На правах рукописи Веремеев Алексей Владимирович КОРРЕКЦИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ И
advertisement
На правах рукописи Веремеев Алексей Владимирович КОРРЕКЦИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ И РЕПЕРФУЗИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ МИОКАРДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ 14.03.03 – патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Кемерово 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» Сибирского отделения РАМН, Кемерово Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Журавлева Ирина Юрьевна Официальные оппоненты: Золоев Георгий Кимович – доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Новокузнецкий научно-практический центр медико-социальной экспертизы и реабилитации инвалидов Федерального медико-биологического агентства», генеральный директор Будаев Алексей Владимирович – доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, профессор кафедры патологической физиологии Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится «___»________2012 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.035.02 при ГБОУ ВПО КемГМА Минздравсоцразвития России по адресу: 650029, г.Кемерово, ул.Ворошилова, 22а С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО КемГМА Минздравсоцразвития России Автореферат разослан «___»________2012 года Ученый секретарь диссертационного совета, д-р мед. наук, профессор Разумов Александр Сергеевич 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Сохранение жизнеспособности миокарда при операциях на открытом сердце или при его пересадке продолжает оставаться одной из главных проблем кардиохирургии [Surendian A., 2009]. Для продления жизнедеятельности миокарда применяют различные методы консервации. В настоящее время наибольшее распространение получил метод кардиоплегической защиты, включающий гипотермическую и фармакологическую защиту [Allen D.G., 1985; Willund L., 1994]. В связи возрастанием информации о механизмах повреждения миокарда при ишемии и реперфузии появляются новые исследования, направленные на применение этих знаний в практике. Так как важнейшим повреждающим фактором ишемии и реперфузии является разрушение мембран из-за активации в них процессов перекисного окисления липидов, активно изучают защитные возможности различных антиоксидантов [Grattagliano I., 2008]. Рассматривают также возможности фармакологической коррекции энергетического обмена ишемизированного миокарда [Torchilin V.P., 2005; Verma D.D., 2006]. Для защиты от ишемических и реперфузионных повреждений может оказаться перспективными использование липосомальных препаратов [Panwar P., 2010]. За последнее время описаны десятки способов получения липосом [Sakai H., 2008]. В состав липосом удалось ввести как углеводные последовательности, так и белки («протеолипосомы»), что послужило поводом к созданию так называемых «иммунолипосом», специфичных к определенным лигандам [Gotoh T., 2008]. Получены липосомы, способные избегать защитных факторов организма, что значительно продляет время их циркуляции в кровотоке [Дорогова О.А., 2006]. Вместе с тем, пока нет общепринятых методов стандартизации полученных липосомальных препаратов, что затрудняет сопоставление результатов различных исследований, так как авторы используют липосомы, отличающиеся по размеру, составу, способу получения, что может повлиять на их фармакологические свойства. Включение биологически активных веществ в состав липосом позволяет вводить эти соединения непосредственно в клетку и предохраняет их от разрушения при нахождении в кровяном русле. Цель исследования: обосновать возможность применения липосомальных форм препаратов, относящихся к группам макроэргических 4 соединений и антиоксидантов и оценить их эффективность на экспериментальных моделях ишемических и реперфузионных повреждений миокарда. Задачи исследования 1. Выполнить комплексную оценку углеводно-энергетического обмена тотально ишемизированного миокарда при различных температурных режимах. 2. Исследовать поглощение и распределение липосом в миокардиоцитах в зависимости от температуры. 3. Оценить эффективность способа экструзии для получения и стандартизации липосомальных препаратов. 4. Оценить эффективность системного введения липосомальных препаратов. 