Предимплантационный генетический скрининг: ПРОТИВ

Предимплантационный
генетический скрининг:
ПРОТИВ
Боярский К.Ю.
Санкт-Петербургская Государственная
Педиатрическая Медицинская академия
Предимплантационный генетический скрининг или
скрининг анеуплоидии (ПГС или ПГ-АС) – это
определение числа хромосом в одном или двух
бластомерах делящегося эмбриона с помощью
флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Обычно эта методика применяется для
повышения частоты наступления беременности и
родов в ЭКО, как у пациентов общей группы, так
и при специфических показаниях. ПГС следует
отличать от предимплантационной диагностики
(ПГД), под которой обычно понимают
определение наличия или отсутствия
носительства генетической мутации.
Сравнительный анализ ПГС и ПГД
Предимплантационный генетический Предимплантационная генетическая
скрининг (определение числа
диагностика
хромосом методом FISH)
- Общая группа пациентов
ЭКО/ИКСИ
Генетические болезни (аутосомные
ПЦР, связанные с Х-хромосомой –
FISH)
-
- Старшая возрастная группа
- HLA- типирование
- Несколько неудачных попыток в
анамнезе
- Диагностика заболеваний (раннего
рака и т.д.)
- После применения ИКСИ/ТЕЗА
- Транслокации (FISH)
FISH
Стандартный набор хромосом, соответствующий
«теории нелетальной мутации».





Х хромосома – синдром ШершевскогоТернера – 45, ХО
Y хромосома – синдром Клайнфельтера –
47, XXY
13 хромосома – синдром Патау – 47, +13
18 хромосома – синдром Эдвардса – 47, +18
21 хромосома – сидром Дауна – 47, +21
Анализ кариотипа генетического
материала выкидышей в сроке от
пяти до 12 недель беременности
Выбор числа хромосом для FISH





Ограничение методики – возможно определение только 5
хромосом за один цикл гибридизации
Выбор хромосом для первого цикла гибридизации –
13,18,21, X,Y.
Выбор хромосом для второго цикла более сложен – 22, 14,
15, 16,17, 9, 7,1 и др.
Неизвестно распределение хромосом по частоте
анеуплоидии и динамика изменения встречаемости
анеуплоидии на разных этапах развития эмбриона.
В любом случае методика FISH не может включить в себя
определения 24 типов хромосом встречающихся в
эмбрионах человека.
Многообещающие результаты серии
случаев и контролируемых исследований
без рандомизации
Девиз доказательной медицины
From eminence based medicine to
evidence based medicine
От медицины основанной на
авторитетах к медицине
основанной на доказательствах
Иерархия доказанности в клинической практике в эпоху
доказательной медицины
Список рандомизированных контролируемых
исследований по изучению эффективности ПГС у
пациенток ЭКО.












