Оптимизация бактериологического анализа мочи в соответствии

Оптимизация
бактериологического
анализа мочи в
соответствии с
международными
стандартами
Шуляк Б.Ф.,
научный отдел компании
«ГЕМ» (Москва)
Дорогие коллеги!
Цель наших аналитических обзоров – информирование
специалистов о том, как следует проводить
микробиологические исследования на современном
уровне.
Презентацией можно пользоваться без каких-либо
ограничений с единственным условием - ссылкой на
первоисточник.
ЗНАЧЕНИЕ И ИНЦИДЕНТНОСТЬ ИМП




Формы колонизации патогенными микроорганизмами МС
Бессимптомная бактериурия
С симптомами поражения МС вариабельной тяжести
(гломеруло- и пиелонефрит, цистит, уретрит)
в тяжелых случаях с системными нарушениями и бактериемией
(уросепсис)
У мужчин возможно вовлечение в инфекционный процесс
половых органов (орхит, эпидидимит, простатит)
Инцидентность клинических ИМП
 В 1-е месяцы жизни - 3% мальчиков и 1,5-2% девочек (после 1 г наоборот)
 До достижения совершеннолетия - 1 из 10 девочек и 1 из 20
мальчиков
 В течение жизни - 2% мужчин и >50% женщин.
Ежегодно - 4% населения планеты.
25-40% госпитальных инфекций – важнейший резервуар АМПрезистентных штаммов
США (ежегодно)
9,5 млн. обращений к врачу
300 тыс. госпитализаций
Затраты $3,5 млрд.
Российская Федерация
Нет статистических данных
При численности населения в 2,3
раза меньшей, чем в США,
ежегодно ИМП должны проявляться
у ≈ 4 млн. чел
ОТЕЧЕСТВЕННАЯ НОРМАТИВНАЯ БАЗА
ПРИКАЗ N 535
МЗ СССР
от 22.04. 1985 г.
ОБ УНИФИКАЦИИ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ
(БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ)
МЕТОДОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ,
ПРИМЕНЯЕМЫХ В
КДЛ ЛПУ
Отечественные лаборатории проводят
бактериологический анализ мочи по
регламенту Приказа № 535 МЗ СССР от
22.04. 1985 г.
Часть данного нормативного документа,
касающаяся БАМ, не обновлялась 28 лет,
несмотря на значительные изменения
знаний и совершенствование технических
средств в данной области.
ОСНОВНЫЕ РАЗЛИЧИЯ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ И
ЗАРУБЕЖНЫХ НД ПО БАМ
1. Классификация уропатогенных бактерий.
2. Диагностические критерии ИМП.
3. Методическая основа.
4. Материально-техническое оснащение.
5. Показания для проведения бак. анализа мочи.
КЛАССИФИКАЦИЯ УРОПАТОГЕНОВ
Не все виды микроорганизмов, обнаруживаемых в моче в одинаковой мере
способны вызывать инфекционный и воспалительный процессы
Приказ № 535
 Энтеробактерии (E.coli, Prot.mirabilis, Klebs. pneumoniae,
Citrobacter spp., Serratia spp.), Pseud.aeruginosa, E.faecalis.
 Стафилококки (золотистый, эпидермальный
сапрофитный), Str.pyogenes, Mycoplasma spp.
Рекомендации Евпропейской Ассоциации
клинической медицины (ECLM, 2000 г.)
 Вызывают поражения МС при отсутствии ее
структурных и функциональных нарушений
 Вызывают поражения МС на фоне других патологий,
иммунодефицитов и ятрогенных воздействий
 Редко вызывают клинически значимые ИМП
Уропатогенные бактерии
E. coli – важнейший уропатоген
Уропатогенные штаммы относятся к
О-группам: 01, 02, 04, 06, 07, 08, 016,
016/72, 018, 025, 050, 075
Серотипы часто вызывающие
пиелонефрит: 01:K1:H7; 01:K1:H-;
02:K1:H4; 02:K1:HS; 02:K1:H-; 02:H4;
04:[KS]:[H9]; 04:K12:H1; 04:K12:H5;
06:K2:H1; 06:H1; 07:K1:H-; 09:K34:H-;
016:K1:H6; 016:K1:H-; 018:KS:H7;
018:K5:H-; 025:H1; 075:K5:H-; 075:HОсновной возбудитель цистита 06:K13:K1
Вызывает ИМП у 52-85% пациентов разных
групп.
