12 16,7±4,39 6 × 15 163 34 20,9±3,18 15 × 6 56 25 44,6±6,64 5×6 100 61 61,0±4,88 6×5 44 12 27,3±6,71 4 × 15 65 23 35,4±5,93 15 × 4 30 8 26,7±8,07 6 × 14 42 1 2,4±2,35 14 × 6 58 13 22,4±5,48 4×5 35 29 82,9±6,37 4×6 57 31 54,4±6,60 14 × 4 170 25 14,7±2,72 104 Выявлено также негативное влияние некоторых генотипов на выход каллуса. В этом случае данные о частоте каллусообразования (табл. 4.5) усредняли в пределах комбинаций скрещивания для каждого из родительских компонентов гибридов. Хотя каллус и образовывался из пыльников всех генотипов, в комбинациях, где в качестве одного из родителей использовался образец № 14, процент пыльников с каллусом был существенно ниже, чем в том случае когда родительскими компонентами являлись образцы № 4, № 5, № 6 или № 15 (табл. 4.6). В целом, из представленных данных видно, что генотип играет существенную роль в индукции каллусообразования у льна. Таблица 4.6 Влияние генотипа на каллусообразование из пыльников льна Родительский Высажено Каллусов через Пыльников с компонент пыльников, 30 дней, каллусом, гибрида шт. шт. % №4 357 116 32,5±2,48 №5 388 175 45,1±2,53 №6 520 177 34,0±2,08 № 14 706 157 22,2±1,56 № 15 759 241 31,8±1,69 4.4. Влияние состава питательной среды на процессы каллусогенеза и органогенеза Работы, в которых изучается культура микроспор льна, единичны и индуцировать гаплоиды с приемлемой частотой при использовании такого 105 подхода пока не удается [163]. В связи с этим предпринимаются попытки получать гаплоиды у льна через культуру пыльников. Так, R. Bergmann и W. Friedt [144] показали, что у данного вида индукция процессов эмбриоидогенеза при использовании микроспор мало эффективна, поэтому растения-регенеранты у льна реально получать в настоящее время через каллус [144]. Тем не менее, многие исследователи при индукции регенерационных процессов в каллусной культуре сталкиваются с рядом трудностей, поскольку различные генотипы у большинства видов характеризуются и различной способностью к регенерации [1, 162, 270]. Кроме того скорость роста, степень развития каллуса из пыльников, индукция в таком каллусе процессов органогенеза в значительной мере зависят от общего и гормонального состава питательных сред, на которые пассируется каллус [23, 162, 182]. Так, например, было показано, что такие цитокинины как зеатин и тидиазурон положительно влияют на регенерацию побегов из каллуса льна [162], причем полученные на среде с зеатином побеги в дальнейшем меньше гибли и лучше укоренялись, однако, из невысокого процента регенерации (6,4% в данном случае) следует необходимость дальнейшей доработки и оптимизации условий регенерации. В этой связи мы проводили исследования по изучению процессов каллусообразования и регенерации в культуре пыльников у двух генотипов льна масличного на различных питательных средах. В качестве материала использовали два гибрида F1 льна масличного, полученные от скрещивания линейного материала различного происхождения из коллекции Института масличных культур НААН: МР485 × Авангард и 6-8 гнездный × М22. Эти образцы характеризуются рядом хозяйственно-ценных признаков, поэтому вовлечение их в селекционный процесс и получение новых форм на их основе весьма привлекательно. Каллус, полученный в культуре пыльников 106 вышеуказанных гибридов, высаживали на питательные среды N6 [165] и LMA-1 [62] с различным содержанием 6-бензиламинопурина (БАП). Размер исходного экспланта составлял 3-5 мм. В дальнейшем каллусы культивировали при комнатной температуре согласно схемы на рис. 4.2 при искусственном освещении и 16-ти часовом фотопериоде. Каждые 4-5 недель, во время пересадки каллусов на новую питательную среду, подсчитывали количество каллусов, давших начало регенерации корней или побегов, а также степень развития самих каллусов. Хорошо развитыми считали те из них, которые по диаметру превышали первоначально высаженные каллусы и были естественного зеленого или бледно-зеленого цвета. В каждой чашке диаметром 60 мм, которую рассматривали как повторность, культивировали 6 каллусов. Данные по повторностям суммировали и обрабатывали статистически, используя программу MSTAT–C для ПК. Каллус из пыльников льна Среда LMA-1 с БАП, мг/ л 2 4 6 Среда LMA-1 с БАП, мг/ л 2 4 6 Среда LMA-1 Среда N6 с БАП, мг/ л 2 4 6 Среда N6 с БАП, мг/ л 2 4 6 Среда N6 Рис. 4.2. Схема культивирования каллусов из пыльников льна масличного 107 При культивировании каллусов двух разных генотипов льна наблюдались как общие закономерности, так и некоторые особенности. Как видно из данных, приведенных в таблице 4.7, для генотипа Таблица 4.7 Влияние состава питательной среды на развитие каллуса из пыльников льна гибрида МР485 × Авангард № 2 мг/л БАП 4 мг/л БАП 6 мг/л БАП пас- Все- Из них Все- Из них Все- Из них са- го хорошо го хорошо го хорошо жа кал- развитых кал- развитых кал- развитых лу- шт. % лу- шт. % лу- шт. сов, сов, сов, шт шт. шт. % Среда N6 1 72 67 93,1±3,00 72 17 23,6±5,03* 72 1 1,4±1,38* 2 72 70 97,2±2,01 66 22 33,3±5,78* 66 0 0* 3 66 65 98,5±1,72 54 31 57,4±6,73* 48 0 0* Среда LMA-1 1 78 64 82,1±4,35 78 13 16,7±4,25* 72 8 11,1±3,68* 2 78 66 84,6±4,04 66 11 16,6±4,62* 48 4 8,3±3,91* 3 66 64 97,0±2,09 48 26 54,2±7,19* 42 18 42,8±7,63* Примечание. * – Различия между вариантами 4-6 мг/л БАП и 2 мг/л БАП существенны при p< 0,1% 108 МР485 × Авангард концентрация БАП 2 мг/л для пролиферации каллуса оказалась лучшей в сравнении с концентрациями 4 и 6 мг/л. На это указывает значительно большее количество хорошо развитых каллусов, которые пролиферировали на среде с 2 мг/л БАП в сравнении с 4 и 6 мг/л БАП. Концентрация БАП 4 мг/л оказалась промежуточной – количество пролиферирующих каллусов на ней было выше, чем на среде с 6 мг/л БАП, но ниже, чем на 2 мг/л БАП (рис. 4.3). Подобная закономерность была характерной для роста каллусов как на среде LMA-1, так и на среде N6. Однако на среде LMA-1 различие в развитии каллуса при концентрации БАП 4 и 6 мг/л было мало существенным, что может объясняться составом самой среды LMA-1, а не концентрацией фитогормона. Так, на среде LMA-1 с концентрациями БАП 4 и 6 мг/л в конце первого пассажа было Рис. 4.3. Развитие каллусов из пыльников льна на средах с разным содержанием БАП 109 соответственно 16,7% и 11,1% хорошо развитых каллусов, тогда как на среде N6 в последнем случае (6 мг/л БАП) их было значительно меньше чем в первом (4 мг/л). Подобные результаты наблюдались и после второго пассажа на те же среды – количество хорошо развитых (интенсивно пролиферирующих) каллусов было выше на средах с 2 мг/л БАП (рис. 4.4). Однако, в конце второго пассажа на среде N6 с максимальным содержанием БАП – 6 мг/л – рост каллуса полностью угнетался, тогда как на среде LMA-1 каллусы продолжали развиваться (их количество составило 8,3%). Во время третьего пассажа каллусы МР485 × Авангард культивировали на тех же средах, но без фитогормонов. Это оказывало положительное влияние на развитие и рост каллусов, поскольку количество хорошо развитых каллусов существенно возрастало. Так количество таких Рис. 4.4. Хорошо развитый каллус из пыльников льна масличного 110 каллусов со среды LMA-1 с 2 мг/л БАП приближалось к 100%, а количество тех, что были пересажены со среды LMA-1 с 4 и 6 мг/л БАП на среду без гормонов, равнялось 54,2% и 42,9% соответственно (табл. 4.7). Генотип F1 6-8 гнездный × М22 характеризовался подобными закономерностями развития каллуса при культивировании на средах с разным содержанием БАП (табл. 4.8, 4.9, 4.10). В конце первого пассажа наибольшее количество хорошо развитых каллусов было на средах с концентрацией БАП 2 мг/л и наименьшее – с 6 мг/л. Определенные отличия были характерны лишь для самих сред – LMA-1 и N6. Если на среде LMA-1 концентрация 6 мг/л БАП очень сильно угнетала нормальное развитие каллуса в сравнении с 4 мг/л БАП (с 63,8 до 26,6%), то на среде N6 процент нормально развитых каллусов уменьшался лишь с 83,3 до 73,3%. Таблица 4.8 Влияние БАП в количестве 2 мг/л на процессы побегообразования и ризогенеза в культуре каллуса из пыльников льна гибрида F1 6-8 гнездный × М22 № пас- Все- Из них хорошо Каллусов с Каллусов с сажа го развитых корнями побегами каллусов, шт 1 2 шт. % шт. % шт. % 3 4 5 6 7 8 Среда LMA-1 I (через 4 недели) I (через 5 недель) II 36 34 94,4±3,95 0 - 0 - 36 - - 7 19,4±6,53 5 13,8±6,33 30 30 100 3 10,0±5,47 1 3,3±1,81 111 Продолжение таблицы 4.8 1 2 3 4 5 6 7 8 III 30 22 73,3±8,07 5 16,6±6,85 1 3,3±1,81 Среда N6 I (через 4 30 30 100 0 - 0 - 30 - - 8 26,6±8,10 0 - II 30 30 100 2 3,3±3,11 0 - III 30 27 90,0±5,77 1 3,3±3,26 0 - недели) I (через 5 недель) Относительно регенерации корешков и побегов, то ни на одной из изученных сред через месяц культивирования каллусов при первом пассаже морфогенез не наблюдался. Ситуация существенно изменялась, если каллусы генотипа 6-8 гнездный × M22 продолжали пролиферацию на той же среде еще на протяжении недели. На обеих средах был зафиксирован образование побегов и корешков. На среде LMA-1 формирование корешков наблюдалось при концентрации БАП 2 и 4 мг/л, однако побеги получали лишь при 2 мг/л БАП (рис. 4.5). Полученные данные свидетельствуют, что содержащийся в среде БАП в концентрации 6 мг/л полностью угнетал образование как корешков, так и побегов. На среде N6 корни развивались при всех испытанных концентрациях БАП, тем не менее больше всего (26,6%) их было при 2 мг/л (рис. 4.6). Побеги регенерировали при 4 и 6 мг/л БАП, а при наименьшей концентрации – 2 мг/л, – их не было. 112 Таблица 4.9 Влияние БАП в количестве 4 мг/л на процессы побегообразования и ризогенеза в культуре каллуса из пыльников льна гибрида F1 6-8 гнездный × М22 № Всего Из них хорошо Каллусов с Каллусов с пассажа кал- развитых корнями побегами лусов, шт. шт. % шт. % шт. % LMA-1 I (через 4 недели) 36 23 63,8±8,00*** 0 - 0 - 5 недель) 36 - - 4 11±5,21 0 - II 18 12 66,6±11,08** 0 - 0 - III 6 6 100*** 0 - 0 - I (через N6 I (через 4 недели) 30 25 83,3±6,85* 0 - 0 - 5 недель) 30 - - 3 10,0±5,47 13 43,3±9,03 II 30 28 93,3±4,65 0 - 5 16,6±б,85 III 28 18 64,3±9,05** 1 3,6±3,51 10 5,3±4,23 I (через Прим. *, **, *** - Различия между вариантами 4 мг/л БАП и 2 мг/л БАП существенны при p < 5, 1 и 0,1% соответственно. 113 Рис. 4.5. Регенерация побегов в культуре каллуса из пыльников льна 114 Рис. 4.6. Ризогенез в культуре каллуса из пыльников льна масличного Во время второго пассажа у генотипа гибрида F1 6-8-гнездный × М22 количество хорошо развитых каллусов увеличивалось или оставалось неизменным на обеих средах при всех концентрациях БАП. Тем не менее количество корешков и побегов существенно уменьшалось. Очевидно, пересадка на свежую питательную среду приводила к дедифференциации регенерированных органов. Так, на среде N6 при концентрации БАП 6 мг/л не было зафиксировано ни корешков, ни побегов, хотя во время предшествующего пассажа их было 3,3 и 13,3% соответственно. Подобная ситуация наблюдалась и при содержании БАП в обеих средах 4 мг/л. В случае с концентрацией БАП 2 мг/л ситуация при втором пассаже принципиально не изменилась, лишь количество регенерированными корешками и побегами было меньшим. каллусов с 115 Таблица 4.10 Влияние БАП в количестве 6 мг/л на процессы побегообразования и ризогенеза в культуре каллуса из пыльников льна гибрида F1 6-8 гнездный × М22 № пассажа Всего каллусов, шт. Из них хорошо развитых Каллусов с корнями Каллусов с побегами шт. % LMA-1 шт. % шт. % 30 8 26,6±8,10*** 0 - 0 - 5 недель) 24 - - 0 - 0 - II 24 7 29,1±9,26*** 0 - 0 - III 0 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 1 3,3±3,11 4 13,3±6,14 I (через 4 недели) I (через N6 I (через 4 недели) 73,3±8,10** 30 22 5 недель) 30 - II 24 18 75,0±8,83** 0 - 0 - III 24 13 54,2±10,17** 0 - 2 8,3±5,63 I (через Примеч. **, *** - Различия между вариантами 6 мг/л БАП и 2 мг/л БАП существенны при p< 1 и 0,1% соответственно. В конце последнего, третьего пассажа, ситуация в варианте с 2 мг/л БАП принципиально не изменилась ни на среде LMA-1, ни на среде N6, хотя и наблюдались некоторые отличия в процентном отношении как интенсивно пролиферирующих каллусов, так и каллусов, давших начало регенерации побегов и корней. В вариантах с 4 и 6 мг/л БАП на среде N6 116 отмечены те же закономерности, что и в предыдущем пассаже, за исключением того, что в варианте с 4 мг/л БАП у 3,6% каллусов развивались корешки, которых не было во время культивирования на среде с фитогормоном во втором пассаже. Что касается среды LMA-1, то из-за гибели материала в большинстве чашек вследствие неблагоприятных условий в этих двух вариантах проанализировать определенные закономерности развития каллусов не представлялось возможным. 4.5. Влияние состава питательной среды на удлинение и укоренение побегов льна Побеги гаплоидного типа, полученные каким-либо способом, чаще всего необходимо дорастить перед укоренением. Это можно осуществлять либо на той же среде, на которой были получены побеги, либо на другой, специально оптимизированной среде. В состав такой среды можно включить фитогормоны, способствующие росту клеток, например, гибберелловую кислоту. Она вызывает сильный рост клеток растяжением, что в данном случае и необходимо. В данной части работы мы изучали рост побегов на пяти средах с минеральной основой среды МС. Каллусы льна высаживали в пяти повторностях в чашки Петри на 5 питательных сред (№ 29-33): № 30 – среда МС + 1 мг/л БАП + 0,05 мг/л НУК, № 29 – МС + 1 мг/л БАП + 0,05 мг/л НУК + аминокислоты + В1, № 31 – МС + 1 мг/л БАП + 0,05 мг/л НУК + аминокислоты + В1 + В, № 32 – МС + 1 мг/л БАП + 0,1 мг/л ИМК + 0,1 мг/л ГК3 + аминокислоты + В1, № 33 – МС + 0,5 мг/л БАП + 0,05 мг/л НУК + 0,2 мг/л ГК3 + аминокислоты + В1. За исключением среды № 30 остальные среды содержали в разных сочетаниях аминокислоты – аспарагин (200 мг/л), серин (100 мг/л) и глутамин (30 мг/л), витамин В1 (0,4 мг/л) и микроэлемент бор (25 мг/л). 117 Из литературных данных известно, что ряд аминокислот и микроэлементов благоприятно влияют на культуру клеток и тканей, выращиваемых в искусственных условиях. Так, показано, что L-глутамин является предпочтительным источником азота для построения ряда аминокислот при пролиферации клеток по типу II и способствует удлинению периода эмбриогенной компетенции культуры у пшеницы [150]. Серин оказывает положительный эффект на стенку пыльника в культуре пыльников [175]. Ранее в ряде работ [215, 254] показано, что L-серин, совместно с глутамином и глутатионом оказывали весьма благоприятное действие на культуру пыльников рапса. Что касается такого микроэлемента как бор, то установлено, что он участвует в регулировании метаболизма фенольных соединений, биосинтезе лигнина, дифференцировке ксилемы, а его нехватка немедленно приводит к ингибированию роста корней. Добавление бора в питательную среду в виде борной кислоты в концентрации до 2 мМ увеличивает частоту побегообразования в культуре in vitro киви [301]. Показано, что бор влияет на соматический эмбриоидогенез ряда культур, например риса и папайи. Так, максимальное количество соматических эмбриоидов у папайи было получено при концентрации борной кислоты 62 мг/л [283], тогда как без этого микроэлемента процессы соматического эмбриоидогенеза были угнетены. В качестве материала использовали каллусы с регенерированными побегами, полученные из пыльников двух образцов льна. Культивирование проводили по стандартным методикам на протяжении двух пассажей. Подсчитывали количество побегов, удлиненных не менее чем на 10 мм. 118 Рис. 4.7. Удлиненные побеги льна генотипа МР 470 на среде для укоренения Рис. 4.8. Укорененные побеги льна генотипа МР 470 119 При культивировании каллусов с регенерированными побегами в течение месяца (I пассаж) лишь на некоторых из пяти изученных сред наблюдали удлинение побегов (табл. 4.11). Реакция разных генотипов при этом тоже не была одинаковой. Так, при культивировании каллусов с регенерацией образца F1 4 × 5 количество каллусов с удлинившимися побегами варьировало от 3,7 до 10,7% в зависимости от среды. И лишь на базовой среде МС без каких-либо добавок не наблюдали этого эффекта. У генотипа МР 470 после первого пассажа удлинение побегов отмечено только на среде с наиболее полным набором добавок. Таблица 4.11 Влияние состава питательной среды на удлинение побегов льна Среда, № Каллусов с Из них с регенер. удлинившимипобегами, ся побегами, шт. % I пассаж Каллусов с Из них с регенер. удлинившимипобегами, ся побегами, шт. % II пассаж Генотип F1 4 × 5 29 27 3,73,63 27 3,73,63 30 27 0 10 0 31 25 4,03,84 18 5,55,37 32 28 10,75,95 27 0 33 26 3,853,77 20 5,04,87 Генотип МР 470 29 29 0 15 6,676,44 30 23 0 20 5,04,87 31 22 0 12 8,37,96 32 22 0 15 6,676,44 33 19 10,57,03 19 31,610,96 120 После второго пассажа удлиненные побеги отмечены практически на всех средах, но наименьший эффект наблюдался на среде 30, а наибольший – на среде 33 (рис. 4.7). У образца МР 470 удлиненные побеги отмечены на всех средах, но больше всего их наблюдали на среде, содержащей, в дополнение к гормонам БАП и НУК, гибберелловую кислоту, аминокислоты и дополнительный источник витамина B1. В последнем случае почти каждый третий побег удлинялся (табл. 4.11). А у образца F1 4 × 5 после второго пассажа картина практически не изменилась, за исключением среды № 32, на которой удлинения побегов не наблюдалось. На среде № 30 без исследуемых добавок побеги также не росли. Итак, питательная среда № 30 оказалось наименее подходящей для удлинения побегов льна. Такие результаты можно считать закономерными, поскольку она не содержит дополнительных добавок. Наиболее пригодной для удлинения побегов можно считать среду № 33, но и в этом случае процесс был генотипоспецифичен. По результатам данного эксперимента лучший рост регенерированных побегов наблюдался на среде МС-33. Эта среда содержит ряд добавок, в частности, кроме фитогормонов БАП и НУК (0,5 и 0,05 мг/л), 0,2 мг/л ГК3, аминокислоты аспарагин – 200 мг/л, глутамин – 30 мг/л и серин – 100 мг/л и увеличенное количество витамина В1. Для укоренения удлинившиеся побеги мы переносили на специальную среду с уменьшенным содержанием макроэлементов и сахарозы и с другим набором фитогормонов. Концентрацию агар-агара также увеличивали на 0,1-0,2%, поскольку это благоприятно сказывалось на внешнем виде побегов. Побеги некоторых генотипов укоренялись даже в дистиллированной воде, тогда как другие требовали особой среды. Обычно в качестве фитогормонов добавляли НУК, ИУК и ИМК. Другие фитогормоны не применяли. Согласно нашим данным побеги льна успешно укоренялись на 121 среде МС, содержащей 60-75% макро- и микроэлементов, 1-2% сахарозы и дополненной различными комбинациями гормонов – 1-2 мг/л НУК, 2 мг/л ИМК или по 1 мг/л НУК и ИУК (рис. 4.8). 4.6. Исследования плоидности при получении удвоенных гаплоидов у льна В культуре пыльников, независимо от изучаемого объекта, важное значение имеет контроль плоидности получаемого материала. Этот новообразованный материл, либо в виде каллуса, либо в виде эмбриоидов может образовываться как из гаметофитной ткани, так и из спорофитной. Новообразования, полученные из спорофитной ткани, не представляют интереса в плане гомозиготности, поскольку повторяют генетические свойства исходного родителя. При получении гомозиготных линий важны растения, ведущие происхождение от гаплоидных структур (микроспор), поскольку именно они после удвоения набора хромосом обладают полной гомозиготностью. В связи с этим приходится постоянно контролировать происхождение этого материала. 4.6.1. Способ установления гаплоидной природы растений, полученных через культуру пыльников Одним из способов доказательства того, что регенерированные растения получены из гаплоидной, а не из спорофитной ткани пыльников, в наших исследованиях было использование генетического анализа по маркерным признакам для популяции растений, полученной из пыльников гибридов F1. Впервые разработанная и примененная нами на льне для целей установления плоидности источника происхождения новообразований модельная система представляла собой гибрид, полученный от скрещивания линий, различающихся по одному из маркерных признаков. В 122 качестве такого признака был выбран визуально легко идентифицируемый морфологический признак – «окраска цветка». Одна из используемых родительских линий гибрида обладала признаком синей окраски венчика цветка, тогда как другая – белой, признаком, рецессивным по оношению к вышеупомянутому. В силу этого гибридные растения имели синюю окраску цветка, тогда как мужские гаметы (микроспоры) гибридов несли либо доминантный, либо рецессивный аллель окраски. Следовательно, растения полученные из спорофитной (диплоидной) ткани могли быть лишь синецветковыми, тогда как популяция растений, полученных из гаметофитной (гаплоидной) ткани должна состоять из синецветковых и белоцветковых растений в соотношении 1 : 1 (синецветковые : белоцветковые). Еще более убедительной является генетическая система, основанная на комплементарном взаимодействии генов. Такое взаимодействие обнаружено у льна масличного при наследовании окраски цветка при скрещивании ряда белоцветковых генотипов между собой [17]. В этом случае растения, полученные из диплоидной ткани, имеют окрашенный венчик, тогда как растения, полученные из гаплоидной ткани (микроспоры), имеют окрашенный и неокрашенный венчик в соотношении 1:3. Схема возможного образования растений-регенерантов из клеток разной плоидности при культивировании пыльников в комплементарного взаимодействия генов показана на рис. 4.9 и 4.10. случае 123 AAbb белая aaBB белая AaBb синяя Родители Гибрид Гаплоидные клетки (гаметы) гибрида AB Ab aB ab AABB AAbb aaBB aabb Растениярегенеранты синяя белая белая белая Окраска цветка Рис. 4.9. Схема получения растений-регенерантов гаплоидного происхождения из пыльников гибрида при комплементарном взаимодействии генов 124 AAbb белая aaBB белая AaBb синяя Родители Гибрид Диплоидные клетки (спорофитная ткань) гибрида AaBb AaBb Растениярегенеранты синяя Окраска цветка Рис. 4.10. Схема получения растений-регенерантов диплоидного происхождения из пыльников гибрида при комплементарном взаимодействии генов В таблице 4.12 приведены данные о соотношении растений с белым и окрашенным (синим) венчиком, полученных нами через культуру пыльников из гибридных растений F1. В данных комбинациях скрещивания белая окраска цветка наследуется моногенно и рецессивно. Из таблицы видно, что в комбинациях скрещивания МР485 × Авангард и 15 × 6 125 количество регенерированных из пыльников гибридов F1 сине- и белоцветковых растений было приблизительно одинаковым. Статистический анализ, проведенный по методу хи-квадрат, не выявил существенных отклонений от расщепления 1:1, ожидаемого при образовании гамет у гибридов. В силу этого можно утверждать, что источником происхождения этих регенерированных растений были микроспоры, а не спорофитная ткань пыльника. В противном случае все регенерированные растения были бы лишь синецветковыми. Таблица 4.12 Генетический анализ популяций растений льна, полученных через культуру пыльников в случае доминирования синей окраски цветка над белой Соотношение растений, полученных через Комбикультуру Фенотип нация пыльников гибридов скрещиF1 Окра- Неокравания P1 P2 шеншенный ный венчик венчик МР485 × Окрашен- Белый Окрашен13 11 Фенотип родителей Авангард ный венчик венчик 15 × 6 1:1 (2 = 0,17) ный венчик Окрашен- Белый Окрашенный Модель расщепления венчик венчик 20 17 1:1 (2= 0,24) ный венчик Сходный вывод о происхождении регенерантов может быть сделан и при анализе растений, регенерированных из пыльников гибридов комбинаций скрещивания М12 × М24 и 14 × 5 (табл. 4.13). В этом случае, 126 учитывая комплементарное взаимодействие генов, детерминирующих белую окраску венчика цветка у родительских компонентов гибридов, среди регенерантов ожидалось соотношение сине- и белоцветковых растений 1:3. Таблица 4.13 Генетический анализ популяций растений льна, полученных через культуру пыльников в случае комплементарного взаимодействия генов Фенотип родителей Комбинация скрещивания P1 P2 М12 × Белый Белый М24 венчик венчик Соотношение растений, полученных через пыльниковую Фенотип культуру гибридов F1 Окра- Неокрашеншенный ный венчик венчик Окрашен11 27 Модель расщепления 1:3 (2= 0,32) ный венчик 14 × 5 Белый Белый Окрашен- венчик венчик ный 5 22 1:3 (2= 0,60) венчик Данные, представленные в табл. 4.13, подтверждают это предположение на высоком уровне значимости и указывают на то, что, как минимум, все регенерированные белоцветковые растения происходят из микроспор, а не из спорофитных тканей, имеющих диплоидную природу. Таким образом, нами разработан способ прогнозирования плоидности растений в культуре in vitro, который заключается в том, что при получении регенерантов в культуре пыльников в качестве как минимум одного из родительских компонентов гибрида используют форму с 127 маркерным признаком, а прогнозирование плоидности растений- регенерантов проводят по наличию или отсутствию расщепления по этому маркерному признаку. Если источником происхождения популяции растений-регенерантов являются гаплоидные структуры (микроспоры), то среди данных растений наблюдается расщепление по маркерному признаку, а в случае, если источником происхождения популяции растенийрегенерантов являются спорофитные ткани, то расщепления не наблюдается, т.е. все растения имеют одинаковые морфологические признаки. Это обнаруживают в результате простого визуального наблюдения, которое не требует особых знаний или специального оборудования. Существенным преимуществом данного способа является еще и то, что он работает на любом виде цветковых растений. Также данный способ применим и при получении гаплоидов в культуре семязачатков, а не только в культуре пыльников. Разработанный способ не только позволяет расширить арсенал методов определения плоидности растения, но и упростить процедуру определения гаплоидной или диплоидной природы происхождения растений в условиях in vitro. 4.6.2. Цитологический анализ числа хромосом у регенерированных растений льна Анализ количества хромосом у льна проводили в соматических клетках молодых листочков или корней растений-регенерантов. Для исследования брали молодые листочки длиной 2-4 мм, либо кончики корешков длиной до 5 мм. Материал фиксировали по Дайеру или по Карнуа [70]. Для суперспирализации хромосом материал перед фиксацией 128 иногда обрабатывали 0,3%-ным раствором 8-оксихинолина. В качестве красителя использовали ацетокармин или пропионолакмоид. Окрашивание проводили в растворе красителя на кипящей водяной бане в течение 5-15 мин. После этого материал охлаждали, промывали в дистиллированной воде и в 45% уксусной либо пропионовой кислоте. Для приготовления временных давленых препаратов от листика или корешка отрезали его основание длиной до 1 мм [50]. Подсчет количества хромосом проводили под световым микроскопом при увеличении × 1000-1250. Для установления количества хромосом в клетках просматривали не менее 10 клеток, в которых хромосомы имели четкие контуры и находились на некотором расстоянии друг от друга. Подсчет количества хромосом на метафазных пластинках растенийрегенерантов, полученных из каллусов предположительно гаплоидного происхождения, то есть инициированного из микроспор, показал, что подавляющее большинство растений имело гаплоидный или близкий к гаплоидному набор хромосом. На рис. 4.11 представлен типичный цитологический препарат, полученный из кончиков корешков растений, полученных в культуре пыльников льна гибрида 4 × 5. Лишь в некоторых случаях выявляли метафазные пластинки, число хромосом на которых было вдвое большим. Эти растения, вероятно, имели спонтанно удвоенный набор хромосом либо имели спорофитное происхождение. Обобщая представленные в данной главе данные, следует при получении гаплоидов и удвоенных гаплоидов льна масличного учитывать такие особенности. На одноядерной стадии развития пыльцы бутоны льна имеют толщину 1,8-2,5 мм и длину 4-4,5 мм. При этом лепестки короче пыльников на 1/2-1/4. 129 Рис. 4.11. Метафазная пластинка растения-регенеранта льна масличного, полученная на препаратах кончиков корешков Лучшей температурой для каллусообразования при культивировании пыльников была температура 25°C. Температура 6-10°C была эффективной только тогда, когда длительность ее воздействия не превышала 5 суток. Для развития каллуса из микроспор пыльников льна наилучшее влияние оказывает фитогормон БАП в концентрации 2 мг/л. Более высокие концентрации данного фитогормона ингибируют развитие каллуса. Индукция побегообразования в данной каллусной культуре наблюдается при концентрации БАП 2-4 мг/л. Пересадка на свежую питательную среду во многих случаях приводит к дедифференциации регенерированных структур. Для удлинения побегов льна наиболее эффективной была среда, содержащая фитогормоны БАП, НУК и ГК3 в концентрации 0,5, 0,05 и 130 0,2 мг/л соответственно, с добавкой аспарагина, глутамина и серина (200, 30 и 100 мг/л соответственно) и борной кислоты. Для укоренения побегов льна можно использовать среду МС содержащую 60-75% макро- и микросолей, 1-2% сахарозы и фитогормоны НУК, ИМК или НУК и ИУК в концентрации 1-2, 2 или 1 и 1 мг/л соответственно. В результате проведения исследований по разработке и совершенствованию технологии получения удвоенных гаплоидов льна через культуру пыльников создан селекционно-ценный материал, который был передан в лабораторию селекции и генетики льна Института масличных культур для включения в селекционный процесс, что подтверждено соответствующим актом (см. Приложение Б). Результаты, представленные в данной главе, отражены в монографии «Ботанические и цитогенетические особенности видов рода Linum L. и биотехнологические пути работы с ними» [49] и статьях [87, 93, 98, 101, 104]. Новизна разработанной технологии получения удвоенных гаплоидов льна масличного закреплена патентом [65]. Новизна способа прогнозирования плоидности растений, полученных в культуре пыльников, закреплена патентом [68]. 131 РАЗДЕЛ 5 РАСШИРЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ IN VITRO ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ И УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ РАПСА И ГОРЧИЦЫ Известно, что применение для получения константного гомогенного материала методов, использующих половые клетки, которые имеют гаплоидный набор хромосом, позволяет сделать это значительно быстрее, чем традиционными полевыми методами. Так, если перевод на гомозиготный уровень новой гибридной формы требует в полевых условиях 4-6 лет, то использование методов экспериментальной гаплоидии позволяет выполнить эту операцию в течение одного семенного поколения, т.е. за один-два года. Наиболее часто в этих целях применяют методы, основанные на культуре пыльников и микроспор, хотя в ряде случаев используют и женские гаметы. В частности, получение гаплоидов методами андрогенеза на сегодняшний день является одним из общепризнанных способов для создания константных коммерческих линий ряда сельскохозяйственных культур. Женские половые клетки используют значительно реже, чаще всего, когда применение мужских гамет затруднительно или малоэффективно [49, 60, 198, 245]. У такой масличной и технической культуры как рапс, для получения гаплоидов наиболее широкое применение нашли методы культуры пыльников и микроспор [60, 118, 175, 284]. В первом случае используют пыльники, в которых микроспоры находятся, преимущественно, на одноядерной стадии развития, во втором – культивируют уже выделенные из пыльников изолированные микроспоры. Оба метода предполагают подбор таких условий искусственного культивирования, когда происходит образование преимущественно гаплоидных структур. При этом частота образования гаплоидов может быть достаточно высокой, хотя и остается 132 ряд нерешенных вопросов, связанных, в первую очередь, с генотипоспецифической реакцией ответа на культуру in vitro, а также с условиями выращивания донорных растений и некоторыми другими аспектами [169, 193, 214, 330, 331]. Учитывая вышесказанное, выяснение особенностей технологии получения удвоенных гаплоидов рапса и горчицы через культуру пыльников требует проведения дальнейших исследований. 