5. Оценить эффективность интракоронарного введения липосомальных препаратов на модели перфузии изолированного сердца при различных температурных режимах. Научная новизна Установлено, что метод экструзии более приемлем для получения липосом, так как имеет ряд преимуществ: низкий уровень процессов ПОЛ, стабильный размер и состав липосом. Показано, что данный метод не влияет на активность веществ, включенных во внутреннюю фазу липосом. Установлено, что липосомы активно встраиваются в миокардиоциты и определяются, преимущественно, в митохондриях и грубых плазматических мембранах. Доказана возможность коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда с использованием липосом различного состава. Установлено, что липосомальные препараты антиоксидантов, введенные системно или интракоронарно, значительно восстанавливают функциональную активность миокарда после ишемии и последующей реперфузии. Практическая значимость Показана возможность получения липосом стандартного размера, со стабильной липидной фазой и внутренним составом. Показана эффективность применения липосомальных препаратов при ишемии-реперфузии миокарда. Установлено, что при системном и интракоронарном введении липосом, содержащих антиоксиданты в значительной степени сохраняется функциональная активность сердца. Положения, выносимые на защиту 1. Метод экструзии позволяет получить липосомы стандартного диаметра и состава с заданно низким уровнем содержания продуктов перекисного окисления липидов. 5 2. Липосомы активно включаются в субклеточные структуры миокардиоцитов и распределяются в основном в цитоплазматической мембране и мембране митохондрий. 3. Введение α-токоферола в состав липидной фазы липосом стабилизирует липосомальную мембрану и значительно ограничивает процессы липопероксидации в ней. 4. Липосомальные препараты антиоксидантов и макроэргических фосфатов эффективно предотвращают ишемические и реперфузионные повреждения миокарда как при системном, так и при интракоронарном введении. Введение результатов исследования в практику Научные положения и практические рекомендации, сформулированные в диссертации, введены в научную деятельность ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН, в учебнометодический процесс кафедры кардиологии и сердечно-сосудистой хирургии ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Апробация работы Материалы настоящего исследования были доложены и обсуждены на VIII международном конгрессе по адаптивной медицине (ISAM) (Москва, 2006), XIII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007), III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), Международном форуме по нанотехнологиям «RUSNANOTECH» (Москва, 2008), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ 2010» (Москва, 2010), XIV ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева (Москва, 2010), Первом Российско-Греческом симпозиуме «Biomaterials and bionanomaterials: recent adnances and safety – toxicology issues» (Гераклион, Греция, 2010), 60-м конгрессе европейского общества кардиоваскулярных и эндоваскулярных хирургов (ESCVS) (Москва, 2011). Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Объем и структура работы Работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация изложена на 157 страницах текста, 6 содержит 9 таблиц и 53 рисунка. Указатель использованной литературы содержит 190 источников. Личный вклад автора Анализ данных литературы по теме диссертации, биохимические исследования, оценка и статистическая обработка результатов, написание диссертации выполнены лично автором. Проведение экспериментов на открытом сердце, разработка технологии получения липосом и оценка метаболизма миокарда при ишемии и реперфузии проведены совместно с канд. биол. наук Р.А. Мухамадияровым и канд. биол. наук Н.Л. Воронцовой, которым автор выражает глубокую признательность. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. Эксперименты проведены на 529 взрослых крысах-самцах линии Wistar с массой тела 300-450 г. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями, изложенными в Приказе N 755 МЗ СССР от 12 августа 1977г. Под тиопенталовым наркозом (50 мг/кг) животным вскрывали грудную клетку, извлекали сердца, быстро фиксировали их на аортальной канюле и начинали перфузию по Langendorff. Перфузия изолированного сердца. В течение 15 минут сердце перфузировали оксигенированным раствором Кребса-Хензеляйта при 370С и давлении 90 см вод.ст., после чего переходили на антеградную перфузию через канюлю, введенную в левое предсердие, при постоянном давлении 12 см вод.