Влияние КФС на метаболизм клеток врожденного иммунитета

Влияние КФС на метаболизм клеток врожденного иммунитета
Плехова Наталья Генадьевна
Доктор биологических наук, заведующая лабораториипатоморфологии и электронной
микроскопии НИИЭМ СО РАМН.
Радькова Л.И. - Врач – преподаватель высшей категории, генеральный директор ООО
«Долгожитель».
Изучено цитотоксическое и проапоптическое действие КФС № 2 на клетки врожденного
иммунитета, а также его способность оказывать влияние на адгезивную активность,
которая является одним из механизмов стимуляции этих клеток. Установлено, что КФС не
обладает цитотоксической, проапоптической активностью и стимулирует адгезию
фагоцитов. Комплексное исследование ферментативной активности клеток врожденного
иммунитета показало выраженное стимулирующее воздействие КФС. Это может стать
решающим фактором, определяющим перспективность его применения в качестве
иммуностимулирующего средства, в частности, для повышения естественной
резистентности организма к возбудителям различных инфекционных заболеваний.
Введение. К одной из многочисленных глобальных проблем, порожденных техногенной
цивилизацией, относится нарастание экологического кризиса в глобальных масштабах.
Два аспекта человеческого существования как части природы и как деятельного существа,
преобразующего природу, приходят в конфликтное столкновение. Особенно это
проявляется на самом человеческом организме, который теряет свое гомеостатическое
состояние. В первую очередь, страдает его иммунная система, объединяющая органы и
ткани, которые защищают организм от заболеваний, идентифицируя и уничтожая
опухолевые клетки и патогены. Эта система распознает множество разнообразных
возбудителей: от вирусов до паразитических червей и отличает их от биомолекул
собственных клеток. Иммунная система защищает организм от инфекции в несколько
этапов, при этом с каждым этапом повышается специфичность защиты. Первую линию
защиты осуществляет врождённая иммунная система, которая включает клеточные
элементы: моно-циты/макрофаги, нейтрофилы и NK-клетки.
Адгезивная способность фагоцитирующих клеток врожденного иммунитета –
нейтрофилов и моноцитов/макрофагов является одним из основных параметров,
определяющих их функциональную активность. Как правило, нарушения адгезии клеток
ведут к значительному утяжелению состояния больного, снижению резистентности
организма к инфекционным агентам.
В ряде случаев снижение уровня адгезии клеток сопровождает вторичные
иммунодефициты различного генеза. В связи с этим актуален подбор
дифференцированного иммунотропного воздействия для корректировки нарушенных
адгезивных свойств фагоцитов.
По основным биохимическим параметрам фагоцитирующие клетки врожденного
иммунитета – моноциты/макрофаги и нейтрофилы – не имеют принципиальных отличий
от других клеток, однако характерной особенностью их метаболизма является
способность под влиянием различных факторов экзогенного и эндогенного
происхождения к мгновенной активации. Нейтрофилы являются короткоживущими, но
многочисленными, и им отведена главная роль в разрушении внеклеточных патогенов и
их токсинов, тогда как другая группа фагоцитов, производных от моноцитов – макрофаги
– относится к длительноживущим клеткам.
В норме большинство нейтрофилов и моноцитов периферической крови находятся в
состоянии покоя. Способность этих клеток к стимуляции систем отражает их
«готовность» к осуществлению основных функций, а именно: бактерицидность,
поглощение и переваривание патогенов, которые в дальнейшем обеспечивают
антигенпредставляющие и иммунорегуляторные функции в защите организма.
Для фагоцитов при фаго-, пино- и экзоцитозе характерно постоянное потребление
(интерьеризация) плазматической мембраны, которое компенсируется перманентным
синтезом ее компонентов. Определение активности эктоферментов мембраны макрофагов,
к которым относят АТФазу, 5'-нуклеотидазу и другие, позволяет оценить степень
стимуляции этих клеток. Также при стимуляции различными агентами в фагоцитах
наблюдается активация ферментных систем, резко возрастают поглощение кислорода,
расход глюкозы, выделение углекислого газа и молочной кислоты, а цепь таких
взаимосвязанных реакций получила название «дыхательного или метаболического
взрыва».
Комплексные
исследования
различных
проявлений
реактивности
фагоцитирующих клеток, основанные как на количественном определении
ферментативной активности, так и на оценке способности клетки к активации систем под
влиянием специфического стимулятора, позволяет подойти к углубленной оценке роли
этих клеток в защите организма.