5.1. Подбор питательных сред для индукции новообразований в культуре пыльников рапса и горчицы Процесс индукции гаплоидных новообразований и регенерации из них растений подвержен влиянию ряда факторов. Наиболее важными из них являются состав питательной среды и набор используемых фитогормонов [23, 161, 182]. Известно, что такие фитогормоны как 2,4-Д, БАП, НУК и некоторые другие, наиболее часто используемые в культуре пыльников, индуцируют эмбриоидогенез или каллусогенез [35, 60]. Хорошо известна и различная реакция генотипов на культивирование in vitro у представителей целого ряда семейств, таких, например, как пасленовые, злаковые, капустные, бобовые и многих других [29, 46, 308, 320]. Эта реакция проявляется в весьма существенном влиянии генотипа на процессы инициации новообразований, каллусогенеза, регенерации, морфогенеза и прочее. В связи с вышесказанным нами на материале селекции Института масличных культур был протестирован набор питательных сред с разным базовым составом и различным соотношением фитогормонов для выяснения закономерностей индукции новообразований в культуре пыльников рапса и горчицы. В качестве материала использовали 5 сортообразцов рапса (сорта Анна, Наташа, Отелло, Атаман и Титан) и 5 образцов горчицы (Г 2, Г 5, Г 11, Г 15, Г 44). Пыльники этих видов культивировали на питательных 133 средах на основе МС и В-5, которые различались между собой содержанием фитогормонов 2,4-Д, БАП, НУК и ИУК. На основе МС использовали следующие варианты среды – МС-1 (0,6 мг/л БАП), МС-2 (0,6 мг/л 2,4-Д), МС-3 (0,3 мг/л БАП и 0,3 мг/л 2,4-Д), МС-8 (5 мг/л ИУК), МС14 (0,4 мг/л БАП и 0,4 мг/л 2,4-Д). На основе B-5 среды были такими – B-5-1 (0,6 мг/л БАП), B-5-2 (0,6 мг/л 2,4-Д), B-5-3 (0,3 мг/л БАП и 0,3 мг/л 2,4-Д), B-5-4 (0,1 мг/л НУК и 0,1 мг/л 2,4-Д), B-5-5 (1 мг/л НУК и 1 мг/л 2,4-Д). В результате проведенных исследований было установлено, что в культуре пыльников рапса и горчицы на испытанных питательных средах происходит формирование различных типов морфогенных структур – инициированных как из микроспор (эмбриоиды и каллус), так и диплоидных тканей пыльника (каллус) (табл. 5.1.1 и 5.1.2). Таблица 5.1.1 Частота новообразований у генотипов рапса на средах с разным содержанием фитогормонов Состав Кол-во Кол-во Кол-во Кол-во Среда фитогормо- высажен- пыльников с пыльников с пыльников нов ных эмбриоидами каллусом из с каллусом пыльнииз микро- микроспор, из тычин. ков, шт. спор, % % нити, % 1 2 3 4 5 6 Образец 1 (Анна) МС-1 БАП 434 0 0 1,8±0,64 МС-2 2,4-Д 124 0 0,8±0,80 21,0±3,66 МС-3 БАП+2,4-Д 98 0 1,0±1,01 25,5±4,40 В-5-1 БАП 200 0,5±0,49 0 1,0±0,70 В-5-2 2,4-Д 100 0 0 27,0±4,44 В-5-3 БАП+2,4-Д 127 0 0 30,7±4,09 134 Продолжение таблицы 5.1.1 1 2 3 4 5 6 Образец 2 (Наташа) МС-1 БАП 577 0,2±0,17 0 36,4±2,00 МС-2 2,4-Д 190 0,5±0,53 0 25,8±3,17 МС-3 БАП+2,4-Д 137 0,7±0,73 0,7±0,73 62,0±4,15 В-5-1 БАП 251 0,4±0,45 0 2,4±0,97 В-5-2 2,4-Д 192 0 0 28,0±3,24 В-5-3 БАП+ 2,4-Д 199 0 0 42,2±3,50 Образец 3 (Отелло) МС-14 БАП+ 2,4-Д 255 1,9±0,87 0 40,4±3,07 В-5-4 НУК+2,4-Д 305 0 0 16,4±2,12 В-5-5 НУК+2,4-Д 292 0 0 21,6±2,40 Образец 4 (Атаман) МС-14 БАП+ 2,4-Д 308 0 0 41,0±2,80 В-5-4 НУК+2,4-Д 303 0 0 21,0±2,34 В-5-5 НУК+2,4-Д 316 0 0,3±0,32 25,6±2,45 Образец 5 (Титан) МС-14 БАП+ 2,4-Д 301 0 0,7±0,47 59,5±2,83 В-5-4 НУК+2,4-Д 320 0,9±0,54 0,6±0,44 22,8±2,34 В-5-5 НУК+2,4-Д 313 0 0 47,0±2,82 Как видно из таблиц 5.1.1 и 5.1.2, независимо от состава базовой среды наличие 2,4-Д в комбинации с БАП обуславливает высокую частоту спорофитных новообразований. Так, например, данная комбинация фитогормонов вызывала образование каллусной ткани с частотой 25,562,0% у различных генотипов рапса и 3,95-45,3% – горчицы. Наличие в 135 среде только БАП в большинстве случаев не инициирует или довольно слабо инициирует развитие этих структур. Инициация морфогенного каллуса из микроспор наблюдалась лишь при наличии в среде 2,4-Д как самостоятельно, так и в сочетании с БАП и НУК. Чаще всего (с частотой до 1%) это наблюдалось на средах, где 2,4-Д сочетался с фитогормоном БАП. В отношении эмбриоподобных структур никаких закономерностей влияния изученных фитогормонов выявлено не было. Таблица 5.1.2 Частота новообразований у генотипов горчицы на средах с разным содержанием фитогормонов Состав Кол-во Кол-во Кол-во Среда фитогормо высажен- пыльников с пыльников нов ных эмбриоидами, с каллусом, пыльни% % ков, шт. 1 2 3 4 5 Кол-во пыльников с каллусом из тычин. нити, % 6 Образец Г 2 МС-1 БАП 60 0 0 0 МС-2 2,4-Д 80 0 0 10,0±3,35 МС-3 БАП+2,4-Д 85 0 0 13,0±3,64 МС-14 БАП+2,4-Д 150 0 0 45,3±4,06 В5-2 2,4-Д 79 0 0 8,8±3,20 В5-3 БАП+2,4-Д 31 0 0 16,1±6,60 В5-4 НУК+2,4-Д 123 0 0 5,7±2,09 В5-5 НУК+2,4-Д 176 0 0,6±0,56 22,7±3,16 Образец Г 5 МС-8 ИУK МС-14 БАП+2,4-Д 68 0 0 0 147 0 0 0 136 Продолжение таблицы 5.1.2 1 2 3 4 5 6 В5-4 НУК+2,4-Д 124 0 0 0 В5-5 НУК+2,4-Д 179 0 0 0 Образец Г 11 МС-8 ИУK МС-14 БАП+2,4-Д 89 0 0 0 126 0 0 39,3±5,17 В5-4 НУК+2,4-Д 156 0 0,6±0,62 10,9±2,50 В5-5 НУК+2,4-Д 124 0 0 26,6±3,96 Образец Г 15 МС-8 ИУK МС-14 БАП+2,4-Д 20 0 0 0 152 0 0 3,95±1,58 В5-4 НУК+2,4-Д 150 0 0 0 В5-5 НУК+2,4-Д 153 0 0 0,6±0,62 Образец Г 44 МС-1 БАП 59 0 0 0 МС-2 2,4-Д 30 0 0 0 МС-3 БАП+2,4-Д 60 1,7±1,67 0 20,0±5,16 МС-14 БАП+2,4-Д 148 0 0 30,4±3,78 В5-1 БАП 32 0 0 0 В5-2 2,4-Д 94 0 0 0 В5-3 БАП+ 2,4-Д 93 0 0 21,5±4,25 В5-4 НУК+2,4-Д 151 0 0 29,1±3,69 В5-5 НУК+2,4-Д 125 0 0 40,8±4,39 В целом, у капустных культур на примере рапса и горчицы установлена значительная роль фитогормона ауксиновой природы 2,4-Д как в индукции новообразований гаметофитного типа, так и спорофитного типа. В свою очередь, наличие в среде одного лишь фитогормона 137 цитокининового ряда (БАП) тормозит формирование структур спорофитного типа на пыльниках. В дальнейшем эксперимент по влиянию фитогормонов на индукцию развития новообразований в культуре пыльников рапса был проведен еще на одном генотипе ярового рапса (Д 49), используя единую базовую среду МС. Результаты представлены в табл. 5.1.3. Таблица 5.1.3 Влияние фитогормонов на формирование новообразований различного типа у рапса Тип среды Контрол ь Высажено пыльников, шт. 364 Пыльники с Пыльники с новообразовановообразованиями ниями гаметофитного каллусного типа происхождения спорофитного эмбрио- калпроисхождения иды, лусы, всего, % шт. % шт. шт. 0 0 0 0 0 2,4-Д 436 190 43,6±0,17 1 0 0,2±0,01@ БАП 386 0 0* 8 0 2,1±0,04 360 139 38,6±0,21 5 1 1,7±0,04# 352 131 37,2±0,17 1 0 0,3±0,01# 2,4-Д + БАП 2,4-Д + НУК * - различия между вариантом с добавлением БАП и вариантами с 2,4-Д и их комбинацией существенны при p<0,1%; # - различия между вариантами с добавлением БАП и НОК на фоне 2,4-Д существенны при p<0,1%; @ - различия между вариантом с добавлением 2,4-Д и вариантами с БАП и их комбинацией существенны при p<0,1%. 138 Опыт включал следующие варианты: контроль (среда МС без гормонов), 2,4-Д (0,5 мг/л), БАП (0,5 мг/л), 2,4-Д + БАП (0,25 мг/л каждого из фитогормонов), 2,4-Д + НУК (0,25 мг/л каждого из фитогормонов). Как видно из табл. 5.1.3 при добавлении веществ гормонального действия, таких как 2,4-Д, БАП и их комбинации, наблюдается развитие новообразований как спорофитного, так и гаметофитного происхождения. Относительно новообразований спорофитного происхождения, то их совсем не отмечали в варианте, где присутствует только один БАП, тогда как добавление в состав питательной среды одной 2,4-Д, и в комбинации с БАП, приводило к появлению от 38,6 до 43,6 % новообразований данного типа. Это согласуется с данными таблицы 5.1.1, где наблюдали формирование незначительного количества новообразований спорофитного происхождения при наличии БАП как в среде на базе МС, так и на базе В5. На средах с добавлением 2,4-Д, БАП и их комбинации новообразования гаметофитного происхождения были представлены в основном эмбриоидами, тогда как формирование каллуса наблюдали только в одном случае. Менее всего эмбриоидов формировалось на среде с 2,4-Д. При наличии в среде БАП или БАП в сочетании с 2,4-Д количество эмбриоидов увеличивалась почти в 10 раз. Ранее (табл. 5.1.1) мы также не наблюдали формирования эмбриоидов на средах с 2,4-Д как на базе МС, так и на базе В5. Эмбриоиды в данном эксперименте формировались только при включении в состав базовой среды БАП – одного или в комбинации с 2,4-Д. Также сравнивали эффективность воздействия БАП и НУК на формирование новообразований в культуре пыльников рапса. Это устанавливали на фоне присутствия в питательной среде фитогормона 2,4-Д. Из данных табл. 5.1.3 видно, что наличие в среде нафтилуксусной кислоты было мало эффективным, поскольку в этом случае частота образования эмбриоидов составляла лишь 0,3%. В то же время добавление 139 6-бензиламинопурина существенно увеличивало частоту новообразований гаметофитного происхождения. Таким образом, установлено, что для индукции эмбриоидов из микроспор в культуре пыльников рапса лучшее действие оказывал цитокинин БАП без сочетания с другими изученными фитогормонами. При этом ингибировалось формирование морфогенных структур спорофитного происхождения. Добавление к БАП 2,4-Д также эффективно для индукции морфогенных структур гаметофитного происхождения (эмбриоидов), однако в этом случае со значительной частотой образуются аналогичные структуры из диплоидных тканей пыльника. Известно, что эффективность индукции морфогенных образований в культуре пыльников определяется не только набором и концентрацией фитогормонов в питательной среде, но и ее углеводными составляющими [292]. C целью изучения влияния углеводных компонентов на частоту морфогенных образований в культуре пыльников рапса, выделенные по стандартной методике пыльники высаживали на питательные среды с минеральной основой среды МС и двумя разными углеводами – сахарозой и мальтозой. В одном из вариантов фитогормонов не добавляли, а в качестве углевода присутствовала сахароза. В двух других вариантах присутствовал фитогормон 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л и один из углеводов (сахароза либо мальтоза) в концентрации 10%. В дальнейшем пыльники культивировали при комнатной температуре, проводя каждые 7-10 суток анализ развития пыльников и формирования новообразований. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.1.4. При исследовании влияния типа углевода в питательной среде на выход морфогенных структур различного происхождения было обнаружено, что замена сахарозы на мальтозу существенно изменяет их частоту. При этом меняется частота структур как гаметофитного, так и 140 спорофитного происхождения. Так, при наличии в среде мальтозы, в отличие от сахарозы, в 3 раза увеличивалась частота морфогенных структур гаметофитного происхождения и в 1,5 раза частота морфогенных структур из диплоидных тканей пыльника. Таблица 5.1.4 Влияние углеводов в питательной среде на формирование новообразований различного типа у рапса Тип среды Пыльники с Пыльники с новообразованиями новообразовагаметофитного ниями Высажено происхождения пыльников, каллусного типа спорофитного эмбрио- калшт. происхождения иды, лусы, всего, % шт. шт. шт. % Без гормонов + 364 0 0 0 0 0 436 190 43,6±0,17 1 0 0,2±0,01 332 203 61,1±0,26* 2 0 0,6±0,03* сахароза 2,4-Д + сахароза 2,4-Д + мальтоза * Различия между средами с сахарозой и мальтозой на фоне 2,4-Д существенны при p<0,1% Таким образом, наличие в питательной среде углевода мальтозы вместо сахарозы способствует инициации развития новообразований гаплоидного и диплоидного происхождения в культуре пыльников рапса. 141 5.2. Действие температурного фактора на индукцию новообразований в культуре пыльников рапса Хорошо известно, что температура часто может быть решающим фактором при индукции новообразований в культуре пыльников. При этом важны температурные условия как предобработки пыльников, так и в период их последующего культивирования in vitro на питательной среде. Однако сочетание разных температурных режимов исследовано мало, как и реакция отдельных генотипов на действие этого фактора. В этом плане нами изучено формирование гаплоидных новообразований в зависимости от различных комбинаций температурных обработок до и после размещения пыльников на питательной среде. В качестве материала использовали растения 6 образцов озимого и ярового рапса, предоставленные лабораторией селекции рапса ИМК НААН (г. Запорожье) и Институтом кормов НААН (г. Винница). Сорванные соцветия или бутоны рапса выдерживали на фоне пониженной (5-7°C), комнатной (20-25°C - контроль) и повышенной (32°C) температур в течение 1-2 суток. После данной температурной обработки из бутонов рапса в стерильных условиях выделяли пыльники, высаживали на искусственные питательные среды и вновь выдерживали на фоне пониженной (5-7°C), комнатной (20-25°C) и повышенной (32°C) температур в течение 4-х суток. Озимые образцы рапса перед высаживанием пыльников подвергали воздействию температурного фактора всех трех градаций (пониженная, комнатная и повышенная температуры), а яровые – обрабатывали лишь пониженной температурой. В дальнейшем пыльники культивировали при комнатной температуре в темноте согласно стандартным методикам [267]. Всего по данным 6-ти генотипам было высажено 9361 пыльников. Через каждые 7-10 суток проводили анализ пыльников, отмечая формирование новообразований спорофитного и гаметофитного происхождения. 142 Пыльники рапса в процессе культивирования на искусственных питательных средах формировали различные типы новообразований – гаметофитного спорофитной и спорофитного природы новообразования были гаметофитной происхождения. представлены природы – Новообразования лишь как каллусом, каллусом, так а и эмбриоидами. Суммарные результаты проведенного опыта приведены в табл. 5.2.1. Таблица 5.2.1 Реакция пыльников разных генотипов рапса при их культивировании in vitro на действие различных температур Пыльники с новообразоТепловая Тепловая Высажено ваниями Гено- предпослепыльни- спорофитного тип обработка, обработка, ков, шт. про°С °С исхождения, % 1 2 3 4 5 №1 6-8 22-25 32 №3 6-8 Пыльники с новообразованиями гаметофитного происхождения, % 6 Озимые образцы 6-8 166 10,8 0 22-25 163 11,0 0 32 169 8,9 0 6-8 228 0,9 0 22-25 240 1,7 0 32 236 0,8 0 6-8 277 0 0 22-25 286 0,7 0 32 286 0 0 6-8 312 5,8 0 22-25 316 6,6 0 143 Продолжение таблицы 5.2.1 1 2 22-25 32 №5 6-8 22-25 32 F1 53 F1 81 Д 49 6-8 6-8 6-8 НСР0,05 3 4 5 6 32 304 2,0 0 6-8 108 7,4 0 22-25 102 6,9 0 32 101 6,9 3,0 6-8 264 0 0 22-25 240 0 0 32 241 0 0 6-8 293 13,3 0 22-25 292 14,0 4,1 32 271 9,6 4,4 6-8 271 12,2 0 22-25 293 8,2 0 32 281 13,5 0 6-8 208 1,4 0 22-25 195 1,5 1,5 32 214 0 0 Яровые образцы 6-8 357 13,7 0,8 32 349 6,3 0,9 6-8 457 19,7 0 32 460 20,7 0 6-8 667 20,8 0 32 714 28,4 2,1 3,26 0,39 144 Как видно из приведенных данных, в результате температурной обработки новообразования гаметофитного происхождения формировались у 4-х из 6-ти генотипов. Их частота была меньшей у яровых образцов (0,82,1%) и в два раза выше – у озимых (1,5-4,4%). Новообразования спорофитного частотой и происхождения почти во всех появлялись вариантах со значительно обработки. большей Генотипические особенности были заметны лишь в случае формирования гаплоидных структур - определенные генотипы, такие как F1 81 и № 1, не образовывали их ни в одном из изученных вариантов. Диплоидные же структуры инициировались у всех генотипов, хотя и с разной частотой. Относительно обнаружено, что различий в гаплоидные действии температурного новообразования фактора значительно чаще формировались тогда, когда пыльники после высаживания на питательную среду подвергали воздействию повышенных температур или культивировали при комнатной температуре. Обработка пониженными температурами (6-8°C) в данном случае задерживала развитие гаплоидных структур. У озимых образцов рапса такие структуры не образовывались совсем, а у яровых образцов лишь один генотип F1 53 показал положительную реакцию на такую обработку. Влияние температуры в случае пред-обработки материала оказалось иным. В данном случае речь идет об озимом рапсе, поскольку яровые образцы этой культуры не подвергались предобработке высокой температурой. Пониженная температура, в отличие от повышенной, действовала эффективней в плане индукции гаплоидных новообразований. И хотя такие новообразования наблюдали и при воздействии температур 22-25°C и 32°C, их частота была в полтора-два раза меньше чем на фоне температуры 6-8°C. Фон повышенной температуры оказался более благоприятным и в плане ингибирования развития спорофитных структур, которые 145 нежелательны в пыльниковой культуре. При данных температурных условиях новообразования спорофитного типа формировались со значительно меньшей частотой чем в случае, когда пыльники перед высаживанием культивировали на фоне более низких температур. Таким образом, для инициации развития гаплоидных новообразований у рапса наиболее эффективной оказалась комбинация режима пред-обработки температурой 6-8°C с режимом после-обработки температурами 22-25 и 32°C. При этом эффективность температурного воздействия на пыльники значительно зависела от генотипа. 5.3. Особенности развития женской генеративной сферы рапса и индукции новообразований в культуре семенных зачатков В плане получения удвоенных гаплоидов интерес представляют не только мужские гаметы (культура пыльников и микроспор), но и женские (культура неоплодотворенных семязачатков). В отношении использования семенных зачатков в качестве объекта культивирования in vitro информация в научной литературе весьма ограничена [43]. 5.3.1. Связь между размером бутонов и семязачатков у рапса Размер семязачатков часто играет решающую роль при использовании их в качестве объекта биотехнологических исследований. Этот показатель возможно определять как напрямую, так и косвенно, по величине бутона. В последнем случае это осуществляется намного быстрее, что экономит время и ресурсы. Для изучения связи между размером бутонов и семенных зачатков из соцветий озимого и ярового рапса отбирали бутоны размером 2-7 мм, выделяли из них семенные зачатки и проводили их линейные измерения. Под микроскопом при помощи окуляр-микрометра измеряли максимальную 146 длину и ширину семязачатков, анализируя по каждому варианту в среднем около 30 семенных зачатков. Установлено, что линейные размеры семенных зачатков у ярового и озимого рапса на ранних этапах развития различаются (табл. 5.3.1). Так, размер семенных зачатков, выделенных из бутонов длиной 3,0 мм, для озимого рапса составил около 240х200 единиц, тогда как у ярового рапса семенные зачатки были значительно меньшего размера. С увеличением длины бутонов до 5-6 мм размер семенных зачатков у озимого и ярового рапса выравнивается и составляет 500-600 единиц в длину и 400-570 в ширину. Таблица 5.3.1 Связь между размером бутонов и семенных зачатков у рапса Размер бутона, мм 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 3,0 5,0 6,0 Семенных зачатков, шт. Размер семенных зачатков, усл.ед.* длина Рапс озимый (образец №3) 45 214,3±4,69 45 241,5±4,26 47 315,7±8,19 58 340,6±11,81 25 439,3±9,66 30 495,4±6,22 10 518,4±3,75 20 567,3±5,95 20 553,7±10,4 10 600,3±7,63 20 584,3±11,78 Рапс яровой (образец №53) 10 46,0±6,88 15 576,3±24,15 20 567,3±21,93 * 1 мм = 1489,4 усл.ед. ширина 182,4±5,65 197,7±3,57 260,6±8 273,7±6,58 309,5±8,03 339,8±7,28 353,7±2,24 416,8±7,49 412,8±11,64 484,9±11,74 472,1±8,9 44,4±5,91 538,3±29,96 572,8±20,37 147 Характерно, что семенные зачатки озимого и ярового рапса были разные и по форме. Если у озимого рапса они были удлиненные (длина значительно превышала ширину), то у ярового рапса они были более округлыми. Установление связи между размером бутонов и семенных зачатков у рапса позволило в дальнейшем определять по размеру бутонов размер семенных зачатков для их культивирования in vitro. В последующих исследованиях использовали семенные зачатки из бутонов размером 57 мм. 5.3.2. Влияние температурной обработки бутонов рапса на способность к индукции новообразований в культуре семенных зачатков Хорошо известно, что в культуре пыльников индукция гаплоидных новообразований зависит в значительной степени от температуры и длительности ее воздействия in situ [169, 193, 214, 330]. Относительно культуры неоплодотворенных семязачатков этот вопрос также может иметь важное значение. С целью изучения влияния фактора температуры на индукцию новообразований в культуре семязачатков собранные соцветия рапса выдерживали на фоне пониженной температуры 4-6°C в течение 1-7 суток, в зависимости от генотипа. После температурной обработки из бутонов рапса в стерильных условиях выделяли семенные зачатки, высаживали на питательную среду, выдерживали на фоне повышенной температуры и культивировали в искусственных условиях согласно стандартным методикам [267]. Через каждые 7-10 суток проводили анализ семенных 148 зачатков, отмечая увеличение размера и изменение цвета зачатков и появление на них новообразований каллусного типа. Установлено, что обработка соцветий рапса пониженной температурой по разному влияла на развитие семенных зачатков озимого и ярового рапса (табл. 5.3.2, 5.3.3). Таблица 5.3.2 Влияние температурной обработки соцветий озимого рапса на индукцию новообразований из семенных зачатков Гено- Длительтип Всего Семенных ность семенных зачатков с измене- термо- зачатков, ниями цвета и обработки, шт. размера дн. 3 5 8 шт. Семенных зачатков с каллусом шт. % % 0 129 15 11,6±2,82 0 0±0 1 95 26 27,4±4,57 0 0±0 2 265 41 15,5±2,22 0 0±0 3 106 2 1,9±1,32 0 0±0 4 105 0 0±0 0 0±0 7 91 0 0±0 0 0±0 1 195 73 37,4±3,47 0 0±0 2 124 28 22,6±3,75 0 0±0 3 126 29 23±3,75 1 0,8±0,79 0 249 0 0±0 0 0±0 1 152 62 40,8±3,99 1 0,7±0,66 2 166 4 2,4±1,19 0 0±0 4 109 0 0±0 0 0±0 7 77 0 0±0 0 0±0 149 Так, у озимого рапса наибольший эффект для начальной стимуляции развития семенных зачатков наблюдали при продолжительности термообработки в течение одних суток. Максимальный стимулирующий эффект отмечен у генотипа № 8, у которого процент семенных зачатков, которые начали стартовое развитие достигал 40,8%. Без обработки, в контроле, семенные зачатки или не развивались, или их развитие было значительно слабее. Более длительная температурная обработка – в течение 4-х и 7-ми дней не инициировала развитие исследуемых структур. Таблица 5.3.3 Влияние температурной обработки соцветий ярового рапса на индукцию новообразований из семенных зачатков Гено- Длительтип Всего Семенных ность семенных зачатков с измене- термо- зачатков, ниями цвета и обработки, шт. размера дн. 111 175 53 81 шт. Семенных зачатков с каллусом шт. % % 1 62 5 8,1±3,46 10 16,1±4,67 2 66 6 9,1±3,54 23 34,8±5,87 4 84 18 21,4±4,48 47 56±5,42 1 116 16 13,8±3,2 0 0±0 3 95 27 28,4±4,63 0 0±0 1 54 6 11,1±4,28 42 77,8±5,66 2 128 17 13,3±3 57 44,5±4,39 4 141 19 13,5±2,88 43 30,5±3,88 1 340 61 17,9±2,08 5 1,5±0,65 2 192 10 5,2±1,6 0 0±0 3 250 60 24±2,7 0 0±0 4 123 38 30,9±4,17 0 0±0 150 У ярового рапса ситуация была несколько иной. Обработка температурой в течение 4-х суток была более эффективной по сравнению с 1-3-суточной обработкой. Максимальный стимулирующий эффект наблюдали у генотипа № 81, где процент семенных зачатков, которые начали стартовое развитие достигал почти 31%. Что касается новообразований из семенных зачатков, то у озимого рапса их почти не наблюдали ни в опытных, ни в контрольном вариантах. У ярового же рапса каллус на семенных зачатках формировался с достаточно высокой частотой. В отдельных случаях отмечали до 77,8% новообразований каллусного типа. Однако связи частоты формирования новообразований с температурным фактором обнаружено не было. 5.4. Идентификация гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса, полученных через культуру пыльников (цитологические и морфологические исследования) Считается, что поскольку растения при использовании культуры пыльников образуются из гаплоидных структур, они чаще всего имеют гаплоидный набор хромосом. Часть растений, тем не менее, могут быть и удвоенными гаплоидами (часто их называют «дигаплоидами») вследствие спонтанного удвоения хромосом в культуре in vitro или воздействия специфических агентов типа колхицина – вещества, ингибирующего образование хроматинового веретена в процессе клеточного деления. Практический интерес для последующей работы представляют, как правило, удвоенные гаплоиды. Визуально же отличать гаплоидные растения от удвоенных гаплоидов не всегда представляется возможным. В литературе имеется немного информации об отличиях гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса. Целью нашей работы было выявить различия между гаплоидными растениями и удвоенными гаплоидами озимого рапса, 151 полученными через культуру пыльников, на цитологическом и морфологическом уровнях. В качестве материала для дифференциации гаплоидных растений и удвоенных гаплоидов использовали растения озимого рапса, полученные в культуре in vitro при культивировании пыльников. Для сравнения привлекали также диплоидные растения селекционно-ценных образцов этой культуры из коллекции ИМК НААН. Подсчет количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и измерение длины замыкающих клеток устьиц проводили в эпидермальной ткани, взятой с нижней стороны апикальной части листа. Использовали наиболее развитые листья с базальной части стебля. Эпидермальную ткань фиксировали в ледяной уксусной кислоте в течение 20 мин, после чего ее помещали в краситель на 10 мин. В качестве красителя использовали 5%ный раствор йода в йодистом калии [70]. Затем эпидермальные высечки просматривали под световым микроскопом с увеличением × 1125. По каждому образцу анализировали 150 устьиц. Подсчитывали общее количество хлоропластов в обеих замыкающих клетках каждого из устьиц. У каждого растения также подсчитывали количество устьиц в 30-ти полях зрения, которое затем пересчитывали на единицу площади в 1 мм2. Цитологические характеристики гаплоидных образцов и удвоенных гаплоидов сравнивали между собой и с соответствующими усредненными показателями диплоидов. После начала цветения анализировали морфологические характеристики цветков диплоидных растений, гаплоидов и удвоенных гаплоидов в десяти повторностях. При этом учитывали такие элементы цветка как максимальный диаметр, длину и ширину лепестка, а также длину пыльников. Анализируемая популяция растений была получена из эмбриоидов при культивировании пыльников озимого рапса на искусственной 152 питательной среде (рис. 5.4.1). В связи с этим данную популяцию, предположительно, составляли растения двух типов – гаплоиды и спонтанно удвоенные гаплоиды [102]. Изучаемые растения вначале анализировали на плоидность методом прямого подсчета количества хромосом в соматических клетках. Результаты анализа метафазных пластинок показали, что среди проанализированных 5 образцов рапса были как растения с количеством хромосом около 19, так и с увеличенным в 2 раза (рис. 5.4.2) количеством хромосом. То есть, часть растений была гаплоидами (2 образца), а другие растения (3 образца) – удвоенными гаплоидами. Рис. 5.4.1. Индукция in vitro гаплоидных структур эмбриоидного (вверху) и каллусного (внизу) типов на пыльниках озимого рапса 153 Рис.5.4.2. Метафазные пластинки гаплоидного образца (слева) и удвоенного гаплоида (справа) рапса Те же растения с разной плоидностью, определенную прямым методом подсчета хромосом, анализировали на плоидность и косвенными методами. Эти методы включали как цитологический, так и морфологический анализ. В первом случае был проведен подсчет количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, измерение размера замыкающих клеток устьиц и определение количества устьиц в ткани эпидермиса и количества эпидермальных клеток на единицу площади листа. Данные о количестве хлоропластов в замыкающих клетках устьиц растений разной плоидности представлены в таблице 5.4.1. 154 Таблица 5.4.1 Количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц разных по плоидности образцов рапса озимого Плоидность № образцов по образца количеству Количество хлоропластов, шт. хромосом Количество хлоропластов по отношения к диплоидам, % 1 Гаплоид 12,8±0,12 63 2 Гаплоид 14,4±0,14 71 3 Удвоенный гаплоид 20,5±0,15 100 4 Удвоенный гаплоид 19,5±0,16 100 5 Удвоенный гаплоид 20,9±0,15 100 6 Диплоид 20,3±0,27 – 7 Диплоид 20,9±0,22 – Установлено, что гаплоидные по числу хромосом образцы характеризовались значительно меньшим количеством хлоропластов по сравнению с удвоенными гаплоидами или диплоидными образцами, которые были взяты для сравнения. Их количество у гаплоидных растений варьировало от 13 до 14 штук на клетку, тогда как у удвоенных гаплоидов их было 19-21 штук на клетку (рис.5.4.3). Количество хлоропластов у гаплоидов и удвоенных гаплоидов по отношению к диплоидным образцам, которые в данном случае можно рассматривать как контроль, составило 100% для удвоенных гаплоидов и 63-71% - для гаплоидных образцов (табл. 5.4.1). Таким образом, уменьшение количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц гаплоидов составило 29-37% по сравнению с диплоидами и удвоенными гаплоидами. 155 Рис. 5.4.3. Количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц гаплоида (слева) и удвоенного гаплоида (справа) рапса Помимо хлоропластов у растений, полученных через культуру пыльников, анализировали и длину замыкающих клеток устьиц (табл. 5.4.2). Из данных этой таблицы видно, что размер устьиц гаплоидных растений значительно отличался от диплоидов и удвоенных гаплоидов. Они были почти на треть короче по сравнению с вышеупомянутыми образцами. Длина замыкающих клеток устьиц удвоенных гаплоидов также отличалась от диплоидов в меньшую сторону и по отношению к ним составляла менее 90%. Еще одним цитологическим критерием, по которому проводили сравнение полученных через культуру пыльников растений, служило количество устьиц на единицу площади. Как видно из таблицы 5.4.3, наибольшее количество устьиц было у растений с гаплоидным набором хромосом. Их было почти в полтора раза больше чем у удвоенных гаплоидов и более чем в два раза больше чем у диплоидов. Очевидно, это обусловлено более мелким размером клеток гаплоидов по сравнению с диплоидами. Имелись также некоторые различия и между удвоенными гаплоидами и диплоидами. У растений первой группы количество устьиц на 1 мм2 было большим. 156 Таблица 5.4.2 Длина замыкающих клеток устьиц у гаплоидов, удвоенных гаплоидов и диплоидных растений рапса озимого № Плоидность образца Длина Размер замыкающих замыкающих клеток устьиц, клеток устьиц по мкм отношению к диплоидам, % 1 Гаплоид 16,42±0,10*** 61 2 Гаплоид 16,58±0,11*** 61 3 Удвоенный 23,83±0,13 88 22,26±0,18 82 23,09±0,14 85 гаплоид Удвоенный 4 гаплоид Удвоенный 5 гаплоид 6 Диплоид 27,06±0,25 – 7 Диплоид 26,91±0,23 – *** Гаплоидные образцы отличаются от удвоенных гаплоидов и диплоидных растений на уровне существенности p<0,1% Также было проанализировано количество эпидермальных клеток на единицу площади листовой поверхности у растений рапса различной плоидности (табл. 5.4.4). Установлено, что у гаплоидных растений клетки были значительно меньшего размера и их количество в 1,4-1,9 раз превышало этот показатель у удвоенных гаплоидов и диплоидов. Удвоенные гаплоиды по этому показателю существенно не отличались от диплоидов. 157 Таблица 5.4.3 Количество устьиц на 1 мм2 у гаплоидов, удвоенных гаплоидов и диплоидных растений рапса озимого № Плоидность по Количество Количество устьиц образца числу хромосом устьиц на 1 мм2, на 1 мм2 по шт. отношению к диплоидам, % 1 Гаплоид 314±24,5 220 2 Гаплоид 243±7,9 170 3 Удвоенный гаплоид 171±4,6 120 4 Удвоенный гаплоид 186±5,6 130 5 Удвоенный гаплоид 186±6,4 130 6 Диплоид 157±3,1 – 7 Диплоид 129±3,9 – При проведении цитологических исследований учитывались методические особенности, выявленные при изучении возможностей использования размера анатомических элементов для обнаружения гаплоидов кукурузы [113]. В частности, известно, что имеется некоторая изменчивость в размере замыкающих клеток устьиц в пределах листа и в зависимости от возраста листа. В этой связи для измерений мы использовали эпидермальную ткань лишь с определенной части листьев одного возраста. По данным Хохлова и др. [113] различия по размеру клеток у гаплоидов и диплоидов кукурузы выражались в пределах 40%. В наших исследованиях размер замыкающих клеток устьиц у гаплоидов был меньше на 39% по сравнению с диплоидами и на 28% по сравнению с удвоенными гаплоидами (табл.5.4.2). 158 Таблица 5.4.4 Количество эпидермальных клеток на 1 мм2 у гаплоидов, удвоенных гаплоидов и диплоидных растений рапса озимого Количество Количество № Плоидность по эпидермальных эпидермальных образца числу хромосом клеток на 1 мм2, клеток на 1 мм2 по шт. отношению к диплоидам, % 1 Гаплоид 583,2±19,63 161,6 2 Гаплоид 528,4±33,07 146,5 3 Удвоенный гаплоид 306,0±20,28 84,8 4 Удвоенный гаплоид 378,2±11,75 104,8 5 Удвоенный гаплоид 337,8±9,90 93,6 6 Диплоид 360,8±12,93 – НСР0,05 = 69,93 шт. на 1 мм2 Различия между растениями разной плоидности исследовали и на морфологическом уровне. Эти различия наблюдались даже визуально – у гаплоидных растений цветки были значительно мельче (рис. 5.4.4). Морфология некоторых элементов цветка у растений разной плоидности представлена в таблице 5.4.5. Как видно, все элементы цветков, сформированных на растениях гаплоидного типа, были существенно меньше, чем у удвоенных гаплоидов и у диплоидного образца. Диаметр цветка у гаплоидов по сравнению с удвоенными гаплоидами уменьшился в 1,4 раза, длина пыльников – в 1,8 раза, длина и ширина лепестков – в 1,6 раза. При этом различия между удвоенными гаплоидами и диплоидами не были выявлены. 159 Таблица 5.4.5 Морфология цветков растений рапса озимого разного типа плоидности Диаметр Длина Ширина Длина цветка, лепестка, лепестка, пыльника, мм мм мм мм Диплоид 18,1±0,41 13,0±0,25 6,2±0,23 4,4±0,19 Удвоенный гаплоид 17,2±0,35 12,9±0,38 6,5±0,21 4,0±0,18 Гаплоид 12,6±0,23* 9,5±0,49* 4,0±0,14* 2,2±0,14* Тип растения# * – отличия от удвоенного гаплоида и диплоида существенны при p < 0,1%. # – усредненные значения образцов одного и того же типа. Рис. 5.4.4. Морфология цветков (вверху) и побегов (внизу) разного типа плоидности рапса озимого: слева – гаплоида, справа – удвоенного гаплоида 160 Рис. 5.4.5. Завязываемость семян у гаплоидного образца (слева) и удвоенного гаплоида рапса озимого Цветки как гаплоидных растений, так и удвоенных гаплоидов образовывали достаточно много пыльцы. Однако, если у удвоенных гаплоидов наблюдалось нормальное завязывание семян, то у гаплоидов формировались стручки лишь с единичными семенами (рис. 5.4.5). Высокая завязываемость семян в первом случае указывает на нормальное протекание процессов мейоза, микро- и макроспорогенеза и подтверждает, что у данных растений имеется удвоенный набор хромосом (2n=38). Плохая завязываемость семян во втором случае говорит о том, что данные растения имеют одинарный набор хромосом (n=19). 