Автореферат Калашникова Е.Ю.

На правах рукописи
КАЛАШНИКОВА Евгения Юрьевна
ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕННОЙ ГАЗОВОЙ СРЕДЫ И ТЕМПЕРАТУРЫ НА
ФОРМИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА 1 ТИПА
03.03.01 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2013
Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии медицинского факультета
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Российский университет дружбы народов»
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Торшин Владимир Иванович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Будылина Софья Михайловна, профессор кафедры
нормальной физиологии ФГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический
университет им. А.И. Евдокимова»
доктор медицинских наук Благонравов Михаил Львович, профессор кафедры общей патологии
и патологической физиологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Российский университет
дружбы народов»
Ведущая организация:
ФГБУ «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П. К. Анохина» РАМН
Защита диссертации состоится «19» июня 2013г. в 13.00 часов на заседании Совета по защите
докторских и кандидатских диссертаций Д212.203.10 при Российском университете дружбы
народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале УНИБЦ (Научная библиотека)
Российского университета дружбы нардов (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6).
Автореферат размещен на сайте www.rudn.ru
Автореферат разослан «___»___________2013г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 212.203.10
доктор медицинских наук, профессор
Ермакова Наталья Викторовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
исследования.
Изучение
физиологических
особенностей
формирования симптомокомплекса сахарного диабета является актуальной
проблемой (Дедов И. И. с соавт.,2002). Сахарный диабет — группа метаболических
(обменных) заболеваний, характеризующихся гипергликемией, которая является
результатом дефектов секреции и действия инсулина или обоих этих факторов
(WHO. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes
Mellitus, 1999). По прогнозам Международной Федерации Диабета, в настоящее
время 366 млн. человек в мире страдают сахарным диабетом, и к 2030 г. эта цифра,
составит 552 млн. человек (IDF Diabetes Atlas, 5th edition, 2011). ВОЗ призвала
страны разрабатывать национальные стратегии борьбы с диабетом. В России
сахарный диабет – наиболее частая причина смертности после сердечно-сосудистых
и онкологических заболеваний (Аналитический вестник Совета Федерации ФС РФ
№ 10 (422), 2011г.). Главными причинами инвалидизации больных СД являются
поздние осложнения диабета, такие как ретинопатия, нефропатия, синдром
диабетической стопы, полинейропатия. Как известно, сахарный диабет 1 типа (СД1)
– болезнь, вызванная разрушением β-клеток островков поджелудочной железы. На
современном этапе развития медицины единственным способом лечения сахарного
диабета 1 типа остается инсулинотерапия. В тоже время с помощью имеющихся
методов терапии у большинства больных СД1 достаточно трудно достичь той
степени компенсации заболевания, которая позволила бы реально предотвратить
или замедлить прогрессирование осложнений (Аметов А.С., Авакова К.А., 2007).
Инсулинотерапия при СД1 носит заместительный характер. При интенсивной
инсулинотерапии возрастает частота метаболического синдрома, что увеличивает
риск развития атеросклероза (Ligthelm RJ., 2009). В связи с этим возрос интерес к
изучению
физиологических
механизмов
возникновения
и
реализации
инсулиноподобного эффекта от воздействия факторов внешней среды. Особое
внимание уделялось исследованию физиологической роли артериальных
хеморецепторов в формировании симптомокомплекса СД1 (Агаджанян Н.А. с
соавт., 1993; Шевченко Л.В., Елфимов А.И., 1994; Торшин В.И. с соавт., 2011).
Имеются данные о применении периодических гипоксических тренировок у
женщин, в результате которых
удалось добиться стабилизации содержания
глюкозы в крови, исчезновения сахара в моче, нормализации содержания
гликозилированного гемоглобина и дало возможность снизить на 10% дозу
инсулина (Радзиевская М.П. и соавторы, 2007).
Поскольку СД1 является
результатом клеточно-опосредованной аутоиммунной деструкции β-клеток
поджелудочной железы, приводящей к абсолютной инсулиновой недостаточности,
то терапия, направленная на замедление и подавление этого процесса, является
перспективной и эффективной в плане поддержания стабильной собственной
секреции инсулина и, возможно, восстановления пула β-клеток (Никонова Т.В.,
Алексеева Ю.В., 2012). Таким образом, несмотря на достигнутые успехи в этой
области до настоящего времени остаются малоизученными физиологические
особенности экспериментального сахарного инсулинозависимого диабета при
воздействии изменённой газовой среды и температуры.
1
Цель исследования: изучение влияния периодического воздействия гипоксии и
пониженной температуры окружающей среды на течение экспериментального
сахарного диабета 1 типа.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительные исследования содержания глюкозы крови,
кардиореспираторных и гематологических показателей у лабораторных животных в
обычных условиях окружающей среды и при периодическом воздействии гипоксии
и пониженной температуры до и после моделирования СД1 (токсическая модель).
2. Изучить динамику содержания глюкозы крови у животных после моделирования
СД1 (аутоиммунная модель) при периодическом воздействии гипоксии и
пониженной температуры.
3. Исследовать реакцию животных с СД1 на однократное введение ангиотензина-II.
4. Выявить и оценить особенности влияния адаптации к гипоксии и холоду на
формирование аутоиммунной и токсической формы СД1.
Научная новизна.
