03Специфическое антигриппозное действие

Изучение антигриппозного и антиаденовирусного
действия экстракта Протефлазид in vitro и in vivo.
Исследуемые в эксперименте фармацевтические составы
действующего вещества лекарственного препарата Протефлазид®.
1.Фармацевтический состав действующего вещества лекарственного
препарата Протефлазид® - далее: (ДВП). ). [В 1 мл. ( ДВП ) – 0,48 мг. (ДВ)]
Состав:
а)(ДВ) Лекарственного препарата Протефлазид
(флавоноидных гликозидов в пересчете на рутин)
–
0,48 мг/мл.
б) Воды – до 1 мл.
в) Этанола – 0,05 мг/мл.
2. Фармацевтический состав действующего вещества лекарственного
препарата Протефлазид®, полученый методом температурной инактивации
фармацевтического состава ДВП, с целью дезактивации пептидных и
белковых соединений в составе ДВП. Далее обозначали как - (t0 –
инактивированный ДВП).
3. Фармацевтический состав действующего вещества лекарственного
препарата Протефлазид®, полученный методом ферментативной обработки
ДВП, с целью дезактивации сахаров и аминокислот в составе ДВП.Далее
обозначали как- (рамнозидаза+ ДВП).
Определение максимально переносимой и минимально активной
концентрации ДВП (далее-ДВП)
Для определения максимально переносимой концентрации (МПК)
ДВП использовали клетки MDCK (перевиваемая культура клеток почки
собаки). В опытах использовали не менее десяти лунок в пластиковых
плашках с культурой клеток для каждого разведения ДВП в питательной
среде. Планшеты с культурой клеток инкубировали в термостате с подачей 5
% СО2 при 37° С в течение 5 суток. Ежедневно проводили просмотр опытных
и контрольных культур с целью выявления наличия или отсутствия
цитопатогенного действия (ЦПД) ДВП на клетки.
Для определения ЦПД использовали ДВП концентрация которого
составляет 3 300 мкг/мл.
Степень ЦПД определяли по изменению морфологии клеток
(округление и сморщивание клеток, отторжение от поверхности лунок
продегенерировавших клеток) по 4-плюсовой системе от «1+» до «4+».
Максимально переносимой концентрацией препарата считали его самое
большое количество, которое не вызывало дегенерацию клеток. Результаты
опытов приведены в таблице 2.1.
1
Таблица 2.1 - Результаты определения МПК ДВП на культуре клеток
MDCK.
ДВП,
концентрация,
Показатели цитопатогенного действия ДВП в лунках
мкг/мл
1 650
4+ 4+ 4+
4+
4+
4+
4+
4+
4+ 4+
825
412,5
206,5
103
Контроль
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
клеток
Как следует из таблицы 2.1, МПК ДВП для клеток MDCK составляет 825
мкг/мл.
Определение химиотерапевтического индекса ДВП к вирусу
гриппа.
Химиотерапевтический индекс (ХТИ) ДВП по отношению к вирусу
гриппа определяли путем установления соотношения МПК к минимально
активной концентрации (МАК), которая представляет собой минимальное
количество ДВП, угнетающее развитие вирусспецифического ЦПД на 50 %.
Для определения МАК тест-вирус в дозе 100 ТЦД50/0,1 мл вносили в культуру
клеток МDСК, предварительно обработанные трипсином, и инкубировали в
течение 1 часа при 37° С. После адсорбции вируса на клетках, культуральную
жидкость удаляли и клетки промывали питательной средой RPMI-1640, после
чего в поддерживающую среду (RPMI-1640 + 2 % фетальной сыворотки)
вносили исследуемый препарат в розведениях от 1:20 до 1:1280. Отсутствие
ЦПД в опытах при наличии его в контролях позволило определить МАК
препарата (табл. 2.3 и 2.4).
При определении МАК преследовались две цели: определение МАК для
ДВП, а также определение функциональной активности составляющих
компонентов этого препарата, углеводов и белковой структуры. Поэтому в
опыт были взяты ДВП и его модификации:
1) t-инактДВП, 2) ДВП + рамнозидаза.