161 Пыльцевые зерна различающихся по плоидности растений рапса визуально также отличались (рис. 5.4.6). Гаплоиды формировали много деформированной пыльцы, которая и по размеру и по форме была иной, чем у удвоенных гаплоидов или диплоидов. Рис. 5.4.6. Пыльцевые зерна гаплоида (слева) и удвоенного гаплоида (справа) рапса озимого под микроскопом Таким образом, показано, что гаплоидные растения и удвоенные гаплоиды озимого рапса можно достаточно надежно различать и при помощи косвенных методов анализа. В результате сравнения на цитологическом уровне установлено, что они существенно отличались по количеству хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размеру замыкающих клеток устьиц, количеству устьиц и эпидермальных клеток на единицу площади листа. У гаплоидов два первых показателя были меньше, а количество устьиц и количество эпидермальных клеток было больше чем у удвоенных гаплоидов и диплоидов. Проведенные исследования растений разных типов плоидности выявило их существенные отличия по морфологии цветка. При этом у 162 гаплоидов уменьшался как диаметр цветка и размеры лепестков, так и длина пыльников. Обобщая представленные в данном разделе данные, можно сделать вывод о том, что ауксин 2,4-Д самостоятельно или в различных сочетаниях чаще чем фитогормон БАП индуцирует образование на культивируемых пыльниках морфогенных структур каллусного типа, инициированных из микроспор. Использование лишь одного БАП ингибирует формирование морфогенного каллуса из диплоидной ткани пыльника, тогда как при использовании 2,4-Д частота таких новообразований существенно увеличивается. Выявлено, что температурный режим пред- и постобработки пыльников существенно влиял на частоту гаплоидных новообразований у рапса. Наиболее эффективным было взаимодействие пред-обработки температурой 6-8°C с режимом после-обработки температурами 22-25°C и 32°C (рис. 5.4.7). Установлено, что линейные размеры семенных зачатков у ярового и озимого рапса на ранних этапах развития существенно отличаются. Однако с увеличением длины бутонов до 5-6 мм размеры семенных зачатков выравниваются и составляют 0,34-0,40 мм по длине и 0,27-0,38 мм в ширину. Семенные зачатки озимого и ярового рапса разные и по форме. Низкотемпературная обработка соцветий рапса по разному влияла на развитие семенных зачатков озимого и ярового рапса. У озимого рапса наибольший эффект для начальной стимуляции развития семенных зачатков наблюдали при продолжительности термообработки в течение 1 суток, а у ярового рапса обработка течение 4-х суток была более эффективной. Новообразований из семенных зачатков почти не наблюдали у озимого рапса ни в опытных, ни в контрольном вариантах, тогда как у ярового рапса каллус на семенных зачатках формировался с достаточно 163 Рис. 5.4.7. Растения рапса, полученные через культуру пыльников, перед высадкой в грунт высокой частотой, хотя связи частоты формирования новообразований с температурным фактором в данном случае и не установлено. Между гаплоидами и удвоенными гаплоидами имеются существенные различия как на цитологическом, так и на морфологическом уровне, которые детектируются прямыми и косвенными методами. Показано, что у гаплоидных растений количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и размер самих замыкающих клеток устьиц были значительно меньшими, а количество устьиц и количество эпидермальных клеток на единицу площади листа – большим чем у удвоенных гаплоидов. Гаплоиды характеризовались также меньшими размерами лепестков и пыльников и, в целом, цветка. 164 Практическим результатом проведения данных исследований стала передача в лабораторию селекции сортов и гибридов рапса Института масличных культур НААН удвоенных гаплоидов рапса для вовлечения их в селекционный процесс (см. Приложение Б). Результаты, представленные в данной главе, отражены в публикациях автора [102, 105, 300]. 165 РАЗДЕЛ 6 ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА Подсолнечник составляет значительную долю мирового рынка масличных культур и является основной масличной культурой Украины. Расширение площадей под данной культурой, замена устаревающих сортов и гибридов на более урожайные, пластичные и технологичные требует привлечения в селекционный процесс методов и приемов, облегчающих и ускоряющих работу селекционеров. Длительный период, затрачиваемый учеными для создания каждой новой формы, стимулирует интенсивное использование новейших подходов, призванных сократить период от скрещивания исходных родительских форм до получения константных образцов, которые в дальнейшем станут сортами или войдут в состав гибридов. Из целого ряда перспективных методов одним из наиболее доступных является метод культуры незрелых зародышей. Этот биотехнологический прием на подсолнечнике используется в разных аспектах, например, для получения отдаленных гибридов, введения в культурные сорта желаемых признаков, а также для ускорения создания новых форм данной культуры [74, 76, 164, 170, 187, 188, 223]. Получение одного-двух дополнительных поколений в год позволяет существенно сократить период, требуемый для приведения расщепляющейся формы к стабильному состоянию. Это возможно благодаря тому, что в условиях искусственного культивирования возможно стимулировать развитие зародыша минуя стадию покоя и, частично, дозревания, что может существенно ускорить получение взрослых продуктивных растений следующего поколения [97, 155]. 166 Как показано для многих культур, возраст незрелых зародышей имеет существенное значение для сохранения их высокой жизнеспособности и получения из зародышей полноценных растений [166, 252, 293]. Слишком молодые зародыши требуют питательной среды значительно более сложного состава, их сложно выделять из соцветий, они отстают в росте, характеризуются рядом морфологических изменений, легко образуют каллус, что зачастую нежелательно. Зародыши, взятые на очень поздних стадиях развития, труднее вводить в культуру, поскольку они сильнее повреждаются болезнями и вредителями в полевых условиях. На подсолнечнике практически отсутствует информация о влиянии возраста зародышей на частоту получаемых их них растений. Кроме того, не имеется конкретных данных о различиях в характеристиках растений, полученных из зародышей разного возраста, что может иметь важное значение в практической работе. В связи с вышеизложенным целью нашей работы было изучить влияние возраста незрелых зародышей на выход жизнеспособных растений, а также влияние эмбриокультуры на некоторые характеристики полученных из зародышей растений. 6.1. Влияние возраста зародышей подсолнечника на частоту полученных из них растений в культуре in vitro В качестве материала для исследований использовали зародыши культурного подсолнечника Helianthus annuus L. трех гибридов (1814 × 1811, 1812 × 1811, 1813 × 1811) и сорта Прометей. Через 7-21 суток после принудительного самоопыления, в зависимости от представленного образца, из корзинок асептически выделяли незрелые зародыши и высаживали в чашки Петри на искусственную питательную среду. Питательная среда представляла собой модифицированную среду МС со сниженным вдвое содержанием минеральных веществ и повышенным содержанием витаминов. Зародыши культивировали при 16-часовом 167 фотопериоде при температуре 20-25°C. После формирования нормальных растений их переносили в почву и доращивали до стадии цветения. Незрелые зародыши начинали рост на искусственной питательной среде через несколько дней их культивирования in vitro. Так, зародыши исследуемых гибридов прорастали через 5-7 суток. Однако это происходило только у образцов, зародыши которых формировались в условиях in vivo 21 сутки (табл. 6.1.1, рис. 6.1.1). Лишь у образца 1814 × 1811 не отмечено развитие за этот период. Зародыши, выделенные через 14 суток после самоопыления, в течение этого времени еще не образовывали ни корней, ни Рис. 6.1.1. Прорастание 21-суточных зародышей образца 1813 × побегов. Эти структуры появлялись 1811 через 7 суток после лишь через 10-14 суток с частотой посадки 15,8-25,0% в зависимости генотипа. Через 14 от дней культивирования незрелые зародыши возрастом 21 сутки формировали корни и побеги с частотой до 85,7%, а те, которые выделяли в более молодом возрасте (14 суток), образовывали проростки с частотой до 25%. После высадки полученных растений в сосуды с почвой их приживаемость (в целом по вариантам) составила около 58% для 14суточных зародышей и около 80% – для 21-суточных (рис. 6.1.2). 168 Таблица 6.1.1 Образование проростков незрелыми зародышами разного возраста у гибридов подсолнечника Возраст зародышей, суток 14 21 Высажено зародышей, Генотип шт. Образовали проростки, % через 7 дней через 14 дней 1814 × 1811 36 0 25,0±7,32 1812 × 1811 19 0 15,8±8,60 1813 × 1811 12 0 16,6±11,22 1814 × 1811 41 0 19,5±6,26 1812 × 1811 15 26,7±11,82 26,7±11,82 1813 × 1811 14 64,3±13,29 85,7±9,71 существенно влияет Безусловно, возраст зародышей на эффективность получения из них растений не только у гибридов, но и у сортового материала. Чем моложе зародыши, тем сложнее подобрать для них условия, обеспечивающие нормальное дальнейшее развитие. Тем не менее конкретных данных о различиях в частоте растений, полученных в зависимости от возраста используемых зародышей у подсолнечника, в доступной литературе не выявлено. Согласно нашим данным, как это видно из таблицы 6.1.2, из зародышей сорта Прометей 14-суточного возраста было получено 60,6% растений, тогда как из зародышей 7-суточного возраста – лишь 3,1%. Кроме того, ткани более дедифференцируются и молодых зародышей образуют каллус. В значительно нашем случае чаще при культивировании зародышей 7-суточного возраста таких зародышей было почти 18%. Это также сказывается на конечном результате и снижает долю полученных из зародышей нормальных растений. 169 Таким образом, частота растений, полученных из незрелых зародышей подсолнечника, существенно зависела от возраста зародышей. Зародыши, выделенные через 14 суток после опыления, не прорастали в короткие сроки (7 дней культивирования), в отличие от зародышей 21суточного возраста. Частота прорастания незрелых зародышей 14суточного и 21- суточного возрастов через 14 дней их культивирования была близкой и лишь для отдельных генотипов количество ростков, которые появились, было значительно большим для зародышей 21суточного возраста [90]. В целом из представленных данных видно, что нормальные растения подсолнечника возможно получать как из зародышей трехнедельного 80 60 40 20 0 14 21 Возраст зародышей, суток Рис. 6.1.2. Приживаемость растений, полученных из незрелых зародышей подсолнечника разного возраста 170 Таблица 6.1.2 Частота получения растений из незрелых зародышей разного возраста у сорта подсолнечника Прометей Возраст Высажено зародышей, зародышей, суток шт. 7 97 17,5±3,86# 3,1±1,76### 14 175 6,9±3,67 60,6±3,69 Сформировали каллус, % Получено растений, % Примечание. #,### - отличия между вариантами по возрасту зародышей существенны при p < 5 и 0,1% соответственно. возраста, так и из двух- и даже однонедельного. Однако возраст зародышей существенно влияет на частоту регенерированных из них растений, что выражается в снижении данного показателя при уменьшении сроков формирования зародышей in vivo. 6.2. Проявление некоторых морфологических признаков у растений, полученных из зародышей разного возраста При использовании метода эмбриокультуры важно знать особенности растений, полученных из зародышей соответствующего возраста. Это может иметь важное значение в практической работе. Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о различиях в характеристике растений, полученных из зародышей разного возраста. В связи с этим мы изучали каким образом возраст зародышей подсолнечника влияет на отдельные показатели продуктивности и морфологические особенности экспериментальных растений. В качестве материала использовали две линии подсолнечника из лаборатории селекции межлинейных гибридов подсолнечника Института 171 масличных культур: ЗЛ-809 и ЗЛ-95. Растения получали из зародышей двух возрастов: 8-10 суток (1 неделя) и 14-16 суток (2 недели). Корзинки вышеуказанных образцов подсолнечника изолировали до цветения, а затем принудительно самоопыляли. Зародыши соответствующего возраста выделяли из корзинок, промывали в растворе с детергентом 1-2 минуты, ополаскивали проточной водой 5-10 минут, стерилизовали 30 секунд в этиловом спирте и 20 минут в 5%-ном растворе хлорамина, промывали стерильной водой и высаживали на искусственную питательную среду (1/2 МС) с добавкой витаминов. Культивировали в темноте 1 сутки, а затем на свету до прорастания зародышей и формирования зеленых растеньиц (7-10 дней). Сформированные растения с побегами и корнями высаживали в небольшие емкости со стерильной почвой. После 2-х недельной акклиматизации они были высажены в открытый грунт на опытном участке ИМК НААН. Анализировали высоту растений, сроки зацветания и длительность вегетационного периода. Как было установлено, возраст зародышей подсолнечника существенно повлиял на некоторые количественные характеристики полученных из них растений. Для обеих изученных линий характерным было то, что более молодые по возрасту зародыши формировали и более низкие растения (табл. 6.2). Вероятно, срок 8-9 суток in vivo недостаточен для того, чтобы генетическая программа, отвечающая за развитие вегетативных органов, в частности, признаков, обеспечивающих нормальную высоту изученных линий подсолнечника, была полностью реализована. Задержки в развитии вегетативной сферы при культивировании более молодых зародышей приводили и к удлинению вегетационного периода в целом. Правда, здесь сказались некоторые генотипические различия между линиями. Так, растения линии ЗЛ-809, в отличие от ЗЛ-95, имели 172 одинаковую длину вегетационного периода, независимо от возраста использовавшихся зародышей. Однако, сроки зацветания растений (т.е. период от высаживания зародышей на питательную среду до начала цветения растений), полученных из зародышей разного возраста, практически не различались. Вероятной причиной отсутствия различий по срокам цветения между разными вариантами может быть, например, то, что генетическая программа, отвечающая за данный признак, уже начала реализовываться in vivo к моменту выделения зародышей даже самого молодого возраста – 8-9 суток. Тому факту, что растения, выросшие из зародышей 8-9-суточного возраста, зацветают через то же количество дней, что и растения, выросшие из зародышей 14-16-суточного возраста, можно найти успешное практическое применение в плане совмещения сроков цветения линий с целью успешного проведения гибридизации. Таблица 6.2 Влияние возраста зародышей на некоторые количественные характеристики полученных из них растений у двух линий подсолнечника Линия ЗЛ-95 Признак Высота, см Дней до начала цветения Вегетационный период, дн. Линия ЗЛ-809 8-9-суточн. 14-16-суточн. 8-9-суточн. 14-16-суточн. зародыши зародыши зародыши зародыши 69,8±4,85 86,2±2,59** 44,3±1,68 55,8±2,58*** 76,5±1,32 75,7±0,84 67,7±0,96 66,4±0,53 118,9±1,73*** 114,1±0,98 114,8±1,16 127,5±1,74 **, *** – различия между вариантами по возрасту зародышей существенны на 1% и 0,1% уровнях значимости, соответственно. 173 Сравнивая высоту растений, полученных через культуру зародышей, с высотой растений тех же образцов, выращенных в полевых условиях, было установлено, что степень ингибирования признака «высота растений» при культивировании зародышей на искусственной питательной среде зависела от генотипа. Оказалось, что у линии ЗЛ-809 ингибирование было более сильным, чем у линии ЗЛ-95. Так, степень снижения высоты растений линии ЗЛ-809 для однонедельных зародышей составила 2,1 раза, а для линии ЗЛ-95 – 1,3 раза. Установлено, что по таким морфологическим признакам как диаметр корзинки, количество семян в корзинке, угол наклона корзинки, морфотип листа, растения, полученные из одно- и двухнедельных зародышей, практически не различались. Так например, средний диаметр корзинки у линии ЗЛ-809 был 8,5±0,56 см, а у растений, выросших из двухнедельных зародышей, – 9,0±0,64 см. Сходными показателями по диаметру корзинки характеризовалась и линия ЗЛ-95. Особо следует остановиться на количестве семян, полученных с опытных растений. Это важно в связи с тем, что основное назначение метода культуры незрелых зародышей – доведение растений до стадии биологического созревания и получения с них определенного количества семян, достаточного для дальнейшего ведения селекционной работы. Наш эксперимент показал, что растения, выросшие как из одно-, так и из двухнедельных зародышей, формируют достаточное количество семян. Однако в последнем случае (двухнедельные зародыши) завязываемость семян существенно выше. Таким образом, возраст зародышей влияет на такие признаки как высота растений и длина вегетационного периода. С уменьшением возраста зародышей высота растений уменьшается, а вегетационный период удлиняется, хотя на проявление последнего признака оказывают влияние и генотипические особенности используемых образцов. 174 6.3. Эффективность метода незрелых зародышей в зависимости от генотипа экспланта В качестве материала для исследований использовали селекционные образцы (линии) подсолнечника, созданные лабораторией селекции межлинейных гибридов подсолнечника ИМК НААН: ЗЛ-131, ЗЛ-103, ЗЛ169, ЗЛ-809, ЗЛ-2554. Данные линии используются для получения гибридов и различаются по длительности вегетационного периода, высоте и некоторым другим признакам. Выращенные в полевых условиях растения перед цветением изолировали, после начала цветения принудительно самоопыляли, а через 2 недели завязавшиеся семянки собирали и стерилизовали в растворе гипохлорита кальция или натрия (хозяйственный отбеливатель). Асептически выделенные зародыши высаживали на агаризованную среду МС-3 (среда МС с половинной концентрацией макросолей) в чашки Петри и культивировали при температуре 25±3°С и 16-часовом фотопериоде. Через 9-13 дней укоренившиеся проростки высаживали в почву и в дальнейшем выращивали на фитотроне в стандартных условиях. По каждому генотипу подсчитывали количество полученных растений и количество завязавшихся семян в корзинке, а также анализировали некоторые другие селекционно важные признаки. Состав используемой питательной среды оказался вполне подходящим для культивирования зародышей подсолнечника линий запорожской селекции. Зародыши всех используемых генотипов быстро начинали рост, хотя в дальнейшем и различались по типу развития в искусственных условиях. Так, зародыши линий ЗЛ-131 и ЗЛ-809 образовывали мощные, хорошо растущие, быстро укореняющиеся проростки, тогда как среди проростков линий ЗЛ-2554 и ЗЛ-169 отмечалось значительное количество нарушений (искривленные, желтеющие, 175 витрифицированные растеньица). Зародыши линии ЗЛ-103 отставали в росте, слабо образовывали корни. В целом, у этой линии около 25% высаженных зародышей так и не дали корней. Такие различия роста in vitro сказались и на количестве прижившихся после высадки в грунт растений. Например, до фазы цветения было доведено более 70% высаженных зародышей генотипов ЗЛ-809 и ЗЛ-131, тогда как у линий ЗЛ-2554 и ЗЛ-169 – лишь около 50%. В значительной мере культивирование зародышей in vitro повлияло на высоту растений (рис. 6.3). Так, после доращивания зародышей линии ЗЛ169 наблюдалось 5-10-кратное снижение высоты растений, по сравнению с высотой растений в полевых условиях при посеве семенами, а у генотипа ЗЛ-131, более высокорослого в полевых условиях, высота растений снижалась не более чем в 1,5 раза [97]. Рис. 6.3. Начинающие цветение растения линий ЗЛ 809 (слева) и ЗЛ 169 (справа), полученные после культуры зародышей Не было установлено четкой зависимости между длительностью периода всходы-цветение у изученных линий в естественных условиях и длительностью периода от высадки зародышей на искусственную 176 питательную среду до начала цветения корзинки. Так, несмотря на то, что линию ЗЛ-809 селекционеры относят к ультраскороспелой группе (вегетационный период 85 дней), цветение растений данного образца после культивирования зародышей in vitro протекало практически одновременно с линиями ЗЛ-131 и ЗЛ-2554, значительно более позднеспелыми (вегетационный период 100 и 98 дней соответственно). Практически все растения, полученные после культивирования зародышей, завязали семена, хотя варьирование по данному признаку было достаточно большим, как в пределах каждой линии, так и между ними (табл. 6.3). Таблица 6.3 Реакция некоторых генотипов подсолнечника на культивирование зародышей в условиях in vitro Генотип Высажено зародышей, Получено растений Число семян в корзинке, шт. шт. шт. % среднее максимальное ЗЛ-103 183 94 51,4 23,7±1,69 74 ЗЛ-131 192 140 72,9 24,0±2,11 153 ЗЛ-169 209 100 47,9 10,4±0,92 52 ЗЛ-809 207 161 77,8 50,6±2,14 146 ЗЛ-2554 155 74 47,7 25,6±2,81 97 В целом, среднее число семян в корзинке было меньше чем в полевых условиях. Например, у линии ЗЛ-809 в поле этот показатель составил 925±103 шт., а при использовании эмбриокультуры – 50,6±2,14 шт. Эта же линия, по сравнению с другими, при культивировании зародышей in vitro характеризовалась и наибольшим средним количеством семян на корзинку, 177 а наименьшее количество (10,4 шт.) отмечали у линии ЗЛ-169. При этом у образцов с лучшим развитием зародышей в условиях in vitro среднее число семян на корзинку было значительно выше, чем у остальных генотипов. Максимальное же количество выполненных семян в корзинке составило 153 и 146 шт. у линий ЗЛ-131 и ЗЛ-809 соответственно. Семена всех образцов, несмотря на то, что они были большей частью мельче, чем полученные в полевых условиях, давали после посева в почву нормальные всходы. Таким образом, показано, что метод эмбриокультуры можно с успехом использовать при работе с генетическим материалом подсолнечника запорожской селекции с целью ускорения селекционного процесса (например, при создании новых форм или для более быстрого получения дополнительных поколений). При этом установлено, что при доращивании незрелых зародышей подсолнечника двухнедельного возраста количество полученных растений у разных линий варьирует от 47 до 77%. Метод эмбриокультуры возможно использовать и в другом аспекте. В частности, после культивирования зародышей in vitro у подсолнечника наблюдается ускоренное, по сравнению с условиями естественного выращивания, цветение. Этот аспект, иногда нежелательный, был бы весьма полезен при оценке селекционного материала подсолнечника по методу грунт-контроля, поскольку значительно ускорил бы эту длительную процедуру [96]. Установлено, подсолнечника выращиванием что при запорожской в полевых культивировании селекции условиях, in vitro, зародышей по изменяется линий сравнению ряд с свойств регенерированных растений, в частности уменьшается их высота, быстрее наступает цветение, при этом степень этих изменений зависит от генотипа. Обобщая представленные в данной главе результаты, можно сделать следующие выводы. 178 Нормальные продуктивные растения подсолнечника можно получать как из зародышей трехнедельного, так и двух- и однонедельного возраста. При доращивании незрелых зародышей подсолнечника двухнедельного возраста количество полученных растений, в зависимости от генотипа, варьирует от 47 до 77%, а в случае зародышей однонедельного возраста – составляет около 3%. Динамика прорастания незрелых зародышей подсолнечника существенно зависит от их возраста. Зародыши 14-суточного возраста, в отличие от 21-суточных, не прорастают через 7 дней культивирования. Через 14 дней культивирования частота их прорастания равна таковой при культивировании 21-суточных зародышей и лишь для отдельных генотипов количество ростков, которые появляются, значительно больше для зародышей 21-суточного возраста. Культивирование зародышей in vitro значительно сказывается на таких признаках как высота растений и длина вегетационного периода. На эти же признаки существенное влияние оказывает и возраст зародышей. С уменьшением возраста зародышей высота растений уменьшается, а вегетационный период удлиняется, при этом степень этих изменений зависит от генотипа. В процессе проведения исследований по культуре незрелых зародышей подсолнечника были получены растения, которые переданы в соответствующие научные подразделения Института масличных культур НААН для включения в селекционный процесс, что отражено в соответствующих актах (см. Приложение Б). Результаты, представленные в данной главе, отражены в публикациях автора [58, 89, 90, 96, 97]. 179 РАЗДЕЛ 7 СОЧЕТАНИЕ МЕТОДОВ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ IN VITRO И ХИМИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА КАК ПУТЬ УВЕЛИЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА Подсолнечник – одна из наиболее важных и широко используемых масличных культур в мире. В то же время имеющаяся генетическая база подсолнечника слишком узка для большинства исследований, что сдерживает темп работ с данной культурой. Поэтому, одной из первоочередных задач любой селекционно-генетической программы на подсолнечнике является расширение доступной селекционеру генетической изменчивости. Эту задачу можно решать при помощи разных приемов, например, вовлекая в скрещивания дикорастущие виды или используя биотехнологические подходы, такие как культура клеток и тканей in vitro или генетическая инженерия. Метод индуцированного мутагенеза также крайне важен в этом аспекте, поскольку давно и надежно зарекомендовал себя как способ получения форм растений, обладающих новыми ценными свойствами. В настоящее время для индуцирования мутаций чаще всего используют ионизирующее излучение и химические мутагены. При помощи искусственного мутагенеза уже созданы сотни новых сортов основных сельскохозяйственных культур [21, 124, 240]. Чаще всего в качестве объекта при воздействии мутагена используют зрелые семена. Однако для ряда культур такой метод не всегда приемлем или не может обеспечить достаточно высокой эффективности. Например, воздействуя гамма-лучами в четырех дозах на зрелые семена подсолнечника S.J. Jambhulkar и D.C. Joshua [211] хотя и получили во втором мутантном поколении ряд морфологических мутантов, но эти индуцированные изменения затрагивали всего четыре группы признаков, что совершенно недостаточно для проведения успешной селекции данной культуры. В связи 180 с этим остаются актуальными вопросы поиска других объектов обработки, таких как побеги, клубни, почки, пыльца и т.п., использование которых могло бы обеспечить более высокий выход мутаций или расширить их спектр. Особенно это касается культурного подсолнечника, для которого доступная генетическая изменчивость уже почти исчерпана. На многих сельскохозяйственных культурах, включая подсолнечник, давно и успешно используется метод культуры незрелых зародышей. Эта технология позволяет получать новые гибридные формы, недоступные при обычных скрещиваниях или даже просто увеличивать число генераций за единицу времени. Поэтому логичным выглядит привлечение данного метода для решения задачи по созданию новых форм у данной культуры более быстрыми темпами. Таким образом, сочетание методов индуцированного мутагенеза с таким биотехнологическим приемом как культура зародышей могло бы оказаться весьма полезным в плане расширения генетического разнообразия у подсолнечника. Методики с использованием искусственного мутагенеза разрабатываются во многих лабораториях мира [116, 229, 297]. Тем не менее, почти отсутствует информация о влиянии обработки мутагеном незрелых зародышей на генетическую изменчивость. Учитывая, что экспрессия генов на разных этапах онтогенеза растения безусловно разная, можно ожидать иной спектр изменчивости при обработке незрелых зародышей по сравнению со зрелыми семенами. В связи с вышесказанным, исследования по изучению мутагенного действия на незрелые зародыши у подсолнечника представляет несомненный теоретический и практический интерес. В качестве материала для исследований использовали незрелые зародыши двух линий культурного подсолнечника Helianthus annuus L. запорожской селекции (ЗЛ-809 и ЗЛ-95), которые входят в состав ряда перспективных гибридных комбинаций. Для опыта с незрелыми 181 зародышами растения выращивали в условиях теплицы и перед цветением изолировали. После зацветания растений их принудительно самоопыляли, а затем через 9-11 и 14-16 суток из корзинок выделяли незрелые зародыши, обрабатывали 0,02%-ным водным раствором этилметансульфоната (ЭМС) в течение 16-ти часов, тщательно отмывали водопроводной водой, стерилизовали 70%-ным этиловым спиртом и водным раствором хлорамина Б, освобождали от внешней оболочки и высаживали на модифицированную питательную среду МС с уменьшенным содержанием макроэлементов и увеличенным содержанием витаминов. В контрольных вариантах манипуляции были такими же, за исключением того, что зародыши обрабатывали вместо ЭМС дистиллированной водой. Впоследствии зародыши культивировали в чашках Петри при 16-часовом фотопериоде и комнатной температуре до момента прорастания. Зеленые проростки высаживали в почву – сначала в пластиковые стаканчики, а после начала интенсивного роста и появления двух-трех пар настоящих листьев – в поле. Перед цветением растения изолировали, а затем принудительно самоопыляли. В конце вегетационного периода подсчитывали количество выживших растений М1 и количество растений, которые завязали семена. В течение вегетационного периода за растениями М1 вели фенологические наблюдения. На следующий год семена растений М1 посемейно высевали в поле для получения поколения М2. Каждая семья М2 насчитывала до 30 растений. Во время вегетации анализировали показатели всхожести семян, сроки цветения и созревания и другие морфологические и физиологические признаки, по которым растения опытных вариантов отличались от контрольных растений. Всего было проанализировано 145 семей у линии ЗЛ-809 (из них 115 после обработки зародышей ЭМС) и 127 семей у линии ЗЛ-95 (из них 97 после обработки зародышей ЭМС). Общее количество 182 растений в М2 составило больше 8000. Перед цветением растения искусственно изолировали. Сбор семян проводили отдельно с каждого растения вручную. Частоту мутаций (в процентах) в М2 определяли в расчете на число исследованных семей [59]. Наследование измененных признаков, – предполагаемых мутаций, – проверяли в следующем, третьем поколении (М3). Для этого семена отобранных в М2 возможных мутантов подсолнечника посемейно высевали в полевых условиях. Каждая семья М3 – потомство одного растения, отобранного из семьи М2. По каждой семье высевали до 30 шт. семян. Делянки однорядковые, максимально по 10-20 растений в каждой. Анализировали проявление морфологических и физиологических признаков (по которым они отбирались) у возможных мутантов на определенных стадиях развития. При подтверждении мутантной природы признака изолировали по 2-3 растения для дальнейшей работы с мутантами. На основании подтверждения мутантной природы выделенных признаков устанавливали окончательную частоту морфологических и физиологических мутаций в М2. Для выявления биохимических мутаций (масличность семян) в семьях М2 изолировали по 1-2 растения, которые, как правило, несли какиелибо изменения на морфологическом уровне и после сбора урожая проводили анализ на масличность. Для подтверждения мутантной природы данного биохимического признака семена отобранных в М2 растений со значительными изменениями показателя масличности посемейно высевали для получения следующего поколения М3. Масличность образцов оценивали по пробе семян в 10г на приборе, работающему по принципу ядерного магнитного резонанса и сохраняющему семена интактными. Одновременно с отбором в М2 возможных мутантов в каждой семье этого поколения отбирали по несколько растений (чаще всего с морфозами листьев) для оценки мутационной изменчивости в М3. Потомство каждого 183 такого растения и формировало семью М3. В этих семьях вели поиск растений, изолируя их, с отличающимися от контроля морфологическими и физиологическими признаками. При этом изменение, обнаруженное в данной семье в более раннем поколении (М2), не принималось во внимание. Поиск возможных мутаций в М3 вели и в семьях, где проводилось подтверждение выделенных в М2 возможных мутантов. Окончательную частоту и спектр мутаций в М3 устанавливали после подтверждения мутантной природы выделенного признака в М4. Вместе с работой по подтверждению мутантной природы признаков, выделенных в М2, во всех семьях М3 проводили визуальный учет возможных морфологических или физиологических мутаций, которые раньше в М2 не выделялись. Перед цветением выявленные возможные мутантные растения искусственно изолировали, а в период цветения принудительно самоопыляли. Сбор семян проводили отдельно по каждому растению, вручную. Всего в М3 проанализировано около 900 семей двух генотипов. C целью сравнения эффективности мутагенной обработки незрелых зародышей одновременно с зародышами этилметансульфонатом обрабатывали и зрелые семена тех же линий подсолнечника – ЗЛ-809 и ЗЛ95. Их замачивали в 0,01%-ном водном растворе данного мутагена в течение 16-ти часов, отмывали водопроводной водой и высевали в грунт. Дальнейшие манипуляции с этим материалом производили аналогично опыту с незрелыми зародышами, ограничиваясь получением информации о частоте и спектре мутаций в поколении М2 по данным поколения М3. Использовали два типа контролей – из зародышей разного возраста, (два варианта) и со зрелых семян (один вариант), не подвергавшихся обработке мутагеном. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием специализированных программ MSTAT-C, Statistica и MS Excel. 184 7.1. Выживаемость растений, полученных после обработки этилметансульфонатом зародышей подсолнечника разного уровня развития Для оценки эффективности влияния мутагенного фактора на исследуемый материал (зародыши двух линий) изучали выживаемость растений, полученных их незрелых зародышей подсолнечника. Очевидно, что чем более сильным является действие мутагена, тем более угнетенными будут выросшие из зародышей растения. Кроме того, как было показано нами ранее [96], возраст незрелых зародышей имеет определенное значение для сохранения ними жизнеспособности и получения впоследствии полноценных продуктивных растений. При обработке же дополнительным фактором – химическим мутагеном – эти различия могут быть еще больше (табл. 7.1.1). Как видно из этилметансульфонатом представленных наблюдалась данных, значительная, после по обработки сравнению с контролем, гибель зародышей как в возрасте 9-11-ти, так и 14-16-ти суток. Однако больше всего мутаген негативно повлиял на зародыши наиболее молодого возраста (вариант 2). Так, у линии ЗЛ-95 в варианте ЭМС 2 количество высаженных в поле растений составило лишь около 20,6% от потенциально возможного, тогда как в контроле (Контроль 2) этот показатель составил около 50%. А у линии ЗЛ-809 растения, образованные из зародышей, обработанных мутагеном в возрасте 9-11-ти суток, не выжили вообще (в контроле – 95,9%). Основная часть зародышей, как в опыте, так и в контроле, погибала еще до момента развития нормально сформированных растений и их высадки в поле, за исключением варианта “Контроль 2” у линии ЗЛ-809. Главной причиной гибели зародышей в опытных вариантах было отсутствие у них зародышевого корешка. Однако даже у тех зародышей, у 185 Таблица 7.1.1 Жизнеспособность растений подсолнечника после обработки незрелых зародышей разного возраста этилметансульфонатом Обработано Вариант зародышей мутагеном, шт. Высажено растений в поле, шт. Продук- Выживаемость тивных продуктивных растений, растений, шт. % ЗЛ-809 Возраст зародышей 14-16 суток Контроль 1 75 59 51 68,0±5,39 ЭМС 1 238 169 115 48,3±3,24** Возраст зародышей 9-11 суток Контроль 2 73 70 8 11,0±3,66### ЭМС 2 224 0 0 0**, ### ЗЛ-95 Возраст зародышей 14-16 суток Контроль 1 67 36 34 50,7±6,11 ЭМС 1 243 77 65 26,7±2,84*** Возраст зародышей 9-11 суток Контроль 2 123 61 41 33,3±4,25## ЭМС 2 165 34 32 19,4±3,08** 1. ***, ** – отличия от контроля существенны при p<0,1% и p<1% соответственно. 2. ### – различия межу вариантами с разным возрастом зародышей существенны при p<1 и 0,1% соответственно. которых он образовался, этот корешок почти сразу же после появления останавливал рост и загнивал. Вероятно, воздействие ЭМС в первую 186 очередь повреждало клетки корневой меристемы, которые в дальнейшем уже не могли нормально развиваться. На рис. 7.1.1 представлены проростки, полученные из незрелых зародышей более молодого возраста, обработанных мутагеном, в сравнении с контролем. Видно, что через неделю после помещения зародышей на питательную среду в опытных вариантах образования корней почти не наблюдалось, тогда как без обработки мутагеном (контроль) многие проростки уже имели достаточно хорошо сформированную корневую систему. Данная закономерность отмечалась как у линии ЗЛ-809, так и у линии ЗЛ-95. Формирование корневой системы у проростков опытного варианта линии ЗЛ-95 происходило со значительным запаздыванием и она характеризовалась более слабым развитием. Что касается линии ЗЛ-809, то образования корней в данном варианте вообще не отмечали, очевидно, в силу деградации и отмирания клеток корневой меристемы, что хорошо видно на рис. 7.1.1. Следует отметить, что часть сеянцев погибала и после высадки в поле. Кроме того, некоторые растения не образовывали семена. Однако доля погибших в поле или непродуктивных растений значительно меньше той, которая была в период от обработки зародышей до высадки растений в поле. Выжившие (после обработки зародышей мутагеном) растения, по сравнению с контрольными, зацветали, в целом, с существенным опозданием (табл. 7.1.2). У обеих линий начало цветения задерживалось в среднем от 15 до 17 дней. Правда, первые растения линии ЗЛ-95 в опытном варианте зацветали в те же сроки, что и контроль, однако в среднем начало цветения существенно задерживалось у обеих линий. 187 Рис. 7.1.1. Проростки подсолнечника линий ЗЛ-95 и ЗЛ-809 после культивирования на питательной среде обработанных мутагеном незрелых зародышей возраста 9-11 суток 188 Увеличивался на 4-12 дней и вегетационный период. Эти данные свидетельствуют о том, что обработка мутагеном существенно повлияла на незрелые зародыши и подтверждают сведения других авторов, установивших, что при действии некоторых мутагенов часто наблюдается угнетение роста и развития растений, вследствие чего они позже вступают в фазу цветения [59]. Таблица 7.1.2 Влияние мутагенной обработки незрелых зародышей подсолнечника на рост и развитие растений М1 Линия ЗЛ-95 Контроль Признак 9-11-сут. 14-16-сут. зародыши зародыши Высота, см Линия ЗЛ-809 Опыт Контроль Опыт 14-16-сут. 9-11-сут. 14-16-сут. 14-16-сут. заро- заро- заро- заро- дыши дыши дыши дыши 69,8±4,85 86,2±2,59 98,3±2,88 44,3±1,68 55,8±2,58 31,6±1,25 76,5±1,32 75,7±0,84 92,1±0,89 67,7±0,96 66,4±0,53 81,9±0,76 Период до начала цветения, дн. Вегетационный 127,5±1,74 118,9±1,73 132,9±0,52 114,1±0,98 114,8±1,16 118,4±0,72 период, дн. Однако наиболее сильно действие мутагена сказалось на высоте растений. При этом исследуемые линии отреагировали на влияние данного фактора по-разному. У линии ЗЛ-95 высота растений, выращенных из 189 обработанных мутагенов зародышей, значительно увеличилась, а у линии ЗЛ-809 — существенно уменьшилась. Сравнение высоты растений, полученных из зародышей разного возраста, свидетельствует о том, что их культивирование in vitro даже без обработки мутагеном существенно сказывается на данном признаке. Так, растения линии ЗЛ-809, выращенные из зародышей 14-16-суточного возраста, имели среднюю высоту 55,8 см, а выращенные из зародышей более молодого возраста – ниже на 10 см и более. Такая же картина наблюдалась и для линии ЗЛ-95. Часто в поколении М1 после обработки мутагеном обнаруживают нарушения пигментации различных органов растения. В нашем случае у растений М1 подсолнечника не наблюдали каких либо изменений окраски листьев или стебля, т.е. опытные растения по характеру пигментации не отличались от контрольных. Однако встречались растения с деформированной или отсутствующей точкой роста или, наоборот, несколькими побегами, растения с уродливыми листьями, утолщенным стеблем. Частота таких растений была значимо выше в опытном варианте. Особенно сильно увеличилось количество ветвящихся растений. Если у контрольных растений, полученных из незрелых необработанных мутагеном зародышей, ветвистыми, как правило, с базальным ветвлением, были не более 2-4% экземпляров, то при обработке этилметансульфонатом ветвление наблюдалось у 9,3% растений линии ЗЛ-95 и у более половины растений линии ЗЛ-809. Растения этих же линий, выращенные из зрелых семян, не ветвились совсем. При воздействии этилметансульфоната на незрелые зародыши у многих растений изменялся также угол наклона корзинки. Такие изменения выявлены у 29,4% растений линии ЗЛ-809 и 5,2% растений линии ЗЛ-95. В контроле же по этому признаку наблюдалась значительная однородность. 190 Из таблицы 7.1.3 видно, что ЭМС по разному влиял на проявление некоторых количественных признаков продуктивности растений М1 двух линий. Если у линии ЗЛ-809 наблюдали угнетение развития растений, что проявлялось в существенном уменьшении диаметра корзинки и количества семян в корзинке, то у линии ЗЛ-95 для отдельных признаков отмечено их стимуляцию. Таблица 7.1.3 Влияние мутагенной обработки незрелых зародышей подсолнечника на некоторые характеристики продуктивности растений М1 Возраст Вариант зародышей, суток Диаметр Количество семян корзинки, см. в корзинке, шт. ЗЛ-809 Контроль 14-16 9,0±0,64 246,6±30,00 Контроль 9-11 8,5±0,56 179,8±19,50 ЭМС 14-16 5,3±0,23*** 82,9±10,41*** ЗЛ-95 Контроль 14-16 11,7±0,80 367,5±31,70 Контроль 9-11 10,7±1,05 171,6±36,00### ЭМС 14-16 19,2±4,81 484,3±35,30* ЭМС 9-11 13,5±1,02 478,4±69,77*** Примечания: 1. *, *** - различия между опытом и контролем существенны при p<5 и 0,1% соответственно. 2. ### - различия межу вариантами с разным возрастом зародышей существенны при p<1 и 0,1% соответственно. 191 Увеличение количества семян в корзинках растений опытных вариантов линии ЗЛ-95, очевидно, обусловлено более крупными размерами самих корзинок из-за стимулирования мутагеном высоты растения, в отличие от линии ЗЛ-809, где обработка зародышей этилметансульфонатом сильно подавляла рост. Однако, в целом, растения обеих линий во всех вариантах обработки завязывали достаточное количество семян для проведения дальнейшей работы по установлению частоты и спектра мутаций. Изменение растений М1 количественных подсолнечника этилметансульфонатом в характеристик результате свидетельствовало о многих обработки признаков зародышей существенном влиянии мутагена на данный объект и позволяло надеяться на получение высокой частоты мутаций и широкий спектр наследуемых изменений в последующих поколениях. В целом необходимо отметить, что зародыши более молодого возраста требуют менее жесткого фона обработки, который следует подбирать экспериментально. Это же касается и обработки незрелых зародышей подсолнечника гамма-лучами, которые в наших предварительных экспериментах в дозах 100-400 Гр оказались летальными для зародышей обоих возрастов. 7.2. Влияние обработки незрелых зародышей разного возраста и зрелых семян самоопыленных линий подсолнечника этилметансульфонатом на спектр наследуемых изменений Обработка этилметансульфонатом (ЭМС) незрелых зародышей подсолнечника с последующим их доращиванием в условиях in vitro привела к появлению более широкого спектра мутаций чем обработка зрелых семян. Следует отметить, что во всех вариантах в поколении М1 растений с мутантными признаками выявлено не было. Все мутанты были выявлены в последующих поколениях: в случае со зрелыми семенами – в 192 М2, а в случае с незрелыми зародышами – в М2 и М3. Что касается возраста незрелых зародышей, то обработка ЭМС зародышей как 9-11-ти, так и 1416-ти суточного возраста индуцировала широкий спектр морфологических и физиологических наследуемых изменений в М2 и М3. Краткое описание всех выделенных в эксперименте мутаций дано в таблице 7.2.1. Указанные в ней номера типов мутаций соответствуют номерам в последующих таблицах. Все наследуемые изменения были объединены в семь следующих групп: хлорофилльной недостаточности, мутации семядольных листьев, мутации настоящих листьев, мутации стебля, мутации соцветия, мутации семян и мутации физиологических признаков. Таблица 7.2.1 Типы морфологических и физиологических мутаций, выделенных после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей и зрелых семян подсолнечника, и их краткое описание № Тип мутации Характеристика 1 2 3 I Мутации с нарушением синтеза хлорофилла у всходов и взрослых растений 1 Viridis Светло-зеленый сеянец и растение 2 Xantha Желто-зеленые листья обвертки и донце корзинки 3 Xantha некротического Желто-зеленые всходы и растение, ярко желтотипа зеленые пятна на листьях, превращающиеся в некротические сектора к концу вегетации II Мутации семядольных листьев 4 Деформированные Искривленные, часто сросшиеся или семядоли рассеченные, семядольные листья 193 Продолжение таблицы 7.2.1 1 2 3 III Мутации настоящих листьев 5 Гофрированный лист Волнистый край листа 6 Трубкоподобный лист Первая пара настоящих листьев, сросшаяся в виде трубки 7 Деформированный лист Деформированные, искривленные, часто сросшиеся или рассеченные, пластинки листа; сросшиеся или рассеченные черешки 8 Крупный лист Листовая пластинка большого размера 9 Дихотомическое Вееро-подобное жилкование, гофрированный жилкование лист, маленькая величина угла между стеблем и черешком листа 10 Эректоидный лист Уменьшенный угол между стеблем и черешком листа IV Мутации стебля 11 Низкорослые Уменьшенная высота растения 12 Высокорослые Увеличенная высота растения 13 Низкорослые с мощным Низкорослые растения с мощным стеблем и 14 15 габитусом крупными листьями Высокорослые с Высокорослые растения с мощным стеблем и мощным габитусом крупными листьями Мощный габитус Растения с мощным стеблем и крупными листьями 16 Наклоненный стебель Верхушка растения с корзинкой наклонена к земле к концу вегетационного периода 17 Табакоподобное Растение с укороченными междоузлиями, растение округлыми листьями, широкими и округлыми семядолями, уменьшенным числом коротких краевых цветков 194 Продолжение таблицы 7.2.1 1 2 3 18 Фасциация стебля Сплющенный стебель 19 Ветвление 1-3 боковых побега в базальной части стебля V Мутации соцветия 20 Мало листьев обвертки Уменьшенное число листьев обвертки 21 Много листьев обвертки Увеличенное число листьев обвертки 22 Деформированные Значительно разрастание листьев обвертки листья обвертки 23 Фасциация корзинки Деформированная корзинка, срастание меньших по размеру корзинок 24 Угол наклона корзинки Корзинка направлена вертикально вверх 25 Частичная стерильность Недоразвитие генеративных тканей в центре 26 корзинки корзинки Полная стерильность Мужская и женская стерильность, неразвитость мужских и женских генеративных структур, отсутствие краевых цветков Мало краевых цветков Уменьшенное число краевых цветков 28 Много краевых цветков Увеличенное число краевых цветков 27 29 Короткие краевые Уменьшенная длина краевых цветков цветки 30 Гофрированные краевые Искривленные, с волнистыми краями краевые цветки цветки VI Мутации семени 31 Окраска семени Красно-коричневая окраска семенной оболочки VII Физиологические мутации 32 Раннее цветение Укороченный на 2-4 дня период всходыцветение 195 Продолжение таблицы 7.2.1 1 2 3 33 Позднее цветение Удлиненный на 2-4 дня период всходыцветение Три типа мутаций хлорофилльной недостаточности были выявлены в исследованиях, касающихся обработки незрелых зародышей – viridis (1) (рис. 7.2.1 в), xantha (2) и xantha некротического типа (3). Первые две мутации являются обычными для многих сельскохозяйственных культур. Они были обнаружены ранее нами и при обработке мутагеном зрелых и незрелых семян подсолнечника [236]. Кроме этих мутантных типов растения с ярко-желтыми пятнами на листьях, ближе к концу вегетационного периода трансформирующихся в некротические сектора, выявлены в одном из вариантов обработки мутагеном незрелых зародышей (рис. 7.2.1 а, б). Несмотря на сильное изменение пигментации, мутантные растения имели нормальную высоту и характеризовались достаточно высокой продуктивностью. В случае со зрелыми семенами на исследуемых линиях ЗЛ-95 и ЗЛ-809 мутации такого типа обнаружены не были. Один тип мутаций семядольных листьев, названный нами деформированные семядоли (4), был выделен в данном исследовании только при обработке незрелых зародышей. Мутантные сеянцы имели искривленные, часто сросшиеся или рассеченные, семядольные листья. Изменения настоящих листьев включали такие типы как гофрированный лист (5), лист-трубка (6), деформированный лист (7), крупный лист (8), дихотомическое жилкование (9) и эректоидный лист (10). У мутанта с листом-трубкой первая пара настоящих листьев срасталась и формировала трубкоподобное образование (рис. 7.2.2). По мере роста растения с появлением новых листьев трубка разрывалась, но ее наличие у растения можно было распознать и к концу вегетации. 196 а) б) в) Рис. 7.2.1. Хлорофилльные мутации подсолнечника, выделенные после обработки незрелых зародышей: а - б) xantha некротичного типа, в) viridis (справа – мутант, слева – контроль) 197 Мутация дихотомического жилкования затрагивала ряд признаков, таких как жилкование листа, форма листовой пластинки и угол между черешком листа и стеблем. Для растений, несущих эту мутацию, характерным было отсутствие ярко-выраженной центральной жилки, гофрированность листовой пластинки в местах расположения главных жилок и эректоидное расположение листьев. Мутация эректоидный лист характеризовалась уменьшенным по сравнению с контролем углом между стеблем и черешком листа и не затрагивала какие-либо другие признаки. Из всех типов изменений листа при обработке зрелых семян выявляли лишь два – трубкоподобный и деформированный лист. Рис. 7.2.2. Морфотип мутанта подсолнечника «лист – трубка», выделенный после обработки незрелых зародышей Мутации стебля были представлены фасциацией (18), ветвлением (19) и такими изменениями габитуса как низкорослые (11), высокорослые (12), низкорослые с мощным габитусом (13), высокорослые с мощным габитусом (14), мощный габитус (15), наклоненный стебель (16), а также табакоподобное растение (17). Фасциированные мутанты включали 198 растения со сплющенным стеблем, а ветвистые мутанты имели 1-3 боковых побега в базальной части растения. Мутанты с измененным габитусом имели меньшее число междоузлий (низкорослые), большее число междоузлий (высокорослые), более крупные листья (мощный габитус), более крупные листья и уменьшенную высоту (низкорослые с мощным габитусом), более крупные листья и большую высоту (высокорослые с мощным габитусом). Мутация наклоненного стебля была хорошо заметной в конце вегетационного периода, когда верхушка стебля с созревающей корзинкой почти наклонялась до земли. Табакоподобные растения имели явные отличия от нормальных растений начиная со стадии сеянцев. Они характеризовались несколькими измененными признаками, такими как овальные семядольные листья, укороченные междоузлия, овальные настоящие листья и уменьшенное число коротких краевых цветков (рис. 7.2.3). Большинство мутаций стебля было выявлено при обработке незрелых зародышей. Лишь низкорослые и низкорослые с мощным габитусом растения были обнаружены и при действии мутагена на зрелые семена. Одиннадцать наследуемых типов изменений составили группу мутаций соцветия – мало листьев обвертки (20), много листьев обвертки (21), редуцированные листья обвертки (22), фасциация корзинки (23), угол наклона корзинки (24), частичная стерильность (25), полная стерильность (26), мало краевых цветков (27), много краевых цветков (28), короткие краевые цветки (29), гофрированные краевые цветки (30). Все они, кроме одного (мало листьев обвертки), обнаружены лишь при обработке незрелых зародышей. Первые два типа мутаций имели измененное количество листьев обвертки. Мутантные растения с малым числом листьев обвертки одновременно характеризовались и уменьшенным числом краевых цветков. Мутация деформированных листьев обвертки вызывала их значительное 199 Рис. 7.2.3. Морфотип мутанта подсолнечника «табако-подобное растение» (а) и форма его семядолей в сравнении с контролем (б) в результате обработки ЭМС зародышей молодого (9-11суточного) возраста 200 разрастание. Два мутантных типа имели измененное, как в сторону уменьшения, так и увеличения, количество краевых цветков. Два типа стерильности корзинки были выявлены в результате обработки мутагеном незрелых зародышей. Один из них характеризовался недоразвитием генеративных тканей в центре корзинки (частичная стерильность корзинки). Мутанты другого типа имели полную недоразвитость мужских и женских генеративных структур (рис. 7.2.4). Эта мутация сопровождалась отсутствием краевых цветков. Растения одного из мутантных типов, связанных с формой лепестков, имели искривленные, с волнистыми краями краевые цветки. После мутагенной обработки незрелых зародышей выявлен один тип мутаций семени. Мутанты имели рыжевато-коричневую окраску семенной оболочки, тогда как в контроле семена были черными. Физиологические мутации были представлены рано- и поздноцветущими растениями. По сравнению с контролем такие мутанты имели укороченный или удлиненный на 2-4 дня период всходы-цветение. Раноцветущие растения обнаруживали как при обработке незрелых зародышей, так и при обработке зрелых семян. Спектр мутаций в М2 при обработке мутагеном незрелых зародышей и зрелых семян проиллюстрирован в табл. 7.2.2. Из данной таблицы видно, что обработка ЭМС незрелых зародышей была более эффективной чем обработка зрелых семян. Так, у линии ЗЛ-809 при использовании в качестве объекта обработки незрелых зародышей было получено 7 типов наследуемых изменений, тогда как в случае зрелых семян – лишь 3 типа. У линии ЗЛ-95 при обработке зрелых семян выявили также незначительное количество типов мутаций, в отличие от вариантов обработки незрелых зародышей (9 и 14 типов в зависимости от их возраста). 201 Таблица 7.2.2 Спектр видимых мутаций в M2 после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей и зрелых семян подсолнечника Линия, обрабатываемый материал ЗЛ-95 № 1 ЗЛ-809 Тип мутации 2 Зародыши Зародыши Зрелые 14-16 сут. 9-11 сут. семена 3 4 5 Зародыши 1416 сут. 6 Зрелые семена 7 I Мутации с нарушением синтеза хлорофилла у всходов и взрослых растений 1 Viridis 2 Xantha + + II Мутации семядольных листьев 4 Деформированные семядоли + + III Мутации настоящих листьев Гофрированный лист + 6 Трубкоподобный лист + 5 7 8 + Деформированный + лист Крупный лист + + IV Мутации стебля 11 13 Низкорослые Низкорослые с мощным габитусом + + + + + + + 202 Продолжение таблицы 7.2.2 1 14 15 2 3 Высокорослые с мощным габитусом 19 Ветвление 5 6 7 + Мощный габитус 16 Наклоненный стебель 4 + + + + + V Мутации соцветия 20 21 22 Мало листьев + обвертки Много листьев обвертки Деформированные 27 28 + листья обвертки 23 Фасциация корзинки 24 + Угол наклона + + корзинки Мало краевых цветков + + + Много краевых + цветков VI Мутации семени 31 Окраска семени + VII Физиологические мутации 32 Раннее цветение + 33 Позднее цветение + Всего 14 9 3 7 + 3 203 В поколении М2 спектр мутаций в вариантах с различным возрастом незрелых зародышей различался. Однако наибольшие отличия в спектре мутаций наблюдались при анализе поколения М3 (табл. 7.2.3). Таблица 7.2.3 Спектр видимых мутаций в М3 после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей подсолнечника разного возраста у линии ЗЛ-95 № Тип мутации 1 2 Зародыши, Зародыши, 14-16 суток 9-11 суток 3 4 I Мутации с нарушением синтеза хлорофилла у всходов и взрослых растений 1 3 Viridis + Xantha + + некротического типа II Мутации семядольных листьев 4 Деформированные + семядоли III Мутации настоящих листьев 6 9 10 Трубкоподобный лист + Дихотомическое + жилкование Эректоидный лист + IV Мутации стебля 11 Низкорослые + 12 Высокорослые + + 204 Продолжение таблицы 7.2.3 1 2 3 4 15 Мощный габитус + + 17 18 Табако-подобное + растение Фасциация стебля + V Мутации соцветия 22 Деформированные + листья обвертки 23 Фасциация корзинки + + 24 Угол наклона корзинки + + 26 Полная стерильность + 29 30 Короткие краевые + цветки Гофрированные краевые + цветки VI Мутации семени 31 Окраска семени + + VII Физиологические мутации 32 Раннее цветение + 33 Позднее цветение + Всего 12 14 Как видно из табл. 7.2.3 спектры мутаций вариантов с разным возрастом зародышей существенно различались. Так, после обработки наиболее молодых зародышей линии ЗЛ-95 такие редкие мутации как дихотомическое жилкование (рис. 7.2.4), табакоподобное растение (рис. 205 Рис. 7.2.4. Мутант подсолнечника с дихотомическим жилкованием листа, выделенный из линии ЗЛ-95 7.2.3), короткие и гофрированные краевые цветки, а также xantha некротического типа (рис. 7.2.1) были найдены только в этом варианте. Интересным результатом обработки зародышей 14-16-ти суточного возраста линии ЗЛ-95 было появление в М3 мутации полной стерильности (рис. 7.2.5). Эти мутанты характеризовались полным нарушением развития мужских и женских генеративных структур, поэтому поддерживались нами через гетерозиготы. В целом, спектр мутаций как в М2, так и в М3 был довольно широким. Общее количество мутантных типов, выявленных нами при обработке зародышей обоих возрастов у линий ЗЛ-95 и ЗЛ-809, составило 21. Такое их количество было выделено в М2 и на один тип меньше – в М3. Морфологические изменения были обусловлены мутациями синтеза хлорофилла, семядольных листьев, настоящих листьев, стебля, соцветия и семян. Впоследствии был установлен генетический контроль многих, 206 Рис. 7.2.5. Мутации генеративной сферы подсолнечника, полученные при обработке ЭМС незрелых зародышей 14-16-суточного возраста 207 Таблица 7.2.4 Содержание масла (%) в семенах биохимических мутантов подсолнечника поколения М2 после обработки мутагеном незрелых зародышей и зрелых семян Номер Содержание масла, Относительно мутантного образца % контроля, % ЗЛ-809 Зрелые семена 301-9 33,46 -8,84 312-3 37,40 -4,90 контроль 42,30 0,00 320-6 44,03 1,73 НСР05 = 3,15% Незрелые зародыши 64 36,03 -5,23 37 37,67 -3,58 контроль 41,25 0,00 49-2 43,95 2,70 124-2 46,56 5,31 НСР05 = 1,82% ЗЛ-95 Зрелые семена 325-4 31,15 -9,20 330-2 33,28 -7,07 контроль 40,35 0,00 НСР05 = 5,20% Незрелые зародыши 181-6 25,32 -11,63 контроль 36,95 0,00 НСР05=11,47% 208 выявленных нами в процессе данного исследования, морфологических мутаций [100, 299]. Некоторые мутантные типы, наподобие viridis, дихотомическое жилкование листа и ряд других, были выявлены в нашем предыдущем исследовании после обработки этилметансульфонатом зрелых и незрелых семян подсолнечника [236]. Помимо морфологических и физиологических изменений у ряда выделенных в М2 образцов после обработки незрелых зародышей и зрелых семян также были проанализированы изменения такого важного биохимического признака как общее содержание масла в семенах. Нами были обнаружены растения как с низкой, так и с повышенной масличностью семян. Данные, которые наиболее существенно отличались от показателей контрольных растений, приведены в таблице 7.2.4. Как видно, у линии ЗЛ-809 были выявлены мутанты как со сниженным, так и с увеличенным содержанием масла, а у линии ЗЛ-95 – лишь с уменьшенным. Для варианта обработки незрелых зародышей наибольшее отклонение от контроля составило 5,31% для линии ЗЛ-809 и 11,63% – для линии ЗЛ-95. При обработке зрелых семян различия составляли 8,84% для линии ЗЛ-809 и 9,20% – для линии ЗЛ-95. 7.3. Частота наследуемых изменений при обработке незрелых зародышей и зрелых семян самоопыленных линий подсолнечника этилметансульфонатом Данные о частоте видимых наследуемых изменений в M2 подтвердили существенное влияние мутагена на незрелые зародыши, что выражалось в появлении значительного количества мутаций в данном случае. У линии ЗЛ-809 их было около 15%, а у ЗЛ-95 – почти в 3 раза больше. Как видно из таблицы 7.3.1, частота мутаций при обработке мутагеном зародышей обоих возрастов была значительно большей, чем при обработке зрелых семян 209 подсолнечника обеих линий. Разница в частоте наблюдалась лишь в зависимости от линии, что, очевидно, обусловлено значительными различиями в генетическом происхождении двух исследуемых образцов. Для линии ЗЛ-809 превышение этого показателя при обработке незрелых зародышей (в сравнении со зрелыми семенами) составило почти 180%, тогда как у линии ЗЛ-95 различия были еще больше (3-4 раза). Таблица 7.3.1 Частота мутаций в M2 после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей и зрелых семян подсолнечника, % Линия, обрабатываемый материал Тип мутации ЗЛ-95 ЗЛ-809 Зародыши Зародыши Зрелые Зародыши 14-16 сут. 9-11 сут. семена 14-16 сут. 1 2 3 4 5 1 1,6 2 Зрелые семена 6 0,9 4 4,8 5 1,6 6 3,2 3,1 2,4 4,8 7 8 1,6 3,1 11 8,0 3,1 13 6,3 3,1 14 1,6 15 3,1 16 1,6 3,1 19 1,6 6,2 2,4 0,9 2,9 210 Продолжение таблицы 7.3.1 1 2 3 4 20 21 5 1,8 1,6 22 6,2 23 1,6 24 1,6 27 3,2 0,9 2,9 28 1,8 31 3,1 32 1,8 33 7,3 Общая частота 6 39,9±6,17 34,1±8,51 9,6±4,60 15,4±3,46 2,9 8,7±4,83 Общая частота в 6,67±6,44 0 0 0 0 контроле Различий по общей частоте мутаций между вариантами с разным возрастом зародышей не обнаруживали, хотя при обработке мутагеном более молодых зародышей наблюдалась некоторая тенденция к увеличению частоты морфологических и физиологических изменений и различия в этом случае были в пределах ошибки. Вместе с тем между этими вариантами имелись различия по частоте мутаций отдельных типов. Так, после мутагенной обработки зародышей 14-16-суточного возраста линии ЗЛ-95 с наибольшей частотой встречались мутации деформированных семядолей, а также мутации габитуса – низкорослые и низкорослые с мощным габитусом. Частота двух последних наследуемых изменений составляла почти 15%. При обработке этилметансульфонатом более молодых (9-11- 211 суточного возраста) зародышей этой линии чаще всего выявляли мутации листьев обвертки, а также ветвления. Следует отметить, что в большинстве контролей, как для незрелых зародышей, так и для зрелых семян, мутаций не обнаруживали. Лишь в одном случае – в контроле варианта мутагенной обработки зародышей линии ЗЛ-95 возраста 14-16 суток, – выделили мутацию типа xantha (2). Общая частота мутаций здесь составила 6,67%. Растения, несущие такую мутацию xantha, имели четкие признаки хлорофильной недостаточности на ранних стадиях развития и желтозеленые листья с сильными некротическими пятнами в конце вегетации (так наз. некроз 2) (рис. 7.3.1). Эта хророфильная мутация отличается от описанной нами ранее у линии ЗЛ-95 мутации xantha некротического типа (рис. 7.2.1, а-б). Обычно в третьем поколении частота мутаций бывает более низкой по сравнению с М2. В нашем случае при мутагенной обработке незрелых зародышей частота наследуемых изменений в М3 (табл. 7.3.2) значительно не отличалась от таковой в более раннем поколении (табл. 7.3.1). Такая картина была характерной для обеих линий. Также как в поколении М2, и в следующем поколении М3 наблюдали различия в частоте отдельных типов мутаций между вариантами с разным возрастом зародышей. У линии ЗЛ-95 после обработки зародышей 9-11суточного возраста с частотой 3,1% были выявлены такие видимые изменения деформированные листья обвертки, короткие и гофрированные краевые цветки, не обнаруженные при обработке зародышей 14-16- суточного возраста. В этом варианте были отобраны и такие редкие мутации как xantha некротического типа, дихотомическое жилкование, табакоподобное растение и ряд других. 212 Рис. 7.3.1. Мутант «хлорофильная недостаточность типа xantha (2)» на разных стадиях развития, выделенный из линии ЗЛ-95 213 Таблица 7.3.2 Частота мутаций в M3 после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей подсолнечника, % Линия, обработка Тип мутации ЗЛ-95, ЭМС 1 ЗЛ-95, ЭМС 2 1 1,6 3,1 2 0,9 3 3,1 4 1,6 6 3,2 9 3,1 10 3,1 11 3,2 12 1,6 15 3,2 3,1 3,1 17 3,1 18 3,1 22 3,1 23 1,6 24 1,6 0,9 6,3 29 3,1 30 3,1 31 1,6 32 1,6 33 1,6 Общая частота 0,9 4,6 25 26 ЗЛ-809, ЭМС 1 28,7±5,70 34,1±8,51 7,3±2,49 214 В случае мутагенной обработки более зрелых зародышей с наибольшей частотой в М3 выявлена мутация полной стерильности. Растения этого мутантного типа были обнаружены в четырех семьях и не отмечались нигде больше в нашем исследовании. Выделенные нами в поколениях М2 и М3 мутации как при обработке незрелых зародышей, так и зрелых семян, могут использоваться в селекционных программах по подсолнечнику как доноры маркерных признаков в семеноводстве гибридов или для создания исходного материала в качестве источников низкорослости, высокорослости, укороченного и удлиненного вегетационных периодов, повышенной масличности и некоторых других признаков, имеющих хозяйственное значение. В процессе разработки биотехнологического метода «Получение мутантных генотипов зародышей» было подсолнечника изучено c использованием наследование ряда культуры выявленных морфологических мутаций и установлено, что они находятся под простым генетическим контролем [100, 299]. Это значительно облегчает вовлечение образцов подсолнечника, несущих данные мутантные признаки, в селекционный процесс и свидетельствует об эффективности биотехнологических подходов в практической селекции. Подытоживая данные, представленные в главе 7, можно сделать следующие выводы. Выживаемость растений М1 после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей подсолнечника, как 9-11, так и 14-16-суточного возраста, существенно снижалась по сравнению с необработанными мутагеном зародышами. При этом выживаемость растений из более молодых зародышей была значительно меньшей. Во всех случаях большая часть материала погибала еще до момента высадки растений в поле. Обработка незрелых зародышей 9-11 и 14-16-суточного возраста ЭМС с последующим доращиванием их в условиях in vitro и высадкой в поле 215 существенно изменяла такие количественные показатели растений поколения М1 как высота растения, длина вегетационного периода, диаметр корзинки, количество семян в корзинке и др. При этом увеличивалось количество дней до начала цветения, удлинялся вегетационный период, а направленность изменения высоты растений зависела от генотипа. Характерно, что растения выросшие из зародышей более молодого возраста имели значительно меньшую высоту. Установлено, что использование в качестве объекта мутагенного воздействия незрелых зародышей приводит к появлению в М2 высокой частоты наследуемых изменений, которая составляла 15,4% у линии ЗЛ-809 и варьировала от 34,1 до 39,9% – у линии ЗЛ-95. При этом частота мутаций в случае использования незрелых зародышей была значительно выше чем при использовании зрелых семян, где наблюдали от 8,7 до 9,6% мутаций. При обработке зрелых семян у каждой линии выявляли лишь 3 типа мутаций, тогда как в случае обработки мутагеном незрелых зародышей – от 7 типов у линии ЗЛ-809 и до 9-14 типов – у линии ЗЛ-95. В поколении М3 при обработке незрелых зародышей также наблюдали высокую частоту и широкий спектр мутаций. Спектр мутантных типов в значительной степени были обусловлены возрастом обрабатываемых зародышей. Лишь в случае зародышей более молодого (9-11-суточного) возраста наблюдали появление таких оригинальных мутаций как дихотомическое жилкование, табакоподобное растение, короткие и гофрированные краевые цветки, а также xantha некротического типа, тогда как результатом обработки зародышей 14-16-суточного возраста было появление мутаций полной стерильности. При обработке химическим мутагеном зрелых семян подсолнечника выявлены изменения масличности семян, которые, однако, были связаны лишь с уменьшением данного показателя. У мутантов линии ЗЛ-809 216 максимальное уменьшение масличности составляло 8,84%, а у линии ЗЛ-95 – 9,20%. При действии ЭМС на незрелые зародыши также выявлены значительные изменения на биохимическом уровне. Вместе с тем, эти изменения наблюдались как в меньшую, так и в большую сторону. Так, у линии ЗЛ-809 выделены мутантные образцы с увеличенным содержанием масла в семенах. Максимальное превышение по сравнению с контролем составляло 5,31%. 