В комплексных исследованиях, проведенных на лабораторных животных впервые
выявлено, что при адаптации к холоду и гипоксии повышается устойчивость крыс к
диабетогенному влиянию стрептозотоцина и формируются адаптативнокомпенсаторные реакции при развитии экспериментального сахарного диабета.
Показано снижение содержания глюкозы крови у лабораторных животных при
периодическом воздействии холода и гипоксии по сравнению с контрольной
группой. На фоне гипоксических и холодовых воздействий установлено, что степень
снижения концентрации глюкозы в крови животных с аутоиммунным СД1 более
выражена, чем у животных с токсической формой СД1. Впервые выявлено, что
однократное введение ангиотензина – II лабораторным животным с СД1 не
вызывает достоверного повышения АД и ЧСС по сравнению с контрольной
группой.
Практическая значимость.
Полученные данные могут быть использованы при разработке методов коррекции
уровня гликемии у больных сахарным диабетом, в частности, сочетанного
применения немедикаментозных методов и инсулинотерапии с целью снижения
дозы инсулина и уменьшения побочных эффектов лечения, а также при разработке
патогенетически обоснованных мероприятий, направленных на коррекцию
метаболических изменений у больных инсулинозависимым сахарным диабетом.
Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах
физиологии медицинских институтов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Периодическое воздействие гипоксии или холода уменьшает содержание глюкозы
крови у белых лабораторных крыс.
2. При экспериментальном инсулинозависимом сахарном диабете (СД1 токсическая и аутоиммунная модели) периодическое понижение температуры или
парциального
давления
кислорода
в
окружающей
среде
являются
физиологическими воздействиями, корригирующими уровень гликемии у
лабораторных крыс.
2
3. Однократное введение ангиотензина – II крысам с СД1 не вызывает достоверного
повышения АД и ЧСС по сравнению с контрольной группой.
Апробация работы.
Материалы исследований были доложены и обсуждены на XIV Международном
симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации", (Москва, 2009); XII
Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2011);
The 4th International Conference on Fixed Combination in the Treatment of Hypertension,
Dyslipidemia and Diabetes Mellitus , (Paris, 2011); Всероссийской конференции с
международным участием «Физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2013).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 работы в журналах,
рекомендованных ВАК. Работа поддержана государственным контрактом
14.740.11.1200 от 14.06.2011г, выполняемым в рамках федеральной целевой
программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на
2009-2013гг.
Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, трёх глав: обзора литературы, материалов и
методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения,
выводов, практических рекомендаций и списка используемой литературы. Общий
объём диссертации 137 страниц, 12 таблиц, 24 рисунка. Список литературы
состоит из 144 отечественных и 81 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследований
Эксперименты проведены на белых беспородных крысах-самцах, что позволяло
исключить гормональное влияние, связанное с эстральным циклом. Исследования
проводили с соблюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по
надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием
экспериментальных животных разных видов (FELASA Principles and practice in
ethical review of animal experiments across Europe. Federation of European Laboratory
Animal Science Associations, 2005). Животные находились в стандартных условиях
вивария. В каждой клетке размером 30х40х60 см содержалось не более 6 животных.
Общая характеристика, объем и методы исследований представлены в таблице 1.
Все исследования проведены в 2 этапа. На 1 этапе по основным критериям (уровень
гликемии 5,0-5,5 мМоль/л и масса тела 250-300 г) отобраны 60 животных.
Содержание глюкозы в крови определяли на приборе «Эксан-Г», массу тела - на
лабораторных весах ВЛТК-500. В фоновых исследованиях (утром натощак) у 45
животных определяли и рассчитывали гематологические и кардиореспираторные
показатели: количество эритроцитов (Эр, х1012/л) на счётчике микрочастиц
«Целлоскоп», концентрацию гемоглобина (Нb, г/л) на гемоглобинометре фирмы
«Линсон-инструмент», потребление кислорода (VO2/кг, мл/кг), выделение
углекислого газа (VСO2/кг, мл/кг) с помощью газоанализаторов АК-I и ГАУ-3 в
3
Таблица 1
Общая характеристика, объем и методы исследований
№
п/п
Этапы
исследования
Количество
лабораторн
ых
животных
Число
исследо
ваний
Исследуемые
показатели
Количество
1.Исследование
динамики
эритроцитов
(Эр,
гликемии,
массы
тела,
12
х10 /л), содержание
гематологических
и
кардиореспираторных
гемоглобина (Нb, г/л
235
60
показателей
у
крыс
с
потребление
токсической
моделью
кислорода (VO2/кг,
инсулинозависимого
мл/кг),
выделение
сахарного диабета (СД1) в
CО2 (СO2/кг, мл/кг),
обычных условиях обитания и
дыхательный
при периодическом снижении
коэффициент (ДК,
температуры
или
ед.),
частота
парциального
давления
сердечных
кислорода в окружающей
сокращений (ЧСС,
среде.
уд./мин,
215
70
2. 1. Исследование динамики
систолическое
гликемии и массы тела у крыс
артериальное
с аутоиммунной моделью
давление (мм.рт.ст.),
инсулинозависимого
масса тела (г).
сахарного диабета (СД1) в
обычных условиях обитания и
при периодическом снижении
температуры
или
парциального
давления
кислорода в окружающей
среде (n = 60 животных).
2.
