механизмы серологических реакций

Министерство образования и науки Российской Федерации
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
О. П. Комкова, А. М. Образцова, Н. А. Сидорова
МЕХАНИЗМЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
Методические указания для студентов
медицинского факультета
Петрозаводск 2006
Печатаются по решению редакционно-издательского совета
Петрозаводского государственного университета.
Рецензент
доктор биологических наук Е. К. Олейник
Комкова, О. П.
Механизмы серологических реакций: Методические указания для студентов медицинского факультета / О.П. Комкова,
А. М. Образцова, Н. А. Сидорова; ПетрГУ. − Петрозаводск,
2006. − с.
Методические указания разработаны для лабораторных занятий по
практической иммунологии для студентов медицинского факультета. В
издании изложены классические серологические методы выявления и количественного определения антигенов и антител, дана характеристика антигена и антитела, описаны принципы методов и их практическое применение.
ПРЕДИСЛОВИЕ
Методические указания по механизмам серологических реакций составлены в соответствии с программой курса иммунологии для студентов медицинских специальностей вузов на основе учебной литературы по
иммунологии и материалах, излагаемых в лекциях.
Задача настоящих указаний – помочь студентам овладеть методами
серологических реакций, углубить и закрепить полученные знания. Предложенный материал рассчитан для студентов курсов, знакомых с основами органической химии, биохимии, молекулярной биологии.
Основная часть материала посвящена классическим серологическим
методам выявления и количественного определения антигенов и антител.
Описаны принципы, возможности методов и их практическое применение. Это позволит студентам свободно ориентироваться в накопленном
экспериментальном материале, правильно подходить к выбору методов
исследования и интерпретировать данные в дальнейшей профессиональной деятельности.
Подробное изложение материала поможет студентам самостоятельно выполнять предлагаемые задания и правильно оформлять полученные результаты.
3
ВВЕДЕНИЕ
В основе всех реакций иммунитета лежит специфическое
взаимодействие антитела (Ат) с антигеном (Аг). Эти реакции
называют серологическими, так как для их постановки используют сыворотки (serum), содержащие Ат. В серологических реакциях один компонент (ингредиент) должен быть всегда известен. Серологические реакции применяются в следующих случаях:
а) для определения неизвестного Аг (бактерия, вирус, токсин
и др.) с помощью известного Ат (иммунная сыворотка);
б) для определения Ат в сыворотке с помощью известного Аг.
В зависимости от состояния Аг и особенностей среды, в
которой взаимодействуют Аг и Ат, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента,
иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа и другие.
4
МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНА С
АНТИТЕЛОМ
Взаимодействие антигена со специфическим антителом
проявляется в организме образованием иммунных комплексов. Свойства комплекса АГ – АТ показано на рисунке 1.
Прочному взаимодействию АГ с АТ способствуют: количество детерминант в АГ, количественное соотношение, последовательность расположения концевых групп аминокислот в
детерминанте, наличие в детерминанте ароматических аминокислот, аффинность и авидность (рис. 2).
Аффинитет – это связь одного активного центра: Fab 1
или Fab 2 и детерминанты.
Авидность – это cвязь всех активных цетров: Fab1 и
Fab2 с детерминантами.
5
Свойства комплекса АГ – АТ
обратимая
аффинитетом
авидностью
измеряется
нековалентная
Взаимосвязь с поверхностными структурами АГ и АТ
прочная
Связь АГ-АТ
В комплексе не
происходит
инактивации
АГ и АТ
КОМПЛЕКС АГ-АТ
Формируется
при оптимальном соотношении
АГ и АТ
Приобретает новые свойства в отличие от свойств
составляющих его компонентов
Спирохты + АТ→ сорбирует бактерии
Комплекс холерный вибрион +АТ→сорбирует тромбоциты
Растворимый или
корпускулярный АГ
+АТ→ прикрепляется к Fc рецепторам на макрофагах
Растворимый или
корпускулярный АГ
+АТ→ присоединяет к → активация
себе комплемент
комплемента
Растворимый или
корпускулярный АГ
+АТ + комплемент
Растворимый или
корпускулярный АГ
+АТ→ комплекс средних размеров индуцирует
иммунокомплексный тип алергии
→ присоединяется к рецепторам
комплемента на макрофагах
СХЕМАТИЧЕСКОЕ ИЗОБРАЖЕНИЕ СТЕПЕНИ
АФФИНИТЕТА И АВИДНОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ
ОТ СТЕРИЧЕСКОГО СООТВЕТСТВИЯ РЕАГИРУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ –АГ и АТ
Связь одного активного центра: Fab 1 или Fab 2 и детерминанты – аффинитет.
Связь всех активных цетров: Fab1 и Fab2 с детерминантами – авидность.
детерминанта
АГ
детерминанта
авидность
аффинитет
АГ
детерминанта
АГ
Неполное
стерическое
соответствие
Отсутствие стерического
соответствия
антитело
антитело
антитело
высокий
аффинитет и
авидность
средний
аффинитет и
авидность
слабый
аффинитет и
авидность
7
МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АГ И АТ
(детерминанты и активного центра)
Электростатические Притяжение между двумя протисилы
воположно заряженными ионизированными группами
(NH3+
и СОО- )
Водородные
Образование слабых водородных
связи
связей мнжду ОН, NН2 и СООН
гидрофильными группами.
Гидрофобные
При соприкосновении гидрофобвзаимодействия
ных групп белков в воде наступает
их взаимное притяжение.
Вандерваальсовы
Взаимодействие внешних элексилы
тронных облаков, зависящее от
площади контакта АГ и АТ и
встречи зарядов противоположного знака.
Реакции АТ с АГ протекают также в системе «in vitro» и
имеют ряд типичных характеристик: потребность в электролитах, обратимость, двухфазность (фаза взаимодействия активного центра АТ и детерминант АГ – несколько секунд или
минут; фаза проявления – визуально наблюдаемый эффект несколько минут или часов).
8
Часто такие реакции называют серологическими (от латинского «serum» – сыворотка), так как источником АТ служит
сыворотка крови.
В связи с высокой чувствительностью и специфичностью
серологические реакции нашли широкое диагностическое
применение.
Серологические реакции применяют для двух целей:
1. По известному АГ определяют в исследуемой сыворотке
титр специфических к данному АГ антител. Титром сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое еще дает
положительную реакцию с соответствующим АГ.
2. С помощью известного АТ, т.е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале
специфического антигена или осуществляют серологическую
идентификацию выделенной чистой культуры возбудителя.
Все серологические реакции можно разделить на несколько
групп:
1. Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в растворе электролита: реакция агглютинации в ее различных вариантах, реакция преципитации и ее различные
модификации.
2. Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция
связывания комплемента, иммунного гемолиза и их модификации.
3. Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: реакции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции торможения гемагглютинации.
4. Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсонофагоцитарная реакция и другие.
5. Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.
6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы:
ИФА, РИА.
9
АНТИГЕНЫ
Для серологических реакций могут быть использованы целые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоциты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, опухолевые
клетки и т.д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА,
РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (растворимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации,
нейтрализации, ИФА и других.
Принципы получения корпускулярного антигена:
Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивированные) клетки в изотонических или буферных растворах.
При инактивации клеток пользуются методами, не вызывающими изменения специфичности и снижения иммуногенных свойств.
Микроорганизмы инактивируют: 1) высокой температурой,
подвергая медленному нагреванию во избежание денатурации
белков; 2) химическими веществами (формалином, спиртом
и другими); 3) ультразвуком, ультрафиолетом и рентгеновскими лучами. Облучением, в частности, инактивируют опухолевые клетки.
Стандартные антигены из инактивированных патогенных
микроорганизмов широко применяются в серологическом
анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и животных.
С помощью серологических реакций выявляют у исследуемых бактериальных клеток антигенный состав.
Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в серологических реакциях используют для определения локализованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови,
СД-маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и
других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим
антигенам.
10
Принципы получения растворимых антигенов
Для изучения природы, функции и иммуногенности отдельных антигенных веществ, входящих в состав клеток или
других сложных систем, а также для выявления антител к отдельным антигенам, необходимо получить антигены в чистом
виде. Это многоступенчатый процесс, требующий применения
комбинаций различных методов.
Антигены прокариот и эукариот получают экстрагированием различными растворителями целых или дезинтегрированных клеток.
