008039 - 1 - Предпосылки изобретения Эндогенный легочный

008039
Предпосылки изобретения
Эндогенный легочный сурфактант снижает поверхностное натяжение на поверхности раздела воздух-жидкость альвеолярной выстилки, предотвращая коллапс легкого в конце выдоха. Дефицит сурфактанта представляет собой распространенное нарушение у недоношенных детей и является причиной респираторного дистресс-синдрома (respiratory distress syndrome, RDS), который может быть эффективно
излечен препаратами, представляющими собой липидные экстракты измельченного легкого млекопитающего, или посредством легочного лаважа. Указанные препараты известны как модифицированные
природные сурфактанты, и они состоят главным образом из фосфолипидов (PL), таких как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (РЕ) и фосфатидилглицерин (PG), и гидрофобных сурфактантных
белков В и С (SP-B и SP-C).
Более конкретно, список PL, упоминаемых в этой заявке на патент, выглядит следующим образом:
фосфатидилхолин: PC,
фосфатидилэтаноламин: РЕ,
фосфатидилглицерин: PG,
фосфатидилинозит: РI,
фосфатидилсерин: PS,
сфингомиелин: SM,
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин, в общем случае известный как дипальмитоилфосфатидилглицерин: DPPG,
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, в общем случае известный как дипальмитоилфосфатидилхолин: DPPC,
1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин, в общем случае известный как пальмитоилолеил-фосфатидилглицерин: POPG,
1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфохолин, в общем случае известный как пальмитоил-олеилфосфатидилхолин: РОРС,
1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин, в общем случае известный как диолеилфосфатидилглицерин: DOPG,
1-пальмитоил-2-линолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин, в общем случае известный как пальмитоиллинолеил-фосфатидилхолин: PLPC,
1-стеароил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин, в общем случае известный как стеароиларахидоноил-фосфохолин (SAPC),
1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (РАРС),
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, в общем случае известный как дипальмитоилфосфатидилэтаноламин: DPPE,
1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, в общем случае известный как дистеароилфосфатидилэтаноламин: DSPE,
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин, в общем случае известный как дипальмитоилфосфатидилсерин: DPPS.
Глицериновые группировки фосфолипидов в основном этерифицированы жирными кислотами с
длинной цепью (С14-С20), которые в свою очередь могут быть насыщенными (например миристиновая,
пальмитиновая и стеариновая кислота), мононенасыщенными (например олеиновая кислота) или полиненасыщенными (например линолевая и арахидоновая кислота).
Фосфолипиды, содержащие в качестве характерных остатков нейтральные или цвиттер-ионные
группировки, такие как глицерин (PG), инозит (PI) и серин (PS), известны как кислые фосфолипиды.
Другими примерами кислых фосфолипидов являются DPPG, POPG и DPPS.
Сурфактанты обычно вводят недоношенным детям в виде водных суспензий посредством инстилляции в легкие через трахею. Они также могут быть введены взрослым, пораженным различными патологиями, включающими тяжелую легочную недостаточность, такую как респираторный дистресссиндром взрослых (adult respiratory distress syndrome, ARDS).
Для того чтобы обладать оптимальными с биофизической и фармакологической/терапевтической
точки зрения свойствами, препарат сурфактанта должен:
1) эффективно снижать поверхностное натяжение; 2) обладать удовлетворительной скоростью распространения; 3) иметь вязкость, достаточно низкую для обеспечения возможности приготовления концентрированной суспензии в водной среде с оптимальными показателями доставки и распределения на
альвеолярном уровне при введении в небольшом объеме посредством внутритрахеальной инстилляции.
Способность сурфактантов к снижению поверхностного натяжения, равно как и другие параметры,
такие как скорость распространения, могут быть протестированы in vitro с использованием различных
способов, например «способа захваченного пузырька», который описан в Schurch, S., Bachofen, H., Goerke, J., Possmayer, H. (1989) "A captive bubble method reproduces the in situ behaviour of lung surfactant
monolayers" J. Appl. Physiol., 67: 2389-2396.
Одним из наиболее важных липидных компонентов препаратов сурфактантов является 1,2дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), так как он образует мономолекулярную пленку на по-1-
008039
верхности раздела воздух-жидкость во время сжатия, вероятно претерпевая фазовый переход (отвердение) во время сжатия поверхности, тем самым стабилизируя систему альвеол различных размеров.
В общем случае также считается, что кислые фосфолипиды имеют первостепенное значение для
получения хорошей активности, поскольку они благоприятствуют распространению DPPC.
С другой стороны, высокие концентрации насыщенного PL, такого как DPPC, могут влиять на другие свойства липидной суспензии, такие как вязкость препарата.
Возможность приготовления концентрированной суспензии в небольшом объеме особенно важна
для введения сурфактантов посредством эндотрахеальной инстилляции новорожденным с низкой массой
тела.
Модифицированные природные сурфактанты, полезные для терапевтического применения, имеют
концентрацию, в общем случае составляющую от 25 до 50 мг/мл. Только один их них, «Curosurf®», доступен в более высокой концентрации, а именно 80 мг/мл.