7.3.1. Оценка мутантных линий методом электрофореза запасных белков семян Часть мутантов линий ЗЛ-95 и ЗЛ-809, полученных в результате обработки химическим мутагеном этилметансульфонатом незрелых зародышей, была оценена по электрофоретическому спектру запасных белков семян. Материалом служили семена мутантных линий с различным типом хлорофильной недостаточности, измененным габитусом, с мутациями соцветия и др. Для выделения запасных белков семян подсолнечника из каждой семянки извлекали ядра, индивидуально измельчали до гомогенного состояния, отделяли масло, а из остатка экстрагировали гелиантинины. Полученный супернатант с добавкой концентрирующего и дезагрегирующего раствора отстаивали в течение ночи. Для проведения электрофореза по 100 мкл раствора супернатанта наносили в слоты 13%ного полиакриламидного геля. Электрофорез осуществляли в электродном ацетатном растворе при силе тока 100 мА и напряжении 450 вольт в течение 2,5 часов. Окраску гелей проводили в течение 16-17 часов в растворе кумасси бриллиантового синего R-250. Электрофоретические гели сканировали при помощи офисного сканера, после чего анализировали 217 визуально, а также используя специальное программное обеспечение для анализа гелей (Gel электрофоретических Analyzer спектров 2010 белков и аналогичное). проводили на Описание основании локализации и интенсивности белковых компонентов. Анализ электрофореграмм свидетельствует о наличии мутантных в некоторых образцов из них линии ЗЛ-95 различий в электрофоретических спектрах запасных белков семян по сравнению с исходной линией (рис. 7.3.1.1). Эти различия заключались как в наличииотсутствии компонентов, так и их интенсивности в составе белковых спектров. Характерно, что различия в электрофоретических спектрах Рис. 7.3.1.1. Электрофоретические спектры запасных белков семян мутантных и исходной линии ЗЛ-95 подсолнечника: 1 – линия ЗЛ-95, 2 – xantha 2, 3 – xantha 1, 4 – наклоненный стебель, 5 – рыже-бурая окраска семян 218 наблюдали лишь относительно низкомолекулярных белков (локусы HEL 4 и HEL 6). Как видно из рис. 7.3.1.1 и табл. 7.3.1.1, для электрофоретического спектра запасных белков семян исходной линии ЗЛ-95 характерно лишь наличие первого компонента в двухкомпонентном локусе HEL 6. Аналогичный спектр в данном локусе характерен и для мутантных образцов xantha 1 и образца с рыже-бурой окраской семян. Вместе с тем, электрофоретический спектр локуса HEL 6 линии xantha 2 представлен вторым компонентом этого локуса, а линии, имеющей наклоненный стебель – обоими компонентами. Таблица 7.3.1.1 Подвижность полипептидов подсолнечника мутантных образцов и исходной линии ЗЛ-95 в локусах HEL 4 и HEL 6, Rf Зона 1 Мутантный образец 2 3 4 5 HEL 4 1 0,70 0,70 0,70 0,69 2 0,75 0,75 0,75 3 0,77 0,77 0,77 4 0,79 5 0,81 0,81 6 0,84 0,84 0,69 0,78 0,82 0,81 0,81 0,83 0,83 0,94 0,93 HEL 6 1 2 0,94 0,93 0,98 0,97 Отличительной особенностью электрофоретического спектра ряда мутантов линии ЗЛ-95 является также иной компонентный состав и большая степень интенсивности отдельных белковых компонентов в локусе 219 HEL 4 по сравнению с исходной линией. Эти отличия от исходной линии несли мутанты xantha 1 и с наклоненным стеблем. Таким образом, из представленных на рис. 7.3.1.1 электрофореграмм четырех мутантных линий на основе линии ЗЛ-95, три из них отличались по спектру запасных белков семян от исходной линии. Мутантные линии xantha 2 и с наклоненным стеблем несли отличия в двух локусах – HEL 4 и Рис. 7.3.2. Электрофоретические спектры запасных белков семян мутантных и исходной линии ЗЛ-809 подсолнечника: 1 – линия ЗЛ-809, 2 – viridis, 3 – низкий габитус, 4 – мало краевых цветков 220 HEL 6, при этом спектры обеих линий отличались друг от друга. Линия xantha 1 отличалась от исходной по белковому спектру локуса HEL 4. И лишь электрофоретический спектр запасных белков семян мутанта с рыжебурой окраской семян полностью совпадал со спектром исходной линии по всем локусам. Очевидно, мутации, приведшие к изменению данных морфологических признаков растений xantha 1, xantha 2 и с наклоненным стеблем затронули запасные белки семян данных мутантных линий в отличие от мутанта с рыже-бурыми семенами. Что касается мутантов линии ЗЛ-809, то линия viridis по спектру запасных белков семян не отличалась от исходной линии (рис. 7.3.2). Мутантная линия с низким габитусом, также как и мутант с малым количеством краевых цветков характеризовались иным количеством белковых компонентов в локусе HEL 4 и их иной интенсивностью. Кроме того, линия с малым количеством краевых цветков характеризовалась наличием одного из белковых компонентов в локусе HEL 6. Таким образом, проведенный электрофоретический анализ запасных белков семян некоторых мутантных линий, полученных в результате обработки мутагеном незрелых зародышей подсолнечника, выявил у ряда из них отличия в электрофоретическом спектре от исходных линий. Это дополнительно свидетельствует о генетических изменениях, произошедших у анализируемых мутантных образцов. 7.4. Наследование некоторых признаков у мутантных образцов подсолнечника, полученных с использованием эмбриокультуры и химического мутагенеза Несмотря на многочисленность новых признаков, которые были получены при помощи индуцированного мутагенеза, их пока недостаточно для того, чтобы можно было говорить о возможности кардинальных изменений по расширению генофонда подсолнечника. В связи с этим 221 предпринимаются многочисленные усилия по поиску новых подходов для увеличения генетического разнообразия данной культуры, в том числе и с использованием биотехнологий. Результатом использования разработанного нами приема, основанного на обработке химическим мутагеном незрелых зародышей, стало появление широкого спектра образцов подсолнечника с новыми признаками, генетический контроль которых был неизвестен. Выяснение особенностей наследования признаков имеет принципиальное значение для ускорения их внедрения в практический селекционный процесс [15]. Материалом для изучения наследования новых мутантных признаков были мутантные линии подсолнечника, полученные при обработке химическим мутагеном этилметансульфонатом незрелых зародышей линий ЗЛ-95 и ЗЛ-809 селекции Института масличных культур, а также сами исходные линии. Для получения семян гибридов F1 изоляцию и кастрацию родительских растений проводили согласно стандартной методики [75]. Во время цветения проводили опыление материнских компонентов будущих гибридов пыльцой соответствующего родительского образца. Для получения семян F2 гибридные растения F1 индивидуально изолировали и самоопыляли. Семена F2 высевали для получения растений F2 и на соответствующей стадии развития проводили визуальный анализ растений на наличие мутантного или нормального признака. Анализ наследования мутантных признаков выполняли по общеизвестным методикам генетического анализа качественных признаков. Проверку гипотез соответствия фактического расщепления теоретически ожидаемому проводили с использованием критерия χ2 [219]. Нами было изучено наследование таких мутантных признаков как светло-зеленая окраска листа, округлая форма листа, некроз ткани на листьях и веерообразное жилкование листа. 222 Наследование признака светло-зеленой окраски листьев, окраской листьев индуцированного у линий ЗЛ 95 и ЗЛ 809 Мутантную линию со светло-зеленой («хлорофилльная недостаточность типа viridis»), выделенную в результате обработки мутагеном незрелых зародышей 14-16-суточного возраста линии ЗЛ 95 (рис. 7.2.1, в), скрещивали с исходной формой, – зеленым растением. Все гибриды первого поколения по этому морфологическому признаку не отличались от контроля и имели зеленую окраску листьев. В поколении F2 наблюдали расщепление на растения с зелеными и светло-зелеными листьями. Из данных гибридологического анализа, сведенных в таблице 7.4.1, видно, что признак данной хлорофильной недостаточности типа «viridis», которая проявляется как светло-зеленая окраска листьев, является рецессивным и наследуется моногенно (χ2 = 0,02) при скрещивания мутантной линии с исходной ЗЛ-95. Таблица 7.4.1 Наследование признака «хлорофилльная недостаточность типа viridis» при скрещивании мутанта подсолнечника с исходной линией ЗЛ-95 Фенотип растений F1 Всего Расщепление в F2 растений, Лист шт. зеленый 237 179 Лист зеленый Прим.: χ205 (df=1)=3,84. Лист Модель светло- расщепления χ2 зеленый 58 3:1 0,02 223 Также нами изучалось наследование признака «viridis», выделенного у линии ЗЛ 809, совместно с «virescent» от ЗЛ 102. Растения с признаком viridis имели светло-зеленую окраску листьев, а растения с признаком virescent имели желтые всходы с последующим позеленением на более поздних стадиях развития. Гибриды F1 характеризовались зеленой окраской листьев. В F2 происходило расщепление на классы: зеленые всходы и растения, желтые всходы и зеленые растения, зеленые всходы и светлозеленые растения, желтые всходы и светло-зеленые растения в соотношении 127:38:38:6. Данное расщепление существенно не отличается от ожидаемого 9:3:3:1 (χ2 = 4,65; p = 0,1993). Следовательно, гены, детерминирующие данные признаки, являются рецессивными, наследуются моногенно и локализованы, вероятно, в разных хромосомах . Наследование признака «дихотомическое жилкование», индуцированного у линии ЗЛ 95 В случае изучения наследования признака «дихотомическое жилкование» (иначе «веерное жилкование») (рис. 7.2.4) гибриды первого поколения по типу жилкования листа ничем не отличались от контроля. Листья всех растений F1 характеризовались сетчатым жилкованием, свойственным исходной линии. В F2 большая часть растений несла такой же признак, как и гибриды F1, а приблизительно четвертая часть растений имела веерное жилкование листа. Проведенный гибридологический анализ (табл. 7.4.2) свидетельствует о том, что признак измененного типа жилкования листьев является рецессивным и наследуется моногенно в скрещиваниях с исходной линией. 224 Таблица 7.4.2 Наследование признака «дихотомическое жилкование» при скрещивании мутанта подсолнечника с исходной линией ЗЛ-95 Фенотип растений F1 Нормальные растения Всего растений, шт. Расщепление в F2 сетчатое дихотоми- жилко- ческое вание жилкование 73 22 95 Модель расщепле- χ2 ния 3:1 0,22 Прим.: χ205 (df=1)=3,84. Наследование признака округлой формы листовой пластинки, выявленного у линии ЗЛ 95 При скрещивании исходной линии ЗЛ-95 с мутантом, выделенным по признаку «округлая форма листа» (рис. 7.2.3), все гибриды F1 имели удлиненный лист, типичный для исходной линии. Из результатов гибридологического анализа (табл. 7.4.3) видно, что лишь четверть растений из популяции F2 имела листья округлой формы, что свидетельствует о рецессивном характере данного мутантного признака. Наследование формы (округлая, удлиненная) и жилкования (веерообразное, сетчатое) листа При скрещивании исходной линии ЗЛ-95 с мутантом с округлой формой листьев, выделенным после обработки этилметансульфонатом незрелых зародышей подсолнечника (рис. 7.2.3), все гибриды F1 имели удлиненный лист, типичный для исходной линии. Из результатов гибридологического анализа (табл. 7.4.4) видно, что наследование данного признака происходит согласно модели расщепления 3:1 (χ 2=1,96). 225 Таблица 7.4.4 Наследование признака «округлая форма листа» при скрещивании мутанта подсолнечника с исходной линией ЗЛ-95 Расщепление в F2 Всего Фенотип растений F1 растений, шт. Лист Лист Лист удлиненный округлый 68 удлиненный Модель 56 расщепления 12 3:1 χ2 1,96 Прим.: χ205 (df=1)=3,84. При скрещивании мутантов «округлая форма листа» и «веерное жилкование» от линии ЗЛ-95 в F1 растения обладали нормальным фенотипом, то есть имели удлиненную форму листа и сетчатое жилкование, как видно из таблицы 7.4.5. В F2 наблюдали расщепление близкое к 9:3:3:1. В данной популяции 49 растений имели нормальный фенотип, 18 растений несли удлиненную форму листа и веерообразное жилкование, 11 растений имели округлую форму и сетчатое жилкования листьев, а 3 растения округлую форму и веерообразное жилкование листьев. Для выяснения того, отличается ли расщепление, наблюдаемое нами, от теоретически ожидаемого (9:3:3:1), был рассчитан χ2, на основании чего был сделан вывод о том, что данное расщепление не отличается от менделевского и отвечает дигибридному скрещиванию при независимом наследовании генов. Таким образом, данные мутантные признаки являются рецессивными, наследуются независимо, а гены, которые их определяют, локализованы, вероятно, в разных хромосомах. Аналогичные расщепления наблюдали и в других популяциях F2 от скрещивания мутантов с округлой формой листа и веерным жилкованием (табл. 7.4.5). 226 Таблица 7.4.5 Наследование признаков «веерное жилкование листа» и «округлый лист» при скрещивании мутантов подсолнечника между собой Расщепление в F2 Фенотип χ2 растений F1 Лист удлиненный, жилкование 81 49 18 11 3 9:3:3:1 1,86 сетчатое Прим.: χ205 (df=3)=7,84 Наследование веерообразного жилкования листа и некроза тканей листа xantha В результате мутагенной обработки незрелых зародышей подсолнечника были обнаружены несколько типов мутантов с различным проявлением хлорофильной недостаточности. В данном случае мы изучали наследование признака «хлорофилльная недостаточность типа xantha» (рис. 7.3.1), которая проявлялась как желто-зеленые листья с сильными некротическими пятнами в конце вегетации, вместе с признаком «тип жилкования листа». Для анализа наследования признаков веерообразного жилкования листа и некроза тканей листа скрещивали две мутантные линии между 227 собой. Гибриды F1 после такого скрещивания имели нормальный фенотип, то есть сетчатое жилкование и здоровые зеленые листья. В следующем поколении F2 было проанализировано 284 растения и наблюдалось расщепление близкое к 9:3:3:1 (табл. 7.4.6). Среди растений преобладали особи, имевшие нормальный фенотип, характеризующийся сетчатым жилкованием листьев и здоровыми зелеными листьями. Примерно одинаковое количество растений было в двух фенотипах, несших по одному мутантному признаку. Меньше всего было растений, несших оба мутантных признака, т.е. веерообразное жилкование и некроз тканей листа. Полученные данные позволяют утверждать, что мутантные признаки наследуются согласно закону о дигибридном скрещивании при независимом наследовании генов. Закономерности наследования верного жилкования листа разного типа В качестве исходного материала использовали мутанты с измененным, по сравнению с исходной формой, типом жилкования двух самоопыленных линий подсолнечника селекции Института масличных культур НААН, которые являются компонентами уже созданных коммерческих гибридов и широко используются в настоящее время для получения новых удачных комбинаций скрещивания. Один из мутантов был выделен в М3 в результате обработки незрелых зародышей 9-10-суточного возраста линии ЗЛ-95 0,02%-ным водным раствором этилметансульфоната. Для растений, несущих эту мутацию, характерным было отсутствие ярко выраженной центральной жилки, гофрированность листовой пластинки в местах расположения главных жилок, вплоть до наличия у основания листа израстаний (рис. 7.2.4). 228 Таблица 7.4.6 Наследование признаков веерного жилкования листа и хлорофилльной недостаточности тканей листа xantha у подсолнечника Классы фенотипов в F2 Сетчатое жилкование Вариант Веерное жилкование листа листа Зеленый Xantha Зеленый ♂ ♀ 163 55 53 14 161 53 53 18 9 3 3 1 Фенотип родителей Фенотип Xantha F1 гибрида F1 Факт. расщепление в F2 Теор. ожидаемое расщепление в F2 Ожидаемое соотношение χ2 0,99 Прим.: χ205 (df=3) = 7,84. Другая мутация веерного жилкования листа была нами ранее выделена в М2 в результате обработки химическим мутагеном этилметансульфонатом незрелых семян линии ЗЛ-9 [100]. У такого мутанта основная часть боковых жилок первого порядка отходит не от центральной жилки, а от черешка. Для исходных линий ЗЛ-95 и ЗЛ-9 характерен сетчатый тип жилкования, когда боковые жилки, не доходя до края листовой пластинки, многоразово ветвятся и их многочисленные ответвления соединяются между собой, образуя сетку из отдельных петель. 229 Первоначально было изучено наследование данного признака в скрещиваниях с исходной формой ЗЛ-95. Гибриды первого поколения по типу жилкования листа ничем не отличались от контроля. Листья всех растений F1 характеризовались сетчатым жилкованием, свойственным исходной линии. В F2 большинство растений несли такой же признак, как и гибриды F1, а приблизительно четвертая часть – имела веерное жилкование листа (табл. 7.4.7). Таблица 7.4.7 Наследование признака «веерное жилкование» при скрещивании мутанта подсолнечника с исходной линией ЗЛ-95 Фенотип растений F1 Сетчатое жилкование листа Всего растений, шт. 95 Расщепление в F2 сетчатое жилкование 73 Модель веерное расщепле- жилкование ния 22 3:1 χ2 0,22 Прим.: χ205 (df=1)=3,84. Проведенный гибридологический анализ свидетельствует о том, что признак измененного (веерного) жилкования листьев является рецессивным и наследуется моногенно в скрещиваниях с исходной линией. При дальнейшем исследовании тест на аллелизм показал, что гены, детерминирующие веерное жилкование у обеих линий, различны, поскольку листья гибридов от скрещивания этих мутантов между собой имели обычное сетчатое жилкование. В F2 наблюдали расщепление на 4 фенотипических класса: листья с сетчатым жилкованием, листья с веерным жилкованием, характерным для линии ЗЛ-95, листья с веерным жилкованием, от линии ЗЛ-9 и листья с 230 комбинированным веерным жилкованием. В последнем случае кроме веерного жилкования по типу мутанта линии ЗЛ-9 листья характеризовались очень сильной зубчатостью и пузырчатостью, а сами растения несли признаки угнетенности (рис. 7.4.1). Проведенный гибридологический анализ двух популяций F2 указывает на расщепление, типичное для дигибридного скрещивания при комплементарном взаимодействии двух генов (табл. 7.4.8). Очевидно, гены, отвечающие за веерный тип жилкования этих двух мутантов независимы, т.е. локализованы, скорее всего, в разных хромосомах и являются рецессивными. Рис. 7.4.1. Мутантный образец подсолнечника с веерным жилкованием и сильной изрезанностью листа, выделенный из популяции F2 ЗЛ-95 × ЗЛ-9 Несмотря на то, что оба этих гена обуславливают веерный тип жилкования листа, каждый из них имеет свои особенности 231 фенотипического проявления, что позволяет легко проводить их визуальную идентификацию. Таблица 7.4.8 Расщепление в F2 при скрещивании мутантов подсолнечника с разным типом веерного жилкования листа, выделенных из линий ЗЛ-9 и ЗЛ-95 Классы фенотипов в F2 Вариант Фенотип родителей Фенотип гибрида F1 Фактическое расщепление в F2 Теоретически ожидаемое расщепление в F2 Ожидаемое соотношение χ2 Прим.: χ205 (df=3) = 7,84. ♂ ♀ 45 12 16 7 45 15 15 5 9 3 3 1 F1 1,47 232 Двойная рецессивная гомозигота, являясь в данном случае новообразованием, имеет веерное жилкование листа, подобное мутанту линии ЗЛ-9, сильно деформированный лист и отставание в росте и развитии. Такие растения фенотипически легко отличаются от обоих мутантных генотипов. Наследование признака «рыжая окраска семян» Также нами изучалось наследование признака «рыжая окраска семян» в скрещиваниях с исходной формой, которая имела черную окраску оболочки семени (табл. 7.4.9). Этот мутант был выделен в результате обработки незрелых зародышей подсолнечника линии ЗЛ-95 химическим мутагеном ЭМС. Таблица 7.4.9 Наследование признака «рыжая окраска семян» при скрещивании мутанта подсолнечника с исходной линией ЗЛ-95 (черная окраска семян) Фенотип растений F1 Всего Расщепление в F2 растений, рыжие черные шт. семена семена 144 37 107 Черная окраска оболочки семени Модель расщепления 3:1 χ2 0,85 Прим.: χ205 (df=1)=3,84. Как видно из вышеупомянутой таблицы, все растения в F1 имеют черную окраску оболочки семени, то есть этот тип окраски доминирует. В F2 происходит расщепление на классы с черной и рыжей окраской оболочки семян в соотношении 3: 1, соответственно. Из этого расщепления видно, 233 что признак «рыжие семена» является рецессивным по отношению к исходному образцу и контролируется одним геном. Таким образом, при изучении генетики некоторых новых мутантных признаков подсолнечника, выделенных в результате обработки химическим мутагеном этилметансульфонатом зародышей незрелого возраста двух линий, было установлено, что признаки светло-зеленой окраски листьев, округлой формы листа, рыжей окраски семян, веерообразного жилкования и некроза тканей листа являются рецессивными и в скрещиваниях с исходными линиями наследуются моногенно. Признаки веерообразного жилкования и округлой формы листа, а также веерообразного жилкования и некроза тканей листа в парных скрещиваниях наследуются независимо. Что касается признака «сетчатое жилкование листа», то, судя по полученным нами данным, его проявление обусловлено наличием как минимум двух доминантных аллелей генов, локализованных, очевидно, в разных хромосомах. А веерное жилкование детерминируется рецессивными аллелями любого из этих двух генов. Проведенный генетический анализ показал, что многие мутантные признаки, выявленные при обработке незрелых зародышей подсолнечника химическим мутагеном этилметансульфонатом, характеризуются простым генетическим контролем. Это позволяет легко передавать данные признаки селекционному материалу, вовлекая в скрещивания мутантные линии. Таким образом, использование незрелых зародышей в качестве объекта мутагенной обработки позволило получить целый ряд образцов подсолнечника с новыми признаками, которые не удавалось выявить используя иные методы. В целом это дало возможность расширить генетическое разнообразие у данной культуры. Результаты, представленные в данной главе, отражены в монографии «Индуцированный мутагенез масличных культур» [51], методических рекомендациях «Получение мутантных генотипов подсолнечника c 234 использованием культуры зародышей» [103] и других публикациях [13, 91, 94, 95, 100, 236, 298, 299]. Новизна данной технологии также защищена патентом [66]. 235 РАЗДЕЛ 8 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Получение андроклинных растений через культуру пыльников и микроспор на сегодняшний день является наиболее прогрессивной технологией создания гомозиготных линий растений в плане быстроты их получения и генетической однородности [60, 245]. Однако, поскольку растения при культивировании пыльников образуются из гаплоидных структур, они могут быть как гаплоидами, так и удвоенными гаплоидами. Последние образуются либо вследствие спонтанного удвоения количества хромосом в культуре in vitro, либо в результате воздействия специфических агентов, которые ингибируют образование веретена деления. Сами гаплоиды, как правило, редко представляют интерес для практики из-за несбалансированности генома и невозможности нормального получения семенного поколения. Поэтому важно отличать гаплоиды от удвоенных гаплоидов, которые визуально не всегда различимы. Надежным методом идентификации плоидности живых организмов является подсчет количества хромосом в соматических клетках. Вместе с тем этот подход не лишен недостатков, поскольку не всегда удается быстро найти соответствующие приготовления стадии временных или деления клеток, постоянных а сам препаратов процесс достаточно длителен. Поэтому для анализа плоидности часто прибегают к непрямым методам анализа, - не таким надежным, но более быстрым. Из таких методов хорошо известен метод подсчета числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. Он успешно апробирован на ряде культур, таких как морковь, горчица, перец и ряде других [22, 44, 206, 273]. С плоидностью растений могут коррелировать и другие признаки. Так, дифференциацию гаплоидных растений и удвоенных гаплоидов проводят и по размеру замыкающих клеток устьиц. Например, данный 236 параметр положительно коррелировал с уровнем плоидности у андрогенных растений перца, хотя, по мнению авторов, количество хлоропластов является более надежным критерием [273]. Для выявления гаплоидов возможно использовать также и количество замыкающих клеток устьиц на единицу площади листа. Например, по данным О.В. Котляровой [44] у гаплоидных растений Daucus carota L. этот показатель был на четверть большим, чем у диплоидов. Известно также, что растения с разной плоидностью характеризуются и разным размером вегетативных и генеративных органов. По этим показателям в популяции диплоидных растений можно выделять образцы с более высоким уровнем плоидности. В отношении дифференциации рапса использование гаплоидных растений косвенных и подходов удвоенных для гаплоидов практически не исследовано. Известны лишь отдельные сведения о возможной связи между количеством хлоропластов в клетках и плоидностью растения. В результате проведенных исследований нами выявлена достаточно четкая связь между плоидностью образцов озимого рапса, полученных через культуру пыльников, морфологическими и некоторыми характеристиками растений. цитологическими Показано, что и у гаплоидных растений число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и размер самих замыкающих клеток устьиц были значительно меньшими, а количество устьиц на единицу площади – большим, чем у удвоенных гаплоидов и диплоидов. Гаплоиды характеризовались также меньшими размерами лепестков и пыльников и, в целом, цветка по сравнению с удвоенными гаплоидами и диплоидами. Разработанная нами методология позволяет достаточно быстро выявлять растения рапса с нужной плоидностью для дальнейшего их использования в селекционных или научных программах. 237 Еще одной проблемой при получении гомозиготных линий растений в культуре пыльников является выяснение источника происхождения новообразований. Часто не представляется возможным определить клетки какой плоидности дали начало образующимся на поверхности пыльников каллусной ткани или эмбриоидам. На сегодняшний день для решения этой проблемы используют практику взятия проб ткани растений-регенерантов и проведения цитологического анализа плоидности клеток этих тканей. Однако к этому времени растения-регенеранты уже могут иметь двойной набор хромосом из-за спонтанного удвоения и реально не отражать источник своего происхождения [60, 130]. Проведение цитологического анализа плоидности на более ранних этапах невозможно из-за высокой вероятности повреждения образующихся регенерантов. Для прогнозирования источника происхождения новообразований (такими источниками могут быть микроспоры или спорофитные ткани пыльника), образующихся при культивировании in vitro пыльников гибрида F1, нами предложено использовать анализ генетической структуры популяции регенерированных из новообразований растений с маркерным признаком, присущим как минимум одному из родительских компонентов гибрида. В качестве маркерного можно использовать такой признак, который четко идентифицируется на соответствующей стадии развития растения (например, окраска листьев или цветка). Однотипность генома диплоидных клеток спорофитных тканей пыльника гибрида, в случае образования из них регенерантов, обусловливает однотипность по морфологическим признакам и растенийрегенерантов. В отличие от диплоидной клетки спорофитной ткани, микроспора имеет гаплоидный генотип и получает в процессе мейоза лишь по одной из каждой пары гомологичных хромосом. Это приводит к тому, что из разных 238 по генотипу микроспор гибрида формируются различные по морфологическим признакам растения-регенеранты. Вследствие этого среди растений-регенерантов по маркерному признаку происходит расщепление на несколько классов – два класса растений выявляют в случае контроля исследуемого признака, обусловленного одной парой генов, четыре класса – двумя парами генов при их независимом наследовании и так далее. Таким образом, если источником происхождения популяции растений-регенерантов являются гаплоидные структуры (микроспоры), то среди данных растений наблюдается расщепление по маркерному признаку, а в случае, если источником происхождения популяции растенийрегенерантов являются спорофитные ткани, то расщепления не наблюдается, т.е. все растения имеют одинаковые морфологические признаки. Это обнаруживают в результате визуального наблюдения, что не требует особых знаний или специального оборудования. Важным преимуществом данного способа является еще и то, что его можно использовать не только для культуры льна, на котором он разработан, но и на любом виде цветковых растений. Лен масличный является важной сельскохозяйственной культурой, забытой на некоторое время в Украине. Однако в настоящее время он возрождается, посевы его с каждым годом расширяются, а усиленная селекционная работа по созданию новых сортов льна требует привлечения современных методических подходов, одним из которых является культура пыльников. Особенно это важно в вязи с тем, что гомозиготные удвоенные гаплоиды этой культуры могут напрямую использоваться как сорта. Тем не менее, широкое применение у льна такого биотехнологического приема как культура пыльников сдерживается сложностями индуцирования процессов морфогенеза в каллусной ткани, а также развития и удлинения побегов, которые начали формироваться из 239 почек в очагах меристематической ткани. В обоих случаях речь может идти о необходимости тщательного подбора питательных сред, выявления компонентов сред, наиболее сильно влияющих на протекание вышеуказанных процессов каллус [23, 162, 182]. Вместе с тем, в процессе поиска оптимальной питательной среды для регенерации не было достигнуто ее приемлемой частоты. В этом плане нами было более детально изучено влияние такого фитогормона как 6бензиладенин и показано, что БАП в концентрации 2 мг/л оказывал наилучшее влияние на развитие каллуса и индукцию побегов у льна. Нами также была выявлена особенность, проявляющаяся в том, что последующее культивирование на свежей питательной среде вызывало дедифференциацию регенерированных структур. Не менее важным вопросом, который требует решения, является слабая интенсивность роста побегов, регенерированных из гаплоидного каллуса. Одним из путей регуляции высоты растения является воздействие фитогормонами, в частности, гибберелловой кислотой. Поэтому ее часто используют для удлинения междоузлий в полевых условиях у карликовых образцов [158, 156], а также в культуре in vitro для удлинения побегов [167]. Вместе с тем известно, что лен, по сравнению с другими видами, менее отзывчив на стимулирующее воздействие гибберелловой кислотой, в частности, в плане вегетативного роста [281]. В этой связи нами были испытаны фитогормоны разных классов в различных сочетаниях. При этом в состав сред дополнительно вводили ряд аминокислот и бор. Лучшим вариантом оказалась питательная среда, содержащая, кроме других компонентов, три ростовых вещества, относящихся к разным группам действия – БАП, НУК и ГК3. Сложности получения полноценных растений в культуре пыльников могут наблюдаться и на этапе укоренения регенерированных побегов. Обычная практика предполагает в этом случае двойное уменьшение 240 концентрации минеральных солей и снижение количества углеводов [10, 267]. Для данного этапа нами предложено использовать среду МС, содержащую 60-75% макро- и микросолей, 1-2% сахарозы и набор фитогормонов (НУК, ИМК и/или ИУК) в определенной концентрации. В обобщающем виде модифицированная технология получения удвоенных гаплоидов льна через культуру пыльников состоит из следующего набора процедур: - выращивание донорных растений в оптимальных условиях; - сбор бутонов в период оптимальной (одноядерной или ранней двухядерной) стадии развития пыльцы; - предобработка бутонов при пониженной (5-7°C) температуре в течение 1-2-х суток; - высадка пыльников на стерильную питательную среду LMA-1 с увеличенной концентрацией сахарозы на 2-4%; - культивирование пыльников при комнатной или пониженной (10°C) температуре в течение первых 10-ти суток после посадки; - последующее культивирование пыльников при комнатной температуре в течение 30-35 суток; - пассирование образовавшихся каллусов на среду для регенерации с базовым составом по среде N6 и количеством БАП 2-4 мг/л; - пассирование образовавшихся побегов на среду N6 или МС для удлинения побегов, содержащую фитогормоны БАП, НУК и ГК3 в концентрации 0,5, 0,05 и 0,2 мг/л соответственно, с добавкой аспарагина, глутамина и серина (200, 30 и 100 мг/л соответственно) и витамина В1; - укоренение побегов на среде МС с пониженным на 25-40% содержанием макро- и микроэлементов, содержанием сахарозы 1-2% и дополненной гормонами НУК, ИМК или ИУК в концентрации 1-2 мг/л; - анализ плоидности регенерантов и последующая диплоидизация гаплоидных растений раствором колхицина концентрации 0,05-0,5%; 241 - высадка в почву и адаптация к естественным условиям; - доращивание растений до созревания семян. Детальное изложение данной технологии представлено в методических рекомендациях [104]. Каллусные культуры имеют самое разное предназначение и могут использоваться как продуценты биологически активных веществ, являться исходным материалом при регенерации, быть источником для суспензионных культур и др. [10, 84]. Поэтому неудивителен повышенный интерес исследователей к оптимизации условий культивирования каллусной ткани [242, 271]. Узким местом в этом вопросе является высокая генотипоспецифичность, что ограничивает более широкое применение каллусных культур. В этой связи нами были предприняты усилия по оптимизации подсолнечника. условий Особое культивирования каллуса внимание обращали разных также на генотипов инициацию каллусных культур из разных типов эксплантов. Выявлено, что у подсолнечника на эксплантах гипокотилей и семядолей каллус развивался лучше. Среда, содержащая фитогормоны БАП и НУК, в этом плане оказалась наиболее оптимальной. В процессе изучения каллусных культур нами была выявлена интересная особенность, заключающаяся в том, что степень развития каллуса из гибридных генотипов была лучше, чем каллуса из родительских компонентов гибрида, т.