Для исследований использовали ДВП, концентрация которого
составляет 480 мкг/мл.
2
Таблица 2.2. - МАК ДВП и его модификации по
отношению к вирусу гриппа
Разведения
lg уровня репродукции вируса
0
ДВП
tрамнозидаза
исходный
(концентрация, инактивированное
+ДВП
ДВП
мкг/мл )
ДВП
1:20 (24)
3,0
6,0
6,0
1:40 (12)
2,0
6,0
6,0
1:80 ( 6)
3,0
3,0
6,0
1:160( 3)
2,0
3,0
6,0
1:320(1,5)
3,0
6,0
6,0
1:640(0,75)
3,0
5,0
5,0
1:1280(0,37)
2,0
5,0
4,0
КВ
4,0
6,0
6,0
КВ – (контроль вируса)
Согласно методическим рекомендациям [1], действующее вещество
считают активным, при снижении им уровня репродукции вируса на 2,0 lg и
больше. Таким образом, МАК ДВП соответствует разведению 1:1280
(концентрация:0,37 мкг/мл). Термообработка не влияет на величину МАК.
Ферментативная обработка рамнозидазной увеличивает величину МАК
(снижение уровня репродукции вируса на 2,0 lg происходит при
концентрациях ̴ 3 мкг/мл.
Таблица 2.3 - Результаты определения МПК, МАК и ХТИ ДВП и его
модификаций
Препараты
МПК, мкг/мл
МАК, мкг/мл
ХТИ
825
0,37
2230
825
825
3,0
0,37
275
2230
ДВП
ДВП
термообработка
ДВП+рамнозидаза
ДВП
Как свидетельствует приведенная таблица 2.3, показатели МПК, МАК и
ХТИ позволяют отнести ДВП к высокоактивным антивирусным препаратам.
Кроме того, установлено, что присутствие углеводного компонента
усиливает антивирусную активность ДВ
3
Изучение антигриппозной активности ДВП in vivo
Изучение антигриппозной активности ДВП in vivo проводили на модели
гриппозной пневмонии у мышей.
Для этой цели был использован штамм вируса гриппа А/FM/1/47
(H1N1), адаптированный к легким белых мышей, который прошел 15
пассажей на мышах, инфекционный титр – 4,0 - 5,5 lg LD50, 100 % летальность
мышей наблюдалась на протяжении 5 суток.
Исследование по определению антигриппозной активности in vivo
проводили по профилактической и лечебной схемам. Неинбредным мышам
внутрибрюшинно вводили 0,2 мл раствора ДВП за 24 часа до интраназального
заражения вирусом гриппа в дозе 10 LD50 (профилактическая схема), и через
24 часа после заражения вирусом гриппа (лечебная схема). Одновременно
ставили контроль вируса гриппа тамифлю для профилактической и лечебной
схемы опытов. Учет эффективности действия препаратов осуществляли по
индексу эффективности ингибиции летальности и инфекционного титра
вируса гриппа в легочной ткани мышей. Результаты исследования
представлены в таблице 2.4.
Таблица 2.4. - Профилактическое и лечебное действие ДВП
на модели экспериментальной гриппозной инфекции in
vivo
Препарат
Количе
ство
мышей
ДВП
Тамифлю
Вирус гриппа
10
10
10
ДВП
Тамифлю
Вирус гриппа
10
10
10
Доза
препарата
мкг/кг
(разведение)
Из них
погибло
Всего
КЗ
ИЭ
Титр (lg)
вируса
гриппа в
легких
мышей
10,0
5,0
0
100
80
0
2,0
1,5
4,0
5,0
3,3
0
80
69,7
0
2,5
2,5
4,0
%
Профилактическая схема
(1:100)48
0
0
1000
2
20
10
100
Лечебная схема
(1:500)9,6
2
20
1000
3
30
10
100
Анализируя представленные в таблице 2.4 данные, следует отметить,
что
ДВП защищает мышей от летальной гриппозной инфекции при
профилактической схеме введения в разведении 1:100. При лечебной схеме
защитный эффект отмечается при введении ДВП в разведении 1:500
4
Определение антинейрамидазной активности ДВП
Для изучения механизма действия ДВП были проведены исследования
по параметрам определения его антинейраминидазной активности.
