Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии.
реклама
На правах рукописи Солодовникова Ирина Михайловна Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии. специальность 03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2007 1 Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова. Научные руководители доктор биологических наук, Бакеева Л.Е. доктор биологических наук, профессор, Ягужинский Л.С. Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор, лаб. Капелько В.И, рук. экспериментальной патологии сердца, Инст. эксп. кардиол., Рос. кардиол. науч.произв.компл., Фед. агентство Росмедтехнологий доктор биологических наук, профессор, Мошков Д.А, зав. лаб. ультраструктуры нейрона, Инст. теор. и эксп. биофиз. РАН. Ведущая организация: Институт морфологии человека, г.Москва. Защита состоится “_18_” _декабря_2007 г. в _15:30_ часов на заседании Диссертационного Совета _ ___.___.__ при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские Горы, д.1, корп.12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан “14” ноября 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вопросы взаимосвязи структуры и функции митохондрий постоянно находятся в центре внимания широкого круга исследователей. В последние годы произошли и происходят революционные события в митохондриологии. В традиционные представления о роли митохондрий в клетке внесены существенные коррективы. Ещё сравнительно недавно наши представления о митохондриях сводились только как к энергетическим станциям клетки, где роль митохондрий в развитии патологии ограничивалась нарушением энергообеспечения, и исключительно с этих позиций рассматривались все ультраструктурные преобразования митохондрий, в то время как многие ультраструктурные состояния митохондрий невозможно объяснить в свете таких представлений. В настоящее время основным компонентом в развитии многих патологий считается окислительный стресс. Термин «окислительный стресс» не имеет на сегодня чёткого определения, он используется для широкого круга разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих как повышенную внутриклеточную генерацию активных форм кислорода (АФК), так и окислительное повреждение клетки. Как известно, ткань миокарда является одним из активных потребителей кислорода. Снижение уровня кислорода – гипоксия вызывает значительные нарушения структуры и функции миокарда. Наиболее чувствительными к гипоксии структурами клетки являются митохондрии, поэтому большой интерес представляет изучение состояния митохондрий в этих условиях. Кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации приводит не только к нарушению энергетики клетки, но и резко изменяет скорость генерации АФК митохондриями. Не смотря на огромное количество работ и неослабевающий интерес, на протяжении всего времени изучения ультраструктуры митохондрий, к состоянию этих органелл в условиях гипоксии, нехватка фактических данных пока ещё не позволяет составить полное представление о действии гипоксии на состояние митохондрий и прежде всего в ткани миокарда, где повреждающее действие гипоксии имеет место при многих патологиях миокарда. Цель работы состояла в изучении морфофункциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов при длительном действии гипоксии. Был применен специальный экспериментальный подход: исследование проводили на кусочках изолированного миокарда, инкубированных при 200С в условиях длительной гипоксии начиная с 6 ч и далее через каждые 12 ч, в течение 3-х суток. Были поставлены следующие задачи исследования: 3 1. Исследовать особенности ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии; 2. Исследовать динамику изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда в течение 72 ч инкубации ткани в условиях гипоксии, начиная с 6 часов и далее через каждые 12 часов; 3. Изучить функциональные особенности митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда после 72 ч гипоксии на изолированных митохондриях, а так же непосредственно in situ методом электронномикроскопической гистохимии на выявление функциональной активности цитохром с-оксидазы. Научная новизна. Определены основные ультраструктурные признаки ткани миокарда на модели изолированных кусочков ткани миокарда в условиях безкислородной среды, при которых сохраняется нативность ультраструктуры кардиомиоцитов и дыхательная активность митохондрий в течение 3-х суток. Впервые описана динамика возникновения популяции мелких электронно-плотных митохондрий, располагающихся внутри митохондрий основной популяции «митохондрий внутри митохондрий». Впервые исследованы особенности специфических для условий гипоксии перестроек внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов: геометрически упорядоченных ячеистых структур. Показано, что эти структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны изменяют свою морфологию при добавлении в среду инкубации АДФ, а также полностью исчезают при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М сахарозе. Изучены функциональные изменения системы