AA Belov, NF Kazanskaya , VN Filatov, Ye.N. Belova

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2006. Т. 47. № 2
87
УДК 677.494-614:577.15
ИЗМЕНЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА
ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА АЛЬДЕГИДСОДЕРЖАЩИЕ
ТЕКСТИЛЬНЫЕ НОСИТЕЛИ В ПРОЦЕССЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ
И ХРАНЕНИЯ
А.А. Белов*, Н.Ф. Казанская , В.Н. Филатов*, Е.Н. Белова*
(кафедра химической энзимологии; e-mail: ABelov2004@ yandex.ru)
Изучено изменение в процессе хранения протеолитической активности иммобилизованного панкреатического трипсина на модифицированных текстильных носителях на основе целлюлозы и поликапроамида. Показано наличие двух фракций, лабильной и стабильной, в иммобилизованных образцах. Установлено, что максимальное падение протеолитической активности полученных материалов
происходит в процессе высушивания.
Èñïîëüçîâàíèå ôåðìåíòîâ â ìåäèöèíå èìååò ìíîãîëåòíþþ èñòîðèþ. Îñîáîå âíèìàíèå ïðèâëåêëè
ïðîòåàçû – ôåðìåíòû, ãèäðîëèçóþùèå áåëêè. Íà÷àëîì íàó÷íî îáîñíîâàííîãî ïðèìåíåíèÿ ýíçèìîâ êàê
òåðàïåâòè÷åñêèõ ñðåäñòâ â ðàçëè÷íûõ îáëàñòÿõ ìåäèöèíû ñëåäóåò ñ÷èòàòü 50-å ãîäû ÕÕ â. [1]. Äîêàçàíî,
÷òî ôåðìåíòíûì ñèñòåìàì ïðèíàäëåæèò îñíîâíàÿ
ðîëü â î÷èùåíèè ðàí îò ãíîÿ è íåæèçíåñïîñîáíûõ
òêàíåé. Ëå÷åíèå ãíîéíûõ ðàí, íåñìîòðÿ íà çíà÷èòåëüíûå óñïåõè ìåäèöèíñêîé íàóêè, â ñèëó ðÿäà
ïðè÷èí îñòàåòñÿ îäíîé èç îñíîâíûõ ïðîáëåì õèðóðãèè. Ãíîéíûå çàáîëåâàíèÿ è îñëîæíåíèÿ âñòðå÷àþòñÿ
ó 30–35% âñåõ õèðóðãè÷åñêèõ áîëüíûõ [2]. Ïðè ïîëó÷åíèè ðàíåâûõ ïîêðûòèé íåîáõîäèìî ïðèíèìàòü
âî âíèìàíèå òî, ÷òî â îòëè÷èå îò ìàòåðèàëîâ ñ áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ èíîãî íàçíà÷åíèÿ ðàíåâûå
ïîêðûòèÿ – ýòî îäíîðàçîâûå ñðåäñòâà ñ íåáîëüøèì
ñðîêîì ýêñïëóàòàöèè (äî 72 ÷), ïîýòîìó èõ áèîëîãè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü äîëæíà ìàêñèìàëüíî ðåàëèçîâàòüñÿ
ïðè íàëîæåíèè íà ðàíó [3]. Ñîâðåìåííûì íàïðàâëåíèåì â ðàçðàáîòêå ïåðåâÿçî÷íûõ ìàòåðèàëîâ ÿâëÿåòñÿ
îòêàç îò óíèâåðñàëüíûõ ñðåäñòâ, ïðèìåíÿåìûõ â òå÷åíèå âñåãî ïåðèîäà ðàíåâîãî ïðîöåññà, è ïåðåõîä ê
ïîâÿçêàì, ïðåäíàçíà÷åííûì ñïåöèàëüíî äëÿ èñïîëüçîâàíèÿ â òîé èëè èíîé åãî ôàçå â ñîîòâåòñòâèè ñ
êîíêðåòíîé êëèíè÷åñêîé ñèòóàöèåé.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ èìåþòñÿ âîçìîæíîñòè ñîçäàíèÿ âîëîêíèñòûõ ìàòåðèàëîâ, îáëàäàþùèõ áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ [2–5]. Äëÿ ýòîãî ìîãóò áûòü
èñïîëüçîâàíû òðè ñïîñîáà:
1) ïîëó÷åíèå ïîëèìåðîâ ñ òîé èëè èíîé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ïóòåì ñòàòè÷åñêîé ïîëèìåðè-
*ФГУП НИИ текстильных материалов.