Резервуар уропатогенных штаммов - люди и
животные (особенно птицы)
Способна вызывать аутоинфекцию, попадая
в МС из кишечника.
Подвижна за счет многочисленных жгутиков
Пилями типов 1 и 2 прикрепляется к
маннозным рецепторам зонтиковых клеток
мочевого пузыря и клеткам почек, соотв.
Способна проникать в клетки, формируя
биопленко-подобные комплексы (104-105 бакт/
клетку) – плацдарм для колонизации МС,
причина неэффективной терапии и рецидивов
ИМП.
БАКТЕРИУРИЯ
Присутствие бактерий в моче может быть
обусловлено инфекционным процессом или
случайной контаминацией мочи.
Инфекционный процесс может сопровождаться
клиническими нарушениями (собственно ИМП) и
бессимптомно (бессимптомная бактериурия)
Поэтому обнаружение в моче даже первичных
уропатогенов не позволяет ставить окончательный
диагноз на ИМП.
КРИТЕРИИ «ИСТИННОЙ» БАКТЕРИУРИИ
Отличить «истинную» бактериурию от случайной
контаминации мочи можно по результатам анализа
парных проб мочи, взятых с интервалом в
несколько дней.
Недостаток
большие материальные и временные затраты.
Высокая титр бактерий в моче - более
практичный критерий «истинной» бактериурии.
Он приемлем, если:
В преаналитический период он не претерпел
существенных изменений.
Установлено его «диагностическое» значение.
МОЧА - ПРЕКРАСНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ БАКТЕРИЙ
Основной способ отбора проб (свободное
мочеиспускание) прост, но сопряжен с
контаминацией посторонними
микроорганизмами
Титр бактерий в моче при комнатной t°С
возрастает с течением времени в
геометрической прогрессии.
Оптимальный срок посева проб ≤30мин
после мочеиспускания, но из-за технических
затруднений его регламентируют 1-2 ч.
Но на практике он значительно больше!
КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМАЯ ТЯЖЕСТЬ БАКТЕРИУРИИ
105 КОЕ/мл
В России диагностическим титром бактерий в моче
считают 105 КОЕ/мл (критерий Э.Х.Касса,
определенный как прогностический показатель
пиелонефрита у беременных женщин).
Большое количество случаев
ИМП не диагностируют (и
соответственно не лечат) из-за
завышенного диагностического
критерия
Но такой показатель не может быть
универсальным, т.к. на него влияют:
Пол и возраст пациента
Наличие или отсутствие симптоматики
Способ взятия проб мочи
Продолжительность и режим преаналитического
этапа хранения проб мочи
Число и патогенность обнаруженных в моче
видов бактерий
Способ оценки степени бактериурии, в т.ч.
величина посевной дозы мочи
КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМАЯ ТЯЖЕСТЬ БАКТЕРИУРИИ
(Европейские рекомендации 2000 и 2008 гг.
Способ взятия мочи
Цистоцентез
Однократная катетеризация
мочевого пузыря
Тип ИМП
Неосложненные
и осложненные
Неосложненные
Обнаруженные
УБ
тип
число
Диагностическ
и-значимый
титр (КОЕ/мл)
Любой
1-2
101
Любой
1-2
102 (♀) 103(дети)
103 (♂)-104 (♀)
Любой
1-2
104
I
1
II
1
102-103 (от тест.
V проб)
Осложненные
Из постоянного катетера
При мочеиспускании (средняя
порция)
Неосложненные
и осложненные
Неосложненые
II
III
Осложненные
Любой
2
1
1-2
104 (♀ и дети)
105
105
105 (♀) - 104 (♂)
ОЦЕНКА ТЯЖЕСТИ БАКТЕРИУРИИ
1.Экспрессметоды
Назначение
Ускоренная диагностика тяжелой бактериурии
Обоснование эмпирической антибиотикотерапии
Сокращение числа проб, подлежащих посеву
Скрининг бессимптомной бактериурии
Частота ошибочных результатов достигает 20-40%.