Meyer LR, Klipstein S, Hazlett WD, Nasta T, Mangan P, Karande VC. A prospective randomized controlled trial of preimplantation genetic
screening in the "good prognosis" patient. Fertil Steril. 2009 May;91(5):1731-8.
Hardarson T, Hanson C, Lundin K, Hillensjö T, Nilsson L, Stevic J, Reismer E, Borg K, Wikland M, Bergh C. Preimplantation genetic screening
in women of advanced maternal age caused a decrease in clinical pregnancy rate: a randomized controlled trial. Hum Reprod. 2008
Dec;23(12):2806-12.
Schoolcraft WB, Katz-Jaffe MG, Stevens J, Rawlins M, Munne S. Preimplantation aneuploidy testing for infertile patients of advanced maternal
age: a randomized prospective trial. Fertil Steril. 2009 Jul;92(1):157-62.
Staessen C, Platteau P, Van Assche E, Michiels A, Tournaye H, Camus M, Devroey P, Liebaers I, Van Steirteghem A. Comparison of blastocyst
transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: a prospective
randomized controlled trial. Hum Reprod. 2004 Dec;19(12):2849-58.
Blockeel C, Schutyser V, De Vos A, Verpoest W, De Vos M, Staessen C, Haentjens P, Van der Elst J, Devroey P. Prospectively randomized
controlled trial of PGS in IVF/ICSI patients with poor implantation. Reprod Biomed Online. 2008 Dec;17(6):848-54.
Debrock S, Melotte C, Spiessens C, Peeraer K, Vanneste E, Meeuwis L, Meuleman C, Frijns JP, Vermeesch JR, D'Hooghe TM. Preimplantation
genetic screening for aneuploidy of embryos after in vitro fertilization in women aged at least 35 years: a prospective randomized trial. Fertil
Steril. 2010 Feb;93(2):364-73.
Twisk M, Mastenbroek S, Hoek A, Heineman MJ, van der Veen F, Bossuyt PM, Repping S, Korevaar JC. No beneficial effect of preimplantation
genetic screening in women of advanced maternal age with a high risk for embryonic aneuploidy. Hum Reprod. 2008 Dec;23(12):2813-7.
Mersereau JE, Pergament E, Zhang X, Milad MP. Preimplantation genetic screening to improve in vitro fertilization pregnancy rates: a
prospective randomized controlled trial. Fertil Steril. 2008 Oct;90(4):1287-9.
Staessen C, Verpoest W, Donoso P, Haentjens P, Van der Elst J, Liebaers I, Devroey P. Preimplantation genetic screening does not improve
delivery rate in women under the age of 36 following single-embryo transfer. Hum Reprod. 2008 Dec;23(12):2818-25.
Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, Sikkema-Raddatz B, Korevaar JC, Verhoeve HR, Vogel NE, Arts EG, de Vries JW, Bossuyt
PM, et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. N Eng J Med (2007) 357:9–17
Stevens J, Wale P, Surrey ES, Schoolcraft WB, Gardner DK. Is aneuploidy screening for patients aged 35 or over beneficial? A prospective
randomized trial. Fertil Steril (2004) 82:S249–S249
Jansen RP, Bowman MC, de Boer KA, Leigh DA, Lieberman DB, McArthur SJ. What next for preimplantation genetic screening (PGS)?
Experience with blastocyst biopsy and testing for aneuploidy. Hum Reprod (2008) 23:1476–1478.
Эффект предимплантационного генетического
скрининга на вероятность прогрессирующей
беременности у пациенток старшей возрастной
группы: РКИ и мета-анализ
ПГС значительно уменьшает вероятность прогрессирующей
беременности у пациенток старшей возрастной группы.
Эффект предимплантационного генетического
скрининга на вероятность родов у пациенток с
хорошим прогнозом: РКИ и мета-анализ
ПГС значительно уменьшает вероятность родов у
пациенток с хорошим прогнозом.
Эффект предимплантационного генетического
скрининга на вероятность прогрессирующей
беременности у пациенток с неоднократными
неудачами в программе ЭКО: РКИ и мета-анализ
ПГС не повышает вероятность прогрессирующей беременности
у пациенток с неоднократными неудачными попытками ЭКО.
Эффект предимплантационного генетического
скрининга на вероятность прогрессирующей
беременности у пациенток разного возраста: РКИ
ПГС не повышает вероятности прогрессирующей беременности у
пациенток разного возраста
Twisk M. и др. Отсутствие положительного эффекта ПГС у пациенток
старшей возрастной группы. Hum Reprod, т. 23, стр. 2813-7, 2008
Эффект предимплантационного генетического
скрининга на вероятность
прогрессирующей беременности при наличии эмбрионов
разного качества: РКИ
ПГС не повышает вероятности прогрессирующей
беременности при наличии эмбрионов разного качества
Эффект предимплантационного генетического
скрининга на вероятность прогрессирующей
беременности у пациенток с наличием или
отсутствием выкидышей в анамнезе: РКИ
ПГС не повышает вероятность прогрессирующей вероятности
при наличии или отсутствием выкидышей в анамнезе
Twisk M. и др. Отсутствие положительного эффекта ПГС у пациенток
старшей возрастной группы. Hum Reprod, т. 23, стр. 2813-7, 2008
Мета-анализ влияния ПГС на частоту наступления
беременности у пациенток старшей возрастной группы
Mastenbroek S. и др. «Что ожидать дальше от ПГС? Есть ли необходимость
в большем числе РКИ?» Human Reproduction, т.23, стр. 2626-8, 2008
Гипотетическое РКИ необходимое для изменения
выводов текущего мета-анализа
Для изменения выводов текущего мета-анализа необходимо провести РКИ с
включением 6000 циклов и при условии 20% увеличения частоты наступления
беременности
Mastenbroek S. и др. «Что ожидать дальше от ПГС? Есть ли необходимость в большем числе
РКИ?» Human Reproduction, т.23, стр. 2626-8, 2008
Комментарий редактора
Предимплантационный генетический скрининг: конец дела?
Рекомендации Практического
Комитета Американского Общества
Репродуктивной Медицины
Имеющиеся доказательства не поддерживают
использование предимплантационного
генетического скрининга для повышения
вероятности родов у:
 пациенток старшей возрастной группы
 пациенток с многочисленными неудачными
попытками ЭКО в анамнезе
 пациенток с привычным невынашиванием
беременности
Практический Комитет АОРМ Предимплантационный генетический скрининг:
мнение Практического Комитета. Fertil Steril, т. 88, стр. 1497-504, 2007
Рекомендации Британского
Общества Фертильности