Ранее нами было установлено, что Неофлазид в дозе 4,5 мкг/мл
ингибирует на 80% нейраминидазную активность вируса гриппа A/FM/1/47
(H1N1).
Поэтому, в настоящем исследовании в эксперимент взяты ДВП и Неофлазид.
Чтобы определить, как химическая структура влияет на антинейраминидазную
активность исследовали также ДВП обработанный рамнозидазой(ДВП+
рамнозидаза).
Определение антинейрамийидазной активности проводили по методу
Aminoff.
К разведениям нейраминидазы (0,1 мл) прибавляли 0,1 мл препаратов в дозах
4,5 мкг/мл, 4,8 мкг/мл, инкубировали 1 час при 370С, добавляли фетуин и
оставляли при 370С на 18 часов. Затем в каждую пробирку вносили по 0,25 мл
перйодата натрия и инкубировали 30 минут. После этого добавляли 0,4 мл
арсенита натрия, встряхивали и вносили по 2 мл тиобарбитуровой кислоты.
Кипятили в течение 7,5 минут, охлаждали на льду. Затем добавляли 5 мл
подкисленного бутанола, встряхивали, центрифугировали 10 минут при 1500
об/мин. Активность нейраминидазы выражали в единицах УФ-поглощения при
длине волны 549 нм или в процентах при сравнении исследуемых образцов.
Антинейраминидазную активность ДВП изучали на примере
ингибирования нейраминидазы вируса гриппа A/FM/1/47
(H1N1) и
стандартного вещества, выделенного из Astrobacter ureafaciens 105 γ/мл/мин
раствора. Результаты приведены в таблице 2.5.
5
Таблица 2.5. - Показатели антинейраминидазной активности действующих
веществ.
Нейрами
нидаза в
у/мл/мин
Доза
препарата в
мкг/мл
γ/мл/мин
(мкг/мл)
Astrobacter
ureafaciens
105
A/FM/1/4
7 (H1N1)
Показатели оптической
плотности (ОП/549 )
Процент ингибиции
нейраминидазной
активности (%)
0,910
Нейраминидаза
+ препарат
0,250
80,0
0,890
0,100
100,0
ДВП +
0,910
рамнозидаза (1:1)
0,900
0
Неофлазид
(4,5)
ДВП (4,8)
0,200
0,100
80,0
|
100,0
0,865
0
Неофлазид
(4,5)
ДВП – (4,8)
Нейраминидаза
0,850
ДВП+рамнозидаза
(1:1)
Результаты опытов показывают, что ДВП полностью ингибирует
нейраминидазную активность вируса гриппа A/FM/1/47 (H1N1) и
стандартного препарата нейраминидазы Astrobacter ureafaciens 105.
Анализируя полученные результаты, следует отметить, что ДВП обработанный
рамнозидазой не ингибировал нейраминидазную активность вируса гриппа.
Следовательно наличие присоединенного к флавонолу углевода (сахара,
карбоновой кислоты) является необходимым для ингибиции нейраминидазной
активности вируса гриппа.
Изучение специфического антиаденовирусного
действия лекарственного препарата Протефлазид®
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Вирус и культура клеток. Использовали аденовирус человека
серотипа 5, который наиболее часто используют в антиаденовирусных
исследованиях.
Культура клеток. Перевиваемые клетки Нер-2 (эпидермоидная карцинома
гортани человека) культивировали в питательной среде RPMI-1640 + 10%
фетальной сыворотки теленка + антибиотики. Клетки выращивали в 24луночных плашках с покровными стеклами.. Через 2 суток роста клеток в
плашках их заражали аденовирусом, предварительно определяли разведение
вируса. Инфицированные вирусом клетки инкубировали в поддерживающей
среде RPMI-1640 без добавления сыворотки в течение 48 часов, когда
6
выявляли более половины инфицированных клеток по наличию
внутриядерных включения [3,6].