Так, из целых микробных клеток обычно экстрагируют вещества, которые нековалентно интегрированы в состав клеточной стенки. Например, белок А золотистого стафилококка
и липополисахарид наружной мембраны Гр (-) бактерий.
Чаще экстракции предшествует дезинтеграция клеток.
Наиболее часто клетки разрушают: 1) механически в специальных приборах (дезинтеграторах и прессах); 2)клетки
можно разрушить, воздействуя на них ультразвуком; 3) при
помощи ферментов, которые разрывают ковалентные связи,
разрушают отдельные клеточные структуры; 4) при помощи
детергентов, которые связывают молекулы белков и липидов.
Полученную дезинтегрированную клеточную массу разделяют на отдельные клеточные компоненты, применяя различные виды центрифугирования: дифференциальное, зональное,
равновесное в градиенте плотности.
Отдельные антигены из дезинтегрированных или интактных клеток, а также из их изолированных структур экстрагируют дистиллированной водой, буферами, растворами кислот,
щелочей и т. д.
Экстракты – это сложные смеси антигенов и дополнительных балластных веществ.
11
Антигены выделяют и очищают фракционированием различными методами: избирательным осаждением солями тяжелых металлов, гельфильтрацией, аффинной хроматографией с использованием моноклональных антител.
Высокая степень очистки микробных и тканевых антигенов имеет большое практическое значение, так как повышает
чувствительность серологических реакций, следовательно,
эффективность диагностики.
Принципы получения иммунных сывороток.
Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой
сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену.
В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают
экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.
В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, - их высокая специфичность и достаточное содержание антител.
По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические - к одному конкретному
антигену.
Получить моноспецифические сыворотки можно: 1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены, 2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности. Для этого используют: 1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ АТ и выделением антител;
12
2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические
перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные антитела.
Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы
антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой)
принадлежности и авидности, поскольку синтезируются разными клонами лимфоцитов, вовлеченными в иммунный ответ
Идентичными по всем характеристикам являются антитела
к одной антигенной детерминантной группе, продуцируемые
клеточным клоном, происходящим из одного лимфоцита, т. е.
моноклональные антитела.
Для иммунизации животных готовят корпускулярные или
растворимые антигены различной степени очистки в зависимости от задач исследования.
Получение сыворотки, отвечающей предъявляемым требованиям, во многом зависит от кратности, сроков и способов
введения антигенов.
Способы введения антигенов животным могут быть различными (внутривенные, подкожные, внутрикожные и другие). Хорошо комбинировать внутривенное и локальное введение антигенов.
Количество антител в полученной сыворотке устанавливают титрованием ее в соответствующей серологической реакции с гомологичным антигеном.
13
РЕАКЦИИ, ПРОТЕКАЮЩИЕ С УКРУПНЕНИЕМ
АНТИГЕНА
1. Реакции агглютинации
Феномен агглютинации заключается в способности АТ
(агглютининов) связываться с корпускулярными АГ (агглютиногенами), склеивая их в агрегаты (агглютинаты), которые выпадают в осадок в присутствии электролита.
Механизм реакции агглютинации описывается теорией
«решетки», согласно которой агглютинат образуется при соединении одного активного центра 2-х валентного антитела с
детерминантной группой АГ, а второго активного центра – с
детерминантной группой другого АГ.
Рис. Схема реакции прямой агглютинации
По характеру агглютината различают зернистую и крупнохлопчатую агглютинацию. Зернистая наблюдается при агглютинации безжгутиковых бактерий, хлопчатая - у жгутиковых
бактерий.
14
Различают прямую и непрямую (пассивную) реакции агглютинации. Антигеном в прямой реакции агглютинации могут быть микробные клетки, эритроциты, лейкоциты.
Способы постановки реакции агглютинации:
Существуют различные варианты постановки реакции агглютинации, из которых наиболее распространены пластинчатая и объемная (развернутая) реакции.
Пластинчатую реакцию агглютинации выполняют на
стеклянных или фарфоровых пластинках с гладкой и тщательно обезжиренной поверхностью для обеспечения растекания реагентов. Применяют ее как ускоренный ориентировочный метод обнаружения антител, а также для идентификации
клеточных антигенов (микробных, эритроцитарных, лейкоцитарных). В зависимости от задач эксперимента в капле сыворотки на стекле агглютинируют известный диагностикум, исследуемые микробные или другие клетки.
Этот вариант реакции агглютинации отличается простотой постановки и позволяет быстро анализировать большое количество проб сыворотки или культур микроорганизмов. Положительная реакция прямой агглютинации на стекле имеет диагностическое
значение только при использовании адсорбированных сывороток.
Рис. Пластинчатая реакция агглютинации
15
Развернутую реакцию агглютинации проводят в пробирках
или в лунках полистероловых пластин с несколькими последовательными разведениями сыворотки, в которые вносят
одинаковые количества антигена. Эта реакция дает возможность определить не только количество антител, но и идентифицировать микроорганизмы при использовании неадсорбированных сывороток.
Рис. Развернутая реакция агглютинация
В инфекционной патологии и эпидемиологии РА наиболее
применима в следующих направлениях:
а) для выявления АТ у больного, носителя, переболевшего и
иммунизированного.
Исследуемую сыворотку титруют в изотоническом (физиологическом) растворе двукратно и последовательно (например, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д.) в пробирках лунках и добавляют
корпускулярный антиген, чаще стандартные диагностикумы.
16
Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или
формалином определенных микробных клеток с известным
содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена
могут быть использованы также взвеси живых бактерий.
Феномен реакции проявляется предварительно через два
часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при
комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики
представляет интерес положительная реакция только в определенном титре сыворотки, который служит диагностическим.
Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туляремии -1:100.
Для выявления антител можно ставить экспрессные реакции агглютинации (время учета несколько минут). Например:
1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю
цельной крови больного на специальном стекле наносят каплю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляремийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2
минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков.
2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютинации по Хеддельсону при бруцеллезе.
Данные реакции не позволяют определить количество антител в сыворотке.
б) для идентификации чистой культуры возбудителей инфекционных болезней.
С этой целью используются иммунные диагностические
агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтами
вакцин и сывороток, путем иммунизации животных целыми
микробными клетками.
Для достоверности сыворотки лучше использовать адсорбированные, чтобы в них содержались только антитела, соответствующие определенному виду или типу микроорганизма.
17
При идентификации (серотипирования) чистой культуры
возбудителя часто ставят ориентировочную пластинчатую реакцию агглютинации. На стекла вносят капли диагностических агглютинирующих сывороток, в которые вносят изучаемую чистую культуру возбудителя. Результат учитывается
через несколько минут.
Если сыворотки неадсорбированные – после ориентировочной ставят развернутую реакцию агглютинации.
Принадлежность микроорганизма к данному виду или типу
устанавливают лишь в том случае, если он агглютинируется
соответствующей диагностической сывороткой не менее чем
до ½ или ¾ ее титра.
Непрямые (пассивные) реакции агглютинаци
Для данной реакции растворимые антигены или антитела
адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат
инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и
другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, Огруппы человека).
Пассивные реакции агглютинации по чувствительности
намного превосходят прямую реакцию агглютинации.
Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит
название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или
(РНГА).
Выпускаются коммерческие препараты – эритроцитарные
диагностикумы (на эритроцитах нагружены известные молекулярные АГ), которые используются в РНГА для обнаружения специфических АТ в исследуемой сыворотке и эритроцитарные диагностикумы антительные (на эритроцитах нагружены Fc фрагментами известные АТ), которые применяются в
РНГА для выявления АГ.
18
Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные)
эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции
сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде
«пуговки».
Рис. . Схема реакции пассивной гемагглютинации:1− эритроциты, 2− Аг эритроцита, 3 – конъюгированный Аг, 4 − Ат
Для идентификации возбудителей инфекционных болезней
широко используется реакция коагглютинации. Для нее необходимы коагглютинирующие реагенты (Ко-А реагент). Они
представляют собой взвесь золотистых стафилококков (S. aureus) штамма Cowan, на А белке которых нагружены Fc фрагментом Ат к искомым Аг. Реакцию коагглютинации ставят
на стекле капельным методом.
