Работа 1.
реклама
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАКУЛЬТЕТА ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ПО КУРСУ: "БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ" Методические указания по курсу: "Биологическая химия" предназначены для использования при выполнении лабораторных работ и самостоятельной подготовки студентов факультета ветеринарной медицины по направлениям «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза» Ставрополь, 2013 г. ВВЕДЕНИЕ Биохимия животных изучает химический состав организма животного, обмен веществ и энергии в нем. Успехи биохимии превратили ее из науки описательной в науку преобразующую. Знание биохимических процессов поможет специалисту направленно влиять на обмен веществ с целью повышения продуктивности животных, диагностики заболеваний и организации лечебных мероприятий, эффективного использования кормов и добавок биологически активных веществ. В биохимических отделах и лабораториях для контроля за состоянием обмена веществ у животных используют современные биохимические и биофизические методы – электрофорез, фотоколориметрию, спектрофотометрию, хроматографию, полярографию и др. Задачей биологической химии является изучение теоретических основ и обучение студентов практическим навыкам для проведения таких исследований и анализа полученных результатов. Студенты, получив на лекциях в кратком виде основы теоретических знаний, самостоятельно проработав учебный материал и конспекты, на лабораторных занятиях путем беседы с преподавателем показывают, как они разобрались в этих разделах дисциплины и что требуют дополнительной проработки. Лабораторный практикум позволит студентам освоить основные методики биохимических исследований с использованием таких приборов, как рН-метр, рефрактометр, фотоколориметр, аппарат для электрофореза, и на основании теоретических знаний, расшифровать полученные результаты. ПРАВИЛА ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ В ХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Приступая к работе в лаборатории, необходимо внимательно изучить возможные причины несчастных случаев и меры их предупреждения. В химической лаборатории разрешается работать только в халатах. В помещении лаборатории необходимо поддерживать порядок и чистоту, соблюдать тишину. Запрещается пить воду, принимать пищу, курить, пробовать на вкус химические вещества. По окончании пользования газом, водой и электричеством немедленно закрыть краны и выключить электроприборы. Перед тем, как набрать какой-либо химический реактив, внимательно прочтите надпись на этикетке. Крышки и пробки от банок и флаконов нужно класть на стол поверхностью, не соприкасающейся с реактивом, а по окончанию пользования реактивом закрыть флаконы той же пробкой. Определяя запах вещества, нужно направлять струю воздуха в сторону носа легкими движениями кисти руки над отверстием пробирки. Избегать контакта с любыми неорганическими и органическими реактивами. Неиспользованные химические реактивы нельзя возвращать в ту же склянку. Порезы рук стеклом часто происходят при закрывании пробирки пробкой с газоотводной трубкой. Следует запомнить, что нужно прилагать лишь небольшие усилия, держась за резиновую пробку, но не за трубку. В случае пореза ранку промывают водой, очищают от осколков стекла и смазывают спиртовым раствором иода. При термическом ожоге нужно обожженное место смочить 5% раствором танина в 40% этиловом спирте. При ожоге крепкими кислотами следует немедленно промыть обожженный участок большим количеством воды, затем наложить компресс из ваты, смоченной 1% раствором содой. При ожоге щелочами – действия те же, но компресс 1% раствор уксусной кислоты. При попадании кислоты или щелочи в глаза, их обильно промывают водой, а затем 2% раствором борной кислоты (для нейтрализации щелочи), либо 2% раствором гидрокарбоната натрия (для нейтрализации кислоты). При небольших ожогах фенолом пораженный участок кожи смазывают глицерином. Причина выброса – нагревание жидкости выше температуры кипения. Вероятность перегрева увеличивается при нагревании пробирки на открытом пламени, особенно при наличии в жидкости осадка. Для предотвращения выброса реакционной смеси необходимо: – перед нагреванием в реакционную смесь добавить кипятильный камешек; – пробирку нагревать в наклонном положении, а не вертикально; – при нагревании вращать пробирку вдоль оси, иногда осторожно встряхивая; отверстие пробирки направлять в сторону от себя и от соседа. Работу с ядовитыми веществами и концентрированными кислотами, щелочами следует проводить в вытяжном шкафу, предварительно включив тягу, при этом не вводить голову внутрь шкафа. Растворы сильных кислот и щелочей, а также ядовитых веществ отмеривать только цилиндрами, а не пипетками. При работе с кислотами надо твердо помнить правило смешивание крепкой серной кислоты с водой – кислоту вливать в воду небольшими порциями, а не наоборот. ОФОРМЛЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ЖУРНАЛА Во время лабораторных занятий студент обязан кратко записывать методику и результаты опытов в специальной тетради. Рекомендуется следующая форма записи лабораторных работ (в тетради на развернутом листе): Название темы______________________ Дата_______________________________ Назв ание Уравнени е Опы та 1 Методик а основной реакции ия 2 Результат Выводы ы выполнен опыта опыта 3 4 5 Графы NN 1, 2, 3 заполняются дома при подготовке к занятию, графы 4 и 5 – в лаборатории после проведения каждого опыта. Писать уравнения химических реакций (графа 2) следует, пользуясь структурными формулами с развернутым изображением функциональных групп. Методика выполнения опыта (графа 3) описывается кратко и по существу. Результат опыта (графа 4) записывается одной фразой, например: выпадает осадок синего цвета, выделяется газ и т.