е. наблюдалось проявление гетерозиса по признаку «каллусообразующая способность». В литературе отмечается обусловленность высокой отзывчивости в культуре in vitro аддитивнодоминантной моделью действия генов [271]. Более того, показано, что не только каллусообразующая, но и регенерационная контролируется генетически, а данный признак доминантный [117]. способность наследуется как 242 Говоря о культуре льна следует сказать, что относительно многих его дикорастущих видов почти неизвестны работы по их вводу в культуру in vitro. Zhan et al. (1989) приводит данные о культивировании Linum marginale, а Barakat M.N., Cocking E.C. (1985) и Ling H., Binding H. (1992) изучали процессы регенерации в культуре протопластов ряда видов. Вместе с тем, дикорастущие виды льна интересны как с селекционной, так и с генетической точек зрения. Нами была изучена частота каллусообразования у пяти однолетних видов льна при использовании в качестве эксплантов гипокотилей, семядолей, меристем. В отличие от культурного льна меристемы дикорастущих видов оказались наименее пригодными для получения каллуса в культуре in vitro. Такая информация была нами получена впервые, в частности для L.angustifolium, L.hispanicum и L.pubescens. Метод эмбриокультуры нашел широкое применение у многих сельскохозяйственных растений, в том числе и у подсолнечника. В большинстве случаев он используется в процессе получения гибридов при межвидовых и межродовых скрещиваниях [164, 223], особенно когда традиционные методы гибридизации неэффективны. Известно его применение и для увеличения числа поколений за год [155]. В этих работах основная направленность исследований сосредоточена на аспектах подбора питательной среды и режима культивирования для получения взрослых продуктивных растений. Однако не обращалось внимание на самой морфологии и физиологии получаемых через эмбриокультуру растений. Этот аспект особенно важен при вовлечении таких растений в последующие скрещивания, где имеет значение, например, совпадение периода цветения родительских компонентов или их высота. Не был исследован и вопрос влияния возраста культивируемых зародышей на жизнеспособность получаемых из них растений. 243 Нами показано, что и само культивирование зародышей на питательной среде и их возраст в момент выделения из соцветий существенно влияют на морфологические и физиологические особенности образуемых растений. Высота растений как при доращивании зародышей в условиях in vitro, так и при культивировании зародышей более молодого возраста, в большинстве случаев уменьшается по сравнению с растениями, полученными из зрелых семян. При культивировании зародышей на питательной среде укорачивается и период «всходы-цветение», однако возраст зародышей в данном случае существенного значения не имеет. Вместе с тем необходимо учитывать тот факт, что при культивировании in vitro обработанных мутагеном зародышей вышеотмеченные закономерности, как показано в наших экспериментах, могут нарушаться. Также следует отметить, что степень изменения и высоты растений и длительности периода до начала цветения в значительной мере обусловлена генотипом. У некоторых образцов наблюдается даже 5-10-кратное снижение высоты растений по сравнению с полевыми условиями при посеве семенами. В силу отсутствия зависимости между длительностью периода «всходы-цветение» у различных по скороспелости образцов подсолнечника в естественных условиях и длительностью периода от высаживания зародышей на искусственную питательную среду до начала цветения возможно обеспечивать позднеспелых генотипов. одновременное Это особенно цветение важно раннеспелых при и проведении гибридизации между различающимися по длине вегетационного периода образцами. Для подсолнечника одной из проблем является его узкая генетическая база, существенно ограничивающая успешное создание новых сортов и гибридов. Предпринимались различные попытки решения этой проблемы. Прежде всего речь идет об использовании межвидовой и даже межродовой 244 гибридизации, а также индуцированного мутагенеза. Вместе с тем, как показала практика, такие подходы не удовлетворяют полностью запросы селекционеров. Поэтому ведется поиск других подходов, позволяющих увеличить генетическое разнообразие у данной культуры. В их числе рассматривают и биотехнологические методы. Так, метод культуры зародышей, несмотря на то, что он давно известен и широко используется в различных целях, в сочетании с методом индуцированного мутагенеза может стать новой технологией для увеличения разнообразия селекционноценного материала различных культур. Опираясь на то, что на стадии незрелых зародышей экспрессируется иной набор генов, чем на стадии семени, нами исследовано индуцированное химическим мутагеном разнообразие при обработке данным агентом зародышей подсолнечника на разных этапах их развития. Фактором воздействия на зародыши могли бы быть и их обработка ультразвуком, воздействие магнитным полем, а также ряда других физических агентов. Однако данные подходы на подсолнечнике лишь недавно стали разрабатываться, в связи с чем пока не могут рассматриваться в качестве законченных технологий. Наши исследования этилметансульфонатом показали, незрелых зародышей что при спектр обработке мутаций был достаточно широким, а частота мутаций в несколько раз превышала частоту, обнаруживаемую при обработке зрелых семян. В процессе изучения была выявлена интересная закономерность, заключающаяся в зависимости спектра мутаций от определенного возраста зародышей. Например, мутации мужской и женской стерильности наблюдали лишь при действии мутагена на зародыши 14-16-суточного возраста и не выявляли их в случае использования зародышей более молодого возраста. 245 Технология получения мутантных генотипов подсолнечника с использованием индуцированного мутагенеза и культуры незрелых зародышей может быть схематично представлена в следующем виде: - изолирование корзинок подсолнечника исходных образцов индивидуальными изоляторами перед цветением; - выделение незрелых семянок из изолированных соцветий через 9-15 дней после самоопыления; - обработка семянок 0,02 %-ным водным раствором химического мутагена этилметансульфоната (или аналогичного) в течение 16 часов; - стерилизация семянок и выделение из них незрелых зародышей; - высадка зародышей на стерильную питательную среду и их дальнейшее культивирование в стандартных условиях; - высадка полученных из зародышей растеньиц М1 в грунт и их адаптация к естественным условиям; - получение семян из изолированных перед цветением растений М1; - посемейный посев семян, собранных с растений М1, и выделение предполагаемых мутаций в поколении М2; - анализ поколения M3 для проверки наследования выделенных в М2 мутаций. Более полное изложение данной технологии представлено в методических рекомендациях [103]. Такой методический подход оказался эффективным для подсолнечника, у которого были получены образцы с измененными признаками, многие из которых имели хозяйственную ценность. Данный прием, основанный на обработке мутагеном незрелых зародышей с последующим их культивированием in vitro может быть рекомендован и для других культур, у которых имеется необходимость в увеличении генетического разнообразия. Вместе с тем, на основе данного подхода предполагается разработка и других методов. Так, например, представляет 246 интерес исследовать возможность обработки мутагеном зародышей в процессе их культивирования на питательной среде. Малые концентрации действующего вещества и более продолжительная экспозиция могут вызвать ответные реакции в других локусах, не затрагиваемых мутагеном при иных методах воздействия. Вследствие этого подобные специфические условия воздействия на зародыши индуцирующего мутации агента могут привести к формированию и иного спектра наследуемых изменений. 247 ВЫВОДЫ В диссертации на основании проведенных исследований разработаны новые и усовершенствованы существующие биотехнологии, направленные на повышение эффективности селекционного процесса масличных культур, и включающие: совместное использование культуры незрелых зародышей и индуцированного мутагенеза для увеличения генетического разнообразия подсолнечника; выяснение оптимальных условий реализации тотипотентности в культуре пыльников при получении константного материала льна масличного, рапса и горчицы; выявление особенностей эмбриокультуры для ускоренного создания хозяйственно-ценных образцов подсолнечника; удвоенных способы гаплоидов дифференциации рапса, а также гаплоидных растений установления и источника происхождения растений-регенерантов в культуре пыльников различных видов растений. 1. Усовершенствована технология получения удвоенных гаплоидов льна масличного через культуру пыльников (патент на изобретение № 84732). При этом установлено, что фитогормон БАП в концентрации процессы 2-4 мг/л органогенеза. питательную среду регенерированных стимулирует Пересадка приводит структур. в каллусной каллуса к Наилучшее на культуре свежую дедифференциации развитие каллуса наблюдается при концентрации БАП 2 мг/л, а в более высокой концентрации он ингибирует пролиферацию каллуса. Выявлено, что для удлинения побегов льна наиболее эффективной является среда, содержащая фитогормоны БАП, НУК и ГК3 в концентрации 0,5, 0,05 и 0,2 мг/л соответственно, с добавкой аспарагина, глутамина и серина (200, 30 и 100 мг/л соответственно) и витамина В1. Среда на основе МС, содержащая 60-75% макро- и микросолей, 248 1-2% сахарозы и фитогормоны НУК, ИМК или НУК и ИУК в концентрации 1-2, 2 или 1 и 1 мг/л, соответственно, способствует укоренению побегов льна. 2. Показано, что при культивировании in vitro пыльников рапса фитогормон 2,4-Д, по сравнению с БАП, чаще индуцирует образование из микроспор морфогенного каллуса, тогда как БАП – эмбриоидов. Использование одного БАП ингибирует образование каллуса из диплоидных тканей пыльника. С наибольшей частотой новообразования из микроспор формируются при комбинации температурных режимов пред-обработки при 6-8°C и постобработки при 22-25°C и 32°C. 3. Между гаплоидами и удвоенными гаплоидами рапса имеются существенные различия как на цитологическом, так и на морфологическом уровнях, которые детектируются не только прямым, но и косвенными методами. У гаплоидных растений количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и размер самих замыкающих клеток устьиц значительно меньше, а количество устьиц и количество эпидермальных клеток на единицу площади листа – больше, чем у удвоенных гаплоидов. Гаплоиды характеризуются пыльников и, также в меньшими целом, цветка. размерами Выявленные лепестков и особенности представляют основу для идентификации гаплоидов и удвоенных гаплоидов рапса непрямыми методами. 4. Разработан способ доказательства гаплоидной природы растений, полученных в культуре пыльников in vitro. Данный способ основан на анализе наличия или отсутствия расщепления по маркерным признакам в популяции растений-регенерантов (патент на изобретение № 99675). 5. Выявлены различия в каллусообразовании как между 249 генотипами, так и между разными типами эксплантов у подсолнечника, которые наблюдались, в основном, в начальные сроки культивирования. И по частоте каллусообразования, и по степени развития каллуса отмечено преимущество гибрида над его родительскими формами. Показано лучшее развитие каллуса из гипокотилей и семядолей подсолнечника на среде с добавлением фитогормонов БАП и НУК, чем на средах без гормонов или с содержанием других гормонов. Каллус подсолнечника, образовавшийся на гипокотилях, по сравнению с семядолями, дольше сохраняет высокую жизнеспособность на индукционной питательной среде. Как у культурного льна, так и однолетних дикорастущих видов 6. Linum angustifolium Huds., L.grandiflorum Desf., L.hispanicum Mill. и L.pubescens Banks & Solander на первичных эксплантах семядолей, в отличие от гипокотилей каллусообразования происходит и меристем, быстрее. При инициация этом у дикорастущих видов частота каллусообразования различна и значительно меньше, чем у культурного вида. В то же время каллус, полученный из эксплантов апикальных меристем, характеризуется наилучшим развитием. 7. При доращивании незрелых зародышей подсолнечника in vitro, частота полученных из них продуктивных растений варьирует в зависимости от их возраста, причем в случае зародышей двухнедельного возраста она у разных генотипов составляет от 47 до 77%, а однонедельного возраста – около 3%. Зародыши 14суточного возраста, в отличие от 21-суточных, не прорастают через 7 дней культивирования. Однако в дальнейшем частота их прорастания, зародышей. как правило, не отличается от 21-суточных 250 8. Возраст зародышей подсолнечника при их культивировании in vitro влияет на некоторые морфологические и физиологические признаки полученных из них растений. С уменьшением возраста зародышей высота растений уменьшается. Культивирование более молодых зародышей (как и сама культура in vitro) также позволяет сокращать период до начала цветения, что может найти применение для более раннего вовлечения селекционного материала в гибридизацию. 9. Использование в качестве объекта мутагенной обработки незрелых зародышей подсолнечника приводит к значительно более высокой (15,4-39,9%) частоте мутаций в М2, чем при использовании зрелых семян, где наблюдают от 8,7 до 9,6% мутаций. При обработке зрелых семян выявляются лишь 3 типа мутаций, тогда как в случае обработки мутагеном незрелых зародышей – от 7 типов у линии ЗЛ-809 до 9-14 типов у линии ЗЛ95. На основе установленных закономерностей разработан способ увеличения генетического разнообразия подсолнечника с использованием эмбриокультуры и индуцированного мутагенеза (патент на изобретение № 95344). 10. Обработка незрелых зародышей в возрасте 9-11-ти и 14-16-ти суток 0,02%-ным водным раствором этилметансульфоната (ЭМС) в течение 16-ти часов, приводит к их гибели, в зависимости от генотипа и варианта, от 20,6% до 100%. Больше всего мутаген негативно влияет на зародыши более молодого возраста. 11. Культивирование незрелых зародышей подсолнечника in vitro после обработки их мутагеном ЭМС существенно сказывается на ряде количественных признаков у полученных из них растений М1. Это приводит к задержке начала цветения на 15-17 дней, удлинению вегетационного периода на 4-12 дней и существенно 251 влияет на такие показатели как высота растения, диаметр корзинки, количество семян в корзинке. 12. Возраст обрабатываемых мутагеном незрелых зародышей подсолнечника не влияет на частоту мутаций, но в значительной степени изменяет их спектр. Спектр мутаций в М2 является довольно широким и составляет для обеих линий 21 тип, которые представлены наследуемыми изменениями семядольных и настоящих листьев, стебля, соцветия, семян и синтеза хлорофилла. Эти изменения в ряде случаев затрагивают и спектр запасных белков семян. Лишь при использовании зародышей более молодого (9-11-суточного) возраста наблюдается появление оригинальных мутаций дихотомического жилкования, табакоподобных растений, редких типов результатом хлорофильной обработки недостаточности, зародышей тогда 14-16-суточного как возраста является появление мутаций полной стерильности, характерных только для данного варианта. 13. Результатом разработки метода расширения генетической изменчивости с использованием незрелых зародышей и мутагенеза стала передача в Национальный центр генетических ресурсов Украины 7-ми мутантных образцов и 155 образцов в лабораторию селекции межлинейных гибридов подсолнечника ИМК. При изучении особенностей культуры зародышей подсолнечника в сектор генетических ресурсов и интродукции ИМК и лабораторию селекции межлинейных гибридов подсолнечника ИМК были переданы растения дополнительного поколения 6-ти образцов. В результате разработки и усовершенствования способов получения удвоенных гаплоидов льна масличного и рапса через культуру пыльников в лаборатории селекции льна и селекции рапса передано 522 образца. 252 РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Метод обработки химическим мутагеном этилметансульфонатом концентрации 0,02% незрелых зародышей подсолнечника 9-15суточного возраста с экспозицией 16 часов рекомендуется для получения широкого спектра наследуемых морфологических и других изменений с высокой частотой. Выделенные в результате мутагенной обработки незрелых зародышей мутации могут быть использованы в качестве маркерных (хлорофилльная недостаточность листьев и всего растения, окраска семян, количество и окраска краевых цветков и др.) или хозяйственноценных (изменение габитуса, низкорослость, раннее цветение, высокая масличность) признаков. 2. При получении удвоенных гаплоидов льна масличного через культуру пыльников лучшей для каллусообразования является температура 25°C. Температура 6-10°C является эффективной только в случае, когда длительность ее воздействия не превышает 5 суток. С целью индукции гемогенеза из каллусной ткани рекомендуется добавление в питательную среду БАП в концентрации 2 мг/л, а для удлинения регенерированных побегов – использовать в комплексе набор фитогормонов (БАП, НУК и ГК3) и аминокислот (аспарагин, глутамин и серин). Для пыльниковой культуры льна рекомендуется выбирать бутоны толщиной 1,8-2,5 мм и длиной 4-4,5 мм одновременно учитывая, что лепестки должны быть короче пыльников на 1/2-1/4. 3. При получении стабильной каллусной культуры подсолнечника рекомендуется включать в состав питательной среды фитогормоны БАП и НУК, а в качестве эксплантов использовать гипокотили, а не апикальные меристемы или семядоли. У льна 253 масличного рекомендуется в качестве эксплантов использовать как семядоли, так и меристемы, тогда как для однолетних дикорастущих видов льна L.angustifolium Huds. и L.grandiflorum Desf. более предпочтительно использование эксплантов гипокотилей, а для L.hispanicum Mill. и L.pubescens Banks & Solander – семядолей. 4. Получение растений подсолнечника из зародышей, начиная с их однонедельного возраста, рекомендуется использовать для ускорения селекционного процесса за счет увеличения количества дополнительных поколений. Феномен более раннего зацветания растений, полученных через культуру зародышей in vitro, рекомендуется для проведения более ранней гибридизации. 5. Способ, основанный на анализе наличия или отсутствия расщепления по маркерным признакам в популяции растенийрегенерантов, рекомендован для определения их происхождения в культуре пыльников in vitro. 6. Различия в количестве хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, а также в количестве устьиц и эпидермальных клеток на единицу площади листа, которые выявляются между гаплоидами и удвоенными гаплоидами рапса, следует использовать для их идентификации. 254 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авксентьева О.А. Роль генотипа, состава среды и типа экспланта в формировании первичного каллюса изогенных линий пшеницы / О.А. Авксентьева, В.А. Петренко // Вiсник Харкiвського нацiонального унiверситету iм. В.Н. Каразiна. Сер.: Біологія. – 2009. – Т. 856, № 9. – С. 56 – 62. 2. Аладина О.Н. Индуцированный мутагенез в культуре ткани груши / О.Н. Аладина, И.В. Жаркова, И.И. Ханжиян // Докл. ТСХА. – 1997. – № 268. – С. 206–212. 3. Андреев И.О. Генетические эффекты культивирования in vitro тканей кукурузы / И.О. Андреев, Е.В. Спиридонова, Д.Н. Майданюк, В.А. Кунах // Физиология и биохимия культ. растений. – 2009. – Т. 41. – С. 487–495. 4. Анисимова И.Н. Полиморфизм и наследование запасного белка семян у подсолнечника / И.Н. Анисимова, В.А. Гаврилова, А.В. Лоскутов, В.Т. Рожкова, В.В. Толмачев // Генетика. - 2004. – Т 40, № 9. – C. 1215– 1223. 5. Баер Г. А. Сомаклональная вариабельность как источник для создания новых сортов пальчатого проса Eleusine coracana (L.) Gaertn. / Г. А. Баер, А.И. Емец, Н.А. Стадничук, Д.Б. Рахметов, Б. Блюм // Цитология и генетика. - 2007. – Т. 41. – С. 9–14. 6. Баер О.А. Введение в культуру in vitro и регенерационная способность сортов льна–долгунца с различной устойчивостью к полеганию / О.А. Баер, Г.Я. Баер, А.И. Емец, Я.Б Блюм // Физиология и биохимия культ. растений. - 2004. – Т 36, № 1. – C. 48–54. 7. Блаттнер П. Использование Microsoft Excel 2002. / Блаттнер П. – М.: Вильямс, 2002. – 864 c. 255 8. Боровиков В. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков – СПб: Питер, 2001. – 656 с. 9. Бурдасов В.М. О создании солеустойчивых форм древесных растений методами биотехнологии / В.М. Бурдасов, Л.В. Матюнина // Тр. Юж. – Сиб. ботан. сада. - 1997. – С. 54–57. 10. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Бутенко Р. Г. – М.: ФБК–Пресс, 1999. – 160 с. 11. Бучинская А.С. Влияние фитогормонов на каллусогенез и регенерацию в культуре незрелых зародышей подсолнечника : Сб. матер. 4й межд. конф. молод. ученых и спец. / А.С. Бучинская, А.И. Сорока. Краснодар, 2007. - С. 23-25. 12. Бучинська А.С. Калусогенез та регенерація в культурі незрілих зародків соняшнику / А.С.Бучинська, А.І. Сорока // Наук.-техн. бюл. ІОК УААН. - 2006. - № 11. - C. 9-14. 13. Васин В.А. Влияние обработки этилметансульфонатом зрелых и незрелых семян подсолнечника на частоту и спектр мутаций в М2 / В.А. Васин, А.И. Сорока, В.А. Лях // Физиология и биохимия культ. раст., 2006. - Т.38. - № 1. - С.34-44. 14. Волощук С. И. Скрининг in vitro генотипов пшеницы на устойчивость к патогенным грибам. / С.И. Волощук, А.Д. Волощук, В.С. Гирко // Физиол. и биохимия культ. раст. – 1999. – Т. 31. – С. 453–460. 15. Гаврилова В.А. Генетика культурных растений. / В.А. Гаврилова, И.Н. Анисимова – СПб.: ВИР, 2003. – 209 с. 16. Гаврилова В.А. Генетическая изменчивость видов Helianthus L. и возможности ее использовании в селекции: автореф. дис. на соиск. уч. степ. д–ра биол. наук: спец. 03.00.15 «Генетика» / В.А. Гаврилова. – Санкт– Петербург, 2003. – 31 с. 256 17. Генетическая коллекция вида Linum usitatissimum L. (каталог) / В.А. Лях, Л.Ю. Мищенко, И.А. Полякова; под ред. В.А. Ляха. – Запорожье: Институт масличных культур, 2003. – 60 с. 18. Грищенко Е.И. Особенности эмбриогенного развития in vitro пыльцевых зерен Brassica napus / Е.И. Грищенко, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. – 2001. – Т. 5. – C. 65–73. 19. Губанова Н. Клеточная селекция кормовой свеклы на устойчивость к нескольким стрессовым факторам. / Н. Губанова, О.В. Дубровная, Т.В. Чугункова // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18. – С. 227–231. 20. Губанова Н. Отбор и сравнительный анализ устойчивых к солевому стрессу каллюсных культур кормовой свеклы, полученных из эксплантов различной плоидности. / Н. Губанова, О.В. Дубровная, Т.В. Чугункова // Физиология и биохимия культ. растений. – 2000. – Т. 32. С. 362–368. 21. Гулян А.А. Эффективность использования экспериментального мутагенеза в селекции озимой мягкой пшеницы. aвтореф. дис. д–ра биол. наук. / А. А. Гулян. – Ереван, 1999. – 37 с. 22. Давыдова Н.Н. Усовершенствование метода культуры пыльников для использования в селекционном процессе капусты (Brassica oleracea L.) Автореф. дис. канд. с.–х. наук. / Н.Н. Давыдова. – М., 2008. – 25 с. 23. Диас С. Роль физиологических факторов в повышении эффективности регенерации растений из культивируемых тканей кукурузы / С. Диас, И. Долгих // Биотехнология. – 1997. –№ 11–12. – C. 32–36. 24. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) / Доспехов Б.А. – М.: Агропромиздат, 1985. – 5 изд., – 351 c. 257 25. Егорова Е.Г. Создание форм льна–долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе эмбриокультуры. Авт. дис. канд.биол.наук / Е.Г. Егорова. – М., 1999. – 16 с. 26. Егорова Н.А. Биотехнологические методы в селекции эфиромасличных растений. / Н.А. Егорова, Л.А. Бугаенко, И.В. Ставцева // Бюл. Гос. Никит. ботан. сада, 2002. – С. 41–44, 66–67. 27. Ежова Т.А. Генетический контроль тотипотентности растительных клеток в культуре in vitro / Т.А. Ежова // Онтогенез. – 2003. – Т. 34. – С. 245–252. 28. Ємельянова збагачення Л.С. Проблеми біорізноманітності середовища / Л.С. в Ємельянова, збереження, умовах А.И. відновлення антропогенно Сорока, В.А. та зміненого Лях // Каллусообразующая способность некоторых типов эксплантов ряда видов рода Linum. Матеріали міжн. наук. конф. 16–19 травня 2005 p. – Кривий Ріг, 2005. – С. 205–206. 29. Жаркова Т.В. Скрининг различных образцов гороха (Pisum sativum L.) по морфогенетической способности в культуре in vitro / Т.В. Жаркова, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный // Цитология и генетика. – 1998. – Т. 32, № 3. – C. 36–42. 30. Жук И.П. Межвидовое скрещивание томата с использованием культуры эмбриокаллуса / И.П. Жук // Вiсн. аграр. науки. – 1997. – С. 54–55. 31. Жученко А.А. Мировой генофонд льна и основные направления его использования / А.А. Жученко, Т.А. Рожмина // Льняное дело. – 1988. – Т. 2. – C. 9–18. 32. Жученко А.А. Экологическая генетика культурных растений и проблемы агросферы (Tеория и практика) / Жученко А.А. – М.: ООО Изд– во Агрорус, 2004. – Т. 1. – 690 с. 258 33. Зезуль Т.Г. Регенерация in vitro растений подсолнечника (Helianthus annuus L.) через соматический эмбриогенез. / Т. Г. Зезуль, Э. В. Горбатенко, Г. Н. Ралдугина // Генетика. – 1995. Т. 31. С. 228–233. 34. Игнатова С.А. Генотипическая специфичность морфогенетических процессов в культуре соматических тканей кукурузы / С.А. Игнатова, А.А. Белоусов, Л.В. Сидоренко // Цитология и генетика. – 1993. – Т. 27, № 3. – C. 39–44. 35. Игнатова С.А. Клеточные технологии в растениеводстве, генетике и селекции возделываемых растений: задачи, возможности, разработки систем in vitro / С.А. Игнатова // Астропринт. – Одесса, 2011. – 224 с. 36. Какжанова А.А. Биологические особенности гриба Fusarium graminearum sсhwabe и применение его метаболитов в клеточной селекции пшеницы. / А.А. Какжанова, А. П. Наунова // Вестн. КазНУ. Сер. Экол.. – 2003. – №7 – С. 154–157. 37. Калашникова Е. А. Разработка методических подходов в клеточной селекции моркови на устойчивость к альтернариозу / Е.А. Калашникова, Н. Намбудри, В. А. Раскалиева // Изв. ТСХА. – 1998. – №1 – С. 112–119. 38. Каляева М.А. Особенности регенерации льна – долгунца (Linum usitatissimum L.) / М.А. Каляева, Н.С. Захарченко, Я.И. Бурьянов // Биотехнология. – 2000. – Т. № 6. – C. 34–39. 39. Кашин А.С Доращивание незрелых зародышей и получение регенерантов межвидовых гибридов проса in vitro. / А.С. Кашин, М.К. Костючкова, М.П Чернышова,. Н.И. Давоян // С.–х. биол. Сер. Биол. раст.,. – 1999. – Т 2, № 4. – С. 63–67. 40. Кириченко В.В. Селекция и семеноводство подсолнечника (Helianthus annus L.) / В.В. Кириченко // Монография. – Харьков, 2005. – 387 с. 259 41. Клеточная селекция на устойчивость к кольцевой гнили картофеля: оптимизация оценки устойчивости сомаклональных линий картофеля к кольцевой гнили / [Рассадина Г.В., Хромова Л.М., Бутенко Р.Г., Иванова Н.Г.] – Биол. культивир. клеток и биотехнол. растений, Р.Г. Бутенко. Ин–т физиол. раст. – М.: АН СССР, 1991. – С. 133–137. 42. Кляченко О. Л. Селекция in vitro на устойчивость клеточных линий сахарной свеклы к низким температурам, / О. Л. Кляченко В. Лобко // 2 Конференция Московского общества генетиков и селекционеров им. Вавилова, посвященная 115–летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова, Москва, 2003. – С 136–137. 43. Котлярова Е.Б. Аспекты применения методов биотехнологии в селекции ярового рапса (Brassica napus L.). Автореф. дис. на соиск. научн. степени канд. биол. наук. / Е.Б. Котлярова. – Рамонь, 2007. – 24 с. 44. Котлярова О.В. Усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови (Daucus carota L.). Автореф. дис. канд. с.–х. наук / О.В. Котлярова. – М., 2010. – 26 с. 45. Кунах В.А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого–біохімічні основи / В.А. Кунах– К.: Логос, 2005. – 730 с. 46. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 3. Каллусообразование in vitro / Кунах. В.А. // Биополимеры и клетка. – 1997. – Т. 13, № 5. – C. 362–371. 47. Локоть О. Агробіологічні та біоенергетичні аспекти оптимізації технологій вирощування льну–довгунця. / О. Локоть – Ніжин: Аспект– Поліграф, 2009. – 380 с. 48. Лукаткин А.С. Использование каллусных культур огурца для изучения холодового повреждения. / А.С. Лукаткин // Изв. РАН. Сер. биол. – 1999. – № 3. – С. 304–308. 260 49. Лях В.А. Ботанические и цитогенетические особенности видов рода Linum L. и биотехнологические пути работы с ними. / В.А. Лях, А.И. Сорока // Монография. – Запорожье: ЗНУ, 2008. – 182 с. 50. Лях В.А. Изучение количества хромосом в меристеме листьев различных генотипов льна / В.А. Лях, В.В. Стрельникова, А.И. Сорока // Наук.-тех. бюл. ІОК УААН. – 2001. – Вип. 6. – С. 11-14. 51. Лях В.А. Индуцированный мутагенез масличных культур. / В.А. Лях, И.А. Полякова, А.И. Сорока // Монография. – Запорожье: ЗНУ., 2009. – 266 с. 52. Мазур А.Л. Определение сублетальных концентраций фильтрата Fusarium graminearum Shwabe для получения устойчивых форм мягкой пшеницы в культуре in vitro / А.Л. Мазур, С.А. Игнатова // Фактори експерементальної еволюції організмів. – Київ: Логос, 2006. – С. 484-489. 53. Масленников С. Е. Методы культуры каллусов и клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу / С. Е. Масленников // Моск. с.–х. акад. им. К.А. Тимирязева. – М.: ТСХА, 1994. – С. 15. 54. Мельничук М.Д. Біотехнологія рослин / Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. – Київ: ПоліграфКонсалтинг, 2003. – 520 c. 55. Мепаришвили Г.В. Использование сомаклональной изменчивости в создании форм пшеницы, устойчивых к фузариозу / Мепаришвили Г.В. – Большие Вяземы: ВНИИ фитопатол., [Автореф. дисс. канд. биол. наук. Специальность 06.01.11 Защита растений] . – М.: 2003. – С. 20. 56. Метод культуры незрелых зародышей в увеличении разнообразия Rosa hybrida L. / Маркова И.В., Брель Н.Г., Ленец А.А., Грибик О. // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений, Харьков, 2001: Сборник тезисов межд. конф. молодых ученых – И–т растениеводства им. В.Я. Юрьева УААН, 2001. – С. 39–40. 261 57. Методы отбора ценных генотипов на уровне пыльцы. (Методические рекомендации). / [Лях В.А., Сорока А.И., Мищенко Л.Ю., Калинова М.Г., Мирошниченко Е.Н.] – Запорожье: ИМК, 2000. – 48 с. 58. Михалевич морфологические О.Г. Влияние характеристики возраста полученных зародышей из них на растений подсолнечника / О.Г. Михалевич, А.И. Сорока // Зб. матер. Міжн. конф. „Сучасні проблеми біології, екології та хімії”. Част.2. Запоріжжя, 2007. – С.507-509. 59. Моргун В.В. Мутационная селекция пшеницы / В.В. Моргун, В.