Исследование
реакции
сердечно-сосудистой системы
(систолическое артериальное
давление и частота сердечных
сокращений)
у
крыс
с
аутоиммунной моделью СД1
на
введение
(внутрибрюшинно)
ангиотензина-II (n = 10
животных).
закрытой системе ёмкостью 3 л, дыхательный коэффициент (ДК, ед.), частоту
сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин) по интервалам R-R электрокардиограммы.
1.
4
После определения и расчёта указанных показателей животные были распределены
на три равные группы. Первая группа («нормоксия», n = 20) находилась в обычных
условиях вивария. Животные второй группы («гипоксия», n = 20) в течение трёх
недель ежедневно 4 часа (1000 - 1400 ч) подвергались воздействию гипоксии,
создаваемой в барокамере емкостью 110 л. В первый день воздействия уровень
гипоксии соответствовал «высоте» 2000 м и в последующие 5 дней градуально
нарастала до «высоты» 4000 м (РiО2 = 95 мм.рт.ст.). Этот уровень воздействия
гипоксии оставался постоянным в последующие три недели. Животные третьей
группы («гипотермия», n = 20) в течение трёх недель ежедневно 4 часа (1000 - I400 ч)
подвергались воздействию пониженной температуры, создаваемой в холодильнике
емкостью 150 л в условиях обычной атмосферы. В первый день воздействия
температура воздуха составляла +5ОС и последующие 5 дней градуально снижалась
до -5ОС. Этот уровень воздействия гипотермии сохранялся постоянным в течение
трёх недель. Через три недели указанных выше воздействий у животных создавали
токсическую модель СД1 в результате однократной инъекции стрептозотоцина
(STZ) фирмы «Sigma-Aldrich», Германия в дозе 50 мг/кг массы тела
внутрибрюшинно. При использовании STZ в указанной дозе наступает глубокое
повреждение β-клеток поджелудочной железы, которые становятся неспособными к
восстановлению своей функции; помимо этого STZ повреждает регионарные
стволовые клетки поджелудочной железы, что предотвращает индукцию процессов
регенерации β-клеток. В результате под влиянием STZ прогрессирует
фиброзирующая регенерация, не способствующая развитию аутоиммунного
повреждения (Nir Т. с соавт., 2007). Уровень гликемии, гематологические и
кардиореспираторные показатели у животных трёх групп определялись на 2, 7 и 10
сутки после интоксикации стрептозотоцином. На 2-ом этапе, также как и на 1-ом, по
основным критериям (уровень гликемии 5,0-5,5 мМоль/л и масса тела 250-300 г)
отобраны 70 крыс. Аутоиммунную модель СД1 у всех животных, генетически не
предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, создавали в результате
трёх с интервалом в 7 суток инъекций стрептозотоцина и адъюванта Фрейнда. При
этом во время первой инъекции (внутрибрюшинно) количество стрептозотоцина
определяли из расчёта 25 мг/кг массы тела животного, во время второй - 20 мг/кг
массы тела, а в третьей - 25 мг/кг массы тела. Каждой инъекции стрептозотоцина
предшествовало 12 часов голодания животных. За сутки перед каждой инъекцией
стрептозотоцина внутрибрюшинно вводили 1 мл неполного адъюванта Фрейнда.
Адъюванты являются
неспецифическими стимуляторами иммуногенеза,
способствуют развитию аутоиммунных процессов. В неполный адъювант Фрейнда
входят сложные жирные кислоты (дериваты ланолина), масла и эмульгаторы
(Арлацел А). В организме под их влиянием происходит развитие воспалительного
процесса и стимуляция пролиферативной и фагоцитарной активности
ретикулоэндотелиальной системы, усиление плазмоклеточной реакции. Малые дозы
стрептозотоцина не приводят к разрушению всей популяции β-клеток, а вызывают
лишь частичную их гибель. Последовательное введение адъюванта и
стрептозотоцина приводит к развитию иммуннозависимого разрушения оставшихся
β-клеток (Великий Д.А., 2010 ).Через две недели после третьей инъекции адъюванта
и стрептозотоцина у животных трёх групп определяли исходные показатели
5
гликемии и массы тела (фон). Далее первая группа животных («нормоксия», n = 20)
находилась в обычных условиях вивария, а животные второй («гипоксия», n = 20) и
третьей («гипотермия», n = 20) групп подвергались таким же воздействиям, как и
животные на 1 этапе исследований. Показатели гликемии и массы тела определяли
на 4, 7, 15 сутки воздействий и через 2 недели после их отмены. Животным
четвертой группы (n = 10) через 2 недели после третьей инъекции стрептозотоцина
вводили Aнгиотензин-II (внутрибрюшинно) в дозе 300 мкг/кг («Sigma») и в течение
60 минут регистрировали систолическое артериальное давление (САД) в хвостовой
артерии и частоту сердечных сокращений (ЧСС). Эти показатели измеряли
непрямым методом с использованием системы NIBP («AD Instrument») у
бодрствующих крыс, помещенных в пластиковые пеналы. Величины САД и ЧСС
выражали в процентах от фоновых значений. Была проведена интерполяция
величин АД и ЧСС с использованием кубических сплайнов для приведения данных
к одной временной сетке. Полученные в экспериментах данные обработаны
статистически с использованием ПО «Statistica 6.0». Анализ достоверности
оценивали с применением t- критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
На первом этапе исследований основной особенностью течения СД1 явилась
относительная стабилизация уровня гликемии и массы тела у животных под
влиянием периодического снижения температуры или PiO2 в окружающей среде
после инъекции стрептозотоцина. Изменение массы тела и содержания глюкозы в
крови животных представлены в таблице 2.