д. Выводы из каждого опыта (графа 5) должны быть хорошо продуманными, краткими. ЗАДАНИЕ 1 ТЕМА: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ И БЕКОВ. Аминокислотами называются соединения, в молекулах которых содержатся одновременно аминные и карбоксильные группы. Для аминокислот характерна изомерия углеродного скелета, положения аминогруппы по отношению к карбоксилу и оптическая изомерия. В природе в основном распространены - аминокислоты L - ряда, являющиеся структурными единицами белков. При изучении данной темы следует ознакомиться с основными способами получения аминокислот: гидролиз белков, реакция взаимодействия моногалогензамещенных карбоновых кислот с аммиаком, а также оксинитрильный синтез. Следует обратить внимание на то, что аминокислоты являются бифункциональными соединениями и проявляют амфотерные свойства. По карбоксильной группе протекают реакции образования солей, сложных эфиров, галогенангидридов, а по аминогруппе – реакции алкилирования, ацилирования, взаимодействия с азотистой кислотой. Работа 1. Определение рН водных растворов аминокислот. На полоску индикаторной бумаги нанести отдельно по капле 0,1% раствора глицина, аспарагиновой кислоты и лизина. Определить pH с помощью универсального индикатора. Полученные результаты занести в таблицу: Название рН Формула аминокислоты К какой группе по классификации относится данная аминокислота Глицин Аспарагиновая кислота Лизин Объясните, почему растворы исследуемых аминокислот имеют различное значение рН? Работа 2. Окраска растворов аминокислот нингидрином. Эта окраска характерна для аминогрупп, находящихся в α-положении. Все аминокислоты, взаимодействуя с нингидрином, образуют продукты, окрашенные в синий или фиолетовый цвет. Эту окраску дают также и белки. Ход работы: Смешивают в пробирке по 0,3 мл 1% раствора глицина и 0,2% спиртового раствора нингидрина. Нагревают пробирку и отмечают появление синего окрашивания. Повторяют опыт, взяв вместо глицина раствор белка. В этом опыте окраска появляется медленнее и она менее интенсивна, так как белок имеет меньше свободных аминогрупп не единицу массы по сравнению с аминокислотами. Работа 3. Образование комплексной медной соли глицина Помещают в пробирку 1 микрошпатель оксида меди (II) (13) и добавляют 5 капель раствора глицина (108). Пробирку нагревают в пламени газовой горелки и оставляют в штативе на 1-2 минуты, дав отстояться избытку черного порошка. Обращают внимание на образование темно-синего раствора медной соли глицина. К отстоявшемуся синему раствору прибавляют 2 капли раствора NаОН (26). Выпадает ли осадок гидроксида меди (II)? Объясните результаты опыта. Работа 4. Действие формальдегида на аминокислоты В пробирку помещают 3 капли раствора формалина (75), добавляют 2 капли раствора индикатора метилового красного (109). Наблюдается красное окрашивание. В пробирку прибавляют NаОН (26) до тех пор, пока раствор приобретет желтый цвет (нейтральная реакция). К полученному раствору добавляют 2-3 капли глицина (108). Наблюдают появление красного окрашивания, свидетельствующее об образовании метиленаминокислоты. Работа 5. Количественное определение аминокислот методом формольного титрования. Аминокислоты в водных растворах образуют внутримолекулярные соли, поэтому без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот щелочью невозможно. В процессе реакции с формальдегидом аминогруппа теряет свои основные свойства. Образующееся метиленовое производное (метиламинокислота) легко может быть оттитровано щелочью. Метод формольного титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучать действие протеолитических ферментов. Ход работы: В колбочку отмеривают 3 мл раствора глицина (задача), добавляют 1 каплю фенолфталеина и титруют 0,1 N NаОН до появления слабо розовой окраски. Затем в этот нейтральный раствор глицина отмеривает пипеткой 2 мл формольной смеси и розовая окраска раствора исчезает. Титруют 0,I N раствором NaOH до появления розового окрашивания, затем добавляют еще 4 капли NaOH для получения рН = 8. Отмеряют количество 0,1 N раствора NaOH, израсходованного на титрование после добавления формольной смеси и производят вычисления. Расчет: а) 1.мл 0,1 N NaOH соответствует 1,4 мг азота. Умножив количество миллилитров щелочи, пошедшей на титрование на 1,4 узнаем количество аминного азота в миллиграммах в 3 мл раствора глицина (задача.). Это число мг переводим в граммы. б) По количеству азота находим количество кислоты, исходя из того, что в молекуле глицина имеется 1 атом азота, с атомной массой 14, а молекулярная масса глицина - 75. 