Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии
Российской академии наук
на правах рукописи
Саутин Максим Евгеньевич
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИ НАПРАВЛЕННАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ
ПСОРИАЗА И АТЕРОСКЛЕРОЗА АТОРВАСТАТИНОМ С УЧЕТОМ
ОБЩИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФАКТОРОВ
14.03.06 - клиническая фармакология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор медицинских наук, профессор А.Л. Пирузян
КОНСУЛЬТАНТ:
кандидат биологических наук В.В. Соболев
Москва - 2014
2
СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ ........................................................................................................ 2
ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 8
1.1. Общая клиническая характеристика псориаза и атеросклероза .................. 8
1.2. Медиаторы воспаления в развитии атеросклероза и псориаза .................. 14
1.3. Матриксные металлопротеиназы ................................................................ 21
1.3.1 Характеристика матриксных металлопротеиназ ................................... 21
1.3.2 Члены семейства матриксных металлопротеиназ ................................. 22
1.3.3 Патофизиология металлопротеиназ и их роль в патогенезе псориаза
и атеросклероза ................................................................................................ 25
1.4. Интерлейкины в патогенезе псориаза и атеросклероза ............................. 29
1.5. Статины в терапии атеросклероза и псориаза ............................................ 31
ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ ......................... 37
И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ........................................................................... 37
2.1. Общая характеристика обследованных пациентов .................................... 37
2.2. Препарат, применяемый для лечения ......................................................... 42
2.3. Биоинформационный анализ и базы данных .............................................. 44
2.4.Методика гомогенизации и приготовления образцов ................................. 45
2.5. Приготовление серии стандартов для проведения RT-PCR ...................... 48
2.6. Подбор праймеров и оптимизация условий ПЦР ....................................... 49
2.7. Полимеразная цепная реакция в реальном времени .................................. 49
2.8.
Иммуногистохимическое
атеросклеротическим
исследование
процессом,
и
кожи
сосудов,
пораженных
пациентов,
страдающих
псориазом ............................................................................................................ 51
2.9. Иммуноферментный анализ ........................................................................ 54
3
2.10. Статистическая обработка данных ............................................................ 57
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ..................................................... 58
3.1. Результаты обследования пациентов, страдающих псориатическим
поражением
кожи,
и
пациентов,
страдающих
атеросклеротическим
поражением сосудов, до начала лечения аторвастатином ................................ 58
3.2. Результаты биоинформационного анализа ................................................. 62
3.3. Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих интерлейкин IL-17A и
матриксные металлопротеиназы MMP-2, MMP-9, MMP-12. ........................... 71
3.4. Результаты исследования исходного уровня IL-17A и MMP-12 в
сыворотке крови обследованных пациентов ..................................................... 81
3.5. Динамика лабораторных показателей при контрольном обследовании ... 82
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ........................... 93
ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 98
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ .................................................................. 100
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................... 102
4
ВВЕДЕНИЕ
Псориаз – хроническое, обычно длительно протекающее, рецидивирующее
заболевание кожи, основным элементом которого являются папулы, покрытые
серебристо-белыми чешуйками. Это один из наиболее распространенных
хронических дерматозов: Доля пациентов, больных псориазом, составляет 12-15%
среди всех дерматологических больных.
Сейчас не возникает сомнений в системном характере проявлений псориаза.
Заболевание сопровождается нарушением обмена веществ и поражением многих
органов. Среди патологий, сопутствующих псориазу, выделяют поражения сердца
и сосудов, в том числе атеросклеротического генеза. Имеющиеся данные
свидетельствуют о нарушениях липидного обмена при псориазе, характерных для
атеросклеротического процесса, усилении прогрессирования атеросклероза у
больных псориазом.
Несмотря на наличие множества теорий, касающихся возникновения,
развития, прогрессирования псориаза, вопрос его лечения остается открытым. В
настоящее время существует целый ряд схем терапии, направленных скорее на
регрессирование проявлений заболевания, чем на искоренение причин развития
самого
процесса,
среди
глюкокортикоидами,
них
инъекций
-
применение
триамцинолона,
мазей
с
дитранол,
фторированными
использование
аналогов витамина D3.
У каждого метода есть свои недостатки. Так, длительное применение мазей с
фторированными глюкокортикоидами приводит к атрофии кожи, развитию стрий
и телеангиэктазий. Триамцинолон может вызывать гипопигментацию в месте
введения препарата. Применять препараты, содержащие витамин D3, можно на
площади кожи, не превышающей 40% поверхности тела, так как это может
вызвать гиперкальциемию.
В настоящее время развитие исследований в области изучения патогенеза и
вариантов лечения псориатической болезни направлены на создание препаратов
5
фармакологического воздействия и выяснение молекулярных и генетических
причин возникновения заболевания.
Атеросклероз – хроническое, прогрессирующее, воспалительное заболевание
стенок сосудов мышечного и мышечно-эластического типов с длительным
бессимптомным течением, что является основной причиной смерти в развитых
странах.
Прогрессирование
заболевания
приводит
к
возникновению
острых
кардиологических состояний, таких как инфаркт миокарда, нестабильная
стенокардия и внезапная сердечная смерть. Пока заболевание находится на
доклинической стадии, наличие атеросклероза можно установить с помощью
дуплексного
сканирования,
ультрасонографии,
коронарографии,
компьютерной
томографии,
внутрисосудистой
магнитно-резонансного
исследования. Терапия статинами может замедлить, остановить или даже
привести
к
обратному
развитию
атеросклеротического
заболевания,
в
зависимости от интенсивности проводимого лечения. В любом случае, лечение
пациентов с субклинической формой атеросклероза остается спорным и широко
обсуждается в научных кругах [160].
Атеросклероз возникает очень рано. Патологоанатомическое исследование
сердца молодых людей (средний возраст 22,1 года), убитых при боевых действиях
во
Вьетнаме,
продемонстрировало
практически
в
50%
случаев
атеросклеротическое поражение коронарных сосудов. Посмертные исследования
коронарных сосудов пациентов в возрасте от 13 до 19 лет показали наличие
атеросклеротических поражений и, в некоторых случаях, фиброзных бляшек в
артериях сердца [116].
Суммируя данные различных исследований, можно прийти к выводу о
ведущей роли воспалительного процесса в развитии как атеросклеротического
поражения сосудов, так и псориатического процесса [4].
Схожесть изменений в цитокиновом статусе и нарушения липидного обмена,
которые были описаны ранее и характерны как для псориаза, так и для
атеросклероза, указывают на схожесть механизмов, приводящих к поражению
6
кожи при псориазе и сосудистой стенки при атеросклерозе [7]. Представленные
данные послужили основой для исследования механизмов патогенеза и
протоколов ведения больных псориазом, у которых было выявлено нарушение
липидного обмена.
Профилактика и коррекция состояния липидного обмена – основного
фактора риска атеросклероза, остается крайне актуальной и в настоящее время.
Применение
гиполипидемических
препаратов
включено
в
современные
стандарты лечения атеросклеротических поражений сосудов при ИБС и других
заболеваниях [8; 9]. Среди препаратов, обладающих гиполипидемическим
действием, широкое применение получили статины [1].
За
последние
годы
появилось
свидетельствующих
о
том,
предрасполагающих
факторов
что
большое
псориаз
развития
количество
может
исследований,
являться
атеросклеротического
одним
из
поражения
артерий. Ряд данных, свидетельствует о выраженной противовоспалительной
активности препаратов группы статинов, и, в частности, их ингибирующем
действии на продукцию ряда провоспалительных цитокинов [8]. В связи с этим
большой интерес представляет изучение возможностей применения этой группы
препаратов в терапии заболеваний, основным патогенетическим звеном которых
является воспаление.
Целью настоящего исследования явилось обоснование эффективности
фармакотерапии аторвастатином больных псориазом и больных атеросклерозом с
применением общих молекулярных маркеров.
Задачи исследования:
1.
Изучить особенности течения псориаза в исследуемых группах
больных.
2.
Выявить с помощью биоинформационных методов сигнальные пути,
общие для псориаза и атеросклероза, и определить уровень экспрессии и
локализацию накопления белковых продуктов ключевых генов.
3.
Изучить изменение клинического статуса больных псориазом и
больных атеросклерозом на фоне применения аторвастатина.
7
4. Изучить изменение уровней IL-17A и MMP-12 у больных псориазом и
больных атеросклерозом на фоне лечения аторвастатином.
8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая клиническая характеристика псориаза и атеросклероза
Псориаз – эритематозно-сквамозный дерматоз, мультифакторной природы с
доминирующим значением генетических факторов в развитии. Характеризуется
гиперпролиферацией
эпидермальных
клеток,
нарушением
кератинизации,
воспалительной реакцией в дерме, изменением в различных органах и системах
[57]. Наиболее характерным для псориаза является гиперпролиферация и
измененная дифференцировка эпидермиса. В дополнение к этому псориаз
характеризуется комплексом иммунологических, биохимических, сосудистых и
неврологических отклонений.
Больные псориазом составляют 12-15% от всех пациентов, страдающих
дерматологическими
заболеваниями.
Существуют
данные,
которые
свидетельствуют не только о большой вариабельности как кожных проявлений
заболевания так и поражения органов и систем, сопровождающие его течение. По
данным за 2002 год распространенность псориаза среди населения Москвы и
Московской области составила 0.970.8%. В России заболеваемость псориазом
составляет около 1% [3].
В последние годы был отмечен рост тяжелых форм заболевания, которые
могут вести к инвалидности, а при особо тяжелом течении и к летальным
исходам. Это особенно коснулось пациентов детского возраста [5].
Псориаз в настоящее время классифицируется как иммуноопосредованное
воспалительное заболевание (ИВЗ) кожи [35]. Стало общепризнанным, что
пациенты с различными формами псориаза более подвержены развитию
системных коморбидных состояний, таких как сердечно-сосудистые заболевания,
метаболический
синдром,
диабет.
Исследования
показали,
что наиболее
эффективными мишенями при лечении псориаза являются T-клетки [42; 148] или
такие медиаторы воспаления как фактор некроза опухолей альфа (TNF-a),
воздействие на которые ведет к практически полной ремиссии заболевания [54].
Современные
исследования
подтверждают
данную
концепцию,
однако
9
свидетельствуют о том, что история более запутанная, поскольку включает в себя
варианты
регуляции
генетических
локусов
[161]
в
дополнение
к
противомикробной защите [65], презентацию антигенов [106], влияние NF-kB
транскрипционного комплекса [105] и T-клеток [28].
Ранние исследования функциональных путей, вовлеченных в патогенез
псориаза, ограничивались одним или несколькими генами. В исследование были
включены: трансформирующий ростовой фактор альфа [41], белки S100A8 и
S100A9 [70], ингибитор протеаз-3, интерферон-гамма [21], интерлейкин-8 [32]. В
настоящее время появилась возможность одновременного исследования большого
числа генов у одного и того же пациента. В одном из первых таких исследований
у 8ми пациентов, страдающих псориатическими повреждениями кожи, было
идентифицировано 153 гена, вовлеченных в воспалительный процесс [111]. На
основании ряда подобных исследований идентифицировано множество генов,
вовлеченных в процесс псориатичесокого, воспаления и составлены сети их
взаимодействий.
Psoriasis vulgaris характеризуется экспансией и активацией Th-1, Th-17 и Th22, продукцией в коже цитокинов, таких как интерферон-гамма, фактор некроза
опухолей (TNF), интерлейкинов IL-17 и IL-22 [89; 110]. Миелоидные дендритные
клетки
при псориазе
продуцируют
высокий
уровеньIL-23,
что
активно
стимулирует пролиферацию Т-клеток invitro. Одним из типов дендритных клеток
при
псориазе
является
TNF-a/индуцированные
дендритные
клетки,
продуцирующие оксид азота. Этот тип клеток продуцирует также большие
количества TNF, IL-20 и других воспалительных молекул [58]. Таким образом,
TNF-a/индуцированные дендритные клетки могут быть ключевым фактором для
привлечения широкого круга воспалительных молекул в кератиноциты и другие
типы клеток через пути, опосредованные фактором некроза опухолей и IL-20.
Избыточная продукция IL-1, IL-6, IL-8, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF)
и большого количества хемокинов может происходить при активации данного
пути.
10
Диапазон
воспалительных
молекул,
синтезируемых
при
псориазе,
регулируется T-клетками - Th-1 и Th-17, интерфероном-гамма, IL-17A и IL-22,
каждый из которых приводит к образованию характерных продуктов воспаления
в кератиноцитах и других типах клеток, присутствующих в поврежденной коже
[109]. В целом при псориазе синтезируется огромное количество воспалительных
продуктов (сотни отдельных продуктов генов) [79]. Эффективное лечение
псориаза снижает уровни циркулирующих цитокинов, таких как TNF и IL-1,
повышенный уровень которых является фактором риска развития сердечнососудистых заболеваний (ССЗ) [159].
Согласно модели Davidovici etal. (2010) цитокины, синтезируемые локально
при псориатическом поражении кожи, попадая в системный кровоток, могут
оказывать провоспалительное действие на другие органы и ткани, вызывая
системное воспаление [35].
Атерогенез начинается в местах повреждения эндотелия. Такие повреждения
могут быть итогом действия различных факторов, в том числе возросшей энергии
сдвига
при
артериальной
гипертонии,
повышенных
концентрациях
липопротеидов низкой плотности, токсинов, попадающих в организм при
курении. Фактором риска является также низкий уровень липопротеидов высокой
плотности и замедление обратного транспорта холестерина, резистентность к
инсулину, гликозилирование, как следствие сахарного диабета [47; 136]. Эти
факторы
приводят
к
уменьшению
продукции
оксида
азота,
ослабляя
сосудодвигательную функцию и снижая защитные функции эндотелия. Как
результат - липопротеиды низкой плотности инфильтрируют субэндотелиальное
пространство, а NO- может подвергнуться влиянию различных ферментов,
например таких как - 5’-липооксигеназа, фосфолипаза A2 и миелопероксидаза
[62].
Нефункционирующий эндотелий экспрессирует большое количество
молекул адгезии (VCAM-1, ICAM-1). Селектины провоцируют фиксацию
моноцитов крови к эндотелиальным клеткам сосудов. Фиксированные моноциты
взаимодействуют с моноцитарным белком хемоаттрактантом – 1, хемокином,
обеспечивающим
миграцию
фиксированных
к
эндотелию
моноцитов
в
11
субэндотелиальный слой сосуда. Таким образом, моноциты проникают в стенку
сосуда путем прямого эндотелиального трансцитоза или между эндотелиальными
клетками через поврежденные щелевые контакты [49; 129]. Повышенная
экспрессия моноцитарного колониестимулирующего фактора в воспаленной
интиме
стимулирует
дифференциацию
моноцитов
в
макрофаги,
экспрессирующих на своей поверхности рецепторы SPA, CD-36, связывающие и
способствующие интернализации окисленных липопротеидов низкой плотности,
других частиц и клеточных фрагментов. Макрофаги прогрессивно накапливают в
цитозоле все больше и больше холестерина в виде липидных капель, приобретая
вид пенистых клеток.
T-лимфоциты и другие медиаторы воспаления и иммунного ответа
обнаруживаются в месте повреждения в интиме и адвентиции сосудов [76; 127].
Однажды, попав в различные слои артериальной стенки, Т-клетки могут
секретировать провоспалительные цитокины и ростовые факторы, проводящие
сигнал к гладкомышечным клеткам и изменяющие их цитоскелет, продуцируют
матриксные металлопротеиназы и мигрируют из медии в интиму, где
пролиферируют и секретируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса,
формирующие фиброзную бляшку над местом повреждения [98].
Цитокины являются частью воспалительного каскада. Важно отметить, что
развитие воспалительного ответа в сосудистой стенке дает сигнал к дальнейшему
захвату липопротеидов низкой плотности и лейкоцитарной инфильтрации,
создавая основу для дальнейшего роста атеросклеротического повреждения.
Таким
образом, по прошествии времени
в месте атеросклеротического
повреждения образуется липидное ядро [20; 24].
Стабильность возникшего атеросклеротического повреждения зависит от его
клеточного и внеклеточного состава. Бляшки с малым липидным ядром, толстой
фиброзной покрышкой, малым числом воспалительных клеток и большим
количеством
гладкомышечных клеток, обычно стабильны. В тоже время,
наиболее подвержены разрыву бляшки, содержащие большое липидное ядро,
12
тонкую
покрышку,
большое
количество
макрофагов
и
малое
число
гладкомышечных клеток [38].
Активированные макрофаги в развившейся бляшке секретируют матриксные
металлопротеиназы, которые разрушают и ослабляют матриксный компонент
фиброзной бляшки. Они также секретируют различные цитокины, которые
ингибируют пролиферацию, запускают апоптоз гладкомышечных клеток и
подавляют продукцию матрикса
[38]. Цитокины являются активаторами
определенных генов, экспрессия которых включается при воспалении, а
глюкокортикоиды и факторы роста - модуляторами действия цитокинов.
Разрыв бляшки обычно происходит у основания фиброзной капсулы, которая
зачастую тонкая, содержит малое число гладкомышечных клеток и много клеток
воспаления. При разрыве, тромбоциты и факторы свертывания из крови
задерживаются на тромбогенных составляющих экстрацеллюлярного матрикса и
липидного ядра бляшки, таких как коллаген, фосфолипиды и тканевой фактор
Фактор фон Виллебрандта, формирование тромбина, превращение фибриногена в
фибрин и из активированных тромбоцитов формируют сеть взаимодействий,
которые приводят к образованию тромба. В процессе увеличения размеров, тромб
может частично или полностью закрывать просвет сосуда.
Многие из повреждений покрышки бляшек никак себя не проявляют и
выявляются при посмертных исследованиях. Прогрессирование атеросклероза с
годами является основой риска развития сердечно - сосудистых заболеваний,
развития осложнений и, как следствие, возможной смерти пациентов от
возникших осложнений.
Маркеры воспаления могут являться также и маркерами бессимптомного
течения
атеросклероза.
При
воспалительном
ответе
резко
возрастает
концентрация С-реактивного белка (СРБ), вызывая повреждение сосудов за счет
активации эндотелиальных клеток. Для этого процесса необходим переход
активного пентамерного CРБ в мономерный – мСРБ. В культуре эндотелиальных
клеток
артерий
концентраций
человека
именно
компонентов
мСРБ
вызывает
воспалительного
быстрое
ответа,
повышение
таких
как
13
хемоаттрактантный белок - 1 моноцитов, интерлейкин-8 и др. Нативный CРБ
такого эффекта не оказывает. Для индукции процесса необходим переход
пентамерной формы в мономерную [2]. Промотор гена СРБ содержит
регуляторные элементы, взаимодействующие с IL-1 и IL-6.
Повышение базовых концентраций высокочувствительного CРБ достоверно
предсказывает атеротромботические события и последствия после острого
инфаркта миокарда, указывая на ключевую роль CРБ в воспалительных
процессах, приводящих к атеросклерозу. Высокий уровень С - реактивного белка
ассоциирован
с
растущим
риском
возникновения
сердечно-сосудистых
осложнений, что дает дополнительную информацию при исследовании уровня
ЛПНП.
CРБ
способен
специфически
связываться
с
Х-ЛПНП,
модифицированными (окисленными) частицами Х-ЛПНП, которые в связи с CРБ
способны активировать комплемент. С-реактивный белок обнаруживается в
атероме, бляшках и в местах повреждений при острых инфарктах миокарда. При
исследовании интимы сосудов у здоровых детей оказалось, что умеренное
повышение высокочувствительного CРБ сочетается с увеличением индекса
толщины интимы/медии сонных артерий.
Изучение генетической основы сердечно-сосудистых заболеваний позволяет
говорить о необходимости раннего определения предрасположенности к ним. На
данный момент обследованию подвергаются пациенты с уже проявившимся
заболеванием. Врач может определить, почему именно развилась артериальная
гипертензия, атеротромбоз или гиперхолестеринемия, заложена ли в этом
генетическая
составляющая.
Соответственно,
это
позволяет
подобрать
индивидуальную терапию для каждого конкретного пациента.
На волне развития нанотехнологий все больший интерес уделяется
возможности лечения пациентов с генетическими нарушениями. Тем более,
перспективным
представляется
изучение
генетического
аппарата
задействованных в процессе повреждения клеток. Накопление информации об
изменении экспрессии генов предопределяет развитие смежных дисциплин и
открывает новые направления в лечении атеросклероза.
14
1.2. Медиаторы воспаления в развитии атеросклероза и псориаза
Хотя
прямые
механизмы
взаимодействия
между
метаболическими
нарушениями и неблагоприятными сердечно-сосудистыми изменениями при
псориазе не выявлены, псориаз и атеросклероз имеют сходную гистологическую
картину, в которую вовлечены T-клетки, макрофаги и моноциты. В частности,
перемещение лейкоцитов через эндотелий наблюдается как в псориатических, так
и
в
атеросклеротических
атеросклеротические
бляшки
бляшках.
Нестабильные
содержат
в
себе
псориатические
большое
и
количество
активированных T клеток, экспрессирующих цитокины, включая локальную и
системную экспрессию молекул
адгезии
и эндотелинов.
Клетки
Th-17,
секретирующие IL-17, играют важную роль в патогенезе псориаза и активации
воспаления в различных системах органов [16; 95]. IL-17 всегда повышен в
плазме пациентов, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, и всегда
экспрессируется на животных моделях возрастных коронарных артерий,
восприимчивых к ишемии [18; 61]. Широко известные факторы риска, такие как,
диабет, гипертоническая болезнь и ожирение, могут развиваться при участии
триггеров, локализующихся в воспаленной коже, жировой ткани[119]. В
частности, повышенный уровень С-реактивного белка провоцирует синтез
печенью высоких уровней IL-6, попадаюшего затем в кровеносное русло.
При исследовании генома идентифицирован, по меньшей мере 21 локус
генов, причастных к развитию сердечно-сосудистых заболеваний [17]. Интересно,
что ни один из идентифицированных генов не располагается в локусах
предрасположенности к псориазу. Это подтверждает предположение о том, что
патогенетические связи в большей мере существуют за счет системного
воспаления и/или нарушения метаболической регуляции, ассоциированной с
воспалением.
Исследование иммунной системы и эндотелия сосудов показало присутствие
воспаления в стенке сосудов на всех стадиях атеросклеротического процесса,
начиная
с
момента
формирования
тучных
клеток
до
стадии
разрыва
15
атеросклеротической
бляшки
Эпидемиологические
[85].
исследования
подтверждают воспалительное происхождение атеросклеротического процесса.
Они основаны на результатах обследования пациентов, перенесших острое
нарушение кровообращения, а также клинически здоровых лиц, у которых
обнаружены
такие
биомаркеры
воспаления
как
С-реактивный
белок,
использованный в качестве предиктора ранней диагностики риска развития
сосудистых
осложнений
[126].
Обследованы
пациенты,
страдающие
ревматоидным артритом, воспалительными заболеваниями кишечника, а также
пациенты стоматологических клиник [83; 135]. В этих исследованиях при
наличии
системных
повышенный риск
хронических
развития
воспалительных
заболеваний
сосудистых заболеваний,
выявлен
подтверждающихся
наличием у пациентов общеизвестных факторов риска развития ССЗ. Обобщение
данных лабораторных и клинических исследований привело к новому видению
патофизиологии атеросклероза.
На рисунке 1 схематично изображен каскад событий, которые предшествуют
формированию
атеросклеротической
и
псориатической
бляшек.
Антиген-
презентирующие клетки (АПК) активируют наивные Т-клетки в лимфатических
узлах, что провоцирует увеличение экспрессии ассоциированного с функцией
лейкоцитов антигена-1 (LFA-1). Активированные T-клетки (1)
мигрируют в
кровеносные сосуды (2), прилипают к эндотелию (3) и вместе с макрофагами
собираются на его поверхности (3а). LFA-1 и внутриклеточная молекула адгезии
1 (ICAM-1) способствуют перемещению клеток из кровеносного русла (4).
Активированные Т-клетки взаимодействуют с макрофагами, дендритными
клетками и гладкомышечной тканью (5), секретируют хемокины и цитокины,
которые провоцируют развитие воспаления, что приводит к образованию
псориатических или атеросклеротических бляшек (6). Макрофаги, в свою очередь,
трансформируются в тучные клетки в результате захвата окисленного ЛПНП (7).
Этот
каскад
событий
заканчивается
формированием
жировых
полос
в
субэндотелии и, в дальнейшем, атеросклеротических бляшек (8). В 2006 году
16
GelfandJ. M. etal. высказано предположение о том, что пациенты, страдающие
хроническими воспалительными заболеваниями, имеют более высокий риск
Рисунок.1 Иммунологические основы формирования бляшки при псориазе и
атеросклерозе. IP– адаптивный белок [122]
развития сердечно-сосудистых заболеваний. Согласно наблюдениям некоторых
авторов вероятность развития таких грозных осложнений, как острый инфаркт
миокарда у пациентов с различными формами псориаза, до двух раз выше, чем у
пациентов без признаков псориатического поражения[48]. Выявлена прямая
зависимость между степенью псориатического поражения и вероятностью
17
развития сосудистых осложнений в различных возрастных группах. Риск
возникновения осложнений оказался выше у молодых пациентов с тяжелыми
формами псориаза по сравнению с пожилыми пациентами с более легкими
формами псориатических поражений.
Аналогичные
результаты
получены
Mehtaetal. (2010) при анализе историй болезни 3603 больных тяжелыми формами
псориаза и сравнении их с данными группы условно здоровых пациентов [99].
Gelfand J. M. et al. (2006) предполагают, что такая зависимость указывает на
гетерогенный характер заболевания, поскольку в более раннем возрасте оно также
сопровождается и более тяжелыми формами аутоиммунных расстройств [48]. В
этом же исследовании отмечается, что пациенты, страдающие тяжелыми формами
псориаза, также более подвержены развитию острого нарушения мозгового
кровообращения(ОНМК).