Ф. Логвиненко. – Киев: Наукова думка, 1995. – 628 c. 60. Ницше В. Гаплоиды в селекции растений / В. Ницше, Г. Венцель // – М.: Колос, 1980.– 128 c. 61. Патент 2095971 РФ. Способ получения наследственно измененных форм пшеницы / Тучин С.В., Итальянская Ю.В.; заявитель и патентообладатель Научно–исследовательский институт сельского хозяйства Юго–Востока Научно–производственного объединения "Элита Поволжья" – 95112871/13. заяв. 20.07.1995, опубл. 20.11.1997, Бюл. № 32. 62. Патент 2120741 РФ A01H4/00. Питательная среда для культивирования пыльников льна / Поляков А.В., Пролетова Н.В.; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно–исследовательский институт льна – № 96112871/13; заяв. 27.06.1996; опубл. 27.10.1998, Бюл. № 30. 63. Патент 2146865 RU. Способ оценки растений in vitro к абиотическим факторам внешней среды / Россеев В.М.; Сибирское научно– производственное объединение "Колос". – № заявки 92002021/13; заявл. 10.26.1992. опубл. 27.03.2000. 64. Патент 2229219 RU A01H4/00, C12N5/00, A01H1/04. Способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных 262 сомаклонов / Барсукова Е.Н., Фисенко П.П., Моисеенко Л.М.; заявл. 04.04.2002; опубл. 27.05.2004. 65. Патент 2478282 RU A01H1/04. Способ получения регенерантов льна-долгунца, устойчивых к антракнозу, методами in vitro / Виноградова Е.Г., Пролётова Н.В., Кудрявцева Л.П.; опубл. 27.10.2012. 66. Патент 95344 Україна МПК A01H 1/06. Спосіб отримання мутантних генотипів соняшника / Сорока А.І., Лях В.О.; заявник та патентовласник Інститут олійних культур, Сорока А.І., Лях В.О. – № a200910096; заявл. 05.10.2009; опубл. 25.07.2011; Бюл. № 14. 67. Патент 84732 Україна МПК A01H 04/00. Спосіб отримання дигаплоїдних рослин льону / Сорока А.І.; заявник та патентовласник Інститут олійних культур, Сорока А.І. – № a200608565; заявл. 31.07.2006; опубл. 11.02.08, Бюл. № 3. 68. Патент 99675 Україна МПК A01H 4/00, A01H 1/00. Спосіб прогнозування плоїдності рослин у культурі in vitro / Лях В.О., Сорока А.І.; заявник та патентовласник Запорізький національний університет – № a201105731; заявл. 06.05.2011; опубл. 27.02.12, Бюл. № 4. 69. Патент РФ. Способ получения межвидовых гибридов томата / Уралец М.И., Грати М.И., Андрющенко В.К.; заявл. 1993/11/9; опубл. 1996. 70. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева; М.: Агропромиздат, 1988. - 271 c. 71. Петренкова В.П. Наукове обгрунтування захисту соняшнику від некротрофних патогенів на сході Лісостепу України : Автореф. дис. д–ра с.– г. наук: 06.01.11. Нац. аграр. ун–т. / В.П. Петренкова. – К., 1999. – 33 с. 72. Поляков А.В. Сомаклональная изменчивость у льна (Linum usitatissimum L.). Тез. докл. VII Межд. конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» / А.В. Поляков, И. Рутковска–Краусе – М.: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, центр 'Биоинженерия", 1997. – С. 225–226. 263 73. Поляков А.В. Усовершенствование селекционного процесса льна– долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе использования биотехнологических методов. Авт. дис. докт.биол.наук / А.В. Поляков. – Москва, 1998. – С. 50. 74. Попов культурного В.Н. Генотипические подсолнечника с особенности дикими видами скрещиваемости и использование эмбриокультуры при отдаленной гибридизации / В.Н. Попов, Л.Л. Юшкина, Шарипина, В.В. Кириченко // Цитология и генетика. – 2005. – Т. 39, № 1. – C. 3–9. 75. Пустовойт В.С. Подсолнечник. – Под ред. В.С. Пустовойта. – М.: Колос. 1975. – 592 с. 76. Пушкаренко А.Я. Культура незрелых зародышей подсолнечника in vitro / А.Я. Пушкаренко, С.А. Игнатова, С.Ф. Лукьянюк // Сборник научных трудов ВСГИ. – 1988. – C. 72–77. 77. Решетников В.Н. Биотехнология растений и перспективы ее развития / В.Н. Решетников, Е.В Спиридович, А.М. Носов // Физиология раст. и генетика, 2014. - Т.46. - № 1. - С.3-18. 78. Роик Н.В. Окраска корнеплодов в апозиготических потомствах сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / Н.В. Роик, Н.С. Ковальчук, О.А. Яцева С.И. Малецкий // Сахарная свекла, 2010. – № 12. – С. 10–13. 79. Рожанская О.А. Количественная изменчивость в популяциях сомаклонов культурных растений / О.А. Рожанская // Ботанические исследования в азиатской России, Т. 3, Материалы 11 Съезда Русского ботанического общества. Барнаул, 2003. – С. 105–107. 80. Рожанская О.А. Сомаклональные вариации количественных признаков ярового рапса / О.А. Рожанская, Н.Г. Клеблеева, А.Ю. Кравченко // Докл. Рос. акад. с.–х. наук. – 1999. С. 17–18. 81. Россеев В.М. Оценка селекционного материала зерновых культур in vitro на устойчивость к неблагоприятным абиотическим факторам среды 264 / В. М. Россеев // Методы комплекс. оценки продуктив. и устойчивости с.–х. раст.: науч.–метод. совещ., 15–17 нояб. 1994 г.: тезисы докл. – Моск. обл., пос. Немчиновка, 1994. – С. 44–45. 82. Русина Л.В. Использование метода культуры изолированных зародышей для получения межвидовых гибридов / Л.В. Русина, А.М. Бугара, Л.А.Бугаенко // Физиол. и биохимия культ. раст. – 1997. – Т. 29, № 2. – C. 121–128. 83. Сатарова Т.Н. Кукуруза: биотехнологические и селекционные аспекты / Т.Н. Сатарова, В.Ю. Черчель, А.В. Черенков // Днепропетровск: Новая идеология, 2013. – 552 с. 84. Сельскохозяйственная биотехнология / [Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. и др.]; под. ред. В.С. Шевелухи. – [3–е изд.]. – М.: Высш. шк., 2008. – 710 с. 85. Сергеева Л.Е. Отбор и изучение клеточных линий табака, устойчивых к ванадию. / Сергеева Л.Е. // Физиол. и биохим. культ. растений. – 2000. – Т. 32. – С. 369–371. 86. Соловых Н.В. Отбор устойчивых к культуральному фильтрату гриба Phytophthora cactorum (Leb. et Cohn) Schroet каллусов яблони с использованием селективных сред / Н.В. Соловых, Л.А. Ищенко, В.М. Тюленев, И.Н. Чеснокова // Бюл. науч. инф. ВНИИ генет. и селекции плод. раст., 1998. – № 6 – С. 9–14, 51. 87. Сорока А. И. Влияние состава среды на процессы каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников льна / Сорока А.И. // Цитология и генетика, 2004. – № 2. – C. 20–24. 88. Сорока А. И. Влияние типа экспланта и генотипа на образование каллуса у подсолнечника / А.И. Сорока // Вісник ЗДУ, Фіз.–мат., біол. науки. – 2003. – № 1. – С. 191–194. 89. Сорока А.И. Влияние возраста незрелых зародышей на частоту их прорастания и выход жизнеспособных растений у подсолнечника / А.И 265 Сорока // Наук.–техн. бюл. Інституту олійних культур НААН. – 2005. – № 10. – C. 29-33. 90. Сорока А.И. Влияние возраста незрелых зародышей подсолнечника на выход жизнеспособных растений и некоторые их характеристики / Сорока А.И. // Вісник Запорізького національного університету. Біологічні науки. – 2008. – № 2. – C. 185–188. 91. Сорока А.И. Влияние обработки этилметансульфонатом зрелых и незрелых семян подсолнечника на частоту и спектр мутацій в М2 / А.И. Сорока, В.А. Лях // Физиология и биохимия культурних растений. – 2006. – Т. 38, №1. – C. 34–44. 92. Сорока А.И. Влияние питательной среды на рост каллуса подсолнечника линии ЗЛ-22А / А.И. Сорока, В.В Стрельникова, А.С. Бучинская // Наук.-тех. бюл. ІОК УААН. - 2003. – № 8 - С. 74-78. 93. Сорока А.И. Влияние состава питательной среды на регенерацию побегов из каллуса пыльников льна масличного / А.И. Сорока // Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. – 2006. – Т.4. – № 1. – С.84-88. 94. Сорока А.И. Индуцированная изменчивость в М2 при действии мутагенного фактора на зародыши разного возраста у подсолнечника / Сорока А.И. // Геном рослин: Зб. наук. статей V Міжн. конф. / Півд. біотехн. центр в росл. Одеса, 2008. – С. 124–126. 95. Сорока А.И. Индуцированный мутагенез в культуре незрелых зародышей подсолнечника как путь расширения его генетической изменчивости / Сорока А.И // тез. Современная биотехнология сельскохозяйственных растений и биобезопасность (Геном растений VI), Одеса, Інститут виноградарства і виробництва ім. В.Є. Таїрова. – 2010. – Т. 6. – С. 58. 96. Сорока А.И. Использование культуры незрелых зародышей для получения дополнительных поколений у подсолнечника / Сорока А.И // Межд. науч.–практ. конф. "Современные проблемы научного обеспечения 266 производства подсолнечника", Краснодар, Россия, 2006: Сб. докл. – ВНИИМК, Краснодар, 19–22 июля, 2006. – С. 159–161. 97. Сорока А.И. Использование метода культуры зародышей в селекции подсолнечника / Сорока А.И // Наук.–техн. бюл. ІОК УААН, Запоріжжя. – 2000. – Т. 5. – C. 28–31. 98. Сорока А.И. Каллусообразование в культуре пыльников льна / А.И. Сорока // Наук.-тех. бюл. ІОК УААН. – 2001. – Вип. 6. – С. 32-36. 99. Сорока А.И. Каллюсообразование у некоторых однолетних видов льна / Сорока А. И. // Физиология и биохимия культурных растений. – 2005. – Т. 37. – С. 413–421. 100. Сорока А.И. Наследование жилкования листьев у подсолнечника культурного / А.И. Сорока // Вісник Донецького нац. утету, Сер. А. Природничі науки. – 2012. –№ 1. – С. 196–199. 101. Сорока А.И. Органогенез в культуре каллуса из пыльников льна на различных питательных средах / А.И. Сорока // Наук.-тех. бюл. ІОК УААН. – 2002. – Вип. 7. – С. 45-49. 102. Сорока А.И. Особенности растений озимого рапса разных типов плоидности, полученных через культуру пыльников / А.И Сорока // Науково–технічний бюлетень Інституту олійних культур НААН. – 2010. – № 15. – C. 16–20. 103. Сорока А.И. Получение мутантных генотипов подсолнечника c использованием культуры зародышей / Сорока А.И // Методические рекомендации. – Запорожье: Институт масличных культур НААН, 2011. – 16с. 104. Сорока А.И. Получение удвоенных гаплоидов у льна масличного через культуру пыльников / Сорока А.И // Методические указания. – Запорожье: ИМК, 2007. – 27 c. 105. Сорока А.И. Характеристика гаплоидных и дигаплоидных растений озимого рапса, полученных через культуру пыльников / Сорока 267 А.И // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: зб. наук. пр. – К.: Логос, 2012. – С. 606–608. 106. Талат М.М. Использование эмбриокультуры in vitro при межвидовой гибридизации. / М.М. Талат, А. В. Калинин, И. Ф. Лапочкина // Бюл. Гл. ботан. сада РАН., 1997. – С. 127–132. 107. Тихонов О.И. Биология, селекция и возделывание подсолнечника / Тихонов О.И., Бочкарев Н.И., Дьяков А.Б. : Под. ред. В.М. Пенчуков, акад. ВАСХНИЛ. – М.: ВО "Агропромиздат", 1991. – 281 c. 108. Ульянов А.Н. Каллусообразование у двух генотипов подсолнечника / А. Н. Ульянов // Науч.–техн. бюл. ВНИИ масл.культур. – 1990. – Т 2, № 109. – С. 8–10. 109. Фардзинова И.М. Получение и размножение интрогрессивных гибридов рода Cerasus Mill. методом культуры зародышей / И.М Фардзинова. Всесоюзн. научн. конф. по с.–х. биотехнологии. – Целиноград, 1991 – С. 87–88. 110. Федоренко Т.С. Цитология каллусогенеза пыльников подсолнечника в культуре in vitro / Т. С. Федоренко, Н. И. Никитина // Научно–техн. бюл. ВНИИМК. – 1983. – № 82. – C. 17–22. 111. Хадеева Н.В. Выделение солеустойчивых форм риса путем прямой и непрямой селекции в культуре тканей. / Н.В. Хадеева, И.Л. Дридзе, А.Н. Майсурян // Биотехнология, 2000. – № 3– С. 27–37. 112. Хай Н.Т. Получение in vitro клеточных и тканевых культур подсолнечника (Helianthus annus L.), устойчивых к Sclerotinia sclerotiorum: автореф. дис. на соиск. науч. степени канд. биол. наук: спец. 03.00.23 „Биотехнология” / Хай Н.Т. – Москва, 2008. – 28с. 113. Хохлов С.С. Гаплоидия и селекция / Хохлов С. С., Тырнов В. С., Гришина Е.В.и др – М.: Наука, 1976. – С. 221. 114. Чалык С.Т. Методы гаплоидии в генетике и селекции кукурузы / Чалык С.Т. – Кишинев: Центр ГАУМ, 2003. – C.179. 268 115. Чеченева Т. Н. Индукция каллуса у зрелых зародышей кукурузы / Т. Н. Чеченева, Л. В. Лучко, М. Дыкун // Биополимеры и клетка. – 1999. – Т. 15. – С. 237–240. 116. Чеченева Т.Н. Влияние химических мутагенов и гамма– облучения на культуру in vitro инбредных линий кукурузы / Т. Н. Чеченева, Е. А. Ларченко // Цитол. и генет. – 1997. – Т. 31. – С. 65–71. 117. Чеченева Т.Н. Генетическая обусловленность каллусообразования и регенерационной способности у кукурузы / Т. Н. Чеченева, В. А. Труханов // Цитология и генетика. – 1984. – Т. 28. – С. 46– 50. 118. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор / Шамина З.Б. : Культура клеток растений [Под ред. Р.Г. Бутенко.] – М.: Наука, 1981. – С. 124–135. 119. Шуплецова О. Н. Совершенствование и применение метода культуры ткани для получения форм ярового ячменя, устойчивых к кислым почвам. / О.Н. Шуплецова – М: Моск. с.–х. акад, 2003. – 23c. 120. Abraha E. Analysis of factors affecting embryogenesis in microspore cultures of Brassica carinata / E.Abraha, M.Bechyne, M.Klima, M.Vyvadilova // Agricultura Tropica Et Subtropica. – 2008. – Vol. 41. – P. 53– 60. 121. Abraham A. Growing Colocasia embryos in culture / A. Abraham, K. Ramachandran // Curr. Sci. - 1960. - Vol. 29. - P. 342-343. 122. Achar P.N. A study of factors affecting embryo yields from anther culture of cabbage / P.N. Achar // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. – 2002. – Vol.69, № 2. – P. 183–188. 123. Afiah S.A. Somaclonal variation in bread wheat (Triticum aestivum L.) 4–RAPD, Finger printing of elite genotypes under Siwa Oasis conditions : African Crop Science Conference Proceedings / S.A. Afiah, K.Z. Ahmed, K.A. Soliman. – El-Minia, Egypt, 2007. - Vol. 8. - P. 2039-2045. 269 124. Ahloowalia B.S. Global impact of mutation–derived varieties / B.S. Ahloowalia, М. Maluszynski // Euphytica. – 2004. – Vol. 135. – P. 187–204. 125. Alam M.A. Haploid plantlet regeneration through anther culture in oilseed Brassica species / M.A. Alam, M.A. Haque, M.R. Hossain, S.C. Sarker, R. Afroz // Bangladesh Journal of Agricultural Research. – 2009. - Vol. 34, №4. P. 693-703. 126. Albany N.R. Comparative study of morphological parameters of Grand Nain banana (Musa AAA) after in vitro multiplication with growth retardants / N. R. Albany, J. A. Vilchez, L. Garcia, E. Jimenez // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2005. – Vol. 83. – P. 357–361. 127. Albrecht S. Selection in vitro for erucic–acid content in segregating populations of microspore derived embryoids of Brassica napus / S. Albrecht, C. Mollers, G. Robbelen // Plant Breed. – 1995. – Vol. 114, № 3. – P. 210–214. 128. Anjum M.A. Selection of hydroxyproline–resistant cell lines from Solanum tuberosum L. callus. Plant regeneration and frost tolerance of regenerated plans / M. A. Anjum // Acta biotechnol. – 1998. – Vol. 18. – P. 361– 366. 129. Antonova T.S. Somatic embryogenesis in callus from cotyledons of immature sunflower embryos / T.S. Antonova, S.F. Krasnyanskii, T.A. Chelyustnikova, T.G. Zezul. // Sov–Agric–Sci. New York. – 1991. – Vol 1. – P. 9–13. 130. Asif M. Progress and Opportunities of Doubled Haploid Production / M. Asif – Springer International Publishing, 2013. – 75 p. 131. Asif M.J. In vitro zygotic embryo culture of wild Musa acuminata ssp.malaccensis and factors affecting germination and seedling growth / M.J. Asif, C.Mak, R.Y. Othman // Plant Cell Tissue and Organ Culture, - 2001. - Vol. 67, № 3. – Р. 267-270. 270 132. Aslam F.N. Rapid cycling Brassica species : in breeding and selection of B. campestris for anther culture. / F.N. Aslam, M.V. Mac Donald, P. Loudon, D.S. Ingrain, // Annal. of Bot. – 1990 . – Vol. 65 (5). P. 557–566. 133. Assani А. Production of haploids from anther culture of banana [Musa balbisiana (BB)] / А. Assani, F. Bakry, F. Kerbellec. R. Haicour, G. Wenzel, B. Foroughi-Wehr // Plant Cell Rep. - 2003. - Vol. 21. – Р. 511–516. 134. Babbar S.B. Isolated microspore culture of Brassica: An experimental tool for developmental studies and crop improvement / S.B. Babbar, P.K.Agarwal, S.Sahay, S.S.Bhojwani // Indian Journal of Biotechnology. – 2004. – Vol. 3(2). – P. 185–202. 135. Bagheri N. Combining Ability and Heritability of Callus Induction and Green–Plant Regeneration in Rice Anther Culture / N. Bagheri, N.B. Jelodar // Biotechnology. – 2008. – Vol. 7. – P. 287–292. 136. Baohong Z. Selection of NaCl tolerant embryogenic cell line and plant regeneration of cotton in vitro / Z. Baohong // Abstr. 11th 7–11 Sept., Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Varna, 1998. 137. Barakat M.N. An assessment of the cultural capabilities of protoplasts of some wild species of Linum / M.N. Barakat, E.C Cocking // Plant Cell Repts. – 1985. – Vol. 4. – P. 164–167. 138. Barro F. Doubled haploid lines of Brassica carinata with modified erucic acid content through mutagenesis by EMS treatment of isolated microspores. / F. Barro, J. Fernandez–Escobar, M. De La Vega, A. Martin // Plant Breeding. – 2001. – Vol. 120. – P. 262–264. 139. Basiran N. Genetic transformation of flax (Linum usitatissimum L.) by Agrobacterium tumefaciens. Regeneration of transformed shoots via callus phase / N. Basiran, P. Armitage, R. Scott, J. Draper // Plant Cell Repts. – 1987. – Vol. 6. – P. 396–399. 271 140. Begum M.K. Production of somaclone in vitro for drought stress tolerant plantlet selection in sugarcane (Saccharum officinarum L.) / M.K. Begum, M.O. Islam M.A.S. Miah, M.A. Hossain, N. Islam // The Agriculturists. – 2011 - Vol. 9. - Issue 1-2. - P. 18–28. 141. Bennett M.D. Additional mitosis in wheat pollen induced by entherel. / M.D. Bennett, V.G. Hughes // Nature. – 1972. – Vol. 240. N 5383. – P. 566–568. 142. Benvenuti A. Preliminary studies of embryogenesis in a few interspecific hybrids of Helianthus genus / A. Benvenuti, G.P. Vannozzi, P. Megale, M. Bardini // Ann.Bot. - 1990. – V. 48. - P. 63-69. 143. Berglund D.R. Flax: New uses and demands / D.R. Berglund // Trends in new crops and new uses. J. Janick and A. Whipkey (eds.). - ASHS Press, Alexandria, VA, 2002.- P. 358–360. 144. Bergmann R.W. Haploidy and related biotechnological methods in linseed (Linum usitatissimum L.) / R. Bergmann, W. Friedt // In vitro haploid production in higher plants / Eds. J.S. Mohan; Sopory, S.K.; Veilleux, R. – Dordrecht/Boston/London: Kluwer Acad. Publ. – 1997. – Vol. 5. – P. 1–16. 145. Bertin P. Use of somaclonal variation and in vitro selection for chilling tolerance improvement in rice / P. Bertin, J. Bouharmont // Euphytica, 1997. – Vol. 96. – P. 135–142. 146. Binzel M.L. Induction of direct somatic embryogenesis and plant regeneration in pepper (Capsicum annuum L.) / M. L. Binzel, N. Sankhla, S. Joshi, D. Sankhla // Plant Cell Reports. – 1996. – Vol. 15. – P. 536–540. 147. Blakeslee A.F. A haploid mutant in the Jimson weed, Datura stramonium / A.F. Blakeslee, J. Belling, M.E. Farhnam, Bergner A.D. // Science. – 1922. – Vol. 55. – P. 646–647. 148. Bouman H. Measurement of the extent of somaclonal variation in begonia plants regenerated under various conditions. Comparison of three assays 272 / H. Bouman, G.–J. De Klerk, // Theoretical and Applied Genetics. – 2001. – Vol. 102. – P. 111–117. 149. Boutilier K. Ectopic Expression of BABY BOOM Triggers a Conversion from Vegetative to Embryonic Growth / K. Boutilier, R. Offringa, V.K. Sharma, H. Kieft, T. Ouellet, L. Zhang, J. Hattori, Liu C.–M., A.A.M.v.Lammeren, B.L.A.Miki, J.B.M.Custers, M.M.v.L. Campagne // The Plant Cell. – 2002. – Vol. 14. – P. 1737–1749. 150. Brisibe E.A. Cytodifferentiation and transformation of embryogenic callus lines derived from anther culture of wheat / E.A. Brisibe, A. Gajdosova, A. Olesen, S.B. Andersen // Journal of Experimental Botany. – 2000. Vol. 51, No. 343. – P. 187–196. 151. Brown J. Intergeneric hybridization between Sinapis alba and Brassica napus / J. Brown, A. Brown, J.B. Davis, D. Erickson // Euphytica. – 1997. – Vol. 93, № 2. – P. 163–168. 152. Burbulis N. Genotypic and exogenous factors affecting linseed (Linum usitatissimum L.) anther culture/ N. Burbulis, A. Blinstrubiene // J. Food, Agriculture and Environment. – 2011. – Vol. 9, Nr. 3–4. – P. 364–367. 153. Cardoza V. Brassica biotechnology: progress in cellular and molecular biology / V. Cardoza, C.N.J. Stewart // In vitro Cell. Dev. Biol.— Plant. – 2004. – Vol. 40. – P. 542–551. 154. Catarina C.S. Repetitive Somatic Embryogenesis of Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae): Effect of Somatic Embryo Developmental Stage and Dehydration / C.S. Catarina, A.d.S. Olmedo, G.d.A. Meyer, J. Macedo, W. Amorim, A.M. Viana // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2004. – Vol. 78. № 1. – P. 51–53. 155. Cecconi F. Embryo rescue in Sunflower (Helianthus annuus L.) a simple method to obtain more generations per year / F. Cecconi, M. Baldini, M. Turi, G.P. Vannozzi // Proc. 14th International Sunflower Conference, 273 Beijing/Shenyang, China, June 12–20, 1996. – China, 1996. – Vol. 1. – P. 1075– 1081. 156. Cecconi F. The sunflower dwarf mutant dwl: effects of gibberellic acid treatment / F. Cecconi, M. Gaetani, C. Lenzi, M. Durante // Helia. – 2002. – Vol.25, № 36. – P.161–166. 157. Chandler J.M. Embryo culture of Helianthus hybrids / J.M. Chandler, B.H. Beard // Crop Sci. – 1983. – Vol. 23 – P. 1004–1008. 158. Chandler P.M. Gibberellin doze – response curves and the characterization of dwarf mutants of barley / P.M. Chandler, M. Robertson // Plant Phisiol. – 1999. – Vol. 120. – P.623–632. 159. Charne D.G. Improving microspore culture as a rapeseed breeding tool: the use of auxins and cytokinins in an induction medium / D.G. Charne, W.D. Beversdorf // Can.J.Bot. – 1988. – Vol. 66. № 8. – P. 1671–1675. 160. Chawla H.S. Introduction to Plant Biotechnology / Chawla H.S. – Science Publishers, 2002. – 538 p. 161. Chen Y. Effect of genotype and medium composition on flax Linum usitatissimum L. anther culture / Y. Chen, P. Dribnenki // Plant Cell Repts. – 2002. – Vol. 21, № 3. – P. 204–207. 162. Chen Y. Plant regeneration from anther culture in Canadian cultivars of flax (Linum usitatissimum L.) / Y. Chen, E.O. Kenaschuk, J.D. Procunier // Euphytica. – 1998. – Vol. 102, № 2. – P. 183–189. 163. Chen Y. Response of flax genotypes to doubled haploid production / Y. Chen, E. Kenaschuk, P. Dribnenki // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1999. – Vol. 57, № 3. – P. 195–198. 164. Christov M. Development of fertiliry restorer lines originating from interspecific hybrids of genus Helianthus / M. Christov, P. Shindrova, V. Encheva // Helia. – 1996. – Vol. 19, № 24. – P. 65–72. 274 165. Chu C.C. The N6 medium and its applications to anther culture of cereal crops / C.C. Chu // Proc. Symp. on Plant Tissue Culture. Science Press, Beijing, China, 1978. – P.43–50. 166. Clarke H.J. Embryo rescue and plant regeneration in vitro of selfed chickpea (Cicer arietinum L.) and its wild annual relatives / H.J. Clarke, J.G. Wilson, I. Kuo, M.M. Lulsdorf // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2006. – Vol.85, № 2. – P. 197–204. 167. Coello C.Y. Plant growth regulators optimization for in vitro cultivation of the orchid Guarianthe skinneri (Bateman) / C. Y. Coello, C. L.Miceli, C. Orantes, L. DenDooven, F.A. Gutiérrez // Dressier & W.E.Higgins. Gayana Bot. – 2010. – Vol. 67, № 1. – P.19–26. 168. Custers J.B.M. Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.). / J.B.M. Custers // Doubled haploid production in crop plants / eds. M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster and I. Szarejko.: Kluver Academic Publisher. – 2003. – Vol. 3. – P. 185–194. 169. Custers J.B.M. Temperature controls both gametophytic and sporophytic development in microspore cultures of Brassica napus / J.B.M. Custers, J.H.G. Cordewener, Y. Noellen, H.J.M. Dons, M.M van Lookeren Champagne. // Plant Cell Rep. – 1994. – Vol. 13. – P. 267–271. 170. Dagustu N. Regeneration of fertile plants from sunflower (Helianthus annuus L.): Immature embryo / N. Dagustu, M. Sincik, G. Bayram, M. Bayraktaroglu // Helia. – 2010. – Vol. 33, Nr. 52. – P. 95–102. 171. Dagustu N. The short breeding cycle protocol effective on diverse genotypes of sunflover (Helianthus annuus L.) / N. Dagustu, G. Bayram, M. Sincik, M. Bayrataroglu // Turkish Journal of Field Crops. – 2012. – Vol. 17, № 2. – Р. 124-128. 172. Dal Corso G. In vitro plant regeneration of the heavy metal tolerant and hyperaccumulator Arabidopsis halleri (Brassicaceae) / G. Dal Corso, L. 275 Borgato, A. Furini, // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2005. – Vol. 82. – P. 267–270. 173. Dolcet-Sanjuan R. Carnation (Dianthus caryophyllus L.) dihaploid lines resistant to Fusarium oxysporum f.sp. dianthi / R. Dolcet-Sanjuan, E. Claveria, L. Laurado, A. Ortigosa, P. Arus // Acta Horticulturae. - 2001.- Vol. 560. - P. 141-144. 174. Dore C. In situ gynogenetic haploid plants of chicory (Cichorium intybus L.) after intergeneric hybridization with Cicerbita alpina Walbr / C. Dore, J. Prigent, B. Desprez // Plant Cell Repts. – 1996. – Vol. 15, № 10. – P. 758– 761. 175. Doubled haploid production in crop plants: a manual / [Eds. M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster and I. Szarejko]. – Netherlands: Kluwer Academic Pub. Dordrecht, 2003. – 428 p. 176. Dunwell J.M. Influence of genotype, plant growth temperature and anther incubation temperature on microspore embryo production in Brassica napus ssp. oleifera / J.M. Dunwell, M. Cornish, A.G.L.D. Courcell // J.Exp.Bot. – 1985. – Vol.36, № 165. – P. 679–689. 177. Ekiert H. Medicinal plant biotechnology: the Apiaceae family as the example of rapid development / H. Ekiert // Pharmazie. – 2000. – Vol. 55, № 8. – P. 561–567. 178. Elbern B. Antherenkultur und Regeneration haploider Pflanzen von Mohn (Papaver somniferum) / B. Elbern // Landbauforsch. Volkenrode. – 1984. – Vol. 4, №1. – P 63–66. 179. Encheva J. Field evaluation of somaclonal variation in sunflower (Helianthus annuus L.) and its application for crop improvement /J. Encheva, H. Kohler, W. Friedt, F. Tsvetkova, P. Ivanov, V. Encheva, P. Shindrova // Euphytica. – 2003. - Vol. 130. - Р. 167-175. 180. Encheva J. New sunflower restorer lines developed by direct organogenesis method from interspecific cross Helianthus annuus L. (cv. 276 Albena) × Helianthus salicifolius L.: Disease resistance, combining ability / J. Encheva, M. Christov, P. Shindrova, M. Drumeva, V. Encheva // Helia. – 2006. – Vol. 29, Nr. 45. – P. 95–106. 181. En–rang Z. Изучение in vitro отбора солевыносливых каллусов чеснока / Z. En–rang, C. Zhi–hui // Xibei zhiwu xuebao – Acta Bot. Boreali– Occident. Sin. – 2003. – Vol. 23. – P. 1571–1576. 182. Escandon A.S. Genotype and composition of culture medium are factors important in the selection for transformed sunflower (Helianthus annuus) callus / A.S. Escandon, G. Hahne // Physiol.Plant. – 1991. – Vol. 81, № 3. – P. 4–5. 183. Espinasse A. Embryo Rescue through in Ovulo Culture in Helianthus / A. Espinasse, J. Volin, D.C. Dybing, C. Lay // Crop Sci. – 1991. – Vol. 31. – P. 102–108. 184. Etedal F. Biometric–genetic analysis of in vitro callus proliferation in rapeseed (Brassica napus) / F. Etedal, A. Khandan, A. Motalebi–Azar, Z. Hasanzadeh, A. Amiri Sadeghan, A. Pezeshki, S. Kazemiani // African J. of Agricultural Research. – 2012. – Vol. 7(48). – P. 6474–6478. 185. Etedal F. Genetic analysis of callus induction and growth in rapeseed / F. Etedal, Moghadam Mohammad, M. Khossroshahli, F. Javidfar, A.R. Motalebi Azar, M. Valizadeh // J. Agricultural Science (Univ. of Tabriz). – 2004. – Vol. 14(3). – P. 67–82. 186. Fathi H. Review of embryo culture in fruit trees / H. Fathi, U. Jahani // Annalis of Biological Research. – 2012. - Vol. 3, № 9. – Р. 42764281. 187. Faure N. Partial hybridization in crosses between cultivated sunflower and the perennial Helianthus mollis: effect of in vitro culture compared to natural crosses / N. Faure; H. Serieys; F. Kaan; A. Bervillé // Plant Cell Rep. – 2002 . – Vol. 20. – P. 943–947. 277 188. Faure N. Partial Hybridization in Wide Crosses between Cultivated Sunflower and the Perennial Helianthus Species H.mollis and H.orgyalis / N. Faure, H. Serieys, E. Cazaux, F. Kaan, A. Berville // Annals of Botany. – 2002. – Vol. 89, № 1. – P. 31–39. 189. Feng X.R. High frequency production of haploid embryos in asparagus anther culture. / X.R. Feng, D.J. Wolyn. // Plant Cell Reports. – 1991. – Vol. 10. – P. 574–578. 190. Ferrie A.M.R. Doubled haploid production in nutraceutical species: a review / Ferrie A.M.R. // Euphytica. – 2007. – Vol. 158, – P. 347–357. 191. Finer J.J. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of hybrid sunflower Helianthus annuus L.on a high sucrose– containing medium / J.J. Finer // Plant Cell Reports. – 1987. – Vol. 6. – P. 372–374. 192. Freyssinet G. Fertile plant regeneration from sunflower (Helianthus annuus L.) immature embryos. / Freyssinet G., Freyssinet M. // Plant Sci. – 1988. – Vol. 56. – P. – 177–181. 193. Friedt W. Haploids in the Improvement of Crucifers // Haploids in Crop Improvement II / W. Friedt, M.K. Zarhloul / Eds C.E.D. Palmer, W.A. Keller and K.J. Kasha. Biotechnology in Agriculture and Forestry,.: Springer Berlin Heidelberg. – 2005. – Vol. 56. – P. 191–214. 194. Gamborg O. Nutrient requiments of suspension cultures of soybean root cells / O. Gamborg, R. Miller, K. Ojima // Exp. Cell Res. – 1968. – Vol. 50. – P. 151–158. 195. Gamborg O.L. Tissue culture, protoplasts and morphogenesis in flax / O.L., Gamborg, J.P. Shyluk // Bot. Gaz. – 1976. – Vol, № 137. – P. 301–306. 196. Geerts P. Rescue of early heart–shaped embryos and plant regeneration of Phaseolus polyanthus Greenm. and Phaseolus vulgaris L. / P. Geerts, G. Mergeai, and J. P. Baudoin // Biotechnol., agr., soc. et environ. – 1999. – Vol. 3. – P. 141–148. 278 197. George L. In vitro induction of pollen embryos and plantlets in Brassica juncea through anther culture / L. George, P.S. Rao // Plant Sci. Lett. – 1982. - Vol. 26. - P. 111-116. 198. Germana M.A. Anther culture for haploid and doubled haploid production / M.A. Germana // Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2007. – V. 104, № 3. – Р. 283-300. 199. Gland A. Genetic and exoneous factors affecting embryogenesis in isolated microspore cultures of B. napus L. / A. Gland, R. Lichter, H.G. Schweiger // J. Plant Physiol. – 1988. – Vol.132. P. 613–617. 200. Gomes da Cunha A.C. Somatic embryogenesis, organogenesis and callus growth kinetics of flax / A.C. Gomes da Cunha, M. F. Ferreira // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1996. – Vol. 47. – P. 1–8. 201. Gonzalez–Benito M.E., Aguilar N., Avila T. Germination and embryo rescue from Passiflora species seeds post–cryopreservation / M.E. Gonzalez–Benito, N. Aguilar, T. Avila // Cryo Letters. – 2009. – Vol. 30, № 2. – P. 142–147. 202. Gopalkrishnan K. Shortening breeding cyle through immature embryo culture in sunflower (Helianthus annuus L.) / K. Gopalkrishnan, M.R. Naidu, D. Sreedhar // Helia. - 1993. - Vol. 16, - P. 61-68. 203. Gray D.J. Comparison of methodologies for in ovulo embryo rescue of seedless grapes / D.J. Gray, L.C. Fisher, J.A. Mortensen, Spiegel-Roy P. // Hort.Sci. - 1987. – Vol. 22. - P. 1334-1335. 204. Gupta P.K. Biotechnology and Genomics / Gupta P.K. – Rastogi Publications, 2009. – 796 p. 205. Haimin Li. Oтбор выносливых к кадмию мутантов в культуре пыльников риса / Li Haimin, C. Ying // Yichuan xuebao. – 1987. – Vol. 14. P. 42–48. 279 206. Hamaoka Y. Number of Chloroplasts in Haploids and Diploids Produced via Anther Culture in Brassica campestris / Y. Hamaoka, Y. Fujita, S. Iwai // Plant Tissue Culture Letters. – 1991. – Vol. 8, № 2. – P. 67–72. 207. Hammerschlag F. A. Regenerants derived from leaf explants of several strawberry cultivars, exhibit increased levels of resistance to the fungal pathogen Colletotrichum acutatum / F. A . Hammerschlag, S. Garces, M. Koch– Dean, J. Maas // In vitro Cell. Dev. Biol – Animal. – 2001. – Vol. 37. – P. 2002. 208. Hofer M. Induction of doubled haploids in sweet cherry (Prunus avium L.) / M. Hofer, C. Grafe // Euphytica. – 2003. – Vol.130, № 2. – P. 191– 197. 209. Jain S. Photosynthetic response to NaCl salinity in in vitro selected salt tolerant somaclones and parent cv. Prakash of Brassica juncea L. / S. Jain, H. S. Nainawatee, R. K. Jain, I. S. Sheoran, J. B. Chowdhury // Indian J.Exp. Biol. – 1994. – Vol. 32. – P. 588–593. 210. Jain S.M. Somaclonal variation and induced mutations in crop improvement / S.M. Jain, D.S. Brar, B.S. Ahloowalia.: Springer–Verlag, 1998. – 640 p. 211. Jambhulkar S.J. Induction of plant injury, chimera, chlorophyll and morphological mutations in sunflower using gamma rays / S.J. Jambhulkar, D.C. Joshua // Helia. – 1999. – Vol. 22, № 31. – P. 63–74. 212. Jeannin G. Donor plant growth conditions and regeneration of fertile plants from somatic embryos induced on immature zygotic embryos of sunflower (Helianthus annuus L.) / G. Jeannin, G. Hahne // Plant Breed. – 1991. – Vol. 107. – P. 280–287. 213. Kaushal R.P. Induction of callus cultures and regeneration of somaclones from different explant of urdbean [Vigna mungo (L.) hepper] and their evalution for resistanse to Cercospora canescens / R. P. Kaushal, B. Kaushal, N. Rashmi, A. Vaid, B. M. Singh // Proc. Indian Nat. Sci. Acad. – 1997. – Vol. 63. – P. 359–367. 280 214. Keller W.A. Embryogenesis and plant regeneration in Brassica napus cultures / W.A. Keller, K.C. Armstrong // Can J. Bot. – 1977. – Vol. 55. – P. 1383–1388. 215. Keller W.A. In vitro production of plants from pollen in Brassica campestris / W.A. Keller, R. Rajhathy, J. Lacapra // Can. J. Genet. Cytol. – 1975. – Vol.17, – P. 655–666. 