регуляция активности растворимой нуклеозидтрифосфатазы из

Биология
УДК 577.152.3
В.Ф. СИВУК
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ РАСТВОРИМОЙ НУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТАЗЫ
ИЗ ПОЧЕК БЫКА (BOS TAURUS)
Regulatory properties of a soluble nucleoside triphosphatase (NTPase) (EC 3.6.1.15) partially purified from bovine kidney are
investigated. Propionate and lactate were inhibitors of the enzyme, whereas fructose-1,6-diphosphate showed activating effect. Based
on opposite effects of fructose-1,6-diphosphate and propionate, one may assume, that the enzyme may be involved in the regulation
of the rate of glycolysis and gluconeogenesis.
Гидролиз нуклеозидтрифосфатов (НТФов) представляет собой основной источник энергии для
многочисленных энергозависимых процессов клеточной активности. Свойства ферментов, осуществляющих гидролиз этих соединений, и механизмов их регуляции в тканях человека и животных представляют собой биохимическую основу для целенаправленной разработки методов коррекции отклонений метаболизма. Известно, что при некоторых патологиях (например, при диабете) отмечается
существенный сдвиг энергетического статуса клетки. При этом ощутимо изменяется концентрация не
только «главной энергетической валюты» клетки (АТФ), но и других высокоэнергетических нуклеозид-5′-трифосфатов (ИТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ), выполняющих специфические функции в некоторых
биосинтетических путях и межклеточной коммуникации [1−4]. Колебания уровней высокоэнергетических трифосфатов находятся в тесной зависимости от активности ферментов их биосинтеза и катаболизма [2, 5, 6]. Хотя ферменты биосинтеза НТФов изучены достаточно хорошо, однако о ферментах их гидролиза известно в настоящее время очень мало.
Ферменты катаболизма НТФов, объединенные в семейство нуклеозидтрифосфатаз (НТФаз) (КФ
3.6.1.15), безусловно, вносят также ощутимый вклад в формирование энергетического статуса клетки.
Некоторые НТФазы уже достаточно хорошо изучены [7−10], однако роль растворимых ферментов с
НТФазной активностью, присутствующих в тканях млекопитающих, в настоящее время остается неизвестной. Не выяснены также и механизмы регуляции этих растворимых ферментов.
Целью данной работы является исследование регуляторных свойств и возможной биологической
роли частично очищенной растворимой НТФазы из почек быка (Bos taurus).
63
Вестник БГУ. Сер. 2. 2009. № 2
Материал и методика
В работе использованы нуклеозидтрифосфаты: ГТФ или ИТФ; глюкоза, глюкозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-дифосфат, 2-фосфоглицерат, фосфоенолпируват, изоцитрат, цитрат, α-кетоглутарат, сукцинат, оксалоацетат (Reanal, Венгрия); пируват, пропионат, ацетил-КоА, лактат (Sigma-Aldrich GmbH,
Германия); остальные реагенты квалификаций «х. ч.» и «ч. д. а» (Реахим, Россия). Для удаления примесей нуклеозидтрифосфаты подвергались дополнительной очистке на колонке (∅ 2,8 × 20 см) с сервацелом ДЭАЭ-32 (Reanal, Венгрия).
Начальную скорость НТФазной реакции измеряли по образованию неорганического фосфата (Pi).
Инкубационная смесь для регистрации активности НТФазы включала: 50 мМ трис-НCl буфер (рН
7,5), 10 мМ MgCl2, 50 мкг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), 0,05 мМ НТФ и образец
белка в конечном объеме 0,2 мл. Реакцию проводили в течение 30 мин при 37 °С, останавливали добавлением 1 мл реагента для определения Pi, инкубировали 25 мин при комнатной температуре
(22 °С) и регистрировали оптическую плотность при длине волны λ = 635 нм в соответствии с методом [11]. При кинетических исследованиях состав реакционной среды (концентрация субстрата и
клеточного метаболита) и время инкубации несколько изменялись в зависимости от цели эксперимента при неизменных фиксированных параметрах реакции. Концентрацию Pi высвобождающегося в
результате ферментативного гидролиза субстрата находили по калибровочному графику, построенному с известными количествами дигидрофосфата калия. За единицу активности (Ед) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль продукта за 1 мин в стандартных условиях испытания. Удельную активность выражали в Ед·мг–1 белка.
Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при λ = 280 нм или по методу [12], используя ЧСА в качестве стандарта.
При графическом анализе данных, требующем построения прямых, рассчитывались уравнения
линейной регрессии по методу наименьших квадратов с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 97. Статистическую обработку данных осуществляли при помощи пакета статистических программ GraphPad Prism 3.0.
Результаты и их обсуждение
Из почек быка была частично очищена растворимая НТФаза с помощью ряда методов, включающих
гидрофобную хроматографию на тойоперле HW-60, гель-фильтрацию на молселекте G-75, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-тойоперле 650М, адсорбционную хроматографию на гидроксиапатите и
гель-фильтрацию на сефакриле S-200. Полученный препарат фермента имел удельную активность
30,3 мкмоль·мин–1·мг–1, что в 252,5 раза выше активности экстракта (данные не приводятся). Все дальнейшие эксперименты осуществлялись на частично очищенном препарате фермента из почек быка.
Влияние различных метаболитов клетки на НТФазу из почек быка
Соединение, 0,05 мM
Контроль
Цитрат
Изоцитрат
α-Кетоглутарат
Сукцинат
Оксалоацетат
Ацетил-КоА
Глюкоза
Глюкозо-6-фосфат
Фруктозо-1,6-дифосфат
2-фосфоглицерат
Фосфоенолпируват
Пируват
Лактат
Пропионат
Относительная активность, %
100
98,9 ± 6,0
99,0 ± 10,5
95,9 ± 7,5
105,6 ± 0,45
100,1 ± 3,0
101,6 ± 3,75
101,7 ± 11,6
90,0 ± 8,7
208,4 ± 0,8 *
96,5 ± 5,8
97,8 ± 11,6
94,7 ± 14,5
32,9 ± 17,4 *
14,4 ± 8,7 *
П р и м е ч а н и е . *Статистически достоверные различия (P < 0,05) по сравнению с контролем.
С целью выяснения биологической роли в метаболизме клетки растворимой НТФазы был исследован ряд интермедиатов гликолиза (глюкоза, глюкозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-дифосфат, 2-фосфо64
Биология
глицерат, фосфоенолпируват, пируват,
лактат), цикла Кребса (изоцитрат, цитрат, α-кетоглутарат, сукцинат, оксалоацетат, ацетил-КоА), а также пропионат.
Не вызывает сомнения тот факт, что
для оценки возможных эффектов перечисленных соединений in vivo необходимо в первую очередь исходить из физиологических концентраций клеточных метаболитов. Согласно данным литературы, содержание промежуточных
продуктов гликолиза и цикла Кребса в
тканях не превышает 100 нмоль/г [13]. В
Рис. 1. Зависимость начальной скорости реакции,
связи с этим эксперименты проводили
катализируемой НТФой из почек быка, от концентрации субстрата
при 0,05 мМ концентрациях метаболив координатах Хейнса: 1 – в отсутствие ингибитора; 2 – в присутствии
тов клетки. В качестве субстрата
0,05 мМ пропионата
НТФазной реакции использовали ГТФ.
Как видно из таблицы, большинство интермедиатов цикла трикарбоновых кислот и гликолиза индифферентны по отношению к изучаемому ферменту, за исключением фруктозо-1,6-дифосфата и
лактата. Первый из них достоверно повышал скорость гидролиза НТФа в два раза (на 208,4 %), тогда
как второй снижал активность НТФазы на 67,1 %. Пропионат в концентрации 0,05 мМ оказывал выраженное ингибирующее действие на фермент почек быка (снижение активности составило 85,6 %).