Так или иначе, но псориатическое воспаление за счет системного действия
воспалительных агентов поражает не только кожные покровы и суставы, но и
эндотелий сосудов.
В течение последних лет при наблюдении за больными, страдающими
псориатическим повреждением кожи, появилось ряд предположений о том, что
псориаз имеет несколько более глубокий уровень изменений в организме, нежели
только
повреждение
кожных
покровов.
Ревматологам
хорошо
известны
заболевания сердечно-сосудистой системы, поскольку они часто встречаются у
пациентов, страдающих ревматоидным [103];[72] и псориатическим артритом
[117]. Исследования показали, что для больных псориазом характерен более
высокий риск развития острого инфаркта миокарда и более высокий уровень
кальцинации коронарных артерий.
Наблюдается повышение уровня ряда биомаркеров, свидетельствующих о
наличии системного воспаления у пациентов, страдающих псориазом. Среди них
С-реактивный белок [33], эндотелиальный фактор роста сосудов [37], P-селектин
[46; 90].
Отмечено, что больные псориазом обладают инсулин-резистентностью. В
связи с тем, что инсулин является вазоактивным гормоном, его присутствие в
18
кровотоке вызывает вазодилятацию, подобную
NO-зависимой дилятации
сосудов.
Инфаркт миокарда
Атеросклероз
Эндотелиальная
дисфункция
Инсулинорезистентность
Системное воспаление
Распространенный
псориаз
Путь к сердечно-сосудистым осложнениям при псориазе
Рисунок 2. Развитие сердечно-сосудистых осложнений при псориазе
Представленный
на
рисунке
2
путь
включает
в
себя
активацию
фосфоинозитид 3-киназы, что приводит к фосфорилированию эндотелиальной
NO-синтазы. Инсулин, в свою очередь, может активировать проатерогенный
каскад MAP-киназ в эндотелиальных клетках [73].
Эндотелиальная
дисфункция
приводит
к
дисбалансу
в
синтезе
сосудорасширяющих и сосудосуживающих факторов. Нарушение баланса
является предрасполагающим фактором для возникновения изменений в
эндотелии сосудов, предшествующих возникновению их атеросклеротического
повреждения.
Сюда
относятся:
повышение
уровня
лейкоцитов,
рост
гладкомышечных клеток, нарушение коагуляции, воспаление стенки сосуда,
развитие атеросклероза и тромбоз. В коронарных артериях, пораженных при
атеросклерозе, нарушена вазодилятация, а парадоксальная ваконстрикция может
привести к дисфункции эндотелиальных клеток. Связующим звеном между
инсулинорезистентностью и дисфункцией эндотелиальных клеток является
рецептор инсулина 1 (IRS-1). IRS-1 является одним из ключевых белков,
19
направляющих влияние инсулина на развитие метаболических эффектов,
например, захват глюкозы адипоцитами и продуцирование эндотелиальными
клетками оксида азота [130]. Низкий клеточный уровень IRS-1 обнаруживают у
пациентов с инсулинорезистентностью, что может явиться причиной раннего
развития атеросклероза. Более того, низкий уровень экспрессии IRS-1 может быть
маркером не только инсулинорезистентности, но и показателем повышенной
ригидности артерий. На основании этих данных сделан вывод о том, что такие
стрессовые факторы, как гипергликемия, приводящая к оксидативному стрессу и
снижению
IRS-1
в
жировых
и
эндотелиальных
клетках,
приводит
к
инсулинорезистентности и эндотелиальной дисфункции.
При
изучении
псориаза
различные
группы
ученых
при
помощи
ультразвуковых методов исследования обнаружили признаки эндотелиальной
дисфункции, такие, как нарушение поток-зависимой дилятации сосудов [50].
Инфильтрация,
сопровождающаяся
высвобождением
цитокинов
и
ферментов, таких как матриксные металлопротеиназы, приводит к разрушению
межклеточного матрикса. Этот шаг сопровождается формированием более
тяжелых повреждений фиброзной ткани и накоплением большого количества
богатого жирами некротичекого дебриса и гладкомышечных клеток. Бляшка,
скрытая
фиброзной
покрышкой,
может
стать
источником
дальнейших
повреждений. Под воздействием продолжающегося воспаления стабильная
атеросклеротическая бляшка превращается в нестабильную, которая может стать
причиной тромбоэмболических нарушений с последующим развитием инфаркта
миокарда и инсульта.
Псориатический артрит - воспалительное заболевание опорно-двигательного
аппарата,
осложняющее
течение
псориаза.
Для
пациентов,
страдающих
псориатическим артритом, характерен более высокий риск развития сердечнососудистых заболеваний и метаболического синдрома [123]. Причина этого –
наличие традиционных факторов риска, таких как возраст, пол, курение и диабет.
Однако, от 30 до 50% больных не имеют предрасполагающих факторов риска [52;
53].
20
В норме эндотелиальные клетки артериальной стенки препятствуют адгезии
и агрегации лейкоцитов, способствуют фибринолизу. В то же время под
воздействием
ожирения, инсулинорезистентности, гипертонии, воспаления,
эндотелиальные клетки экспрессируют на своей поверхности молекулы адгезии,
которые выборочно вылавливают из тока крови различные классы лейкоцитов.
Клетки воспаления, такие как моноциты, вступают в контакт с поверхностью
эндотелия путем связывания с молекулами адгезии лейкоцитов. Активированная
белая жировая ткань увеличивает синтез провоспалительных цитокинов, таких
как интерлейкины-1,6,17 (IL-1, IL-6, IL-17A) и фактор некроза опухолей альфа
(TNF-a) [112; 114]. IL-6 стимулирует продукцию печенью C-реактивного белка
(CRP), активирующего макрофаги и способствующего продукции этими клетками
тканевого
фактора,
атеросклеротических
провоспалительными
важного
бляшках.
прокоагулянта,
Следующим
цитокинами
который
шагом
адипоцитов,
является
которые
находят
в
стимуляция
синтезируют
нейропептиды, играющие ключевую роль в патогенезе псориаза [124]. Цитокины
имеют непосредственное отношение к таким состояниям как ожирение,
инсулинорезистентность, воспаление и повреждение коронарных артерий.
Индивидуальные
компоненты
метаболического
синдрома,
такие
как
ожирение, гипертония, инсулинорезистентность, дислипидемия описаны в ряде
исследований, у пациентов, страдающих псориатическим артритом. Основной
причиной смерти среди них (428 человек), являются сердечно-сосудистые
заболевания (36,2%). В другой группе пациентов (648 человек) намного чаще
наблюдалась стенокардия, инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь[51].
Еще
одно
исследование
выявило
у
3066
пациентов,
страдающих
псориатическим артритом, предрасположенность к развитию ишемической
болезни сердца, атеросклерозу, развитию диабета второго типа, гиперлипидемии,
гипертензии, по сравнению с контрольной группой (p< 0.05) [59]. При сравнении
результатов исследования 47 пациентов и контрольной группы (100 человек),
отмечено наличие таких проблем сердечно-сосудистой системы, как гипертония,
21
гиперлипидемия, высокая СОЭ, а также высокие уровни С-реактивного белка и
фибриногена [75].
На данный момент профилактика заболеваний сердечно-сосудистой системы
при псориатическом артрите включает в себя отказ от табакокурения, снижение
уровней артериального давления до значений не превышающих 140/90 мм.рт.ст.,
и уровня холестерина сыворотки крови до значений не выше 200 mg/dl (более
специфичным является значение ЛПНП до 100 mg/dl), снижение веса тела,
здоровая диета, не менее 30 минут физической активности в течение дня [74].
1.3. Матриксные металлопротеиназы
1.3.1 Характеристика матриксных металлопротеиназ
Матриксные металлопротеиназы (MMP) – группа цинк и кальций зависимых
протеолитических ферментов, которые разрушают различные компоненты
экстрацеллюлярного матрикса [152].
Матриксные металлопротеиназы представляют собой семейство, состоящее
из
25
протеолитических
млекопитающих.
MMP
ферментов,
участвуют
выявленных
в
преимущественно
ремоделировании
и
у
разрушении
внеклеточного матрикса и клеточных мембран при различных биологических
процессах
(формирование
скелета,
эмбриональное
развитие,
ангиогенез,
овуляция, клеточная миграция, развитие молочных желез, заживление ран и т.п.)
[44]. При воспалительных процессах металлопротеиназы проявляют аналогичные
свойства. Они играют важную роль в регуляции проницаемости сосудов,
разрушая межклеточные связи между эндотелиальными клетками и способствуя
миграции лейкоцитов в очаги воспаления. Металлопротеиназы регулируют
активность воспалительных медиаторов - цитокинов и хемокинов [93]. Недавние
исследования показали прямое и опосредованное влияние MMP на ионные
каналы эндотелия и гладкомышечных клеток сосудов, а также на другие
механизмы расширения и сужения сосудов.
Металлопротеиназы состоят из нескольких групп, при этом их молекулярная
структура, в целом, характеризуется 5-ю доменами: это домен, содержащий
22
сигнальный белок, необходимый для секреции, продомен, каталитический домен,
шарнирная область и гемопексино–подобный домен. MMP-2 и MMP-9
отличаются от остальных MMP наличием трех фибронектиноподобных модулей
(также известных как модули фибронектина II типа), вовлеченных в связывание
фибронектина с денатурированным коллагеном [115].
1.3.2 Члены семейства матриксных металлопротеиназ
На основании субстратоспецифичности, нуклеотидных последовательностей,
MMP разделяют на шесть групп: коллагеназы, желатиназы, стромелизины,
матрилизины, мембранно-связанные MMP и другие металлопротеиназы [81].
В таблице 1 представлена сводная информация по MMP.
Таблица 1. Типы матриксных металлопротеиназ
Название фермента
Аббревиату
Субстрат,
ра
на который воздействует фермент
Коллагеназы
Коллагеназа
внутренних органов
Коллагеназа
нейтрофилов
Коллагеназа 3
MMP – 1
MMP – 8
MMP – 13
Коллаген I, II, III, VII, X типов,
желатин, MMP - 2, - 9
Коллаген I, II, III, V, VII, X типов,
желатин
Коллаген I, II, III, IV типов, желатин,
фибронектин, ламинин
Желатиназы
Желатиназа А
MMP – 2
Желатиназа Б
MMP – 9
Желатин, коллаген I, IV, V, VII, X, XI
типа, фибронектин, ламинин, эластин
Желатин, коллаген III, IV, V, VII, X
типа, эластин, витронектин
Стромелизины
Стромелизин – 1
MMP – 3
Коллаген III, IV, V, IX, X типа,
23
желатин, фибронетин, ламинин,
теназин, MMP-1, -7, -8, -9, -13
Коллаген III, IV, V, IX типа, желатин,
Стромелизин – 2
MMP – 10
фибронетин, ламинин, казеин, MMP1, -8
Коллаген IV, желатин, фибронектин,
Стромелизин – 3
MMP – 11
ламинин, α1-антипротеазу и
инсулиноподобный ростовой
факторосвязующий протеин-1
Мембрано-связанные металлопротеиназы (MT-MMPs)
Коллаген I, II, III типа, желатин,
MT – 1
MMP – 14
фибронектин, ламинин, витронектин,
протеогликаны, активирует проMMP-2 и про-MMP-13
MT – 2
MMP – 15
Активирует про-MMP-2
MT – 3
MMP – 16
Активирует про-MMP-2
MT – 4
MMP – 17
Активирует про-MMP-2
MT – 5
MMP – 24
Активирует про-MMP-2
MT – 6
MMP – 35
Желатинолитическая активность
Не относятся ни к одной из групп
MMP – 12
Аггрекан, фибропектин, ламинин и
коллагеназа IV типа
Желатин, тенаскин, ламинин,
MMP – 19
аггрекан, коллагеназа IV типа,
нидоген
Энамилизин
MMP – 20
Амелогенин
24
MMP – 21
Неизвестен
MMP – 22
Неизвестен
MMP – 23A
Неизвестен
MMP – 23B
Неизвестен
MMP – 27
Неизвестен
MMP – 28
Неизвестен
Секреция и активность MMP в нормальной ткани - очень низкая [104].
Основная
регуляция
происходит
на
Экспрессию генов металлопротеиназ
уровне
транскрипции
мРНК
[145].
регулируют различные факторы роста
(epidermal GF, basic fibroblast GF, plateled-derived GF), цитокины (TNF-α, IL-1), а
также химические агенты и физический стресс. Внеклеточные стимулы через
пути передачи сигнала приводят к активации транскрипционного фактора AP-1,
сайты связывания с которым есть только у MMP-1,3,7,8,9,10,11,12 и MMP-13.
Экспрессия AP-1 индуцируется MAP киназами, через внеклеточные сигналрегулируемые киназы (ERK 1, 2), активируемые стрессом протеин киназы (SAPK)
и p38 [26; 147].
После синтеза MMP находятся в форме профермента в межклеточном
пространстве. В тот момент, когда возникает дополнительный сигнал к активации
через
активные
формы
кислорода,
триггеры
ишемии
(тромбин
или
химотрипсиноподобная протеаза) или ангеотензин-превращающий фермент из
тучных клеток, открывается активный участок фермента [138].
25
1.3.3 Патофизиология металлопротеиназ и их роль в патогенезе псориаза
и атеросклероза
Участие MMP в широком спектре биологических процессов, связанных в
основном, с деградацией компонентов внеклеточного матрикса, предполагает
существование баланса между MMP и их естественными ингибиторами (TIMP).
Нарушение баланса между ними приводит к возникновению патологий, в
частности, к развитию различных сосудистых заболеваний, таких как аневризма
аорты, варикозное расширение вен, атеросклероз и гипертония [121]. Например,
при атеросклерозе показано, что MMP активно участвуют на различных стадиях
его
развития.
Активация
MMP
приводит
к
изменению
структуры
атеросклеротической бляшки и может привести к ее разрыву. Разрушение
атеросклеротической бляшки происходит при воздействии протеиназ на ее
фиброзную покрышку, обращенную в просвет сосуда, что может привести к
развитию острого инфаркта миокарда и внезапной сердечной смерти [140].
Экстрацеллюлярный матрикс, продуцирующийся в основном гладкомышечными
клетками синтетического типа, расположенными в интиме артерий, включает в
себя коллаген I, III, IV, V, VIII типов и ламинин. Коллаген I и III типов
синтезируется и локализуется в интиме и фиброзных бляшках, в то время как
краевые участки бляшки содержат большое количество проколлаген-коллаген
синтезирующх клеток I типа [11; 94; 163].
Металлопротеиназы принимают участие в ремоделировании миокарда при
инфаркте, что может привести к дилатационной кардиомиопатии. Процесс
ремоделирования
желудочка
после
инфаркта
миокарда
или
вирусного
повреждения также происходит под воздействием MMP, которые разрушают
каркас из коллагена и эластина, приводя к гипертрофии и дилатации желудочка.
По мере того как тяжесть и спектр сердечно-сосудистых заболеваний меняется от
острых состояний, таких как инфаркт миокарда, внезапная сердечная смерть, к
хроническим заболеваниям (атеросклероз сосудов), ремоделирование миокарда и
воспаление выходят на первое место. Ремоделирование ткани – двустадийный
процесс: клеточный компонент изменения структуры и изменение в структуре
26
матрикса. Внеклеточный матрикс в настоящее время рассматривается как
непосредственный участник функции органа и изменения его структуры, а
матриксные металлопротеиназы – как медиаторы его ремоделирования.
Последние исследования указывают на роль MMP в этом процессе и на
потенциальные
возможности
терапевтических целях.
их
использования
в
диагностических
и
В настоящее время матриксные металлопротеиназы
рассматриваются как потенциальные биомаркеры развития кардиологических
осложнений при разрушении атеросклеротических бляшек. Металлопротеиназы
рассматривают
как
точку
воздействия
для
коррекции
изменений
при
атеросклеротическом поражении коронарных сосудов. Так, при увеличении
экспрессии MMP-12
происходит
моноцитарная инфильтрация сосудистой
стенки, приводящая к разрыву внутренней стенки эластического слоя и
ускорению атеросклеротического процесса [84; 102].
В свою очередь, структурная целостность бляшек также зависит от баланса
между процессами синтеза и разрушения внеклеточного матрикса, который, в
основном, регулируется через взаимодействие MMP и с их ингибиторами (TIMP).
Так, было показано, что в бляшках, целостность которых была нарушена
комплексе
в
MMP-9/TIMP- 1, нарушался баланс уровня экспрессии в сторону
увеличения экспрессии MMP-9, по сравнению с бляшками, которые не
подверглись разрушению. При этом наблюдалось снижение уровня TFPI-2 (Tissue
factor pathway ingibitor) [63]. Таким образом, чрезвычайно высокая экспрессия
MMP приводит к разрушению артериального внеклеточного матрикса, что
является причиной отрыва бляшки, приводящей в большинстве случаев к
инфаркту миокарда [78].
Уровень экспрессии мРНК MMP-1,3,9 и TIMP-1 значительно апрегулирован
в материале бляшек сонной артерии, тогда как уровень экспрессии TFPI-2 был
уменьшен. Частичное апрегулирование MMP-9 и разбалансировка экспрессии
MMP9/TIMP-1 могут играть кардинальную роль в разрушении бляшки.
В процессе развития многих заболеваний был выявлен повышенный уровень
экспрессии некоторых MMP. Наиболее исследованными в этом отношении
27
оказались онкологические заболевания, сосудистые заболевания и артриты. При
различных видах онкологических заболеваний были оверэкспрессированы MMP1, 2, 3, 7, 9, 10, 11, 13 и 14 [71]. MMP могут способствовать росту опухоли не
только путем деградации внеклеточного матрикса, но и благодаря выходу
изолированных ростовых факторов [108]. Так, MMP-9 мобилизует VEGF из
внеклеточного матрикса и расщепляет коллаген IV типа, образуя ангиогенный
ингибитор - тамстатин [63].
В биологии кожи MMP вовлечены в ремоделирование воспаленного
матрикса, образование новых сосудов, заживление ран и злокачественное
перерождение
Псориаз
[139].
гистологически
характеризуется
гиперпролиферацией кератиноцитов, инфильтрацией воспалительными клетками,
неоангиогенезом, дилятацией сосудов кожи и продукцией цитокинов, таких как
TNF-a, IL-1b, TGF-a и INF-g так же регуляцией транскрипции MMP. Многие из
этих факторов так же принимают участие в заживлении ран кожи путем четкой
регуляции деятельности MMP [22; 36]. Многие цитокины или факторы роста,
гиперпродукция которых отмечается при псориазе (TNF-a, IL-1, INF-g, IL-6, IL-8,
VEGF, TGF-a) также могут регулировать продукцию MMP.
Стромелизин-1
(MMP-3)
и
2
(MMP-10),
матрилизин
(MMP-7)
и
металлоэластаза (MMP-12) часто объединяют в подгруппу стромелизина по их
структуре и субстратспецифичности. MMP-3 и MMP-10 могут экспрессироваться
эпителиальными клетками. MMP-3 разрушает фибронектин и тенасцин, уровень
которых значительно повышен в коже больных псориазом [23].
Элемент подгруппы стромелизинов – MMP-12, наиболее активная MMP
против эластина [131; 162]. Она также может нарушать структуру фибронектина,
коллагена 4 типа, ламинина-1, а так же активировать TNF-a [27; 56]. Предыдущие
исследования показали, что макрофаги – основной источник MMP-12.
Нейтрофилы и макрофаги являются одними из важнейших клеток,
принимающих
Активированные
участие
в
нейтрофилы
образовании
способны
псориатического
влиять
не
только
дифференцировку кератиноцитов, но и активировать T-клетки [144].
инфильтрата.
на
рост
и
28
Экспрессия матриксных металлопротеиназ в основном регулируется на
уровне транскрипции, поэтому уровни MMP хорошо коррелируют с уровнем
матриксной РНК [101; 143]. Согласно одному из исследований mRNAMMP-3
была однаружена в 19% образцов кожи с проявлениями атеросклероза [139],
аmRNAMMP-12 - в 77% случаев. Достоверное увеличение уровня экспрессии
данной металлопротииназы отмечено во всех сайтах воспаления. В данном
исследовании показано, что MMP-12 позитивными клетками в данном случае
являются макрофаги. Отмечалось, что MMP-3 и MMP-12 не экспрессируются в
здоровой коже [29; 66].
Экспрессия
TIMP-1
отмечена
в
воспалительных
инфильтратах
и
эндотелиальных клетках в 75% случаев. Наиболее четкие данные получены у
пациентов, которые местно принимают кортикостероиды. Изменение уровня
экспрессии TIMP-3 отмечено в 50% образцов, при этом также наблюдалось
изменение уровня экспрессии в образцах здоровой кожи, периваскулярной строме
сосудов и волосяных фолликулах [13]. TIMP-1 экспрессируется в здоровой коже
отдельными фибробластами [45].
Показано, что MMP-12 и MMP-9 наиболее интенсивно экспрессируются в
очагах псориатического повреждения кожи. MMP-1,7,10,13 менее ассоциированы
с данным заболеванием[139].
Благодаря своей способности к деградации эластических волокон MMP-12
способствует миграции макрофагов в другие ткани. Активированные макрофаги
являются первыми клетками, которые попадают в эпидермис при появлении
псориатических бляшек [45]. При исследовании клеточных культур контакт Tклеток с макрофагами увеличивает экспрессию MMP-12. Отмечается повышенная
экспрессия IL-1b, VEGF гранулоцит/макрофаг колониестимулирующий фактор
(GM-CSF) при псориазе, что увеличивает экспрессию MMP-12 макрофагами [30;
45; 113].
Для активации MMP-12 необходим активатор плазминогена урокиназного
типа [25], а его уровень повышен при псориазе. В дополнение к этому MMP-12
может увеличивать воспалительный ответ путем стимулирования выработки TNF-
29
aльфа из проTNF-a[27]. Отмечено, что для увеличения экспрессии MMP-12
недостаточно только лишь гиперпролиферации керотиноцитов.
При
гиперпролиферации
кератиноцитов
отмечено
снижение
уровня
экспрессии MMP-9 по сравнению с нормальными кератиноцитами.
MMP-12 обладает антиангиогенным эффектом благодаря расщеплению
плазминогена до ангиостатина [34]. Увеличение экспрессии TIMP-1 и MMP-12
может не являться специфичным.
1.4. Интерлейкины в патогенезе псориаза и атеросклероза
Недавно выявлено наличие отдельной сигнальной системы лиганд-рецептор
для нового семейства цитокинов - интерлейкина-17[15].
Представлены убедительные данные о его важности в регуляции иммунного
ответа. Первым из этого семейства был охарактеризован IL-17A, а затем
выявлены еще пять белков семейства IL-17 (всего шесть, IL-17A-F). IL-17A
представляет собой гомодимер, цитокин с м.м. около 32 kDa. Он продуцируется
активированными T-клетками памяти, стимулирует врожденный иммунитет и
иммунную защиту организма. IL-17A и IL-17F, оба цитокина мобилизуют
нейтрофилы, частично через гранулопоэз и CXC индукцию, а также повышение
локального выживания клеток. Продукция IL-17A и IL-17F Т-лимфоцитами
регулируется
IL-23-независимой
активацией
T-клеточного
рецептора.
Классификация клеток T-хелперов 1 и 2 типов (Th1 и Th2) до последнего времени
являлась основой для понимания биологии CD4(+) T-клеток и взаимодействия
врожденного и приобретенного иммунитета. Недавние исследования выявили
ранее неизвестный тип эффекторного ответа CD4(+) T-клеток, линию Th17. Эта
группа
Т-клеток
продуцирует
интерлейкин-17,
обладающий
сильными
провоспалительными свойствами и индуцирующий тяжелые аутоиммунные
патологии.
Тогда
как
IL-23
служит
для
распространения
ранее
дифференцированных T(H)-17 клеток, IL-6 и трансформирующий фактор роста
бета (TGF-β) индуцируют дифференцировку T(H)-17 клеток из наивных
предшественников [118].
30
Все больше данных подтверждают активную роль семейства IL-17 в
развитии
воспалительных
заболеваний,
аутоиммунных
патологий
и
злокачественных опухолей. Сигнальный путь IL-17 функционирует в различных
тканях таких, как суставной хрящ, кость, мениск, мозг, кроветворная ткань, почка,
легкие, кожа и кишечник. Таким образом, участие лигандов и рецепторов
семейства IL-17 может играть важную роль в гомеостазе тканей в норме и при
патологических процессах, и вне иммунной системы. Повышенные уровни IL-17
ассоциированы с различными состояниями, включая воспаление дыхательных
путей, ревматоидный артрит, внутрибрюшинный абсцесс, воспалительные
заболевания
кишечника,
отторжение
аллотрансплантата,
псориаз,
рак
и
рассеянный склероз[91].
IL-17 относится к провоспалительным цитокинам из-за его способности
увеличивать экспрессию многих медиаторов воспаления (IL-1β, IL-6, IL-12, IL-10,
TNF- α), в особенности тех из них, которые вовлечены в пролиферацию,
созревание и хемотаксис нейтрофилов[158]. Многие исследователи ассоциируют
повышенный уровень IL-17A с некоторыми хроническими воспалительными
заболеваниями, в том числе - с псориазом [151]
T-хелперы 17 типа являются провоспалительными CD4+ клетками, которые
могут продуцировать IL-17A[100]. Эти клетки и цитокины, которые они
производят, обнаружены в высоких концентрациях в областях поврежденных
кожных покровов при псориазе[89]; [60]. Th22 в настоящее время описывают как
воспалительные CD4+ клетки, но не экспрессирующие IL-17A или IFN-g[86];
[110]; [146]. Численность Th22 также увеличена в очагах псориаза. [110]. До
открытия Th17 и Th22 изучение воспалительных CD4+ Т клеток при псориазе
основывалось на Th1, которые производят IFN-g. В работах за многие годы
представлена информация о большом количестве Th1 и цитокинов в области
псориатического поражения[19].