1.2. Препарат. -Протефлазид® (ПФ) разработан НПК "ЭКОФАРМ",
Украина, г. Киев. Для исследования представлен препарат Протефлазид®
1.3. Схема обработки клеток препаратом.
Использовали следующие схемы обработки клеток:
1) обработка клеток препаратом во время адсорбции вируса;
2) обработка клеток после заражения.
1.3.1. Обработка клеток препаратом во время адсорбции вируса.
Через 48 час роста клеток в плашках ростовую среду из лунок удаляли и
клетки инфицировали вирусом, разведенным средой RPMI-1640, содержащей
препарат в разных концентрациях. Дозу вируса определяли, как буде описано
ниже. Адсорбцию вируса проводили при комнатной температуре в течение 1
часа. Затем клетки отмывали от неадсорбированного вируса трижды
раствором Хэнкса, вносили поддерживающую среду и инкубировали при
37оС с подачей СО2 в течение 48 часов. Контролями служили клетки
инфицированные вирусом, разведенным средой не содержащей препарат.
1.3.2. Обработка клеток препаратом после заражения вирусом.
Через 48 час роста культуры клеток удаляли ростовую среду и клетки
инфицировали вирусом в соответствии с подобранным разведением. После
адсорбции вируса в течение 1 часа клетки отмывали раствором Хэнкса, а
затем вносили поддерживающую среду, содержащую препарат в разных
концентрациях и инкубировали при 37оС с подачей СО2 в течение 48 часов.
Контролями были клетки, зараженные только вирусом без препарата. Был
использован еще один вариант, когда после инфицирования клетки
инкубировали без препарата 1 сутки, а затем вводили препарат.
1.4. Определение антивирусной активности препарата.
Определение антивирусной активности препарата методом редукции
количества инфицированных клеток.
1.4.1. Метод разработан нами [5-7] и в отличие от методов, основанных на
цитодеструктивном действии вируса ( ЦПД, МТТ, бляшки), позволяет
количественно после первого цикла репродукции вируса оценить
ингибирующее
действие
препарата
по
уменьшению
количества
инфицированных клеток, содержащих вирусспецифические внутриядерные
включения
[3].
Ранее
было
показано
совпадение
результатов
антиаденовирусной активности рибавирина и 6-азацитидина при
использовании для определения количества инфицированных клеток данного
метода и метода флюоресцирующих антител [5,7].
Для проведения данных исследований использовали плашки, в которые
до внесения клеток помещали полоски покровных стекол. Клетки
инфицировали аденовирусом и обрабатывали препаратом в соответствии с
вышеописанными схемами (1.4.) Через 48 час среду из плашек отсасывали
пипеткой и переносили в эппендорфы для определения в последующем
инфекционного титра, а клетки на стеклышках фиксировали и окрашивали
гематоксилин-эозином по общепринятой методике [17]. Окрашенные
7
препараты клеток с помощью канадского бальзама помещали на предметные
стекла.
Препараты клеток исследовали в световом микроскопе, используя
объектив х40, окуляр х10. В каждом из 3-х стекол с разной концентрацией
препарата исследовали по 500 клеток и определяли процент
инфицированных клеток с внутриядерными вирусными включениями (рис.1 и
2). Ингибирование препаратом количества инфицированных клеток
определяли по отношению к контролю ( зараженных только аденовирусом
клеток) и выражали в процентах, используя формулу:
К - О
__________ х 100
К
где К – процент инфицированных клеток в контроле;
О – процент инфицированных клеток в опыте.
За эффективную концентрацию (ЕС50) принимали ту, в которой препарат
уменьшал количество инфицированных клеток на 50 % по отношению к
контролю.
1.4.2. Определение антиаденовирусной активности препарата по
снижению инфекционного титра вируса.
В пробах вируссодержащей среды, отобранной из плашек перед
фиксацией клеток на стеклышках, определяли титр внеклеточного вируса
методом титрования в культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД).