75 – 14 Х – аГ. Х = (аГ · 75)/14 в) После этого узнаем процентное содержание глицина по пропорции: в 3 мл - х в 100 мл - % глицина Примечание. Метод формольного титрования в сущности прост, но надо помнить, что правильный результат можно получить с моноаминомонокарбоновыми кислотами жирного ряда. Диаминокислоты дают заниженные данные, а дикарбоновые кислоты и тирозин, наоборот завышенные. Работа 6. Реакция аминокислот с азотистой кислотой Помещают в пробирку 3-4 капли раствора глицина (108) и добавляют 2-3 капли концентрированной соляной кислоты (42) и 4-5 капель раствора (53). При встряхивании содержимого пробирки наблюдают выделение газообразного азота. (Сравните с опытом №3, тема 15). Работа 7. Цветная реакция на тирозин В пробирку помещают 2-3 капли раствора сернокислой соли тирозина (111) и добавляют 4-5 капель реактива Миллона (112). Пробирку встряхивают и оставляют стоять в штативе на несколько минут. Наблюдают окрашивание раствора в кроваво-красный цвет. Для ускорения появления окраски пробирку с раствором слегка подогревают в пламени газовой горелки. Работа 8. Цветная реакция на гистидин В пробирку помещают 4-5 капель сульфаниловой кислоты (113) и добавляют 5 капель раствора NaNO2 (53). Пробирку встряхивают и немедленно прибавляют 3 капли раствора гистидина (116). Затем при повторном встряхивании содержимого пробирки в нее добавляют по каплям NаОН (26) до появления интенсивной вишнево-красной окраски сульфобензолазогистидина. Метод хроматографии. Хроматографией называется физико-химический метод разделения смеси веществ, заключающийся в распределении компонентов смеси потоком подвижной фазы по слою адсорбента. Вследствие различия коэффициентов распределения для отдельных компонентов смеси между подвижной фазой (жидкость или газ) и неподвижной, происходит селективное распределение хроматографируемых веществ в слое сорбента в виде отдельных зон. В зависимости от характера взаимодействия между адсорбентом и находящимся в подвижной фазе веществом различают адсорбционную, распределительную и ионообменную хроматографию. При адсорбционной хроматографии происходит физическая сорбция растворенного вещества поверхностью твердой фазы. В распределительной хроматографии разделяемые компоненты распределяются между двумя жидкими фазами, одна из которых закреплена на поверхности твердого носителя. В ионообменной хроматографии в качестве сорбента применяются ионообменные смолы – полиэлектролиты, содержащие основные (-NН2, -NН) или кислотные (-СОOH, -SOН, -SН)– группы и процесс основан на обратимом ионном обмене между сорбентом и разделяемыми компонентами смеси. По технике выполнения различают хроматографию бумажную, колоночную и тонкослойную. Основной задачей любого хроматографического процесса является разделение исследуемой смеси на отдельные компоненты. Данный метод применяется для качественного и количественного анализа сложных смесей, препаративного выделения различных веществ, их идентификации, концентрирования из разбавленных растворов. Метод хроматографии в тонком слое (ТСХ) экономичный и простой, широко используется в различных областях органической, аналитической и биологической химии. Для хроматографирования в тонком слое используют пластинки из стекла или алюминиевой фольги со слоем адсорбента (силикагель, оксид алюминия). На стартовую линию наносят капилляром в виде небольших пятен, не более 2-3 мм в диаметре, раствор разделяемой смеси и раствор известного вещества – «свидетель». Край пластинки помещают ниже стартовой линии в систему растворителей, налитую на дно хроматографической камеры или эксикатора. Под действием капиллярных сил растворитель движется по пластинке. Разделяемые компоненты диффундируют и распределяются на зоны. Пластинку сушат и проявляют специальными методами. В тонкослойной хроматографии важной характеристикой степени разделения хроматографируемых соединений является величина Rf – отношение расстояния от центра пятна на пластинке до линии старта – Х к расстоянию – Y, пройденному растворителем – от линии старта до линии фронта (рис. 1). Rf = х/у. Рис. 1. ТСХ (тонкослойная хроматография) Величина Rf является константой данного соединения при постоянных условиях хроматографии. Работа 9. Качественный и количественный анализ аминокислот с помощью автоматического хроматографа Анализатор служит для качественного и количественного анализа аминокислот методом ионообменной хроматографии на ионитах. Анализ аминокислот проводят в двух видах образцов: в гидролизатах белков и физиологических жидкостях. В гидролизатах прибор определяет каждую из присутствующих аминокислот. Анализ физиологических растворов и тканевых экстрактов представляет определение более 60 веществ, включая свободные аминокислоты и пептиды Анализатор находит применение в биохимических лабораториях, в исследованиях питания человека и животных, в пищевой и кормовой промышленностях, в здравоохранении, в диагностике. Принцип ионообменной хроматографии. Образец состоит из смеси аминокислот. Разделение смеси на отдельные компоненты осуществляется на хроматографической колонне, которая представляет собой трубку заполненную ионообменником. Это очень мелкие частицы синтетической смолы в форме шариков. Образец протекает через колонну с помощью буферного раствора, при этом вследствие различного сродства отдельных аминокислот по отношению к иониту кислоты проходят в колонне с различным запаздыванием, т.