Имеющиеся доказательства показывают, что
предимплантационный генетический скрининг не
повышает вероятность частоты беременности и не
снижает вероятности выкидышей у пациенток
старше 35 лет. Клинические исследования
показывают, что частота родов может
значительно уменьшаться после применения
предимплантационного генетического скрининга.
Anderson RA, Pickering S. The current status of preimplantation genetic screening: British Fertility Society Policy and Practice Guidelines.
Hum Fertil (Camb). 2008 Jun;11(2):71-5. Современное состояние предимплантационного генетического скрининга: политика и
практические рекомендации Британского Общества Фертильности
БОФ: новые рекомендации по применению ПГС 12 июня 2008 г. www.fertility.org.uk
Рекомендации Американского Колледжа
Акушеров и Гинекологов

Предимплантационный генетический
скрининг анеуплоидии не увеличивает
успех ЭКО и даже может его уменьшать
Мнение Комитета АКАГ от марта 2009 года
ACOG Committee Opinion No. 430: preimplantation genetic screening for
aneuploidy. Obstet Gynecol. 2009 Mar;113(3):766-7
Причины отсутствия
положительного эффекта при
применении ПГС





Технические ограничения технологии и
возможные ошибки
Мозаицизм эмбрионов
Само-коррекция эмбрионов
Определение ограниченного числа
хромосом при FISH
Отрицательное влияние биопсии на
дальнейшее развитие эмбриона
Само-коррекция эмбриона
Само-коррекция – это физиологический феномен, при
котором эмбрион с наличием анеуплоидии в одном или
двух бластомерах, может оказаться абсолютно нормальным
при культивировании до стадии бластоцисты. Частота
само-коррекции может достигать 71% (Munne и др., 2005).
Данный феномен связан с мозаицизмом и хромосомной
нестабильностью человеческих эмбрионов.
Magli MC, Jones GM, Gras L, Gianaroli L, Korman I, Trounson AO. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that develop to morphologically
normal blastocysts in vitro. Hum Reprod (2000) 15:1781–1786.
Li M, DeUgarte CM, Surrey M, Danser H, DeCherney A, Hill DL. Fluorescence in situ hybridisation reanalysis of day-6 human blastocysts diagnosed with
aneuploidy on day 3. Fertil Steril (2005) 84:1395–1400.
Munne S, Velilla E, Colls P, Garcia Bermudes M, Vemuri MC, Steuerwald N, Garrisi J, Cohen J. Self-correction of chromosomally abnormal embryos in culture
and implications for stem cell production. Fertil Steril (2005) 84:1328–1334.
Fragouli E, Lensi M, Ross R, Katz-Jaffe M, Schoolcraft WB, Wells D. Comprehensive molecular cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Hum
Reprod (2008) 23:2596–2608
Barbash-Hazan S, Frumkin T, Malcov M, Yaron Y, Cohen T, Azem F, Amit A, Ben-Yosef D. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in
correlation with their developmental potential. Fertil Steril (2009) 92:890–896
Comparative genomic hybridization (CGH) – сравнительная геномная
гибридизация (СГГ)
В настоящее время различают 2 типа СГГ – на хромосоме и СГГ на
микрочипе (CGH array)
Sanlaville D. и др. Молекулярное кариотипирование в конституциональной
цитогенетике человека. European Journal of Medical Genetics, т.48, стр. 214-31, 2005
Относительная частота анеуплоидии в ооцитах и