готовили 10-кратные разведения исследуемых проб и инфицировали ими
культуру клеток Нер-2 через 24 часа роста в 96-луночных плашках, внося в
каждую лунку по 10 мкл исследуемого материала. На каждое разведение
использовали 4 лунки. Через 1 час после контакта клеток с вирусом в лунки
вносили по 100 мкл среды. В контрольных лунках ростовую среду удаляли и
вносили по 10 мкл среды. Клетки инкубировали при 37оС + СО2 и
просматривали в микроскопе на наличие ЦПД. Учет проводили на 5-е или 7-е
сутки. Титром вируса принято считать то наибольшее разведение, при
инфицировании которым в культуре клеток наступает дегенерация 50%
монослоя. Титр вируса выражают в lg ТЦД50/0,1 мл. Зная титры вируса в
исследуемых пробах определяли снижение титра внеклеточного вируса,
образующего в культуре клеток при воздействии препарата при сравнении с
контролем вируса. Эффективной концентрацией препарата принято считать
ту, в которой он снижает титр вируса не менее, чем на 2 lg.
2.1.Определение химиотерапевтического индекса препарата Протефлазид
Химиотерапевтический индекс (ХТИ) Протефлазида по отношению к
аденовирусу 5 типа (инфекционный титр в культуре клеток Нер-2 составлял
4,0
lg ТЦД50) определяли путем установления соотношения МПК к
8
минимально ингибирующая концентрации (МИК), которая представляет
собой минимальное количество препарата, угнетающее развитие
вирусспецифического ЦПД на 50 %. МПК
препарата Протефлазид
составляла 1:100 или 3,2 мкг/мл. Для определения МИК тест-вирус вносили в
культуру клеток Нер-2. После адсорбции вируса на клетках, культуральную
жидкость удаляли и клетки промывали питательной средой RPMI-1640, после
чего в поддерживающую среду
вносили Протефлазид в разных
концентрациях. Отсутствие ЦПД в опытах при наличии его в контролях
позволило определить МИК препаратов ( табл.1)
Таблица 1
МПК Протефлазида по отношению в аденовируса 2 и 5 типов
Разведения
Доза препарата в Титры вируса в lg ТЦД50
препарата
мкг/мл
адновирус 2 типа аденовирус 5 тип
100
3,2
1,0
1,0
400
0,8
1,0
2,0
1600
0,2
1,0
2,0
3200
0,1
2,0
4,0
Контроль вирусов
3,0
4,0
Исходя из данных, представленных в табл.1, МИК препарата
Протефлазид по отношению к аденовирусам 2 и 5 типов составил 0,2 мкг/мл,
при этом ингибиция инфекционного титра вденовирусов равнялась 2-3 lg
ТЦД50.
Согласно методическим рекомендациям вещество или препарат считается
проявляющим активность при снижении уровня репродукции вируса на 2 lg и
более.
Результаты определения МИК, МПК и ХТИ представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты определения МИК, МПК и ХТИ препарата Протефлазид
Препарат
Протефлазид
МПК, мкг/мл
3,2
МИК, мкг/мл
0,2
ХТИ
16
Как видно из представленной таблицы 2, показатели МПК, МИК и ХТИ
позволяют отнести препарата Протефлазид к активным антивирусным
препаратам по отношению к аденовирусам.
2.2. Определение инфицирующей дозы аденовируса
Необходимое количество вируса для проведения исследований было
получено следующим образом: культуру клеток выращивали на поверхности
флаконов емкостью 500 мл, инфицировали аденовирусом типа 5 и через 5
9
суток после наступления ЦПД и отслаивания клеток от стекла, взвесь клеток
подвергали 3-х кратному замораживанию и размораживанию, что
способствовало разрушению клеток и выходу вируса в среду. Получив смесь
внеклеточного и внутриклеточного вируса, разливали его по пробиркам и
хранили при -20оС.
Полученный вирус разводили – 1:10, 1:20, 1:40, инфицировали клетки,
которые выращивали в 24-луночных плашках с покровными стеклами. Через
48 часов инкубации в термостате стекла фиксировали жидкостью Шабадаша и
окрашивали гематоксилин-эозином. Исследование проводили в световом
микроскопе (при объективе х40, окулярах х10) на наличие внутриядерных
включений, образование которых характерно для репродукции аденовирусов
[3].