216. Keller W.A. Stimulation of embryogenesis and haploid production in Brassica campestris anther cultures by elevated temperature treatments / W.A. Keller, K.C. Armstrong // Theoretical and Applied Genetics. – 1979. – Vol. 55, № 2. – P. 65–67. 217. Kim D.S. Selection of 5–methyltryptophan resistant rice mutants from irradiated calli derived from embryos / D.S. Kim, I.S. Lee, C.S. Jang, D.Y. Hyun, Y.W. Seo, Y.I. Lee // Euphytica. – 2004. – Vol. 135. – P. 9–19. 218. Kimber G. Haploid angiosperms / G. Kimber, R. Riley // Botanical Review. – 1963. – Vol. 29, № 4. – P. 480—531. 219. Klug W.S. Concepts of genetics / W.S. Klug, M.R. Cummings, C.A. Spencer, M.A. Palladino. - 10th ed: Pearson Education, 2012. – 876 p. 220. Knudson L. Nonsymbiotic germination of orchid seeds / L. Knudson // Bot. Gaz. - 1922. – Vol. 73. - P. 1-25. 221. Ko Myong S. Влияние некоторых факторов на индукцию и увеличение образования каллуса у сафлора красильного / S. Ko Myong, S. Ro Myong // Kwahagwon thongbo ; Bull. Acad. Sci. DPR Korea. – 1996. – Vol 3. – P. 46–49. 222. Kosturkova G. Regeneration systems from immature embryos of Bulgarian pea genotypes. / G. Kosturkova., A. Mehandjiev., I. Dobreva, V. Tzvetkova // Plant Cell Tissue and Organ Culture. – 1997. – №8. – P. 139–142. 223. Krauter R. Efficient interspecific hybridization in the genus Helianthus via "embryo rescue" and characterization of the hybrids / R. Krauter, A. Steinmetz, W. Friedt // Theor. Appl. Genet. – 1991. – Vol.82. – P.521–525. 281 224. Krauter R. Efficient interspecific hybridization via embryo rescus for application in sunflower breeding / R. Krauter, W. Friedt // Helia. – 1990. – Vol. 13, No. 13. – P. 17–20. 225. Kumar J.V. Production of plants resistant to Alternaria carthami via organogenesis and somatic embryogenesis of safflower cv. NARI–6 treated with fungal culture filtrates / J. V. Kumar, B. R. Kumari, G. Sujatha, E. Castano // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2008. – Vol. 93. – P. 85–96. 226. Kurtar E. Production of in vitro haploid plants from in situ induced haploid embryos in winter squash (Cucurbita maxima Duchesne ex Lam.) via irradiated pollen / E. Kurtar, A. Balkaya // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2010. – Vol. 102, № 3. – P. 267–277. 227. Kurtar E.S. Obtention of haploid embryos and plants through irradiated pollen technique in squash (Cucurbita pepo L.) / E.S. Kurtar, N. Sari, K. Abak // Euphytica. – 2002. – Vol. 127, № 3. – P. 335–344. 228. Larkin P.J. Somaclonal variation – a noval source of variability from cell cultures for plant improvement / P.J. Larkin, W.R. Scowcroft // Theor. Appl. Genet. – 1981. – Vol. 60, № 4. – P. 197–214. 229. Latado R.R. In vitro mutation of chrysanthemum (Dendranthema grandiflora Tzvelev) with ethylmethanesulphonate (EMS) in immature floral pedicels / R.R. Latado, A.H. Adames, A.T. Neto // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2004. – Vol. 77, № 1. – P. 103–106. 230. Leelavathi S. Somatic cell genetic studies in Brassica species: High frequency production of haploid plants in Brassica alba / S. Leelavathi, V.S. Reddy, S.K. Sen // Plant Cell Rep. – 1984. – Vol. 3. – P. 102–105. 231. Li R. Tissue culture-induced morphological somaclonal variation in St. Augustinegrass [Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze] / R. Li, A.H. Bruneau, R. Qu // Plant Breeding. – 2010. - V. 129, №1. – P. 96–99. 232. Lichter R. Anther culture of Brassica napus in a liquid culture medium / R. Lichter // Z.Pflanzenphysiol. – 1981. – Vol.103. – P. 229–237. 282 233. Ling H. Improvement of plant regeneretion from Linum protoplasts by the induction of somatic embryogenesis / H. Ling, H. Binding // J. Plant Physiol. – 1992. – Vol. № 139. – P. 422–426. 234. Lloyd G. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot–tip culture / G. Lloyd, B. McCown // Proc. Int. Plant Propagators' Soc. – 1980. – Vol. 30. – P. 421–427. 235. Lutova L.A. Genetic control of in vitro differentiation processes in radish / L.A. Lutova, I.S. Buzovkina, O.A. Smirnova // In vitro Cellular & Developmental Biology. Plant. – 1997. – Vol.33, № 4. – P. 269–274. 236. Lyakh V. Influence of mature and immature sunflower seed treatment with ethylmethanesulphonate on mutation spectrum and frequency / V. Lyakh, A. Soroka, V. Vasin // Helia. – 2005. – Vol. 28, № 43. – P. 87–98. 237. Mahmood I. In vitro selection of tissue culture induced somaclonal variants of wheat for drought tolerance / I. Mahmood, A. Razzaq, M. Ashraf, I.A. Hafiz, S. Kaleem, A. Qayyum, M. Ahmad // Journal of Agricultural Research. – 2012. - Vol. 50, No. 2. – P. 177-188. 238. Malik M.R. Induction of microspore embryos in a CMS line of Brassica juncea and formation of the androgenic plantlets / M.R. Malik, N.S.Rangaswamy, K.R. Shivanna // Euphytica. – 2001. – Vol. 120, № 2. – P. 195–203. 239. Mallikarjiuna N. Ovule and embryo culture to obtain hybrids from interspecific incompatible pollinations in chickpea / N. Mallikarjiuna // Euphytica. – 1999. – Vol. 110, № 1. – P. 1–6. 240. Maluszynski K. Officially released mutant varieties. – The РАО/IAEA database / K. Maluszynski, K. Nichterlein, L. Van Zanten // Mutation breeding review. – 2000. – Vol. № 12. – P. 1–84. 241. Mandal A.B. Development and characterization of salt tolerant somaclones in rice cultivar pokkali / A.B. Mandal, C. Bikash, T. E. Sheeja // Indian J. Exp. Biol. – 2000. – Vol. 38. – P 74–79. 283 242. McCann A.W. A system for routine plantlet regeneration of sunflower (Helianthus annuus L.) from immature embryo–derived callus / A.W. McCann, G. Cooley, J. Van Dreser // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1988. – Vol. 14, № 2. – P. 103–110. 243. Miflin B.J. Crop biotechnology. Where Now / B.J. Miflin // Plant Physiol. – 2000. – Vol.123, № 1. – P. 17–27. 244. Morrison G. The occurrence and use of haploid plants in the tomato with especial reference to the variety Marglobe. / G. Morrison // Proc. 6th Int. Cong. Genet, N.Y. - . 1932 - Vol. 2. - P. 137-139. 245. Morrison R.A. Haploid plants from tissue culture: New plant varieties in a shortened time frame / R.A. Morrison, D.A. Evans // Nature Biotechnology. – 1988. – Vol. 6. – P. 684–690. 246. Murashige J. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture / J. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. – 1962. – Vol.15 – P. 473–497. 247. Naleczynska A. Dihaploid production in Brassica napus L. by in vitro androgenesis / A. Naleczynska, T. Cegielska // Genet.pol. – 1984. – Vol. 25, № 3. – P. 271–276. 248. Nedev T. Immature embryo culture of Helianthus hybrids / T.Nedev, R.Vassilevska–Ivanova, Z.Tzekova // Докл. Бьлг. АН. – 1997. – Vol.50, № 4. – P. 121–124. 249. Nehnevajova E. In vitro breeding of Brassica juncea L. to enhance metal accumulation and extraction properties / E. Nehnevajova, R. Herzig, K.H. Erismann, J.P. Schwitzguébel // Plant Cell Rep. – 2007. – V. 26 - № 4. – P. 429437. 250. Nichterlein K. Plant regeneration from isolated microspores of linseed (Linum usitatissimum L.) / K. Nichterlein, W. Friedt // Plant Cell Rep. 1993. - Vol. 12. - P. 426-430. 284 251. Nikam T.D. In vitro culture of Safflower L. cv. Bhima: initiation, growth optimization and organogenesis / T.D. Nikam, M.G. Shitole // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1998. – Vol. 55. – P. 15–22. 252. Nikova V.M. Overcoming of interspecies incompatibility in the Solanaceaous genera Nicotiana and Capsicum via in vitro techniques / V.M. Nikova, R. D. Vladova, A. C. Petkova, A. Iancheva // In vitro Cell. Dev. Biol – Anima. – 2001. – Vol. 37. – P. 2024. 253. Nissen O. A microcomputer program for the design, management and analysis of agronomic research experiments / O. Nissen // User’s Guide to MSTAT–C. Michigan State Univ., East Lansing, USA, 1991. – 254 p. 254. Nitsch D. Pollen culture – a new technics for mass production of haploid and homozygous plant / D. Nitsch / Haploids in Higher Plants: Advances and Potential / Ed. K.F. Kasha. – Guelph: Univ. of Guelph Press/ – 1974. – № 3. – P. 123–135. 255. Nurhidayah interspezifischer T. Direkte Embryogenese Sonnenblumenhybriden – aus Antherenkultur biochemische und molekularbiologische Charakterisierung der Regenerate / T. Nurhidayah, T. Rocher, H. Kohler // Vortr. fur Pflanzenzuchtung.– Bonn. – 1996. – Vol. № 32. – P. 94–96. 256. Nurhidayah T. High regeneration rates in anther culture of interspecific sunflower hybrids / T. Nurhidayah, R. Horn, T. Rocher, W. Friedt // Plant Cell Reports. – 1996. – Vol.16, № 3–4. – P. 167–173. 257. Obert B. Flax anther culture: effect of genotype, cold treatment and media / B. Obert, B. Dedicova, A. Hricova, J. Samaj, A. Pret'ova // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2004. – Vol. 79, № 2. – P. 233–238. 258. Ochatt S. Haploid plants from pollen grains / S. Ochatt, Y. Zhang // Science. – 1996. – Vol.163. – P. 85–87. 259. Ochatt S.J. In vitro recurrent selection of potato : Production and characterization of salt tolerant cell lines and plants. / S. J. Ochatt, P. L. Macroni, 285 S. Radice, P. A. Arnozis, O. H. Caso // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. – 1998. – Vol. 55. – P. 1–8. 260. Ottaviano E. Pollen selection: efficiency and monitoring / E. Ottaviano, M. Sari Gorla, D.L. Mulcahy // Ed. : Wiley–Liss Inc. – 1990. – № 4. – P. 575–588. 261. Ozyigit I.I. Genotype dependent callus induction and shoot regeneration in sunflower Helianthus annuus L. / N. Gozukirmizi, B.D. Semiz // African Journal of Biotechnology. - 2007. – Vol 6, No 13. – Р. 1498–1502. 262. Patent 2333837–A. Cultivating and screening plants / P. Boutsalis; Novartis – № GB19980002250 19980203; заявл. 1998–02–03; опубл. 1999– 08–04. 263. Paterson K.E. Regeneration of Helianthus annuus inbred plants from callus / K.E. Paterson, N.P. Everett // Plant Sci. – 1985. – Vol. 42. – P. 125– 132. 264. Peixe A. Induction of haploid morphogenic calluses from in vitro cultured anthers of Prunus armeniaca cv. ‘Harcot’ / A. Peixe, J. Barroso, A. Potes, M.S. Pais // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2004. – Vol. 77, № 1. – P. 35–41. 265. Perera P. Androgenic potential in coconut (Cocos nucifera L.) / P. Perera, V. Hocher, J.L. Verdeil, H. Bandupriya, D. Yakandawala, L. Weerakoon / Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2008. – Vol. 92, № 3. – P. 293–302. 266. Phan T.B. Стимуляция регенерации растений из каллуса риса indica, обработанного культуральным экстрактом патогена Piricularia oryzae / T. B. Phan, T. M. Le, D. T. Nguyen // Nong nghiep cong nghiep thuc pham Agr. and Food Ind. – 1997. – P. 172–174. 267. Plant Cell Culture Protocols / [Eds. V.V. Loyola-Vargas, N. OchoaAlejo]. - 3rd ed. - New York: Humana Press, 2012. - 430 p. 286 268. Popielarska M. In vitro culture of isolated living sunflower (Helianthus annuus L.) embryo sacs / M. Popielarska, L. Przywara // Sex Plant Reprod. – 2003. – Vol. 16. – P. 23–33. 269. Prakash J. Androgenesis in oilseed rape / J. Prakash, K. L. Giles // presented at Gen. Manipulat. Plant Breed, 1986. Genetic manipulation in plant breeding : proceedings, international symposium organized by EUCARPIA, September 8–13, 1985, Berlin (West), Germany / Ets. W. Horn... [et al.]. Berlin, [W. Ger.] : W. de Gruyter, 1986. – P. 331–333. 270. Pugliesi C. Plant regeneration and genetic variability from tissue cultures of sunflower Helianthus annuus L. / C. Pugliesi, F. Cecconi, A. Mandolfo, S. Baroncelli // Plant Breed. – 1991. – Vol. 106. – P. 114–121. 271. Punia M.S. Callus development and plant regeneration from different explants of six wild species of sunflower (Helianthus L.) / M.S. Punia, N.E. Bohorova // Plant Sci. – 1992. – Vol. 87. – P. 79–83. 272. Purohit V.K. In vitro multiplication of Quercus leucotrichophora and Q. glauca: Important Himalayan oaks / V.K. Purohit, S. Tamta, S. Chandra, P. Vyas, L.M. S. Palni, S.K. Nandi // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2002. – Vol. 69. – P. 121–133. 273. Qin X. Chloroplast number in guard cells as ploidy indicator of in vitro–grown androgenic pepper plantlets / X. Qin, G. L. Rotino / Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1995. – Vol. 41, № 2. – P. 145–149. 274. Quaglia M. In vitro screening for sunflower (Helianthus annuus L.) resistant calli to Diaporthe helianthi fungal culture filtrate / M. Quaglia, A. Zazzerini / European Journal of Plant Pathology. – 2007. – Vol. 118, № 4. – P. 393–400. 275. Quimio C.A. Diallel analysis of callus induction and green–plant regeneration in rice anther culture / C. A. Quimio, F. J. Zapata // Crop Science. – 1990. – Vol. 30, No. 1. – P. 188–192. 287 276. Raducanu F. Preliminary results regarding in vitro screening for roundup resistance in sunflower / F. Raducanu // Romanian Agricultural Research. – 2004. – Vol. № 21. – P. 39–47. 277. Raducanu F. The "in vitro" reaction of some sunflower genotypes to different concentrations of oxalic acid to different filtrates of Sclerotinia sclerotiorum (Lib. de Bary), / F. Raducanu, G. Soare, M. Verzea // Proc. Syposium on Breeding of Oil and Protein Crops, Albena, Bulgaria, 1994 – P. 202–207. 278. Raghavan V. One hundred years of zygotic embryo culture investigations in vitro cell. / V. Raghavan // Dev. Biol. – 2003. - Vol. 39. – Р. 437442. 279. Rakoczy–Trojanovska M. The effect of growth regulators on somaclonal variation in rye (Secale cereale L.) and selection of somaclonal variants with increased agronomic traits / M. Rakoczy–Trojanovska // Cell Mol. Biol. – 2002. – Vol. 7. – P. 1111–1120. 280. Ramming D.W. In ovulo embryo culture of early maturing Prunus / D.W. Ramming // Hort. Sci. - 1985. - Vol. 20. - P. 419-420. 281. Rastogi A. Effect of auxin and gibberellic acid on growth and yield components of linseed (Linum usitatissimum L.) / A. Rastogi, A. Siddiqui, B.K. Mishra, M. Srivastava, R. Pandey [et al.] // Crop Breed. Appl. Biotechnol. [online]. – 2013. – Vol.13, no.2. – P. 136–143. 282. Ravi G.K. Development of intergeneric hybrids in crop Brassicas via embryo rescue and somatic hybridization / G.K. Ravi, S.R. Bhat, S. Prakash, V.L Chopra // In vitro Cell. Dev. Biol – Animal. – 2001. – Vol. 37, № 3 Part II. –. 2041 p. 283. Renukdas N. Influence of boron on somatic embryogenesis in papaya / N. Renukdas, M.L. Mohan, S.S. Khuspe, S.K. Rawal // Biologia Plantarum. – 2003. – Vol. 47, № 1. – P. 129–132. 288 284. Ribarits А. Combination of reversible male sterility and doubled haploid production by targeted inactivation of cytoplasmic glutamine synthetase in developing anthers and pollen / А. Ribarits, А. Mamun, L. Shipeng, Т. Resch, М. Fiers, Е. Heberle–Bors, С.–M. Liu, А. Touraev // Plant Biotechnology Journal. – 2007. – Vol. 5, № 4. – P. 483–494. 285. Rodeva R. Evaluation of pea genotypes for ascochyta blight resistance in vivo and in vitro / R. Rodeva, G. Kosturkova, I. Georgieva, A. Mehandjiev // Beitr. Zuchtungsforsch (Bundesanst. Zuchtungsforsch. Kulturpflanz). – 2001. – Vol. 7. – P. 47–51. 286. Roseland C.R. Somaclonal variants of sunflower with modified coumarin expression under stress / C.R. Roseland, A. Espinasse, T.J. Grosz // Euphytica. – 1991. – Vol. 54. – P. 183–190. 287. Rout G.R. Biotechnology of the rose: A review of recent progress / G. R. Rout, S. Samantaray, J. Mottley, P. Das // Sci. hort. (Neth.). – 1999. – Vol. 81. – P. 201–228. 288. Safarnejad A. Characterization of alfalfa (Medicago sativa L.) following in vitro selection for salt tolerance : Pap. 14th EUCARPIA Congr. Adapt. Plant Breed., Jyvaskyla, July 31–Fug. 4, 1995. / A. Safarnejad, H. A. Collin, K. D. Bruce, T. McNeilly // Euphytica. – 1996. – Vol. 92. – P. 56–61. 289. Samac D.A. Plant improvement for tolerance to aluminum in acid soils. A review / D. A. Samac, M. Tesfaye // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. – 2003. – Vol. 75. – P. 189–207. 290. Sari Gorla M. Extent of haplo–diploid gene expression in maize / M. Sari Gorla, C. Frova, G. Binelli, E. Ottaviano // Maize Genet.Cooper.News Letters. – 1983. – Vol. 58. – P. 145–146. 291. Schryer P.A. Rapid regeneration of Phaseolus angustissimus and P. vulgaris from very young zygotic embryos / P. A. Schryer, Lu Q, A. Vandenberg, K. E. Bett // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2005. – Vol. 83. P. 67–74. 289 292. Sharad T. Anther culture and long–term culture ability of androgenic calli in durum wheat (Triticum durum Desf.) / T. Sharad // Wheat Inf. Serv. – 2003. – № 96. – P. 15–19. 293. Sharma D.R. Embryo rescue in plants – a review / D. R. Sharma, R. Kaur, K. Kumar // Euphytica. – 1996. – Vol. 89. – P. 325–337. 294. Sharma K.K. Microspore embryogenesis in anther culture of two Indian cultivars of Brassica juncea / K.K. Sharma, S. Bhojwani // Pl. Cell Tis. Org. Cul. – 1985. – Vol. 4. – P. 235–239. 295. Sharma T.R. Generation and evaluation of somaclones of Brassica juncea for resistance to Albugo candida and Alternaria brassicae / T. R. Sharma, B. M. Singh // Proc. Indian Nat. Sci. Acad. B. – 1995. – Vol. 61, P. 155–161. 296. Siebel J. A comparison of anther and microspore culture as a breeding tool in Brassica napus / J. Siebel, K.P. Pauls / Theor.Appl.Genet. – 1989. – Vol. 78, № 4. – P. 473–479. 297. Sonali S. Mutagenic effectiveness and efficiency of seven chemical mutagens in sesame (Sesamum indicum L.) / S. Sonali, A.K. Datta // Plant Arch. – 2003. – Vol. 3, № 1. – P. 45–50. 298. Soroka A. Genetic variability in sunflower after mutagen treatment of immature embryos of different ages / A. Soroka, V. Lyakh // Helia. – 2009. – Vol. 32(51). – P. 33–45. 299. Soroka A. Inheritance of some mutant traits in sunflower / A. Soroka, V. Lyakh // Helia. – 2011. – Vol. № 54. – P.123–128. 300. Soroka A.I. Differentiation of haploid and dihaploid rape plants at the cytological and morphological levels / A.I. Soroka // Cytol Genet. – 2013. – 47(2). – P. 88-92. 301. Sotiropoulos T. Effect of boron and methionine on growth and ion content in kiwifruit shoots cultured in vitro / T. Sotiropoulos, K. Dimassi, V. Tsirakoglou // Biologia Plantarum. – 2006. – Vol. 50, № 2. – P. 300–302. 290 302. Sukno S. Interspecific hybridization between sunflower and wild perenial Helianthus species via embryo rescue / S. Sukno, J. Ruso, C.C. Jan, J.M. Melero–Vara, J.M. Fernandez–Martinez // Euphytica. – 1999. – Vol. 106, № 1. – P. 69–78. 303. Tang W. Plant regeneration via organogenesis from six families of loblolly pine / W. Tang, F. Ouyang, // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1999. – Vol. 58. – P. 223–226. 304. Taregyan M.R. Selection for resistance to the herbicide imazethapyr in somaclones of soyabean / M. R. Taregyan, A. M. Mortimer, P. D. Putwain, H. A. Collin, // Weed Res. – 2001. – Vol. 41. – P. 143–154. 305. Thakur M. In vitro selection and regeneration of carnation (Dianthus caryophyllus L.) plants resistant to culture filtrate of Fusarium oxysporum f.sp. dianthi / M. Thakur, D. Sharma, S. Sharma // Plant Cell Reports. – 2002. – Vol. 20. – P. 825–828. 306. Todorova M. Induced parthenogenesis in sunflower: effect of pollen donor / M. Todorova, P. Ivanov // Helia. – 1999. – Vol. 22, № 31. – P. 49–56. 307. Tonguc M. Development of black rot resistant interspecific hybrids between Brassica oleracea L. cultivars and Brassica accession A 19182, using embryo rescue / M. Tonguc, P.D. Griffiths // Euphytica. – 2004. – Vol. 136. - № 3. – P. 313–318. 308. Tuberosa R. Callus induction and plant regeneration in Italian cultivars of bread wheat / R. Tuberosa, S. Ravaglia, C. Lucchese // Agricoltura mediterranea. – 1988. – Vol.188. – P. 361–365. 309. Umesha S. Selection of downy mildew resistant somaclones, from a susceptible B line of pearl millet / S. Umesha, K. C. Nagarathna, S. A. Shetty, H. S. Shetty // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1999. – Vol. 58. – P. 159– 162. 310. Vagera J. In vitro haploid zygotic embryogenesis due to pollination with maize pollen and induces in vitro androgenesis in Czech wheat breeding 291 genotypes / J. Vagera, Z. Nesvadba, P. Martinek, L. Ohnoutkova // Rostl. vyroba. – 2001. – Vol. 47, № 5. – P. 193–200. 311. Van Ripley L. Hybridization of Sinapis alba L. and Brassica napus L. via embryo rescue / L. Van Ripley, P.G. Arnison // Plant Breed. – 1990. – Vol. 10, № 1. – P. 26–33. 312. Vasic D. Concentration of mineral elements in callus tissue culture of some sunfower inbred lines / D. Vasic, S. Pajevic, M. Saric, L. Vasiljevic, D. Skoric // Journal of Plant Nutrition. – 2001. – Vol. 24, № 12. – P. 1987–1994. 313. Venkatachalam P. Selection and regeneration of groundnut plants resistant to the pathotoxic culture filtrate of groundnut plants resistant to the pathotoxic culture filtrate of Cercosporidium personatum through tissue culture technology / P.Venkatachalam, N. Jayabalan // Appl. Biochem. and Biotechnol. A. – 1996. – Vol. 61. – P. 351–364. 314. Vikrant. Somatic embryogenesis from immature and mature embryos of a minor millet Paspalum scrobiculatum L. / Vikrant, A. Rashid // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2002. – Vol. 69. – P. 71–77. 315. Weber S. In vitro Regeneration interspezifischer Hybriden der Sonnenblume (Helianthus annuus L.) / S. Weber, R. Horn, W. Friedt // Vortr. fur Pflanzenzuchtung. – 1996. Vol. № 32. – P. 97–99. 316. Wolyn D.J. Genotype, incubation temperature and sampling date affect embryogenesis in asparagus anther culture / D.J. Wolyn, X.R. Feng // HortScience. – 1993. – Vol. 28. – P. 216–217. 317. Xianhong M. Культура зародышей Lilium dauricum / M. Xianhong, B. Ding, X. Liu // Dongbei linye daxue xuebao. –1997. – Vol. 25, № 1. – P. 26–28. 318. Xu Y. Selection for salt tolerance in tissue culture of sainfoin and recovery of plants from NaCl tolerant callus / Y. Xu, M. Wang, J. Jia, // Xibei zhiwu xuebao – Acta Bot. Boreali–Occident. Sin. – 2000. – Vol. 20. – P. 15–21. 292 319. Yang Z. Studies on somaclonal variants for resistance to scab in bread wheat (Triticum aestivum L.) through in vitro selection for tolerance to deoxynivalenol / Z. Yang // Euphytica. – 1998. – Vol. 101. P. 213–219. 320. Zagorska N.A. Induced androgenesis in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) I. Influence of genotype on androgenetic ability / N.A. Zagorska, A.A. Shtereva, B.D. Dimitrov, M.M. Kruleva / Plant Cell Reports. – 1998. – Vol. 17, № 12. – P. 968–973. 321. Zair I. Salt tolerance improvement in some wheat cultivars after application of in vitro selection pressure / I. Zair, A. Chlyah, K. Sabounji, M. Tittahsen, H. Chlyah // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2003. – Vol. 73. – P. 237–244. 322. Zaki A.M. Structural changes during the first divisions of embryos resulting from anther and free microspore culture in B. napus / A.M. Zaki, H.G. Dickinson // Protoplasma. – 1990. – Vol. 156. – P. 149 – 162. 323. Zenkteler M. In vitro fertilization of ovules of some species of Brassicaceae / M. Zenkteler // Plant Breed. – 1990. – Vol. 105, № 3. – P. 221– 228. 324. Zhan X.C. In vitro plantlet formation in Linum marginale from cotyledons, hypocotyls, leaves, roots and protoplasts / X.C. Zhan, D.A. Jonec, A. Kerr. // Aust. J. Plant. Physiol. – 1989. – Vol. 16. – P. 315–320. 325. Zhang D. Новая селекционная техника, комбинирующая культуру пыльников горчицы сарептской с анализом эруковой кислоты. I. Использование нового метода оценки эруковой кислоты и ее распределение в различных тканях / D. Zhang, Z. Chen, W. Li // Yichuan xuebao. – 1987. – Vol. 14. – P. 19–24. 326. Zhang F.L. Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops / F.L. Zhang, Y. Takahata // Theoretical and Applied Genetic. – 2001. – Vol. 103, № 2–3. – P. 254–258. 293 327. Zhang G.Q. Plant regeneration from the hybridization of Brassica juncea and B. napus through embryo culture / G. Q. Zhang, W. J. Zhou, H. H. Gu, W. J. Song, E. J. J. Momoh // J. Agron. and Grop Sci. – 2003. – Vol. 189. – P. 347–350. 328. Zhang Y. Improved production of doubled haploids in Brassica rapa through microspore culture / Y. Zhang, A. Wang, Y. Liu, Y. Wang, H. Feng // Plant Breeding. – 2012. – Vol.131. - № 1. - P. 164–169. 329. Zhizheng C. High frequency induction of pollen–derived embryoids from anther cultures of rape (Brassica napus L.) / C. Zhizheng, C. Zhenghua // Kexue Tongbao. – 1983. – Vol. 28, № 12. – P. 1690–1694. 330. Zhou W.J. Efficient production of doubled haploid plants by immediate colchicine treatment of isolated microspores in winter Brassica napus / W.J. Zhou, G.X. Tang, P. Hagberg // Plant Growth Regulation. – 2002. – Vol.37, № 2. – P. 185–192. 331. Zhou W.J. Increasing embryogenesis and doubling efficiency by immediate colchicine treatment of isolated microspores in spring Brassica napus / W.J. Zhou, P. Hagberg, G.X. Tang // Euphytica. – 2002. – Vol.128, № 1. – P. 27–34. 294 ПРИЛОЖЕНИЯ 295 Приложение А. Таблицы экспериментальных данных Таблица А.1 Доля каллусов с разной степенью развития на эксплантах разного типа у подсолнечника, % Всего Всего Дней экскалв плантов, лусов, культуре шт. шт. 1 2 3 Степень развития каллуса @ + ++ +++ 4 5 6 Генотип ЗЛ-678 Гипокотиль 5 48 1 100,0 2 0,0 2 0,0 7 48 24 100,0 c, 2 0,0 c, 2 0,0 14 48 48 21 48 48 28 48 48 27,1±6,41 bc, 23 70,8±6,56 c, 2 2,1±2,06 bc, 3 6,3±3,49 41,7±7,12 c, 2 52,1±7,21 c, 2 6,3±3,49 35,4±6,90 c 58,3±7,12 bc Семядоли 5 49 39 76,9±6,75 bc, 13 23,1±6,75 bc, 13 0,0 7 49 48 29,2±6,56 bc, 13 70,8±6,56 bc, 13 0,0 14 49 49 8,2±3,91 bc, 13 89,8±4,32 bc, 1 2,0±2,02 3 21 48 48 8,3±3,99 62,5±6,99 1 29,2±6,56 1 28 48 48 8,3±3,99 43,8±7,16 c 47,9±7,21 c, 3 Меристема 5 19 5 100,0 2 0,0 2 0,0 7 19 12 91,7±7,98 b, 2 8,3±7,98 2 0,0 14 19 19 0,0 12 73,7±10,10 b 26,3±10,10 12, b 296 Продолжение таблицы А.1 1 2 3 4 5 6 21 19 19 0,0 2 63,2±11,07 bc 36,8±11,07 bc 28 19 19 0,0 2 26,3±10,10 bc 73,7±10,10 bc, 2 Генотип ЗЛ-22А Гипокотиль 5 19 4 100,0 0,0 0,0 7 19 13 100,0 c 0,0 c 0,0 14 19 19 0,0 a, 2 21 19 19 0,0 2 36,8±11,07 3 63,2±11,07 2 28 19 19 0,0 2 15,8±8,37 2 84,2±8,37 a, 2 73,7±10,10 c, 23 26,3±10,10 ac, 3 Семядоли 5 21 9 100,0 a 0,0 a 0,0 7 21 14 92,9±6,88 a, 3 7,1±6,88 a 0,0 60,0±10,95 35,0±10,67 ac, ac,13 13 5,0±4,87 14 21 20 21 21 21 28,6±9,86 13 42,9±10,80 c, 3 28,6±9,86 13 28 21 21 23,8±9,29 13 42,9±10,80 c, 13 33,3±10,29 13 Меристема 5 5 0 0,0 0,0 0,0 7 5 0 0,0 a, 2 0,0 0,0 14 5 0 0,0 c, 2 0,0 ac, 12 0,0 ac, 1 21 5 3 100,0 2 0,0 a, 12 0,0 ac, 2 28 5 4 100,0 2 0,0 a, 2 0,0 a, 2 Генотип F1 ЗЛ-22 × ЗЛ-678 297 Продолжение таблицы А.1 1 2 3 4 5 6 0,0 0,0 Гипокотиль 5 20 9 100,0 7 20 17 14 20 20 0,0 a, 2 25,0±9,68 ab, 2 75,0±9,68 ab, 2 21 20 20 0,0 15,0±7,98 a, 2 85,0±7,98 a, 2 28 20 20 0,0 0,0 a, 2 100,0 a, 2 0,0 a 0,0 76,5±10,29 ab 23,5±10,29 ab 0,0 Семядоли 100,0 a 5 28 14 7 28 18 72,2±10,56 a 27,8±10,56 a 0,0 14 28 28 32,1±8,8 ab, 1 64,3±9,06 ab, 1 3,6±3,51 13 21 28 28 7,1±4,87 78,6±7,75 b, 13 14,3±6,61 13 28 28 28 7,1±4,87 3 75,0±8,18 ab, 13 17,9±7,24 a, 13 Меристема 5 8 5 100,0 0,0 0,0 7 8 8 87,5±11,69 b 12,5±11,96 0,0 14 8 8 0,0 2 37,5±17,12 b 62,5±17,12 b, 2 21 8 8 0,0 28 8 8 0,0 25,0±15,31 a, 2 75,0±15,31 ab, 2 0,0 a, 2 100,0 a, 2 Примечания: 1. @ – + - каллус слабо развит, ++ - нормально развит, +++ - очень хорошо развит. 2. 1 2 3 – Различия между эксплантами внутри генотипа значимы при 5% уровне значимости. 3. abc – Различия между генотипами с одним типом экспланта значимы при 5% уровне значимости. 298 Таблица А.2 Частота каллусообразования на эксплантах разного типа у различных видов льна на модифицированной среде N6 Вид 1 Тип экс- Кол-во Дней в Частота планта эксплан- куль- каллусообразования тов, туре 2 Гипокотиль L.angustifolium СемядоHuds. ля Меристема Гипокотиль L.grandiflorum СемядоDesf. ля Меристема шт. 3 40 40 4 7 14 шт. 5 0 3 % 6 0,0 7,5 40 40 21 7 5 0 12,5 0,0 40 40 40 14 21 7 14 16 0 35,0 40,0 0,0 40 40 14 21 12 16 30,0 40,0 40 40 40 7 14 21 0 16 22 0,0 40,0 55,0 40 40 7 14 0 28 0,0 70,0 40 39 21 7 35 0 87,5 0,0 39 39 14 21 6 8 15,4 20,5 299 Продолжение таблицы А.2 1 2 Гипокотиль L.hispanicum Семядо- Mill. ля Меристема Гипокотиль L.pubescens Banks & Solander Семядоля Меристема Гипокотиль L.usitatissimum Семядоля L. Меристема 3 40 4 7 5 0 6 0,0 40 40 40 14 21 7 3 5 0 7,5 12,5 0,0 40 40 14 21 20 26 50,0 65,0 40 40 40 7 14 21 0 4 6 0,0 10,0 15,0 40 40 7 14 0 1 0,0 2,5 40 40 21 7 3 0 7,5 0,0 40 40 40 14 21 7 12 14 0 30,0 35,0 0,0 40 40 14 21 2 4 5,0 10,0 40 40 40 7 14 21 0 18 31 0,0 45,0 77,5 32 32 7 14 0 30 0,0 93,8 32 21 21 7 32 0 100,0 0,0 21 21 14 21 8 12 38,1 57,1 Примечания: НСР0,05 для эксплантов разного типа на 14-й день культивирования = 17,02%. НСР0,05 для эксплантов разного типа на 21-й день культивирования = 22,08%. 300 Таблица А.3 Состояние эксплантов разных типов у различных видов льна на модифицированной среде МС Состояние эксплантов Кол-во с небольшим Тип эксп- Дней в разбухших, без с рыхлым каллусом каллуса количеством каллуса экслан- кульпланта тов, туре шт. % SE шт. % SE шт. % SE шт. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 с плотным каллусом шт. % SE 11 12 13 14 15 L.angustifolium Huds. Гипоко- 40 7 0 0,0в, 3,4,5 тиль 40 14 0 0,0в, 4 40 21 0 0,0в, 4 40 7 1 2,5 2,47 40 14 1 2,5 40 21 1 2,5 Мери- 40 7 стема 40 40 Семядоля 7,41 5 12,5б,в, 2,3,4,5 5,23 8 20,0в, 3,5 6,32 26 65,0б,в, 2,3,4,5 7,54 5 12,5в, 3,5 5,23 9 22,5б,в, 2,3 6,60 26 65,0б,в, 2,3,4,5 7,54 5 12,5в, 3,5 5,23 9 22,5б,в, 2,3 6,60 4 10,0a,в, 2,4,5 4,74 29 72,5a,в, 2,4,5 7,06 6 15,0в, 5 5,65 2,47 4 10,0a,в, 2,3,5 4,74 9 22,5с, 2,4 6,60 26 65,0a,в, 2,5 7,54 2,47 4 10,0a,в, 2,3,5 4,74 9 22,5с,2,4 6,60 26 65,0a,в, 2,5 7,54 4 10,0a, 5 4,74 0 0,0a,б 0 0,0a,б 36 90,0a,б, 5 4,74 14 4 10,0a, 5 4,74 0 0,0a,б 0 0,0a,б 36 90,0a,б, 5 4,74 21 4 10,0a, 5 4,74 0 0,0a,б 0 0,0a,б 36 90,0a,б, 5 4,74 27 67,5б,в, 2,5 301 Продолжение таблицы А.3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 25,0в, 3,5 6,85 L.grandiflorum Desf. Гипокотиль Семядоля Меристема 40 7 0 0,03,4,5 3 7,5б, 1,3,4,5 4,16 27 67,5б,в, 1,3,4 7,41 10 40 14 0 0,04 1 2,5б, 1,3,4,5 2,47 11 27,5б,в, 3,5 7,06 28 70,0б,в, 1,3,4,5 7,25 40 21 0 0,04 1 2,5б, 1,3,4,5 2,47 11 27,5б,в, 3,5 7,06 28 70,0б,в, 1,3,4,5 7,25 40 7 1 2,5 2,47 31 77,5a,в, 1,3,4 6,60 4 10,0a,в, 1,3,4,5 4,74 4 40 14 1 2,5 2,47 31 77,5a,в, 1,3,4 6,60 2 5,0a, 1,3,4,5 3,45 6 15,0a,в, 1,3,4,5 5,65 40 21 1 2,5 2,47 31 77,5a,в, 1,3,4 6,60 2 5,0a, 1,3,4,5 3,45 6 15,0a,в, 1,3,4,5 5,65 39 7 2 5,1 3,53 0 0,0б 0 0,0a,б 37 94,9a,б 3,53 39 14 2 5,1 3,53 0 0,0б 0 0,0a 37 94,9a,б 3,53 39 21 2 5,1 3,53 0 0,0б 0 0,0a 37 94,9a,б 3,53 7,25 0 0,0б,в, 1,2,5 0,00 0 0,0б,в, 1,2,4 0,00 10,0в, 4,5 4,74 L.hispanicum Mill. Гипо- 40 7 12 30,0б,в, 1,2 7,25 котиль 40 14 0 0,04 40 100,0б, 1,2,4,5 0,00 0 0,0б,в, 1,2,4,5 0,00 0 0,0б,в, 1,2,4,5 0,00 40 21 0 0,04 40 100,0б, 1,2,4,5 0,00 0 0,0б,в, 1,2,4,5 0,00 0 0,0б,в, 1,2,4,5 0,00 28 70,0б,в, 2,5 302 Продолжение таблицы А.3 1 Семядоля Меристема 2 3 4 5 40 7 0 40 14 40 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0,0a 7 17,5a,в, 2,5 6,01 29 72,5a,в, 2,4,5 7,06 4 10,0a,в, 4,5 4,74 0 0,0 13 32,5a,в, 1,2,4,5 7,41 8 20,0a,в, 2,4 6,32 19 47,5a,в, 2,5 7,90 21 0 0,0 13 32,5a,в, 1,2,4,5 7,41 8 20,0a,в, 2,4 6,32 19 47,5a,в, 2,5 7,90 40 7 2 5,0a 3,45 0 0,0a,б 0 0,0a,б 38 95,0a,б 3,45 40 14 2 5,0 3,45 0 0,0б 0 0,0a,б 38 95,0a,б 3,45 40 21 2 5,0 3,45 0 0,0б 0 0,0a,б 38 95,0a,б 3,45 5 12,5б,в, 3,5 5,23 L.pubescens Banks & Solander Гипокотиль Семядоля Меристема 40 7 8 20,0б, 1,2 6,32 27 40 14 40 67,5б,в, 2,5 7,41 0 0,0б,в, 1,2,5 6 15,0б, 1,2 5,65 17 42,5б,в, 1,2,3,5 7,82 9 22,5б,в, 3,5 6,60 8 20,0б,в, 2,3 6,32 21 6 15,0б, 1,2,5 5,65 17 42,5б,в, 1,2,3,5 7,82 9 22,5б,в, 3,5 6,60 8 20,0б,в, 2,3 6,32 40 7 0 0,0a 13 32,5a,в, 1,2,5 7,41 15 37,5a,в, 1,2,3 7,65 12 30,0a,в, 2,3,5 7,25 40 14 0 0,0a 3 7,5a, 2,3,5 4,16 18 45,0a,в, 1,2,3 7,87 19 47,5a,в, 2,5 7,90 40 21 0 0,0a 3 7,5a, 2,3,5 4,16 18 45,0a,в, 1,2,3 7,87 19 47,5a,в, 2,5 7,90 40 7 3 7,5 4,16 0 0,0a,б 0 0,0a,б 37 92,5a,б 4,16 40 14 3 7,5 4,16 0 0,0a 0 0,0a,б 37 92,5a,б 4,16 40 21 3 7,5 4,16 0 0,0a 0 0,0a,б 37 92,5a,б 4,16 303 Продолжение таблицы А.3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 L.usitatissimum L. Гипокотиль Семядоля Меристема 40 7 8 20,0б,в, 1,2 6,32 10 25,0б,в, 1,2,3,4 6,85 22 55,0б,в, 1,3,4 7,87 0 0,01,2,4 40 14 3 7,5 8 20,0б,в, 1,2,3,4 6,32 20 50,0в, 1,2,3,4 7,91 9 22,5б,в, 2,3 6,60 40 21 0 0,04 6 15,0б,в, 1,2,3,4 5,65 24 60,0в, 1,2,3,4 7,75 10 25,0б,в, 2,3 6,85 32 7 0 0,0a 22 68,8a,в, 1,3,4 8,19 10 31,3a,в, 1,2,3 8,19 0 0,01,2,3,4 32 14 0 0,0 20 62,5a,в, 1,3,4 8,56 12 37,5в, 2 8,56 0 0,0a, 1,2,3,4 32 21 0 0,0 20 62,5a,в, 1,3,4 8,56 12 37,5в, 2 8,56 0 0,0a, 1,2,3,4 21 7 0 0,0a, 1 0 0,0a,б 0 0,0a,б 21 100,01 0,00 21 14 0 0,01 0 0,0a,б 0 0,0a,б 21 100,0a, 1 0,00 21 21 0 0,01 0 0,0a,б 0 0,0a,б 21 100,0a, 1 0,00 4,16 Примечания: 1. SE – стандартная ошибка. 2. a, б, в – разница между эксплантами внутри генотипа существенна при p < 0,05. 3. 1, 2, 3, 4, 5 – разница между генотипами с одним типом экспланта существенна при p < 0,05. 304 Приложение Б. Акты внедрения, патенты, свидетельства 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316