19
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ:
1.Провести серотипирование выделенной чистой культуры
Salmonella с помощью ориентировочной реакцией агглютинации.
Ингредиенты реакции:
1. чистая культура Salmonella,
2. поливалентные сальмонеллезные адсорбированные сыворотки АВСДЕ,
3. групповые (О) адсорбированные сальмонеллезные сыворотки,
4. типовые (Н) сальмонеллезные адсорбированные сыворотки,
5. физиологический раствор.
а) Постановка ориентировочной реакции агглютинации с
поливалентными адсорбированными сальмонеллезными сыворотками группы АВСДЕ. На поверхность хорошо обезжиренного стекла нанести каплю поливалентной сыворотки в
разведении 1:5 и каплю физиологического раствора (для контроля спонтанной агглютинации). В обе капли петлей внести
искомую чистую культуру. Перемешать. В контроле капля
должна остаться мутной, в кале с сывороткой должно произойти просветление фона и образование агглютината.
б) Постановка ориентировочной реакции агглютинации с
групповыми адсорбированными сальмонеллезными О–
сыворотками. Испытать чистую культуру сальмонелл в пластинчатой реакции агглютинации с каждой групповой адсорбированной сальмонеллезной О-сывороткой в разведении 1:5,
входящей в состав поливалентной АВСДЕ сыворотки. Установить, какой групповой сывороткой агглютинируется культура.
20
в) Постановка ориентировочной реакции агглютинации с типовыми
адсорбированными
сальмонеллезными
Нсыворотками. Испытать чистую культуру сальмонелл в пластинчатой реакции агглютинации с типовыми Н-сыворотками
в разведении 1:5, содержащей АТ к сальмонеллам, входящим
в серогруппу сальмонелл, с групповой сывороткой которой
произошла реакция на предыдущем этапе.
11. Произвести серотипирование выделенной чистой культуры Shigella реакцией Ко-агглютинации.
Ингредиенты:
1. Набор КоА реагентов (Ко-А реагент к Sh. Sonne,
Ко-А реагент к Sh. Flexneri).
2. Исследуемый материал.
3. Физиологический раствор.
Постановка реакции. На предметное стекло, положенное
на лист черной бумаги, наносят капли Ко-А реагентов и каплю физиологического раствора (для контроля культуры на
спонтанную агглютинацию). Затем вносят титруемую культуру во все капли. Покачивая стекло, наблюдают коагглютинацию. Реакцию учитывают по 3-х плюсовой шкале:
( +++ ) − полная коагглютинация, полное просветление фона,
(++ ) − хорошо выраженная коагглютинация, явное просветление фона,
( +) − неполная коагглютинация, слабое просветление фона,
(-) – отсутствие коагглютинации, реакция отрицательная.
Заключение о принадлежности выделенной культуры делают на основании положительной реакции Ко-агглютинации
не менее, чем на (++) 2 креста при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле.
21
111. Произвести серотипирование выделенной чистой культуры Shigella с помощью РНГА.
Ингредиенты:
1.Исследуемый материал.
2.Эритроцитарные диагностикумы антительные к Sh. Sonne,
к Sh. Flexneri.
3.Физиологический раствор.
Постановка реакции. В лунки полистиролового планшета
вносят дизентерийные эритроцитарные диагностикумы антительные (по 0,25 мл), в одну лунку ( для контроля) добавляют
0,25 мл физиологического раствора, во все лунки вносят
взвесь культуры шигелл по 0,25 мл. Встряхивают планшеты и
ставят на 2 часа в термостат. Учет проводят по внешнему виду
осадка и по прозрачности надосадочной жидкости.
В отрицательной реакции эритроциты оседают на дно в виде плотного диска с ровными краями («пуговка»), в положительной – осадок имеет вид кружев («зонтик»).
В случае титрования антигена из антигенсодержащего материала готовят серию двукратных разведений в объеме 0,25
мл и к ним доливают по 0,25 мл антительного эритроцитарного диагностикума.
Учет такой же, как и в предыдущем варианте.
Титр – последнее разведение, где реакция идет на 2 креста
1V. Выявить в сыворотке крови специфические агглютинины к бруцеллам развернутой реакцией агглютинации Ройта.
Ингредиенты:
1.Исследуемая сыворотка.
2.Физиологический раствор.
3.Единый бруцеллезный диагностикум.
22
Постановка реакции. Приготовить основное разведение (1:50)
исследуемой сыворотки: внести в пробирку 0,2 мл неразведенной сыворотки, добавить к ней 9,8 мл раствора хлорида
натрия и тщательно перемешать. Из основного разведения сыворотки сделать ряд последовательных, кратных двум разведений от 1:100 до 1:1600 в агглютинационных пробирках, установленных в штатив.
Затем прибавить по 3 капли бруцеллезного диагностикума.
Поставить контроли: контроль сыворотки (1 мл сыворотки в
разведении 1:50 ) и контроль диагностикума (3 капли диагностикума и 1 мл физ. раствора). Штатив с пробирками встряхнуть и поместить в термостат при 37 о С на 18-20 часов.
Таблица
Схема постановки опыта
Ингредиенты
Физ.раствор
Сыворотка
исследуемая
АТ (1:50)
Полученное
разведение
Бруцеллезный
диагностикум
(капли)
Результаты
Контроль Контроль
АТ
АГ
Доза реагентов, мл
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
3
3
3
3
3
1
1
-
-
3
23
Провести учет основываясь на величине осадка и степени
просветления жидкости. Контроль сыворотки должен быть
прозрачным. Контроль АГ – равномерно мутным. Если контроли хорошие, устанавить наличие и степень агглютинации
во всех опытных пробирках, которую обозначают плюсами:
(++++) – большой осадок и полное просветление,
(+++) – большой осадок и неполное просветление жидкости,
(++) – заметный осадок и заметное просветление жидкости,
(+) – очень слабый осадок и слабое просветление жидкости,
(-) – отрицательная реакция, раствор мутный.
Сделать выводы по реакции, учитывая что диагностический титр при бруцеллезе 1:200.
V. Выявить в сыворотке крови антитела к шигеллам в реакции пассивной гемагглютинации.
Ингредиенты:
1.Исследуемая сыворотка.
2.Эритроцитарный диагностикум Sh. Sonne.
3.Эритроцитарный диагностикум Sh. Flexneri.
4.Физиологический раствор.
Постановка реакции. Приготовить основное разведение (1:50)
исследуемой сыворотки, смешивая в пробирке 0,2 мл сыворотки и 0,8 мл физиологического раствора.
В 2-х рядах лунок полистиролового планшета последовательно развести в физиологическом растворе исследуемую
сыворотку в объеме 0,5 мл от 1:100 до 1:6400. Во все лунки
первого ряда внести по 0,25 мл эритроцитарного диагностикума Sh. Sоnne, второго ряда по 0,25 мл эритроцитарного диагностикума Sh. Flexneri.
24
Для проверки спонтанной агглютинации диагностикумов в
лунки внести по 0,25 мл диагностикумов и 0,5 мл физиологического раствора. Встряхнуть планшеты и поместить в термостат при 37 о С на 2-3 часа.
Учесть реакцию по внешнему виду осадка эритроцитов и
прозрачности надосадочной жидкости.
Таблица
Схема постановки опыта по РСК
Ингредиенты
Доза реагентов
( мл )
Контроль
Физиологический
раствор
0,5
0,5
0,5
0,5
0.5
0,5
0,5
0,5
Сыворотка исследуемая
в разведении 1:50
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-
Полученное разведение
1:100 1:200
1:6400
Эритроцитарный диагностикум из шигелл
0,25 0,25
1:400
0,25
1:800
0,25
0,25
1:1600 1:3200
0,25
0,25
0,25
25
2. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ - это агрегация антителами (преципитинами) растворимых (молекул) АГ (преципитиногенов), проявляющаяся в помутнении прозрачной жидкости, в появлении преципитата в виде осадка, кольца и т.д.
Таким образом, в отличие от реакции агглютинации, антиген
для реакции преципитации обязательно должен быть в молекулярном виде.
Механизм реакции преципитации аналогичен реакции агглютинации, т.е. по «теории решетки».
Осаждение из раствора комплексов АГ - АТ происходит в
диапазоне эквивалентных соотношений концентраций взаимодействующих молекул. В случае большого избытка одного
из реагентов образуется растворимый комплекс АГ-АТ и феномен реакции не проявляется.