Препараты сурфактантов, полученные из тканей животных, так или иначе обладают некоторыми
недостатками, такими как их доступность в ограниченных количествах, сложность процессов получения
и стерилизации и соответствующие производственные затраты; как следствие, было приложено много
усилий для получения синтетических сурфактантов.
Согласно Wilson (Expert. Opin. Pharmacother. 2001, 2, 1479-1493), синтетические сурфактанты подразделяют на:
«искусственные» сурфактанты, не содержащие сурфактантных белков, просто состоящие из смесей
синтетических соединений, в основном фосфолипидов и других липидов, которые готовят таким образом, чтобы они имитировали липидный состав и поведение природного сурфактанта; и
«реконструированные» сурфактанты, представляющие собой искусственные сурфактанты, к которым добавлены сурфактантные белки, выделенные из животных или произведенные с использованием
рекомбинантной технологии, например как описано в WO 95/32992, либо синтетические аналоги сурфактантных белков, например как описано в WO 89/06657, WO 92/22315 и WO 00/47623.
Разработка реконструированных сурфактантов в большей степени была сфокусирована на аналогах
сурфактантных белков, в то время как липидному составу уделялось меньше внимания.
Немногим больше имеется информации о составе и концентрации липидной смеси разрабатываемых синтетических сурфактантов.
В ходе проведения крупного скрытого многонационального рандомизированного испытания (фаза
III) вводили 5,8 мл/кг или 175 мг/кг Surfaxin® для сравнения его с Exosurf® по способности предупреждать RDS (Moya F. et al. Abstract № 2643 of the Annual Meeting of the Paediatric Academy Societies, San
Francisco, May 1-4, 2004). Из этих величин можно было экстраполировать, что Surfaxin® вводили в концентрации 30 мг/мл.
Surfaxin®, также известный как KL4-Surfactant, представляет собой синтетический пептидсодержащий сурфактант, приготовленный путем смешивания фосфолипидов дипальмитоил-sn-глицеро3-фосфохолина (DPPC) и 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG) в соотношении
3:1 по массе с пальмитиновой кислотой (РА), составляющей 15% по массе по сравнению с фосфолипидами, в органическом растворителе.
В предшествующем испытании его также использовали в двух концентрациях: 26,6 мг/мл и 35
мг/мл, выражаемых как концентрация фосфолипидов (Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1996, vol. 153, pp.
404-410).
Предшествующий уровень техники
Согласно предшествующему уровню техники данные о липидном составе искусственных и/или реконструированных сурфактантов представлены в следующих далее документах.
Suzuki et al. (Eur. J. Respir. Dis. 1986, 69, 336-345) описывали свойства in vitro и in vivo сурфактанта,
приготовленного из низкомолекулярных сурфактантных белков и фосфолипидной смеси, состоявшей из
DPPC и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (DPPG) в соотношении 80:20 по массе. Хотя
авторы сообщили, что ненасыщенные фосфолипиды способствуют эффективному распространению на
поверхности раздела воздух-жидкость, было обнаружено, что DPPG превосходит ненасыщенные PG в
системе DPPC, рекомбинированного с небольшим апопротеином.
В работе Notter et al. (Clin. Perinatology 1987, 14, 433-479) рассматривали влияние липидов или фосфолипидов, таких как диолеил-РС, РЕ, холестерин, PC с короткой насыщенной цепью, жирных кислот и
глицеридов на свойства перераспределения DPPC. Главные результаты заключались в усиленном динамическом перераспределении по сравнению с одним DPPC. В данном тексте также сообщалось, что согласно литературным источникам использовались искусственные сурфактанты, приготовленные из смеси DPPC:яичный PG (7:3).
В работе Darfler FJ (In Vitro Cell Dev. Biol. 1990, 26(8), 779-83) не содержащие белка липидные микроэмульсии, подходящие для использования в культуре ткани, готовят из очищенных синтетических липидов с целью получения гомогенной водорастворимой стабильной суспензии, которую можно стерилизовать фильтрованием. Состав микроэмульсии оптимизировали, наблюдая за влиянием на рост клеток
-2-
008039
яичника китайского хомячка (СНО). Приготовленные микроэмульсии, приведенные в табл. 2, содержат
альфа-токоферол и по меньшей мере 16,3% ацетата холестерина.
WO 89/06657 и WO 92/22315, Scripps, относятся к полипептидному аналогу SP-B. Несмотря на то,
что в описании в целом сообщается, что липидная часть (композиций сурфактантов, примечание редактора) предпочтительно составляет от приблизительно 50 до приблизительно 90, более предпочтительно
от приблизительно 50 до 75% по массе DPPC с оставшейся частью, приходящейся на PC, PG, триацилглицерины, пальмитиновую кислоту, сфингомиелин или их смесь, тем не менее в примерах обеих заявок
анализировали свойства in vitro образцов сурфактантов, содержащих 4 или 10 мг/мл смеси DPPC:PG 3:1
(75:25) по массе. Для изучения свойств in vivo использовали ту же самую смесь в концентрации 20 мг/мл,
в некоторых случаях дополнительно содержащую пальмитиновую кислоту.