6 ВМУ, химия, № 2
çàöèè èëè ïîëèêîíäåíñàöèè ñ ïîñëåäóþùèì ôîðìîâàíèåì âîëîêîí;
2) ââåäåíèå îïðåäåëåííûõ äîáàâîê, îòâåòñòâåííûõ
çà áèîëîãè÷åñêóþ àêòèâíîñòü, â ïðÿäèëüíûå ðàñòâîðû èëè ðàñïëàâû ïîëèìåðîâ íà ñòàäèè ôîðìîâàíèÿ
âîëîêîí;
3) ìîäèôèêàöèÿ ãîòîâûõ âîëîêîí ñ ïîìîùüþ âåùåñòâ, îáóñëîâëèâàþùèõ áèîëîãè÷åñêóþ àêòèâíîñòü.
Ïðè ìîäèôèêàöèè âîëîêîí ñ öåëüþ ïðèäàíèÿ èì
áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ñâÿçü ìåæäó ïîëèìåðíîé
ìàòðèöåé è áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûì âåùåñòâîì ìîæåò áûòü êîâàëåíòíîé, êîîðäèíàöèîííîé è (èëè)
èîííîé. Âûáîð êàæäîãî èç íàçâàííûõ òèïîâ ñâÿçè
îïðåäåëÿåòñÿ ïðàêòè÷åñêèì íàçíà÷åíèåì ñîçäàâàåìûõ
ìàòåðèàëîâ [4, 5].
Экспериментальная часть
 ðàáîòå èñïîëüçîâàëè êàçåèí ïî Ãàììåðñòåíó
(Ðîññèÿ), òðèïñèí (“Spofa”, ×åõèÿ), âñå îñòàëüíûå ðåàêòèâû îòå÷åñòâåííîãî ïðîèçâîäñòâà êâàëèôèêàöèè
íå íèæå “õ.÷.”.
Êîëè÷åñòâî àëüäåãèäíûõ ãðóïï îïðåäåëÿëè ëèáî
êîíäåíñàöèåé â êèñëîé ñïèðòîâîé ñðåäå ñ ãèäðîêñèëàìèíîì, ëèáî îêèñëåíèåì éîäîì â ñëàáîùåëî÷íûõ óñëîâèÿõ [6] ñ ó÷åòîì âëàæíîñòè íîñèòåëÿ. Ñîäåðæàíèå áåëêà íà íîñèòåëå îïðåäåëÿëè ïî ìåòîäó
Ëîóðè–Ãàðòðè [7]. Ïðîòåîëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü
(ÏÀ) îïðåäåëÿëè ìåòîäîì Êóíèòöà (ãèäðîëèç 1%-ãî
ðàñòâîðà êàçåèíà ïî Ãàììåðñòåíó â 1/15 Ì ôîñôàòíîì áóôåðå, ðÍ 8,0) [8]. Íà ðèñ. 1 ïðèâåäåíû èñïîëüçîâàííûå ñõåìû ìîäèôèêàöèè òåêñòèëüíûõ íîñèòåëåé.