Поскольку преципитиноген имеет ультрамикроскопическое
строение и его концентрация в единице объема выше, чем АТ
в таком же объеме сыворотки, то для осаждения более легких
частичек АГ с образованием видимого преципитата необходимо значительно большее количество АТ. Поэтому диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром АТ.
Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и твердой среде.
26
Реакция преципитации в жидкой среде
Обязательным условием постановки реакции преципитации
(РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность
иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании растворов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на
другой. В этом случае по характеру образовавшего преципитата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреципитации.
Реакция преципитации в агаре ( геле )
Для реакции используют гель, приготовленный из агара
Дифко или же специально приготовленный предельно осветленный гель из агар-агара.
Сущность реакции заключается в том, что специфические
Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой,
и образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитата.
Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и
двойной.
Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони.
В агаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на предметное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от
друга ( 4 – 10 мм ) при помощи специальных штампов или
стеклянных трубок с ровными краями.
В лунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в
различных разведениях. Из лунок АГ и АТ диффундируют
навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких
белесоватых линий. Поскольку диффузия реагентов из лунок
в гель происходит радиально, это позволяет анализировать
сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг
лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами разных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки
антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в
27
центральную лунку внести известный АГ, а в периферические – исследуемую сыворотку в разных разведениях.
Метод двойной иммунодиффузии применяют преимущественно для качественного анализа, для определения природы
АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного
определения АГ и АТ путем их титрования.
Для количественного определения антигена часто используют простую радиальную иммунодиффузию по Манчини,
которая основана на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении раствора исследуемого АГ
в лунки, вырезанные в слое геля, в котором предварительно
диспергирована моноспецифическая антисыворотка.
В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого АГ.
Содержание АГ определяют относительно стандартного
раствора АГ с известной его концентрацией. Чаще всего при
помощи этого метода определяют белковые АГ: количество
Yg разных классов в сыворотке крови и других жидкостях,
секретов желез, белков крови, спинномозговой жидкости и
т.д.
Реакцию иммунодиффузии обычно поводят при комнатной
температуре, во влажных камерах. Продолжительность иммунодиффузии зависит от природы АГ.
Методы иммунодиффузии обладают высокой специфичностью и чувствительностью.
Практическое применение реакции преципитации.
РП применяются:
- для изучения АГ структуры бактерий, сложных белков,
жидкостей человека и
животных;
- для изучения токсигенности бактерий;
- при диагностике ряда инфекционных заболеваний бактериальной, вирусной,
грибковой природы (сибирской язвы, чумы, туляремии и
т.д.);
В качестве АГ используют раневые экссудаты, фильтраты
экстрактов пораженных органов, спинно-мозговую жидкость и т.д.
- для установления степени родства видов микроорганизмов,
растений, животных –
определяют общий АГ;
- в судебно-медицинской практике – для определения видовой принадлежности
белков (крови, слюны, спермы и т.д.);
- для выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях.
ФЛОККУЛЯЦИЯ – вид иммунопреципитации, при котором
преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реакцию проводят смешиванием разных разведений сыворотки
со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл.
Первая пробирка, где появились хлопья ( инициальная
флоккуляция ) указывает на эквивалентное соотношение АГ
и АТ. По инициальной флоккуляции рассчитывают количество сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт
стандартных препаратов.
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ. Вначале проводят электрофоретическое разделение АГ в забуференном агаровом геле.
После разделения в канавку, которая идет в направлении миграции антигенных веществ, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. АГ и АТ диффундируют в геле навстречу
друг другу и в месте их взаимодействия образуется дуга преципитации. Дуга – потому что АГ диффундирует из точечного источника радиально, а АТ из канавки – ровным фронтом.
Это встречный иммуноэлектрофорез.
СХЕМА:
На основе сочетания электрофореза с иммунопреципитацией
разработано несколько удачных методов, в каждом из которых перемещение АГ в электрическом поле приводит к его
контакту с АТ.
Непрямая преципитация иммунных комплексов.
По целому ряду причин в результате реакции АТ с АГ могут
образовываться растворимые комплексы.
Важное значение имеет определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) при некоторых патологических состояниях макроорганизма.
Часто для осаждения ЦИК используют раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ). Есть несколько методик осаждения ПЭГ.
Например, можно определить концентрацию ЦИК измерением убыли белка в надосадочной жидкости после осаждения
2% раствором ПЭГ.
Методика:
1) В исследуемой сыворотке определить концентрацию белка
биуретовым методом.
2) В пробирки внести 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл 4% раствора
ПЭГ (М=6000) на физрастворе (рН 7,2 ). 2% раствор ПЭГ
(конечная концентрация) не осаждает белки в сыворотке
здоровых яиц, а только иммунные комплексы, в том числе
и растворимые. В контрольную пробирку вносят 0,6 мл
физраствора и 0,5 мл сыворотки. Пробирки закрыть и оставить на 18 часов при комнатной температуре
3) После инкубации пробирки центрифугировать 45 минут
при 6000 об/мин.
4) В сухие пробирки внести по 0,1 мл надосадочной жидкости
и 4,9 мл физраствора. Определить концентрацию белка в
опыте и контроле относительно физраствора, содержащего
ПЭГ ( 0,5 мл физраствора и 0,5 мл 4% раствора ПЭГ). По
снижению количества белка в опыте вычисляют количество осажденного белка, т.е. количество ЦИК.
Наличие ЦИК не всегда указывает на их патологическое
значение. Присутствие ЦИК сопровождает нормальную
иммунную реакцию.
Уровень ЦИК возрастает при аутоиммунных заболеваниях
(системной красной волчанке, ревматоидном артрите и др.)
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ
1. Определить количество Yg M в испытуемых сыворотках.
Ингредиенты: гель, стекла, моноспецифитческие сыворотки против YgМ человека,
исследуемые сыворотки, вероналмединаловый буфер.
При 56 0 С 3% гель смешивают в соотношении 1:1 с антисывороткой, разведенной на веронал-мединаловом буфере. Этой смесью покрывают равномерным слоем стекла
(9 мл смеси на стекло размером 9х12 см).
В застывшем геле с антисывороткой пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от
другой. На стекле делают несколько рядов лунок.
В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по
2 мкл стандартной сыворотки (т.е. с известным количеством YgМ), неразведенной и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8.
Лунки следующих рядов заполняются испытуемыми сыворотками. Пластины инкубируют во влажной камере при
комнатной температуре в течении 48 часов ( с антисывороткой Yg G – 24 часа). По окончании инкубации измеряют диаметры колец преципитации.
По стандартной сыворотке строят на миллимитровой бумаге калибровочную кривую: по оси абсцисс откладывают
диаметры колец стандартной сыворотки, а по оси ординат
– известное количество Yg в мг/ мл, содержащееся в
стандартной сыворотке каждого разведения.
Образовавшиеся точки соединяют прямой. Для определения уровня Yg в испытуемой сыворотке поступают следующим образом. На оси абсцисс откладывают диаметр
кольца преципитации испытуемой сыворотки. Восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой, и точку
пересечения прооектируют на ось ординат.
Аналогично можно определить количество других классов
Yg, фракций комплемента, С-реактивного белка и других
белков в сыворотке крови.
2. Для диагностики раневой анаэробной инфекции определить
в фильтрате раневого
экссудата наличие АГ соответствующего возбудителя реакцией двойной
иммунодиффузии по Оухтерлони.
Ингредиенты: исследуемый фильтрат раневой жидкости,
моноспецифические
cыворотки Cl. perfringens, Cl. novi, Cl. Septicum, гель, стекла.
На стекла нанести гель ( 56% ) равномерным слоем. После
застывания в нем сделать пробойником ряд лунок: одна лунка
в центре и четыре по периферии на расстоянии 7 – 8 мм.
В центральную лунку микрошприцем внести 2 мкл исследуемого фильтрата, а в периферические лунки внести моноспецифические сыворотки, в четвертую для контроля физраствор.
Выдержать во влажной камере 48 часов при комнатной
температуре. Учесть по появлению белой преципитационной
линии между центральной и периферическими лунками
Постановка и учет РСК
Перед постановкой реакции готовят рабочие растворы реагентов РСК.