В работе Cochrane et al. (Science, 1991, 254, 566-568) исследовали поведение in vitro «упрощенных»
пептидов, таких как KL4, и PL, приготовленных из DPPC и PG (3:1), DPPC и 1-пальмитоил-2-олеил PG
(POPG) (3:1), DPPC и 1-пальмитоил-2-олеил-РС (РОРС) (3:1). КL4 тестировали в концентрации 3%, в то
время как другие пептиды - в концентрации 3-5%. Кроме этого, тестировали свойства in vivo 3% KL4 в
липидной смеси DPPC:POPG (мононенасыщенный фосфолипид) в соотношении 3:1 и 15% пальмитиновой кислоты. Авторы сделали общее заключение, что комбинация этих «упрощенных» пептидов и
DPPC:POPG дает отличный сурфактант для 27-дневных эмбрионов кроликов и 130-дневных эмбрионов
макак-резусов.
В работе Yu et al. (Biochimica and Biophysica Acta 1992, 1126, 26-34) использовали методику «пульсирующего пузырька» для изучения поверхностной активности бинарной фосфолипидной смеси, содержащей DPPC и ненасыщенные кислые PL, такие как яичный PG, POPG или яичная фосфатидная кислота,
в соотношении 7:3 по массе в комбинации с 1% SP-B.
В заявке на патент WO 95/32992, Byk Gulden, относящейся к полипептидным аналогам SP-C, в целом сообщается, что фосфолипидная часть может включать DPPC, POPG (или PG) и соль, такую как
хлорид Са, Мg или Na, для уменьшения вязкости. В примерах использовали смесь DРРС: РОРG: пальмитиновая кислота (7:3:0,25) + CaCl2.
Curstedt et al. (9th International Workshop on Surfactant Replacement, Jerusalem, May 22-25, 1994) сообщали об активности in vitro SP-C аналогов, рекомбинированных со следующими липидными смесями:
DPPC:POPC:DOPG (55:35:10), в которых POPG и DOPG являются мононенасыщенными фосфолипидами; DPPC:PG (7:3); DPPC:PG:пaльмитинoвaя кислота (68:22:9), с добавлением или без добавления СаСl2.
Препарат, содержащий систему DPPC:PG:пaльмитинoвaя кислота (68:22:9), имел наибольшую скорость
адсорбции и наименьшее равновесное поверхностное натяжение по сравнению с другими липидными
смесями.
Krill et al. (Chemistry and Physics of Lipids 71, 47-59, 1994) пришли к таким же заключениям; в результате исследования, целью которого была оценка свойств in vitro композиций сурфактантов, приготовленных из синтетического фрагмента белка В, DPPC и POPG, они предположили, что присутствие
пальмитиновой кислоты помогает в установлении стабильной липидной пленки DPPC, способной к достижению низких значений поверхностного натяжения. Никаких указаний соотношений компонентов не
приводится.
В WO 00/47623, от имени заявителя, относящейся к пептидам-аналогам SP-C, в целом сообщается,
что подходящие липиды/фосфолипиды могут быть выбраны из группы, состоящей из PC (предпочтительно DPPC), PG, пальмитиновой кислоты, триацилглицеринов, сфингомиелина. В примерах были протестированы in vitro препараты сурфактантов, приготовленные из одного из заявленных пептидов, например SP-C(LKS), в комбинации с DPPC:PG (7:3 мас./мас.) или DPPC:PG:пaльмитинoвaя кислота
(68:22:9 мас./мас./мас.).
В работе Palmblad et al. (Biochem. J. 1999, 339, 381-386) сообщены те же данные, что и в WO
00/47623. В этой статье также утверждается, что оптимальные характеристики in vitro были получены
для препарата, содержащего SP-C(LKS), SP-B, DPPC и PG, то есть когда пальмитиновая кислота была
исключена из липидной смеси.
Diemel et al. (J. Biol. Chem., 2002, 277, 21179-21188) сообщали о структурных свойствах смесей
сурфактантов, приготовленных из SP-B и DPPC:DPPG (80:20), DPPC:POPG (80:20) или
DPPC:POPC:DPPG (60:20:20).
В последней смеси были использованы насыщенный (DPPG) и мононенасыщенный (РОРС) фосфолипид.
В WO 02/06301 описан способ лечения состояний, ассоциированных с окислением липидов или
микробной пролиферацией, включающему стадию введения композиции, содержащей фармакологически
эффективное количество антиоксиданта или соединения, представляющего собой антимикробный легочный сурфактантный белок, такой как белки А и D и их производные. В тексте в целом утверждается, что
способы по этому изобретению включают введение указанных соединений в комбинации с носителем,
который может быть органическим растворителем, фосфатидилхолином, холестерином или сурфактантными фосфолипидами. В примерах для проверки способности легочных сурфактантных белков предупреждать окисление липидов в качестве субстрата была использована сурфактантная липидная смесь,
-3-
008039
составленная из яичного фосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), холестерина и 1олеоил-2-линолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (1:1:0,15:0,15 мас./мас., соответственно). В этой смеси
яичный PC и DPPC присутствуют в количествах, составляющих 43%, в то время как 1-олеоил-2линолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин и холестерин присутствуют в количестве, составляющем 7%, соответственно, от общей массы смеси. Смесь не содержит кислых фосфолипидов.