88
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2006. Т. 47. № 2
Ñèíòåçèðîâàíû ïðîèçâîäíûå òðèïñèíà íà ÄÀÖ,
ïîëèêàïðîàìèäå, àêòèâèðîâàííîì ãëóòàðîâûì àëüäåãèäîì (ÏÊÀ–ÃÀ) è ÏÊÀ ñ ñîáñòâåííûìè àëüäåãèäíûìè ãðóïïàìè (ÏÊÀ–À) [9, 10]. Äëÿ ïîëó÷åííûõ ïðîèçâîäíûõ áûëî èññëåäîâàíî èçìåíåíèå ÏÀ â ïðîöåññå èììîáèëèçàöèè, âûñóøèâàíèÿ è õðàíåíèÿ. Íàéäåíû
îïòèìàëüíûå óñëîâèÿ, ìåòîä ìîäèôèêàöèè è ñòåïåíü
ìîäèôèêàöèè òåêñòèëüíîãî íîñèòåëÿ äëÿ èììîáèëèçàöèè [9, 10], ïðè êîòîðûõ ïðàêòè÷åñêè íå ïðîèñõîäèò
èíàêòèâàöèè Òð â ïðîöåññå èììîáèëèçàöèè. Äëÿ ñîçäàíèÿ îïòèìàëüíûõ óñëîâèé (ðÍ, òåìïåðàòóðà, ñîñòàâ
ðàñòâîðà äëÿ èììîáèëèçàöèè è òîìó ïîäîáíîå) âûáèðàëè òàêèå ïàðàìåòðû, ÷òîáû â ïðîöåññå èììîáèëèçàöèè îòíîñèòåëüíîå çíà÷åíèå ÏÀ äîñòèãàëî ìàêñèìàëüíîé âåëè÷èíû è íå èçìåíÿëîñü äî íà÷àëà âûñóøèâàíèÿ îáðàçöîâ, à ïàäåíèå ÏÀ â ïðîöåññå õðàíåíèÿ
îêàçûâàëîñü ìèíèìàëüíûì. Ñíèæåíèå ÏÀ ïðè èììîáèëèçàöèè â ìîêðûõ îáðàçöàõ ìîæåò ïðîèñõîäèòü
âñëåäñòâèå àâòîëèçà â ñëàáî êèñëûõ, íåéòðàëüíûõ èëè
ùåëî÷íûõ çíà÷åíèÿõ ðÍ. Êàê îòìå÷àëîñü ðàíåå [11,
12], ìîäèôèêàöèÿ (ñâÿçûâàíèå ñ àëüäåãèäàìè) ε-àìèíîãðóïïû òðèïñèíà íå âåäåò ê çíà÷èòåëüíîìó ïàäåíèþ ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè ïîñëåäíåãî. Íà ðèñ. 2
è 3 ïðåäñòàâëåíû çàâèñèìîñòè èçìåíåíèÿ ïðîòåîëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè èììîáèëèçîâàííûõ ïðåïàðàòîâ Òð
â ïðîöåññå èììîáèëèçàöèè è õðàíåíèÿ (ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, â òåìíîòå). Íåîáõîäèìî îòìåòèòü, ÷òî
ãðàôèêè ïðèâåäåíû äëÿ îáðàçöîâ, ïîëó÷åííûõ â îïòèìàëüíûõ óñëîâèÿõ.