В отечественных лабораториях
Нитритный (на нитрат редуктазу Г- бактерий)
Трифенил-тетразолий хлоридный (ТТХ)
При титре 105 КОЕ/мл
чувствительность = 98%,
специфичность = 90%
При титре 103 КОЕ/мл
чувствительность снижается до
63%
Другие тесты подсчет бактерий в пробах мочи
В окрашенном по Граму мазке осадка мочи (10 мкл,
1000х;1 бакт=105 КОЕ/мл (низкий порог чувствительности);
В счетных камерах (нативную мочу или ее осадок)
слайд-планшетный центрифужный метод
(чувствительность=106-108 КОЕ/мл, специфичность >
90%): 200 мкл, 200хg - 5 мин, окраска по Граму.
Концентрация = N12 полей х 5
ПИУРИЯ
Повышенная концентрация лейкоцитов в моче подтверждает наличие
воспаления ≥10/мкл (> 5 в поле зрения микроскопа х400, что эквивалентно
выделению с мочой 400 тыс. лейкоцитов/ч)
Экспресс-метод выявления пиурии - тест-полоски на лейкоцитарную эстеразу
Бактериурия без пиурии
контаминация бактериями проб мочи
бессимптомная бактериурия
анализ мочи до развития воспаления
тестирование центрифужного супернатанта
Пиурия без бактериурии
во время антибиотикотерапии
мочекаменная болезнь
травмы и инородные тела в МС
инфекции прихотливых и медленнорастущих бактерий (хламидий,
микобактерий и пр.), не выявляемые рутинным БАМ
неинфекционные гломерулонефрит, интерстициальный нефрит и цистит.
вирусные инфекции
хронические неинфекционные воспалительные процессы
пациенты с трансплантированными почками
подсчет разных видов лейкоцитов, а не гранулоцитов
Количественные методы оценки тяжести бактериурии
V
4-секторный - длительно был основным количественным
способом определения титра бактерий в моче. Трудоемок,
стандартизирован только для V=5 мкл, низкая воспроизводимость
результатов.
Несекторный - осуществляется посевом мочи калиброванной
бактериологической петлей на неселективную среду в чашке
Петри.
Чем ниже предполагаемая тяжесть
бактериурии, тем выше должна быть
N выросших Титр
посевная доза.
высеваемой
колоний
пробы мочи
1 мкл
10 мкл
100 мкл
бактерий в
моче, КОЕ/мл
Способ взятия мочи
1
103
10
104
При мочеиспускании
(средняя порция)
100
105
Надлобковая пункция
1
102
10
103
100
104
1
101
10
102
100
103
При цистоскопии или 1кратной катетеризации
Из введенного на
длительное время катетера
Диагностический
титр (КОЕ/мл)
102 -105
101
102
104
Полуколичественные методы
Полуколичественные методы –
уступают количественным по
точности, но значительно превосходят
их простотой, быстротой учета
результата и низкой трудоемкостью.
Нашли применение в погружной
(Дипслайд) и штриховой (Дипстрик)
технологиях бактериологического
анализа мочи.
На оценку плотности роста по
шаблону или таблице затрачиваются
секунды.
N колоний:
<10
10
10-24
25-50
КOЕ/мл
<103
103
104
105
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Универсальные среды
(кровяной агар, CLED и др.)
Селективные среды
(Левина, МакКонки, Колубийский CNA и др.)
Хромогенные среды
(Uriselect, UTI и др.)
Качество и стандартность питательных сред во многом определяют
достоверность результатов бак.анализа мочи.
Проблема: в связи с распространением прионных
инфекций перестали выпускать основы типа МПБ.
Решение проблемы: Колумбийский агар –пригоден
для культивирования широкого спектра бактерий,
включая прихотливых, и селективной изоляции Г+
бактерий (при добавлении в нее колистина и
налидиксовой кислоты).