US 2002/0072540 относится к композиции легочного сурфактанта, содержащей легочный сурфактант, который при диспергировании в виде порошка или частиц в концентрации 10% (мас./мас.) в 0,9%ном (мас./мас.) хлориде натрия при температуре окружающей среды способен формировать в процессе
набухания на поверхности раздела воздух-жидкость-твердое тело двоякопреломляющие сеть или канальцы в пределах временного периода от приблизительно 0,5 мин до приблизительно 120 мин, что обнаружено с использованием поляризационной микроскопии. В этом тексте в целом утверждается, что
композиция легочного сурфактанта по изобретению содержит фосфолипиды, такие как, например, насыщенные и ненасыщенные фосфолипиды или их смеси. Фосфолипиды могут содержать дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC).
Evans et al. (Lipids 15, 524-535) сообщают о том, что поверхностная вязкость большинства полностью насыщенных фосфолипидов очень высока, а некоторых ненасыщенных фосфолипидов - очень низка. Авторы также сообщают о том, что холестерин снижает поверхностную вязкость в монослоях DPPC.
Однако они не дают рекомендаций, как регулировать состав липидной смеси препарата сурфактанта с
целью снижения его вязкости, одновременно поддерживая способность к эффективному снижению низкого поверхностного натяжения во время сжатия пленки.
В большинстве документов уровня техники, относящихся к липидным смесям как носителям для
легочных сурфактантов, были использованы липидные композиции с содержанием насыщенных PL и, в
частности DPPC, равным или более 70% по массе, в комбинации с PG или POPG, либо такие композиции
были предложены в качестве предпочтительных, в особенности для снижения поверхностного натяжения
до низких величин.
Однако относительно высокое содержание насыщенных PL может влиять на реологические свойства путем увеличения вязкости препарата, в особенности, когда желательна концентрированная композиция синтетического сурфактанта, то есть с концентрацией, равной или большей чем приблизительно 30
мг/мл, предпочтительно более 40 мг/мл, более предпочтительно более 50 мг/мл. Высокая вязкость действительно может отрицательно влиять на распространение сурфактанта и, следовательно, его распределение в бронхо-альвеолярной части легких (King et al. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2002, 282,
L277-L284). Более того, для приготовления концентрированных суспензий липидных смесей с высоким
содержанием насыщенных PL с приемлемой вязкостью необходимо прибегнуть к процедурам нагревания и интенсивного перемешивания.
Ввиду наличия этих недостатков, было бы чрезвычайно полезно создать липидные смеси для использования их в приготовлении синтетических сурфактантов, которые, позволяя достичь хороших
свойств in vitro и in vivo, могли бы поддерживать низкую вязкость концентрированных препаратов сурфактантов, благоприятствуя их доставке и распределению в бронхо-альвеолярной части легких после
введения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к липидной смеси для приготовления синтетического сурфактанта, состоящей из по меньшей мере 95% по массе фосфолипидов, включающих в себя:
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) в количестве по меньшей мере 40 мас.%, предпочтительно от 40 до 65 мас.%, более предпочтительно от 45 до 60% и особенно от 45 до 55 мас.%;
полиненасыщенные фосфолипиды в количестве более 10 мас.%, предпочтительно более 20 мас.%,
более предпочтительно от 20 до 45 мас.% и особенно от 30 до 40 мас.%; и
насыщенные или мононенасыщенные кислые фосфолипиды в количестве более 10 мас.%, предпочтительно от 10 до 30 мас.%, более предпочтительно от 15 до 30 мас.%,
причем все количества рассчитываются на общую массу липидной смеси;
возможно дополнительно включают нейтральный липид в количестве до 5 мас.% включительно.
Действительно было обнаружено, что используя липидную смесь с таким составом, можно приготовить препараты сурфактантов, характеризующиеся хорошими свойствами in vitro, то есть низким поверхностным натяжением и высокой скоростью распространения во время сжатия пленки, равно как и
хорошей биологической активностью. В экспериментах in vivo, проведенных на недоношенных новорожденных кроликах, действительно было показано, что реконструированные сурфактанты, содержащие
одну из липидных смесей по изобретению, приводят к высоким величинам дыхательного объема и объема газа в легких.
В частности, было обнаружено, что реконструированные сурфактанты, содержащие ненасыщенные
PL в количестве более 30% и кислые фосфолипиды в количестве более 10%, имеют результатом лучшие
характеристики объема газа в легких по сравнению с сурфактантами, содержащими меньшее их количество.
-4-
008039
Препараты синтетических сурфактантов, содержащие липидные смеси по изобретению, обладают
технологическими характеристиками, позволяющими приготовить концентрированную водную суспензию фосфолипидной смеси с концентрацией, равной или превышающей 30 мг/мл, предпочтительно превышающей 40 мг/мл, более предпочтительно превышающей 50 мг/мл и до 80 мг/мл включительно, характеризующуюся низкой вязкостью, преимущественно от 5 до 20 сП (от 5 до 20 мПа⋅с) и предпочтительно от 6 до 15 сП (от 6 до 15 мПа⋅с), что благоприятствует их доставке и распределению в легких после введения.