окислительного фосфорилирования митохондрий во времени при глубокой длительной гипоксии кардиомиоцитов. Впервые удалось получить кластеры митохондрий, объединенные межмитохондриальными контактами во фракциях. Показана функциональная активность цитохром с-оксидазы в мелких, электронноплотных митохондриях при полном или частичном отсутствии таковой в митохондриях основной популяции. Впервые обнаружена поразительная стабильность и получена функциональная характеристика межмитохондриальных контактов при гистохимическом исследовании экспериментальной ткани на цитохром с – оксидазную активность. Практическая ценность работы. Предложенная в настоящей работе экспериментальная система исследования действия гипоксии может использоваться для изучения механизмов нарушения тканей сердца при тяжёлых поражениях миокарда. Установленные в работе закономерности изменений 4 структуры митохондриального аппарата кардиомицитов также могут быть использованы при изучении и интерпретации ультраструктуры митохондрий при действии гипоксии в различных исследованиях клеток и тканей. Полученные данные углубляют фундаментальные знания о действии гипоксии на ультраструктуру митохондриального аппарата. Апробация работы. Материалы работы были представлены: на II Всероссийской конференции «Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология)», (Москва, 2002), Международной конференции “Митохондрии в патологии” (Пущино, 2003), 1-й Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), FEBS Congress (Варшава,2004), III Съезде биофизиков России (Воронеж 2004), Международной конференции “Митохондрии в патологии” (Пущино, 2005), XXI Российской th конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006), 14 European Bioenergetics Conference EBEC, Moscow State University (Moscow, 2006), International Small-Angle Scattering Workshop is devoted to Yu. M. Ostanevich, (Dubna,2006), Первой Всероссийской школе-семинаре (Современные достижения бионаноскопии) физ-фак МГУ (Москва, 2007), Sixth National Conference on Application of X-ray, Synchrotron Radiation, Neutrons and Electrons for Material Characterization, (Москва, 2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы исследования”, “Результаты”, “Обсуждение результатов”, “Выводы”, “Список литературы”. Работа изложена на 103 страницах, включает 47 рисунков, список литературы содержит 220 ссылок. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. В исследовании по действию гипоксии на кардиомиоциты миокарда были использованы взрослые беспородные крысы массой 150-180 г. Экспериментальная модель. Крыс (150-180 г) декапитировали, ткань желудочков извлекали, измельчали на фрагменты 2 мм в растворе буфера: 250 мМ сахарозы, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ Tris, рН 7.4 при 4ºC. Препарат ткани помещали в пластиковые пробирки и заливали тем же буфером, предварительно продутым азотом в течение 30 мин, в котором нарезалась ткань. Образец быстро герметизировали и инкубировали при 20 оС начиная с 6 часов и до 72 часов. Выделение фракций митохондрий. Митохондрии для измерения функциональной активности выделяли с помощью стандартного метода дифференциального центрифурирования в среде выделения: 250 мМ сахароза, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ 5 Tris, рН 7.4, предварительно охлажденной до температуры 0оС. Фракции осаждали: ядерную при 300g, тяжелую -1700g, среднюю -10000g и лёгкую –17000g. Исследование функциональной активности митохондрий. Исследование проводили с помощью одновременной регистрации скорости поглощения кислорода электродом Кларка и мембранного потенциала митохондрий ТPP селективным электродом («НИКО», Россия). Среда инкубации содержала: 120 мМ KCl, 1мМ ЭДТА, 10мМ Tris, 5 мМ глутамат, 5 мМ малат, 0.5 мкМ тетрафенилфосфоний (TPP), рН 7.4. Для электронно-микроскопического исследования была использована общепринятая классическая методика. Определение активности цитохром c – оксидазы в митохондриях нативной и экспериментальной ткани сердца проводили по методике, описанной Селигманом с соавт. (Seligman et al., 1968). Ткань миокарда фиксировали 3%-ным раствором глутарового альдегида в PBS-буфере (0,15 NaCl/ 27 mM KCl/ 12 mM NaH2PO4, рН 7,2) в течение 10 минут при 4°; затем ткань инкубировали в растворе: 5 mg 3, 3'- диаминобензидина тетрагидрохлорида / 9 ml 0,05 M фосфатного буфера, рН 7,4/ 1 ml каталазы (20µg/ml)/ 10 mg цитохрома с/ 750 mg сахарозы в течение 3 часов при 37°С. Ткань отмывали в PBS-буфере 1 час, дофиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия в буфере 1,5 ч и далее обрабатывали по стандартной методике для электронно-микроскопического исследования. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Ультраструктура кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии. Проведённое электронно-микроскопическое исследование состояния ткани кусочков изолированного миокарда, инкубированных 72 часа в гипоксии при 20°С показало, что в этих экспериментальных условиях в кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда выраженных деструктивных процессов не происходит. На препаратах исследуемой ткани можно видеть расположенные рядами вдоль миофибрилл цепочки нативных по своей ультраструктуре митохондрий, объединённых межмитохондриальными контактами. Наличие межмитохондриальных контактов показывает, что выбранные нами экспериментальные условия позволяют сохранить в исследуемой ткани объединённую митохондриальную систему – характерную ультраструктурную особенность нативной ткани миокарда. 6 Однако обращает на себя внимание выраженная ультраструктурная гетерогенность популяции митохондрий: основную популяцию составляют электронно-светлые митохондрии с обводненным, просветленным матриксом, контрастными, хорошо выраженными мембранами, в тоже время в ткани можно видеть и митохондрии иной ультраструктуры: мелкие электронно-плотные органеллы с электронно-плотным матриксом, выраженным обводнённым межмембранным пространством. Электронно-плотные митохондрии значительно варьируют по размерам от чрезвычайно мелких, имеющих 2-3 кристы, до сопоставимых по размеру с основной массой митохондрий. Электронноплотные митохондрии могут располагаться непосредственно среди миофибрилл, а так же в межмембранном пространстве более крупных электронно-светлых митохондрий, как правило, на периферии органеллы (фот. 1). Эта удивительная морфологическая особенность является характерным ультраструктурным признаком исследуемой ткани. В наших экспериментальных условиях мы также обнаружили изменения ультраструктуры митохондрий, хорошо известные в литературе для условий гипоксии. Это прежде всего большое количество септированных митохондрий, а также образование включений во внутрикристном пространстве, которые имеют вид электронно-плотного материала. Наряду с этими изменениями морфологии митохондрий мы обнаружили в нашей экспериментальной ткани неизвестные ранее перестройки внутренней организации митохондрий. Так в отдельных митохондриях можно видеть участки повышенной электронной плотности, которые можно Фот.1. Последовательные срезы митохондрии изолированной ткани миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии. В межмембранном пространстве расположена мелкая, электронно-плотная митохондрия. 7 принять за мелкую, электронно-плотную митохондрию. Анализ этих структур при большом увеличении показывает, что это участки повышенной электронной плотности, в которых происходит образование внутренней митохондриальной мембраной упорядоченФот. 2 а, б. Локальная перестройка внутренней митохондриальной ных струкмембраны с образованием упорядоченной структуры: а-обзорная тур в резульфотография, б-при большем увеличении. тате перехода ламеллярной упаковки мембран соседних крист в трубчатую. На фот. 2 а, б видно, что внутренняя мембрана митохондрии образует электронно-плотную ячеистую структуру. Расположение ячеек упорядочено, хорошо различимы как бы узлы, в результате чего на поперечном сечении они имеют гексагональные очертания. Структура этих образований напоминает кристаллическую решетку. Различим плавный переход внутренней митохондриальной мембраны в эту структуру, поэтому данное образование не является изолированной самостоятельной структурой. Образования такого типа внутри митохондрий до настоящего времени в литературе не установлены. При изменении условий инкубации, добавлением в среду инкубации 0,1мМ АДФ, эти структурные образования резко меняют свою морфологию (фот. 3 а, б). На поперечном сечении это скопление треугольных структур, а при наклонном - это треугольные призмы, расположенные на одинаковом расстоянии и параллельно друг другу (3, а). На продольном сечении – это параллельно расположенные тяжи крист (фот. 3, б). 8 При этом утрачивается повышенная электронная плотность этого структурного образования. Такая ультраструктура митохондрий была описана Ревелом и соавт. для крикотироидной мышцы летучей мыши (схема В). Особенностью этих структурных образований является обратимость перестроек внутренней митохондриальной мембраны. Как показали наши исследования, при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М Фот. 3 а, б. Ультраструктура локальных сахарозе эти структурные перестройки перестроек внутренней мембраны митохондрий при добавлении в срезу внутренней митохондриальной мембраны инкубации 0,1мМ АДФ. В-схема исчезают. Нам никогда не удавалось ультраструктуры митохондрии по Revel обнаружить эти структуры в изолированных J.P. et al., 1963. митохонриях. Гипоксия является сильным стрессовым воздействием на клетку. Можно предположить, что наблюдаемые нами ультраструктурные изменения внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов также могут быть компенсаторной реакцией, обеспечивающей более высокую жизнеспособность митохондрий клетки в экстремальных условиях гипоксии. 9 2.