Антитела (Ig M, Ig G), участвующие в РСК, характеризуются способностью связывать комплемент. Исследуемую сыворотку накануне постановки реакции прогревают на водяной
бане при температуре 56о С в течение 30 мин для инактивации
собственного комплемента. В день постановки реакции сыворотку разводят раствором хлорида натрия (0, 15 моль/л) в соотношении 1 : 5 (для качественного анализа) или же готовят
ряд последовательных, кратных двум разведений – от 1 : 5 до
1 : 640 (для определения титра АТ).
Антигены, используемые в РСК, могут быть корпускулярными или растворимыми: взвеси бактериальных клеток, их
лизаты. Белковые или полисахаридные вещества, экстракты
из нормальных и патологически изменённых тканей.
Комплементом является смесь сывороток морских свинок
– свежая или лиофилизированная (сухой комплемент – препарат промышленного изготовления), которую разводят раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 непосредственно
перед употреблением, так как при хранении в жидком состоянии её активность снижается.
Гемолитическую сыворотку с известным титром АТ (1 :
1200, 1 : 1600, 1 : 1800) изготовляют промышленным путём,
иммунизируя кроликов эритроцитами барана.
Эритроциты получают из дефибринированной крови барана. Кровь фильтруют через трёхслойный марлевый фильтр
для удаления плёнок фибрина, затем фильтрат центрифугируют (2000 мин-1) в течение 10 мин. Удаляют плазму, а эритроциты наоборот остаются.
39
Поэтому антигены перед проведением опыта титруют в
присутствии рабочей дозы комплемента.
а) антиген разводят в объёмах 0,5 мл;
б) добавляют в каждую пробирку 0, 5 мл рабочей дозы комплемента;
в) помещают в термостат при температуре 37о С на 1 час;
г) добавляют во все пробирки по 1, 0 мл гемолитической системы;
д) помещают в термостат при температуре 37о С на 1 час;
З а д а н и е: по готовому ряду определить титр антигена (наименьшее разведение при котором наблюдается полный гемолиз). Рассчитать рабочую дозу антигена (1/2 – 2/3 титра).
4. Постановка основного опыта
З а д а н и е: В исследуемой сыворотке выявить титр антител к
токсоплазменному антигену.
Ингредиенты:
1. исследуемая инактивированная сыворотка 1 : 5;
2. положительная инактивированная сыворотка 1 : 5;
3. отрицательная инактивированная сыворотка 1 : 5;
4. токсоплазменный антиген для РСК в рабочей дозе;
5. комплемент в рабочей дозе;
6. 3% взвесь бараньих эритроцитов;
7. гемолитическая сыворотка в рабочей дозе;
8. буфер (физиологический раствор)
Общие объём ингредиентов реакции 2, 5 мл.
Приготовить в пробирке необходимый объём гемолитической системы и собрать основную систему по схеме.
41
Сделать по результатам опыта вывод. Для вывода используйте обозначения эффектов реакции:
(++++) – реакция резко положительная (полная задержка гемолиза, жидкость бесцветная, все эритроциты на дне),
(+++, ++) – реакция положительная (слабо окрашенная жидкость, осадок эритроцитов на дне пробирки),
(+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне незначительное количество эритроцитов),
(−) – отрицательная реакция (наблюдается полный гемолиз).
VII. РЕАКЦИИ С МЕТКАМИ
Образовавшиеся иммунные комплексы можно выявить по
метке иммунореагента (АТ или АГ).
В качестве метки используют:
1. Флюорохромы, способные флюоресцировать в ультрафиолетовых лучах (реакции иммунофлюоресценции - РИФ).
2. Ферменты, при взаимодействии с субстратом обусловливают его распад, который можно выявить по изменению цвета
или с помощью специальных приборов (реакции иммуноферментного анализа – ИФА).
3. Радиоактивные метки (реакции радиоиммунного анализа
– РИА).
4. Ферритин – белок, содержащий до 28% Fe, хорошо видимый при электронной микроскопии (реакции иммунноэлектронной микроскопии – РИЭМ или ИЭМ).
Требования, предъявляемые к меткам:
1. Они не должны менять специфичность иммунореагента.
2. Они не должны снижать аффинитет и авидность АТ.
3. При присоединении не должны терять своей активности.
4. Должны легко выявляться.
5. Должны быть нейтральными для окружающих людей и
среды.
43
Серологические реакции с метками высокочувствительны,
позволяют быстро получить результат и находят широкое
применение для экспресс−диагностики вирусных, бактериальных и других инфекций, для оценки иммунного статуса
человека, в онкологии и т.д.
VII. I. Реакции иммунофлюоресценции
Иммунофлюоресценция – это метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции и
чувствительности флюоресцентной микроскопии. Он может
быть как прямым, так и непрямым (рис. 11).
Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ,
метится (конъюгируется) флюоресцирующим красителем.
Чаще всего для этого используют флюоресцеинизотиоционаты (ФИТЦ) – зеленое свечение в ультрафиолетовом свете и
тетраметилродаминизотионат (ТРИТЦ) – оранжево-красное
свечение.
АТ, которые метят флюорохромом, должны обладать физико-химической гомогенностью. Наиболее подходящими для
мечения являются моноклональные антитела.
АГ (искомым или известным) для РИФ могут быть антигены, локализованные в клетке или на клетке, срезах тканей.
РИФ выявляют и идентифицируют: 1) микроорганизмы в
чистых и смешанных культурах, в мазках- отпечатках; 2)
клетки, пораженные вирусами и другими микроорганизмами;
3) Т и В лимфоциты, нормальные киллеры и другие клетки
иммунной системы.
44
РИФ используют: 1) для изучения биосинтеза иммуноглобулинов в плазмоцитах, их транспорта из клеток, иммуноглобулиновых рецепторов В лимфоцитов; 2) для выявления титра
антител при серодиагностике; 3) для выяснения закономерностей возникновения и развития злокачественных новообразований на клеточном и тканевом уровне и т.д.
Для постановки РИФ клетки с искомыми (или известными
АГ) помещают на
стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне 10 минут при
комнатной температуре),
высушивают в течение 20 минут при 37 0 С, а затем обрабатывают в зависимости от
применяемого варианта РИФ.
После каждого этапа обязательна 2-х – 3-х кратная промывка
буферным раствором
для удаления не вступившего в реакцию иммунореагента.
Варианты постановки РИФ:
1 Прямая РИФ (была предложена А. Кунсом в 1941 г.).
Для каждого изучаемого АГ должна быть гомологичная
иммунофлюоресцентная
сыворотка.
2. Непрямая РИФ (РНИФ) основана на использовании двух
различных
антисывороток.
Вначале применяют немеченые АТ к искомому АГ (или
искомые АТ в
сыворотке человека к известному АГ).
На 2-м этапе образовавшийся комплекс АГ-АТ обрабатывают антилюминесцентной сывороткой, содержащей меченые флюорохромом АТ к иммуноглобулинам того вида
животных, чья сыворотка использовалась на 1 этапе реакции.
3. Антикомплементарный метод РИФ (РИФСК) основан на
способности
комплемента (сыворотки морских свинок) фиксироваться
на иммунном
комплексе. В этом варианте используют люминесцентные сыворотки против
глобулинов (комплемента) морской свинки.
4. РГИФ (реакция гашения иммунофлюоресценции).
Используется для выявления титра АТ в исследуемой сыворотке, при наличии
известного клеточного АГ и специфической к нему люминесцентной сыворотки.
На первом этапе на известный АГ наносят исследуемую
сыворотку, и если в ней
есть соответствующие антигену антитела, они занимают
эпитопы АГ. При
добавлении на втором этапе люминесцентной сыворотки
к данным АГ,
присоединение люминесцентных АТ к эпитопам происходить не будет.
Свечения не наблюдается.
СХЕМА:
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ:
1). В лабораторию поступили мазки-отпечатки мозговой ткани собаки, погибшей, как считают, от бешенства (рабдовирус). В лаборатории имеется: люминесцентная антирабическая сыворотка, буферные растворы.
Задание: Выявить клетки, пораженные вирусом бешенства
РИФ (прямой вариант).
1. На мазки-отпечатки нанести люминесцентную антирабическую сыворотку.
2. Инкубировать во влажной камере при комнатной температуре 15-20 минут.