е. компоненты с меньшим сродством к иониту выходят из колонны первыми. После разделения смеси аминокислот на отдельные компоненты проводится их определение с раствором нингидрина, который в соединении с аминокислотами и некоторыми другими соединениями дает характерную окраску. Буферный раствор, вытекающий из колонны, непрерывно смешивают с раствором нингидрина, при этом имеет место цветная реакция аминокислот с нингидрином. При определенной длине волны проводят постоянные измерения, результаты регистрируются в форме пиков абсорбции света элюатом из колонны, которая количественно прямо пропорциональна концентрации данного вещества в растворе. Проведением анализа калибровочной смеси известного состава и известной концентрации при постоянных элютивных условиях определяем время прохождения отдельных компонентов смеси и одновременно определяем для каждого компонента в смеси его константу. Константа служит для качественного и количественного определения данного вещества в неизвестной смеси, то есть для количественной оценки хроматограммы. В результате получается аминограмма, которая, рассчитывается автоматически. Одновременно определяется содержание 17 аминокислот. Следует обратить внимание на качественные реакции белков: биуретовая, ксантопротеиновая, нингидриновая и реакция с реактивом Миллона. Работа 10. Осаждение белков ионами тяжелых металлов. При необратимых реакциях осаждения белки подвергаются глубоким изменениям, происходит денатурация белка с разрушением его структуры. К таким реакциям относятся реакции осаждения белков солями тяжелых металлов, алкалоидами, минеральными и органическими кислотами и при нагревании. Осадок белка не растворяется в избытке первоначального растворителя. Полное и быстрое осаждение белков происходит в изоэлектрической точке. Под влиянием ионов солей тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) белки из состояния золя необратимо коагулируют в гель, ионы солей тяжелых металлов с белками образуют прочные комплексные соединения. Кроме того, тяжелые металлы снижают электрический заряд и, очевидно, глубоко изменяют вторичную и третичную структуру макромолекулы белка. Ход работы: В 2 пробирки наливают по 1-2 мл раствора белка. Прибавляют по каплям в первую пробирку раствор уксусного свинца, во вторую – CuSO4. В пробирках образуется осадок белков. Работа11. Окраска растворов белков нингидрином. Все белки, взаимодействуя с нингидрином, образуют продукты, окрашенные в синий или фиолетовый цвет. Ход работы: Смешивают в пробирке по 0,3 мл 1% раствора белка и 0,2% спиртового раствора нингидрина. Нагревают пробирку и отмечают появление синего окрашивания. В этом опыте окраска появляется медленнее и она менее интенсивна, чем у аминокислот, так как белок имеет меньше свободных аминогрупп не единицу массы. Работа 12. Обнаружение в молекулах белков пептидных связей (биуретовая реакция) В пробирку помещают 3-4 капли раствора белка (117), добавляют 2-3 капли CuSO4 (58) и затем 4 капли раствора NaOH (26). Наблюдают краснофиолетовое окрашивание. Объясните результаты опыта. Работа 13. Ксантопротеиновая реакция К 3-5 каплям раствора белка (115) добавляют 2-3 капли концентрированной HNO3 (27). При этом наблюдается появление белого осадка денатурированного белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в желтый цвет. Объясните результаты опыта. Работа 14. Реакция с реактивом Миллона В пробирку помещают 4-5 капель раствора белка (115) и добавляют 5-6 капель реактива Миллона (112). Белок свертывается под действием солей ртути и азотной кислоты, входящих в реактив, образуя сгусток белого цвета. При нагревании пробирки в пламени горелки осадок окрашивается в кирпично-красный цвет. Работа 15. Нитропруссидная реакция на белок В пробирку помещают 8-10 капель раствора белка (115) и добавляют столько же капель насыщенного раствора сульфата аммония (116) и 1 каплю раствора нитропруссида натрия (19). Затем раствор подщелачивают 5-8 каплями раствора аммиака(82). При наличии в белке остатков молекул аминокислоты цистеина развивается пурпурное окрашивание. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ. Что такое аминокислоты? Как они классифицируются? 2. Написать структурные формулы всех аминокислот, содержащихся в белках животного происхождения, выделив цветным карандашом амино- и карбоксильные группы. 3. Перечислите основные физико-химические свойства аминокислот. 4. Каково современное представление о структуре белковой молекулы? Типы связей в молекуле белка. 5. Классификация белков. Перечислите группы простых и сложных белков. 6. Напишите образование пептидной связи при взаимодействии глицина и аланина, валина и лизина. ЗАДАНИЕ 2 ТЕМА: ФИЗИКО – ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Белки представляют собой природные высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, построенные из остатков аминокислот. Белки широко распространены в природе и играют первостепенную роль во всех явлениях жизни. В организме человека и животных они выполняют самые разнообразные функции (строительную, каталитическую, транспортную, защитную и др.) Белки делятся на две основные группы: протеины или простые белки, состоящие только из остатков -аминокислот и протеиды – сложные белки, построенные из белковой части и небелковой, называемой простетической группой. Особое внимание следует обратить на полипептидную теорию строения белковых молекул. В структуре белков выделяют четыре организационных уровня. Первичная структура представлена последовательностью остатков аминокислот в полипептидной цепи и осуществляется взаимодействием аминогруппы и карбоксильных групп с образованием пептидной связи. Вторичная структура определяется способом скручивания полипептидной цепочки в пространстве и в белках в основном представлена спиралью. Третичная и четвертичная структуры отражают целостное представление о строении молекулы. Белки имеют большую молекулярную массу. Большинство из них растворимы в воде, но образуют, как правило, коллоидные растворы. При нагревании с кислотами и щелочами, а также под действием протеолитических ферментов белки подвергаются ступенчатому гидролизу. Работа 1. Высаливание белков сульфатом аммония. К 2 мл раствора яичного белка для высаливания добавляют столько же насыщенного