Полученный «сток» вируса, разведенный 1:10, вызывал образование
внутриядерных включений в 61% клеток, при разведении 1:20 – в 55% клеток,
при 1:4 - в 35% клеток. В клетках преобладали включения позднего типа, в
основном центроядерные, характерные для завершающей стадии их развития.
Проведение испытаний препарата в данных условиях эксперимента позволяет
оценить влияние препарата на репродукцию аденовируса в одноцикловом
эксперименте.
Наиболее приемлемым условием инфицирования
клеток является
использование разведения аденовируса 1:10 или 1:20, при котором в монослое
можно выявить больше половины инфицированных клеток по наличию в их
ядрах характерных включений без нарушения структуры монослоя.
2.3. Влияние Протефлазида на репродукцию аденовируса в культуре клеток.
Используя разведение вируса 1:10 исследовали влияние Протефлазида (ПФ) в
концентрации 0,32 мкг/мл на репродукцию аденовируса в культуре клеток:
при обработке им клеток одновременно с инфицированием вирусом и после
инфицирования. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние Протефлазида на репродукцию аденовируса типа 5 in vitro
Концентр Обработка клеток ПФ
а
инфицированием
ция Проте
флазида
%
уменьшени
инфици- е
кол-ва
рованны инфи
х клеток цированны
х
0,32
48
21
мкг/мл
одновременно с Обработка клеток ПФ
после
заражения
вирусом
титр
снижени %
уменьшени
виру- е титра инфици е
кол-ва
са lg ви-руса
рованны инфи
ТЦД5 lg
х
цированны
0
ТЦД50
клеток
х
5,5
0,5
52
15
10
Контроль
вируса
61
6,0
61
Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что применение
препарата Протефлазид в концентрации 0,32 мкг/мл при заражении
аденовирусом, он незначительно снижает репродукцию вируса, при обработке
им клеток, как во время, так и после инфицирования. При значительном
инфицировании клеток (61%) и высоком титре вируса ( в контроле вируса –
6,0 lg ТЦД50) количество инфицированных клеток, в зависимости от способа
обработки снижалось на 21% или 15%, а титр вируса на 0,5 lg ТЦД50.
В следующем опыте при тех же условиях инфицирования клеток Протефлазид
вводили в более высоких концентрациях – 0,64 мкг/мл и 1,6 мкг/мл.
Полученные результаты представлены в таблице 2 и демонстрируют более
выраженное ингибирующее действие препарата репродукцию аденовируса. В
концентрации
0,64
мкг/мл
Протефлазид
уменьшал
количество
инфицированных клеток, содержащих внутриядерные включения на 35% в
случае обработки им клеток одновременно с заражением вирусом, и на 50% - в
случае внесения его в среду сразу после заражения вирусом. Титр
внеклеточного вируса при этом снижался.
Таблица 4
Влияние Протефлазида на репродукцию аденовируса типа 5
одновременном введении в клетки
Концентра %
ция Проте инфицифлазида
рованных
клеток
0,64
46
мкг/мл
1,6 мкг/мл 45
Контроль 70
вируса
Контроль
клеток
in vitro при
уменьшение снижение митотический амомальные
кол-ва инфи титра ви- индекс в ‰
митозы в %
цированных руса
lg
ТЦД50
35
3,5
33,0
27,2
36
3,0
7,0
12,0
50,0
32,0
30,2
Таблица 5
Влияние Протефлазида на репродукцию аденовируса типа 5 in vitro при
внесении после заражения клеток
Концентра %
ция Проте инфицифлазида
рованных
уменьшение снижение митотический амомальные
кол-ва инфи титра ви- индекс в ‰
митозы в %
цированных руса
lg
11
0,64
мкг/мл
1,6 мкг/мл
Контроль
вируса
Контроль
клеток
клеток
35
35
70
50
50
ТЦД50
2,0
30,0
31,6
3,0
7,0
12,0
50,0
32,0
30,2
С увеличением концентрации препарата до 1,6 мкг/мл ингибирующий эффект
не изменялся и был таким же, как и при воздействии Протефлазида в
концентрации 0,64 мкг/мл. Но при этом был выражен цитотоксический эффект
препарата, состоящий в разрежении клеточного монослоя из-за отслаивания
клеток от стекла.