3. Мазки дважды тщательно промыть буферным раствором, подсушить на воздухе
и просмотреть.
4. Для просмотра используют люминесцентный микроскоп.
5. В положительном случае клетки имеют яркое свечение,
локализующееся по
периферии клетки.
2). Определить в лимфоцитарной массе наличие зрелых Т
лимфоцитов, если в
лаборатории имеется : моноклональные антитела с СД3
меченые ФИТЦ.
1. 25 мкл лимфоцитарной взвеси (концентрация 5000 в 1
мкл) поместить на предметное стекло в пространство,
ограниченное окружностью, проведенной парафиновым стеклографом. Стекло поместить во влажную камеру и инкубировать 20 минут при 37 0 С для осаждения клеток. Остаток жидкости удалить фильтровальной бумагой, прикладывая ее у края, чтобы не повредить монослой клеток.
2. Препарат промыть трижды в сосудах с физраствором.
Удалить избыток влаги фильтровальной бумагой, не
касаясь клеток (не допускать подсыхания).
3. На мазок нанести 25 мкл моноклональных АТ, меченых ФИТЦ в рабочем разведении (1:50). Инкубировать во влажной камере 40 минут при 37 0 С. Препарат
промыть и просушить, как указано выше.
4. Для улучшения качества микроскопирования ядра
лимфоцитов окрашивают ядерным красителем, например, 0,001 % раствором бромида этидия. 15 мкл
красителя наносят на препарат, через 15 минут промывают, как указано выше.
5. Клетки готовы для наблюдения иммунофлюоресценции.
3) В лабораторию поступила мокрота от больного с подозрением на легочную форму
чумы. Как можно провести экспресс-диагностику при наличии: кроличьей чумной сыворотки, антикроличьей люминесцентной сыворотки, буферных растворов.
Можно провести РИФ (непрямой вариант).
1. На предметное стекло нанести мокроту от больного,
зафиксировать.
2. Нанести диагностическую чумную кроличью сыворотку.
3. Выдержать во влажной камере 20 минут при комнатной температуре.
4. Мазки промыть дважды буферным раствором.
5. Нанести на мазок люминесцентную антикроличью сыворотку (АТ кYg кролика, меченые флюорохромом).
6. Выдержать во влажной камере 15-20 минут при комнатной температуре.
7. Промыть дважды буферным раствором, подсушить,
микроскопировать, используя люминесцентный микроскоп.
8. Положительный ответ дать при наличии яркого свечения, локализующегося по периферии клетки.
4) В серологическую лабораторию поступила кровь от больного с подозрением на
бруцеллез.
Задание: определить титр иантибруцеллезных АТ, если в
лаборатории имеется:
а) бруцеллезный диагностикум, б) люминесцентная сыворотка против Yg человека,
в) буферные растворы, г) положительная сыворотка (есть
АТ к бруцеллезному АГ),
д) отрицательная сыворотка (АТ к бруцеллезным АГ нет).
Можно поставить РИФ (непрямой вариант).
1. На предметное стекло нанести 5 капель бруцеллезного диагностикума ( 5
маленьких мазков), зафиксировать.
2. Из крови отделить сыворотку, сделать ее разведения в
физрастворе (1:100,
1:200, 1:400 ).
3. На первые три мазка бруцеллезного диагностикума
нанести испытуемую
сыворотку в разных разведениях (опыт).
4. На 4 мазок – положительную сыворотку ( КПС ).
5. На 5 мазок – отрицательную сыворотку ( КОС ),
6. Стекло поместить во влажную камеру на 20 минут
при комнатной температуре.
7. Промыть дважды буферным раствором.
8. Нанести на все мазки люминесцентную сыворотку
против Yg человека.
9. Выдержать во влажной камере 20 минут при комнатной температуре.
10. Промыть дважды буферным раствором, подсушить.
11. Промикроскопировать в люминесцентном микроскопе, начиная с контролей.
В мазке с отрицательной сывороткой никакого свечения
не должно быть, наоборот, с положительной сывороткой
– яркое свечение. Учесть опытные капли и по свечению
сделать выводы о наличии и титре АТ к бруцеллезному
антигену.
5) Определить титр токсоплазменных АТ в сыворотке беременной женщины, если в
лаборатории имеются: а) токсоплазменный АГ (корпускулярный), б) комплемент,
в) сыворотка против глобулинов морской свинки, г) положительная сыворотка,
д) отрицательная сыворотка , е) буферные растворы.
Можно поставить РИФСК.
1. На предметное стекло нанести 6 капель токсоплазменного АГ, зафиксировать.
2. Исследуемую сыворотку развести стерильным физраствором 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 и нанести на фиксированный токсоплазменный АГ (первые 4 капли).
3. На 5-ю каплю нанести положительную сыворотку в
разведении 1:5.
4. На 6-ю каплю отрицательную сыворотку 1:5.
5. Во все капли внести раствор комплемента в разведении 1:5.
6. Выдержать во влажной камере 15-20 минут при комнатной температуре.
7. Мазки отмыть дважды буферным раствором.
8. Нанести на все мазки люминесцентную сыворотку
против глобулинов морской свинки.
9. Выдержать во влажной камере 15-20 минут при комнатной температуре.
10. Мазки отмыть буферным раствором, подсушить и
промикроскопировать в люминесцентном микроскопе.
Последнее разведение сыворотки, дающее яркое свечение является титром.
6). Определить титр токсоплазменных АТ в сыворотке беременной женщины, если в
лаборатории имеются: а) токсоплазменный АГ, б) токсоплазменная люминесцентная
сыворотка.
Можно поставить РГИФ - реакцию гашения иммунофлюоресценции.
1. На нанесенные и фиксированные мазки токсоплазменного АГ нанести
исследуемую сыворотку в разведении 1:5, 1:10, 1:15,
1:20.
2. Выдержать во влажной камере 15-20 минут при комнатной температуре.
3. Мазок промыть дважды буферным раствором.
4. Нанести на все мазки люминесцентную ирксоплазменную сыворотку.
5. Выдержать во влажной камере 15-20 минут при комнатной температуре.
6. Мазки отмыть дважды буферным раствором, подсушить и промикроскопировать в люминесцентном
микроскопе.
Последнее разведение сыворотки, не дающее свечение, является титром.
Иммуноферментный анализ.
Особенностью метода ИФА является использование функционально активной биологической молекулы фермента.
Комплекс конъюгированных иммунореагентов с ферментами
( ф ) проявляет функциональную активность, т. е. сохраняется
высокая специфичность иммунореагентов и способность фермента расщеплять добавленный субстрат ( с ) с образованием
легко обнаруживаемых продуктов. В связи с этим можно регистрировать и учитывать количественно взаимодействие иммунореагента, например АТ с гомологичным АГ.
Вначале ИФА использовали в иммуногистохимии для выявления локализации тканевых и клеточных АГ, а затем были разработаны варианты реакции, которыми можно качественно и количественно выявить иммунореагенты в жидкостях.
Реагенты реакции:
1. Ферменты применяют только те, которые расщепляют субстрат с образованием продуктов легко (улавливаемых) определяемых: ПХ (пероксидаза хрена), ЩФ (щелочная фосфатаза), каталаза, уреаза, фосфолипаза и др.
Ферменты, используемые в ИФА должны отвечать следующим требованиям: содержать в структуре определенные
реакционные группы, по которым идет связывание с молекулой иммунореагента не меняя его специфичности; быть чис-
тыми; сохранять ферментативную активность в конъюгированном с иммунореагентом виде.
Субстрарами в зависимости от реагента используют: 5аминосалициловую кислоту, ортофенилендиамин, пирогаллол
и другие.
2. Иммунореагенты.
В настоящее время иммунореагентами, с которыми связывают ферменты, могут быть АТ, АГ.
Фермент присоединяют к иммунореагенту с помощью
бифункциональных реагентов: глутарового альдегида, периодат натрия, фенилендималеимида и др. Эти соединения обладают химически активными группировками, которыми они
ковалентно взаимодействуют с биомолекулами. Так, глутаровый альдегид реагирует преимущественно с E аминогруппами аминокислот, в частности лизина, периодат натрия с углеводными остатками.