Исследование функциональной активности митохондрий кусочков изолированной ткани миокарда, инкубированных в условиях длительной гипоксии. Обнаруженные нами в условиях экспериментально вызванной кислородной недостаточности изолированной ткани миокарда особенности ультраструктуры митохондрий неотделимы от функциональных процессов в ткани миокарда, лишённой кислорода. Мы провели исследование функциональных особенностей митохондрий нашей экспериментальной ткани на суспензии изолированных митохондрий, а так же непосредственно in situ методом электронномикроскопической гистохимии. 2.1 Особенности системы окислительного фосфорилирования митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной в условиях длительной гипоксии. Для исследования функциональных характеристик митохондрий нашей экспериментальной ткани было проведено выделение из кусочков ткани миокарда, инкубированных в условиях гипоксии фракций митохондрий, осаждённых на различных скоростях дифференциального центрифугирования. Был проведён ультраструктурный анализ полученных фракций. “Тяжёлая“ (1700g) фракция наряду с миофибриллами, ядрами кардиомиоцитов содержала кластеры митохондрий, объединённые межмитохондриальными контактами. Внутри отдельных митохондрий обнаруживались мелкие электронно-плотные митохондрии. Митохондрии ”средней” фракции (10000g) имели ультраструктуру, характерную для митохондрий, изолированных в 0,25М сахарозе: округлую форму, увеличенное межмембранное пространство, сжатый матрикс. При электронномикроскопическом исследовании ”лёгкой” фракции (17000g) было выявлено, что эта фракция содержит мелкие электронно-плотные митохондрии, по своей ультраструктуре соответствующие электронно-плотным митохондриям, расположенным внутри более крупных электронно-светлых митохондрий. Эти электронно-плотные митохондрии ”лёгкой” фракции имели наружную и внутреннюю мембраны, а их средний диаметр составлял 0,15 мкм. Так же в этой фракции обнаруживались мелкие набухшие митохондрии, набухание которых, очевидно, происходило из-за нарушения мембран во время процесса выделения. Нами были проведены сравнительные исследования дыхательных характеристик митохондрий, выделенных на скорости 10000g из контрольной интактной ткани миокарда и из экспериментальной ткани - ”средней” фракции митохондрий. Так же параллельно с измерением скоростей дыхания измерялся 10 мембранный потенциал (∆Ψ) экспериментальных и контрольных митохондрий. Дыхательные характеристики контрольных митохондрий приведены на рис. 1. Скорости дыхания на субстратах первого (глутамат и малат) и второго (сукцинат) комплексов дыхательной цепи, а так же Рис. 1. Дыхание (верхняя кривая) и мембранный увеличение скорости дыхания потенциал (∆Ψ) (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из интактной ткани миокарда. Добавки: при добавлении АДФ и FCCP Mit- митохондрии, 0.5 мг белка, ADP –АДФ, rot – соответствовали описанным в ротенон 1 мкМ, suc – сукцинат 10мМ, FCCP – FCCP 0.2 литературе данным для мкМ, (глутамат и малат содержался в среде инкубации). изолированных митохондрий контрольной ткани миокарда. Исследование функции дыхательной системы митохондрий ”средней” фракции, выделенных из экспериментальной ткани сердца показало, что максимальная скорость дыхания митохондрий на субстратах первого (глутамат и малат) и второго (сукцинат) комплексов дыхательной цепи в течение 24 часов инкубации не снижается относительно скорости дыхания контрольных митохондрий (рис. 2, таблица 1). Таблица 1. Максимальные скорости дыхания митохондрий. Препарат митохондрий Субстраты дыхания Контрольные митохондрии * глут. +мал. Скорость дыхания <X2> N (нг ат О/ мг белка) 124 22 4 сук.+рот. 127 25 4 Митохондрии, выделенные из ткани микарда, инкубированной 24 часа в гипоксии** глут. +мал. 120 26 3 сук.+рот. 128 25 3 Митохондрии, выделенные из ткани микарда, инкубированной 72 часа в гипоксии** глут. +мал. 5 5 3 120 30 3 сук.+рот. <X2> - среднеквадратичное отклонение, N – количество экспериментов, * - дыхание в состоянии 3 по Чансу, ** - дыхание не стимулируется разобщителем АДФ. 11 Рис. 2. Дыхание (верхняя мембранный потенциал (нижняя кривая) митохондрий, выделенных из ткани миокарда, инкубированной кривая) и в условиях гипоксии в течение 24 часов. Добавки: см. рисунок 1. При этом фосфорилирующая функция митохондрий экспериментальной ткани полностью нарушена: добавление АДФ не стимулирует скорость дыхания, мембранный потенциал (∆Ψ) после добавления субстратов дыхания незначительно возрастает, но затем быстро спонтанно падает (рис. 2). Сукцинатоксидазная активность остаётся без изменений даже через 72 часа инкубации экспериментальной ткани в условиях гипоксии. Это показано на рис. 3, где видно, что скорость дыхания митохондрий на субстрате второго комплекса (сукцинат) не падает по сравнению со скоростью дыхания контрольных митохондрий. Но уже через 72 часа инкубации ткани миокарда в гипоксии полностью подавляется малатоксидазная активность митохондрий, т.