ст. На 10-15 минуте работы сердца регистрировали аортальный выброс и коронарный поток, отбирали аликвоту оттекающего от сердца перфузата для определения активности лактатдегидогеназы (ЛДГ). После подготовительного этапа моделировали нормотермическую ишемию миокарда путем перекрывания всех перфузат-несущих магистралей; сердце при этом погружали в термостатируемую камеру с перфузатом. Использовали модель тотальной тепловой ишемии в течении 30 минут и последующей 15-минутной реперфузии в режиме коронарной перфузии по Langendorff. Через 10 мин реперфузии через аортальную канюлю вводили 1 мл раствора Кребса-Хензеляйта, содержащего 10-8М адреналина. Для регистрации метаболических изменений в динамике сердца забирали после 5, 10, 20 и 30 минут ишемии, а также на 5, 10 и 15 минутах реперфузии, быстро замораживали в жидком азоте для последующего исследования. Кроме того, на 5, 10 и 15 мин реперфузии отбирали аликвоты оттекающего перфузата для определения ЛДГ. С помощью установки для исследования изолированного сердца (ТОО «Топаз», Россия) регистрировали 7 электрограмму (хлорсеребряными электродами) и силу сокращения сердца (фотоэлектрическим изометрическим датчиком). По кривой силы сокращения определяли силу натяжения сердца, закрепленного на аортальной канюле перфузионной системы; максимальную силу сокращения (Fmax); максимальную скорость сокращения (МСС); максимальную скорость расслабления (МСР). По электрограмме оценивали длительность периода нарушений ритма сердца во время реперфузии [Ласукова Т.В., 2009]. Биохимические методы. Концентрацию АТФ определяли энзиматическим методом (набор BioVision Inc., США). Определение содержания малонового диальдегида в ткани миокарда проводили в реакции с α-тиобарбитуровой кислотой [Стальная И.Д., 1977]. Для оценки содержания ДК и ТК проводили спектрофотометрическое измерение оптической плотности гексановых экстрактов против исходного н-гексана при длинах волн 233 нм и 268 нм и длине референтной волны 215 нм [Klein I., 1990]. Активность каталазы (КАТ) измеряли по скорости разложения перекиси водорода [Королюк М.А., 1987]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) в гомогенатах миокарда оценивали методом, основанным на способности данного фермента ингибировать автоокисление адреналина [Мальцев Г.Ю., 1994]. Активность ЛДГ в оттекающем от сердца перфузате определяли с использованием диагностических наборов DiaSys (Германия). Содержание глюкозы оценивали глюкозооксидазным методом по образованию перекиси водорода (DiaSys, Германия); лактата – по нарастанию НАДН в лактатдегидрогеназной реакции в гидразин-глициновом буфере (DiaSys, Германия). Активность тритий-меченых липосом измеряли на жидкостно-сцинтилляционном счетчике RackBeta-II (LKB, Швеция) [Журавлева И.Ю., 1995]. Получение липосом методом ультразвуковой сонификации. Для приготовления мультиламмелярных везикул использовали метод, основанный на получении липидной пленки на внутренней поверхности стеклянной колбы с последующим ее ресуспендированием в водных средах [Omoi N., 2006]. Суспензию мультиламмелярных везикул подвергали воздействию ультразвука (ультразвуковой дезинтегратор «type UD-20», TECHPAN, Poland). Суммарное время озвучивания составляло 12 мин. Осаждали сохранившиеся мультиламеллярные везикулы методом центрифугирования в рефрижераторной центрифуге при 10000 g в течение 15 мин. Измеряли оптическую плотность 1% раствора липосом в диапазоне волн 400-780 нм на спектрофотометре Ultraspec Plus (Pharmacia-LKB, Biochrom Ltd., Великобритания) и рассчитывали размер липосом [Безрукова А.Г., 1981]. 8 Получение липосом методом экструзии. Использовали лабораторный экструдер («Lipex», Biomembranes Inc., Canada), в котором мультиламмелярные везикулы продавливали через два слоя поликарбонатного фильтра с диаметром пор 100 или 50 нм; избыточное давление создавали сжатым аргоном. С целью увеличения включения активных веществ во внутреннюю водную фазу липосом вводили дополнительную стадию гидратации липидов путем замораживания – оттаивания [Mayer L.D., 1985]. Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью программы STATISTICA версии 8.0.360.0 компании StatSoft, Inc (США). Применялись стандартные параметры описательной статистики при распределении, отличном от нормального. Проверка статистической гипотезы о нормальности распределения осуществлялась с использованием критерия Шапиро-Уилка. Использованы следующие методы статистического анализа: Uкритерий Манна-Уитни или метод Колмогорова-Смирнова – с целью сравнения двух независимых групп по количественному признаку; дисперсионный анализ Краскала-Уоллиса – с целью сравнения трех и более независимых групп по количественному признаку. Расчет медианы, интерквартильного размаха, средней и стандартной ошибки средней использован для описания центральных тенденций и дисперсий. Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости р принимался менее 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Установлено, что уже через час ишемической экспозиции при 250C и 140С тканевая концентрация креатинфосфата (КФ) достоверно снижалась на 50,8%, а АТФ на 63,1% (p<0,05). При 40С отрицательный пик концентрации МЭФ наблюдали через 2 часа наблюдения, при этом концентрация АТФ составила 57,7% от исходных значений, а концентрация КФ – 62,5% (p<0,05) (табл. 1). В дальнейшем, концентрация МЭФ при 250С и 40С демонстрировала линейное возрастание до контрольных значений (к 4-му часу при 250С и к 6-му – при 40С). В последующем происходило достоверное снижение концентрации МЭФ в данных группах. 