ФЕРМЕНТЫ И ИХ СУБСТРАТЫ, НАИБОЛЕЕ ШИРОКО
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ИФА
Фермент
Пероксидаза
Щелочная фосфатаза
В-галактозидаза
Источник
получения
Хрен
E. coIi, слизистая кишечника теленка
E.coIi
Субстрат
5-аминосалициловая
кислота
Ортофенилендиамин,
Н2 О2
Р-нитрофенилфосфат
О-нитрофенол
Глюкозооксидаза
Глюкозоамилаза
Грибы Aspergillus
Rhizopus
nivens
Глюкоза, О2
Декстрин
3. Классификация и варианты ИФА
Существует множество вариантов ИФА.
Прежде всего ИФА включает две группы способов постановки реакции: твердофазный (гетерогенный) – ТИФА и гомогенный - ГИФА. Они в свою очередь подразделяются на различные модификации.
3.1. Гетерогенный (твердофазный) способ - твердофазный
иммуноферментный анализ (ТИФА).
Твердофазный способ постановки получил самое широкое
применение. При этом способе АГ или АТ предварительно
адсорбируют на твердый носитель (сорбционно и ковалентно). В качестве твердой фазы используют различные
микропористые (сефароза, стекло, биогель) и непористые
носители (полистирол, полихлорвинил, нейлон, полистирен и другие). По физическому состоянию это могут быть
гели, шарики, диски, титрационные панели.
Чаще всего для ИФА используют полистироловые, поливиниловые пластинки с лунками, которые позволяют адсорбционно связывать АТ и АГ различной природы – белки, ЛПС, гликопротеиды и т.д. Связывание происходит
путем адсорбции (т.е. нековалентно) за счет гидрофобных
или ионных сил, или конъюгацией (ковалентно). Для получения иммуносорбентов путем ковалентной связи ис-
пользуют в основном такие сшивающие реагенты, как
бромциан, глутаральдегид, изоцианаты, при этом в качестве твердой фазы применяют целлюлозу, биогель, сефадекс,
агарозу и др.
Методы ТИФА применимы и при работе с корпускулярным АГ, например, клетками бактерий и эукариот. Клетки
бактерий можно прикрепить к панели высушиванием и
усилить прикрепление фиксатором.
Например, перед адсорбцией клеток бактерий панели обрабатывают поли-L- лизином
в течение 1 часа, лунки промывают и вносят бактериальную взвесь (100мкл взвеси
5х103 - 5х104 в мл ), инкубируют 45 минут и фиксируют
глутаровым альдегидом в
течение 3-5 минут. После связывания иммунореагента
свободные места носителя
блокируют, чтобы предотвратить неспецифическое связывание с ним
иммунореагентов на следующих этапах. Для этого применяют различные белки и
реагенты: БСА (бычий сухой альбумин), нормальные сыворотки, твин-20, желатин.
3.2. Варианты ТИФА.
Существуют неконкурентные и конкурентные варианты.
При неконкурентных вариантах реакция АГ-АТ происходит на поверхности твердой
фазы, ингредиенты добавляются последовательно и определяется количество метки,
связавшейся с носителем
При этом количество связавшейся метки прямо пропорционально количеству
искомого АТ или АГ в исследуемом образце.
При конкурентных вариантах постановки реакции немеченый исследуемый образец
и известное количество меченого искомого вносят в лунки, сенсибилизируют АГ
или АТ одновременно, где происходит конкуренция между первым и вторым
образцами за связывание с твердофазным иммуносорбентом. В этом случае
количество связанной с твердой фазой метки обратно
пропорционально количеству
искомого образца.
3.2.1. Неконкурентные методы ТИФА.
а) Прямой вариант
1). В лунки вносят исследуемый иммунореагент (чаще
АГ) и выдерживают 16-20
часов при 4о или 2 часа при 37о .
2). Промывают буфером .
3). Производят блокировку свободных мест на носителе.
4). Промывают буфером.
5) . Вносят конъюгат иммуноферментов и выдерживают
2 часа при комнатной
температуре или 30 минут при 37о С.
6). Промывают буфером (пятикратно)
7). Добавляют соответствующий фермнту субстрат, выдерживают при комнатной
температуре в темном месте 30 минут.
8). Останавливают реакцию внесением в лунки, например, 0,9 мол/л Н2 SО4 .
9). Учитывают.
б). Непрямой вариант.
Принцип этой модификации можно выразить следующей формулой:
АГ + АТ ---- (АГхАТ) + (АТ2 х Ф)--- (АГхАТ1 хАТ2 х
Ф), где
АТ1
-антитело против АГ (АГ),
(АТ2 х Ф ) – конъюгат,
АТ2 – антитело против АТ1 ,
Ф – фермент.
1). Адсорбция АГ (известного или исследуемого) на
поверхности твердой фазы.
2). Внесение АТ против АГ (известных или исследуемых).
3). Промывка буфером.
4). Внесение иммуноферментного конъюгата – т.е. добавление энзиммеченого
антивидового иммуноглобулина.
5). Промывка буфером.
6). Внесение энзим-субстрата.
7). Останавливают реакцию внесением в лунки 0,9
мол/л Н2 SО4 .
8).Учет реакции.
в) .Метод «сэндвич».
На первом этапе к ТФ прикрепляются АТ 1 против АГ.
На следующем этапе
добавляется искомый АГ.
После установления равновесия систему ( ТФ – АТ1 АГ ) промывают и вносят меченые ферментом АТ2, которые также специфичны к данному АГ, но к другим его
эпитопам (ТФ – АТ 1 - АГ – АТ2 -Ф ). После отмывки добавляют энзим-субстрат.
Схема:
3.2.2. Конкурентные методы.
На первом этапе к ТФ прикрепляется АТ против искомого
АГ.
Затем вносят испытуемую пробу и известное количество АГ,
меченого ферментом,
который конкурирует за центры связывания антител (важным является правильный
подбор концентрации меченого АГ).
Или на первом этапе к ТФ прикрепляется АГ к искомым АТ
(например, в сыворотке
больного). Затем вносят исследуемую сыворотку (АТ? к АГ)
и известное количество коъюгирующей с ферментом иммунной сыворотки, т.е. сыворотку с АТхФ к данному АГ.
Эти сыворотки конкурируют за связывание с эпитопами антигена.
Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометров, измеряя оптическую плотность в опытных и контрольных лунках.
При визуальном учете реакцию расценивают как положительную, если в лунках наблюдается достаточно интенсивное
окрашивание, значительно превосходящее окрашивание в
лунках с отрицательными контролями.
ИФА обладает следующими преимуществами:
- высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода
определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;
- возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;
- стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);
- простотой проведения реакции;
- наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета.
ПРИМЕНЕНИЕ ИФА.
Методы ИФА широко используются в различных областях
биологии и медицины.
Иммуноблотинг ( ИБ)
В основе этого метода лежит использование нитроцеллюлозных полосок, на которые методами горизонтального и затем вертикального электрофореза переносятся АГ в порядке
нарастания их молекулярных масс.
При проведении исследования эти полоски, помещенные в
индивидуальные пластиковые кюветы, последовательно
взаимодействуют с сывороткой (иммунной или испытуемой), конъюгатом и субстратом в условиях горизонтального
встряхивания с целью перемешивания и равномерного взаимодействия реагентов с полоской по всей ее длине.
После завершения контакта с очередным ингредиентом полоску промывают специальным раствором для удаления несвязавшихся компонентов.
При наличии специфичности искомых АГ (АТ) известным
АТ (АГ) они связываются в иммунные комплексы в определенных зонах полоски. К этому комплексу присоединяются
конъюгат, представляющий собой антивидовые антитела,
меченые пероксидазой или другим ферментом. После контакта с субстратом, в местах связывания образуется окрашенный продукт, по локализации и интенсивности окрашивания которого делают визуальное заключение о реакции.
Радиоиммунологический анализ (РИА) – это методики, в которых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной
метки, предварительно введенной в состав антител или антигенов.
Наиболее широко используют две разновидности РИА: радиоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФ РИА). В качестве радиоактивной метки используюи три типа изотопов – 3Н, 14С, 125 I
(или 131 I ). Наиболее популярный способ получения коъюгатов – метка радиоактивным иодом, т.к. этот метод введения метки практически не снижает иммунологической активности антигенов и антител в процессе формирования ИК.
Чаще всего в РИА используется Y-изотоп – 125I, имеющий
более длительное (60 дней) время полураспада, чем радионуклеоид 131 I (8 дней).