Открытие новых типов Т-клеток и новых цитокинов повлекло за собой
необходимость изучения распространения провоспалительных цитокинов в
организме [14]; [40]; [146]. Отмечено увеличение циркулирующих Th17 клеток у
31
пациентов, страдающих болезнью Крона [77], анкилозирующим спондилитом
[132], ревматоидным артритом [132], псориазом [69].
Количество Th-17 увеличено при псориазе, но не коррелирует с тяжестью
поражения кожи. NF-kB и STAT3 вовлечены в регуляцию экспрессии IL-17ATh17 [31]. Ингибирование NF-kB и STAT3 блокирует продукцию цитокинов
циркулирующими Th-17 и Th-1.
Доказано, что инфликсимаб, применяемый для лечения больных псориазом,
снижает уровень TNF-a, Th-17 и Th-1.
Отмечено, что IL-17A может способствовать развитию атеросклероза.
Блокирование IL-17A, продуцируемого преимущественно CD4+ клетками, Th-17
антителами, приводит к уменьшению ранних атеросклеротических повреждений
[92]. IL-17A индуцирует экспрессию MMP-1 и MMP-9, чем, в свою очередь,
увеличивает
вероятность
образования
нестабильной
атеросклеротической
бляшки. Ингибирование IL-17A уменьшает интенсивность воспалительной
инфильтрации (например, Т-клетками или макрофагами).
IL-17A оказывает содействие хемоаттрактантам в захвате и адгезии
лейкоцитов (моноцитов и Т-клеток) путем влияния на CCL5 [43], что может
являться одним из основных механизмов участия IL-17A в атерогенезе. Также
обнаружено, что интерлейкин-17А вносит коррективы в липидный обмен и
образование окисленных ЛПНП.
IL-17A может приводить к изменению системного и сосудистого воспаления
путем стимулирования продукции INF-g, увеличения количества активных форм
кислорода (АФК). Увеличение АФК происходит по тому же принципу, что и при
ангиотензин II индуцированной гипертонической болезни или при приеме пищи с
высоким содержание жиров. Механизм, по которому это происходит, в настоящее
время до конца не изучен.
1.5. Статины в терапии атеросклероза и псориаза
Отмечено, что пациенты, в лечении которых применяли метотрексат,
обладают более низким риском развития ССЗ [120]. Некоторые ученые вполне
32
официально заявляют о том, что псориаз является фактором риска для развития
острого инфаркта миокарда [48].
Согласно рекомендациям американского журнала кардиологии, больные
псориазом должны подвергаться обследованию на предмет наличия у них
гиперлипидемии [48]. Выявление дисбаланса липидов крови требует применения
терапии
по
протоколам,
разработанным
для
пациентов,
страдающих
дислипидемией (ThirdReportoftheNationalCholesterolEducationProgram) [10].
Проведено 5 различных исследований, результаты которых свидетельствуют
о снижении уровня общей смертности, количества инфарктов миокарда,
инсультов, заболеваний периферических сосудов среди пациентов, страдающих
нарушением липидного обмена, лечение которых проводилось с применением
статинов [39],[133], [128], [80]. В данных исследованиях приняло участие более
30000 человек. При этом выявлено, что статины достоверно снижают число
осложнений, вызванных атеросклерозом.
Статины относительно безопасны, однако все же обладают рядом возможных
побочных эффектов. Менее чем в одном проценте случаев встречается
гепатотоксичность, сопровождаемая бессимптомным повышением АСТ и/или
АЛТ более, чем в 3 раза [97]. В связи с этим терапия статинами не рекомендована
пациентам, страдающим хронической печеночной недостаточностью. Особое
внимание следует обратить на пациентов, страдающих псориазом и ранее
принимавших метотрексат [48].
Наиболее распространенным побочным эффектом терапии статинами
является токсичность по отношению к мышечной ткани. Миалгия возникает в 1,53,0% случаев, миозит в 0,3-2,2% случаев, а рабдомиолиз в 0,3 – 13,5 % на миллион
пациентов [97]. Рабдомиолиз – угрожающее жизни состояние, поэтому при
возникновении у пациента мышечной боли на фоне приема статинов,
рекомендовано измерение сывороточной креатинкиназы, для контроля данного
состояния. Только в одной работе описано у пациента, страдающего псориазом,
ухудшение состояния кожных покровов на фоне приема статинов [67].
33
Механизмы, благодаря которым статины снижают уровень липопротеинов
низкой плотности и замедляют прогрессирование псориаза, относительно хорошо
изучены. Статины снижают синтез холестерина в печени путем ингибирования 3гидрокси-3-3 метилглутарил коэнзима А, количество которого влияет на
интенсивность синтеза холестерина [55]. Далее сниженный уровень холестерина в
клетках печени приводит к увеличению экспрессии гена рецептора липопротеина
низкой плотности, а увеличение числа рецепторов ЛПНП на поверхности
гепатоцитов снижает уровень циркулирующих ЛПНП.
Кардиопротективные эффекты статинов не ограничиваются только лишь
снижением уровня липидов, они также обладают противовоспалительным
эффектом, что важно, учитывая воспалительную природу атеросклероза {{Ye,
2013 #632;, 2012 #635;Tu, 2012 #637}. Статины уменьшают количество молекул
адгезии,
таких
как
LFA-1
и
I-CAM-1
на
поверхности
лейкоцитов
и
эндотелиальных клеток, играющих важную роль в активации лейкоцитов, их
миграцию в сайты воспаления и иммунотоксичность. Статины ингибируют
экспрессию MHCII, снижая активацию лейкоцитов, ингибируют экспрессию
хемокиновых рецепторов на поверхности Th-1, что напрямую влияет на их
способность мигрировать в сайты воспаления (рисунок 3).
В дополнение, статины блокируют продукцию макрофагами NO – синтазы, а
также продукцию ряда воспалительных цитокинов, таких как TNF-a и INF-g [107].
Основываясь на патогенезе псориаза, можно сделать вывод о том, что
статины могут обладать лечебным эффектом в лечении псориаза благодаря своим
противовоспалительным
и
иммуномодулирующим
эффектам.
Например,
отмечено, что статины снижают адгезию таких молекул как LFA-1, которые
являются целью для препарата эфализумаб (иммунодепрессант селективного
действия).
Экспрессия лейкоцитами и эндотелиальными клетками молекул клеточной
адгезии уменьшается под воздействием статинов, что выражается в уменьшении
клеточной адгезии и миграции клеток через стенку сосуда. В дополнение к этому
статины уменьшают секрецию хемокинов и MMP, что в дальнейшем сказывается
34
на миграции лейкоцитов. Сигналы молекул адгезии в эндотелии, необходимые
для миграции лейкоцитов, блокируются изменением RAS гомолога (RHO) и
других ГТФаз, что приводит к стабилизации межклеточных контактов эндотелия.
Влияние статинов на цитоскелет уменьшает подвижность лейкоцитов и
направленную миграцию в ответ на вещества увеличивающие хемотаксис.
Рисунок 3. Влияние статинов на лейкоцитарную адгезию, миграцию и
иммунологическую функцию эндотелия (CCL, CC-хемокин лиганд; CCR, CCхемокин рецептор; CXCL, CXC-хемокин лиганд; CXCR, CXC-хемокин рецептор;
eNOS, NO-синтаза эндотелиальных клеток; ICAM1, внутриклеточная молекула
адгезии 1; INFg, интерферон-g; LFA1, ассоциированный с лимфоцитарной
функцией антиген 1; MAC1, рецептор макрофагов 1; MMP, матриксные
металлпротеиназы; NF-kB, ядерный фактор-kB; NO, оксид азота; PI3K,
фосфатидилинозитол киназа; PPARg, рецептор активируемый пролифератором
пероксисом гамма; P-селектин, тромбоцитарный селектин; RHOA, член A
генетического семейства RHO; ROCK, RHO – киназа ассоциированная с
двуспиральными белками; VCAM1, сосудистая молекула клеточной адгезии 1;
VLA4, очень поздний антиген 4.)[122]
35
Статины ингибируют продукцию воспалительных цитокинов, таких как TNFa, являющийся биологической целью для инфликсимаба, этанерцепта и
адалимумаба, а также продукцию IL-17, являющегося целевым для новых
противопсориатических препаратов, находящихся в данное время на 2 стадии
клинических исследований (рисунок 4). Статины ингибуруют активацию и
миграцию Th-1, играющих важную роль в патогенезе псориаза.
Рисунок
4.
Влияние
статинов
на
функцию
Т-клеток
и
антигенпрезентирующих клеток АПК (CCR7, CC-хемокиновый рецептор 7;
CD40L, CD40 лиганд; CIITA, трансактиватор II класса; IFNg, интерферон гамма;
NF-kB, ядерный фактор – kB; TCR, рецептор Т-клеток) [122]
Статины
ингибируют
цитокин-индуцированную
экспрессию
молекул
главного комплекса гистосовместимости II класса (MHC) и ко-стимуляторных
молекул,
осуществляемую
антиген-презентирующими
клетками
(АПК),
предотвращают представление антигенов Т-клеткам CD4+. Пролиферация Тклеток блокируется за счет изменения ГТФ-связанной (GTP) регуляции
клеточного цикла. Статины влияют на организацию цитоскелета и образование
36
иммунологических синапсов, изменяют профиль Т-клеток за счет ингибирования
секреции цитокинов путем ингибирования сигнала трансдуктора и активатора
транскрипции 4 (STAT4) и транскрипционного фактора Т-bet, отвечающего за
дифференцировку Th1. В тоже время, статины могут вызвать увеличение
секреции противовоспалительных цитокинов Th2 через активацию STAT6 и
GATA – связывающего белка 3 (GATA3), которые вовлечены в дифференцировку
Th2.
Обнаружено
только
одно
сообщение
об
использовании
статинов
(аторвастатин) для лечения псориаза [134]. Средний возраст пациентов,
принимающих участие в данном исследовании составил 18 лет. Псориатическое
поражение кожных покровов занимало 10% поверхности, а тяжесть состояния
оценивалась около 12%. Семь пациентов получали аторвастатин в дозировке 40
mg в течение 8 недель. Контрольные осмотры производились на 4й и 8й неделях.
После 8ми недель терапии наблюдалось улучшение состояния пациентов.
Несмотря на небольшую выборку и отсутствие данных о липидном профиле
пациентов данное исследование позволяет сделать предположение о том, что
теория о возможности клинического использования статинов для лечения
псориаза имеет право на существование [122].
37
ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ
И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Общая характеристика обследованных пациентов
Исходя из цели и задач исследования, обследовано 125 пациентов,
страдающих
псориатическим
поражением
кожных
покровов
и/или
атеросклеротическим поражением стенок сосудов. Из них в исследование
включено 64 мужчины и 61 женщина в возрасте от 56 до 65 лет.
Согласно целям и задачам исследования было сформировано 4 группы
пациентов.
В первую группу включено 31, а во вторую 32 пациента, страдающих
псориатическим поражением кожных покровов. Всем пациентам производилось
дуплексное сканирование артерий (сонных, плечевых, почечных, артерий нижних
конечностей) для исключения серьезного атеросклеротического поражения.
Группу III составили 32 человека, у которых по данным инструментального
обследования были выявлены атеросклеротические поражения сосудов. Пациенты
подверглись
хирургическому
лечению
по
поводу
возникшего
на
фоне
атеросклероза стеноза артерий и прошли контрольное дерматологическое
обследование. Видимых проявлений псориаза или другой патологии кожи
выявлено не было.
Контрольная группа сформирована из доноров (30 человек) без серьезной
сопутствующей патологии (группа IV).
Общая характеристика сформированных групп пациентов представлена в
таблице 2.
В группу I включены 16 мужчин (51,6 %) и 15 женщин (48,4%). Средний
возраст пациентов составил 59,2±1,4 года. Группу II составили 17 мужчин (53,1%)
и 15 женщин (46,9%), средний возраст которых составил 60,0± 2,5 года. В группу16 мужчин (50%) и 16 женщин (50%). Средний возраст пациентов в данной
38
группе составил 60,9 ± 3,9 лет. В IV группу включено 15 мужчин (50%) и 15
женщин (50%). Средний возраст пациентов в группе составил 58,2± 2,4 года.
Таблица 2. Характеристика основных групп пациентов, включенных в
исследование
Группа III
Группа I
Больные
псориазом,
(комплексная
терапия)
Группа II
Больные
псориазом
(комплексная
терапия +
аторвастатин)
Пациенты с
Группа IV
тяжелым
Контрольная
атеросклеротиче
группа
ским
пациентов
поражением
(условно
периферических
здоровые
артерий
доноры)
(аторвастатин)
Количество
31
пациентов
32
32
30
М
Ж
М
Ж
М
Ж
М
Ж
16
15
17
15
16
16
15
15
Пол
Средний
59,2± 1,4
возраст, лет
60,9 ± 3,9
60,0± 2,5
58,2± 2,4
* – различия между группами достоверны с р < 0.05
Обзор набранных групп пациентов дает информацию об их сопоставимости по
основным демографическим показателям на момент включения в исследование и
позволяет проводить дальнейшее сравнение полученных результатов.
Исследования проводились на базе 1 кардиологического отделения ФГУ
«Медицинский учебно-научный клинический центр имени П.В. Мандрыка» МО
РФ,
отделения
сосудистой
хирургии
КБ
№
83
ФМБА
России
и
дерматологического отделения ГКБ №14 им В.Г. Короленко г. Москвы.
Сопутствующие заболевания, диагностированные у данных пациентов,
находились в стадии ремиссии, поэтому
влияния на результаты исследования.
не могли оказывать значительного
39
На первом этапе исследований пациенты прошли комплексное обследование,
включающее сбор жалоб, анамнеза, оценку биохимических показателей крови
пациентов, определение уровня цитокинов в сыворотке периферической крови,
определение индекса PASI. В начале исследования у больных, составляющих
первую, вторую и третью группы проводили взятие биопсийного материала.
Клиническая характеристика пациентов, страдающих псориатическим
поражением кожи. Оценку течения псориаза осуществляли при помощи индекса
PASI (индекса распространенности и тяжести псориаза – Psoriasis Area and
Severity Index). Для частей головы, рук, туловища и ног (доля которых составляет
0,1; 0,2; 0,3 и 0,4, соответственно, от общей поверхности кожных покровов) по
схеме, приведенной в таблице 3, определяли параметр «Охват» и заносили его в
таблицу 4.
Таблица 3. Определение параметра «Охват»
Поражение
%
Охват
Нет <10%
0
1
10-
30-
50-
70-
29%
49%
69%
89%
2
3
4
5
≥90%
6
Для исследуемых частей тела по 4-х балльной системе, путем кодирования (0
= нет, 1 = слабо, 2 = умеренно, 3 = тяжело, 4 = максимум), определяли параметры
- "Зуд", "Краснота", "Шелушение" и "Утолщение" и заполняли таблицу 4.
Таблица 4. Таблица, для расчета индекса PASI
Локализация Доля Охват Зуд Краснота Шелушение Утолщение PASI
Голова
Руки
Туловище
Ноги
Итого:
40
В завершение для каждой части тела вычисляли локальный PASI = Доля х
Охват х (Зуд + Краснота + Шелушение +Толщина). Данные приведены в правом
столбце таблицы.
Пациенты, страдающие псориатическим поражением кожных покровов
(группы I и II), получали базовую терапию согласно Московским городским
стандартам оказания медицинской помощи населению, включающую применение
дезинтаксикационных средств, витаминотерапию (парэнтеральное введение
витаминов B1, B6, B12), местную терапию с использованием топических
глюкокортикостероидов, кератолитических и смягчающих средств.
Пациенты из группы II и группы III в качестве терапевтического лечения
получали ингибитор ГМК-КоА-редуктазы (статин) - аторвастатин. В рамках
нашего исследования пациенты принимали данный препарат в дозировке от 5 мг
до 20 мг 1 раз сутки в зависимости от индивидуальной восприимчивости к
терапии под контролем биохимического анализа крови, проводимого 1 раз в 2
недели. Проверяли влияние препарата на уровень общего холестерина крови,
ЛПНП, побочные явления (токсическое влияние на клетки печени и мышечную
ткань) определяли по уровню
АСТ, АЛТ и КФК, соответственно. Согласно
аннотации к препарату изменение активности ферментов печени обычно
наблюдается в течение первых 3 месяцев после начала терапии аторвастатином,
поэтому контроль уровня печеночных ферментов проводился в те же сроки, что и
оценка показателей липидного обмена.
Контрольное
дерматологическое
обследование
всех групп
пациентов
выполнялось через 3 месяца после начала терапии.
В связи с тем, что мы предполагали наличие возможной связи между
псориазом и атеросклерозом на генетическом уровне, было принято решение о
взятии биопсийного материала из очага поражения и визуально непораженного
участка
кожных
покровов
для
количественного
определения
изменения
экспрессии РНК до начала фармакологического воздействия.
Методика
получения
биопсийного
материала
кожи
пациентов,
страдающих псориазом, и его хранение. Взятие пораженного и непораженного
41
участков кожи больных псориазом бляшечного типа (Psoriasis vulgaris) выполняли
под местной анестезией при помощи пробойника площадью 4 мм2. Пациентам не
проводили PUVA/UV или системной терапии на протяжении месяца до получения
материала. Для сравнения участок визуально непораженной псориатическим
процессом кожи получали на расстоянии 3-4 см от бляшки. Материал сразу же
помещали в жидкий азот. Полученные ткани гомогенизировали и взвешивали в
замороженном
состоянии.
Проведение
данных
манипуляций
согласовано
Локальным комитетом по этике при Институте общей генетики РАН и не
противоречат
принципам,
опубликованным
в
декларации
Хельсинкского
соглашения.
Клиническая характеристика пациентов, страдающих ИБС и тяжелым
атеросклеротическим поражением периферических артерий. Пациенты, с
тяжелым атеросклеротическим поражением артерий составили группу III. Данные
пациенты длительное время не получали никакой фармакологической терапии,
которая могла бы повлиять на результаты проводимых нами исследований. В ходе
проведенной доплерографии выявлено значительное сужение артерий за счет
сформировавшихся атеросклеротических бляшек. По результатам комплексного
обследования
пациентам
помимо
фармакологической
терапии
было
рекомендовано проведение хирургического вмешательства, направленного на
удаление стенозированного участка и его протезирование. Пациентам проводили
подбор препаратов и доз для фармакологического воздействия.
Для количественного определения изменения экспрессии РНК использовали
биопсийный материал, полученный от 32 пациентов. Средний возраст пациентов
составил 60,9 ± 3,9 лет.
Методика получения биопсийного материала у больных атеросклерозом
и его хранение. В исследовании использовали материал, полученный при
хирургическом
лечении
пациентов,
страдающих
атеросклеротическим
повреждением бедренных артерий. В ходе открытой операций иссекали участок
поверхностной бедренной артерии, окклюзированный атеросклеротической
бляшкой, после чего производили имплантацию протеза бедренной артерии в
42
образовавшийся дефект. В качестве контрольного образца, для исследования
(участок, не подверженный атеросклеротическому процессу) производилось
взятие участка ветви общей бедренной артерии.
После вскрытия сосуда проводили его надрез длиной, необходимой для
выделения определенной площади интимы, глубиной 1,0 мм.
При помощи пинцета у края надреза захватывали поверхностный слой –
интиму; движением, перпендикулярным направлению надреза, вдоль поверхности
сосуда, отделяли интиму от подлежащего слоя.
Выделенный фрагмент промывали в 0,9% растворе натрия хлорида для
отделения его от тканей другого типа. Раствор использовали однократно.
Полученные участки пораженного сосуда быстро замораживали в жидком азоте и
хранили до момента определения биохимических параметров. Время от начала
процедуры получения биоптатов до замораживания не превышало 5 минут.
2.2. Препарат, применяемый для лечения
В качестве объекта для исследования в настоящей работе был выбран
препарат группы статины – аторвастатин.
Аторвастатин (Atorvastatin) является: [R(R*R*)] – 2 - (4 -Фторфенил) - бета,
дельта – дигидрокси - (1-метилэтил) – 3 – фенил – 4 - [(фениламино) карбонил] –
пиррол – 1 - гептановая кислота (и в виде кальциевой соли).Его брутто-формула:
C33H35FN2O5. Химическая формула препарата представлена на рисунке 5.
Рисунок 5. Химическая формула препарата аторвастатин
43
Препарат оказывает гиполипидемическое действие, конкурентно селективно
ингибирует
ГМГ-КоА-редуктазу,
превращающую
3
–
гидрокси
–
3
-
метилглутарил-КоА в мевалоновую кислоту (предшественник стеролов, включая
холестерин).
Аторвастатин снижает уровни холестерина и липопротеинов в плазме крови,
ингибируя ГМГ-КоА-редуктазу, а также тормозит синтез холестерина в печени,
увеличивая число ЛПНП-рецепторов на поверхности клеток, способствует
усилению захвата и катаболизма ЛПНП. Подавляет образование ЛПНП и число
частиц ЛПНП. Уменьшает уровень холестерина-ЛПНП у больных гомозиготной
семейной
гиперхолестеринемией,
которая
обычно
устойчива
к
терапии
гиполипидемическими средствами.
У большинства пациентов действие проявляется через 2 недели после начала
терапии, максимальный эффект развивается к 4-й неделе и сохраняется в течение
всего периода лечения. Аторвастатин быстро всасывается после приема внутрь,
степень абсорбции увеличивается пропорционально повышению дозы, C max
достигается в течение 1–2 ч.
Абсолютная биодоступность - примерно 14%,
системная доступность в отношении ингибирования ГМГ-КоА-редуктазы —
примерно 30%. Низкая системная доступность обусловлена пресистемным
метаболизмом в слизистой оболочке ЖКТ и/или при «первом прохождении» через
печень. Средний объем распределения аторвастатина — примерно 381 л.
Связывание с белками плазмы составляет ≥98%. Соотношение уровней
кровь/плазма равно примерно 0,25, что свидетельствует о слабом проникновении
аторвастатина
в
эритроциты.
В
печени
аторвастатин
экстенсивно
метаболизируется при участии изофермента CYP3А4 цитохрома P450 с
образованием орто- и парагидроксилированных производных и различных
продуктов бета-окисления. In vitro орто- и парагидроксилированные метаболиты
оказывают
ингибирующее
действие
в
отношении
ГМГ-КоА-редуктазы,
сопоставимое с таковым аторвастатина. Ингибирующий эффект в отношении
ГМГ-КоА-редуктазы
примерно
на
70%
определяется
активностью
44
циркулирующих метаболитов. Аторвастатин и его метаболиты выводятся
главным
образом
с
желчью
после
печеночного
и/или
внепеченочного
метаболизма (не подвергается выраженной кишечно-печеночной рециркуляции).
Т1/2
аторвастатина
—
14 ч.
Благодаря
наличию
активных
метаболитов
ингибирующая активность в отношении ГМГ-КоА-редуктазы сохраняется около
20 –30 ч. Менее 2% принятой внутрь дозы аторвастатина определяется в моче. Не
выводится в ходе гемодиализа.
Особенности фармакокинетики у отдельных групп пациентов. У пожилых
людей плазменные концентрации аторвастатина выше (примерно 40% для C max и
30% для AUC), чем у взрослых пациентов молодого возраста. Значения C max у
женщин выше на 20%, AUC — ниже на 10% (клинического значения не имеет).
Заболевания почек не влияют на плазменные концентрации аторвастатина или его
эффект на показатели липидного обмена. У больных алкогольным циррозом
печени концентрации аторвастатина значительно повышены: при нарушении
функции печени легкой степени выраженности (Child Pugh Class A) - в 4 раза (и C
max,
и AUC), при нарушении функции средней степени выраженности (Child Pugh
Class B) - Cmax в 16 раз, AUC - в 11 раз выше нормы.
Препарат назначался совместно с кардиологом в начальной дозе согласно
Национальным рекомендациям ВНОК (Всероссийского научного общества
кардиологов) за 2011 год. В дальнейшем проводилась коррекция дозы в
зависимости от результатов этапных данных лабораторных исследований
2.3. Биоинформационный анализ и базы данных
В своем биоинформационном исследовании мы использовали программу
PathwayStudio®
и
реферативную
базу
данных
ResNet®
компании
AriadneGenomics (США). Объектами базы данных ResNet являются аннотации
биологических объектов (в частности, белков, клеточных процессов и болезней), а
также аннотации функциональных связей между ними, сформированные в
результате обработки текстового массива полнотекстовых статей и абстрактов,
индексированных в Medline.
45
Обработку данных биологических микрочипов и поиск генов - кандидатов
псориатического процесса проводили, используя этот программный продукт.
Расклад процессов по приоритетам производится программой, исходя из того, что
чем меньше значение p-value, тем больше вероятность того, что гены, попавшие в
конкретный процесс, включены туда неслучайно. Изначально порог для p-value
выставляли равным - 0,05.
Вычисление p-value производился по стандартной следующей формуле:
Где N – генеральная совокупность (в данном случае весь набор генов в базе
данных программы),
R – количество «помеченных» объектов/событий (в нашем случае, объектов,
распознанных программой как гены, то есть все данные биологического
микрочипа, которые являются подмножеством генеральной совокупности)
n – выборка из генеральной совокупности (конкретный процесс из списка
процессов),
r – количество «помеченных» объектов для этой выборки (конкретные гены
конкретного процесса).
Таким образом, с ростом N, например, p-value убывает, то есть вероятность
того, что в нашей произвольной выборке n количество «помеченных» объектов r
не случайно, увеличивается.
2.4.Методика гомогенизации и приготовления образцов
Материал, который получали в ходе взятия биопсий у больных псориазом и
материал, приготовленный из образцов стенки сосудов, полученных в ходе
хирургического лечения больных тяжелым атеросклеротическим поражением,
гомогенизировали в ступке и взвешивали, до размораживания образца.