Таблица 2
Динамика массы тела и содержания глюкозы крови у лабораторных животных с
экспериментальным токсическим сахарным диабетом в различных условиях
окружающей среды
Ф о н
1
2
3
1
2
3
Сроки (сутки) после инъекции стрептозотоцина
2
7
10
г л ю к о з а к р о в и (мМоль/л)
5,77 ± 0,24
19,41 ± 0,31
20,97 ± 0,42
4,63 ± 0,25*
18,12 ± 0,29
15,84 ± 0,38*
4,32 ± 0,26*
17,45 ± 0,32
15,70 ± 0,39*
м а с с а т е л а (г)
339,1 ± 3,41
320,4 ± 3,61
290,0 ± 3,72
313,4 ± 3,53*
300,1 ± 3,58*
294,0 ± 3,61
310,1 ± 3,51*
298,4 ± 3,60*
295,4 ± 3,65
21,99 ± 0,46
15,00 ± 0,41*
15,21 ± 0,45*
273,2 ± 4,22
290,6 ± 3,69*
293,7 ± 3,61*
Примечание: в графе «Фон» слева - цифрами обозначены группы животных;
значком * р<0,05 обозначены достоверные различия в сравнении с 1 группой.
Представленные в таблице 2 данные прежде всего свидетельствуют о достоверной
(по сравнению с контролем) тенденции к уменьшению массы тела и снижению
уровня гликемии у животных в результате предварительного периодического
воздействия гипоксии (2 группа) и холода (3 группа). Достоверно менее
6
выраженной оказалась и реакция животных этих групп на интоксикацию
стрептозотоцином – как по уровню изменения содержания глюкозы в крови, так и
по темпу снижения массы тела на 2-10 сутки после инъекции препарата. Сравнивая
изменение уровня глюкозы крови, можно отметить, что в отличие от контрольной
группы, у которой на 7-е и 10-е сутки имеется неуклонное увеличение данного
показателя (р<0,05), у крыс, подвергавшихся гипоксическому воздействию,
отмечается отчетливое снижение гликемии на 7-е и 10-е сутки соответственно ( на
12% и 17%), аналогичная тенденция наблюдается в группе с холодовым
воздействием (10% и 13%) соответственно (р<0,05). Через 2 недели после отмены
воздействий в обеих группах уровень гликемии в крови достоверно повысился
(р<0,05). Известно, что холодовое воздействия, гипоксия и инсулин используют
различные пути, оба из которых приводят к активации транспорта глюкозы
(L.D.Goodyear, 1998; Alessandra L. Gasparetti, Claudio T. de Souza, 2003). Воздействие
холодом приводит к увеличению экспрессии GLUT-4, которое вызывает накопление
этого транспортера главным образом в мембранной фракции независимо от
действия инсулина (Alessandra L. Gasparetti, Claudio T. de Souza, 2003). Во всех трех
группах наблюдалось снижение массы тела, но в контрольной группе снижение
массы тела в течение развития сахарного диабета было достоверно больше (-16%),
чем в группах, подвергавшихся воздействиям. Известно, что снижение массы тела
при СД1 наблюдается вследствие избыточного выделения глюкозы с мочой,
торможения липогенеза и ослабления синтеза белка и его большим использованием
в качестве источника энергии (Потемкин В.В., 1986). Можно предположить, что
снижение температуры или PiO2 во внешней среде, выполняя роль периодического
стресса, оказывают адаптационно-активирующее воздействие на организм,
направленное на формирование комплекса физиологических реакций, адекватных
гипоинсулинемии и гипергликемии при диабете. Действительно, в проведенных
нами исследованиях специфичность внешних воздействий на животных очевидна снижение температуры на фоне нормального PiO2 и снижение PiO2 на фоне
нормальной температуры. Неспецифическими при таких воздействиях являются
физиологические реакции (стресс-реакции) и гормональная перестройка,
направленные на активацию энергетического обмена. Физиологические механизмы
адаптации к холоду сходны с адаптацией к гипоксии (Агаджанян Н.А., Миррахимов
М.М., 1970; Авцын А.П. и др., 1979). Следует отметить и тот факт, что в результате
физиологических реакций в ответ на холодовое и гипоксическое воздействие
формируются адаптационно-компенсаторные изменения, свидетельствующие об
экономичности функционирования систем организма. Это проявляется в
показателях газотранспортной системы. В таблице 3 представлены данные о
дыхательном коэффициенте и потреблении кислорода у животных, а в таблице 4 –
гематологические показатели. Представленные в таблице 3 данные свидетельствуют
о том, что наметившаяся в фоне (по сравнению с контролем) тенденция к различию
ДК стала достоверной у животных 2 и 3 групп после инъекции стрептозотоцина. У
животных контрольной группы имеется неуклонное снижение ДК. В группах с
воздействиями – на 2-е сутки имеется небольшая тенденция к снижению с
последующей стабилизацией значений.