Ïîòåðÿ ÏÀ â ïðîöåññå âûñóøèâàíèÿ èììîáèëèçîâàííûõ ïðåïàðàòîâ – ôàêò, õîðîøî èçâåñòíûé èç
ëèòåðàòóðíûõ èñòî÷íèêîâ [11, 13]. Ìîëåêóëà áåëêà â
âîäíîì ðàñòâîðå îêðóæåíà ãèäðàòíîé îáîëî÷êîé, îáðà-
Рис. 1. Схемы получения модифицированных текстильных
носителей
çîâàííîé ìîëåêóëàìè âîäû, ñâÿçàííûìè ñ ïîâåðõíîñòüþ áåëêà âîäîðîäíûìè ñâÿçÿìè [14]. Ýòà âîäíàÿ
îáîëî÷êà (èëè, ïî êðàéíåé ìåðå, íåêîòîðàÿ åå ÷àñòü)
ÿâëÿåòñÿ íåîòúåìëåìîé ñîñòàâíîé ÷àñòüþ áåëêà è íåîáõîäèìà äëÿ ïîääåðæàíèÿ åãî ñòðóêòóðû è íîðìàëüíîãî ôóíêöèîíèðîâàíèÿ. Óäàëåíèå ñâÿçàííûõ ìîëåêóë
âîäû â ïðîöåññå âûñóøèâàíèÿ (ïîä äåéñòâèåì îðãàíè÷åñêèõ ðàñòâîðèòåëåé, íàãðåâàíèÿ) ïðèâîäèò ê çíà÷èòåëüíûì èçìåíåíèÿì. Ïðè÷åì, êàê âûÿñíèëîñü, íàõîæäåíèå âëàæíîãî ïðåïàðàòà (îñòàòî÷íàÿ âëàæíîñòü 60–
70%) â òå÷åíèå òðåõ ñóòîê ïðè òåìïåðàòóðå 5±2°Ñ
íå âåäåò ê èçìåíåíèþ ÏÀ. Âûñóøèâàíèå ðàñòâîðîâ
ôåðìåíòîâ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå îáû÷íî âûçûâàåò ïîëíóþ èíàêòèâàöèþ ïîñëåäíèõ [13, ÷. 1, ñ. 29],
ïîýòîìó ïîëó÷èòü àêòèâíûé ïðåïàðàò ôåðìåíòà óäàåòñÿ òîëüêî ïðè âûñóøèâàíèè â óñëîâèÿõ ãëóáîêîãî
âàêóóìà ïðè íèçêîé òåìïåðàòóðå. Ïîëó÷åííûé òàêèì
ñïîñîáîì íåìîäèôèöèðîâàííûé ôåðìåíò ìîæíî õðàíèòü ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå áåç çíà÷èòåëüíîé
ïîòåðè ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè. Òåì íå ìåíåå ïðè
õðàíåíèè íàòèâíûõ ôåðìåíòîâ â âèäå ñóáñòàíöèé è
ëåêàðñòâåííûõ ôîðì ñëåäóåò ó÷èòûâàòü èõ íåäîñòàòî÷íóþ ñòàáèëüíîñòü. Íåîáõîäèìî ñîäåðæàíèå èõ ïðè
íèçêèõ òåìïåðàòóðàõ â çàùèùåííîì îò ïðÿìîãî ñâåòà
ìåñòå, ïðè÷åì â áîëüøèíñòâå ñëó÷àåâ ñðîê ãîäíîñòè
ïðåïàðàòîâ äàæå ïðè òàêîì ðåæèìå íå ïðåâûøàåò îäíîãî ãîäà. Íåñòàáèëüíîñòü ôåðìåíòîâ îãðàíè÷èâàåò
âîçìîæíîñòè ñîçäàíèÿ ìÿãêèõ ëåêàðñòâåííûõ ôîðì â
âèäå àýðîçîëåé (îñîáåííî ýòî êàñàåòñÿ ïðîòåîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ). Íåäîñòàòî÷íàÿ ñòàáèëüíîñòü ðàñòâîðîâ
ôåðìåíòîâ ñîçäàåò îïðåäåëåííûå ñëîæíîñòè ñ èõ èñïîëüçîâàíèåì. Òàêèì îáðàçîì, èììîáèëèçàöèÿ ôåðìåíòîâ äîëæíà ïðèâîäèòü ê óâåëè÷åíèþ ñòàáèëüíîñòè