раствора (NH4)2SO4. В этих условиях глобулиновые функции белка делаются нерастворимыми и выпадают в осадок или в жидкости появляется помутнение. Осадок отфильтровывают и к фильтрату, добавляют порошок (NH4)2SO4 до полного насыщения раствора, чтобы на дне пробирки оставался осадок названной соли. Содержимое пробирки мутнеет и наблюдается выпадение в осадок альбуминов. Через 5-10минут осадок отфильтровывают. Убеждаются в отсутствии белка в фильтрате проделывая биуретовую пробу. К 1-2 мл фильтрата добавляют 1 мл 10% раствора NаОН и 1-2 капли 1% раствора CuSO4. Делая биуретовую реакцию нужно учесть, что ион аммония, имеющийся в фильтрате, образует с медью комплекс темно-синего цвета. Чтобы не оценивать эту реакцию ошибочно, как биуретовую, напомним, что для положительной биуретовой реакции характерно фиолетовое окрашивание. Объясните, почему сначала «высаливаются» глобулины, а затем альбумины? Работа 2. Осаждение белков кипячением. Наливают в 5 пробирок по 2 мл. раствора белка. Первая пробирка служит контролем. Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% СН3СООН, В третью – добавляют 0,5 мл 10% СН3СООН в четвертую – 0,5 мл 10% СН3СООН и 3-4 капли насыщенного раствора NаCl. В пятую пробирку добавляют 0,5 мл 10% раствора NaOH. Все пробирки нумеруют и нагревают до кипения. Отмечают, в каких пробирках появился осадок. Интенсивность образования осадка отмечают количеством плюсов (от одного до трех). Результаты опыта представляют в виде таблицы: № Белок, 1% проби мл СН3СООН, рки капли 1 2 2 2 1 3 2 4 2 5 2 Сделать выводы. 10% 10% СН3СООН, NаОН, мл мл 0,5 0,5 0,5 NаCl, капли Наличие осадка 3-4 - Работа 3. Реакция осаждения белков В четыре пробирки помещают по 10 капель раствора белка (115) и добавляют по 8 капель-в одну раствора уксуснокислого свинца (18), во вторую – раствора соляной кислоты (17), в третью – раствора фенола (66 ), в четвертую – формалина (75). Наблюдается выпадение осадков белка. Работа 4. Выделение дезоксирибонуклеопротеида из селезенки и качественная реакция на ДНК. Дезоксирибонуклеопротеиды являются составной частью клеточных ядер и их еще называют ядерными нуклеопротеидами. Лучше всего получать нуклеопротеиды из тканей, богатых клеточными ядрами (лейкоциты, сперматозоиды, вилочковая железа, лимфатические узлы, селезенка, печень, белковый отдел яйцевода птиц). Характерным свойством ядерных нуклеопротеидов является их способность образовывать очень вязкие растворы в крепких растворах солей (например, в молярном растворе NаCl,) и нерастворимость в разведенных солевых растворах. При осаждении из солевых растворов ядерные нуклеопротеиды коагулируют в виде нитей. Ход работы: 2-5 г ткани (селезенки) предварительно измельчают ножницами, затем тщательно растирают пестиком в ступке с толченым стеклом в течении 10-15 минут. Небольшими порциями в ступку добавляют 70 мл (точно!) 1 N раствора NaCl. Полученный однородный гомогенат сливают в большой центрифужный стакан и центрифугируют в течение 10 минут при 2500 - 3000 об/мин. Центрифугат сливают в цилиндр, измеряют его объем и в большой химический стакан отмеривает шестикратный объем дистиллированной воды. Затем тоненькой струйкой, медленно выливают центрифугат в стакан с водой, стараясь намотать образующиеся нити ядерного нуклеопротеида на деревянную палочку. Осторожно переносят их в химическую пробирку и используют для качественной реакции на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). ДНК дает ряд цветных реакций, по которым ее можно отделить от РНК. Эти реакции обусловлены наличием в молекуле ядерной нуклеиновой кислоты дезоксирибозы. Для обнаружения ДНК наиболее широко используется реакция с дифениламином, который дает с дезоксирибозой и ДНК синее окрашивание. Рибоза и РНК с дифениламином дают зеленую окраску. Ход работы: Немного осадка дезоксирибонуклеотида перенести в пробирку и растворить в 1 мл 0,4% раствора NaOH. Добавить равный объем дифениламинового реактива (до растворения осадка) и поставить в кипящую водяную баню на 15-20 минут. Наблюдается синее окрашивание, Работа 5. Получение РНК - нуклеопротеида из дрожжей и качественная реакция на РНК. Дрожжи богаты нуклеопротеидами рибозного типа. Нуклеопротеиды можно извлечь из разрушенных клеток дрожжей при щелочной реакции раствора и осадить подкислением. Ход работы: 5 г дрожжей помешают в ступку, добавляют 10 капель эфира и 10 капель воды. Вносят щепотку толченого стекла и тщательно растирают в течение 10-15 минут. Затем в ступку прибавляют постепенно, небольшими порциями 30 мл (точно!) 0,4% раствор NaOH и продолжают растирать. Затем гомогенат переносят в малый центрифужный стакан и центрифугируют в течении10 минут при 2500 - 3000 об/мин. Центрифугат сливают в химический стакан, прибавляют 12 мл (точно!) 5 % раствора уксусной кислоты до полного осаждения нуклеопротеида. Осадок нуклеопротеида собирают при помощи повторного центрифугирования (10 минут при 2500 - 3000 об/мин.). Центрифугат выливают, а с осадком проделывают качественную реакцию. К полученному осадку РНК прибавить 1 мл 0,4 % раствора NaOH и после встряхивания перенести в химическую пробирку, добавить 1 мл дифениламинового реактива (до растворения осадка) и поместить в кипящую водяную баню на 15-20 минут. Наблюдается зеленое окрашивание. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ. 1. Охарактеризуйте основные физико-химические свойства белков 2. Что такое нуклеопротеиды, и из каких компонентов они состоят? 