Подробное описание изобретения
Характеристики липидных смесей по изобретению и соответствующие препараты синтетических
сурфактантов будут раскрыты в следующем далее подробном описании.
Полезно, когда липидная смесь состоит из по меньшей мере 95% (по массе) фосфолипидов, предпочтительно из по меньшей мере 98 мас.%. Фосфолипидная фракция содержит 1,2-дипальмитоил-snглицеро-3-фосфохолин (DPPC) в количестве по меньшей мере 40% по массе, предпочтительно от 40 до
65 мас.%, более предпочтительно от 45 до 60% и особенно от 45 до 55 мас.% в расчете на общую массу
липидной смеси.
DPPC может быть либо приготовлен синтетическим путем, либо получен из природного источника.
Благоприятно, когда фосфолипидная фракция содержит полиненасыщенные фосфолипиды в количестве более 10 мас.%, предпочтительно более 20 мас.%, более предпочтительно от 20 до 45 мас.% и
особенно от 30 до 40 мас.% в расчете на общую массу липидной смеси.
Под полиненасыщенными фосфолипидами авторы подразумевают фосфолипиды (PL), как они определены ранее, в которых по меньшей мере один из остатков этерифицирующих жирных кислот содержит более чем одну двойную связь в алифатической цепи. Типичными остатками полиненасыщенных
жирных кислот являются линолевая кислота, линоленовая кислота и арахидоновая кислота. Полиненасыщенными фосфолипидами такого вида являются фосфатидилхолин (PC), фосфатидилинозит (PI), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (PS), фосфатидилглицерин (PG) и сфингомиелин (SM).
Предпочтительными полиненасыщенными фосфолипидами являются 1-пальмитоил-2-линолеил-snглицеро-3-фосфохолин (PLPC), 1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (РАРС) и 1стеароил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (SAPC).
Полиненасыщенные фосфолипиды как правило имеются в продаже и могут быть либо приготовлены синтетическим путем, либо получены из природного источника, например из тканей млекопитающих.
В одном воплощении изобретения в качестве источника полиненасыщенных фосфолипидов также
могут быть использованы природные экстракты. Например, также могут быть использованы фосфатидилэтаноламины, выделенные из яйца (яичный РЕ), или смесь фосфолипидов, содержащая полиненасыщенные жирные кислоты, полученные выделением из печени (печеночный PL). Яичный РЕ содержит
различные этерифицирующие кислоты и, среди прочих, полиненасыщенную линолевую и арахидоновую
кислоты. Обычно печеночный PL имеет следующий приблизительный средний процентный состав: PC
50%, РЕ 25%, сфингомиелин 10%, кислые фосфолипиды 15% по массе, причем некоторые виды PL этерифицированы полиненасыщенными кислотами. Специалист в данной области техники будет использовать яичный РЕ и/или печеночный PL в таком количестве, чтобы конечный состав липидной смеси удовлетворял требованиям, предъявляемые к липидной смеси по данному изобретению.
Преимущественно фосфолипидная фракция содержит насыщенные или мононенасыщенные кислые
фосфолипиды в количестве более 10% по массе, предпочтительно от 10 до 30% по массе, более предпочтительно от 15 до 30% по массе в расчете на общую массу липидной смеси.
Под насыщенными кислыми фосфолипидами авторы подразумевают такие фосфолипиды, как фосфатидилглицерин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин, где этерифицирующие жирные кислоты являются насыщенными, в то время как под мононенасыщенными кислыми фосфолипидами авторы подразумевают такие, где по меньшей мере одна из этерифицирующих жирных кислот является мононенасыщенной. Типичными примерами насыщенных PL являются 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3фосфоглицерин (DPPG), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин (DOPG) и 1,2-дипальмитоил-snглицеро-3-фосфо-L-серин (DPPS). Примерами мононенасыщенных PL являются 1-пальмитоил-2-олеилsn-глицеро-3-фосфоглицерин (POPG) и 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфохолин (РОРС). Предпочтительно, чтобы кислые фосфолипиды в липидной смеси по изобретению представляли собой 1,2дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин (DPPG), 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин (POPG) и их смеси.
Кроме DPPC, полиненасыщенных фосфолипидов и насыщенных или мононенасыщенных кислых
фосфолипидов, фосфолипидная фракция липидной смеси по изобретению может содержать другие фосфолипиды, где этерифицирующие жирные кислоты являются насыщенными или мононенасыщенными.
Типичными фосфолипидами указанного класса являются 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPPE) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE).
Преимущественно в липидной смеси по изобретению соотношение между насыщенными и ненасыщенными (мононенасыщенными и полиненасыщенными) фосфолипидами будет составлять от 65:35
-5-
008039
до 40:60 по массе, предпочтительно от 55:45 до 45:55 по массе, а соотношение между кислыми фосфолипидами и другими фосфолипидами будет составлять от 10:90 до 30:70 по массе, предпочтительно от
15:85 до 25:75 по массе.