ñóáñòàíöèè è ðàñòâîðîâ ôåðìåíòîâ, ÷òî ïîçâîëèò ñòàíäàðòèçîâàòü èõ. Îñîáîå âíèìàíèå ñëåäóåò îáðàòèòü íà
óñëîâèÿ õðàíåíèÿ èììîáèëèçîâàííûõ ïðåïàðàòîâ. Ñòàáèëüíîñòü ëåêàðñòâåííûõ ôîðì è ôàðìàöåâòè÷åñêèõ
ïðåïàðàòîâ â ïðîöåññå õðàíåíèÿ îïðåäåëÿåòñÿ “ñðîêîì
ãîäíîñòè”, â òå÷åíèå êîòîðîãî óðîâåíü êà÷åñòâåííûõ è
êîëè÷åñòâåííûõ èçìåíåíèé õàðàêòåðèñòèê ëåêàðñòâåííîé ôîðìû äîñòèãàåò ïðåäåëà, îïðåäåëÿåìîãî òðåáîâàíèåì äåéñòâóþùåé Ãîñóäàðñòâåííîé Ôàðìàêîïåè èëè
èíîé ÍÒÄ íà äàííîå ìåäèöèíñêîå èçäåëèå [15]. Âàæíîñòü ïðîáëåìû ñòàáèëüíîñòè îïðåäåëÿåòñÿ äâóìÿ
âàæíåéøèìè òðåáîâàíèÿìè:
1) àêòèâíûé èíãðåäèåíò ëåêàðñòâåííîé ôîðìû íå
äîëæåí áûñòðî èçìåíÿòüñÿ ïðè õðàíåíèè;
2) ôàðìàöåâòè÷åñêàÿ ïðîìûøëåííîñòü äîëæíà ãàðàíòèðîâàòü ñîäåðæàíèå òåðàïåâòè÷åñêîé äîçû àêòèâíîãî èíãðåäèåíòà ëåêàðñòâåííîé ôîðìû â òå÷åíèå
îïðåäåëåííîãî ñðîêà.
 ïîäàâëÿþùåì áîëüøèíñòâå ñëó÷àåâ àêòèâíîñòü
ôåðìåíòîâ ïðè èììîáèëèçàöèè ñíèæàåòñÿ. Ïðè÷èíû
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2006. Т. 47. № 2
Рис. 2. Изменение при хранении ПА трипсина, иммобилизованного на модифицированные текстильные носители
ýòèõ ÿâëåíèé äîñòàòî÷íî õîðîøî èçó÷åíû [11, 12].
Ìîæíî óñëîâíî âûäåëèòü òðè îñíîâíûå ñòàäèè èçìåíåíèÿ ÏÀ â ïðîöåññå èììîáèëèçàöèè. Çà 100%
ïðèíèìàåòñÿ çíà÷åíèå ÏÀ âî âëàæíîì ñîñòîÿíèè (äî
âûñóøèâàíèÿ) – ìàêñèìàëüíîå çíà÷åíèå ÏÀ èììîáèëèçîâàííîãî ïðåïàðàòà, è îòíîñèòåëüíî ýòîãî çíà÷åíèÿ ðàññìàòðèâàþòñÿ âñå äàëüíåéøèå èçìåíåíèÿ
ÏÀ. Ïîñëå âûñóøèâàíèÿ èììîáèëèçîâàííûõ îáðàçöîâ
çíà÷åíèå ÏÀ ñîñòàâëÿåò îò 30 äî 60% îò ïåðâîíà÷àëüíîãî (â çàâèñèìîñòè îò óñëîâèé èììîáèëèçàöèè,
èñïîëüçîâàííûõ áåëêîâ èëè íîñèòåëåé). Äàííîå ÿâëåíèå íå ñâÿçàíî ñ ïîïàäàíèåì ìîëåêóë áåëêà â
ïîðû ìàòðèöû, ïîñêîëüêó èìååò ìåñòî, êàê â ñëó÷àå
öåëëþëîçíûõ, òàê è â ñëó÷àå ÏÊÀ-íîñèòåëåé (íåñìîòðÿ íà îòñóòñòâèå ïîð ó ïîñëåäíèõ). Ïðîöåññ âûñóøèâàíèÿ èììîáèëèçîâàííîãî ïðåïàðàòà – ñòàäèÿ
“ñâåðõáûñòðîãî” ñíèæåíèÿ ÏÀ, ñâÿçàííîãî, ñêîðåå
âñåãî, ñ ïîòåðåé âîäû (èçìåíåíèå ìèêðîîêðóæåíèÿ
ôåðìåíòà). Ýòîò ïðîöåññ íåîáðàòèì, è íèêàêèìè èçâåñòíûìè íàì ìåòîäàìè íåâîçìîæíî âîññòàíîâèòü
çíà÷åíèå ÏÀ èììîáèëèçîâàííûõ ïðåïàðàòîâ íà 100%.
Óìåíüøåíèå ÏÀ ñâÿçàíî â îñíîâíîì ñ ïåðåõîäîì
ôåðìåíòà èç ñîñòîÿíèÿ ñ âëàæíîñòüþ 100% â ñîñòîÿíèå ñ âëàæíîñòüþ 4–6%. Êàê èçâåñòíî, äåãèäðàòàöèÿ áåëêà äàæå â ïðîöåññå ëèîôèëèçàöèè ìîæåò
ïðèâîäèòü ê åãî ÷àñòè÷íîé äåíàòóðàöèè.
Ôóíêöèè áåëêà, òàêæå êàê è åãî ñòàáèëüíîñòü, îïðåäåëÿþòñÿ àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ, êîòîðàÿ â ñâîþ î÷åðåäü îáóñëîâëèâàåò êîëëåêòèâíûå
âçàèìîäåéñòâèÿ, ïðèâîäÿùèå ê ôîðìèðîâàíèþ ñïåöèôè÷åñêîé êîíôîðìàöèè [17]. Õèìè÷åñêàÿ ìîäèôèêàöèÿ ïðèâîäèò ê ñòðóêòóðíûì èçìåíåíèÿì áåëêà
(èíîãäà î÷åíü íåáîëüøèì), ÷òî âûçûâàåò çíà÷èòåëüíûå èçìåíåíèÿ åãî ñòàáèëüíîñòè. Ìîäèôèêàöèÿ
ε-àìèíîãðóïï â ìîëåêóëå Òð ïðèâîäèò ê ðàçðûâó
ðÿäà ÷óâñòâèòåëüíûõ (íåêîâàëåíòíûõ) ñâÿçåé è èç7 ВМУ, химия, № 2
89
ìåíåíèþ ñâîéñòâ èììîáèëèçîâàííîãî ïðåïàðàòà. Ïðîèñõîäÿùàÿ äåãèäðàòàöèÿ ôåðìåíòà ïðè âûñóøèâàíèè
èììîáèëèçîâàííûõ ïðåïàðàòîâ Òð ìîæåò ïðèâîäèòü
ê èçìåíåíèþ ñòðóêòóðû áåëêà. Äàæå ïðè õðàíåíèè
â ñóõîì ñîñòîÿíèè ìîæåò ïðîèñõîäèòü èíàêòèâàöèÿ
áåëêà èç-çà ðàçíûõ íåæåëàòåëüíûõ ïðîöåññîâ, íàïðèìåð àãðåãàöèè èëè îêèñëåíèÿ [18]. Äëÿ âòîðîé
ñòàäèè èíàêòèâàöèè, õàðàêòåðèçóþùåé ëàáèëüíóþ
ôðàêöèþ îáðàçöà, òàêæå õàðàêòåðíà îòíîñèòåëüíî áûñòðàÿ ïîòåðÿ ÏÀ èììîáèëèçîâàííîãî Òð.  ñëó÷àå
íàøèõ îáðàçöîâ ýòà ñòàäèÿ ïðîäîëæàëàñü â òå÷åíèå
2–6 ìåñ õðàíåíèÿ â âûøåïðèâåäåííûõ óñëîâèÿõ. Â
òå÷åíèå ïîñëåäóþùåãî âðåìåíè íàáëþäåíèÿ ïðîèñõîäèò òðåòüÿ, ìåäëåííàÿ, ñòàäèÿ èíàêòèâàöèè.