Таким образом, двумя независимыми тестами, направленными на
непосредственное выявление инфицированных клеток и на образование
инфекционного вируса, нами выявлено ингибирующее воздействие
Протефлазида на репродукцию аденовируса в одноцикловом опыте при
обработке им клеток сразу после заражения вирусом, а именно: при внесении
его к клеткам после проведения этапа адсорбции вируса, контакта с клетками
в течение 1 часа. Эффективная концентрация ЕС50 или минимальная
ингибирующая концентрация (МИК50), установленная по снижению
количества инфицированных клеток с внутриядерными вирусными
включениями, составляет 0,64 мкг/мл Протефлазида. С увеличением
концентрации Протефлазида до 1,6 мкг/мл нам не удалось вывить более
высокий ингибирующий эффект.
Ингибиция репродукции вируса составила 2 lg ТЦД50, что является
показателем эффективного антивирусного действия по отношению к
аденовирусу препарата Протефлазид. Однако ХТИ препарата Протефлазид (
16) достаточно низкое. Эффективность ингибиции репродукции аденовируса
5-го типа подтверждается результатами определения митотической
активности клеток.
При лечебном введении препарата Протефлазид в дозе 0,46 мкг/мл
наблюдалась
нормализация
митотического
режима
клеток.
При
одновременной обработке клеток Протефлазидом в дозе 0,64 мкг/мл и
инфицированием аденовирусом митотический индекс и количество
аномальных митозов статистически достоверно не отличались от
неинфицированных клеток.
Протефлазид снижал внутриклеточную репродукцию аденовируса и, случае
присутствия его при адсорбции вируса (одновременная обработка вирусом и
препаратом), однако эффект был ниже 50% и составлял 35%.
Результаты представленных нами исследований обосновывают необходимость
проведения испытания воздействия на репродукцию аденовируса при
сочетанном использовании обоих способов обработки клеток. В таком случае
12
первоначально Протефлазид должен присутствовать при инфицировании
клеток, а затем присутствовать в среде после заражения клеток до окончания
опыта. Возможно такой способ обработки клеток повысит его эффективность
(эффективность препарата), т.к. Протефлазид в некоторой степени способен
предотвращать адсорбцию вируса или проникновение его в клетку, с чем
связано, хотя и небольшое, уменьшение количества инфицированных клеток.
Эти исследования были проведены по следующей схеме. Клеточные культуры
Нер-2 были обработаны смесью вируса в разведении 1:10, 1:20, 1:100 и
препаратом Протефлазида в дозах 0.64 мкг/мл и 0,32 мкг/мл. После адсорбции
вируса в течение 1 часа, культуры клеток отмывали и вносили среду с
препаратом Протефлазида в дозах 0,64 и 0,32 мкг/мл. На 3-и сутки препараты
фиксировали и окрашивали. Результаты определения внутриядерных
включений в инфицированных клетках и уровень репродукции аденовируса
представлены в таблицах 6 и 7.