Выделение РНК из биопсии больных на колонках Qiagen. Ткань
растирали в жидком азоте. В биопсию вносили 300ul RLT буфер (содержащий β-
46
МЕ) и сразу же смешивали. После этого в смесь вносили 590ul ddH20 и
протеиназуК10ul(10 мг/мл, AppliChem, USA),проводили смешивание при помощи
пипетки. В течение 10 мин при 55°С проводили инкубацию. После этого при
комнатной температуре выполняли центрифугирование при 10000g в течение 3
мин, а супернатант (около 900ul) перемещали в другую пробирку.
В выделенный супернатант вносили около 450ul 96% этанола. 700ul образца
перенесли на колонку RNeasy mini, установленную в 2-х мл пробирку. В течение
15 сек выполняли центрифугирование при 8000g (10000об/мин). Жидкость,
собранную в пробирку, удаляли, а предыдущий этап повторяли.
При помощи Buffer RW1 в количестве 350ul выполняли промывание
колонки, а затем ее промывали ДНКазой, для чего 10ul раствора DNase I с 70ul
Buffer RDD помещали на поверхность силикагеля на 15 мин при комнатной
температуре. При помощи Buffer RW1 в количестве 350ul колонку обрабатывали
один раз,при помощи Buffer RPE в количестве 500 ul - дважды.
РНКэлюировали 50ul RNAase-free H20.
Электрофорез
в
агарозном
геле.
Электрофорез
проводили
в
горизонтальном агарозном геле в буфере TAE (40 mM Трис-НСl, pH 8.0; 1мМ
ЭДТА; 20мМ СН3СООН). Использовали гели из 2% агарозы. Перед нанесением к
каждому образцу добавляли буфер для нанесения (70% глицерин, 0.01%
бромфеноловый синий), 1/6 часть от объема образца.
Для визуализации РНК использовали бромистый этидий. Краситель
добавляли в гель в процессе его приготовления до конечной концентрации
0,5мкг/мл. Результаты электрофореза визуализировали в ультрафиолетовом свете
на трансиллюминаторе. В качестве стандарта длины и количества ДНК
использовали 1kb маркер (Promega).
Обратная транскрипция (ОТ-ПЦР).Метод ОТ-ПЦР позволяет получить
копии ДНК (кДНК), комплементарные матрице РНК. Обратную транскрипцию
выполняли помещения в пробирку для ПЦР (200 мкл): буфера, dNTP, 100 ед.,
куда вносили обратную транскриптазу M-MLV (Promega), ингибитор РНК-аз
RNasin
(Promega)
(20
ед.).
Сюда
же
помещали
набор
случайных
47
гексануклеотидных праймеров (Promega) и РНК до итоговой концентрации не
более 100 нг/мкл. На 1 час пробирку помещали в термостат при 37°С.
Отсутствие примесей ДНК в образце РНК контролировали путем проведения
ПЦР на ген JUND (фрагмент forward primer 5’-AGCTCACAGTTCCTCTACCC-3’,
reverse primer 5’-GCTGGTTCTGCTTGTGTAAATC-3’).Обратную транскрипцию
не выполняли.
Полимеразная
цепная
реакция.
Амплификацию
ДНКпроводили
с
помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакцию проводили в объеме 20
мкл в пробирках для ПЦР объемом 200 мкл. Использовались следующие
концентрации компонентов реакционной смеси: однократный ПЦР-буфер; 1 ед.
акт. Taq I ДНК-полимеразы; 0,2 мМ dNTP; 0,5 пмоль праймеры («прямой» и
«обратный»).
ПЦР проводили при помощи амплификатора компании MJ Research (USA),
используя программу, представленную ниже: (1) в течение 4 мин проводилась
денатурация при 95°С, (2) в течение 45 сек - денатурация при 94°С, (3) в течение
45 сек - отжиг при 58°С, (4) в течение 45 сек - элонгация при 72°С, (5) 30 раз
повторяли этапы, (6) в течение 7 мин - 72°С.
Полученные продукты анализировали с применением электрофореза в
агарозном геле.
Выделение ДНК из агарозного геля. Для выделения ДНК из агарозного
геля вырезали участок геля с фрагментом (10мг/мл), добавляли 2,5V KI (250мкл),
инкубировали при 60°С до расплавления геля (около 5 мин), затем добавляли 10
мкл
glass
milk,
предварительно
перемешав
его.
Полученную
смесь
ресуспендировали (Vortex), переносили на 5 мин на лед и центрифугировали 10
сек при 13400 об/мин, супернатант сливали. Осадок промывали 3 раза 100 мкл
раствора New-washing (100 mM NaCl, 10mM TrisHCl pH=7,2, 1mM EDTA, 50%
C2H5OH): центрифугировали каждый раз по 10 сек при 13400об/мин, супернатант
сливали. Осадок растворяли в 10 мкл H2O, тщательно ресуспендировали,
инкубировали 2 мин при 60°С, затем центрифугировали 15 сек при 13400 об/мин,
супернатант отбирали в отдельную пробирку. Последний этап проводили 2 раза.
48
2.5. Приготовление серии стандартов для проведения RT-PCR
Лигирование в Т-вектор pAL-TA плазмидной ДНК. Для приготовления
стандартов Real Time PCR продукты амплификации лигировали в T-вектор pALTA (Евроген) (рисунок6). Лигирование Т-вектора проводили с продуктом
полимеразной цепной реакции. Лигирование проводили в реакционной смеси
объемом 20 мкл следующего состава: 0,5 мкл Т-вектор; ПЦР-продукт 10 мкл;
буфер 2 мкл; 1 мкл T4 ДНК лигаза; 6,5 мкл ddH2O. В контрольную пробу вместо
ПЦР-продукта добавляли то же количество бидистиллированной воды. Далее
полученную смесь инкубировали при tкомн в течение 1 часа.
Получение компетентных клеток E.coli. Ночную культуру клеток 50 мкл.
E.coli (бактериальный штамм XLl-Blue (―Stratagene‖, США): recAl endAl gyrA96
thi-l hsdR17 supE44 relAl lac [F proAB lacPZ&M\5 TnlO(TetR)]) обновляли в 5мл
свежей LB-среды (1:100) с 5 мкл Tet (тетрациклин), выращивали при 37°С около
1,5часа. Переносили на 10 мин на лед, далее разливали в стерильные пробирки
Eppendorf (~1,5мл), центрифугировали 30 сек при 13400 об/мин, надосадочную
жидкость сливали, добавляли 350 мкл 0,1 M MgCl2, переносили на 15мин на лед,
центрифугировали 30 сек при 13400 об/мин, убирали супернатант. Далее
добавляли 350 мкл 0,1 M CaCl2, держали 40 мин на льду и затем
центрифугировали 30 сек при 13400 об/мин, тщательно отбирали супернатант,
добавляли
200
мкл
0,1
M
CaCl2,
перемешивали
встряхиванием.
Все
вышеперечисленные процедуры проводили в стерильных условиях.
Трансформация клеток E.coli. К полученным компетентным клеткам E.coli
добавляли 10 мкл плазмидной ДНК, перемешивали, переносили на 30 мин на лед,
далее инкубировали 2 мин при 42°С, снова оставляли на 5 мин на льду. Затем
добавляли 1мл свежей LB-среды, инкубировали в термостате 1 час при 37°С, при
этом встряхивали каждые 15 мин. Далее центрифугировали 45 сек при 13400 rpm,
сливали надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок. Полученную взвесь
рассевали на чашки Петри с селективной средой (твердая LB-среда: 10г
бактотриптон, 5г дрожжевого экстракта, 5г NaCl, 15г бактоагар на 1000мл; 4мкл
49
IPTG; 40мкл X-Gal; 25мкл Amp; 25мкл Tet) и оставляли в термостате при 37°С.
Далее методом бело-синей селекции отбирали колонии со вставкой (белые
колонии) и наращивали их при 37°С.
Выделение плазмидной ДНК. Культуру клеток E.coli разливали по
пробиркам Eppendorf (1,5мл), центрифугировали 30 мин, супернатант сливали и
добавляли 200мкл буфера I (50mM глюкоза, 25mM Tris HCl, 20mM EDTA) и
10мкл RNAse А, тщательно перемешивали (Vortex). Далее вносили 400мкл
буфера II (1% SDS, 0,2M NaOH, H2O), держали 5 мин на льду, после чего
добавляли 360мкл AcNH4 и снова переносили на 10 мин на лед. Добавляли
150мкл хлороформа, центрифугировали 2 мин при 13000 rpm, далее отбирали
водную (верхнюю) фазу и переносили в свежую пробирку. ДНК переосаждали
изопропанолом 600мкл (0,6 V), центрифугировали 6 мин при 13000 rpm. Осадок
промывали в 500мкл 70% C2H5OH (3 раза; ц/ф по 5 мин), просушили в течение 2
мин и растворяли в 50 мкл ddH2O.
Концентрацию плазмиды измеряли на спектрофотометре Eppendorf. В
качестве стандартов использовали серию из шести десятикратных разбавлений
(10, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7).
2.6. Подбор праймеров и оптимизация условий ПЦР
Праймеры к мРНК генов подобраны нами с помощью программ ―Beacon
Designer 7‖, ―Oligo 6‖ и ―Vector NTI Advance 10‖. Температуру отжига для каждой
пары праймеров, использованной в работе, подбирали опытным путем, принимая
за исходную – температуру, рассчитанную с использованием программы
―OligoCalculator‖.
При
отработке
условий
ПЦР
в
качестве
матрицы
использовалась геномная ДНК человека и тотальная кДНК человека.
2.7. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Real-Time PCR или ПЦР-РВ – метод, который дает возможность выполнять
подсчет продуктов амплификации в процессе исследования и выполнять
отслеживание хода получения копий исходного материала. Определение
50
результатов амплификации выполнялось в растворе за счет гибридизации
продукта
специфичным
олигонуклеотидным
зондом,
содержащим
флуоресцентную метку.
Типы ПЦР-РВ отличаются способами создания флуоресценции. Два
основных принципа основаны на:
- применении интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция
которых усиливается при связывании с двухцепочечной ДНК,
- использовании олигонуклеотидных проб комплементарных участку PCRпродукта, которые содержат флуоресцентныеметки.
В работе применялись меченые олигонуклеотидные пробы, в частности
TaqMan®. Для реакции использовали референсный краситель ROX (Синтол)
(2,5-х реакционная смесь). Пробы и праймеры произведены компанией «ДНКСинтез» (Таблица 5).
Таблица 5. Последовательности праймеров и проб, используемых для
определения уровня экспрессии соответствующих им генов при помощи ПЦРРВ
Ген
Праймеры и пробы
GAPDH Набор праймеров и проба компании «ДНК-синтез»
ACAACCGATCCACCTCACCTT
IL-17A
CTTTGCCTCCCAGATCACAGA
FAM -CTCCACCGCAATGAGGACCCTGAG- BHQ1
CGCTCAGATCCGTGGTGAG
MMP-2 TGTCACGTGGCGTCACAGT
FAM -TTCTTCTTCAAGGACCGGTTCATTTGG- BHQ1
51
ACCTCGAACTTTGACAGCGAC
MMP-9 GAGGAATGATCTAAGCCCAGC
FAM –TGCCCGGACCAAGGATACAGTTTGTT- BHQ1
TCGCCTCTCTGCTGATGACAT
MMP-12 GTCAGGATTTGGCAAGCGTT
FAM -CATTCAGTCCCTGTATGGAGACCCAA- BHQ1
Для амплификации использовали ПЦР-амплификатор
компании Bio-Rad
(iQ4). Применяли программу ―two step‖. Эта программа
подразумевает: (1)
денатурацию при 95°С в течение 4 мин, (2) денатурацию при 94°С в течение 30
сек, (3) отжиг и элонгация при 60°С в течение 1 минуты, (4) этапы 2-3 повторяли
50 раз или ―three step‖; (1) денатурацию при 95°С в течение 4 мин, (2)
денатурацию при 94°С в течение 15 сек, (3) отжиг при 55°С в течение 15 сек, (4)
элонгацию при 72°С в течение 15 сек, (5) этапы 2-4 повторяли 50 раз. В таблице 9
приведены гены и праймеры с пробами к ним.
Для того, чтобы получить возможность сравнивать результаты экспрессии
между собой проводили нормализацию экспрессии гена-мишени на GAPDH (ген
«домашнего хозяйства»).
В качестве стандарта применяли серию (4) десятикратных разведений в
зависимости от концентрации образца.
Для подсчета результатов применялись данные со следующими параметрами
реакции: ПЦР с эффективностью не менее 95%, коэффициент корреляции должен
был составлять не менее 0,99, а наклон кривой -3,4±0,2
2.8. Иммуногистохимическое исследование сосудов, пораженных
атеросклеротическим процессом, и кожи пациентов, страдающих псориазом
Материал
исследования.
исследования использовали
Для
проведения
иммуногистохимического
материал биопсий, полученный от пациентов,
52
страдающих
псориатическим
поражением
кожных
покровов
и
атеросклеротическим поражением артерий крупного калибра.
Методика приготовления препарата.
Фиксация
образцов.
После
иссечения материала образец фиксировали при комнатной температуре в 10%
формалине на протяжении 24 часов. Цель фиксации - убить клетку, прекратить
происходящие
в
ней
процессы
(прежде
всего
ферментативные)
и,
по
возможности, сохранить ее прижизненное строение.
Существует ряд общих правил фиксации:
1) объем фиксирующей жидкости должен не менее, чем в 20 раз превышать
объем фиксируемого кусочка ткани;
2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон,
поэтому мы подвешивали образец на нитке;
3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего
от скорости проникновения фиксатора в ткань;
4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические
компоненты клетки.
Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное
его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки. Средний размер
наших образцов составил 5-10 мм.
Формалин (формальдегид) представляет собой светлую, сильно пахнущую
жидкость, состоящую из 40% водного раствора формальдегида. В работе
применяли 10% водный раствор формалина, для чего часть формалина (т. е. 40%
раствора формальдегида) разводили 9 частями воды. Раствор готовили на
водопроводной воде, поскольку дистиллированная вызывает набухание тканей.
Формалин обладает высокой степенью диффузии, способностью хорошо
сохранять форму, окраску и структуру исследуемого объекта, оказывает
длительное фиксирующее действие, не ухудшая при этом качество материала и
хорошо сохраняя жиры и липоиды.
Промывание. Спустя 24 часа с момента начала фиксации выполняли
промывку препарата проточной водой в течение 6-7 часов.
53
Цель этой процедуры — освободить исследуемый объект от излишнего
количества фиксатора. Для этого препарат помещали в стеклянные сита, которые
закрывали пробкой и опускали в сосуд с проточной водой. Этот этап занимал
около 24 часов.
Обезвоживание. После промывания препараты подвергали дальнейшему
уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации.
Для проведения процедуры приготавливали необходимое количество бюксов или
стаканчиков с притертыми крышками, которые заливали спиртами: 50, 60, 70, 80
и 96% (по два стаканчика), 100% (два стаканчика).
Заливка в парафин. Для получения равномерно тонких срезов исследуемого
объекта, кусочки тканей необходимо пропитать и залить такой средой, которая
превратила бы их в хорошо режущуюся массу.
Для этого этапа исследования использовали парафин.
Этот метод широко распространен в исследовательских гистологических
лабораториях благодаря относительной быстроте заливки (в течение 1—2 дней
после обезвоживания), возможности приготовления серийных срезов, а также
тонких срезов для цитологических исследований (толщина 2—3 мкм), удобству
хранения блоков и неокрашенных срезов (практически неограниченное время). К
недостаткам
метода
следует отнести значительное
сжатие
исследуемого
материала (до 20%), вызываемое воздействием высокой температуры в процессе
пропитывания парафином. Богатые водой, рыхлые ткани малопригодны к заливке
в парафин. Определенное неудобство также представляет необходимость
удаления парафина из срезов перед их окраской.
Существует несколько сортов парафина: мягкие (точка плавления 45-54°С) и
твердые (точка плавления 58-60°С). В нашей работе мы использовали парафин с
точкой плавления 54-56°С.
Во время того, как препарат заливали в парафин, он должен был быть
обезвоженным, а спирт удален. Первое условие обеспечивалось в процессе
обезвоживания и уплотнения в батарее спиртов повышающейся концентрации.
Второе - достигалось обработкой препарата толуолом. Толуол является
54
растворителем парафина и обладает способностью вытеснять спирт. При этом
образец становится более твердым. Обработка толуолом проводилась 2 раза по 30
минут.
После этого материал размещали в чистом парафине при температуре 56°С
(дважды по 24 и 120 часов, соответственно) и парафин для заливки (56°С), с 5%
содержанием пчелиного воска (на срок 24 часа).
Получение
срезов
и
регистрация
результатов.
Для
приготовления
гистологического препарата использовали полученные парафиновые блоки. При
помощи санного микротома МС-2 готовили срезы толщиной 8-10 мкм.
Приготовленный материал помещали на заряженные положительно стекла,
затем проводили депарафинизацию с применением толуола, и регидратацию в
различных концентрациях этанола. Срезы отмывали дистиллированной водой,
выполняли демаскировку антигенов, используя 0,2 % раствор Triton X-100 в PBS.
Затем
срезы
промывали
в
буфере
PBS,
инкубировали
поликлональными антителами кролика против белка
с
первичными
IL-17A и MMP-12
(разведение 1/100, Abcam). После отмывки срезов от первичных антител и
нанесения
вторичных
антител,
содержащих
флюорофор
FITC,
срезы
инкубировали в течение часа, отмывали и помещали под покровные стекла.
Визуализацию
продуктов
иммунохимической
реакции,
проводили
с
применением флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio Imaging (Zeiss, Германия).
2.9. Иммуноферментный анализ
В I, II и III группе пациентов до лечения и спустя 3 месяца после начала
терапии, а в IV в тоже время в качестве контроля, проводили взятие крови для
определения уровня IL-17A и MMP-12 в сыворотке.
Методика
взятия
биологического
материала
у
пациентов.
Для
исследования уровня IL-17A и MMP-12 до и после проводимой терапии
аторвастатином, использовали сыворотку крови. Кровь забирали в вакуумные
пробирки с разделительным гелем (производство BD), согласно требованиям
преаналитики спустя
20 мин центрифугировали при 3000 об/мин. Сыворотку
55
крови аликвотировали и замораживали в эппендорфе при температуре минус 20
градусов Цельсия.
Методика определения уровня IL-17A в сыворотке крови до и через 3
месяца после начала терапии пациентов статинами. Определение уровня IL17A
в
сыворотке
крови,
пациентов,
страдающих
атеросклеротическим
поражением сосудов или псориатическим поражением кожных покровов,
проводили методом ИФА. Использовали набор реагентов Bender MedSystems,
BMS2017
human
ELISA,
IL-17A
предназначенный
для
количественного
определения человеческого интерлейкина 17А (IL-17A).
Принцип метода. Сыворотку крови обследуемых пациентов раскапывали в
лунки планшета согласно инструкции к набору. IL-17A, присутствующий в
образцах или стандартах, связывался с антителами к IL-17A, сорбированными в
ячейках планшета. Добавляемые биотинилированные анти-IL-17A антитела
связывались с образованным комплексом -IL-17A- антитела к IL-17A.
После инкубации и промывки из ячеек удаляли не связавшийся биотиновый
конъюгат
анти-IL-17A
и
добавляли
конъюгат
стрептавидин-пероксидазы
(стрептавидин-HRP), связывающий биотин, конъюгированный с анти-IL-17A
антителами. После инкубации и промывки из ячеек удаляли не связавшийся
стрептавидиновый конъюгат, в ячейки добавляли субстратный раствор, который
взаимодействовал с ферментным комплексом с образованием окрашенного
раствора.
Интенсивность окраски, измеряемая на длине волны 450 нм, прямо
пропорциональна
концентрации
IL-17A,
присутствующего
в
образцах.
Концентрация IL-17A в образцах определялась по стандартной кривой,
построенной по 7 приготовленным разведениям стандарта.
Сбор образцов. Для анализа использовали сыворотку крови больных
атеросклерозом и псориазом.
Клинические образцы хранили при -20°C для предотвращения потери
биоактивности
IL-17A.
Перед
тестированием
замороженные
образцы
56
размораживали однократно, медленно доводили до комнатной температуры и
тщательно перемешивали.
Концентраты буферов разводили перед началом анализа после достижения
растворами комнатной температуры. Рабочие концентрации буферов готовили
перед постановкой в строгом соответствии с прилагаемой к набору инструкцией.
Определение концентрации IL-17A в сыворотках крови проводили согласно
инструкции, поставляемой с набором.
Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм на
универсальном
иммунохимическом
анализаторе
«ФЛЮОРОФОТ»,
разработанном в ООО СКБ «ПРОБАНАУЧПРИБОР».
Расчет результатов основывался
на
определении среднего значения
поглощения для каждого стандарта и образца. Отклонение от среднего не
превышало 20%. Концентрация IL-17A рассчитывалась прибором автоматически.
В ходе анализа образцы были разведены в 2 раза (50 мкл образца + 50 мкл
буфера для разведения образцов), следовательно, полученную концентрацию,
умножали на коэффициент разведения (x2).
Методика определения уровня MMP-12 в сыворотке крови до и через 3
месяца после начала терапии пациентов статинами. Для определения
концентрации
матриксной
использовали
наборы
металлопротеиназы-12
реагентов,
в
предназначенные
сыворотке
для
крови
проведения
иммуноферментного анализа в тестах in vitro.
Принцип метода. Дно лунок микропланшета покрыто специфическими
антителами к MMP-12. Стандарты и образцы вносили в соответствующие лунки
микропланшета, вместе с антителами к MMP-12, конъюгированными с биотином.
На следующем этапе
в лунки
добавляли авидин, конъюгированный с
пероксидазой хрена (HRP), и инкубировали в течение необходимого времени.
Затем в лунки добавляли субстратный раствор TMB. Изменение окрашивания в
лунках обусловлено связыванием антител, конъюгированных с биотином, и
авидина, конъюгированного с ферментом, наблюдается только в лунках,
содержащих MMP-12. Ферментную реакцию останавливали добавлением серной
57
кислоты. Интенсивность развившегося окрашивания измеряли с помощью
микропланшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм ± 10 нм.
Концентрацию
MMP-12
в
образцах
определяли
сравнением
полученной
оптической плотности (ОП) образцов с построенной калибровочной кривой.
Данный
метод
обладает
высокой
чувствительностью
и
прекрасной
специфичностью для обнаружения MMP-12. Перекрестной реактивности или
интерференции MMP-12 и его аналогов не обнаружено.
Определение концентрации MMP-12 проводили согласно инструкции,
поставляемой с набором.
Измерения выполняли с помощью универсального иммунохимического
анализатора
«ФЛЮОРОФОТ»,
разработанного
в
ООО
СКБ
«ПРОБАНАУЧПРИБОР».
2.10. Статистическая обработка данных
Обработку результатов полимеразной цепной реакции проводили методом 2ΔΔCT
, согласно [Livak and Schmittgen, 2001].
Статистическую
обработку
взаимодействий,
выявленных
в
ходе
исследования, проводили с использованием программы Statistica®.
Для групп, данных с нормальным распределением, использовался t-критерий
Фишера (Fisher). Для групп, данных с распределением отличным от нормального,
использовали непараметрические критерий Манн-Уитни (Mann–Whitney U test).
58
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Результаты обследования пациентов, страдающих псориатическим
поражением кожи, и пациентов, страдающих атеросклеротическим
поражением сосудов, до начала лечения аторвастатином
На первом этапе исследований пациенты прошли комплексное обследование,
которое включало в себя сбор жалоб, анамнеза, оценку биохимических
показателей
крови
пациентов,
определение
индекса
PASI,
определение
показателей липидного спектра сыворотки крови, определение показателей
уровня цитокинов.
Результаты общего анализа крови и общего анализа мочи пациентов.
У пациентов всех групп на первом этапе исследований проводили
определение показателей общего анализа крови. Полученные результаты,
свидетельствуют
об
отсутствии
статистически
значительных
изменений
показателей (таблица 6).
Обращает на себя внимание незначительное увеличение количества
лейкоцитов и повышение СОЭ как у пациентов с псориатическим поражением
кожных покровов, так и при атеросклеротическом поражении стенок сосудов. Эти
показатели находятся на верхней границе нормы, что может свидетельствовать о
наличии у пациентов текущего воспалительного процесса и не противоречит
данным литературы об изменениях, происходящих в крови при данных
заболеваниях.
В ходе обследования у пациентов проводили определение показателей
общего анализа мочи. Патологических изменений в моче обнаружено не было,
что свидетельствовало об отсутствии у пациентов нарушений со стороны почек.
Как видно из представленных результатов лабораторного обследования, до
лечения во всех группах обследуемых пациентов не выявлено значительных
отклонений показателей.
59
Таблица 6. Результаты общего анализа крови
Значение в группах
Параметр
Референсные
Единицы
измерения
I
II
III
IV
значения
м
4,56±0,4
4,58±0,3
4,87±0,3
4,6±0,2
4,0-5,1
ж
4,4±0,3
4,37±0,3
4,2±0,4
4,3±0,3
3,7-4,7
10,5±1,1
10,7±1,2
8,8±0,9
5,1±0,8
4,0-9,0
м
141±9
145±11
151±8
142±9
130-160
ж
132±6
129±8
128±6
131±5
120-140
249±42
279±38
265±45
256±49
180-320
*109/л
2±1
3±2
2±1
2±1
1-6
%
55±6
57±8
61±9
59±7
47-72
%
Эозинофилы
1±1
-
1±1
1±1
0-5
%
Базофилы
-
1
-
-
0-1
%
Лимфоциты
29±10
28±8
32±6
38±9
18-40
%
Монофиты
±
±
6±
±
2-9
%
м
11±2
12±3
11±3
6±3
1-10
ж
15±3
14±3
13±4
9±4
2-15
Эритроциты
Лейкоциты
Гемоглобин
Тромбоциты
Палочкоядерные
нейтрофилы
Сегментоядерные
нейтрофилы
СОЭ
*1012/л
*109/л
г/л
мм/ч
*Различия между группами достоверны, p<0.05
** Различия с референсными значениями достоверны, p<0.05
Результаты исследования исходного биохимического профиля пациентов.