7
Таблица 3
Динамика потребления кислорода и дыхательный коэффициент у лабораторных
животных с экспериментальным токсическим сахарным диабетом в различных
условиях окружающей среды
Ф о н
Сроки (сутки) после инъекции стрептозотоцина
2
7
10
п о т р е б л е н и е к и с л о р о д а (мл/кг)
1
23,14 ± 0,15
21,63 ± 0,22
18,61 ± 0,28
2
21,21 ± 0,21*
19,90 ± 0,23*
19,85 ± 0,24*
3
21,45 ± 0,23*
19,79 ± 0,25*
19,47 ± 0,25*
д ы х а т е л ь н ы й к о э ф ф и ц и е н т (ед.)
1
0,831 ± 0,013
0,705 ± 0,015
0,695 ± 0,014
2
0,812 ± 0,013** 0,731 ± 0,014*
0,728 ± 0,013*
3
0,814 ± 0,012** 0,728 ± 0,015*
0,721 ± 0,014*
Примечание: то же, что в таблице 2; значком ** обозначено р<0,1
14,34 ± 0,42
19,33 ± 0,26*
19,28 ± 0,27*
0,622 ± 0,010
0,742 ± 0,012*
0,738 ± 0,011*
Известно, что при нелеченном сахарном диабете значение дыхательного
коэффициента практически всегда снижается, что характерно для преобладания
окисления жиров, которое имеет место при выраженном дефиците инсулина.
Аналогичные различия наблюдались и по индексу потребления кислорода (мл
О2/кг). Достоверное снижение потребления кислорода в комфортных условиях
внешней среды указывает не только на физиологическую целесообразность
указанных воздействий, но и на их инсулиноподобную эффективность при
диабетогенной интоксикации стрептозотоцином. Динамика гематологических
показателей у животных представлена в таблице 4. Представленные в этой таблице
данные свидетельствуют о том, что наряду с одинаковой направленностью в виде
увеличения изменении количества эритроцитов и концентрации гемоглобина в
результате воздействия гипоксии и холода, имеются и различия. Так, у животных 2
группы эти показатели достоверно выше, и прежде всего потому, что парциальное
напряжение кислорода в артериальной крови животных в барокамере на “высоте”
4000 м меньше (~ 95 мм рт.ст.), чем на «равнине». Известно, что имеется
качественное сходство в изменении эритрона при действии холода и гипоксии в
виде увеличения митотической активности эритробластов реконструирующихся
эритробластических островков (ЭО) (Медяник Б.В.,1993; Пиксендеева О.В.,1997).
Достоверное увеличение количества эритроцитов через сутки после воздействий
холода и гипоксии можно объяснить их ускоренным освобождением из зрелых
эритробластических островков. Физиологический механизм такой реакции эритрона
понятен, поскольку направлен на обеспечение адекватности потребления кислорода
в условиях тканевой гипоксии, имеющей место при сахарном диабете.
8
Таблица 4
Гематологические показатели у лабораторных животных с экспериментальным
токсическим сахарным диабетом в различных условиях окружающей среды
Сроки (сутки) после инъекции стрептозотоцина
2
7
10
12
к о л и ч е с т в о э р и т р о ц и т о в (х10 /л)
Ф о н
1
2
3
1
2
3
9,090 ± 0,273
9,220 ± 0,269
9,898 ± 0,281
10,80 ± 0,296
10,26 ± 0,254* 12,09 ± 0,260* 12,42 ± 0,237* 12,60 ± 0,243*
9,93 ± 0,261* 10,75 ± 0,253* 10,92 ± 0,261* 11,15 ± 0,272*
к о н ц е н т р а ц и я г е м о г л о б и н а (г/л)
146,2 ± 2,78
149,6 ± 2,52
151,6 ± 2,52
155,3 ± 2,76
170,0 ± 3,19*
172,2 ± 2,28*
176,3 ±2,08*
180,5 ± 1,15*
157,1 ± 2,18*
158,8 ± 2,21*
160,9 ± 2,69*
163,2 ± 2,67*
Примечание: то же, что в таблице 2.
К этому следует добавить данные о гемодинамике, оцениваемой по результатам
определения частоты сердечных сокращений (таблица 5). Анализируя
представленные в таблице 5 данные, следует отметить отчётливую тенденцию (по
сравнению с контролем) к уменьшению ЧСС у животных 2 и 3 групп в результате
периодического воздействия гипоксии и холода с последующей стабилизацией
после формирования сахарного диабета. Урежение ЧСС физиологически
целесообразно и в энергетическом отношении, особенно в условиях недостатка
кислорода, поскольку этим путем обеспечивается полноценное восстановление
энергетических ресурсов сердца (Миррахимов М.М., Агаджанян Н.А., 1974).
Таблица 5
Частота сердечных сокращений у лабораторных животных с экспериментальным
токсическим сахарным диабетом в различных условиях окружающей среды
Ф о н
Сроки (сутки) после инъекции стрептозотоцина
2
1
2
3
7
10
ч а с т о т а с е р д е ч н ы х с о к р а щ е н и й (уд./мин)
433 ± 10
425 ± 11
440 ± 13
450 ± 14
405 ± 9*
390 ± 10*
383 ± 13
380 ± 14*
403 ± 9*
381 ± 11*
386 ± 14
391 ± 13*
Примечание: то же, что в таблице 3.