9 Т а б л и ц а 1 – Состояние углеводно-энергетического метаболизма и концентрация продуктов липопероксидации в изолированном миокарде крыс при различных температурах ишемической экспозиции Время ишемической экспозиции Показатель АТФ, мкмоль/г КФ, мкмоль/г Лактат, мкмоль/г ДК, нмоль/г МДА, нмоль/г 40С 140С 250С 40С 140С 250С 40С 140С 250С 40С 140С 250С 40С 140С 250С 40С 140С 250С Исходные значения 7,19±0,41 7,19±0,41 7,19±0,41 13,6±0,92 13,6±0,92 13,6±0,92 510±26 510±26 510±26 14,74±1,4 14,74±1,4 14,74±1,4 7,68±0,64 7,68±0,64 7,68±0,64 0,88±0,16 0,88±0,16 0,88±0,16 1 час 2 часа 4 часа 6 часов 8 часов 5,6±0,24 2,65±0,7 5,68±0,55 10,95±1,52 6,69±0,34 7,39±0,85 240±22 122±21 52±6 29,4±3 33,5±2,5 57,2±6,4 11,02±0,79 13,56±2,05 15,49±0,80 1,35±0,31 1,02±0,25 1,68±0,05 4,15±0,6 4,13±0,57 7,29±0,98 8,5±1,4 9,92±1,52 10±1,21 160±29 131±12 97±21 27,2±6,3 36,2±1,9 64,8±9,6 9,46±1,15 13,79±0,78 16,84±0,46 1,38±0,33 1,4±0,16 1,5±0,13 5,06±0,49 3,94±0,71 8,76±1,08 14,8±2,3 9±0,98 12,86±0,64 256±29 159±15 136±33 41,2±3,2 37,6±2,3 43,96±2,7 9,99±0,89 14,13±1,25 11,44±0,79 1,4±0,09 1,86±0,04 3,19±0,40 8,54±0,8 6,93±1,05 4,64±0,49 18,37±2,12 8,83±0,89 9,45±0,89 284±14 226±26 215±15 44,3±3,7 39,2±2,7 42,4±2,9 12,68±0,48 14,40±0,62 10,75±1,34 2,57±0,11 2,44±0,16 3,24±0,22 5,02±0,42 6,76±1,07 3,54±0,21 5,63±1,24 6,97±0,94 7,05±1,09 311±18 254±25 222±12 42,1±4,3 39±2,6 34,7±2,6 14,17±1,01 11,40±0,65 11,85±0,77 1,79±0,07 2,21±0,12 2,51±0,35 9 Глюкоза, мг/100 г Режим 10 При 140С наблюдали иную закономерность. Так, концентрация АТФ восстанавливалась к 6-му часу ишемии и до конца наблюдения достоверно не отличалась от исходных значений (p>0,05) (табл. 1). Установлено, что через час ишемической экспозиции при 250С тканевая концентрация глюкозы достоверно снизилась на 90%, при 140С – на 75%, а при 40С – лишь на 50% и продолжала снижаться вплоть до 2-го часа наблюдения (табл. 1). Параллельно с расходованием глюкозы наблюдали возрастание концентрации лактата: на 280% при 250С, на 136% при 140С и на 11% при 40С. В последующие часы концентрация глюкозы при всех температурах недостоверно увеличивалась. Уровень лактата при 250С продолжал нарастать до 2-го часа ишемии, после чего достоверно снижался, и эта тенденция сохранялась до окончания периода наблюдения. В противоположность этому, в сердцах, инкубированных при 40С, концентрация лактата достоверно возрастала на 64,9%, а при 140С – на 16%. Установлено, что ишемия активирует процессы ПОЛ при всех использованных режимах гипотермии. Уже в течение первого часа инкубации отмечали быстрое достоверное нарастание содержания ДК в миокарде. Это увеличение было наиболее выраженным при температуре 250С и наименьшим при 40С. При 140С после 6 часов ишемии отмечалось достоверное снижение содержания ДК (табл. 1). Концентрация МДА в миокарде достигала максимума к 6-му часу при температурах 40С и 140С, а при 250С – к 4-му часу и сохранялась на высоком уровне вплоть до 6-го часа ишемии. Далее подъем содержания МДА сменялся его снижением. При 140С и 250С повышение концентрации МДА несколько «запаздывало» по сравнению с ДК. Одновременно с увеличением содержания в ткани продуктов ПОЛ отмечали изменение активности антиоксидантных ферментов – СОД и КАТ. При температуре 250С наблюдали достоверное повышение активности СОД (в 2.5 - 3,0 раза), достигающее максимума к 2-му часу ишемии (табл. 2). Далее происходило постепенное снижение ее активности до 79,7% от исходных значений. Кинетика изменения активности СОД при 140С была аналогичной, но характеризовалась меньшей амплитудой. При 40С активность СОД была достоверно ниже исходного уровня на протяжении всего периода наблюдения. Изменение активности каталазы в целом носило аналогичный характер, но происходило с некоторым отставанием по времени. Так, если активность СОД при 140С и 250С достигала максимума через 2 часа инкубации, то активность КАТ - через 4 часа при 250С и через 6 часов при 140С. При 40С активность КАТ достоверно не отличалась от контрольных значений. 