бластоцистах у пациенток с многочисленными
неудачами ЭКО (данные СГГ)
Fraguoli E. и др. Углубленный хромосомный скрининг полярных
тел и бластоцист у пациенток с с многочисленными неудачами
ЭКО. Fertility and Sterility, 2010, in press
Методы применяемые для определения
хромосомных изменений при хромосомной
нестабильности
Метод
Хромосомные изменения
Флуоресцентная гибридизация in
situ (FISH) по отдельным
хромосомам
ПХА, триплоидия
Сравнительная геномная
гибридизация (СГГ, CGH)
ПХА, ЧХА
Одиночный нуклеотидный
полиморфизм (ОНП-SNP- анализ)
ПХА, ЧХА, триплоидия,
ПГЗ, ПГЗ без изменения числа
хромосом
ПХА – полная хромосомная анеуплоидия, ЧХА – частичная хромосомная
анеуплоидия, ПГЗ – потеря гетерозиготности
Geigl J. и др. Определение «хромосомной нестабильности», Trends in Genetics,
т.24, стр. 64-69, 2007
Хромосомная нестабильность- это
состояние впервые описанное при
исследовании злокачественных
опухолей, которое характеризуется
потерей или приобретением лишних
хромосом или их частей, а также
перестройкой хромосом. Обычно этот
процесс происходит при активном
митозе и является динамичным.
Выявляется методами чипирования
СГГ и SNP (полиморфизм одиночных
нуклеотидов), а также методом ВАС
(бактериальной искусственной
хромосомы).
Большинство человеческих делящихся эмбрионов содержат хромосомно
несбалансированные бластомеры
• 2/23 (9%): нормальный диплоидный набор во всех клетках
• 1/23 (4%): диплоидный, но содержали изодисомию происхождения из хромосомы
одного родителя (UPID), потеря гетерозиготности
• 8/23 (35%): мозаики диплоидные/анеуплоидные (5 эмбрионов: соотношение
диплоидных/анеуплоидных >1)
•12/23 (52%) мозаики анеуплоидные (3 эмбриона: обнаружены одинаковые аберрации
во всех клетках, мейотическое происхождение: трисомия по 15 хромосоме,
моносомия по 20 хромосоме и моносомия по 16 хромосоме))
•16 из 23 эмбрионов(70%) отмечались перестройки сегментов хромосом, и 9 из 23
эмбрионов (40%) наблюдались разрывы хромосом и слитие различных хромосом с
образование патологических форм хромосом (изохромосом)
Результаты:
FISH
SNP
Р
96%
0,04
Возможность
интерпретировать
результаты:
83%
Число генет.
диагнозов:
3,2+0,2 1,3+0,2 <0,0001
Мозаицизм:
100%
31%
0,0005
FISH является менее точным анализом,
чем SNP микрочип, и может
преувеличивать вероятность
мозаицизма в делящихся человеческих
эмбрионах
Анализ на основе SNP микрочипа, позволяющего определять 24 хромосомы,
более точен, чем FISH. Treff N. и др. Molecular Human Reproduction, т. 16, стр.
583-9, 2010
Скрининг, на основе SNP микрочипа, позволяющего определять 24 хромосомы,
демонстрирует, что FISH анализ на стадии дробящегося эмбриона плохо
предсказывает наличие анеуплоидии в тех эмбрионах, которые достигли стадии
бластоцисты и имеют нормальную морфологию.
Northrop L. и др. Molecular Human Reproduction, т. 16, стр. 583-9, 2010
FISH: 13, 15, 16, 17, 18,
21, 22, X и Y
29 бластоцист (58%)
эуплоидные во всех
проекциях
12 бластоцисты
(24%) имеют
анеуплоидию
отличную от FISH
9 бластоцист (18%)
совпали результаты
с FISH
SNP анализ из 4
участков
бластоцисты: три
трофэктодермы(ТЭ)
и один внутренней
клеточной
массы(ВКМ)
50
бластоцист
Выводы