3. Какие азотистые основания входят в состав ДНК и РНК? 4. Какие углеводы входят в состав ДНК и РНК? 5. Что такое нуклеиновая кислота и как она построена? Напишите схемы строения нуклеиновых кислот (РНК и ДНК). 6. Какие биохимические функции выполняют ДНК и РНК? КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ: ХИМИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ. ЗАДАНИЕ 3 ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ. ОБЩИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ. Работа 1. Влияние температуры на активность амилазы. При реакциях, катализируемых ферментами, как и при химических реакциях вообще, по мере повышения температуры растет скорость реакции, но так как ферменты являются белками, которые при высокой температуре могут необратимо денатурироваться, то для ферментативной реакции характерно то, что повышение температуры сначала приводит к увеличении скорости реакции, а затем быстрому ее снижению и разрушению ферментов. Полисахарид крахмал под влиянием фермента амилазы подвергается гидролизу по схеме: Ход работы: Берут два ряда пробирок по 4 пробирки в каждом ряду и во все пробирки первого ряда (с 1 по 4) вносят по 10 мл 0,5 % раствора крахмала, а во все пробирки второго ряда (с 5 по 8) вносят по 10 капель разведенной в 10 раз слюны. Пробирки 1 и 5 ставят на 10 минут в холодную воду со льдом, 2 и 6 оставляют в штативе при комнатной температуре, 3 и 7 ставят в водяную баню с температурой 37°, а 4 и 8 - в кипящую воду. Через 10 минут сливают вместе содержимое пробирок 1 и 5; 2 и 6; 3 и 7; 4 и 8, тщательно перемешивают и оставляют стоять 10 минут в тех же условиях. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 капли раствора йода. Результаты опыта записывают в виде таблицы. № пробирки 1и5 2и6 3и7 Температура 0 20° 37° Окраска с йодом 4и8 100° Сделать выводы. Работа 2. Влияние рН на активность амилазы. Активность ферментов меняется в зависимости от величины рH. Для различных ферментов оптимум рН различен. Ход работы: В трех пронумерованных пробирках приготавливают фосфатные буферные смеси с различным значением рН по следующей схеме: Реактивы 1/15 М KH2PO4 1/15 M Na2HPO4 рН буферной смеси Окраска с йодом Номера пробирок 1 2 3 4,7 2,5 0,3 0,3 5,5 2,5 5,8 4,7 8,1 Затем в каждую из трех пробирок наливают по 5 мл 0,5 % раствора крахмала и по 1 мл разбавленной водой слюны (1:10), смешивают и помещают в термостат, при 38-40°С. Через 5 минут из второй пробирки берут несколько капель раствора на предметное стекло и проводят пробу с раствором йода. Эту операцию повторяет несколько раз (через каждые 5 минут) до тех мин, пока во второй пробирке не произойдет полное расщепление крахмала и появится желтое окрашивание с йодом Затем все пробирки охладить водопроводной водой и добавить по 2 капли йода. Содержимое пробирок окрашивается в разные цвета в соответствии с глубиной ферментативного гидролиза крахмала. Отметить оптимальное значение рН для амилазы слюны. Работа 3. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов. Каталитическое действие ферментов может усиливаться некоторыми веществами, которые называются активаторами. Например: активность пепсина повышается в присутствии соляной кислоты, липазы - в присутствии желчных кислот. Вещества, тормозящие активность ферментов, называются ингибиторами (парализаторами). Ход работы: В три пробирки наливают по 1 мл водного раствора слюны в разведении 1:10. В первую пробирку добавляют 1 каплю 1 % раствора NaCl, во вторую - 1 каплю 1 % раствора CuSO4, в третью - 1 каплю воды (контрольная проба). После этого во все пробирки наливают по 2 мл 0,5 % раствора крахмала. Все три пробирки оставляют при комнатной температуре на 10 минут, С содержимым каждой пробирки проделывают на стекле пробу с йодом на присутствие крахмала. Результаты записывают в таблицу: Субстрат Фермент Крахмал Крахмал Крахмал Амилаза Амилаза Амилаза Добавленное вещество 1 капля NаСl 1 капля CuSO4 1 капля H2O Окрашивание с Выводы йодом ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ. 1. Что такое ферменты и какова их химическая природа? Что называется проферментом? 2. Что такое апоферменты и коферменты, простетическая группа, активные центры ферментов? 4. Охарактеризуйте общие свойства ферментов. 5. Какие вещества называются активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры. Что значит конкурентное и аллостерическое ингибирование? 6. По какому принципу классифицируются ферменты? Перечислите 6 классов ферментов. ЗАДАНИЕ 4 ТЕМА: ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. Работа 1. Количественное определение активности амилазы слюны по Вольгемуту. Метод количественного определения активности амилазы слюны заключается в том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и то же количество раствора крахмала. После инкубации находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала, затем производят пересчет на 1 мл слюны. Активность амилазы выражается количеством 0,1 % раствора крахмала в миллилитрах, которое может гидролизовать амилаза 1 мл слюны при температуре 38° в течение 30 минут. Ход работы: Сначала готовят раствор слюны (1:10) Для этого к 1 мл слюны прибавляют 9 мл воды и хорошо перемешивают. В 10 пробирок в штативе отмеривают по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку приливают 1 мл раствора слюны (1:10), хорошо перемешивают, берут из этой же пробирки 1 мл и переносят во вторую пробирку, перемешивают, а затем из второй берут 1 мл и переносят в третью и т.