11 Т а б л и ц а 2 – Активность антиоксидантных ферментов в изолированном миокарде крыс при различных температурах ишемической экспозиции Время ишемической экспозиции Показатель Режим Исходные 2 часа 6 часов 8 часов значения 4 0С 395,6±27,1 204,8±39,4 216,8±71,2 209±37,2 СОД, 140С 395,6±27,1 886,6±76,5 340,8±57,8 274,4±24,0 нмоль/мин/г 250С 395,6±27,1 1175,7±46 662,7±35,0 315,3±95,5 Каталаза, мкмоль/мин/г 4 0С 13,67±0,8 15,95±1,86 18,13±0,91 14,94±1,04 140С 13,67±0,8 19,43±0,73 33,49±1,56 23,20±0,38 250С 13,67±0,8 19,10±0,59 26,87±0,92 24,09±1,39 Таким образом, снижение температуры приводит к уменьшению расхода энергии, но активизирует повреждение мембран. По-видимому, оптимальным уровнем охлаждения миокарда является 140С, при котором возможно сохранение баланса ПОЛ-АОС. В связи с полученной информацией о патофизиологических механизмах ишемических и реперфузионных повреждений был предложен подход к антиишемической защите миокарда, включающий введение липосомальных препаратов антиоксидантов и макроэргических фосфатов. Способ получения липосом был выбран на основании сравнительной оценки двух методов – ультразвуковой сонификации (УЗС) и экструзии. Основными критериями служили интенсивность процессов ПОЛ в липосомальной мембране и сохранение активности включенных в липосомы биологически активных веществ. Было установлено, что исходная концентрация МДА в группах липосом, полученных методом УЗС, достоверно превышает данный показатель в липосомах, приготовленных методом экструзии в 3 раза (p<0,05). Была выполнена попытка ограничения липопероксидации введением в состав липосомальной мембраны α-токоферола. Действительно, α-токоферол предотвращал накопление МДА, ДК и ТК в процессе получения липосом, вне зависимости от способа. Так, исходные значения содержания МДА в липосомах с α-токоферолом, были в 9 раз ниже, чем в стандартных липосомах (p<0,05). Концентрации ДК и ТК в липосомах с α-токоферолом на всем протяжении эксперимента (72 часа) были достоверно ниже значений в стандартных липосомах в 2 раза (p<0,05). 12 Установлено, что при экструзии активность СОД и КАТ, а также концентрация глутатиона, цитохрома С и α-токоферола, включенных в липосомы, снижается недостоверно. В то же время, при сонификации активность КАТ, достаточно большой и разветвленной молекулы, падает приблизительно в 20 раз (p<0,05), а концентрация цитохрома С достоверно снижается на 11% по сравнению с исходной (p<0,05). Было показано, что температура 40С является оптимальной для хранения полученных липосомальных препаратов, так как концентрация продуктов липопероксидации не отличалась от исходных значений вплоть до 72 часа наблюдения. Повышение температуры хранения препаратов до 250С способствует активации процессов ПОЛ в липосомах, полученных как методом экструзии, так и методом УЗС. Так, на протяжении 72 часов наблюдали значимое нарастание концентрации МДА в липосомах, хранившихся при 250С в 2,9 раза (p<0,05). Было показано, что включение и распределение липосом в ишемизированном миокарде зависит от их концентрации, липидного состава и температуры ишемической экспозиции. Сравнивали два вида липосом: «жесткие», с соотношением ФХ:Х – 7:5 и «мягкие» с подобным соотношением 2:1. Липосомы вводили в концентрации 10 мг/мл и 25 мг/мл При температуре 40С в миокард включалась 17-20% введенных липосом (рис. 1). Однако приблизительно половина их была обнаружена в цитоплазматических мембранах, лишь одна третья часть – в мембранах митохондрий, и только 3-6% – в микросомальных мембранах. Р и с у н о к 1 – Суммарное включение в миокард 3Н-меченых липосом с различными концентрациями липидов (25 или 10 мг/мл) и отношениями их массовых долей ФХ:Х (7:5 или 2:1) по субклеточным фракциям при различной температуре 13 При нормотермической ишемии в группе, где использовали липосомы с соотношением липидов ФХ:Х равным 2:1 в концентрации 25 мг/мл, включение их в миокард было достоверно ниже в 2,5-3 раза (p<0,05), чем в трех остальных (рис. 1). Максимальное же включение было отмечено при использовании липосом в концентрации 10 мг/мл с соотношением ФХ:Х=2:1. Распределение 3 Н-ФХ по субклеточным фракциям в данной группе также представляется оптимальным. Так, в митохондриальной фракции было обнаружено 61±6% включенной метки, микросомальной – 4±1%, и лишь 27±3% - во фракциях грубых мембран. При гипотермии 140С максимальное включение липосом в миокард достигнуто при использовании концентрации липидов 10 мг/мл, причем для липосом с ФХ:Х=7:5 оно было наивысшим и составило 23±3% (рис. 1). В данной группе 45±4% липосом включались в грубые плазматические мембраны, 29±4% – в митоходриальную и 6±1% – микросомальную фракции. Таким образом, для предупреждения и коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда были выбраны липосомы с соотношением ФХ:Х равным 7:5 в концентрации 25 мг/мл. Липосомальные препараты разделили на группы: «антиоксидантные» липосомы (в состав внутренней фазы включали СОД и ГТ, а в мембрану- α-токоферол), «энергетические» липосомы (содержащие во внутренней фазе АТФ и КФ) и «пустые» липосомы (содержащие во внутренней фазе 0,9% NaCl). В эксперименте на крысах при системном введении АЛ в значительной степени предупреждали развитие ишемических и реперфузионных повреждений изолированного сердца. Об этом свидетельствует, наблюдавшиеся при реперфузии, достоверное увеличение на 39,9% величины максимальной силы сокращения (р<0,05), достоверно меньшая длительность аритмий на 40% (р<0,05) и значимое снижение в 2 раза активности ЛДГ в оттекающем перфузате (р<0,05) (рис. 2) по сравнению с показателями в контроле. После введения адреналина на 10-й минуте реперфузии Fmax в группе АЛ была достоверно выше показателей в контроле на 32,8% (р<0,05). Кроме того в данной группе наблюдали восстановление МСС на 75,9% (р<0,05) и МСР на 76,3% (р<0,05) (табл. 3). В результате системного введения липосом, содержащих макроэргические фосфаты, наблюдали достоверное ограничение длительности нарушений ритма сердца на 71,3% (р<0,05), значимое увеличение силы сокращения на 20% (р<0,05) и достоверное снижение активности ЛДГ в 1,5 раза (р<0,05) по сравнению с контролем (табл. 3, рис. 2). 14 Сила сокращения, длительность аритмий и активность ЛДГ в группе ПЛ достоверно (р<0,05) отличались от аналогичных показателей в контрольной группе на 24,6%, 13,7% и 9,7% соответственно. После интракоронарного введения липосомальных препаратов, воспроизведения 30-минутной ишемии и возобновления перфузии в контрольной группе происходило восстановление максимальной силы сокращения на 57,8%; в группе ПЛ – на 78,5%; в группе ЭЛ – на 44,9% (табл. 4). В то же время в группе сердец, в которой для защиты использовали антиоксиданты (АЛ) максимальная сила сокращения после цикла ишемии реперфузии достоверно не отличалась от исходных показателей. * - р<0,05 по сравнению с контролем Р и с у н о к 2 – Активность ЛДГ в перфузате после предварительного системного введения липосомальных препаратов, 30-минутной ишемии и последующей 10-минутной реперфузии Величина МСС в контрольной группе сердец после цикла ишемияреперфузия составила 40,9% от исходного уровня. В группе ЭЛ данный показатель восстанавливался до уровня 44,0%, ПЛ – до уровня 61,0%. При использовании АЛ данный показатель достоверно не отличался от исходного уровня и составил 83,3% от исходных значений. Схожая динамика наблюдалась и при регистрации МСР миокарда. Так, в контрольной группе и группе ЭЛ процент восстановления составил 31,5% и 35,0% соответственно. В группе ПЛ – 47%. 15 Т а б л и ц а 3 – Сило-скоростные показатели деятельности миокарда и активность ЛДГ после предварительного системного введения липосомальных препаратов, 30-минутной ишемии и последующей 10-минутной реперфузии F max, г МСС, г/с МСР г/с Исходные значения После И-Р Длительность нарушений ритма, сек 20,62±2,98 13,01±2,24 15,86±2,77 6,92±1,02 328±14 5,42±1 4,07±0,55 25,63±3,20 19,47±1,81 16,35±3,29 12,48±2,09 197±28 8,06±0,75 5,84±0,65 3,31±0,97 22,51±2,42 16,36±2,01 16,29±2,26 9,37±1,30 94±34 6,74±0,7 6,91±0,41 3,25±0,86 23,22±2,73 13,95±3,25 18,55±3,33 9,86±2,40 283±55 5,83±0,6 Группы Исходные значения После И-Р Контроль 6,14±0,75 2,45±0,39 АЛ 6,94±0,51 ЭЛ ПЛ После И-Р F max.адр, г 4 – Сило-скоростные показатели деятельности миокарда после интракоронарного введения липосомальных препаратов, 30-минутной ишемии и последующей 10-минутной реперфузии F max, г МСС, г/с МСР г/с Исходные значения После И-Р Исходные значения После И-Р Исходные значения После И-Р Длительность нарушений ритма, сек Контроль 10,2±0,7 5,9±0,9 43,9±4,7 17,6±2,3 32,0±5,3 10,1±1,1 357±59 7,5±0,8 АЛ 10,9±1,4 9,1±0,9 47,2±9,3 39,3±6,2 35,9±5,9 28,0±3,1 73±26 11,6±0,2 ЭЛ 10,9±0,5 4,9±0,6 43,0±5,2 19,1±2,4 37,1±5,2 13,0±1,3 379±79 9,4±0,9 ПЛ 10,7±0,9 8,4±0,9 49,0±7,8 29,9±6,5 41,3±8,4 19,7±3,3 135±19 10,5±0,5 Группы F max.адр, г 15 Таблица Исходные значения 16 В группе АЛ максимальная скорость расслабления после ишемииреперфузии составила 78,0% от исходных показателей, при этом различия были не достоверными (р>0,05) (табл. 4). Однократное интракоронарное введение адреналина в дозе 10-8 М/мл на 11 минуте репефузии вызвало повышение Fmax у всех сердец. При этом величина данного показателя у сердец группы ЭЛ была наименьшей. Максимальную же реакцию на введение адреналина наблюдали в группе, где для защиты миокарда использовали АЛ (табл. 4). Для оценки аритмогенного эффекта ишемии и последующей реперфузии использовали суммарную длительность аритмий, длительность конкретного вида аритмий и процент наблюдения аритмий в группах. Так в первые минуты постишемической реперфузии наблюдали различные нарушения ритма сердца: атрио-вентрикулярный блок (А-В), желудочковую тахикардию (ЖТ) и фибрилляцию желудочков (ФЖ). Наибольшую аритмогенную активность демонстрировали сердца контрольной группы и группы ЭЛ. В группе ПЛ данный показатель составлял 78,7% от контроля. В контрольной и ЭЛ группах после цикла ишемияреперфузия были отмечены все вышеперечисленные виды аритмий. В контрольной группе у 70% сердец развивалась ЖТ, у 60% - А-В и у 10% - ФЖ. В то же время, в группе ЭЛ у всех сердец развивалась ЖТ и А-В и у 60% - ФЖ. У сердец групп ПЛ и АЛ тахиаритмии (ЖТ и ФЖ) не наблюдали вообще. В данных группах были отмечены лишь А-В-блокады, но у всех сердец. Общая длительность периода реперфузионных аритмий также была различной в разных группах и наибольшей была у сердец группы ЭЛ, и наименьшей - у сердец групп ПЛ и АЛ. Таким образом, было показано, что в результате интракоронарного и системного введения липосом в условиях нормотермической ишемии наилучшим защитным эффектом обладали липосомы с антиоксидантами. В данных группах отмечено наилучшее сохранение максимальной силы сокращения, МСС, МСР, значительное увеличение силы сокращения в ответ на введение адреналина. Кроме того, данный препарат в значительной степени предотвращал развитие фибрилляций желудочков и желудочковых тахикардий. ВЫВОДЫ 1. Ишемия и последующая реперфузия приводят к значительному нарушению сократительной функции сердечной мышцы, угнетению энергетического метаболизма и интенсификации процессов ПОЛ. Основной 17 деструктивный эффект связан с процессами липопероксидации. Динамика метаболизма и степень повреждения мембран миокардиоцитов напрямую зависят от температуры ишемической экспозиции. Оптимальным 0 температурным режимом является 14 С; при этом сохраняется баланс ПОЛ/АОС наряду с умеренным расходованием пула МЭФ. 2. Липосомы, введенные в ишемизированный миокард при температурах 0 4 С, 140С и 370С, включаются в миокардиальную ткань, распределяясь в различных соотношениях между фракциями грубых цитоплазматических мембран, митохондриальной и микросомальной. Интенсивность включения липосом в миокардиоциты и распределение их по субклеточным фракциям в значительной степени зависят от концентрации, липидного состава и температурного режима. 3. Как экструзия, так и ультразвуковая сонификация могут быть использованы в качестве способа получения липосомальных препаратов сложного состава. Однако, липосомы, полученные методом экструзии, характеризуются достоверно более низким содержанием продуктов ПОЛ, стандартным диаметром и стабильностью внутреннего состава. 4. При предварительном системном введении наиболее выраженный защитный эффект оказывают липосомы с заключенными в них природными антиоксидантами, что проявляется восстановлением функциональной активности миокарда, уменьшением длительности периода реперфузионных аритмий и низким показателем выхода внутриклеточных ферментов. 5. При интракоронарном введении наиболее выраженное антиишемическое воздействие оказывает липосомальная форма комплекса природных антиоксидантов, что проявляется значительным восстановлением сократимости миокарда в постишемическом периоде, как при нормо-, так и при гипотермии; отсутствием реперфузионных аритмий и стабильностью мембранных структур миокардиоцитов. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для оценки степени повреждения миокарда при ишемии и реперфузии рекомендовано использовать комплекс методов, включающий, как минимум, оценку состояния гликолиза (уровень ПВК, лактата, глюкозы); энергетического метаболизма (уровень АТФ, ФК); показатели системы ПОЛ-АОЗ (концентрацию МДА, ДК и ТК, активность СОД и каталазы); выброс внутриклеточных ферментов в перфузат (ЛДГ и КФК). 18 2. Для оценки функционального состояния изолированного сердца после ишемии рекомендовано производить анализ физико-механической деятельности миокарда: Fmax, МСС, МСР, оценивать длительность нарушений ритма сердца. 3. В качестве технологии получения липосомальных препаратов предпочтительно использование экструзии, которая позволяет приготовить липосомы, стандартизованные по размеру и составу, с низким содержанием продуктов липопероксидации. 4. При приготовлении липосом рекомендовано вводить дополнительный компонент – α-токоферол. Присутствие этого соединения в составе препарата стабилизирует липосомальную мембрану и значительно ограничивает процессы ПОЛ. 5. Полученные липосомальные препараты рекомендовано хранить при 40С. При данном уровне температуры значительно снижается интенсивность процессов липопероксидации при сохранении структуры и целостности липосом. 6. Для предотвращения повреждений, сохранения и восстановления функций изолированного сердца после ишемии и последующей реперфузии целесообразно использовать липосомы, содержащие в своем составе комплекс природных антиоксидантов. Липосомальные препараты антиоксидантов в значительной степени восстанавливают сократимость миокарда после ишемииреперфузии и ограничивают развитие реперфузионных аритмий. СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК 1. Влияние α-токоферола на динамику процессов липопероксидации в липосомах, полученных методами ультразвуковой сонификации и экструзии, при различных температурах хранения / Р. А. Мухамадияров, А. В. Веремеев, Н. Е. Марцияш, В. Г. Зинчук // Фундаментальные исследования. – 2012. – №6. – С. 566-570. 