е. после добавления субстратов первого комплекса (глутамат и малат) стимуляции дыхания не происходит (рисунок 3. таблица 1). Добавление АДФ не стимулирует скорости дыхания, мембранный потенциал (∆Ψ) не возрастает. Результаты проведённых исследований показывают, что система окислительного фосфорилирования митохондрий экспериментальной ткани быстро разобщается в процессе инкубации ткани в условиях гипоксии: стимуляция скорости дыхания при добавлении АДФ не происходит. При этом Рис. 3. Дыхание (верхняя кривая) и мембранный функция дыхательной цепи потенциал (нижняя кривая) митохондрий, сохраняется длительное время: выделенных из ткани миокарда, инкубированной в активность условиях гипоксии в течение 72 часов. Добавки см. малатоксидазная рисунок 6, KCN - 1мМ KCN. регистрируется в течение 24 12 часов инкубации, а сукцинатоксидазная активность регистрируется в течение 72 часов инкубации. 2.2 Выявление цитохром с оксидазной активности митохондрий изолированных кусочков миокарда, инкубированных 72 часа в условиях гипоксии. Исследования на митохондриях, изолированных из экспериментальной ткани, не позволяют получить полную функциональную характеристику всех морфологических типов гетерогенной популяции митохондрий. Кроме того, приведённые выше функциональные характеристики митохондрий экспериментальной ткани отражают особенности функционирования суспензии изолированных митохондрий, в то время как огромный интерес представляет получение функциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов исследуемой экспериментальной ткани непосредственно in situ, без разрушения ткани.Мы провели исследование на цитохром с оксидазную (ЦО) активность митохондрий кардиомиоцитов после 3 суток инкубации ткани в условиях гипоксии широко известным в литературе с 1968 г методом электронно-микроскопической гистохимии (Seligman et al., 1968; Novikoff and Goldfischer, 1969; Nonaka et al., 1989; Angermuller et al., 1998; Walker and Benzer, 2004). Метод основан на способности цитохрома с окислять 3,3`-диаминобензидин (ДАБ). ДАБ проникает в межмембранное пространство митохондрий, но не идет в матрикс. В комплексе IV (ЦО) дыхательной цепи митохондрий в первом шаге цитохромоксидазной реакции митохондрий происходит окисление ДАБ цитохромом с, что приводит к полимеризации ДАБ-а. Полимеры вступают в реакцию с оксидом осмия, образуя осмиофильный осадок. Продукт данной реакции, в отличие от методов, основанных на Nadi реакции имеет не капельную форму, а проявляется в виде мелкодисперсного осадка, который более точно выявляет цитохром с оксидазу в митохондриях, заполняя внутрикристное пространство и пространство между ограни-чивающими митохондрию наружной и внутренней мембранами, благодаря чему места активной работы цитохром с оксидазы четко видны на электронномикроскопических препаратах. На фот. 4 а электронно-микроскопическая картина митохондрии кардиомиоцита контрольной ткани на большом увеличении, полученная в результате проведения реакции на цитохром с оксидазную активность. Видно, что внутрикристное пространство митохондрии контрольной ткани заполнено электронно-плотным осадком. Так же электронно-плотный осадок присутствует между наружной и внутренней, ограничивающих митохондрию мембранами и во внутрикристном пространстве. После длительного действия 13 гипоксии картина реакции резко меняется. На фот. 4 б четко видно, что внутри электронно-плотной митохондрии по всей длине мембран крист присутствует мелкодисперсный осадок, в то время как в основной митохондрии реакция на цитохром с оксидазу Сравнение отсутствует (ЦО-). картины реакции митохондрий контрольной ткани (фот. 4 а) и картины реакции митохондрий экспериментальной ткани, содержащей мелкую, электронноплотную митохондрию (фот. 4 б), показывает локальную сохранность цитохром с - оксидазной активности только лишь в мелкой электронно-плотной митохондрии, при полном отсутствии цитохром с оксидазной активности в основной митохондрии. Характерной, удивительной особенностью наших экспериментальных условий является наличие в кардиомиоцитах значительного количества межмитохондриальных контактов нативной структуры. При исследовании цитохром соксидазной активности в наших экспериментальных условиях оказалось, что в области межмитохондриальных контактов видна ярко выраженная ЦО+ реакция. В контрольной ткани в Фот. 4 а, б. Электронно-микроскопическая картина митохондрий после реакции на цитохром соксидазную активность: а митохондрия кардиомиоцита контрольной ткани миокарда, бмитохондрия экспериментальной ткани. 14 отличие от экспериментальной межмитохондриальные контакты нам наблюдать не удалось. По нашему мнению, это можно объяснить тем, что согласно использованной методике ткань инкубируется в течение 3 ч при температуре 37оС. В таких условиях межмитохондриальные контакты нативной ткани разрушаются (Тихова и др., 1988). Тем удивительнее являются результаты наших наблюдений многочисленных межмитохондриальных контактов в экспериментальной ткани, которая также инкубировалась 3 ч при температуре 37оС. 3 Динамика изменений ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов изолированного миокарда крысы при длительной инкубации в условиях гипоксии. Фот. 5 а, б. Начальные стадии формирования митохондрии внутри митохондрии. а - появление электронно-прозрачной полости внутри митохондрии, б- перемещение участка матрикса, ограниченного внутренней митохондриальной мебраной, в межмембранное пространство. 