д. Из девятой пробирки 1 мл жидкости выливают. Десятая пробирка будет служить контролем. Во все 10 пробирок приливают по 2 мл 0,1 % раствора крахмала, тщательно перемешивают и помещают на 30 минут в термостат при температуре 38°С. Через 30 минут пробирки вынимают, охлаждают, добавляют по 2 капли раствора йода и перемешивают. Жидкость в первых пробирках окрашена в желтый цвет от присутствия йода, а затем различные оттенки розового и фиолетового цвета появляются благодаря наличию декстринов. Синий цвет появляется в присутствии не расщепившегося крахмала. Активность амилазы рассчитывают по последней пробирке с желтоватой окраской. Так, если расщепление крахмала произошло в первой - четвертой пробирках, то можно вычислить активность, помня, что слюна перед опытом разведена в 10 раз, и что в четвертой пробирке она разведена еще в 16 раз (общее разведение слюны 1:160). Таким образом, 1/160 мл слюны расщепляет 2 мл крахмала, а 1 мл слюны - х мл крахмала, отсюда: X = (2·160)/1 = 320 мл Таким образом активность амилазы, определенная при З8°С в течении 30 минут, составляет 320 условных единиц. Протокол опыта оформляют в виде таблицы: № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Разведение Окраска слюны с йодом 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 контроль Активность фермента (расчет) Работа 2. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Щелочная фосфатаза – фермент, катализирующий гидролиз эфиров фосфорной кислоты при рН 9,0-10,0. Распространена в тканях, особенно много ее в слизистой оболочке кишечника, стенках желчных протоков печени, проксимальных отделах канальцев почек, плаценте, лактирующей молочной железе. Ход работы: В колбу на 50 мл отмеривают 0,2 мл сыворотки крови, прибавляют 10 мл дистиллированной воды и оставляют на 15 мин, периодически перемешивая. После этого добавляют 1 мл 0,05 N Н2SO4 и оставляют еще на 10 мин периодически перемешивая. Добавляют 3-5 капель смеси индикаторов и титруют 0,02 N NaOH до изменения красного цвета в зеленый. Одновременно ставят контрольную пробу, для чего в колбу на 50 мл наливают 1 мл 0,05 N Н2SO4, 10 мл дистиллированной воды и 3-5 капель смеси индикаторов, титруют 0,02 N NaOH. Расчет по формуле: Щф. = ((А-В) Ф 0,8 10)/0,2 (мг%) А - количество NaOH, пошедшее на титрование, В - количество NaOH в опытном растворе, 0,8 - количество NaOH в 2 мл 0,02 N NaOH. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ 1. Какие существуют способы выделения и очистки ферментов? 2. Что принято за международную единицу активности ферментов? 3. Дайте характеристику 6 классов ферментов? КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ: ФЕРМЕНТЫ. ЗАДАНИЕ 5 ТЕМА: ВИТАМИНЫ Работа 1. Реакция на ретинол с треххлористой сурьмой. Ход работы: На сухое предметное стекло нанести каплю рыбьего жира и добавить 2-3 капли хлороформного раствора треххлористой сурьмы. Смешать. Появляется синее окрашивание при наличии ретинола. Работа 2. Реакция на витамин К с диэтилдитиокарбоматом. Ход работы: К 2 каплям витамина К в 96°спирте прибавляют 2 капли 5 % раствора диэтилдитиокарбомата и 1 каплю 4 % NаОН в 96° спирте. Слегка подогреть. Раствор приобретает красно-бурое окрашивание в присутствии витамина К. Работа 3. Диазореакция на тиамин. Тиамин по химическому строению представляет собой сложное соединение, включающее пиримидиновое и тиазоловое кольца. Тиамин входит в состав кофермента декарбоксилазы пировиноградной кислоты липотиаминпирофосфат (ЛТПФ). Тиамин образует соединение розового цвета с диазофенилсульфоновой кислотой (диазореактив) и с этим реактивом может быть обнаружен химически. Ход работа: В пробирку наливают 1,5 мл щелочного раствора и добавляют к нему 15 капель диазореактива. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и наслаивают медленно 0,5 мл раствора тиамина. На границе двух жидкостей появляется оранжевое кольцо. Работа 4. Реакция восстановления рибофлавина. Ход работы: В пробирку наливают 10 капель 0,025 % раствора рибофлавина, добавляют 5 капель концентрированной HCl (осторожно!) и опускают зернышко металлического цинка. Начинается бурное выделение пузырьков водорода. Жидкость постепенно окрашивается в розовый цвет, затем окраска начинает бледнеть и жидкость обесцвечивается. Если удалить остаток цинка, перелив жидкость в другую пробирку и встряхнуть, раствор снова желтеет. Реакция обусловлена восстановлением рибофлавина в лейкофлавин, а обратная реакция - передачей водорода от лейкофлавина на кислород воздуха. Работа 5. Количественное определение витамина С в капусте или яблоках. Ход работы: 2 г капусты или яблок растирают в ступке с 10 мл 2 % раствора HCl, полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр. В две конические колбочки отмеривают пипеткой по 3 мл фильтрата и титруют из микробюретки 0,001 N раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до розовой окраски. Из величин, полученных при титровании содержимого обеих колб, вычисляют среднее значение. Определяют содержание витамина С в 100г капусты или яблок по формуле: Х= (0,088 х А х10 х 100) /(2 х 3) = 14,7 х А = мг % витамина С где: 2 - навеска капусты, в г. 10 - объем экстракта, в мл. 3 - количество экстракта, взятого для титрования, в мл. 100 - коэффициент для пересчета на 100 г капусты. 0,088 - количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 2,6дихлорфенолиндофенола, в мг. А - количество мл 0,001 N 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшее на титрование. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ. Что такое витамины, авитаминозы, гипо- и гипервитаминозы? Причины их возникновения. Что такое провитамины? Приведите примеры провитаминов и расскажите об их превращении в витамины Классификация витаминов. Напишите названия всех витаминов по международной номенклатуре. Какие биохимические функции выполняет ретинол в организме? Каковы специфические признаки авитаминоза А? Охарактеризуйте авитаминоз Д. Каковы биохимические функции кальциферолов? Авитаминоз Е, его специфические признаки. Какова биохимическая функция токоферола? Авитаминоз К. Чем обусловлено понижение свертываемости крови при авитаминозе К? Что такое викасол? Напишите структурные формулы витаминов В1, В2, B6, PP, С и биотина. Каковы их биохимические функции? Назовите коферменты, в состав которых входят витамины В1, В2, B6, PP и биотин. КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ: ВИТАМИНЫ. ЗАДАНИЕ 6 ТЕМА: ГОРМОНЫ. Работа 1. Реакция на адреналин с хлорным железом. Ход работы: В пробирку вносят 3 капли раствора адреналина (1:1000) и каплю 1 % раствора FeCl3. Жидкость в пробирке принимает ярко изумруднозеленое окрашивание, постепенно переходящее в желтое. Если к изумруднозеленому раствору прибавить 1 каплю концентрированного раствора аммиака, то окраска быстро переходит в зеленую, красную и затем коричневую. Работа 2. Реакция на фолликулин с концентрированной серной кислотой. Ход работы: В пробирку наливают 2-3 капли фолликулина, добавляют 2 капли концентрированной серной кислоты (осторожно !) и помещают ее в кипящую водяную баню на 10 минут. Жидкость в пробирке окрашивается в соломенно-желтый цвет, переходящий при нагревании в оранжевый. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ. 1. Какие вещества называются гормонами? Как классифицируются гормоны по химическому строению? Механизм их действия. 2. Гормоны щитовидной и паращитовидной желез, их строение и функции. 3. Гормоны передней, средней и задней доли гипофиза, их строение и биологическая роль. 4. Химическая природа инсулина и его влияние на обмен веществ. 5. Химическая структура мужских и женских половых гормонов, какова их биологическая роль? 6. Каковы биохимические функции гормонов коркового и мозгового слоя надпочечников? 7. Что такое простагландины, их химическая природа и функции? КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ: ГОРМОНЫ. ЗАДАНИЕ 7 ТЕМА: БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. Биологическое окисление в тканях протекает с участием окислительновосстановительных ферментов - дегидрогеназ, цитохромов, цитохромоксидаз, пероксидаз, каталаз и др. Работа 1. Обнаружение пероксидазы в крови Пероксидазы катализируют окисление субстрата в присутствии пероксида водорода, который расщепляется с выделением атомарного кислорода. В организме животных слабой пероксидазной активностью обладает гемоглобин, миоглобин, цитохромы. Принцип метода: об активности пероксидазы можно судить по изменению окраски бензидина. Окисленный бензидин приобретает вначале зеленую, затем синюю и постепенно переходящую в бурую окраску. Ход работы: В две пробирки наливают по 5 капель 1% раствора бензидина и по 5 капель 3% пероксида водорода. В первую пробирку добавляют 5 капель разбавленной крови, во вторую - 5 капель воды. Наблюдают за изменением окраски. Сделать выводы. Работа 2. Качественная реакция на пероксидазу молока. Принцип метода. Пероксидаза расщепляет пероксид водорода, а образовавшийся атомарный кислород окисляет йодистый калий, о появлением свободного йода, который обнаруживается цветной реакцией с крахмалом, по схеме: H2O2 + 2 KJ 2 КОН + J2 крахмал + J2 синее окрашивание Ход работы: В две пробирки наливают по 5 мл сырого молока. В пробирке № 2, служащей контролем, молоко кипятят. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл 1 % раствора крахмала и по 2 капли 10 % раствора йодистого калия и по 5 капель 0,5 % раствора пероксида водорода. В пробирке № 1 появляется синее окрашивание. Пероксидаза присутствует только в сыром молоке. При нагревании до 80° она разрушается, поэтому о степени пастеризации молока судят по активности в молоке пероксидазы. Простота, точность определения позволяют широко применять этот метод в практической работе при проведении экспертизы молока. Работа 3. Качественная реакция на каталазу слюны. Принцип метода: Содержится каталаза во всех тканях и жидкостях организма и предохраняет его от токсического действия пероксида водорода, образующегося в процессе биологического окисления в тканях. Она катализирует реакцию разложения перекиси водорода с освобождением молекулярного кислорода по схеме: 2 H2O2 каталаза 2 Н2О + О2 Ход работы: В пробирку помещают 1 - 2 мл слюны и 2 - 3 мл 0,1 % раствора пероксида водорода. Тотчас же начинается выделение пузырьков кислорода. Работа 4. Качественная реакция на каталазу крови. Ход работы: В пробирку берут 10-15 капель 1% раствора пероксида водорода и добавляют 1 каплю крови. Жидкость вспенивается, так как происходит бурное выделение пузырьков кислорода. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ. 1. Какие ферменты относятся к классу окислительно-восстановительных? 2. Какие процессы катализируются дегидрогеназами, каталазой и пероксидазой? 3. Перечислите коферменты окислительно-восстановительных ферментов. 4. Какие ферменты называются пиридиновыми, флавиновыми, геминовыми? 5. Что называется окислительным фосфорилированием, разобщением окисления и фосфорилирования? Биологическое значение этих процессов. 6. Напишите примеры четырех основных типов реакций дегидрирования. КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ: БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