2. Клиническая и прогностическая значимость интерлейкина-12 у пациентов с инфарктом миокарда / М. В. Зыков, О. Л. Барбараш, В. В. Кашталап, А. В. Веремеев // Медицинская иммунология. – 2011. – Т. 13, № 2-3. – С. 219-226. 19 3. Nanotechnology and nanomaterials: use of vascular nanosystems for ischemic heart injury repair / R.A. Mukhamadiyarov, A.V. Veremeev, I.Yu. Zhuravleva // Journal of International Scientific Publications: Materials, Methods & Technologies. – 2012. – Vol.6. – P. 392-400. Публикации в рецензируемых журналах 4. Приготовление липосом сложного состава методами ультразвуковой сонификации и экструзии и их сравнительные характеристики / Р. А. Мухамадияров, А. В. Веремеев, И. Ю. Журавлева и др. // Медицинский вестник Башкортостана. – 2006. – № 1. – С. 259-263. 5. Мухамадияров, Р. А. Оценка безопасности применения липосомальных препаратов на модели изолированного сердца / Р. А. Мухамадияров, А. В. Веремеев, И. Ю.Журавлева // Медицина в Кузбассе. – 2008. Спецвып. № 9. – С. 65-66. Материалы конференций 6. Мухамадияров, Р. А. Динамика включения и субклеточного распределения липосом в изолированном миокарде, как показатель перспективы их применения для коррекции ишемических повреждений сердца / Р. А. Мухамадияров, А. В. Веремеев, И. Ю. Журавлева // Материалы Российского национального конгресса кардиологов. – М., 2010. – С. 228-229. 7. Мухамадияров, Р. А. Субклеточное распределение липосом в миокарде, как показатель перспективы их применения для клеточной и генной терапии ишемических повреждений сердца / Р. А. Мухамадияров, А. В. Веремеев // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии : материалы IV Всероссийского симпозиума. – С.-Пб., 2010. – С. 98-99. 8. Мухамадияров, Р. А. Эффективность интракоронарного введения липосом в условиях тотальной нормотермической ишемии и последующей реперфузии в эксперименте / Р. А. Мухамадияров, А. В. Веремеев, И. Ю. Журавлева // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. – 2010. – Т.11, №3. – С. 304. 9. Воронцова, Н. Л. Влияние гипотермии на состояние миокардиоцитов изолированного сердца / Н. Л. Воронцова, А. В. Веремеев, Р. А. Мухамадияров // Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. – 2007. – Т.8, №6. – С. 208. 10. Мухамадияров, Р. А. Сравнительное исследование интракоронарного и системного введения липосомальных препаратов для предотвращения ишемических и реперфузионных повреждений изолированного сердца / Р. А. 20 Мухамадияров, А. В. Веремеев, И. Ю. Журавлева // Сибирский медицинский журнал. – Томск, 2007. – №1. С. 87-88. 11. Мухамадияров, Р. А. Характеристика липосом, полученных методами ультразвуковой сонификации и экструзии / Р. А. Мухамадияров, А. В. Веремеев // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. – 2007. – № 62. – С. 187-190. 12. Veremeev, A. V. Lipoperoxidation level in liposomes as safety index of their implementation / A. V. Veremeev, R. A. Mukhamadiarov, I. Yu. Zhouravleva // Biomaterials and Nanobiomaterials: Recent advances safety and toxicology issues : Matherials of 1st Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientists School. – Heraclion, 2010. – P. 54-55. 13. Veremeev A. V. The way of correction of ischemic and reperfusion defects in myocardium using vesicular nanosystems / A. V. Veremeev, R. A. Mukhamadiarov, I. Yu. Zhouravleva // Biomaterials and Nanobiomaterials: Recent advances safety and toxicology issues : Materials of 1st Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientists School. – Heraclion, 2010. – P. 41. 14. Use of liposome preparations for ischemic and reperfusion damages of myocardium / R. A. Mukhamadiarov, I. G. Khaliulin, A. V. Veremeev et al. // International society for adaptive medicine (ISAM) : VIII World congress. – Moscow, 2006. – P. 155. 15. Veremeev, A.V. Correction of ischemic and reperfusion defects in myocardium using liposomal forms of antioxidants / A. V. Veremeev, R. A. Mukhamadiarov, I. Yu. Zhouravleva // 60th international congress of European society for cardiovascular and endovascular surgery (ESCVC). – Moscow, 2011. – P. S107. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ Fmax α-ТФ А-В АОЗ АЛ ДК ЖТ – максимальная сила сокращения – α-токоферол – атриовентрикулярная блокада – антиоксидантная защита – липосомы с антиоксидантами – диеновые коньюгаты – желудочковая тахикардия 21 КАТ КФ ЛДГ МДА МСР МСС ПЛ ПОЛ СОД ТК УЗС ФЖ ЭЛ – каталаза – креатинфосфат – лактатдегидрогеназа – малоновый диальдегид – максимальная скорость расслабления – максимальная скорость сокращения – «пустые» липосомы – перекисное окисление липидов – супероксиддисмутаза – триеновые коньюгаты – ультразвуковая сонификация – фибрилляция желудочков – липосомы с макроэргичекими фосфатами