У животных, находящихся в обычных условиях окружающей среды, отмечено
достоверное увеличение ЧСС на протяжении всех сроков исследования (р<0,05).
Проведенный корреляционный анализ вышеуказанных показателей выявил
достоверную зависимость гематологических и кардиореспираторных показателей от
содержания глюкозы в крови при диабете в сочетании с воздействием гипоксии.
Выявлена положительная корреляция между содержанием глюкозы и количеством
эритроцитов и концентрацией гемоглобина (r = 0,75 и r = 0,74, соответственно), ЧСС
9
(r=0,30), отрицательная корреляция с ДК (r = - 0,87). Также выявлена зависимость
гематологических и кардиореспираторных показателей от содержания глюкозы в
крови при диабете в сочетании с воздействием холода. В группе, подвергшейся
холодовому воздействию, наблюдаются аналогичные менее выраженные изменения
исследуемых показателей в зависимости от изменения уровня глюкозы: эритроциты
(r = 0,31), концентрация гемоглобина (r = 0,31), ЧСС (r=0,10) и достоверная
отрицательная корреляция (r = - 0,80) с ДК. В условиях нормоксии наблюдается
положительная корреляционная связь между содержанием глюкозы и количеством
эритроцитов (r = 0,27), концентрацией гемоглобина (r = 0,57), ЧСС (r=0,65) и
отрицательная корреляция с ДК (r = - 0,79). Динамика кардиореспираторных и
гематологических показателей в контрольной группе по сравнению с группами,
подвергшимися воздействиям, свидетельствует о более выраженных нарушениях
метаболических процессов, причиной которых является стойкая гипергликемия и
нарушения энергетического обмена клеток. Можно предположить, что адаптация к
гипоксии и гипотермии приводит к увеличению мощности системы
энергообеспечения тканей. (Tenney G., 1970, Меерсон Ф.З., 1986). Таким образом,
главным результатом проведенных на 1 этапе исследований является тот факт, что
периодическое понижение температуры или парциального давления кислорода в
окружающей
среде
являются
физиологическими
воздействиями
с
инсулиноподобным эффектом, корригирующим уровень гликемии и метаболизма у
животных с токсической формой СД1. Как известно, нарушения клеточноопосредованного иммунитета при СД1 позволяют отнести его к аутоиммунным
заболеваниям (Никонова Т.В., Алексеева Ю.В., 2012). Поэтому на 2 этапе
исследований нами была выбрана модель иммуннозависимого сахарного диабета.
Как видно из представленного на рис.1 графика, в контрольной группе в течение
всего периода наблюдения отмечается достоверное повышение уровня глюкозы
(р<0,05).
Рис.1 Динамика гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом в обычных условиях
окружающей среды. Примечание: Фон - определение глюкозы крови через 2 недели после
последнего введения стрептозотоцина, в группе с воздействиями 14 сутки - последний день
воздействий, 28 – измерение глюкозы крови через 2 недели после отмены воздействий
В группе животных,
подвергшихся гипоксическим воздействиям, напротив,
имеется достоверное снижение концентрации глюкозы в крови на протяжении всего
периода воздействия по отношению к фону (р<0,001) с тенденцией к
10
восстановлению исходного уровня гликемии после отмены воздействий (рис.2).
Рис.2 Динамика гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом в условиях гипоксии.
Аналогичная динамика гликемии отмечается в группе животных с холодовыми
воздействиями, где концентрация глюкозы в крови в течение двух недель
воздействия достоверно ниже фона (р<0,001) и также после отмены гипотермии ее
значение достигает исходного уровня (рис.3).
Рис.3 Динамика гликемии
гипотермии.
у крыс с экспериментальным сахарным диабетом в условиях
Анализ данных, полученных при воздействии гипоксии и гипотермии на крыс с
аутоиммунным сахарным диабетом 1 типа, выявил, что в обеих группах имеется
достоверная тенденция к снижению уровня гликемии по сравнению с контрольной
группой, в которой на протяжении всех сроков исследования наблюдалось
повышение уровня глюкозы. На 4-е сутки в группах с гипоксическими и
холодовыми воздействиями уменьшение содержания глюкозы в крови составляет 22% и - 16% соответственно. После 4 суток в гипоксической группе продолжается
снижение концентрация глюкозы в крови, в то время как в группе, подвергавшейся
холодовым воздействиям, она остается относительно постоянной. Также
установлено, что снижение содержания глюкозы в крови у животных в группе,
подвергшейся гипоксическому воздействию больше, чем в группе животных,
находящихся в условиях холода: на 7-е сутки, содержание глюкозы было меньше
фонового значения на 25% и 14%, на 14-е сутки на 24% и 18% соответственно.
После отмены воздействий динамика уровня гликемии имеет схожий характер в
11
виде восстановления исходного уровня гликемии (рис.4).
Рис.4 Динамика гликемии у крыс с аутоиммунной формой сахарного диабета в группах с
воздействиями и в контрольной группе в различные сроки.
Основываясь на полученных данных следует отметить более выраженную степень
снижения глюкозы у животных с аутоиммунным диабетом по сравнению с
токсическим (рис.5). Учитывая физиологическое влияние гипоксии и холода на
иммунную систему и механизм патогенеза сахарного диабета 1 типа, можно
предположить, что именно имунносупрессивное действие данных факторов
внешней среды на Т-клеточное звено иммунной системы является
основополагающим в замедлении аутоиммунного процесса. (Смолягин А.И., 1994;
Геппе Н.А., 1994; Горанчук В.В., 1994; Александровский Я.А., 2005).