Проблема: из-за дефицита овечьей крови стали
пользоваться отходами донорской крови,
содержащими антитела ко многим уропатогенам.
Решение проблемы: Готовые среды с кровью
(зарубежных производителей и ЦФГС-ГЕМ)
Проблема: газонный рост и роение протеев
препятствует выявлению других уропатогенов
Решение проблемы: Низкое содержание
электролитов в среде CLED ингибирует эти
феномены (альтернатива: питательные среды с
мочевиной, карболовой и желчными кислотами.
Кроме того эта среда:
• Хорошо поддерживающая рост Г+ и Г- бактерий.
• Позволяет дифференцировать ферментеров и
неферментеров лактозы.
• Содержит цистин – ускорение роста колиформных
бактерий, обычно образующих мелкие колонии.
Назначение: изоляция, идентификация (по цвету и
морфологии), оценка титра патогенных бактерий в
моче
Особенность: неселективные
UTI (Сифин, Германия) – помимо 2 хромогенных
субстанций содержит МУГ, обеспечивающий
свечение колоний E.coli в ультрафиолетовом свете
CUA (Chrom Urine Agar II, Биолайф, Италия) –
матовый агар, на фоне которого легче определить
цвет колоний.
β-глюкуронидаза
β-глюкозида + Триптофан-дезаминаза
Агар МакКонки
Слабо селективная среда для
энтеробактерий.
Полностью не ингибирует рост
грамположительных кокков (стафилококков ,
стрептококков, энтерококков) и грибов.
На ней плохо растут псевдомонады.
ДИПСЛАЙД (погружная технология)
Преимущества
Простота
применения

Возможность посева мочи в месте ее сбора

Транспортировка и инкубации посевов в 1 контейнере
Стандартные готовые высококачественные среды
МакКонки + Uriselect 3 (более точные идентификация и
подсчет титра Г-бактерий)
CLED + Uriselect 3 (количественная и качественная оценка
бактериурии Г+ и Г- бактерий)
CLED + CNA Колумбийский кровяной агар (количественная и
качественная оценка бактериурии Г+ бактерий)


Экономичность
Недостатки
Недозированная технология засева Дипслайда (погружение в
пробу) при высоком титре бактерий в моче ведет к газонному
росту, при котором затруднены или невозможны:

определение титра бактерий
оценка
морфологии выросших колоний
обнаружение медленно растущих бактерий (в смешанных
культурах)

МЕСТО ЗАСЕВА
1. В домашних условиях
(может сделать пациент)
2. В месте сбора мочи
3. В лаборатории
Если термостата нет, то
засеянный Д хранят при
комнатной температуре
и доставляют в
лабораторию не позднее
24 ч
ПОЛЕЗНЫЙ ОПЫТ
1. В месте сбора мочи высевают ее на Дипстрик.
2. Помещают посевы до утра (12-18 ч) в термостат.
3. Утром просматривают Д и передают в
лабораторию только имеющие признаки роста
бактерий.
4. В лаборатории идентифицируют изоляты,
определяют тяжесть бактериурии и при
необходимости оценивают их чувствительность к АБ
ПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ Б.А.М.
Сложившаяся практика: при неосложненных ИМП из экономических
соображений прибегают к эмпирической терапии = 85% клинического
выздоровления, 15%-неэффективна, около 25-30% - рецидивы, рост
антибиотикорезистентности уропатогенов
Основные показания для проведения бак. анализа мочи
 Осложненные ИМП у небеременных женщин (перед началом лечения
берут мочу для БАМ и корректируют АМП по рез-м анализов)
 Клинические проявления ИМП у беременных женщин
 Все случаи ИМП мужчин (первичная диагностика и корректировка АМП
по рез-м БАМ)
 Вспышки госпитальных ИМП
 Лихорадка у пациентов с катетерами мочевого тракта.
