молекулярная природа первичных повреждени днк

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА ПЕРВИЧНЫХ ПОВРЕЖДЕНИ ДНК,
ВЫЯВЛЯЕМЫХ В АЛЬФА-ТЕСТЕ
A. Жук 1,2, A. Ширяева 1, Ю. Андрейчук 1, E. Степченкова 1,2, С. Инге-Вечтомов 1,2
1
2
Санкт-Петербургский государственный университет, Россия
Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Н.И. Вавилова, РАН,
Россия
Большинство
наследуемых
изменений
генетического
материала
является
следствием ошибочной репарации спонтанных и индуцированных первичных
повреждений ДНК. Показано, что первичные повреждения ДНК, которые закрепились
в виде генных или геномных мутаций, приводят к изменению фенотипических
признаков клеток, что может служить причиной рака и наследственных заболеваний
[1]. Тем не менее, мало известно о том, могут ли первичных повреждений ДНК влиять
на фенотип, еще до их превращения в генные и геномные мутации. В этой работе мы
изучили фенотипическое проявление первичных повреждений ДНК и их судьбу после
репарации с использованием альфа-теста.
Материалы и методы
Альфа-тест основан на «незаконном» спариваний α на α гетероталличных штаммов
дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Гаплоидные штаммы дрожжей имеют один из двух
типов спаривания α или а. В норме только гаплойдные клетки противоположных типов
спаривания могут скрещиваться, образуются диплоидные клетки [2]. Клеточный тип
гаплойдных клеток (a или α) контролируется локусом типа спаривания MAT, имеющим
два идиоморфа МАТа и МАТα, расположенным в хромосоме III [2]. Помимо локуса
МАТ в хромосоме III расположены еще два локуса HMRа и HMLα, содержащих
неэкспрессируемую
генетическую
информацию
о
типе
спаривания
а
и
α
соответственно [2]. При определенных условиях может происходить однонаправленная
конверсия между одной из молчащих кассет и локусом МАТ, в результате чего
происходит переключение типа спаривания [2]. У гетероталличных дрожжей
переключение типов спаривания происходит с очень низкой частотой (10-6), которая
повышается при воздействии генотоксических агентов, благодаря нарушению
экспрессии локуса MAT. При нарушении экспрессии МАТα гетероталличные
гаплоидные клетки переключают тип спаривания α →а, и могут скрещиваться с
клетками α типа спаривания.
В альфа-тесте используют два штамм одинакового типа спаривания α с
комплементарными
селективными
маркерами.
Один
из
штаммов
подвергают
генотоксическому воздействию и скрещивают со вторым на селективной среде, где
вырастают только гибриды, не родительские штаммы [3]. Согласно нашей модели в
клетках, подвергшихся генотоксическому воздействию, первичные повреждения ДНК
нарушают экспрессию локуса MATα, что приводит к временному или постоянному
переключение типа спаривания α →а, и делает возможным незаконное скрещивание α×
α. После скрещивания значительная часть первичных повреждений устраняется
системами репарации безошибочно. Однако за время своего существования эти
первичные повреждения успевают повлиять на фенотип дрожжевых клеток, инициируя
временное переключение типа спаривания α → а. Другая часть первичных
повреждений в ходе репарации закрепляется в виде наследуемых изменений
генетического материала: мутаций или хромосомных аберраций, а также провоцирует
конверсию и рекомбинацию [3].
Результаты и обсуждение
Для того чтобы определить молекулярную природу первичных повреждений ДНК,
способных проявляться фенотипически, мы исследовали
действие
эталонных
мутагенов в комбинации с дефектами систем репарации в альфа-тесте.
Для изучения возможности фенотипического проявления двунитевых разрывов мы
оценили эффект камптотецина в альфа-тесте. Мы показали, что двунитевые разрывы,
индуцированные камптотецином, приводят к значительному повышению частоты
наследуемых и ненаследуемых изменений в альфа-тесте (Рис 1).
Для определения возможности фенотипического проявления неспаренностей
оснований изучили эффект инактивации репарации ДНК с неспаренными основаниями
(дизрупция по гену PMS1) в альфа-тесте. Неспаренности оснований повышают частоту
незаконного скрещивания только за счет наследуемых генетических изменений, но не
индуцируют временные повреждения (Рис 1).
Возможность фенотипического проявления модификаций оснований в альфа-тесте
мы изучали на примере двух аналогов оснований 6 пуриновых оснований гидроксиламинопурина (ГАП) и 8-оксогуанина (8-ОГ). ГАП в большей степени
увеличивают частоту точечных мутаций примерно в 139 раз, а также частоту
безошибочно устраненных первичных повреждений (Рис 1). Накопление 8-ОГ,
вызванное мутацией в гене ДНК-гликозилазы (ogg1), повышает частоту временных
повреждений, а из всех наследуемых изменений индуцирует только конверсию (Рис 1).
Заключение
На основе полученных данных, можно сделать вывод о том, что модификации
оснований и двунитевые разрывы ДНК могут проявляться фенотипически в альфатесте до их устранения системами репарации и превращения в наследуемые изменения
генетического материала. Неспаренности нуклеотидов в альфа-тесте в основном
проявляются уже в виде наследуемых изменений. Таким образом, альфа-тест является
эффективным подходом для выявления фенотипического проявления первичных
повреждений различных типов при условии грамотного подбора мутагенных факторов
и генетических блоков путей репарации.
Acknowledgements
Эта работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-08625.
References
1.Jan H., 2009. DNA Damage, Aging, and Cancer. The new England journal of medicine.
361: 1475-1485
2. Haber J. E., 2012. Mating – type genes and MAT switching in Saccharomyces
cerevisiae. Genetics. 191(1): 33-64
3.Inge-Vechtomov S.G., Repnevskaya M.V., 1989. Phenotypic expression of primary
lesions of genetic material in Saccharomyces yeast. Genome. 31: 497-502