15 Чтобы выяснить, не является ли обнаруженное нами явление образования «митохондрий внутри митохондрий» артефактом условий эксперимента, а также для выяснения ультраструктурного механизма возникновения необычной митохондриальной популяции мы провели исследование состояния ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов кусочков изолированных миокарда, инкубируемых 72 ч в условиях гипоксии, через 6, и далее через каждые 12 ч. Через 6 ч инкубации кусочков изолированного миокарда в условиях гипоксии популяция митохондрий кардиомиоцитов одинакова по своей ультраструктуре это органеллы со сжатым, электронно-плотным матриксом, параллельно ориентированными кристами. Характерным ультраструктурным признаком митохондриальной популяции кардиомиоцитов на данное время инкубации являются необычные структурные образования внутри митохондрий. Первоначально в межмембранном пространстве митохондрий возникают незначительные по размеру (расположенные в пределах 1,5 – 2 серийных срезов) электронно-прозрачные замкнутые полости, диаметр которых составляет порядка 0.15 мкм (фот. 5 а, стрелка на рис. а). Далее в эту полость перемещается участок матрикса, ограниченный внутренней мтохондриальной мембраной (фот.5, б). Митохондрия на фот. 5, б, имеет обводненный матрикс, что позволяет детально анализировать организацию этой структуры внутри митохондрии. Стрелкой показано перемещение петлеобразной складки внутренней мембраны с примыкающим к ней матриксом в полость, образованную внутренней митохондриальной мембраной. Далее происходит отшнуровывание этого участка матрикса, ограниченного внутренней митохондриальной мембраной. Нужно Фот. 6 а, б. Образование «митохондрии внутри митохондрии» на 12 заметить, что на ч винкубации ткани в условиях гипоксии: при малом (а) и большом этой стадии вокруг (б) увеличении. полости образуется электронно-плотный слой (фот. 5 а, показано стрелкой). Через 12 ч инкубации ткани миокарда при гипоксии наблюдается увеличение этих структур внутри митохондрий и формирование их мембранного содержимого (фот. 6, а, б). На большом увеличении видно, что эта структура уже имеет ограничивающие мембраны (фот. 6 а, б). Также видно, что вновь образованная структура не связана с основной митохондрией, кристы митохондрии основной популяции как бы 16 «обрываются», образуя замкнутую полость, окружающую вновь образующуюся структуру. Электронно-плотный слой вокруг этой структуры сохраняется. На данный срок инкубации во все большем количестве митохондрий происходит формирование этих структурных новообразований и в пределах одного среза можно видеть различные стадии этого процесса. То есть процесс формирования новых структур внутри митохондрий происходит не одномоментно во всех митохондриях, а постепенно затрагивает все новые органеллы. На 24 ч инкубации в условиях гипоксии в ткани присутствует уже значительное число митохондрий, внутри которых можно наблюдать образование мелких, электронно-плотных структур – предшественников митохондрий. На этот срок инкубации ткани во вновь образованных структурах отчетливо видны концентрические, электронно-плотные мембраны с электронно-плотным матриксом между ними (фот. 7, а, б). В течение двух последующих суток инкубации происходит обособление этих структур. Электронно-плотный слой, окружающий вновь формирующуюся структуру исчезает. В то же время, ко вторым суткам изменяется морфологическое состояние митохондрий основной популяции, внутри которых формируется новая структура. Происходит обводнение матрикса митохондрий, митохондриальные мембраны становятся как бы лизированными. На их фоне четко Фот. 7 а, б. Образование «митохондрии внутри митохондрии» на 24 ч инкубации ткани в условиях гипоксии; при малом (а) и большом (б) увеличении. 17 видно, что во вновь образованных структурах электронная плотность мембран соответствует плотности мембран митохондрий интактного миокарда. К третьим суткам инкубации в ткани присутствуют уже хорошо выраженные, структуры, названные нами как «митохондрии внутри мито-хондрии» (фот. 1). Таким образом, проведённое нами исследование динамики ультраструктуры митохондрий кардиомио-цитов изолированных кусочков мио-карда при инкубации ткани в условиях гипоксии в течение 72 часов показывает, что условия гипоксии, очевидно являются сигналом к индукции процесса образования мелких электронно-плотных митохондрий. Эти преобразования ультраструктуры митохондрий происходили на фоне практически не изменённой общей структуры кардиомиоцитов, что указывает на отсутствие признаков некроза в наших экспериментальных условиях и, следовательно, можно сделать вывод о том, что обнаруженное нами явление образования “митохондрий внутри митохондрий” не является артефактом условий эксперимента. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученная нами на ультраструктурном уровне морфологическая картина изменений митохондриальной популяции кардиомиоцитов под действием гипоксии значительно отличается от имеющихся в литературе представлений. В огромном количестве работ по изучению действия гипоксии на ультраструктуру миокарда, авторы единодушно отмечают однотипность изменений митохондрий, характерной реакцией которых, по их мнению, является набухание митохондрий, разрушение внутренней митохондриальной мембраны, а в далеко зашедших стадиях процесса – сохранение лишь наружной митохондриальной мембраны. В то же время ряд авторов указывает, что наступающие под влиянием острой гипоксии изменения в ультраструктурной организации мышечных клеток сердца являются обратимыми (Саркисов, Втюрин, 1967). Обнаруженные нами удивительные ультраструктурные изменения митохондрий кардиомиоцитов, в частности возникновение мелких электронноплотных митохондрий в наших экспериментальных условиях сопоставимо с хорошо известным в литературе явлением образования промитохондрий в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae в анаэробных условиях. Возможно, что использованная в этих исследованиях фиксация перманганатом калия не позволила авторам выявить или возможно вызывала нарушение деградирующих мембран митохондрий дрожжевых клеток, в результате чего был сделан вывод о наличии в 18 клетках только мелких митохондрий с незначительным количеством крист и большого количества свободно расположенных мембран. Т.е., условия кислородной недостаточности очевидно являются сигналом к индукции процесса образования мелких электронно-плотных митохондрий. Также можно предположить, что в наших экспериментальных условиях кислородной недостаточности ультраструктурная перестройка системы митохондриального ретикулума кардиомиоцитов – появление особых структурных образований «митохондрий внутри митохондрий» может быть обусловлена нарушением митохондриального метаболизма АФК: генерации и удаления АФК митохондриями. Чётко выраженная функциональная активность цитохром с - оксидазы в электронно-плотных митохондриях, локализованных в межмембранном пространстве основной митохондрии, полностью утратившей функциональную активность, очевидно отражает стремление клетки выжить, сохранив в рабочем состоянии хотя бы часть митохондрии. В то же время возможно, что деградация отдельных митохондрий основной популяции, сопровождающаяся появлением мелких электронно-плотных митохондрий – один из возможных механизмов митоптоза, направленного на выбраковку митохондрий с нарушенной функциональной активностью. Ультраструктура межмитохондриальных контактов была описана уже давно (Бакеева и др., 1982). Использование классического метода обработки ткани миокарда коллоидным лантаном показало, что лантан откладывается избирательно в зоне межмитохондриальных контактов, но не сплошным слоем, а в виде упорядоченно расположенных электронно-плотных гранул, аналогично отложению в зоне вставочного диска, где он выявляет морфологию межклеточного контакта (Сударикова, 2000). Нам удалось показать, что в области межмитохондриальных контактов активно работает IV комплекс дыхательной цепи. Полученный нами результат позволяет говорить о том, что в популяции митохондриальной ткани, находящейся в условиях длительного стресса, значительно увеличивается число активно работающих контактов между митохондриями, что приводит к объединённой, слаженной работе этих органелл в условиях тяжёлого поражения кардиомиоцитов. Мы предполагаем, что это является защитной мерой, направленной на выживание ткани в условиях стресса. 19 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что в экспериментальных условиях инкубации изолированных кусочков миокарда при гипоксии в течение 72ч при 20оС в мышечных клетках миокарда выраженных деструктивных процессов не происходит, ультраструктурные признаки некроза отсутствуют и сохраняется сукцинатоксидазная активность митохондрий. 2. Впервые обнаружена неизвестная ранее локальная перестройка внутренней организации митохондрий с образованием трёхмерно упорядоченных структур, возникающая в экспериментальной ткани миокарда наряду с хорошо известными в литературе для гипоксии изменениями ультраструктуры митохондрий: внутрикристными включениями, септированными митохондриями. Показано, что обнаруженные структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны обратимы – при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0.25 М сахарозе они исчезают. 3. Показано, что в процессе инкубации изолированных кусочков миокарда в условиях гипоксии в кардиомиоцитах экспериментальной ткани возникает особая популяция мелких электронно-плотных митохондрий, локализованных в межмембранном пространстве крупных электронно-светлых митохондрий основной популяции этих органелл кардиомиоцитов. 4. Установлено, что структурное образование «митохондрий внутри митохондрий» не является артефактом условий эксперимента – эти структуры сохраняются в процессе выделения митохондрий. Популяция мелких электронноплотных митохондрий может быть выделена как самостоятельная фракция. 