Руководствуясь данными многочисленных исследований об изменении
липидного обмена как при псориазе [149], так и при атеросклерозе [6; 125], в
каждой группе у пациентов определяли основные показатели обмена липидов
сыворотки крови. Результаты исходного исследования липидного спектра
пациентов представлены в таблице 7.
Анализ липидного профиля сыворотки крови, полученной от пациентов,
страдающих псориатическим поражением кожных покровов (группа I), показал
60
повышение уровня общего холестерина до 7,4±0,3 ммоль/л, триглицеридов до
2,8±0,1 ммоль/л, ЛПВП до 0,5±0,2 ммоль/л. В группе II уровни общего
холестерина, триглицеридов, ЛПВП составили 7,5±0,3 ммоль/л, 2,9±0,1 ммоль/л,
0,7±0,2 ммоль/л, соответственно. Полученные данные свидетельствуют об
изменении липидного профиля у больных псориазом.
Таблица 7. Липидный профиль сыворотки крови пациентов во всех
исследуемых группах до начала лечения
Показатель
Среднее
Среднее
Среднее
значение
значение
значение
Референсные
(псориаз)
(псориаз)
(атеросклероз)
значения
группа I
группа II
группа III
7,4±0,3**
7,5±0,3**
7,9±0,3**
≤5.7
2,8±0,1**
2,9±0,1**
3,4±0,1**
≤2.3
0,5±0,2**
0,7±0,2
0,4±0,1**
≥0.9
3,5±0,2**
3,5±0,3**
4,2±0,2**
<3
Общий
холестерин,
ммоль/л
Триглицериды,
ммоль/л
ЛПВП, ммоль/л
Индекс
атерогенности
*Различия между группами достоверны, p<0.05
** Различия с референсными значениями достоверны, p<0.05
В группе пациентов с тяжелым атеросклеротическим поражением стенок
артерий (группа III) уровень общего холестерина (7,9±0,3
ммоль/л) и
триглицеридов (3,4±0,1 ммоль/л) превысил верхнюю границу нормы, а уровень
ЛПВП (0,4±0,1 ммоль/л) был ниже референсного значения.
Полученные результаты не противоречат выводам ранее опубликованных
исследований,
атеросклерозе.
свидетельствующим
о
нарушении
липидного обмена
при
61
При обследовании условно здоровых доноров (группа IV) отклонений в
значениях показателей липидного профиля не выявлено, равно как и не
обнаружено визуальных элементов, свидетельствующих о поражении кожных
покровов.
Обследование пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных
покровов из группы I и II, показало значительное изменение индекса PASI
(значения составили 15,5±0,9 и 15,8±1,2, соответственно). Дерматологическое
обследование групп пациентов III и IV не выявило изменений. Данные приведены
в таблице 8.
Таблица 8. Значение индекса PASI в обследуемых группах пациентов до
начала лечения
Значение в группах
Клинические
признаки
I
II
III
IV
PASI
15,5±0,9
15,8±1,2
0
0
Отсутствие у пациентов с псориатическим поражением кожных покровов
отклонений со стороны печеночных ферментов свидетельствует об отсутствии у
них патологических изменений со стороны печени, следовательно, применение
аторвастатина у этой группы пациентов не противопоказано.
Сходные данные получены при обследовании пациентов, страдающих
аторосклеротическим
поражением
стенок
сосудов.
Обследуемые
группы
сопоставимы по результатам лабораторного обследования.
В группе IV, сформированной из условно здоровых доноров, значительных
отклонений в анализах, выполненных до начала лечения, не выявлено. Данные
дерматологического обследования не показали нарушений со стороны кожных
покровов.
Учитывая описанную раннее воспалительную природу заболеваний, а так же
возможную
патогенетическую
связь
псориатического
поражения
кожных
покровов и атеросклеротического поражения стенок сосудов, следующим этапом
62
наших исследований стал поиск маркеров для оценки влияния аторвастатина на
течение воспалительного процесса при этих заболеваниях.
3.2. Результаты биоинформационного анализа
В своем биоинформационном исследовании мы использовали программу
PathwayStudio®
и
реферативную
базу
данных
ResNet®
компании
AriadneGenomics (США). Объектами базы данных ResNet являются аннотации
биологических объектов (в частности, белков, клеточных процессов и болезней), а
также аннотации функциональных связей между ними, сформированные в
результате обработки текстового массива полнотекстовых статей и абстрактов,
индексированных в Medline.
Значимость, объединенныx общей функцией генов, оценивалась по тому,
насколько пересечение множества генов, приписанных к данной категории,
превышало
ожидаемый
размер.
Гипергеометрическое
распределение
использовали в качестве модели случайного пересечения множеств. p-значение,
оценка значимости ассоциации данной карты с входным списком генов,
вычисляется для гипергеометрического распределения как
pVal (r, n, R, N )  i max( r ,Rn N ) P(i, n, R, N ) ,
min( n , R )
R N R
( )(
)
n
n!
r nr
,( ) 
где P(i, n, R, N ) 
- биномиальный коэффициент;
N
k
k !( n  k )!
( )
n
т.е. pVal (r , n, R, N ) 
min( n , R )

P(i, n, R, N ) 
i  max( r , R  n  N )
min( n , R )
1
R ! n !( N  R)!( N  n)!



, где
N!
i  max( r , R  n  N ) i !( R  i )!(n  i )!( N  R  n  i )!
N
–
генеральная
совокупность;
R
–
количество,
«помеченных»
объектов/событий (число генов, приписанных к определенной категории, то есть
63
все данные биологического микрочипа, которые являются подмножеством
генеральной совокупности);
n –
выборка
из
генеральной совокупности
(конкретный процесс из списка процессов - размер входного списка генов); r –
количество, «помеченных» объектов для этой выборки (число генов из входного
списка, относящихся к данной карте).
При помощи программы производится расклад процессов по приоритетам,
исходя из того, что чем меньше p-значение, тем больше вероятность того, что
гены, попавшие в конкретный процесс, включены туда не случайно. Изначально
порог значимости для p-значения равнялся 0,01. p-значение убывает с ростом N,
то есть увеличивается вероятность того, что в нашей произвольной выборке n
количество «помеченных» объектов r не случайно.
Для решения этой задачи нами был проанализирован список генов,
транскрипция которых достоверно регулируется тем или иным внутриклеточным
сигнальным каскадом, описанным в литературе (2589 генов-мишеней из 547
сигнальных путей). При анализе использовали данные о регуляции генной
экспрессии, представленные в базе данных ResNet.
При выполнении анализа гены, экспрессия которых изменяется при псориазе
и атеросклерозе, сегрегировали по группам по принципу регуляции общим
транскрипционным фактором. На рисунке 6 представлены условные обозначения,
которые использовались при построении сетей генетических взаимодействий.
Например, на рисунках 7, 8 и 9 представлены гены, регулируемые IL-1β, IFNγ и
IL-6
Рисунок 6. Легенда обозначений объектов и взаимодействий между ними.
Рисунок 7. Карта экспрессионных мишеней канонического сигнального пути для IL-1β. Условные обозначения: см.
рисунок 6.
65
Рисунок 8. Карта экспрессионных мишеней канонического сигнального пути для IFNγ. Условные обозначения: см.
рисунок 6.
66
Рисунок 9. Карта экспрессионных мишеней канонического сигнального пути для IL-6. Условные обозначения: см. рисунок
6.
67
Карта сетевых взаимодействий генов представляет собой визуализацию
различных процессов взаимодействия генов, белков, метаболитов, имеющих
отношение к конкретному генетическому процессу.
Выявлено, что 1127 генов из изучаемого списка имеют отношение как к
псориазу, так и к атеросклерозу, и вовлечены в клеточный иммунный ответ,
иммунный ответ, активацию иммунной системы, апоптоз и воспалительный
ответ. Затем был проведен анализ обогащения по имеющимся картам
канонических сигнальных путей (pathwayenrichmentanalysis),
в результате
которого определены сигнальные пути, регулируемые различными цитокинами и
пептидными лигандами, в которыx эти гены представлены (таблица 9). Из
полученныx данныx отобраны сигнальные и регуляторные меxанизмы с
наибольшим представительством генов.
Таблица 9. Результаты анализа обогащения по картам канонических
сигнальных путей для десяти наиболее релевантных карт
N
Перекрывание (%)
P-значение
IL17 Expression Targets
169
39
1.56143e-13
IL1B Expression Targets
66
31
3.59448e-13
IL6 Expression Targets
83
28
3.11936e-12
IFNG-IFNR Expression Targets
116
23
3.42265e-12
TLR4/AP-1 Expression Targets
83
27
3.48486e-12
CXCL12 Expression Targets
39
37
1.46477e-11
TNF/NF-kB Expression Targets
127
21
2.80111e-11
TGFB1-TGFBR2 Expression Targets
134
20
3.83854e-11
TLR1/2/6 Expression Targets
77
21
4.45945e-09
TLR9 Expression Targets
42
28
6.73318e-09
N – количество узлов на карте; Перекрывание – отношение количества узлов
данной карты, совпадающих с исходным списком генов, к общему количеству
узлов на данной карте; P - значение вычислялось по приведенной ранее формуле.
68
Согласно данным литературы, при обоих заболеваниях: псориазе и
атеросклерозе, активируются Th-1 и Th-17 клетки которые продуцируют такие
цитокины как интерферон гамма, фактор некроза опухолей (TNF), IL-17 и IL-22
[89; 110]. При этом дендритные клетки, стимулирующие пролиферацию Т-клеток,
продуцируют высокие дозы IL-23, TNF, TGFβ и других воспалительных молекул
[88]. В результате же проведенного нами анализа оказалось, что сигнальные
каскады, регулируемые такими генами как IL-23, TNF, IL-12, объединяют
наибольшее количество генов, задействованныx в патогенезе обоих заболеваний.
Используя выбранные сигнальные и регуляторные механизмы, с наибольшим
представительством генов связанных с обоими заболеваниями, нами был
построен общий путь активации Т-клеток в псориазе и атеросклерозе. Для его
построения в используемых сигнальных путях оставляли только те гены, которые
были общими как для псориаза, так и для атеросклероза с наибольшим
количеством связей (рисунок 10).
Проанализировав комбинированную карту сигнальных путей активации Тклеток в псориазе и атеросклерозе (рисунок 10), можно отметить, что
складывается картина, которая вполне согласуется с литературными данными.
Так, сигнальные пути от таких цитокинов как TGF-β, IL-1β, IL-6, IL-21 и IL-23
приводят к активации главных компонентов Th-17 пути – STAT3 и RORγ. В свою
очередь TGF-β подавляет экспрессию STAT-4 и GATA-3, ключевых компонентов
Th-1 и Th-2 иммунных путей, что также дополнительно способствует активации
Th-17 пути. IL-1β также негативно регулирует Th-1 активацию, подавляя IFN-γ
посредством увеличения секреции простагландина Е2. Однако это не приводит к
полному блокированию Th-1 иммунного ответа, а лишь немного сдерживает его,
позволяя активно дифференцироваться Th-17 клеткам. Таким образом, при
развитии псориаза и атеросклероза, практически полностью блокируется Th-2
иммунный ответ, и превалируют Th-17 и Th-1 иммунные пути.
В целом, совокупность процессов, затронутых в обоих заболеваниях, скорее
свидетельствует об активации путей, регулируемых IL-17A, TNFα, IFN-γ и IL-21.
69
Рисунок 10. Комбинированная карта сигнальных путей активации Т-клеток
при псориазе и атеросклерозе. Условные обозначения: см. рисунок 6.
Учитывая тот факт, что TNFα и IFN-γ участвуют в активации множества
процессов и не являются специфичными для какого либо заболевания, а IL-21, в
данном случае, ассоциируется в основном с псориазом, мы решили на более
подробно остановиться на IL-17A и построить сигнальный путь характерный как
для псориаза, так и для атеросклероза (рисунок 11).
Анализ сигнального пути, идущего от IL-17A, выявил две группы генов,
сегрегация которых прошла по принципу регуляции общим транскрипционным
фактором. Часть генов регулировалась АР-1 транскрипционным комплексом (JUN
и FOS семейства), другая часть NF-kB.
70
В группу, регулируемую NF-kB транскрипционным комплексом, вошли
гены, которые уже имеют четкую ассоциацию с обоими заболеваниями или
являющиеся маркерными, как S100A7 (псориазин), для псориаза, и CCL2, для
атеросклероза.
Анализ
генов,
участвующих
в
псориатическом
и
атеросклеротическом процессах, показал, что наибольший интерес для нас
Рисунок 11. Комбинированная карта сигнальных путей активации Т-клеток
при псориазе и атеросклерозе. Условные обозначения: см. рисунок 6.
представляет группа генов регулируемых АР-1 транскрипционным комплексом,
где в основном происходит активация металлопротеаз (MMP), которые не
являются специфическими маркерами атеросклероза и псориаза, но их участие
уже
установлено в
их патогенезе.
При атеросклерозе
металлопротеазы
воздействуют на коллагеновые волокна покрышки атеросклеротической бляшки,
приводя к ее размягчению, разрыву, и, как следствие, к развитию фатальных
71
осложнений атеросклеротического процесса. При псориазе - металлопротеазы
ответственны за процессы ремоделирования дермы, что приводит к серьѐзным
гистопатологическим изменениям кожи.
В целом, основная функция MMP заключается
в ремоделировании и
деградации внеклеточного матрикса и клеточных мембран, за счет них
развивается и регулируется иммунный ответ, активируются антимикробные
белки, осуществляется регуляция миграции лимфоцитов и макрофагов и
проницаемости сосудов, а также регуляция активности медиаторов воспаления
[64; 96].
Принимая во внимание то, что как псориаз, так и атеросклероз считаются
воспалительными заболеваниями, в развитии которых непосредственно участвует
иммунный ответ, а содержание воспалительных факторов повышается в зоне
появления бляшек, нам представилось важным изучение роли MMP в качестве
общих факторов риска в патогенезе обоих заболеваний.
Исходя из вышеизложенного и произведенного нами анализа, принято
решение исследовать с помощью молекулярно генетических методов уровень
экспрессии гена IL-17A и металлопротеаз (ММР-2, ММР-9 и ММР-12), в надежде,
что изучение данных генов, как компонентов отдельного сигнального пути,
поможет установить логичную взаимосвязь между такими заболеваниями, как
псориаз и атеросклероз. Предполагалось, что белковые продукты данных генов
могут быть маркерами, позволяющими установить влияние аторвастатина на ход
воспалительного процесса.
3.3. Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих интерлейкин IL-17A
и матриксные металлопротеиназы MMP-2, MMP-9, MMP-12
Исходя из цели настоящего исследования, следующим шагом нашей работы
стал анализ уровня экспрессии идентифицированных биоинформационным путем
генов, участвующих в процессе возникновения и развития как псориатического
поражения кожных покровов, так и атеросклеротического поражения сосудов.
Проводили определение уровней экспрессии генов IL-17A, MMP-2, MMP-9, MMP-
72
12 в пораженных и визуально непораженных участках ткани. Подобное сравнение
позволило максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту
эксперимента и, ранее, было использовано в ряде работ зарубежных авторов [137;
156]. Определение уровня экспрессии генов проводилось до начала курса лечения
аторвастатином.
Оценка уровня экспрессии генов методом количественной ПЦР в реальном
времени проводилась на 63 парах биопсий кожи (пораженного псориатическим
процессом участка и не пораженного участка кожных покровов) и 32 парах
биопсий сосуда (пораженного атеросклеротическим процессом участка и не
пораженного участка сосуда). В качестве контрольного гена использовали ген
«домашнего хозяйства» GAPDH.
На графиках, отображающих количество копий гена IL-17A (рисунки 12 и 13)
на момент начала реакции, указаны параметры, рассчитанные программным
обеспечением к прибору iCycler iQ. В случае идеальной реакции их величины
должны быть следующими:
- эффективность ПЦР не менее 95%
- коэффициент корреляции не менее 0,99
- наклон кривой (slope) -3,4±0,2
По величинам этих параметров можно судить о качестве проведенной
реакции.
Кривую RT-PCR принято разделять на четыре основные фазы:
На
1.
линейная фаза;
2.
ранняя экспоненциальная фаза;
3.
экспоненциальная фаза (log-фаза);
4.
фаза плато.
первой
флуоресценции
стадии
невысок,
амплификация
но
уже
на
только
раннем
начинается
и
экспоненциальном
уровень
этапе
флуоресценция резко возрастает и превышает установленный пороговый уровень.
Цикл, на котором это происходит, называется пороговым (Ct). Понятие
порогового цикла является центральным в теории RT-PCR. Именно по величине
73
Рисунок 12. График RT-PCR для гена IL-17A
Рисунок 13. График, отображающий количество копий гена IL-17A на момент
начала реакции
74
значения Ct
можно судить об увеличении или снижении уровня экспрессии
исследуемого гена [153].
Результаты ПЦР обрабатывали методом 2-ΔΔCT согласно Livak and Schmittgen,
2001 [87].
Сравнительный анализ уровня экспрессии генов у больных псориазом в
пораженной псориатическим процессом коже относительно непораженной в
группе I показал значительное увеличение уровня экспрессии гена, кодирующего
IL-17A и MMP-12. Cреднее повышение уровня экспрессии гена IL-17A составило
56,5±30,09 раза, гена MMP-12 – 14,6±5,52 раза. Уровень экспрессии гена MMP-9
был увеличен в 3,2±1,45 раза. В то же время уровень экспрессии гена MMP-2 был
снижен. Данные полученные, при изучении уровней экспрессии генов у больных
псориазом в группе I представлены на рисунке 14.
Изменение уровня
экспрессии 2^(-δδCt)
100
10
1
0,1
IL-17A
MMP-2
MMP-9
MMP-12
Рисунок 14. Уровень экспрессии генов у больных псориазом (группа I) в
пораженной псориатическим процессом коже относительно непораженной,
нормализованный на GAPDH.
*За единицу принят уровень экспрессии в визуально непораженных участках
(p< 0,05).
Сравнительный анализ уровня экспрессии генов у больных псориазом в
пораженной псориатическим процессом коже относительно непораженной в
75
группе
II
показал
значительное
повышение
уровня
экспрессии
генов,
кодирующих IL-17A и MMP-12. Экспрессия была увеличена более чем в 10 раз.
Среднее увеличение уровня экспрессии гена IL-17A составило 54,9±31,2 раза, гена
MMP-12 – 12,5±7,53 раза. Уровень экспрессии гена MMP-9 был увеличен в
2,6±1,25 раза. В то же время уровень экспрессии гена MMP-2 был снижен. Данные
полученные, при изучении уровней экспрессии генов у больных псориазом в
группе I представлены на рисунке 15.
Изменение уровня
экспрессии 2^(-δδCt)
100
10
1
0,1
IL-17A
MMP-2
MMP-9
MMP-12
Рисунок 15. Уровень экспрессии генов у больных псориазом (группа II) в
пораженной псориатическим процессом коже относительно непораженной,
нормализованный на GAPDH.
*За единицу принят уровень экспрессии в визуально непораженных участках
(p< 0,05).
Значительной разницы в результатах, полученных при изучении уровней
экспрессии генов IL-17A, MMP-2, MMP-9, MMP-12 в пораженной псориатическим
процессом коже, относительно непораженной при сравнении I и II групп
пациентов выявлено не было, что подтверждает их исходную однородность.
Сравнительный анализ уровня экспрессии генов в пораженной и
непораженной атеросклеротическим процессом интиме сосудов, полученных
76
в ходе хирургического лечения стеноза артерий. В ходе хирургических
операций,
проводимых
у
пациентов,
страдающих
атеросклеротическим
поражением артерий крупного калибра, получен материал из пораженного и
визуально не поврежденного участков сосуда. Исследуемый материал получали у
пациентов либо до начала лечения препаратами группы статинов, либо после его
окончания (спустя 3 месяца), что, по данным литературы, является достаточным
для прекращения любого влияния препарата на пациента. При анализе уровня
экспрессии генов MMP-2, 9, 12 и IL-17A в пораженном участке выявлены
статистически значимые изменения по сравнению с непораженным участком
сосуда.
Среднее увеличение уровня экспрессии гена IL-17A составило 32,9±21,1 раза,
гена MMP-12 – в 63,6±41,7 раза. Уровень экспрессии гена MMP-2 увеличен в
11,9±9,42 раза. Уровень экспрессии гена MMP-9 был увеличен в 28,6±15,9 раза.
Данные полученные, при изучении уровней экспрессии генов у больных
псориазом в группе I представлены на рисунке 16.
Изменение уровня
экспрессии 2^(-δδCt)
1000
100
10
1
IL-17A
MMP-2
MMP-9
MMP-12
Рисунок 16. Уровень экспрессии генов у больных атеросклерозов (группа III)
в пораженной атеросклерозом интиме сосуда относительно непораженной
интимы, нормализованный на GAPDH.
*За единицу принят уровень экспрессии в визуально непораженных участках
(p< 0,05).
77
Повышенная экспрессия гена IL-17A, в пораженных атеросклерозом сосудах
по сравнению с визуально непораженными, подтверждает активную роль
семейства IL-17 в развитии воспалительных заболеваний. IL-17 относят к
провоспалительным цитокинам в связи с его способностью повышать экспрессию
многих медиаторов воспаления (IL-1β, IL-6, IL-12, IL-10, TNF- α), в особенности
тех из них, которые вовлечены в пролиферацию, созревание и хемотаксис
нейтрофилов. Многие исследователи ассоциируют повышенный уровень IL-17 с
некоторыми хроническими воспалительными заболеваниями, в том числе,
псориазом и атеросклерозом [12; 151].
Сравнительный анализ полученных данных выявил разнонаправленность в
экспрессии некоторых генов в зависимости от типа патологического процесса
(рисунок 17).
Изменение уровня экспрессии 2^(-δδCt)
1000
100
10
1
0,1
IL-17A
Псориаз (группа I)
MMP-2
Псориаз (группа II)
MMP-9
MMP-12
Атеросклероз (группа III)
Рисунок 17. Сравнение уровней экспрессии генов IL-17A, ММР-2, ММР-9 и
ММР-12 при псориазе и атеросклерозе
*За единицу принят уровень экспрессии в визуально непораженных участках
(p< 0,05).
78
В псориатических и атеросклеротических бляшках, более чем в 10 раз
увеличена экспрессия IL-17A и MMP-12, что подтверждает правильность выбора
данных генов в качестве общих генов-кандидатов псориаза и атеросклероза. По
данным литературы увеличение уровня экспрессии генов более, чем в один раз
является статистически значимым при данном виде исследований.
Повышенная экспрессия генов матриксных металлопротеиназ полностью
согласуется
с
металлопротеиназы
данными
в
литературы,
качестве
представляющими
потенциальных
матриксные
биомаркеров
развития
кардиологических осложнений при разрушении атеросклеротических бляшек.
Матриксные металлопротеиназы рассматривают как точку воздействия для
коррекции изменений, возникающих при атеросклеротическом поражении
коронарных сосудов [84].
В целом полученные нами результаты по экспрессии генов соотносятся с
данными фундаментальных исследований в области генетических основ
атеросклеротического процесса и свидетельствуют о том, что выбранные, для
данного исследования, гены принимают непосредственное участие в развитии
атеросклеротического процесса [64].
С целью определения локализации накопления белковых продуктов
выбранных генов и практического обоснования участия выбора IL-17A и MMP-12
в качестве маркеров воспалительного процесса при псориатическом поражении
кожных покровов и атеросклеротического поражения стенок сосудов проведен
иммуногистохимический анализ материала биопсий.
Анализ экспрессии белковых продуктов генов MMP-12, IL-17A в
образцах кожи, полученных от больных псориазом, и образцах стенки
сосудов пациентов, страдающих атеросклерозом, подтвердил данные анализа
экспрессии генов.
Образцы кожи пациентов, страдающих псориазом, и образцы стенок сосудов,
полученные у пациентов, страдающих атеросклерозом, были исследованы
методом
иммуногистохимии
(рисунок
18).
Метод,
позволяющий
идентифицировать и определять локализацию в тканях исследуемых антигенов,
79
основан на реакции взаимодействия антиген – антитело в срезах ткани. В работе
использовали первичные антитела кролика (Abcam) к продуктам экспрессии
генов IL-17A, MMP-12. Определяемая визуально флюоресценция указывает на
области накопления продуктов экспрессии. На основании полученных данных
установлена локализация накопления белковых продуктов генов IL-17A, MMP-12.
В псориатических бляшках обнаружено значительное количество ММР-12.
Интересно, что накопление белка MMP-12 происходит преимущественно в
базальном слое эпидермиса. В визуально неповрежденной коже у пациентов с
псориазом содержание ММР-12 значительно ниже, чем в псориатических
бляшках, и накопление происходит по всей толще эпидермиса.
Накопление белкового продукта гена IL-17A в псориатических бляшках
происходило
равномерно
по
всей
толщине
эпидермиса.
В
визуально
неповрежденных участках кожи интенсивность наблюдаемого свечения была
значительно ниже.
В
результате
проведенного
иммуногистохимического
исследования
выявлено распределение продуктов экспрессии гена в стенке сосудов. В работе
использовали первичные антитела кролика (Abcam) к продуктам экспрессии.
Определяемая визуально флюоресценция указывает на области накопления
продуктов экспрессии. В данном случае наибольшей интенсивности она достигает
в интиме сосуда. Различие в ширине области свечения объясняется состоянием
ткани. На рисунке 18, представленная при изучении гена MMP-12 интима сосуда,
повреждена в меньшей степени. Входящие в нее эндотелий, подэндотелиальный
слой и внутренняя эластическая мембрана располагаются компактно. В то же
время при изучении локализации накопления продуктов гена IL-17A представлен
разрушенный
определяются
в
большей
пустоты
степени
между
внутренний
волокнами,
слой
сосудистой
составляющими
стенки,
внутреннюю
эластическую мембрану. Наибольшее их накопление отмечается в интиме сосуда,
что подтверждается реакцией иммунофлюоресценции и свечением зеленого
цвета, наибольшая интенсивность которого определяется в области внутреннего
слоя сосуда.