Изменение массы тела и ДК у животных с аутоиммунной формой сахарного диабета
носит такой же характер, как и у животных с токсической формой сахарного
диабета.
Рис.5. Динамика уровня глюкозы крови у животных с токсической и аутоиммунной формами
сахарного диабета в группах в условиях холода и гипоксии.
Нарушение обмена веществ при сахарном диабете приводит к поражению всех
органов и систем организма. Наибольшую проблему представляет кардиальная
автономная
нейропатия,
к
проявлениям
которой
относят:
синдром
денервированного
сердца,
аритмии,
безболевую
ишемию
миокарда,
ортостатическую гипотонию, нарушения циркадного ритма АД. Важную роль в
12
регуляции АД играет ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РААС).
Основным эффекторным звеном РААС является многофункциональный пептид –
ангиотензин II (Камкин А.Г. и соавт., 2004). В нашем исследовании мы изучали
реакцию на введение ангиотензина-II у лабораторных крыс с экспериментальным
аутоиммунным сахарным диабетом. Анализ данных, характеризующих динамику
изменения АД после однократного внутрибрюшинного введения ангиотензина-II
показал, что у интактных крыс прослеживается достоверное увеличение АД от фона
с 5-ой по 25-ю минуту. График изменения носит волнообразный характер, нарастая
с 5-ой до 15-й минуты и снижаясь до 50-й минуты (р<0,05). У диабетических крыс
колебания АД в течение 50 минут после введения ангиотензина-II носят
аналогичный характер, не изменяясь при этом достоверно по отношению к фону.
Выявлено, что после введения ангиотензина-II у животных с экспериментальным
сахарным диабетом нет закономерного физиологического повышения АД (рис.6).
Рис.6. Динамика АД и ЧСС при введении ангиотензина-II. Примечание: * - р<0,05
При сравнении изменения ЧСС у интактных и диабетических крыс в ответ на
введение ангиотензина-II установлено, что у контрольных крыс имеется
достоверное повышение ЧСС на 15-ой минуте, которое сохраняется до конца
наблюдения. У животных с экспериментальным сахарным диабетом ЧСС
достоверно не изменяется, при этом до 30-ой минуты имеет тенденцию к
повышению, а после - к снижению, на 60-ой минуте возвращаясь к исходному
значению (рис.6). Такие изменения могут свидетельствовать о нарушениях в работе
РААС, функцией которой является краткосрочная регуляция АД. Механизмы
данного эффекта могут быть связаны с состоянием хронической гипергликемии,
которая приводит к избыточному образованию свободных радикалов, отеку
миелиновой оболочки, развитию хронической эндоневральной гипоксии и
снижению проводимости. Декомпенсация сахарного диабета может сопровождаться
транзиторными нарушениями проводимости по нервным волокнам и быть причиной
снижения или потери болевой, температурной, вибрационной, проприоцептивной,
висцеральной чувствительности и ослаблению рефлексов.
Таким образом, в результате проведенных исследований выявлено, что пониженное
парциальное давление кислорода и пониженная температура окружающей среды
способны повысить устойчивость к диабетогенному влиянию стрептозотоцина и
достоверно понизить концентрацию глюкозы крови. Полученные данные
13
свидетельствуют о том, что предварительная адаптация приводит к развитию
компенсаторных процессов в организме, направленных на нормализацию
метаболизма. Компенсация диабета по уровню гликемии совпадает с увеличением
гематологических показателей и тенденцией к восстановлению газоэнергообмена
после введения стрептозотоцина. Показано, что у лабораторных животных с
высоким содержанием глюкозы крови отсутствует закономерная реакция изменения
АД и ЧСС на введения ангиотензина-II.
ВЫВОДЫ
1. В результате комплексных сравнительно-физиологических исследований
установлено, что адаптация к периодическому воздействию гипоксии или холода
повышает устойчивость крыс к диабетогенному влиянию стрептозотоцина.
2.
Гипоксическое
или
холодовое
воздействие
замедляет
развитие
экспериментального сахарного диабета у животных – на 2-10 сутки после инъекции
стрептозотоцина содержание глюкозы в крови достоверно меньше (в среднем,
соответственно, 18,5-16,7 и 17,4-15,8 мМоль/л), чем без воздействий (19,4-21,9
мМоль/л).
3. Инсулиноподобный эффект от гипоксических или холодовых воздействий по
уровню гликемии более выражен у животных с аутоиммунной формой СД1, чем у
животных с токсической формой СД1 (в среднем, на 17% и 13% при токсической
форме и на 25% и 18% при аутоиммунной соответственно).
4. У животных
с аутоиммунной формой СД1 снижение уровня гликемии
достоверно больше в результате гипоксических воздействий, чем холодовых (в
среднем, соответственно, на 7,2-7,7 и 5,6-6,1 мМоль/л). Через 2 недели после отмены
воздействий содержание глюкозы в крови возвращается к исходному (до
воздействий) уровню (21,1-21,6 мМоль/л).