Липидная смесь по изобретению может содержать нейтральные липиды в количестве до 5% по массе включительно, предпочтительно в количестве, равном или меньшем, чем 2% по массе. Нейтральные
липиды включают триацилглицерины, холестерин, эфиры холестерина и жирные кислоты, такие как
пальмитиновая кислота.
Предпочтительным нейтральным липидом является холестерин, так как он может способствовать
снижению вязкости липидной смеси.
В качестве примера липидных смесей по изобретению были использованы DPPC:PLPC:SAPC:
DPPG:POPG в соотношении 45:30:10:5:10 (по массе) и DРРС:печеночный PL:POPG в соотношении
50:40:10 (по массе).
Липидные смеси по изобретению могут быть особенно полезны в приготовлении реконструированного сурфактанта.
В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к реконструированному сурфактанту,
содержащему одну из описанных ранее липидных смесей в комбинации с сурфактантным белком, выделенным из животных или произведенным с использованием рекомбинантной технологии, например, как
описано в WO 95/32992, либо с синтетическими аналогами сурфактантных белков SP-B или SP-C, такими как описанные в WO 89/06657, WO 92/22315 и WO 00/47623, либо с их смесями.
Белок может представлять собой любой сурфактантный белок, выбранный из SP-A, SP-B, SP-C, SPD, либо их синтетические или рекомбинантные аналоги.
Реконструированный сурфактант по изобретению может также содержать полимиксин, предпочтительно полимиксин В, в качестве функционального заменителя сурфактантного белка SP-B.
Предпочтительно в качестве синтетического аналога SP-C будет использован пептид общей формулы (I) в соответствии с однобуквенным аминокислотным кодом:
FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLΩGL (I),
где
Х представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, L и nL (норлейцин);
В представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K, I, W, F, Y и орнитина;
Z представляет собой S, возможно замещенный ацильными группами, содержащими 12-22 углеродных атома, связанными с боковой цепью посредством сложно-эфирной связи;
Ω представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М, I, L и nL (норлейцин);
а является целым числом от 1 до 19, предпочтительно от 1 до 11;
b является целым числом от 1 до 19, предпочтительно от 1 до 8;
с является целым числом от 1 до 21, предпочтительно от 1 до 5;
d является целым числом от 0 до 20, предпочтительно от 1 до 11;
е равен 0 или 1;
f равен 0 или 1;
n равен 0 или 1;
m равен 0 или 1;
где предпочтительно:
сумма n и m больше или равна 0;
f больше или равен е;
(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd представляет собой последовательность, состоящую максимально из 22 аминокислот, предпочтительно от 10 до 22.
Еще более предпочтительным является использование пептида формулы (II):
IPSSPVHLKRLBLLLLLLLLILLLILGALLΩGL(II),
где
В представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из К, W, F, Y и орнитина;
Ω представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М, I, L и nL (норлейцин);
и где серин может быть возможно ацилирован, например пальмитоилом.
Наиболее предпочтительным согласно изобретению является представленный далее пептид (SPC33) в неацилированной форме:
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (SP-C33).
Указанные пептиды могут быть получены согласно способу, изложенному в WO 00/47623.
Количество сурфактантного белка или пептида в воспроизведенном сурфактанте будет варьировать
в интервале от 0,1 до 5%, предпочтительно от 0,5 до 3%, более предпочтительно от 1 до 2% в расчете на
массу общей смеси.
Заявленные реконструированные сурфактанты готовят путем смешивания растворов липидной смеси в органических растворителях с пептидом или белком и последующей сушки препарата до получения
сухого порошка.
-6-
008039
Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, состоящим из синтетического сурфактанта, содержащего липидную смесь по изобретению, для введения субъектам, нуждающимся в терапевтическом лечении дефицита сурфактанта.
Указанные фармацевтические препараты вводят интратрахеально или распылением в форме суспензий в водной среде, либо посредством аэрозольного введения в подходящем пропелленте. Предпочтительно их вводят интратрахеально в виде суспензии в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия. Преимущественно концентрация сурфактанта (выраженная в виде содержания фосфолипидов) будет более
30 мг/мл, предпочтительно более 40 мг/мл, более предпочтительно более 50 мг/мл, еще более предпочтительно от 50 до 80 мг/мл.
При концентрации сурфактанта от 50 до 80 мг/мл вязкость сурфактанта, измеренная при 250°С при
приложении скорости сдвига, изменяющейся в интервале от 100 до 500 с-1, преимущественно будет составлять от 2 до 30 сП, предпочтительно от 5 до 20 сП (от 5 до 20 мПа⋅с), более предпочтительно составлять от 6 до 15 сП (от 6 до 15 мПа⋅с), еще более предпочтительно от 6 и 10 сП (мПа⋅с).
Сурфактант, содержащий липидную смесь по изобретению, может быть использован для лечения
всех случаев дефицита сурфактанта и в типичном случае в лечении респираторного дистресс-синдрома
новорожденных (NRDS), острого респираторного дистресс-синдрома взрослых (ARDS), синдрома мекониевой аспирации (MAS), различных типов пневмонии и бронхолегочной дисплазии.