Методика РИП заключается в 1) формировании в растворе
радиоактивного иммунного комплекса (при предварительном введении в состав одного из участников реакции антиген-антитело радиоактивной метки), 2) отделении этого комплекса от не вошедших в него макромолекул, 3) анализе его
радиоактивного компонента.
Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью различных физико-химических методик: электрофореза в геле,
агарозе, адсорбцией на различных органических и неорганических поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения
ИК используется метод «двойных антител», в котором ком-
плекс антиген-антитело утяжеляется с помощью его взаимодействия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфичными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования
вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют
фильтрацией или центрифугированием. . Далее проводят
количественный и качественный анализ радиоактивного
компонента преципитата. РИП можно проводить либо в
прямом, либо в конкурентном варианте.
ТФ РИА заключается в формировании ИК не в растворе , а на
твердой фазе, где предварительно иммобилизируют антиген
или антитело. На иммобилизированный антиген (или антитело) последовательно сорбируются остальные компоненты
ИК. Такая методика дает возможность удалять из смеси не
вошедшие в ИК макромолекулы с помощью простой промывки. Наиболее простым вариантом ТФ РИА является прямой анализ, основанный на эффекте прямой адсорбции антигена на твердую фазу. В настоящее время основными методиками ТФ РИА являются варианты «сэндвича».
Первый вариант наиболее прост в постановке: ( в диагностические наборы на его основе входят только два иммуноглобулиновых препарата, один из которых адсорбирован на
твердой фазе).
Второй вариант отличается тем, что на его основе удобно
конструироовать
диагностические системы – в состав которых
входят антивидовые иммуноглобулины, меченые радиоактивно.
Распространены и конкурентные варианты, когда содержащиеся в исследуемом образце АГ или АТ конкурируют с
аналогичным радиоактивно меченым ингредиентом за право
образовать ИК.
Метод РИА считается одним из наиболее чувствительных
иммунохимических методов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ:
1. Определить инфицированность клеща вирусом клещевого энцефалита, если в лаборатории имеется:
а) содержимое клеща,
б )полистироловые пластины, в лунках которого адсорбированы АТ к АГ вирусов клещевого энцефалита;
в) конъюгат ( АТ к вирусам клещевого энцефалита,
меченые ПХ);
г) субстрат (ОФД);
д) буферный раствор.
Можно провести ИФА , вариант «сэндвич» (двойной):
В лунки с адсорбированными АТ вносим содержимое
клеща и выдерживаем в
термостате (37о ) 30 минут.
Жидкость из лунок удаляем встряхиванием и промываем
буферным раствором три
раза по 5 минут.
В лунки вносим конъюгат (АТ к вирусам клещевого
энйефалита меченые ПХ),
выдерживаем в термостате 30 минут при 37 о .
Промываем буфером.
Вносим субстрат (ортофенилендиамин). Выдерживаем 30
минут в термостате.
Учитываем реакцию или визуально (в положительном
случае при расщеплении
субстрата появляется желтое окрашивание) или с помощью прибора.
2. В исследуемой сыворотке выявить наличие АТ (Yg M )
к HBs – АГ, если в
лаборатории имеется:
Полистироловые шарики с адсорбированными АТ к
НВs –АГ.
Какие еще иммунореагенты необходимы для постановки сэндвич варианта ИФА?
Поставить реакцию:
- На полистироловые шарики с адсорбированными АТ нанести НВs- АГ и выдержать
в термостате 30 минут при 37о .
- Промыть буфером .
- Нанести исследуемую сыворотку и выдержать в термостате 30 минут при 37о.
- Промыть буфером.
- Нанести конъюгат (АТ к YgМ человека, меченые ферментом) и выдержать 30
минут при 37о.
- Промыть буфером.
- Внести субстрат, выдержать 30 минут.
- Учесть реакцию.
2 а. В исследуемой сыворотке выявить наличие АТ ( Yg M )
к HBs –АГ, если в
лаборатории имеется:
1. Полистироловые планшеты, в лунках которого адсорбированы АТ к мюцепям YgМ
2. HBs –АГ.
3. АТ к НBs-АГ, меченые ферментом (ПХ ).
4. Субстрат ( ОФД ).
5. Буферный раствор.
Можно ставить ИФА (сэндвич-вариант)
•
В лунки внести исследуемую сыворотку (Yg М? к
НВs-АГ ). Выдержать 30 минут при 37о
•
Промыть буфером.
•
Добавить НВs- АГ. Выдержать 30 минут при 37о
•
Промыть буфером.
•
•
•
•
Внести конъюгат (АТ к НВs-АГ, меченые ферментом). Выдержать 30 минут при 37о.
Промыть буфером.
Внести субстрат. Выдержать 30 минут в темноте.
Учесть реакцию.
3. Определить титр АТ к токсоплазменному АГ, если имеется:
1. Исследуемая сыворотка.
2. Полистироловые планшеты.
3. Токсоплазменный АГ.
4. Сыворотка против Yg человека, конъюгированная
ферментом ( ПХ )-конъюгат.
5. Субстрат для ПХ (ортофенилендиамин).
6. Буферные растворы.
Можно провести ИФА (непрямой вариант).
* В лунки внести токсоплазменный АГ. Адсорбировать
его 18-20 часов при
комнатной температуре.
* Внести в лунки с АГ исследуемую сыворотку в разных
разведениях ( 1:5, 1:10,
1:20, 1:40).
* Выдержать в термостате 30 минут при 37о.
* Промыть буфером.
* Внести конъюгат. * Выдержать в термостате 30 минут
при 37о.
* Промыть буфером.
* Внести субстрат. Выдержать в темноте 30 минут.
* Учесть реакцию.
4. В исследуемой сыворотке определить наличие АТ к НСV,
если в лаборатории имеется:
1. Полистироловые шарики с адсорбированными АГ НВV.
2. Иммунная сыворотка к НСV меченная изотопом 125J .
3. Буферный раствор.
Можно поставить РИА (конкурентный вариант).
*На полистироловые шарики с НСV-АГ нанести исследуемую сыворотку.
*Нанести иммунную сыворотку к НСV-АГ меченную изотопом 125J.
*Промыть буфером.
*Учесть реакцию.
ОСНОВЫ МЕТОДА ПЦР.
В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя
несколько стадий:
1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);
2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);
3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание
обеих нитей).
Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний.
1. Прямое определение наличия возбудителей.
Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ,
выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление
специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР
дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
2. Высокая специфичность.
Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что
в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.
3. Высокая чувствительность.
Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки
бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.
Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК
возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК
или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма.
5. Высокая скорость получения результата анализа.
Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и
выращивание культуры возбудителя, что занимает большое
количество времени. Унифицированный метод обработки
биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести
полный анализ за 4-4,5 часа.
6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно
культивируемых, некультивируемых и персистирующих
форм микроорганизмов, с которыми часто приходится
сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также
очень эффективно в отношении возбудителей с высокой
антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление
возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).
Недостатки ПЦР.
1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма.
Это налагает определенные требования при использовании
ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае
подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя Обычно этот интервал составляет 4-8
недель.
2. Возможность перекрестной реакции.
Подбор праймеров происходит на основе существующих
знаний о геноме данного и сходных микроорганизмов. Теоретически существует возможность присутствия такого же
фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в
настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к
ложноположительному результату реакции.
3. Изменчивость микроорганизмов.
Хотя при конструировании тест-системы фрагмент генома,
используемый для амплификации, выбирается из высоко
консервативной области, изменчивость микроорганизмов
может приводить к тому, что некоторые генотипы или
штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким образом становиться неуловимыми данной тест-системой.
Последние два пункта важны для разработчиков ПЦРдиагностикумов. В настоящее время разработаны стандар-
ты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя), которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок.
Применение ПЦР в практическом здравоохранении.
Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих
проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение
этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует
отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов. Используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм
бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина.
Показания к применению метода ПЦР при различных заболеваниях.
1.Применение ПЦР в урогинекологической практике.
2. Применение в неопатологии.
3. Применение ПЦР в практике службы крови.
4. Применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии.
5. Применение ПЦР в клинике инфекционных заболеваний.
6. Применение ПЦР в иммунологии.
7.Применение ПЦР в онкологии и др.