5. У животных
с экспериментальным сахарным диабетом не выявляется
достоверное повышение АД и ЧСС в ответ на введение ангиотензина – II, по
сравнению с контрольной группой.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Полученные данные позволяют считать, что применение периодического
воздействия гипоксии и холода в качестве дополнительных методов коррекции
уровня глюкозы в комбинации с инсулином является перспективным с целью
снижения дозы инсулина и уменьшения побочных эффектов лечения.
14
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1.
Шевченко Л.В., Калашникова Е.Ю., Елфимов А.И. Влияние измененной
газовой среды и температуры на уровень гликемии при сахарном диабете I типа у
крыс.// Материалы XIV Международного симпозиума "Эколого-физиологические
проблемы адаптации"- М.: Изд-во РУДН, 2009.- С. 466 - 467
2.
Торшин В.И., Калашникова Е.Ю., Шевченко Л.В., Елфимов А.И. Влияние
гипоксической газовой среды на животных с экспериментальным сахарным
диабетом 1-го типа.// Технологии живых систем.-2011.- Т.8.-№3.-С. 3 - 6
3.
Торшин В.И., Калашникова Е.Ю., Шевченко Л.В., Елфимов А.И.
Корригирующее влияние измененной газовой среды и температуры на
функциональные показатели у животных после каротидной гломэктомии. //Вестник
РУДН. Серия "Медицина".-2011.- №3.-С. 12 - 16
4.
Торшин В.И., Шевченко Л.В., Елфимов А.И., Калашникова Е.Ю. Влияние
факторов внешней среды на уровень глюкозы в крови при экспериментальном
сахарном диабете 1 типа. // Сборник научных статей и тезисов XII Международного
конгресса "Здоровье и образование в XXI веке". (Москва. 7-10.12.2011 г.). 50 лет
медицинскому факультету РУДН М.: Изд-во РУДН.-2011.-С. 255.
5.
Калашникова Е.Ю., Шевченко Л.В., Торшин В.И., Елфимов А.И., Воронцова
К.О., Богатырева К.Б. Динамика уровня глюкозы крови у крыс с иммунозависимым
сахарным диабетом в различных условиях среды обитания.// Технологии живых
систем. -2012.-Т.9,- №4.-С. 17 – 19.
6.
Evgeniya Kalashnikova, Lidia Shevchenko, Vladimir Torshin. Role of External
Influences on Glucose Level at a Diabetes Mellitus. // Abstr.of the 4th International
Conference on Fixed Combination in the Treatment of Hypertension, Dyslipidemia and
Diabetes Mellitus. -Paragon Conventions.- 2011.- Р.105
КАЛАШНИКОВА ЕВГЕНИЯ ЮРЬЕВНА (РОССИЯ)
«Влияние измененной газовой среды и температуры на формирование
экспериментального сахарного диабета 1 типа»
Целью нашего исследования было изучение физиологических особенностей
экспериментального СД1 (токсическая и аутоиммунная модели) у животных в
обычных условиях окружающей среды и при периодическом воздействии гипоксии
и пониженной температуры. Выявлено, что при длительном воздействии холода и
гипоксии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом имеется достоверное
снижение глюкозы в крови (р<0,05) в отличие от контрольной группы с большей
выраженностью у животных с аутоиммунной моделью сахарного диабета, после
отмены которых происходит восстановление фоновых значений глюкозы. Можно
предположить, что физиологические процессы, происходящие в организме
животных и человека при физических упражнениях, длительном воздействии
холода и гипоксии, являются основой возникновения инсулиноподобного эффекта,
выражающегося в облегчении проникновения глюкозы в клетку. Динамика
кардиореспираторных и гематологических показателей в контрольной группе по
сравнению с группами, подвергшимися воздействиям, свидетельствует о более
15
выраженных нарушениях метаболических процессов, причиной которых является
стойкая гипергликемия и нарушения энергетического обмена клеток. Также
обнаружено, что у животных с высоким содержанием глюкозы в крови, вызванным
аутоиммунным диабетом, отсутствует характерное раннее ангиотензининдуцированное повышение АД и ЧСС на введение ангиотензин-II.
KALASHNIKOVA EVGENIA YURIEVNA
(RUSSIA)
«Effect of changed atmosphere and temperature on the formation of experimental diabetes
mellitus type 1»
The purpose of our research was to study the physiological features of experimental
IDDM1 (toxic and autoimmune models) of animals in normal environment conditions and
in the periodic influence of hypoxia and lowered temperature. It is revealed that the long
influence of cold and hypoxia in rats with the experimental diabetes leads to a significant
decrease of glucose in blood (p < 0,05) in contrast to the control group with the greater
intensity in animals with autoimmune model of diabetes, after the lifting of which there is
the restoration of the background levels of glucose. It is possible to assume that the
physiological processes happening in the organism of animals and humans in physical
exercises, prolonged exposure to the cold and hypoxia are the base of insulin-like effect
which expresses in facilitating of the penetration of glucose in a cage. Dynamics of
cardiorespiratory and hematological parameters in the control group in comparison with
the groups which were exposure to influence indicates about more expressed violations of
the metabolic processes, the cause of which is the resistant hyperglycemia and violations
of the energy metabolism in the cages. It is also revealed that the animals with the high
content of glucose in the blood, caused by autoimmune diabetes, haven’t got typical early
angiotensin-induced increase of blood pressure and a delayed reaction AD and HR on the
introduction of angiotensin-II is observed.
16