Атеросклеротическое поражение
сосудов (Х150)
Псориатичекое поражение
кожи (Х50)
80
Визуально неизмененная ткань
MMP-12
IL-17A
Рисунок 18. Визуализация белковых продуктов генов в неизмененных участках кожи и пораженной псориатическим
процессом коже с применением метода иммуногистохимии. Визуализация белковых продуктов генов в неизмененных
участках артериальной стенки и пораженном атеросклерозом сосуде с применением метода иммуногистохимии.
81
Исходя из полученных данных, было принято решение о включении
продуктов именно этих генов в следующий этап исследования при помощи
метода ИФА.
3.4. Результаты исследования исходного уровня IL-17A и MMP-12 в
сыворотке крови обследованных пациентов
Учитывая
результаты
собственных
исследований
и
современные
представления о роли IL-17A и MMP-12 в патогенезе псориаза и атеросклероза,
решено провести определение уровней их в сыворотке крови. Определение
проводилось методом ИФА.
Результаты исходного исследования концентрации IL-17A и MMP-12 в
сыворотке крови пациентов приведены таблица 10.
Таблица 10. Основные показатели цитокинового статуса сыворотки
крови в обследованных группах пациентов
Показатель
IL-17A
(пг/мл)
MMP-12
(пг/мл)
Группа I
Группа II
Псориаз
Псориаз
(комплексная (комплексная терапия
Группа III
Группа IV
Атеросклероз
(аторвастатин)
Контрольная
группа
терапия)
+ аторвастатин)
6,5±0,9
6,7±0,8
8,6±0,9
9,1±1,2
1,8±0,6
1,7±0,5
2,5±0,4**
0,89±0,37
*Различия между группами достоверны, p<0.05
** Различия с референсными значениями достоверны, p<0.05
В результате проведенных исследований установлено, что уровень IL-17A в
сыворотке крови больных, как псориазом, так и атеросклерозом, достоверно не
отличается от контрольных значений. При этом, уровень MMP-12 достоверно
отличается от контрольной группы лишь в группе больных атеросклерозом.
82
Ранее Ye S. получены данные о связи повышения уровня MMP-12 при
атеросклерозе с полиморфизмом гена ММР–12 и восприимчивостью к сердечнососудистым заболеваниям: атеросклерозу артерий, инфаркту миокарда, аневризме
аорты [157]. Активация MMP-12 наступает при изменении соотношения в системе
протеазы-антипротеазы,
влияющего
на
течение
и
прогрессирование
атеросклероза.
После проведения необходимых обследований, в качестве терапевтического
лечения пациенты, составившие группы II и III, получали препарат – аторвастатин
в дозировке от 5 мг до 20 мг 1 раз сутки в зависимости от индивидуальной
восприимчивости к терапии под контролем биохимического анализа крови,
проводимого 1 раз в 2 недели. Побочные явления (токсическое влияние на клетки
печени и мышечную ткань) определяли по уровню
АСТ, АЛТ и КФК,
соответственно.
Через 3 месяца с момента начала применения аторвастатина для оценки
клинической эффективности лечения проведено контрольное обследование.
Проведенные клинические, инструментальные и лабораторные исследования
не выявили токсических и других нежелательных эффектов при применении
аторвастатина.
3.5. Динамика лабораторных показателей при контрольном
обследовании через 3 месяца после начала лечения аторвастатином
Через 3 месяца от начала применения аторвастатина в группах пациентов,
страдающих псориазом, и пациентов с атеросклеротическим поражением артерий,
для оценки клинической эффективности лечения нами проведено контрольное
обследование.
Курс лечения оказал положительное влияние на клиническую картину
заболеваний и привел к улучшению клинических показателей пациентов в группе
больных псориазом, дополнительно получающих аторвастатин.
Согласно результатам контрольного дерматологического
обследования
лечение аторвастатином привело не только к стабилизации, но и к определенной
83
регрессии псориатического процесса. У больных, прошедших курс лечения, не
наблюдалось свежих папулезных высыпаний, а также шелушения уже имевшихся
до
начала
применения
аторвастатина
псориатических
бляшек,
что
свидетельствовало о достижении стационарной стадии заболевания. Общая
оценка состояния больных в обследуемых группах представлена в таблице 11.
Таблица 11. Динамика индекса PASI в группах пациентов, страдающих
псориазом, на фоне лечения аторвастатином
Клинические признаки
Исходно
Через 3 месяца
15,5±0,9
13,1±1,1
Группа I
15,8±1,2
9,7±1,3*
Группа II
0
0
Группа III
0
0
Группа IV
*- различия с исходными показателями достоверны, р < 0.05
Значение индекса PASI
20
15
10
5
0
Исходно
Через 3 месяца
Рисунок 19. Динамика индекса PASI пациентов, страдающих псориатическим
поражением кожных покровов, при лечении аторвастатином (группа II)
* - различия до и через 3 месяца после начала терапии достоверны при значении
р<0,05
84
Общая оценка состояния больных в Группе II также свидетельствовала о
статистически достоверном снижении индекса PASI на 38,6% (среднее значение
PASI до лечения 15,8±1,2, через 3 месяца после начала терапии - 9,7±1,3)
(Рисунок 19).
В группе I (пациенты, не принимавшие аторвастатин) индекс PASI
значительно не изменялся, в течение 3х месяцев ремиссия достигнута не была
(рисунок 20). Среднее значение PASI составило до лечения 15,5±0,9, через 3
месяца после начала терапии – 13,1±1,1.
Значение индекса PASI
20
15
10
5
0
Исходно
Через 3 месяца
Рисунок 20. Динамика индекса PASI пациентов, страдающих псориатическим
поражением кожных покровов, в группе I ( аторвастатин не применялся)
* - различия до и через 3 месяца после начала терапии достоверны при
значении р<0,05
Проведенные клинические, инструментальные и лабораторные исследования
не выявили токсических и других нежелательных эффектов на фоне применения
аторвастатина. Уровень АСТ и АЛТ находился в пределах референсных значений.
85
Все группы пациентов прошли контрольное обследование, включающее
определение показателей липидного профиля пациентов.
Динамика изменения биохимических показателей сыворотки крови в группе I
представлена в таблице 12.
Таблица 12. Динамика основных показателей липидного обмена
больных псориазом, при отсутствии терапии статинами (группа I)
Через 3 месяца
Показатель
До лечения
после начала
Референсные
терапии
Общий холестерин,
ммоль/л
Триглицериды,
ммоль/л
ЛПВП, ммоль/л
Индекс
атерогенности
значения
7,4±0,3**
6,8±0,2*
≤5.7
2,8±0,1**
2,5±0,2
≤2.3
0,5±0,2**
0,7±0,1
≥0.9
3,5±0,2**
3,2±0,1**
<3
* - различия между группами достоверны, р < 0.05
#
- различие с референсными значениями достоверно, р < 0.05
У пациентов, не принимающих аторвастатин, отмечено некоторое улучшение
показателей липидного обмена. На рисунке 21 представлены данные, полученные
до и после курса лечения в сравнении с референсными значениями.
Ниже представлены данные липидного профиля пациентов, принимавших
аторвастатин (группа II). Отмечено значительное улучшение показателей
липидного обмена (таблица 13).
ммоль/л
86
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Общий
холестерин
Триглицериды
До лечения
После лечения
ЛПВП
Индекс
атерогенности
Референсные значения
Рисунок 21. Динамика основных показателей липидного обмена у пациентов,
страдающих псориатическим поражением кожных покровов (группа I)
*Различия между группами достоверны, p<0.05
** Различия с референсными значениями достоверны, p<0.05
Таблица 13. Динамика основных показателей липидного обмена
больных псориазом, получавших терапию аторвастатином (группа II)
Через 3 месяца
Показатель
До лечения
после начала
терапии
Общий холестерин,
ммоль/л
Триглицериды,
ммоль/л
ЛПВП, ммоль/л
Индекс
атерогенности
Референсные
значения
7,5±0,3**
6,1±0,2*
≤5.7
2,9±0,1**
2,14±0,2*
≤2.3
0,7±0,2
0,85±0,1
≥0.9
3,5±0,3**
2,9±0,2*
<3
* - различия между группами достоверны, р < 0.05
** - различие с референсными значениями достоверно, р < 0.05
87
На
фоне
приема
аторвастатина
отмечена
положительная
динамика
показателей липидного обмена: уровень общего холестерина в данной группе
пациентов, уменьшился через 3 месяца после начала терапии до 6,1±0,2 ммоль/л;
триглицеридов - до 2,14±0,2 ммоль/л; значение холестерина ЛПВП увеличилось
до 0,85±0,1 ммоль/л (рисунок 22).
Таким образом, применение аторвастатина у больных псориазом, позволяет
достичь более ранней стабилизации и регрессии псориатического процесса, что
свидетельствует о достижении ремиссии заболевания (снижение индекса PASI на
38,6%),
по сравнению с
группой
больных псориазом,
не
получавших
аторвастатин. Во всех исследуемых группах отмечена положительная динамика
ммоль/л
изменения показателей липидного обмена.
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Общий
холестерин
Триглицериды
До лечения
После лечения
ЛПВП
Индекс
атерогенности
Референсные значения
Рисунок 22. Динамика основных показателей липидного обмена у пациентов,
страдающих псориатическим поражением кожных покровов (группа II)
*Различия между группами достоверны, p<0.05
** Различия с референсными значениями достоверны, p<0.05
При исследовании липидного состава крови пациентов, страдающих
атеросклеротическим поражением артерий, отмечена нормализация контрольных
88
показателей на фоне применения аторвастатина. Их значения приблизились к
референсным, являющимися условными целевыми значениями (таблица 14).
Таблица 14. Динамика основных показателей липидного обмена
больных атеросклерозом, получавших терапию аторвастатином (группа III)
Через 3 месяца
Показатель
До лечения
после начала
терапии
Общий холестерин,
ммоль/л
Триглицериды,
ммоль/л
ЛПВП, ммоль/л
Индекс
атерогенности
Референсные
значения
7,9±0,3**
6,3±0,3*
≤5.7
3,4±0,1**
2,6±0,2*
≤2.3
0,4±0,1**
0,7±0,2
≥0.9
4,2±0,2**
3,3±0,2*
<3
* - различия между группами достоверны, р < 0.05
** - различие с референсными значениями достоверно, р < 0.05
У пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов,
значения основных показателей липидного обмена через 3 месяца после начала
терапии аторвастатином приблизились к референсным, принятым в качестве
условных целевых значений при измерениях на данной модели прибора и для
данного
метода. Уровень общего холестерина, исходно составлявший 7,9±0,3
ммоль/л, уменьшился до 6,3±0,3 ммоль/л; уровень триглицеридов от 3,4±0,1
ммоль/л до 2,6±0,2 ммоль/л; значение холестерина ЛПВП, исходно составлявшее
0,4±0,1 ммоль/л, увеличилось до 0,7±0,2 ммоль/л. (рисунок 23).
ммоль/л
89
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Общий
холестерин
До лечения
Триглицериды
После лечения
ЛПВП
Индекс
атерогенности
Референсные значения
Рисунок 23. Динамика основных показателей липидного обмена у пациентов,
страдающих атеросклеротическим поражением стенок сосудов (группа III).
*Различия между группами достоверны, p<0.05
** Различия с референсными значениями достоверны, p<0.05
Во II и III группах пациентов отмечено значительное улучшение показателей
липидного обмена. В группе I так же наблюдалось незначительное изменение
уровней общего холестерина, триглицеридов и ЛПВП. В группе условно
здоровых доноров (группа IV) значительной динамики показателей отмечено не
было.
В эти же сроки определяли уровень IL-17A и MMP-12 в сыворотке крови
всех групп больных.
Динамика основных показателей цитокинового статуса сыворотки крови
пациентов до и через 3 месяца после начала терапии отражена в таблице 15.
90
Таблица 15. Значения уровней IL-17A и MMP-12 в сыворотке крови
пациентов после проведения терапии с применением аторвастатина
Группа I
Псориаз
Показатель
IL-17A
(пг/мл)
MMP-12
(пг/мл)
(комплексная
терпия)
До
Через 3
лечения
месяца
6,5±0,9
1,8±0,6
Группа II
Псориаз
Группа III
(комплексная
Атеросклероз
терпия +
(аторвастатин)
Группа IV
Контрольная группа
аторвастатин)
До
Через 3
До
Через 3
Контроль
лечения месяца
лечения
месяца
3 месяца
7,6±1,1
6,7±0,8
8,6±0,9
9,6±1,1
1,5±0,5
1,7±0,5 0,95±0,4 2,5±0,4** 2,7±0,3** 0,89±0,37 0,91±0,32
7,8±0,9
9,1±1,2
8,9±1,1
*Различия между группами достоверны, p<0.05
** Различия с референсными значениями достоверны, p<0.05
Как видно из таблицы 15, на фоне терапии аторвастатином, проводимой в
течение 3 месяцев, наблюдались неоднородные изменения уровней цитокинов: в
группе I – у пациентов, страдающих псориазом, уровень интерлейкина IL-17A
увеличился по сравнению с исходным и составил 7.6±1.1 пг/мл, в группе II уровень интерлейкина IL-17A увеличился до 7.8±0.9 пг/мл. Следует отметить, что
значения этих показателей достоверно не отличались от значений, полученных
при
обследовании
контрольной
группы.
При
обследовании
пациентов,
страдающих атеросклерозом, уровень IL-17А повысился и составил 9,6±1,1 пг/мл
(практически не выявлено отличий с контрольной группой).
В то же время концентрация MMP-12 у пациентов, страдающих псориазом
(группа I), уменьшилась до 1,5±0,5 пг/мл, а в группе II - до 0,95±0,4 пг/мл, что
находится в пределах значений, полученных при обследовании контрольной
группы (0,91±0,32 пг/мл). Содержание MMP-12 у пациентов с атеросклерозом на
фоне лечения аторвастатином увеличилось и составило 2,7±0,3 пг/мл.
91
В группе IV при сравнении значений показателей как IL-17A, так и MMP-12
через 3 месяца изменений не выявлено.
Динамика изменения уровня MMP-12 в сыворотке крови пациентов до и
через 3 месяца после начала терапии аторвастатином отражена на рисунке 24.
4
пг/мл
3
2
1
0
Псориаз (группа I)
До лечения
Псориаз (группа II)
После лечения
Атеросклероз (группа III)
Контрольная группа (группа IV)
Рисунок 24. Динамика уровня MMP-12 в сыворотках крови пациентов,
страдающих псориатическим поражением кожных покровов, и пациентов с
атеросклеротическим поражением сосудов крупного калибра
* - различия показателей больных псориазом и контрольной группы
достоверны при значении р<0,05
Следует отметить, что через 3 месяца после начала терапии не было
отмечено статистически достоверного изменения уровней IL-17A и MMP-12 в
сыворотке крови пациентов. Это может свидетельствовать о том, что их
концентрация слишком вариабильна и не отражает реального состояния
локального воспалительного процесса. Отличие уровня MMP-12 как до, так и
через 3 месяца после начала терапии, от референсных значений контрольной
92
группы
свидетельствует
об
участии
матриксных
металлопротеиназ
в
атеросклеротическом процессе.
MMP-12 непосредственно участвует в разрушении экстрацеллюлярного
матрикса стенок сосудов. Повышение уровня MMP-12 у пациентов, страдающих
атеросклерозом,
и
отсутствие
его
изменения
у
больных,
страдающих
псориатическим поражением кожных покровов, может указывать на то, что
ключевое значение имеет расстояние от зоны повреждения до точки получения
биологического материала. Наши измерения проводились в сыворотке крови, а ее
состав быстрее реагирует на изменения в стенках сосудов, чем на изменения,
происходящие в коже. При этом в ходе лечения не происходит быстрого,
статистически значимого изменения концентрации MMP-12 в сыворотке крови.
Выявленная
особенность
может
быть
обусловлена,
несмотря
на
противовоспалительное действие аторвастатина, более длительным периодом,
требующимся для развития системной противовоспалительной активности под
влиянием
препарата,
по
сравнению
с
продолжительностью
требующегося для изменения показателей липидного обмена в крови.
периода,
93
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Не одно десятилетие ведутся поиски генетических маркеров, которые можно
было бы использовать для изучения того или иного заболевания. Причиной тому
является тот факт, что получаемые данные дают возможность выделять группы
риска. Генетический подход позволяет приблизиться к пониманию биологической
сущности заболеваний.
На основании найденных маркеров псориаза и атеросклероза возможно как
создание диагностических платформ для клинического использования, так и
применение в научных целях для дальнейшего исследования заболеваний. Еще
одна возможность их применения – изучение действия препаратов, применяемых
для лечения, с учетом особенностей патогенеза этих заболеваний.
В нашем исследовании использован препарат, относящийся к группе
статинов – аторвастатин. Выбор аторвастатина обусловлен тем, что он широко
применяется для коррекции липидного обмена, нарушение которого является
одним из ключевых факторов развития атеросклеротического процесса. Как
псориатическое поражение кожных покровов, так и атеросклеротическое
поражение
сосудистой
заболеваниями.
К
стенки,
являются
свойствам,
хроническими
присущим
воспалительными
статинам,
относится
противовоспалительная активность, включающая: замедление лейкоцитарной
адгезии и миграции клеток, а так же ингибирующее действие на продукцию ряда
провоспалительных цитокинов. В связи с этим, большой интерес представляет
возможность применения этой группы препаратов в терапии хронических
воспалительных заболеваний.
Ранее проведенные исследования показали, что при всех очевидных
отличиях псориаза и атеросклероза, таких как локализация и симптоматика, есть и
ряд схожих стадий развития процессов. Путь, ведущий к формированию как
псориатической, так и атеросклеротической бляшек состоит из одних и тех же
этапов. На основании этих работ был предложен поиск маркеров, отражающих
94
общий путь развития заболевания, которые могли бы использоваться для оценки
эффективности лечения заболеваний аторвастатином.
В результате
проведенного
нами
биоинформационного исследования
идентифицированы гены, принимающие участие в развитии воспаления при
псориазе и атеросклерозе. Данными генами явились IL-17A, MMP-2, MMP-9 и
MMP-12.
Метод ПЦР в реальном времени позволил выявить изменение уровня
экспрессии перечисленных генов в коже пациентов, страдающих псориазом, и в
интиме сосудов крупного калибра больных атеросклерозом. Это подтвердило
наше предположение об их ключевой роли в процессе развития псориаза и
атеросклероза, а также то, что изменения во внутреннем слое артерии (интиме)
играют значительную роль в патогенезе атеросклероза. Выраженное изменение
уровней экспрессии генов IL-17A и MMP-12, послужило основой для выбора
продуктов данных генов в качестве маркеров воспалительного процесса при
псориазе и атеросклерозе. С помощью метода иммуногистохимии была
локализована область повышенного образования продуктов генов интерлейкина
IL-17A и матриксной металлопротеиназы MMP-12.
IL-17A и MMP-12 выбраны нами в качестве маркеров для определения
эффективности лечения аторвастатином.
Ранее были опубликованы исследования, в которых изучался уровень Th-17 и
IL-17A в сыворотке крови пациентов, страдающих псориатическим поражением
кожи. Yan указывает, что их концентрация отличается при различных типах
псориаза [155].
Takahashi с соавторами в своем исследовании 112 пациентов описывают
значимое увеличение уровня IL-17A в сыворотке больных псориазом по
сравнению со здоровыми донорами [140]. Отмечена положительная корреляция
между уровнем IL-17A и тяжестью заболевания. При этом разница не была
статистически достоверной [158]. Тем не менее, отмечена статистически значимая
корреляция между значением индекса PASI и уровнем IL-17A в сыворотке крови.
95
Yilmaz
с
соавторами
отмечают,
[158]
что
экспрессия
IL-17A
в
псориатических бляшках, измеренная при помощи метода ПЦР, отличается при
разных типах заболевания.
Уровень экспрессии мРНК IL-17A значительно выше в пораженной
псориатическим процессом коже, чем в непораженной [82].
По данным Arican уровень IL-17A в крови не отличался у больных псориазом
по сравнению с группой контроля [15].
Хронический (ауто)иммунный ответ – ключевой механизм развития
атеросклероза. IL-17A - основной цитокин, модулирующий движение иммунных
клеток и инициирующий воспаление при (ауто)иммунных и инфекционных
заболеваниях. Он обладает провоспалительными свойствами, экспрессируется в
основном СD4+ T клетками (Th17), но также в некоторых количествах NK
клетками [150]. IL-17A обладает различными эффектами, такими как, например,
индукция экспрессии TNF-a, IL-1b и MCP-1, а также молекул адгезии ICAM-1 в
воспалительных клетках (макрофаги и эндотелиальные клетки) [43]. Ранее было
показано, что ингибирование IL-17A у мышей уменьшает атеросклеротическое
повреждение сосудов [43; 150].
По всей видимости IL-17A вовлечен в молекулярные механизмы атерогенеза
и оказывает провоспалительное действие на многих уровнях, таких как клеточная
адгезия, перемещение клеток крови в ткани, активация клеток, Т-клеточная
(ко)стимуляция/пролиферация и презентация антигенов в каскаде воспаления при
атеросклерозе. Все это может происходить в тканях, но не влияет на содержание
IL-17A в периферической крови.
Экспрессия IL-17A в контексте развития атеросклероза у человека
практически не изучена.
При
коронарной
болезни
концентрация
интерлейкина
IL-17А
в
периферической крови выше, чем у молодых здоровых людей, но различие
перестает быть значимым при увеличении возраста обследуемой популяции.
Уровень IL-17А не зависит от степени выраженности заболевания [142].
96
Эти
данные
соотносятся
с
результатами,
полученными
нами
при
исследовании уровня IL-17A в сыворотке пациентов, и позволяют сделать вывод о
том, что, несмотря на провоспалительное действие IL-17A, определение его в
сыворотке крови пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением
сосудов, или у больных псориазом, не позволяет оценить эффективность лечения
данных заболеваний.
При этом достоверна разница на тканевом уровне, уровне экспрессии гена,
кодирующего данный белок, при сравнении пораженной и непораженной ткани,
что может свидетельствовать о локальном изменении активности данного гена
при возникновении описанных заболеваний.
Аналогичная картина наблюдается при исследовании уровня MMP-12.
Нами не найдено данных литературы об измерении уровня MMP-12 в
сыворотке крови пациентов, страдающих псориатическим поражением кожи.
При лабораторных исследованиях, проведенных на нокаутных по гену MMP12 мышах, выявлено, что MMP-12 может разрушать фибриноген, являющийся
фактором свертывания, и может быть предиктором тяжелого атеросклероза [102].
По данным Johnson, Jason L. Johnson, MMP-12 может оказывать влияние на
стабильность атеросклеротических бляшек [68]. Их дестабилизация приводит к
развитию тромбоза артерий. В работе предлагается применять ингибиторы MMPдля
12
управления
влиянием
металлопротеиназ
на
стабильность
атеросклеротических бляшек.
В работе Liang J, отмечено, что увеличение экспрессии MMP-12 вызывает
ускорение развития атеросклероза у кроликов [84].
MMP-12 необходима для протеолиза с привлечением макрофагов, для
инвазии макрофагов в ткани и может объяснять уменьшение размеров бляшек, а
также
содержания
макрофагов
у
нокаутных
мышей.
Исследуемая
металлопротеиназа влияет как на проатерогенные, так и на антиатерогенные
липиды, особенно на триглицериды [141].
Исследования, проведенные на hMMP-12 трансгенных кроликах, показали
роль возросшей экспрессии MMP-12 не только в прогрессировании, но и в
97
инициировании атеросклеротического процесса [154]. Так или иначе, учитывая
широкий спектр субстратов для воздействия MMP-12, нельзя рассматривать
только ее эластолитические свойства. Тем не менее, специфические ингибиторы
активности MMP-12 могут обладать потенциальным терапевтическим эффектом
при лечении атеросклероза от момента его возникновения, до развитых стадий
[154].
При этом нами не обнаружено достоверных отличий уровня MMP-12 в
сыворотке крови пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением
сосудов, и у пациентов с псориатическим поражением кожи. Результаты
исследования доказывают, что локальное увеличение экспрессии данного гена в
атеросклеротической
и
псориатической
бляшках
не
дает
значительного
системного эффекта. Поэтому данный фактор не может быть использован в
качестве
контрольного
показателя
для
оценки
степени
эффективности
проводимой терапии.
Проведенные нами исследования показали клиническую эффективность
применения препарата аторвастатин в лечении псориаза. По всей видимости, в
основе его действия лежит возможность влияния препарата на течение
воспалительного процесса. Значительное улучшение состояния кожных покровов,
ремиссия заболевания и улучшение показателей липидного обмена – результаты,
которых удалось достичь в группе больных, принимающих аторвастатин.
Использование IL-17A и MMP-12 в качестве маркеров эффективности
лечения аторвастатином продиктовано теорией о воспалительной природе
псориаза и атеросклероза, а также результатами наших биоинформационных
исследований, доказывающих ключевое значение генов, кодирующих эти белки, в
патогенезе заболеваний. Тем не менее, изменение концентрации IL-17A и MMP12 в сыворотке крови не коррелирует с клинической картиной заболевания и не
отражает полученных данных об эффективности проводимого лечения.
98
ВЫВОДЫ
1. При обследовании пациентов старших возрастных групп, страдающих
псориатическим поражением кожных покровов, и пациентов с тяжелым
атеросклеротическим поражением стенок артерий, выявлены сходные признаки
текущего воспалительного процесса и изменение липидного профиля сыворотки
крови (повышение уровня общего холестерина до 7,4±0,3 ммоль/л и 7,9±0,3
ммоль/л, триглицеридов до 2,8±0,1 ммоль/л и 3,4±0,1 ммоль/л, снижение уровня
ЛПВП до 0,5±0,2 ммоль/л и 0,4±0,1 ммоль/л, соответственно).