С точки зрения доказательной медицины, применение
ПГС не приводит к увеличению вероятности родов, более
того эта вероятность может быть уменьшена
Тщательные молекулярно-биологические исследования с
применением методик СГГ и СГГ-SNP показали, что
традиционный ПГС не отражает хромосомной
конституции человеческого эмбриона
Причиной этого являются технические недостатки ПГС –
вероятность ошибки или отсутствие возможности
интерпретировать результат, а также неадекватный выбор
исследуемых хромосом, мозаицизм и самокоррекция
эмбриона.
Выводы



Ведущие медицинские организации Северной Америки и
Европы признали, что традиционный ПГС не может быть
признан методикой повышающей эффективность ВРТ.
Учитывая тот факт, что все РКИ однозначно показали
неэффективность ПГС и дальнейшее проведение РКИ
признано нецелесообразным, пациенты должны быть
предупреждены об отсутствии научных данных о
клинической значимости этого метода.
Новые более точные методики, такие как СГГ и СГГ-SNP
должны быть проверены на клиническую эффективность.
Также перспективным является анализ хромосомного
состава полярных тел, а также анализ клеток бластоцисты.
Jacobs PA, Hassold TJ.
The origin of numerical chromosome abnormalities.
Adv Genet. 1995;33:101-33.
Зависимость от возраста вероятности наличия ооцитов с нормальным
хромосомным набором и с анеуплоидией (проанализировано 1397 ооцитов).
Причины прерывания беременности после ЭКО и ИКСИ: анализ
клинических и цитогенетических данных.
Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н., Леонченко В.В. Журнал Акушерства
и Женских болезней, т. 57, №4, стр. 73-75, 2008
При анализе по пяти хромосомам
(13,18,21,X,Y) в 78,3% случаев причина
выкидыша не была бы выявлена.
Хромосомная патология
Абсолютное
число
%
Триплоидия
(69, XXY)
1
4,3%
Моносомия
(45, X0
45,XY -21)
2
9,6%
1
4,3%
19
82,6%
6
26,1%
4
17,4%
3
13%
2
9,6%
1
4,3%
1
4,3%
1
4,3%
1
4,3%
Трисомия
по
хромосомам
(48, XX, +13, +14)
Трисомии
из них:
по 16 хромосоме
(4 случая 47, XX, +16 и 2
случая 47, XY, +16)
по 22 хромосоме
(2 случая 47, XX, +22 и 2
случая 47, XY, +22)
по 15 хромосоме
(2 случая 47, XX, +15 и 1
случай 47, XY, +15)
по 21 хромосоме, 2
случая,
(47, XY, +21)
по 9 хромосоме
47, XY, +9
по 14 хромосоме
47, XY, +14
по 18 хромосоме
47, XX, +18
по 20 хромосоме (47, XY,
+20)
2
Нерасхождение хромосом в первом и во втором делениях мейоза
Варианты нерасхождения хромосом во время митоза