Таблица 6 – Влияние Протефлазида на репродукцию аденовируса типа 5 in
vitro при
внесении препарата в дозе 0,64 мкг/мл во время адсорбции вируса
и
после адсорбции
Доза
вируса
%
инфицированных
клеток
1:10
1:20
1:100
К клеток
58
22
-
Обработка Протефлазидом в дозе 0,64 мкг/мл
%
уменьшение титр
снижение
инфициро- количества вируса
в титра
ванных
инфициров. lgТЦД50
вируса
кле-ток
клеток (%)
в lgТЦД50
14
76
2,0
2,0
100
2,0
2,0
2,0
2,0
Таблица 7 – Влияние Протефлазида на репродукцию аденовируса типа 5 in
vitro при
внесении препарата в дозе 0,32 мкг/мл во время адсорбции вируса
и
после адсорбции
Доза
вируса
%
инфицированных
клеток
1:10
1:20
58
22
Обработка Протефлазидом в дозе 0,32 мкг/мл
%
уменьшение титр
снижение
инфициро- количества вируса
в титра
ванных
инфициров. lgТЦД50
вируса
кле-ток
клеток (%)
в lgТЦД50
19
67
1,0
3,0
100
1,0
3,0
13
1:100
К клеток
-
-
-
2,0
2,0
Комментируя полученные результаты, следует отметить, что применение
комбинированной схемы обработки разными дозами препарата Протефлазид
во время адсорбции и последующей репродукции аденовируса эффективность
препарата значительно возросла в зависимости от степени инфицированности
клеток аденовирусом. При инфицированности клеток на 22% препарат
Протефлазид в концентрации 0,64 мкг/мл и 0,32 мкг/мл полностью подавлял
репродукцию аденовируса, то есть, клеток с внутриядерными включениями не
было выявлено.
При инфицированности клеток на 58% и воздействии Протефлазида в дозе
0,64 мкг/мл включения выявлены в 14 % клеток, ингибирование репродукции
аденовируса по внутриядерным включениям составило 76 %. Препарат
Протефлазид в дозе 0,32 мкг/мл уменьшал количество инфицированных
клеток на 67 %, при этом ингибиция репродукции аденовируса составила 2-3
lgТЦД50. При применении дозы аденовируса 1:100 в контрольных образцах не
были отмечены внутриядерные включения, хотя по ЦПД инфекционный титр
аденовируса составлял 2 lgТЦД50
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведено изучение антиаденовирусной активности препарата Протефлазид
in vitro с использованием культуры клеток Нер-2 и аденовируса 5 и 2 типа.
Выявлено снижение репродукции аденовируса на 50% при обработке клеток
после заражения и на 35% - при адсорбции , а также
при сочетанном
использовании обоих способов обработки Протефлазидом. При
этом
количество внутриядерных включений снижалось на 100- 76 % и на 100-67% в
зависимости от дозы вируса и концентрации препарата. Отмечалась
ингибиция репродукции аденовируса на 2-3 lg ТЦД50
и нормализация
митотического режима клеток, что может оказывать благоприятное
воздействие на течение аденовирусного заболевания, это очень важно,
учитывая отсутствие препарата с доказанной специфичностью и высокий
уровень ОРВИ, часто аденовирусной этиологии.
Литература
1. Отчет о доклиническом изучении новых (лечебных) форм препарата
Протефлазид® на моделях вируса гриппа.
АМН Украины ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных болезней
им. Л.В. Громашевского»
Руководитель НИР: зав. лабораторией контроля качества
иммунобиологических препаратов, д.м.н. С. Л. Рыбалко
14
Киев – 2006 г.
2. Отчет о НИР «Доклиническое изучение препарата Протефлазид® на
модели аденовирусной инфекции»
Академия медицинских наук Украины
Государственное учреждение «Институт эпидемиологии и инфекционных
болезней им. Л. В. Громашевского»
03680, г. Киев, ул. Амосова, 5
Научный руководитель работы – д.м.н. С.Л. Рыбалко
Киев – 2012 г.
3. ОТЧЕТ о научно-исследовательской работе˂ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ
ДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЛЕЧЕБНОЙ
СУБСТАНЦИИ ПРОТЕФЛАЗИД®˃.
Академия медицинских наук Украины
Государственное учреждение «Институт эпидемиологии и инфекционных
болезней им. Л. В. Громашевского»
03680, г. Киев, ул. Амосова, 5
Научный руководитель работы – д.м.н. С.Л. Рыбалко
Киев – 2010 г.
4. Отчет о НИР. Анализ антивирусных свойств действующих веществ
экстракта
Протефлазид и экстраполяция действующих in vivo доз на человека.
АМН Украины ГУ «ИЭИБ им. Л.В. Громашевского»
Руководитель НИР - зав. лаб. экспериментальной химиотерапии вирусных
инфекций, д.м.н. С.Л. Рыбалко и д.м.н. Шарыкина Н.И.
Киев-2011г.
15