 Повышение температуры ≥ 38°С (при отсутствии явных причин
лихорадки) у детей в возрасте до 3 лет (перед началом лечения берут мочу
для БАМ и корректируют АМП по рез-м анализов)
 Рецидив ИМП (независимо от того, проводилось лечение или нет).
 Неэффективность антимикробной терапии ИМП.
БЕССИМПТОМНАЯ БАКТЕРИУРИЯ
Критерии
Отсутствие симптоматики + обнаружение:
♀: одного вида бактерий в титре ≥105 КОЕ/мл в парных пробах мочи,
взятых при свободном мочеиспускании,.
♂: в титре ≥104 КОЕ/мл в 1 пробе мочи, взятой при свободном
мочеиспускании.
♀и ♂:в титре ≥102 КОЕ/мл в 1 пробе мочи, взятой пункцией мочевого
пузыря,
Бактерии, наиболее часто вызывающие бессимптомную бактериурию
E.coli
K.pneumoniae и другие энтеробактерии
Коагулазонегативные стафилококки
Энтерококки
Агалактийный стрептококк
Gardnerella vaginalis
Proteus mirabilis (превалирует у мужчин)
НУЖНА ЛИ ДИАГНОСТИКА БЕССИМПТОМНОЙ БАКТЕРИУРИИ?
Ранняя диагностика ИМП позволила бы профилактировать болезни М.С.
Регулярно обследовать все население невозможно и экономически не обосновано.
Бессимптомная бактериурия часто переходит в клиническую лишь в группах
повышенного риска. Для выбора показаний для скрининга бактериурии необходимо
определить эти группы.
Группы населения
Необходимость
БАМ
—
12-16 нед
беременности
Женщины в пременапаузе
Беременные женщины
Инцидентность
ББ, %
1-5
2-14
Женщины в постменопаузе
Больные диабетом
Пожилые люди
3-9
1-27
4-50
Корреляция ББ и
заболеваемости
—
+ (без лечения 20-40%
пиелонефрит)
—
±
—
Пациенты с мочевым катетером
Пациенты, которым проводят
гемодиализ
Пациенты с хирургическими
урологическими показаниями
Пациенты с иммунодефицитами и
трансплантатами
9-100
26-28
—
—
—
—
30-80
+
Перед операцией
23-87
—
—
—
—
—
МОНИКИ рекомендует проводить скрининг донорам и реципиентам транспл. почек
Опыт USA и UK
Cкрининг ИМП сократил
инцидентность
пиелонефрита у
беременных женщин с
20-40% до 3%.
Кафедра гинекологии и акушерства ММА им. Сеченова рекомендует в
случаях неэффективного начального курса АМП повторять БАМ с
интервалом в 2 мес до родов.
РЕКОМЕНДАЦИИ И НД РФ
СТ «Бактериологический анализ мочи» - одобрена
микробиологической секцией конференции
«Интерлабдиагностика-2012» (-М., 3.11.2012) – скрининг отмечен
как 1 из показаний для проведения бакт. анализа мочи
Приказ МЗ РФ № 572н от 1.11.2012 г. (Об утверждении
порядка оказания мед. помощи по профилю акушерство и
гинекология» - регламентирован 1-кратный
бактериологический скрининг мочи у всех беременных
женщин, не имеющих симптомов ИМП, после 14 нед
плодоношения.
В Приказе отмечено, что как при ИМП, так и при бессимптомной
бактериурии проводят лечение не эмпирически, а по результатам
анализа антибиотикограммы.
« Мы лечим пациентов в силу своих
возможностей и знаний. Но если бы они
были большими, неужели мы пренебрегли
бы этим?»
(из бесед Авиценны с учениками)
Новые количественные диагностические критерии ИМП позволят
оказывать медицинскую помощь большему количеству людей,
которые ее раньше не получали.
Современные методы и средства диагностики ИМП облегчают
работу лабораторий, повышают достоверность
результатов.анализов и сокращают время на их получение.
Скрининг ИМП у ряда категорий пациентов (грудные дети с
гипертермией, беременные женщины, пациенты хирургических
урологических отделений) сократит инцидентность осложнений
ИМП и необоснованного применения АМП.
Благодарю за внимание