Преимущества настоящего изобретения будут проиллюстрированы следующими далее примерами.
Пример 1. Приготовление воспроизведенных сурфактантов.
Материалы
Фосфолипиды 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро3-фосфоглицерин (DPPG), 1 -пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин (POPG), 1-пальмитоил-2линолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин
(PLPC),
1-стеароил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин
(SAPC) и фосфолипидную смесь, полученную выделением из печени (печеночный PL), использовали для
получения липидных смесей и приобретали посредством закупок.
Пептид SP-C33 синтезировали согласно способу, изложенному в WO 00/47623.
Приготовление реконструированных сурфактантов
Липиды, растворенные в смеси хлороформ/метанол 98:2 (об./об.) смешивали в виде смесей
DPPC:PLPC:SAPC:DPPG:POPG и DРРС:печеночный PL:POPG в соотношении 45:30:10:5:10 и 50:40:10 по
массе, соответственно, с целью получения липидных смесей согласно доктрине настоящего изобретения
(липидные смеси А и В). Соответствующие препараты реконструированных сурфактантов (сурфактант А
и В) получали, добавляя SP-C33 к липидной смеси в количестве 2% по массе. Сурфактант А упаривали в
атмосфере азота и ресуспендировали в 150 ммоль/л NaCl при концентрации липидов 10 мг/мл и 80 мг/мл,
соответственно, в то время как сурфактант В ресуспендировали при концентрации липидов 80 мг/мл.
Фосфолипидный состав печеночного PL сурфактанта В охарактеризован следующим образом: фосфатидилхолин (PC) 50%, фосфатидилэтаноламин (РЕ) 25%, сфингомиелин (SM) 10%, кислые фосфолипиды 15%.
Пример 2. Активность in vitro.
Поверхностные свойства определяли в сурфактометре с «захваченным» пузырьком. Камеру заполняли раствором сахарозы и инъецировали 2 мкл сурфактанта А (10 мг/мл); затем создавали пузырек, вдувая 10 мкл воздуха. Поверхностное натяжение на поверхности раздела воздух-жидкость определяли по
форме пузырька во время адсорбции пленки и последующего квазистатического сжатия циклической
области.
Сурфактант А демонстрировал хорошие характеристики сжатия площади поверхности, требуемого
для достижения минимального поверхностного натяжения.
Пример 3. Активность сурфактанта A in vivo.
Недоношенных эмбрионов кролика (n = 34) на гестационном сроке 27 дней получали посредством
кесарева сечения (срок = 31 день). По получении животных подвергали внутрибрюшинной анестезии
пентобарбиталом натрия (0,1 мл; 6 мг/мл), подвергали трахеотомии, парализовали внутрибрюшинным
введением панкурония бромида (0,1-0,15 мл; 0,2 мг/мл) и содержали в плетизмографе при 37°С. Их подвергали механической вентиляции параллельно с модифицированным Serto-Ventilator, доставляющим
100%-ный кислород. После инстилляции сурфактанта пиковое давление сначала повышали до 35 см вод.
ст. (3,43 кПа) в течение 1 мин для облегчения распределения сурфактанта в легких, затем понижали до
25 см вод. ст. (2,45 кПа). Далее животных вентилировали с пиковым давлением 25 см вод. ст. (2,45 кПа) в
течение 15 мин, которое затем понижали до 20 см вод. ст. (1,96 кПа) в течение 5 мин и затем до 15 см
вод. ст. (1,47 кПа) в течение 5 мин, а затем опять повышали до 25 см вод. ст. (2,45 кПа) в течение 5 мин.
Дыхательные объемы регистрировали с 5-минутными интервалами с использованием пневмотахографа,
соединенного с боксом плетизмографа.
Частота составляла 40 в минуту, соотношение времен вдох:выдох 1:1. Никакого положительного
давления в конце выдоха не прикладывали.
-7-
008039
Случайным образом отобранным недоношенным новорожденным кроликам при рождении с использованием трахеальной канюли вводили сурфактант А (2,5 мл/кг массы тела; 80 мг/мл). Контрольным
животным в дыхательные пути не инстиллировали никакого материала. Всех животных вентилировали в
течение 30 мин.
Дыхательные объемы (VT) измеряли с использованием системы плетизмографа, как описано в Sun
et al., Eur. Respir. J. 1991, 4, 364-370, и в конце выдоха оценивали объемы газа в легких (LGV) по разнице
между объемом легких и сырой массой легких (Scherle et al. Mikroscopie 1970, 26, 57).
В этих экспериментах было обнаружено, что сурфактант А обеспечивал большие дыхательные объемы. Объемы газа в легких также были значительно увеличены.
Пример 4. Активность сурфактанта В in vivo.
Сурфактант В (80 мг/мл) и имеющийся в продаже модифицированный природный сурфактант
(Curosurf) (80 мг/мл) сравнивали по величинам дыхательного объема и объема газа в легких в одной и
той же животной модели из Примера 3: реконструированный сурфактант В, приготовленный согласно
изобретению, показал активность, сравнимую с активностью модифицированного природного сурфактанта.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Липидная смесь для приготовления синтетического сурфактанта, состоящая главным образом по
меньшей мере из 95% по массе фосфолипидов, включающих в себя
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) в количестве по меньшей мере 40 мас.%;
полиненасыщенные фосфолипиды в количестве более 10 мас.%; и
насыщенные или мононенасыщенные кислые фосфолипиды в количестве более 10 мас.%;
причем все количества рассчитаны на общую массу липидной смеси.