Ïîëó÷åííûå äàííûå ìîãóò áûòü îáúÿñíåíû íå
òîëüêî íàëè÷èåì “ëàáèëüíîé” è “ñòàáèëüíîé” ôðàêöèé èììîáèëèçîâàííîãî ôåðìåíòà, õîðîøî èçâåñòíûõ
äëÿ ôåðìåíòîâ, èììîáèëèçîâàííûõ íà ïðîèçâîäíûõ
öåëëþëîçû [19, 20]. Ïîñêîëüêó ãèãðîñêîïè÷íîñòü íîñèòåëÿ äîñòàòî÷íî âûñîêà (âëàæíîñòü èññëåäóåìûõ
öåëëþëîçíûõ ïðåïàðàòîâ ñîñòàâëÿåò 5%, à ïîëèàìèäíûõ – 2%), à àçîìåòèíîâàÿ ñâÿçü íåóñòîé÷èâà,
èíàêòèâàöèÿ èììîáèëèçîâàííûõ ïðåïàðàòîâ â ïðîöåññå õðàíåíèÿ ìîæåò áûòü âûçâàíà òåìè æå ïðè÷èíàìè, ÷òî è â ðàñòâîðå ôåðìåíòà, íî ïðîöåññ ïðîòåêàåò ñ ìåíüøåé ñêîðîñòüþ. Íà ðèñ. 3 ïðèâåäåíû
êèíåòè÷åñêèå äàííûå, ïðåäñòàâëåííûå â ïîëóëîãàðèôìè÷åñêèõ êîîðäèíàòàõ, îá èçìåíåíèè ÏÀ èììîáèëèçîâàííîãî íà ìîäèôèöèðîâàííûõ òåêñòèëüíûõ íîñèòåëÿõ Òð. Êèíåòèêà èíàêòèâàöèè èììîáèëèçîâàííûõ
ôåðìåíòîâ â ïðîöåññå õðàíåíèÿ îïèñûâàåòñÿ õàðàêòåðíîé äëÿ ãèäðîãåíàç ñëîæíîé ýêñïîíåíöèàëüíîé
çàâèñèìîñòüþ [19, 20]
(A τ /A 0 = a1´e–k1τ + a2´e–k2τ ).
Рис. 3. Кинетика изменения при хранении ПА трипсина, иммобилизованного на модифицированные
текстильные носители
90
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2006. Т. 47. № 2
Çíà÷åíèå ýôôåêòèâíîé êîíñòàíòû èíàêòèâàöèè
–1
(kèí) äëÿ ëàáèëüíîé ôðàêöèè ñîñòàâëÿåò 0,20 ìåñ ,
–1
à äëÿ ñòàáèëüíîé – 0,071 ìåñ .  ïîëóëîãàðèôìè÷åñêèõ êîîðäèíàòàõ óñòàíîâëåííûå çàâèñèìîñòè èìåþò âèä ëîìàíîé ëèíèè, êàæäàÿ èç êîòîðûõ îïèñûâàåòñÿ óðàâíåíèåì ïåðâîãî ïîðÿäêà. Äâóõôàçíàÿ êèíåòèêà èíàêòèâàöèè èììîáèëèçîâàííûõ ôîðì ïðîòåèíàç – ôàêò èçâåñòíûé [11, 12, 19, 21]. Êèíåòè÷åñêèå çàêîíîìåðíîñòè òàêîãî ðîäà ìîãóò áûòü îáúÿñ-
íåíû îáùèì ìåõàíèçìîì èíàêòèâàöèè, âêëþ÷àþùèì
ñóùåñòâîâàíèå äâóõ ôîðì ôåðìåíòà, ðàçëè÷àþùèõñÿ
àêòèâíîñòüþ è óñòîé÷èâîñòüþ ê äåíàòóðèðóþùèì
âîçäåéñòâèÿì. Âíå çàâèñèìîñòè îò êîíêðåòíûõ äåòàëåé ìåõàíèçìà è ñîîòíîøåíèÿ ýëåìåíòàðíûõ êîíñòàíò äâóõýêñïîíåíöèàëüíûé õàðàêòåð èíàêòèâàöèè
ïîêàçûâàåò, ÷òî åå ìåõàíèçì âêëþ÷àåò äâå ðàçëè÷àþùèåñÿ ïî àêòèâíîñòè èëè óñòîé÷èâîñòè ôîðìû
ôåðìåíòà.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Веремеенко К.Н. Ферменты в оториноларингологии. Киев, 1980.