Следует принимать во внимание и место локализации изучаемого процесса в объеме клетки. Эксперименты по дифференциальному центрифугированию гомогената почек быка показали, что
НТФаза представляет собой цитозольный фермент (данные не приведены). В связи с этим, по нашему
мнению, особенно интересным представляется тот факт, что НТФаза из почек быка чувствительна к
физиологическим концентрациям именно цитозольных метаболитов клетки (фруктозо-1,6-дифосфату
и лактату), что позволяет рассматривать их в качестве естественных модуляторов НТФазной активности in vivo.
Эксперименты по ингибированию НТФазы из почек быка пропионатом с использованием ИТФ в
качестве субстрата показали, что данный метаболит ингибирует растворимый фермент по смешанному
типу (рис. 1). Значения кинетических параметров, полученные по уравнениям линейной регрессии для
прямых в координатах Хейнса, составили: Км0 = 27,4 мкМ и V0макс = 4,14 мкмоль·л–1·мин–1 (для исходной
реакции), Км′ = 34,8 мкМ; 50,1 мкМ и V′макс = 3,97 мкмоль·л–1·мин–1; 0,6 мкмоль·л–1·мин–1 (для
[I] = 0,05 мМ и [I] = 0,1 мМ соответственно). Константа ингибирования, рассчитанная по полученным
данным графическим методом в координатах Км′V0макс/Kм0V′макс− [I] [14], равна 44,2 М.
Известно, что в зависимости от способности комплекса «фермент – ингибитор – субстрат» к превращению субстрата в продукт реакции любой из типов ингибирования может быть полным или частичным.
Для выяснения вида ингибирования необходимо определить зависимость 1/v0 от [I], т. е. построить график Диксона. Представленные в координатах Диксона экспериментальные
данные не дают прямой линии (рис. 2),
что характерно для частично смешанного типа ингибирования.
Не вызывает сомнения тот факт, что
глюкоза является основным энергетическим субстратом для клеток мозга,
коркового слоя почек и некоторых других тканей. Глюкоза, наряду с поступлением в организм с пищей, синтезируется в клетках животных из неуглеводных предшественников. Этот процесс
Рис. 2. Зависимость обратной скорости реакции, катализируемой
особенно важен для жвачных животНТФой из почек быка, от концентрации ингибитора
ных, целлюлозолитические бактерии
в координатах Диксона
65
Вестник БГУ. Сер. 2. 2009. № 2
рубца которых способны эффективно расщеплять целлюлозу растительного корма до глюкозы. Однако образующаяся глюкоза всасывается в кровь не сразу, а подвергается дальнейшему сбраживанию
до короткоцепочечных летучих жирных кислот (ЛЖК), среди которых важнейшую роль играет пропионат [15]. Показано, что перенос ЛЖК через мембраны клеток желудочно-кишечного тракта осуществляется монокарбоксилатным транспортером 1, который принадлежит к семейству генов SLC 16
[16]. Пропионат у жвачных животных является главным субстратом для синтеза глюкозы в тканях,
т. е. для глюконеогенеза. Основная часть пропионата, поступившего из кишечника в кровь, метаболизируется клетками печени, оставшаяся с током крови разносится к другим органам и тканям, где и происходит его превращение в глюкозу в процессе глюконеогенеза. Известно, что в почках, печени и тонком кишечнике по сравнению с другими органами глюконеогенез идет наиболее активно. И этот процесс протекает в цитозоле клетки.