2. Липидная смесь по п.1, дополнительно содержащая нейтральный липид в количестве до 5 мас.%
включительно от общей массы липидной смеси.
3. Липидная смесь по п.2, где нейтральный липид выбран из группы, состоящей из триацилглицеринов, холестерина, эфиров холестерина и жирных кислот.
4. Липидная смесь по пп.1-3, где количество DPPC составляет от 40 до 65 мас.%.
5. Липидная смесь по п.4, где количество DPPC составляет от 45 до 55 мас.%.
6. Липидная смесь по любому из пп.1-5, где количество полиненасыщенного фосфолипида составляет более 20 мас.%.
7. Липидная смесь по п.6, где количество полиненасыщенного фосфолипида составляет от 30 до 40
мас.%.
8. Липидная смесь по любому из пп.1-7, где количество кислых фосфолипидов составляет от 15 до
30 мас.%.
9. Липидная смесь по любому из пп.1-8, где полиненасыщенный фосфолипид выбран из группы,
состоящей из 1-пальмитоил-2-линолеил-sn-глицеро-3-фосфохолина (PLPC), 1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (РАРС) и 1-стеароил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (SAPC),
фосфатидилэтаноламина, выделенного из яйца (яичный РЕ) или смеси фосфолипидов, полученной выделением из печени (печеночный PL).
10. Липидная смесь по любому из пп.1-9, где кислый фосфолипид выбран из группы, состоящей из
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (DPPG), 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (DOPG), 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3фосфохолина (РОРС) и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серина (DPPS).
11. Липидная смесь по п.10, где кислый фосфолипид выбран из DPPG, POPG и их смеси.
12. Липидная смесь по пп.1-11, где соотношение между насыщенными и ненасыщенными (мононенасыщенными и полиненасыщенными) фосфолипидами составляет от 65:35 до 40:60 по массе.
13. Липидная смесь по пп.1-11, где соотношение между кислыми фосфолипидами и другими фосфолипидами составляет от 10:90 до 30:70 по массе.
14. Реконструированный сурфактант, содержащий липидную смесь по пп.1-13 в комбинации с одним или более чем одним сурфактантным белком, выбранным из SP-A, SP-B, SP-C, SP-D, их синтетических или рекомбинантных аналогов.
15. Реконструированный сурфактант по п.14, где сурфактантный белок присутствует в количестве
приблизительно от 0,1 до 5% по массе от общей смеси.
16. Реконструированный сурфактант по пп.14 и 15, где сурфактантный белок представляет собой
синтетический или рекомбинантный аналог SP-C общей формулы (I) в соответствии с однобуквенным
аминокислотным кодом:
FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLΩGL (I),
где Х представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, L и nL (норлейцин);
В представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K, I, W, F, Y и орнитина;
-8-
008039
Z представляет собой S, возможно замещенный ацильными группами, содержащими 12-22 углеродных атома, связанными с боковой цепью посредством эфирной связи;
Ω представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М, I, L и nL (норлейцин);
а является целым числом от 1 до 19;
b является целым числом от 1 до 19;
с является целым числом от 1 до 21;
d является целым числом от 0 до 20;
е равен 0 или 1;
f равен 0 или 1;
n равен 0 или 1;
m равен 0 или 1;
причем
сумма n и m больше или равна 0;
f больше е;
(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd представляет собой последовательность, состоящую максимум из 22 аминокислот, предпочтительно из 10-22.
17. Реконструированный сурфактант по п.16, где аналог SP-C имеет формулу (II):
IPSSPVHLKRLBLLLLLLLLILLLILGALLΩGL (II),
где В представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K, W, F, Y и орнитина; и
Ω представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М, I, L и nL.
18. Реконструированный сурфактант по п.17, где аналог SP-C имеет следующий аминокислотный
состав:
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL.
19. Фармацевтический препарат, содержащий реконструированный сурфактант по пп.14-18.
20. Фармацевтический препарат по п.19 в форме суспензии в 0,9%-ном водном растворе хлорида
натрия, где концентрация сурфактанта (выраженная как содержание фосфолипидов) составляет более 30
мг/мл.
21. Фармацевтический препарат по п.20, где концентрация сурфактанта составляет более 40 мг/мл.
22. Фармацевтический препарат по п.21, где концентрация сурфактанта составляет более 50 мг/мл.
23. Фармацевтический препарат по п.22, где концентрация сурфактанта составляет от 50 до 80
мг/мл.
24. Фармацевтический препарат по пп.19-23, характеризующийся вязкостью от 5 до 20 сП (от 5 до
20 мПа⋅с).
25. Фармацевтический препарат по п. 24, характеризующийся вязкостью от 6 до 15 сП (от 6 до 15
мПа⋅с).
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-9-