2. Толстых П.И., Скобелкин О.К., Дербенев В.А., Эфендиев А.И.
Использование углекислотного лазера, низкочастотного ультразвука и иммобилизованных ферментов протеолиза на волокнистых материалах в гнойной хирургии. Баку, 1992.
3. Юданова Т.Н. Дис. … докт. хим. наук. М., 2004.
4. Вольф Л.А. // 3-й симпозиум по физиологически активным синтетическим полимерам и макромолекулярным моделям биополимеров. Тез. докл. Рига, 1971.
5. Белов А.А., Белова Л.А., Филатов В.Н. и др. // Вестн. Моск. ун-та.
Сер. 2. Химия. 2003. 44. С. 16.
6. Белов А.А., Рыльцев В.В., Гриценко С.И. // Сб. научн. тр. ВНИИТГП. М., 1990. С. 36.
7. Белов А.А., Плеханова Н.Ю., Вирник Р.Б., Игнатюк Т.Е. // Сб.
научн. тр. ВНИИТГП. М., 1988. С. 25.
8. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. // Химико-фармацевтический журнал. 1992. № 11–12. C. 101.
9. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Способ
получения целлюлозных материалов, содержащих иммобилизованный трипсин. Авт. св. от 24.11.89. № 1773067 (положительное решение от 01.07.1992 г.).
10. Белов А.А., Рыльцев В.В., Гриценко С.И., Филатов В.Н. Заявка
4855929/05/083643 от 31.07.90 г. (положительное решение от
26.06.91).
11. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы / Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека. М., 1976. Т. 1.
12. Торчилин В.П., Бобкова А.С., Смирнов В.Н. и др. // Биоорг.
химия. 1976. 2. № 1. С. 116.
13. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М., 1983.
14. Белова А.Б., Можаев В.В., Левашов А.В. и др. // Биохимия. 1991.
56. № 11. С. 1923.
15. а) Прогнозирование сроков годности лекарственных форм. М.,
1977; б) Временная инструкция по проведению работ с целью
определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре
И-42-2-82. М., 1983.
16. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы
фотобиологических процессов. М., 1989.
17. Тяги Р., Гупта М.Н. // Биохимия. 1998. 63. № 3. С. 395.
18. Константино Г.Р., Швендеман С.Р., Лангер Р., Клибанов А.М. /
/ Биохимия. 1998. 63. № 3. С. 422.
19. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика (практический
курс). М., 1999. С. 230.
20. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. // Радиационная биология. Радиоэкология. 1994. 34. № 2. С. 306.
21. Хорунжина С.И., Хохлова Б.А., Шамолина И.И., Вольф Л.А. //
ЖПХ. 1978. № 3. С. 651.
Поступила в редакцию 01.12.05
CHANGE IN PROTEOLYTIC ACTIVITY OF TRYPSIN IMMOBILIZED
ON ALDEHYDE-CONTAINING TEXTILE CARRIERS IN THE COURSE
OF IMMOBILIZATION AND STORAGE
A.A. Belov, N.F. Kazanskaya , V.N. Filatov, Ye.N. Belova
(Division of Chemical Enzymology)
Change in proteolytic activity of pancreatic trypsin immobilized on modified textile
carriers on the basis of cellulose and polycaproamide during storage of the enzyme was
studied. Immobilized samples were shown to contain two fractions, labile and stabile. It
was found that maximal decrease in proteolytic activity of materials occurs during drying
process.