В настоящее время функция растворимой НТФазы из почек быка не известна. Однако, исходя из
сказанного, можно представить, что данный фермент вовлекается в регуляцию скоростей гликолиза и
глюконеогенеза. Этот регуляторный процесс, вероятно, осуществляется следующим образом. В ситуациях недостатка энергии в клетке увеличивается уровень фруктозо-1,6-дифосфата за счет многократной интенсификации гликолиза. Данный интермедиат, как уже было показано, способен активировать растворимую НТФазу почек быка. Кинетические эксперименты выявили, что фермент почек
характеризуется наибольшим сродством к ГТФ и ИТФ – субстратам фосфоенолпируваткарбоксикиназы (ФЕП-карбоксикиназы), фермента, катализирующего образование фосфоенолпирувата из оксалоацетата и ГТФ (или ИТФ) в процессе пируваткиназной реакции (данные не приводятся). В связи с
этим активация НТФазы приводит к повышению скорости гидролиза этих двух субстратов, что может способствовать репрессии ФЕП-карбоксикиназной реакции и глюконеогенеза. В состояниях избытка энергии в клетке наблюдается ингибирование исследуемой НТФазы, что способствует увеличению скорости глюконеогенеза при избытке ГТФ (или ИТФ) посредством повышения ФЕПкарбоксикиназной реакции. В то же время пропионат, как было показано, поступая в ткани и органы,
превращается в глюкозу в процессе глюконеогенеза. Поэтому повышение концентрации пропионата
содействует синтезу глюкозы. Кроме того, пропионат ингибирует НТФазу, что приводит к росту локальных концентраций ГТФ и ИТФ. В итоге активируется ФЕП-карбоксикиназа и «запускается» обходной путь пируваткиназной реакции, что имеет следствием повышение скорости глюконеогенеза.
Полученные нами результаты показывают, что в почках быка содержится растворимая НТФаза,
чувствительная к цитозольным метаболитам клетки – фруктозо-1,6-дифосфату, лактату и пропионату. Первое соединение в физиологических концентрациях активирует фермент, тогда как два других
ингибируют его. Пропионат ингибирует НТФазу почек быка по частично смешанному типу. Основываясь на полученных данных об регуляторных свойствах фермента, можно предположить, что исследуемая НТФаза вовлекается в реципрокную регуляцию скоростей гликолиза и глюконеогенеза, осуществляя контроль на обходном пути пируваткиназной реакции.
1. M e t z l e r D . E . Biochemistry. The chemical reactions of living cells. Harcourt, 2001. С. 1973.
2. C o r t e s P . , D u m l e r F . , G o l d m a n J . , L e v i n N . W . // Diabetes. 1987. Vol. 36. P. 80.
3. K i m S . H . , S m i t h J . , C l a u d e A . , L i n R . J . // EMBO J. 1992. Vol. 11. P. 2319.
4. Z i m m e r m a n H . // Prog. Neurobiol. 1996. Vol. 49. P. 589.
5. W i l l i a m s M . , J a r v i s M . F . // Biochem. Pharmacol. 2000. Vol. 15. P. 1173.
6. H o t h e r s a l l J . S . , M u i r h e a d R . P . , T a y l a u r C . E . // Biochem. Med. Metab. Biol. 1993. Vol. 50. P. 292.
7. L e w i s M . , W e i s s m a n S . // Arch. Biochem. Biophys. 1965. Vol. 109. P. 490.
8. Н а р ы ж н ы й С . Н . , К р у т я к о в В . М . // Биохимия. 1982. Т. 47. С. 569.
9. D a l h m a n n N . , K i r c h g e s s e r M . // Biochem. Int. 1990. Vol. 20. P. 317.
10. B r i g h t w e l l R . , T a p p e l A . L . // Arch. Biochem. Biophys. 1968. Vol. 124. P. 333.
11. L a n z e t t a P . A . , A l v a r e z L . J . , R e i n a c h P . S . , C a n d i a O . A . // Anal. Biochem. 1979. Vol. 100. P. 95.
12. B r a d f o r d M . M . // Ibid. 1976. Vol. 72. P. 248.
13. D a w s o n K . D . // J. Physiol. 2005. Vol. 565. P. 637.
14. К р у п я н к о В . И . Векторный метод представления ферментативных реакций. М., 1990. С. 224.
15. F r e e t l y H . C . , F e r r e l l C . L . // J. Anim. Sci. 1998. Vol. 76. P. 3133.
16. K i r a t D . , T a n i y a m a H . , K a t o S . et al. // J. Physiol. 2006. Vol. 576. P. 635.
Поступила в редакцию 17.01.08.
Виктор Францевич Сивук – младший научный сотрудник Гродненского филиала НПЦ «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси».
66