5. Обнаружено, что возникающие в митохондриях основной популяции кардиомиоцитов мелкие электронно-плотные митохондрии обнаруживают хорошо различимую цитохром с-оксидазную активность по всей длине образующихся крист, в то время как основная митохондрия, внутри которой формируется новая органелла, частично или полностью утрачивает цитохром с- оксидазную активность. 6. Впервые был установлен и детально исследован процесс возникновения митохондрий внутри митохондрий в динамике. 7. В кардиомиоцитах изолированной ткани миокарда после длительного действия гипоксии обнаружены межмитохондриальные контакты нативной структуры, характеризующиеся повышенной стабильностью. Межмитохондриальные контакты экспериментальной ткани, в отличие от 20 межмитохондриальных контактов контрольной ткани, сохраняют нативность при инкубации в течение 3 часов при температуре 37 оС. 8. Впервые получена функциональная характеристика межмитохондриальных контактов кардиомиоцитов методом электронно-микроскопической гистохимии. Показано, что в структуре межмитохондриальных контактов чётко выявляется цитохром с оксидазная активность. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Tonshin A.A., Solodovnicova I.M., Saprunova V.B., Bakeeva L.E., Yagujinsky L.S. Functional activity of mitochondria isolated from myocardium tissue after apoptosis induction by anoxia. // Mitochondion. 2002. Vol.1. No 6. P 529. 2. Тоньшин А.А., Сапрунова В.Б. Солодовникова И.М. Бакеева Л.Е. Ягужинский Л.С. Функциональная активность и ультраструктура митохондрий, выделенных из апоптозной ткани сердца. // Биохимия, 2003,68, 1070-1079. 3. Сапрунова В.Б., Солодовникова И.М., Бакеева Л.Е; Ягужинский Л.С. Ультраструктура митохондриального аппарата кардиомиоцитов при апоптозе, индуцированном аноксией. // Цитология. 2003.V.45. Р.922-923. 4. Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С.. Динамика изменений ультраструктры митохондрий кардиомиоцитов изолированного миокарда крысы при длительной инкубации в условиях аноксии. // Цитология. 2006. 48 (10): 848-855. 5. Т. Н. Муругова, В. И. Горделий, А. И. Куклин, И. М. Солодовникова, Л. С. Ягужинский. Регистрация трёхмерно упорядоченных структур в интактных митохондриях с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов. // Кристаллография. 2007. V.52. P. 521–524. 6. В.Б. Сапрунова, И.М. Солодовникова, Л.Е. Бакеева. Выявление цитохром с оксидазной активности в митохондриях кардиомиоцитов изолированной ткани миокарда при длтельном действии гипоксии.// Цитология. 2007. в печати. 7. Тоньшин А.А., Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С. Функциональная активность митохондрий, выделенных из ткани сердца, после индукции апоптоза в условиях аноксии.// Тезисы докладов II Всероссийской конференции “Клинческие и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология) в сб. “I всероссийский конгресс “Современные технологии в педиатрии и детской хирургии”. Материалы конгресса”. Москва. 16-19 октября 2002 г. С. 482. 8. Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б. Бакеева Л.Е; Ягужинский Л.С. Ультраструктура митохондриального аппарата кардиомиоцитов при апоптозе, индуцированном аноксией.// Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пушино. 2003. С. 272-273. 9. Solodovnikova IM, Saprunova VB, Bakeeva LE, Tonshin AA, Yaguzhinsky LS, “BHT action on the dynamics of ultrastructural changes of mitochondria in myocardium tissue after apoptosis induction by anoxia.” Abstracts of FEBS Congress 2004, Blackwell Publishing, p.178 10. Бакеева Л.Е., Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б. Митохондрия внутри митохондрии (условия возникновения, динамика образования).// Тезисы докладов III Съезда биофизиков России. Воронеж. 24-29 июня. 2004, С. 396-397. 11. Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б. Бакеева Л.Е; Ягужинский Л.С. Новообразование митохондрий при апоптозе; подавление антиоксидантами. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пушино, 2005, Р.284. 12. Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б. Бакеева Л.Е; Ягужинский Л.С. Новообразование митохондрий в условиях аноксии: динамика процесса и исследование функциональной активности. Тезисы докладов на XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка), 2006, Р.271. 21 13. T. N. Murugova, V. I. Gordeliy, A. Kh. Islamov, A. I. Kuklin, I. M. Solodovnikova, L. S. Yaguzhinsky. Detection of three-dimensional structures of inner mitochondrial membrane under low-amplitude swelling by small angle neutron scattering. Biochim. Biophys. Acta, 2006. V.14. P. 524-525. 14. T. N. Murugova, V. I. Gordeliy, A. I. Kuklin, A.I. Ivankov, I. M. Solodovnikova,V.I.Yurkov, L. S. Yaguzhinsky. "Investigation of rat heart mitochondria by small angle neutron scattering". // Тhesis of International Small-Angle Scattering Workshop is devoted to Yu. M. Ostanevich, 2006, p. 45, Dubna, Russia 15. Т.Н.Муругова, В.И.Горделий, А.И. Куклин, А.И.Иваньков, И.М.Солодовникова, В.И. Юрков, Л.С.Ягужинский. Изучение структуры митохондрий с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов.Тезисы Первой. Всероссийской школы-семинара (Современные достижения бионаноскопии). // Физ-фак. МГУ Москва, 2007 стр.40-41. 22