2. Сравнительный анализ уровней экспрессии генов IL-17A, MMP-2, MMP-9,
MMP-12 выявил значительное увеличение уровня экспрессии IL-17A и ММР-12
как при псориазе (в 54,5 и 12,5 раз), так и при атеросклеротическом поражении
стенок сосудов (в 32,9 и 63,6 раза соответственно), что свидетельствует об их
ключевой роли в обеих патологиях.
3. Методом иммуногистохимии определены участки локализации белков IL17A, MMP-12
в эпидермисе
больных псориазом и интиме больных
атеросклерозом, что подтверждает их роль в развитии этих патологий.
4. В ходе лечения достигнуто улучшение показателей липидного обмена как
у больных, страдающих псориатическим поражением кожных покровов (ХС
6,1±0,2 ммоль/л; ТРГ 2,14±0,2 ммоль/л; ЛПВП 0,85±0,1 ммоль/л), так и у
пациентов с атеросклеротическим поражением стенок артерий (ХС 6,3±0,3
ммоль/л; ТРГ 2,6±0,2 ммоль/л; ЛПВП 0,7±0,2 ммоль/л)
5. Курс лечения больных псориазом с применением аторвастатина, помогает
достичь более ранней стабилизации и регрессии псориатического процесса, что
свидетельствовало о достижении ремиссии заболевания (снижение индекса PASI
на 38,6%), чем в группе больных псориазом, где аторвастатин не применялся
6. На фоне лечения аторвастатином не выявлено статистически достоверного
изменения уровней IL-17A и MMP-12 в сыворотке крови пациентов, страдающих
псориатическим поражением кожи и атеросклеротическим поражением стенок
сосудов.
99
Практические рекомендации
1. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости тщательного
обследования больных псориазом для выявления поражения сердечно-сосудистой
системы.
2. Для лечения больных псориазом с сопутствующей патологией со стороны
сердечно-сосудистой системы в качестве предпочтительной фармакотерапии
рекомендуется использование препарата аторвастатин.
3.
Рекомендована
следующая
схема,
дополняющая
клиническое
обследование больных с псориатическим поражением кожных покровов :
Больные псориазом
Диагностика нарушений липидного обмена
Диагностированы нарушения
Нарушения липидного обмена не
липидного обмена
диагностированы
Подбор индивидуальной дозы
аторвастатина для коррекции
показателей липидного обмена
Стандартная комплексная терапия
Стандартная комплексная терапия
псориаза + аторвастатин
псориаза
Обязательный плановый контроль показателей липидного обмена
100
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
АГ – артериальная гипертония
ГБ – гипертоническая болезнь
ГМ – головной мозг
ИБС – ишемическая болезнь сердца
ЛЖ – левый желудочек
ЛПНП – липопротеины низкой плотности
ОНМК – острая недостаточность мозгового кровообращения
ОНП – однонуклеотидный полиморфизм
п.н. – пара нуклеотидов
ПЦР – полимеразная цепная реакция
СРБ – С реактивный белок
ТЭЛА – тромбоэмболия легочной артерии
ХПН – хроническая почечная недостаточность
Х – ЛПНП - холестерин липопротеинов низкой плотности
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ACE - ангиотензин-превращающий фермент
AGT – ангиотензиноген
AP-1 – активирующий белок 1
bZIP - basic region leucine zipper
CMV – цитомегаловирус
CRE - cAMP-responsive element
CREB - фактор, связывающий cAMP-респонсивныйэлемент
dNTP – дезокинуклеотидтрифосфат
GP1a - ген интегрина альфа-2
GTF – гуанозинтрифосфат
FAM - FOS activation modules
IL – интерлейкин
JNK – c-JUN N-terminate kinase
101
МАРК - Mitogen-activated protein (MAP) kinases
MMP – матриксные металлопротеиназы
NOS3 - синтаза окиси азота
RT-PCR – полимеразная цепная реакция в реальном времени
SAPK - активируемые стрессом протеиназные киназы
SDS – додецилсульфат натрия
SNP – singlenucleotidepolymorphism
TCFs - Ternary complex factors
TGF-β – трансформирующийростовойфакторβ
TFPI - Tissue factor pathway ingibitor
TIMP - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ
TLR – Toll-like receptor
TNF – факторнекрозаопухоли
TPE - tetradecanoylphorbol-acetate-responsive element
URR - upstream regulatory region
102
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Арутюнов Г.П. Статины и острые коронарные синдромы. Мы на пороге
нового стандарта лечения. // Клин. Фармакология и Терапия. 2001. Т. 10. №
3. — C. 10-16.
2.
Вельков В.В. С-реактивный белок - в лабораторной диагностике острых
воспалений и в оценке рисков сосудистых патологий // Клиниколабораторный консилиум. 2008. Т. 21. № 32. — C. 37-48.
3.
Владимиров В.В. Современные методы терапии псориаза. // Consilium
medicum. Журнал доказательной медицины для практикующих врачей.
2002. Т. 4. № 5. — C. 5.
4.
Волков
В.И.
Провоспалительные
цитокины
и
растворимые
внутриклеточные молекулы адгезии в ишемической болезни сердца //
Кардиология. 2002. Т. 42. № 9. — C. 12.
5.
Мордовцев
В.Н.
Заболевания
кожи
с
наследственной
предрасположенностью. 2002.
6.
Ройтберг
Г.Е.,
Струтынский
А.В.
Внутренние
болезни.
Сердечно-
сосудистая система. // 2003. — C. 481.
7.
Титов
В.Н.,
Лисицин
Д.М.,
Творогова
М.Г.
Корреляция
гиперхолестеринемии и содержание в крови двойных связей полиеновых
жирных кислот. // Клин. Лаб. Диагн. 1999. Т. 9. — C. 28.
8.
Шевченко О.П., Шевченко А.О. Статины Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы.
: Реафарм, 2003.
9.
Menezes I.A., Santos M.R., Cunha C.L. Evaluation of Endothelial Function on
Atherosclerosis using Perfusion Index from Pulse Oximeter // Arq Bras Cardiol.
2014. Т. 102. № 3. — C. 237-244.
10.
Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert
Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in
Adults (Adult Treatment Panel III) final report // Circulation. 2002. Т. 106. № 25.
— C. 3143-421.
103
11.
Adiguzel E., Hou G., Sabatini P.J., Bendeck M.P. Type VIII collagen signals via
beta1 integrin and RhoA to regulate MMP-2 expression and smooth muscle cell
migration // Matrix Biol. 2013. Т. 32. № 6. — C. 332-41.
12.
Aggarwal S., Ghilardi N., Xie M.H., de Sauvage F.J., Gurney A.L. Interleukin-23
promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of
interleukin-17 // J Biol Chem. 2003. Т. 278. № 3. — C. 1910-4.
13.
Airola K., Ahonen M., Johansson N., Heikkila P., Kere J., Kahari V.M.,
Saarialho-Kere U.K. Human TIMP-3 is expressed during fetal development, hair
growth cycle, and cancer progression // J Histochem Cytochem. 1998. Т. 46. №
4. — C. 437-47.
14.
Annunziato F., Cosmi L., Santarlasci V., Maggi L., Liotta F., Mazzinghi B.,
Parente E., Fili L., Ferri S., Frosali F., Giudici F., Romagnani P., Parronchi P.,
Tonelli F., Maggi E., Romagnani S. Phenotypic and functional features of human
Th17 cells // J Exp Med. 2007. Т. 204. № 8. — C. 1849-61.
15.
Arican O., Aral M., Sasmaz S., Ciragil P. Serum levels of TNF-alpha, IFNgamma, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, and IL-18 in patients with active psoriasis and
correlation with disease severity // Mediators Inflamm. 2005. Т. 2005. № 5. — C.
273-9.
16.
Ariza M.E., Williams M.V., Wong H.K. Targeting IL-17 in psoriasis: from
cutaneous immunobiology to clinical application // Clin Immunol. 2013. Т. 146.
№ 2. — C. 131-9.
17.
Arking D.E., Chakravarti A. Understanding cardiovascular disease through the
lens of genome-wide association studies // Trends Genet. 2009. Т. 25. № 9. — C.
387-94.
18.
Ashlin T.G., Kwan A.P., Ramji D.P. Regulation of ADAMTS-1, -4 and -5
expression in human macrophages: differential regulation by key cytokines
implicated in atherosclerosis and novel synergism between TL1A and IL-17 //
Cytokine. 2013. Т. 64. № 1. — C. 234-42.
19.
Austin L.M., Ozawa M., Kikuchi T., Walters I.B., Krueger J.G. The majority of
epidermal T cells in Psoriasis vulgaris lesions can produce type 1 cytokines,
104
interferon-gamma, interleukin-2, and tumor necrosis factor-alpha, defining TC1
(cytotoxic T lymphocyte) and TH1 effector populations: a type 1 differentiation
bias is also measured in circulating blood T cells in psoriatic patients // J Invest
Dermatol. 1999. Т. 113. № 5. — C. 752-9.
20.
Bernberg E., Ulleryd M.A., Johansson M.E., Bergstrom G.M. Social disruption
stress increases IL-6 levels and accelerates atherosclerosis in ApoE-/- mice //
Atherosclerosis. 2012. Т. 221. № 2. — C. 359-65.
21.
Bjerke J.R., Livden J.K., Degre M., Matre R. Interferon in suction blister fluid
from psoriatic lesions // Br J Dermatol. 1983. Т. 108. № 3. — C. 295-9.
22.
Blaha K., Borsky J., Kasparova M., Steklacova A., Zajickova V., Pechova M.,
Matejova R., Kotaska K., Dostalova T. Concentrations of MMP-9 and TIMP-1 in
lip tissue and their impact on cleft lip surgery healing // Biomed Pap Med Fac
Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2013. Т. 157. № 4. — C. 363-6.
23.
Buommino E., De Filippis A., Gaudiello F., Balato A., Balato N., Tufano M.A.,
Ayala F. Modification of osteopontin and MMP-9 levels in patients with psoriasis
on anti-TNF-alpha therapy // Arch Dermatol Res. 2012. Т. 304. № 6. — C. 4815.
24.
Bzowska M., Nogiec A., Skrzeczynska-Moncznik J., Mickowska B., Guzik K.,
Pryjma J. Oxidized LDLs inhibit TLR-induced IL-10 production by monocytes: a
new aspect of pathogen-accelerated atherosclerosis // Inflammation. 2012. Т. 35.
№ 4. — C. 1567-84.
25.
Carmeliet P., Moons L., Lijnen R., Baes M., Lemaitre V., Tipping P., Drew A.,
Eeckhout Y., Shapiro S., Lupu F., Collen D. Urokinase-generated plasmin
activates matrix metalloproteinases during aneurysm formation // Nat Genet.
1997. Т. 17. № 4. — C. 439-44.
26.
Chambers M., Kirkpatrick G., Evans M., Gorski G., Foster S., Borghaei R.C. IL4 inhibition of IL-1 induced Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) expression in
human fibroblasts involves decreased AP-1 activation via negative crosstalk
involving of Jun N-terminal kinase (JNK) // Exp Cell Res. 2013. Т. 319. № 10.
— C. 1398-408.
105
27.
Chandler S., Cossins J., Lury J., Wells G. Macrophage metalloelastase degrades
matrix and myelin proteins and processes a tumour necrosis factor-alpha fusion
protein // Biochem Biophys Res Commun. 1996. Т. 228. № 2. — C. 421-9.
28.
Chang M., Li Y., Yan C., Callis-Duffin K.P., Matsunami N., Garcia V.E., Cargill
M., Civello D., Bui N., Catanese J.J., Leppert M.F., Krueger G.G., Begovich
A.B., Schrodi S.J. Variants in the 5q31 cytokine gene cluster are associated with
psoriasis // Genes Immun. 2008. Т. 9. № 2. — C. 176-81.
29.
Chen C.L., Liou S.F., Chen S.J., Shih M.F. Protective effects of Chlorella-derived
peptide on UVB-induced production of MMP-1 and degradation of procollagen
genes in human skin fibroblasts // Regul Toxicol Pharmacol. 2011. Т. 60. № 1. —
C. 112-9.
30.
Cherng J.Y., Chen L.Y., Shih M.F. Preventive effects of beta-thujaplicin against
UVB-induced MMP-1 and MMP-3 mRNA expressions in skin fibroblasts // Am J
Chin Med. 2012. Т. 40. № 2. — C. 387-98.
31.
Cho M.L., Kang J.W., Moon Y.M., Nam H.J., Jhun J.Y., Heo S.B., Jin H.T., Min
S.Y., Ju J.H., Park K.S., Cho Y.G., Yoon C.H., Park S.H., Sung Y.C., Kim H.Y.
STAT3 and NF-kappaB signal pathway is required for IL-23-mediated IL-17
production in spontaneous arthritis animal model IL-1 receptor antagonistdeficient mice // J Immunol. 2006. Т. 176. № 9. — C. 5652-61.
32.
Christophers E., Schroder J.M., Mrowietz U. Identification of two endogenous
neutrophil-activating peptides in psoriatic skin and inflammatory cells: C5ades
arg and NAP // Dermatologica. 1989. Т. 179 Suppl 1. — C. 9-15.
33.
Coimbra S., Oliveira H., Reis F., Belo L., Rocha S., Quintanilha A., Figueiredo
A., Teixeira F., Castro E., Rocha-Pereira P., Santos-Silva A. C-reactive protein
and leucocyte activation in psoriasis vulgaris according to severity and therapy //
J Eur Acad Dermatol Venereol. Т. 24. № 7. — C. 789-96.
34.
Cornelius L.A., Nehring L.C., Harding E., Bolanowski M., Welgus H.G.,
Kobayashi D.K., Pierce R.A., Shapiro S.D. Matrix metalloproteinases generate
angiostatin: effects on neovascularization // J Immunol. 1998. Т. 161. № 12. —
C. 6845-52.
106
35.
Davidovici B.B., Sattar N., Prinz J.C., Puig L., Emery P., Barker J.N., van de
Kerkhof P., Stahle M., Nestle F.O., Girolomoni G., Krueger J.G. Psoriasis and
systemic inflammatory diseases: potential mechanistic links between skin disease
and co-morbid conditions // J Invest Dermatol. 2010. Т. 130. № 7. — C. 1785-96.
36.
Davis M.E., Gumucio J.P., Sugg K.B., Bedi A., Mendias C.L. MMP inhibition as
a potential method to augment the healing of skeletal muscle and tendon
extracellular matrix // J Appl Physiol (1985). 2013. Т. 115. № 6. — C. 884-91.
37.
Detmar M., Brown L.F., Claffey K.P., Yeo K.T., Kocher O., Jackman R.W.,
Berse B., Dvorak H.F. Overexpression of vascular permeability factor/vascular
endothelial growth factor and its receptors in psoriasis // J Exp Med. 1994. Т.
180. № 3. — C. 1141-6.
38.
Devaraj S., Rogers J., Jialal I. Statins and biomarkers of inflammation // Curr
Atheroscler Rep. 2007. Т. 9. № 1. — C. 33-41.
39.
Downs J.R., Clearfield M., Weis S., Whitney E., Shapiro D.R., Beere P.A.,
Langendorfer A., Stein E.A., Kruyer W., Gotto A.M., Jr. Primary prevention of
acute coronary events with lovastatin in men and women with average cholesterol
levels: results of AFCAPS/TexCAPS. Air Force/Texas Coronary Atherosclerosis
Prevention Study // JAMA. 1998. Т. 279. № 20. — C. 1615-22.
40.
Duhen T., Geiger R., Jarrossay D., Lanzavecchia A., Sallusto F. Production of
interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory
T cells // Nat Immunol. 2009. Т. 10. № 8. — C. 857-63.
41.
Elder J.T., Fisher G.J., Lindquist P.B., Bennett G.L., Pittelkow M.R., Coffey R.J.,
Jr., Ellingsworth L., Derynck R., Voorhees J.J. Overexpression of transforming
growth factor alpha in psoriatic epidermis // Science. 1989. Т. 243. № 4892. —
C. 811-4.
42.
Ellis C.N., Gorsulowsky D.C., Hamilton T.A., Billings J.K., Brown M.D.,
Headington J.T., Cooper K.D., Baadsgaard O., Duell E.A., Annesley T.M., et al.
Cyclosporine improves psoriasis in a double-blind study // JAMA. 1986. Т. 256.
№ 22. — C. 3110-6.
107
43.
Erbel C., Chen L., Bea F., Wangler S., Celik S., Lasitschka F., Wang Y., Bockler
D., Katus H.A., Dengler T.J. Inhibition of IL-17A attenuates atherosclerotic
lesion development in apoE-deficient mice // J Immunol. 2009. Т. 183. № 12. —
C. 8167-75.
44.
Frankova J., Diamantova D., Vrbkova J., Ulrichova J. Influence of
hydrogencalcium salts of oxidized cellulose on MMP-2, MMP-9 and TNF-alpha
production and wound healing in non-healing wounds // Acta Dermatovenerol
Croat. 2013. Т. 21. № 4. — C. 219-23.
45.
Frost J., Ramsay M., Mia R., Moosa L., Musenge E., Tikly M. Differential gene
expression of MMP-1, TIMP-1 and HGF in clinically involved and uninvolved
skin in South Africans with SSc // Rheumatology (Oxford). 2012. Т. 51. № 6. —
C. 1049-52.
46.
Garbaraviciene J., Diehl S., Varwig D., Bylaite M., Ackermann H., Ludwig R.J.,
Boehncke W.H. Platelet P-selectin reflects a state of cutaneous inflammation:
possible application to monitor treatment efficacy in psoriasis // Exp Dermatol. Т.
19. № 8. — C. 736-41.
47.
Gattone M., Iacoviello L., Colombo M., Castelnuovo A.D., Soffiantino F.,
Gramoni A., Picco D., Benedetta M., Giannuzzi P. Chlamydia pneumoniae and
cytomegalovirus seropositivity, inflammatory markers, and the risk of myocardial
infarction at a young age // Am Heart J. 2001. Т. 142. № 4. — C. 633-40.
48.
Gelfand J.M., Neimann A.L., Shin D.B., Wang X., Margolis D.J., Troxel A.B.
Risk of myocardial infarction in patients with psoriasis // JAMA. 2006. Т. 296. №
14. — C. 1735-41.
49.
Ghanavatian S., Diep L.M., Barany P., Heimburger O., Seeberger A., Stenvinkel
P., Rohani M., Agewall S. Subclinical atherosclerosis, endothelial function, and
serum inflammatory markers in chronic kidney disease stages 3 to 4 // Angiology.
2014. Т. 65. № 5. — C. 443-9.
50.
Gisondi P., Fantin F., Del Giglio M., Valbusa F., Marino F., Zamboni M.,
Girolomoni G. Chronic plaque psoriasis is associated with increased arterial
stiffness // Dermatology. 2009. Т. 218. № 2. — C. 110-3.
108
51.
Gladman D.D., Ang M., Su L., Tom B.D., Schentag C.T., Farewell V.T.
Cardiovascular morbidity in psoriatic arthritis // Ann Rheum Dis. 2009. Т. 68. №
7. — C. 1131-5.
52.
Gonzalez-Juanatey C., Llorca J., Amigo-Diaz E., Dierssen T., Martin J.,
Gonzalez-Gay M.A. High prevalence of subclinical atherosclerosis in psoriatic
arthritis patients without clinically evident cardiovascular disease or classic
atherosclerosis risk factors // Arthritis Rheum. 2007. Т. 57. № 6. — C. 1074-80.
53.
Gonzalez-Juanatey C., Llorca J., Miranda-Filloy J.A., Amigo-Diaz E., Testa A.,
Garcia-Porrua C., Martin J., Gonzalez-Gay M.A. Endothelial dysfunction in
psoriatic arthritis patients without clinically evident cardiovascular disease or
classic atherosclerosis risk factors // Arthritis Rheum. 2007. Т. 57. № 2. — C.
287-93.
54.
Gottlieb A.B., Chaudhari U., Mulcahy L.D., Li S., Dooley L.T., Baker D.G.
Infliximab monotherapy provides rapid and sustained benefit for plaque-type
psoriasis // J Am Acad Dermatol. 2003. Т. 48. № 6. — C. 829-35.
55.
Greenwood J., Steinman L., Zamvil S.S. Statin therapy and autoimmune disease:
from protein prenylation to immunomodulation // Nat Rev Immunol. 2006. Т. 6.
№ 5. — C. 358-70.
56.
Gronski T.J., Jr., Martin R.L., Kobayashi D.K., Walsh B.C., Holman M.C., Huber
M., Van Wart H.E., Shapiro S.D. Hydrolysis of a broad spectrum of extracellular
matrix proteins by human macrophage elastase // J Biol Chem. 1997. Т. 272. №
18. — C. 12189-94.
57.
Gudjonsson J.E., Ding J., Johnston A., Tejasvi T., Guzman A.M., Nair R.P.,
Voorhees J.J., Abecasis G.R., Elder J.T. Assessment of the psoriatic
transcriptome in a large sample: additional regulated genes and comparisons with
in vitro models // J Invest Dermatol. 2010. Т. 130. № 7. — C. 1829-40.
58.
Hamlin P.J., Goodfield M. Anti-TNF associated psoriasis // Aliment Pharmacol
Ther. 2012. Т. 35. № 2. — C. 308-9; discussion 309-10.
59.
Han C., Robinson D.W., Jr., Hackett M.V., Paramore L.C., Fraeman K.H., Bala
M.V. Cardiovascular disease and risk factors in patients with rheumatoid arthritis,
109
psoriatic arthritis, and ankylosing spondylitis // J Rheumatol. 2006. Т. 33. № 11.
— C. 2167-72.
60.
Harper E.G., Guo C., Rizzo H., Lillis J.V., Kurtz S.E., Skorcheva I., Purdy D.,
Fitch E., Iordanov M., Blauvelt A. Th17 cytokines stimulate CCL20 expression
in keratinocytes in vitro and in vivo: implications for psoriasis pathogenesis // J
Invest Dermatol. 2009. Т. 129. № 9. — C. 2175-83.
61.
Hashmi S., Zeng Q.T. Role of interleukin-17 and interleukin-17-induced
cytokines interleukin-6 and interleukin-8 in unstable coronary artery disease //
Coron Artery Dis. 2006. Т. 17. № 8. — C. 699-706.
62.
Hess J., Angel P., Schorpp-Kistner M. AP-1 subunits: quarrel and harmony
among siblings // J Cell Sci. 2004. Т. 117. № Pt 25. — C. 5965-73.
63.
Higashikata T., Yamagishi M., Higashi T., Nagata I., Iihara K., Miyamoto S.,
Ishibashi-Ueda H., Nagaya N., Iwase T., Tomoike H., Sakamoto A. Altered
expression balance of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human
carotid plaque disruption: results of quantitative tissue analysis using real-time
RT-PCR method // Atherosclerosis. 2006. Т. 185. № 1. — C. 165-72.
64.
Hijova E. Matrix metalloproteinases: their biological functions and clinical
implications // Bratisl Lek Listy. 2005. Т. 106. № 3. — C. 127-32.
65.
Hollox E.J., Huffmeier U., Zeeuwen P.L., Palla R., Lascorz J., Rodijk-Olthuis D.,
van de Kerkhof P.C., Traupe H., de Jongh G., den Heijer M., Reis A., Armour
J.A., Schalkwijk J. Psoriasis is associated with increased beta-defensin genomic
copy number // Nat Genet. 2008. Т. 40. № 1. — C. 23-5.
66.
Huang J., Luo X., Lu J., Chen J., Zuo C., Xiang Y., Yang S., Tan L., Kang J., Bi
Z. IPL irradiation rejuvenates skin collagen via the bidirectional regulation of
MMP-1 and TGF-beta1 mediated by MAPKs in fibroblasts // Lasers Med Sci.
2011. Т. 26. № 3. — C. 381-7.
67.
Jacobi T.C., Highet A. A clinical dilemma while treating hypercholesterolaemia
in psoriasis // Br J Dermatol. 2003. Т. 149. № 6. — C. 1305-6.
68.
Johnson J.L., George S.J., Newby A.C., Jackson C.L. Divergent effects of matrix
metalloproteinases 3, 7, 9, and 12 on atherosclerotic plaque stability in mouse
110
brachiocephalic arteries // Proc Natl Acad Sci U S A. 2005. Т. 102. № 43. — C.
15575-80.
69.
Kagami S., Rizzo H.L., Lee J.J., Koguchi Y., Blauvelt A. Circulating Th17,
Th22, and Th1 cells are increased in psoriasis // J Invest Dermatol. 2010. Т. 130.
№ 5. — C. 1373-83.
70.
Kelly S.E., Jones D.B., Fleming S. Calgranulin expression in inflammatory
dermatoses // J Pathol. 1989. Т. 159. № 1. — C. 17-21.
71.
Kerkela E., Saarialho-Kere U. Matrix metalloproteinases in tumor progression:
focus on basal and squamous cell skin cancer // Exp Dermatol. 2003. Т. 12. № 2.
— C. 109-25.
72.
Khan F., Galarraga B., Belch J.J. The role of endothelial function and its
assessment in rheumatoid arthritis // Nat Rev Rheumatol. Т. 6. № 5. — C. 25361.
73.
Kim J.A., Montagnani M., Koh K.K., Quon M.J. Reciprocal relationships
between insulin resistance and endothelial dysfunction: molecular and
pathophysiological mechanisms // Circulation. 2006. Т. 113. № 15. — C. 1888904.
74.
Kimball A.B., Gladman D., Gelfand J.M., Gordon K., Horn E.J., Korman N.J.,
Korver G., Krueger G.G., Strober B.E., Lebwohl M.G. National Psoriasis
Foundation clinical consensus on psoriasis comorbidities and recommendations
for screening // J Am Acad Dermatol. 2008. Т. 58. № 6. — C. 1031-42.
75.
Kimhi O., Caspi D., Bornstein N.M., Maharshak N., Gur A., Arbel Y.,
Comaneshter D., Paran D., Wigler I., Levartovsky D., Berliner S., Elkayam O.
Prevalence and risk factors of atherosclerosis in patients with psoriatic arthritis //
Semin Arthritis Rheum. 2007. Т. 36. № 4. — C. 203-9.
76.
Kita T., Yamashita T., Sasaki N., Kasahara K., Sasaki Y., Yodoi K., Takeda M.,
Nakajima K., Hirata K. Regression of atherosclerosis with anti-CD3 antibody via
augmenting a regulatory T-cell response in mice // Cardiovasc Res. 2014. Т. 102.
№ 1. — C. 107-17.
111
77.
Kleinschek M.A., Boniface K., Sadekova S., Grein J., Murphy E.E., Turner S.P.,
Raskin L., Desai B., Faubion W.A., de Waal Malefyt R., Pierce R.H.,
McClanahan T., Kastelein R.A. Circulating and gut-resident human Th17 cells
express CD161 and promote intestinal inflammation // J Exp Med. 2009. Т. 206.
№ 3. — C. 525-34.
78.
Kunz J. Matrix metalloproteinases and atherogenesis in dependence of age //
Gerontology. 2007. Т. 53. № 2. — C. 63-73.
79.
Kyriakou A., Patsatsi A., Sotiriadis D. Anti-TNF agents and nail psoriasis: a
single-center, retrospective, comparative study // J Dermatolog Treat. 2013. Т.
24. № 3. — C. 162-8.
80.
LaRosa J.C., He J., Vupputuri S. Effect of statins on risk of coronary disease: a
meta-analysis of randomized controlled trials // JAMA. 1999. Т. 282. № 24. —
C. 2340-6.
81.
Lemaitre V., D'Armiento J. Matrix metalloproteinases in development and
disease // Birth Defects Res C Embryo Today. 2006. Т. 78. № 1. — C. 1-10.
82.
Li J., Chen X., Liu Z., Yue Q., Liu H. Expression of Th17 cytokines in skin
lesions of patients with psoriasis // J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci.
2007. Т. 27. № 3. — C. 330-2.
83.
Li Y., Jiang L., Zhang S., Yin L., Ma L., He D., Shen J. Methotrexate attenuates
the Th17/IL-17 levels in peripheral blood mononuclear cells from healthy
individuals and RA patients // Rheumatol Int. 2012. Т. 32. № 8. — C. 2415-22.
84.
Liang J., Liu E., Yu Y., Kitajima S., Koike T., Jin Y., Morimoto M., Hatakeyama
K., Asada Y., Watanabe T., Sasaguri Y., Watanabe S., Fan J. Macrophage
metalloelastase accelerates the progression of atherosclerosis in transgenic rabbits
// Circulation. 2006. Т. 113. № 16. — C. 1993-2001.
85.
Libby P., Ridker P.M., Hansson G.K. Inflammation in atherosclerosis: from
pathophysiology to practice // J Am Coll Cardiol. 2009. Т. 54. № 23. — C. 212938.
112
86.
Liu Y., Yang B., Zhou M., Li L., Zhou H., Zhang J., Chen H., Wu C. Memory
IL-22-producing CD4+ T cells specific for Candida albicans are present in
humans // Eur J Immunol. 2009. Т. 39. № 6. — C. 1472-9.
87.
Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. 2001. Т.
25. № 4. — C. 402-8.
88.
Lowes M.A., Bowcock A.M., Krueger J.G. Pathogenesis and therapy of psoriasis
// Nature. 2007. Т. 445. № 7130. — C. 866-73.
89.
Lowes M.A., Kikuchi T., Fuentes-Duculan J., Cardinale I., Zaba L.C., Haider
A.S., Bowman E.P., Krueger J.G. Psoriasis vulgaris lesions contain discrete
populations of Th1 and Th17 T cells // J Invest Dermatol. 2008. Т. 128. № 5. —
C. 1207-11.
90.
Ludwig R.J., Schultz J.E., Boehncke W.H., Podda M., Tandi C., Krombach F.,
Baatz H., Kaufmann R., von Andrian U.H., Zollner T.M. Activated, not resting,
platelets increase leukocyte rolling in murine skin utilizing a distinct set of
adhesion molecules // J Invest Dermatol. 2004. Т. 122. № 3. — C. 830-6.
91.
Madhur M.S., Funt S.A., Li L., Vinh A., Chen W., Lob H.E., Iwakura Y., Blinder
Y., Rahman A., Quyyumi A.A., Harrison D.G. Role of interleukin 17 in
inflammation, atherosclerosis, and vascular function in apolipoprotein e-deficient
mice // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011. Т. 31. № 7. — C. 1565-72.
92.
Mallat Z., Corbaz A., Scoazec A., Graber P., Alouani S., Esposito B., Humbert
Y., Chvatchko Y., Tedgui A. Interleukin-18/interleukin-18 binding protein
signaling modulates atherosclerotic lesion development and stability // Circ Res.
2001. Т. 89. № 7. — C. E41-5.
93.
Manicone A.M., McGuire J.K. Matrix metalloproteinases as modulators of
inflammation // Semin Cell Dev Biol. 2008. Т. 19. № 1. — C. 34-41.
94.
Mannello F., Medda V., Ligi D., Raffetto J.D. Glycosaminoglycan sulodexide
inhibition of MMP-9 gelatinase secretion and activity: possible pharmacological
role against collagen degradation in vascular chronic diseases // Curr Vasc
Pharmacol. 2013. Т. 11. № 3. — C. 354-65.
113
95.
Martin D.A., Towne J.E., Kricorian G., Klekotka P., Gudjonsson J.E., Krueger
J.G., Russell C.B. The emerging role of IL-17 in the pathogenesis of psoriasis:
preclinical and clinical findings // J Invest Dermatol. 2013. Т. 133. № 1. — C.
17-26.
96.
McGuire M.A. A simple, clinically useful technique to predict successful ablation
site of accessory pathways located near the cardiac septum? // J Cardiovasc
Electrophysiol. 2008. Т. 19. № 7. — C. 659-60.
97.
McKenney J.M., Davidson M.H., Jacobson T.A., Guyton J.R. Final conclusions
and recommendations of the National Lipid Association Statin Safety Assessment
Task Force // Am J Cardiol. 2006. Т. 97. № 8A. — C. 89C-94C.
98.
McNamara J.J., Molot M.A., Stremple J.F., Cutting R.T. Coronary artery disease
in combat casualties in Vietnam // JAMA. 1971. Т. 216. № 7. — C. 1185-7.
99.
Mehta N.N., Azfar R.S., Shin D.B., Neimann A.L., Troxel A.B., Gelfand J.M.
Patients with severe psoriasis are at increased risk of cardiovascular mortality:
cohort study using the General Practice Research Database // Eur Heart J. 2010.
Т. 31. № 8. — C. 1000-6.
100. Miossec P., Korn T., Kuchroo V.K. Interleukin-17 and type 17 helper T cells // N
Engl J Med. 2009. Т. 361. № 9. — C. 888-98.
101. Morimoto Y., Oyabu T., Ogami A., Myojo T., Kuroda E., Hirohashi M., Shimada
M., Lenggoro W., Okuyama K., Tanaka I. Investigation of gene expression of
MMP-2 and TIMP-2 mRNA in rat lung in inhaled nickel oxide and titanium
dioxide nanoparticles // Ind Health. 2011. Т. 49. № 3. — C. 344-52.
102. Motterle A., Xiao Q., Kiechl S., Pender S.L., Morris G.E., Willeit J., Caulfield
M.J., Ye S. Influence of matrix metalloproteinase-12 on fibrinogen level //
Atherosclerosis. 2012. Т. 220. № 2. — C. 351-4.
103. Myasoedova E., Gabriel S.E. Cardiovascular disease in rheumatoid arthritis: a
step forward // Curr Opin Rheumatol. Т. 22. № 3. — C. 342-7.
104. Nagase H., Woessner J.F., Jr. Matrix metalloproteinases // J Biol Chem. 1999. Т.
274. № 31. — C. 21491-4.
114
105. Nair R.P., Duffin K.C., Helms C., Ding J., Stuart P.E., Goldgar D., Gudjonsson
J.E., Li Y., Tejasvi T., Feng B.J., Ruether A., Schreiber S., Weichenthal M.,
Gladman D., Rahman P., Schrodi S.J., Prahalad S., Guthery S.L., Fischer J., Liao
W., Kwok P.Y., Menter A., Lathrop G.M., Wise C.A., Begovich A.B., Voorhees
J.J., Elder J.T., Krueger G.G., Bowcock A.M., Abecasis G.R. Genome-wide scan
reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways // Nat
Genet. 2009. Т. 41. № 2. — C. 199-204.
106. Nair R.P., Stuart P.E., Nistor I., Hiremagalore R., Chia N.V., Jenisch S.,
Weichenthal M., Abecasis G.R., Lim H.W., Christophers E., Voorhees J.J., Elder
J.T. Sequence and haplotype analysis supports HLA-C as the psoriasis
susceptibility 1 gene // Am J Hum Genet. 2006. Т. 78. № 5. — C. 827-51.
107. Namazi M.R. Statins: novel additions to the dermatologic arsenal? // Exp
Dermatol. 2004. Т. 13. № 6. — C. 337-9.
108. Noel A., Jost M., Maquoi E. Matrix metalloproteinases at cancer tumor-host
interface // Semin Cell Dev Biol. 2008. Т. 19. № 1. — C. 52-60.
109. Nograles K.E., Zaba L.C., Guttman-Yassky E., Fuentes-Duculan J., SuarezFarinas M., Cardinale I., Khatcherian A., Gonzalez J., Pierson K.C., White T.R.,
Pensabene C., Coats I., Novitskaya I., Lowes M.A., Krueger J.G. Th17 cytokines
interleukin (IL)-17 and IL-22 modulate distinct inflammatory and keratinocyteresponse pathways // Br J Dermatol. 2008. Т. 159. № 5. — C. 1092-102.
110. Nograles K.E., Zaba L.C., Shemer A., Fuentes-Duculan J., Cardinale I., Kikuchi
T., Ramon M., Bergman R., Krueger J.G., Guttman-Yassky E. IL-22-producing
"T22" T cells account for upregulated IL-22 in atopic dermatitis despite reduced
IL-17-producing TH17 T cells // J Allergy Clin Immunol. 2009. Т. 123. № 6. —
C. 1244-52 e2.
111. Oestreicher J.L., Walters I.B., Kikuchi T., Gilleaudeau P., Surette J.,
Schwertschlag U., Dorner A.J., Krueger J.G., Trepicchio W.L. Molecular
classification of psoriasis disease-associated genes through pharmacogenomic
expression profiling // Pharmacogenomics J. 2001. Т. 1. № 4. — C. 272-87.
115
112. Olefsky J.M., Glass C.K. Macrophages, inflammation, and insulin resistance //
Annu Rev Physiol. Т. 72. — C. 219-46.
113. Oriana S., Guendalina L., Oscar C., Antonio Z., Fiorenza O., Mauro P., Roberto
D.P., Andrea G., Annamaria O. Delayed wound healing in aged skin rat models
after thermal injury is associated with an increased MMP-9, K6 and CD44
expression // Burns. 2013. Т. 39. № 4. — C. 776-87.
114. Ouchi N., Parker J.L., Lugus J.J., Walsh K. Adipokines in inflammation and
metabolic disease // Nat Rev Immunol. Т. 11. № 2. — C. 85-97.
115. Parks W.C., Wilson C.L., Lopez-Boado Y.S. Matrix metalloproteinases as
modulators of inflammation and innate immunity // Nat Rev Immunol. 2004. Т.
4. № 8. — C. 617-29.
116. Patel L.R., Curran T., Kerppola T.K. Energy transfer analysis of Fos-Jun
dimerization and DNA binding // Proc Natl Acad Sci U S A. 1994. Т. 91. № 15.
— C. 7360-4.
117. Peters M.J., van der Horst-Bruinsma I.E., Dijkmans B.A., Nurmohamed M.T.
Cardiovascular risk profile of patients with spondylarthropathies, particularly
ankylosing spondylitis and psoriatic arthritis // Semin Arthritis Rheum. 2004. Т.
34. № 3. — C. 585-92.
118. Pober J.S. Interleukin-17 and atherosclerotic vascular disease // Arterioscler
Thromb Vasc Biol. 2011. Т. 31. № 7. — C. 1465-6.
119. Preis S.R., Pencina M.J., Hwang S.J., D'Agostino R.B., Sr., Savage P.J., Levy D.,
Fox C.S. Trends in cardiovascular disease risk factors in individuals with and
without diabetes mellitus in the Framingham Heart Study // Circulation. 2009. Т.
120. № 3. — C. 212-20.
120. Prodanovich S., Ma F., Taylor J.R., Pezon C., Fasihi T., Kirsner R.S.
Methotrexate reduces incidence of vascular diseases in veterans with psoriasis or
rheumatoid arthritis // J Am Acad Dermatol. 2005. Т. 52. № 2. — C. 262-7.
121. Raffetto J.D., Khalil R.A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in
vascular remodeling and vascular disease // Biochem Pharmacol. 2008. Т. 75. №
2. — C. 346-59.
116
122. Rajpara A.N., Goldner R., Gaspari A. Psoriasis: can statins play a dual role? //
Dermatol Online J. 2010. Т. 16. № 2. — C. 2.
123. Raychaudhuri S.P. Comorbidities of psoriatic arthritis -- metabolic syndrome and
prevention: a report from the GRAPPA 2010 annual meeting // J Rheumatol. Т.
39. № 2. — C. 437-40.
124. Raychaudhuri S.P., Jiang W.Y., Raychaudhuri S.K. Revisiting the Koebner
phenomenon: role of NGF and its receptor system in the pathogenesis of psoriasis
// Am J Pathol. 2008. Т. 172. № 4. — C. 961-71.
125. Reynoso-von Drately C M.-A.E., Balcazar-Munoz BR, Bustos-Sandana R,
Gouzales-Ortis M. Lipid profile, insulin secretion, and insulin sensitivity in
psoriasis. Medical research Unit in Clinical Epidemiology, West National
Medical Center, Mexican Institute of Social Security, Guadalajara, Mexico. // J
Am Acad Dermatol. 2003. Т. 48. № 6. — C. 882-5.
126. Ridker P.M., Cushman M., Stampfer M.J., Tracy R.P., Hennekens C.H.
Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy
men // N Engl J Med. 1997. Т. 336. № 14. — C. 973-9.
127. Ross R. Atherosclerosis--an inflammatory disease // N Engl J Med. 1999. Т. 340.
№ 2. — C. 115-26.
128. Sacks F.M., Pfeffer M.A., Moye L.A., Rouleau J.L., Rutherford J.D., Cole T.G.,
Brown L., Warnica J.W., Arnold J.M., Wun C.C., Davis B.R., Braunwald E. The
effect of pravastatin on coronary events after myocardial infarction in patients
with average cholesterol levels. Cholesterol and Recurrent Events Trial
investigators // N Engl J Med. 1996. Т. 335. № 14. — C. 1001-9.
129. Saikku P., Leinonen M., Mattila K., Ekman M.R., Nieminen M.S., Makela P.H.,
Huttunen J.K., Valtonen V. Serological evidence of an association of a novel
Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial
infarction // Lancet. 1988. Т. 2. № 8618. — C. 983-6.
130. Sandqvist M., Nyberg G., Hammarstedt A., Klintland N., Gogg S., Caidahl K.,
Ahren B., Smith U., Jansson P.A. Low adipocyte IRS-1 protein expression is
117
associated with an increased arterial stiffness in non-diabetic males //
Atherosclerosis. 2005. Т. 180. № 1. — C. 119-25.
131. Shapiro S.D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix:
biological consequences // Curr Opin Cell Biol. 1998. Т. 10. № 5. — C. 602-8.
132. Shen H., Goodall J.C., Hill Gaston J.S. Frequency and phenotype of peripheral
blood Th17 cells in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis // Arthritis
Rheum. 2009. Т. 60. № 6. — C. 1647-56.
133. Shepherd J., Cobbe S.M., Ford I., Isles C.G., Lorimer A.R., MacFarlane P.W.,
McKillop J.H., Packard C.J. Prevention of coronary heart disease with pravastatin
in men with hypercholesterolemia. West of Scotland Coronary Prevention Study
Group // N Engl J Med. 1995. Т. 333. № 20. — C. 1301-7.
134. Shirinsky I.V., Shirinsky V.S. Efficacy of simvastatin in plaque psoriasis: A pilot
study // J Am Acad Dermatol. 2007. Т. 57. № 3. — C. 529-31.
135. Solomon D.H., Goodson N.J., Katz J.N., Weinblatt M.E., Avorn J., Setoguchi S.,
Canning C., Schneeweiss S. Patterns of cardiovascular risk in rheumatoid arthritis
// Ann Rheum Dis. 2006. Т. 65. № 12. — C. 1608-12.
136. Song Y., Song S., Zhang D., Zhang Y., Chen L., Qian L., Shi M., Zhao H., Jiang
Z., Guo N. An association of a simultaneous nuclear and cytoplasmic localization
of Fra-1 with breast malignancy // BMC Cancer. 2006. Т. 6. — C. 298.
137. Sonkoly E., Wei T., Janson P.C., Saaf A., Lundeberg L., Tengvall-Linder M.,
Norstedt G., Alenius H., Homey B., Scheynius A., Stahle M., Pivarcsi A.
MicroRNAs: novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis? // PLoS
One. 2007. Т. 2. № 7. — C. e610.
138. Stewart J.A., Jr., Wei C.C., Brower G.L., Rynders P.E., Hankes G.H., Dillon
A.R., Lucchesi P.A., Janicki J.S., Dell'Italia L.J. Cardiac mast cell- and chymasemediated matrix metalloproteinase activity and left ventricular remodeling in
mitral regurgitation in the dog // J Mol Cell Cardiol. 2003. Т. 35. № 3. — C. 3119.
139. Suomela S., Kariniemi A.L., Snellman E., Saarialho-Kere U. Metalloelastase
(MMP-12) and 92-kDa gelatinase (MMP-9) as well as their inhibitors, TIMP-1
118
and -3, are expressed in psoriatic lesions // Exp Dermatol. 2001. Т. 10. № 3. —
C. 175-83.
140. Takahashi H., Tsuji H., Hashimoto Y., Ishida-Yamamoto A., Iizuka H. Serum
cytokines and growth factor levels in Japanese patients with psoriasis // Clin Exp
Dermatol. 2010. Т. 35. № 6. — C. 645-9.
141. Takeichi S., Yukawa N., Nakajima Y., Osawa M., Saito T., Seto Y., Nakano T.,
Saniabadi A.R., Adachi M., Wang T., Nakajima K. Association of plasma
triglyceride-rich lipoprotein remnants with coronary atherosclerosis in cases of
sudden cardiac death // Atherosclerosis. 1999. Т. 142. № 2. — C. 309-15.
142. Taleb S., Romain M., Ramkhelawon B., Uyttenhove C., Pasterkamp G., Herbin
O., Esposito B., Perez N., Yasukawa H., Van Snick J., Yoshimura A., Tedgui A.,
Mallat Z. Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for
interleukin-17 in atherosclerosis // J Exp Med. 2009. Т. 206. № 10. — C. 206777.
143. Taniguchi S., Ryu J., Seki M., Sumino T., Tokuhashi Y., Esumi M. Long-term
oral administration of glucosamine or chondroitin sulfate reduces destruction of
cartilage and up-regulation of MMP-3 mRNA in a model of spontaneous
osteoarthritis in Hartley guinea pigs // J Orthop Res. 2012. Т. 30. № 5. — C. 6738.
144. Terui T., Ozawa M., Tagami H. Role of neutrophils in induction of acute
inflammation in T-cell-mediated immune dermatosis, psoriasis: a neutrophilassociated inflammation-boosting loop // Exp Dermatol. 2000. Т. 9. № 1. — C. 110.
145. Toth P.P. Subclinical atherosclerosis: what it is, what it means and what we can
do about it // Int J Clin Pract. 2008. Т. 62. № 8. — C. 1246-54.
146. Trifari S., Kaplan C.D., Tran E.H., Crellin N.K., Spits H. Identification of a
human helper T cell population that has abundant production of interleukin 22
and is distinct from T(H)-17, T(H)1 and T(H)2 cells // Nat Immunol. 2009. Т. 10.
№ 8. — C. 864-71.
119
147. Tseng H.C., Lee I.T., Lin C.C., Chi P.L., Cheng S.E., Shih R.H., Hsiao L.D.,
Yang C.M. IL-1beta promotes corneal epithelial cell migration by increasing
MMP-9 expression through NF-kappaB- and AP-1-dependent pathways // PLoS
One. 2013. Т. 8. № 3. — C. e57955.
148. Tsuda K., Yamanaka K., Kondo M., Matsubara K., Sasaki R., Tomimoto H.,
Gabazza E.C., Mizutani H. Ustekinumab improves psoriasis without altering T
cell cytokine production, differentiation, and T cell receptor repertoire diversity //
PLoS One. 2012. Т. 7. № 12. — C. e51819.
149. Vanisor Kular B O.A., Cimsit G, Yandi YE,Calapoglu M. Evaluation of the
atherogenic tendency of lipids and lipoprotein content and their relationships with
oxidant system in patients with psoriasis // Clin Chi. Acta. 2003. Т. 328. № 1-2.
— C. 71-82.
150. Weaver C.T., Hatton R.D., Mangan P.R., Harrington L.E. IL-17 family cytokines
and the expanding diversity of effector T cell lineages // Annu Rev Immunol.
2007. Т. 25. — C. 821-52.
151. Witowski J., Ksiazek K., Jorres A. Interleukin-17: a mediator of inflammatory
responses // Cell Mol Life Sci. 2004. Т. 61. № 5. — C. 567-79.
152. Woessner J.F., Jr. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective
tissue remodeling // FASEB J. 1991. Т. 5. № 8. — C. 2145-54.
153. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation //
Biotechniques. 2005. Т. 39. № 1. — C. 75-85.
154. Yamada S., Wang K.Y., Tanimoto A., Fan J., Shimajiri S., Kitajima S., Morimoto
M.,
Tsutsui
M.,
Watanabe
T.,
Yasumoto
K.,
Sasaguri
Y.
Matrix
metalloproteinase 12 accelerates the initiation of atherosclerosis and stimulates
the progression of fatty streaks to fibrous plaques in transgenic rabbits // Am J
Pathol. 2008. Т. 172. № 5. — C. 1419-29.
155. Yan K.X., Fang X., Han L., Zhang Z.H., Kang K.F., Zheng Z.Z., Huang Q.
Foxp3+ regulatory T cells and related cytokines differentially expressed in plaque
vs. guttate psoriasis vulgaris // Br J Dermatol. 2010. Т. 163. № 1. — C. 48-56.
120
156. Yao Y., Richman L., Morehouse C., de los Reyes M., Higgs B.W., Boutrin A.,
White B., Coyle A., Krueger J., Kiener P.A., Jallal B. Type I interferon: potential
therapeutic target for psoriasis? // PLoS One. 2008. Т. 3. № 7. — C. e2737.
157. Ye S. Polymorphism in matrix metalloproteinase gene promoters: implication in
regulation of gene expression and susceptibility of various diseases // Matrix
Biol. 2000. Т. 19. № 7. — C. 623-9.
158. Yilmaz S.B., Cicek N., Coskun M., Yegin O., Alpsoy E. Serum and tissue levels
of IL-17 in different clinical subtypes of psoriasis // Arch Dermatol Res. 2012. Т.
304. № 6. — C. 465-9.
159. Zaba L.C., Cardinale I., Gilleaudeau P., Sullivan-Whalen M., Suarez-Farinas M.,
Fuentes-Duculan J., Novitskaya I., Khatcherian A., Bluth M.J., Lowes M.A.,
Krueger J.G. Amelioration of epidermal hyperplasia by TNF inhibition is
associated with reduced Th17 responses // J Exp Med. 2007. Т. 204. № 13. — C.
3183-94.
160. Zaman A.G., Helft G., Worthley S.G., Badimon J.J. The role of plaque rupture
and thrombosis in coronary artery disease // Atherosclerosis. 2000. Т. 149. № 2.
— C. 251-66.
161. Zhang X.J., Huang W., Yang S., Sun L.D., Zhang F.Y., Zhu Q.X., Zhang F.R.,
Zhang C., Du W.H., Pu X.M., Li H., Xiao F.L., Wang Z.X., Cui Y., Hao F.,
Zheng J., Yang X.Q., Cheng H., He C.D., Liu X.M., Xu L.M., Zheng H.F., Zhang
S.M., Zhang J.Z., Wang H.Y., Cheng Y.L., Ji B.H., Fang Q.Y., Li Y.Z., Zhou
F.S., Han J.W., Quan C., Chen B., Liu J.L., Lin D., Fan L., Zhang A.P., Liu S.X.,
Yang C.J., Wang P.G., Zhou W.M., Lin G.S., Wu W.D., Fan X., Gao M., Yang
B.Q., Lu W.S., Zhang Z., Zhu K.J., Shen S.K., Li M., Zhang X.Y., Cao T.T., Ren
W., Zhang X., He J., Tang X.F., Lu S., Yang J.Q., Zhang L., Wang D.N., Yuan
F., Yin X.Y., Huang H.J., Wang H.F., Lin X.Y., Liu J.J. Psoriasis genome-wide
association study identifies susceptibility variants within LCE gene cluster at
1q21 // Nat Genet. 2009. Т. 41. № 2. — C. 205-10.
162. Yang M., Du G.P., Wang L.Q., Wang X.P., Cui F.Z., Lu Y.J., Huang Y.F. [The
expression level of MMP-2 and collagen of hydroxyapatite modified titanium for
121
keratoprosthesis in the corneal stroma of rabbits] // Zhonghua Yan Ke Za Zhi.
2013. Т. 49. № 10. — C. 914-20.