Недавно русскими учеными был изобретен прибор - пластины КФС Кольцова, в котором
регулирующим фактором является использование скалярной составляющей магнитного
поля и сопутствующие ей продольные электромагнитные волны, составляющие основу
жизни всех белковых систем.
Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования было изучение влияния КФС
на функциональную активность клеток врожденного иммунитета.
Материалы и методы. Фракцию адгезирующих клеток получали из гепаринизированной
(10 ед./мл) венозной периферической крови. В камере Горяева подсчитывали количество
клеток, с верификацией нейтрофилов и мононуклеаров по форме клеточного ядра. Число
моноцитов составляло от 1% до 5% и нейтрофилов от 47% до 72% от общего количества
ядросодержащих клеток. Концентрацию клеток доводили до 2×106 кл/мл, и клеточную
суспензию разносили в пробирки Эпиндорфа. Лейкоцитарную суспензию вносили в лунки
плоскодонного планшета для иммунологических реакций по 100 мкл в лунку, в триплетах
для каждого образца. Время воздействия КФС составило: 15, 30, 45 мин, 1, 2, 3, 4, 5 ч. В
качестве контроля служили клетки без воздействия КФС. После воздействия клетки
высушивали на воздухе, фиксировали в парах формалина в течение 15 мин.
Определяли адгезию клеток, активность фермента плазматической мембраны – 5’нуклеотидазы, для выявления активности кислородзависимой системы использовали
гистохимический метод с нитросинимтетразолием – (НСТ-тест) и выявляли
внутриклеточное содержание лактатдегидрогеназы и миелопероксидазы, а также
катионных
белков
цитоплазматических
гранул
нейтрофилов.
Результаты
спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде
унифицированного показателя – индекса стимуляции (Т), в процентах, который
вычисляли по формуле: Т = (No–Nk)/Nk х 100; где Nk – средний показатель оптической
плотности исследуемого субстрата в нестимулированных клетках; No - средний
показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных клетках.
Для определения цитотоксического действия препарата на клетки использовали метод,
основанный на уменьшении количества метилтиазолилтетразо-лия бромида (МТТ),
включенного в клетки. Преобразование МТТ в формазан происходит с помощью
дегидрогеназ митохондрий, отражающих жизнеспособность клеток. Образованный с
помощью этих ферментов внутриклеточно расположенный диформазан вычисляется
путем определения оптической плотности (ОП) на микроплатерном рейдере при длине
волны 450 нм. Отношение уровня ОП обработанных клеток к уровню ОП контрольных
клеток отражает процент выживших клеток при воздействии на них биологически
активных веществ. В основном МТТ является субстратом для сукцинатдегидрогеназы
(СДГ), которая принимает участие в цепи переноса электронов на молекулярный кислород
О2.
Результаты и обсуждение. В течение всего наблюдаемого периода воздействия КФС (5 ч)
на клетки нами не было обнаружено морфологических признаков гибели. Напротив, по
сравнению с контролем, отмечалось улучшение морфологического состояния клеток.
Так, при микроскопии окрашенных препаратов распластанные клетки с вытянутыми по
поверхности покровного стекла псевдоподиями определяются как интактные.
После 15 мин воздействия КФС преимущественно выявлялись фагоциты в
активированном состоянии, на что указывала их округлая форма. Отсутствие
цитотоксического действия КФС на клетки было подтверждено нами путем исследования
их апоптотической активности, а также показателей некроза фагоцитов. Было выявлено,
что как апоптотический индекс, так и показатель некроза фагоцитов после воздействия на
них КФС недостоверно отличались от таковых значений для интакных клеток на
протяжении всего срока наблюдения. Так, если для интактных клеток апоптотический
индекс составил 12±0,9 %, то для клеток после воздействия на них КФС – 13,6±1,6;
показатель некроза – 8,7±0,7 и 9,4±0,6 % соответственно. Таким образом, нами не было
обнаружено цитотоксического и проапоптотического воздействия КФС на клетки.
При определении активности СДГ в МТТ-тесте было обнаружено повышение показателей
по сравнению с интактными клетками, особенно это было выражено при воздействии
КФС в начальные сроки. Через 15 мин отмечались максимальные показатели 24,4 ± 1,6 %
внутриклеточного содержания этого фермента, а с течением времени его активность
снижалась. Это указывало на стимуляцию функциональной активности нейтрофилов и
макрофагов после воздействия на них КФС.
Адгезивность, т.е. свойство клеток прикрепляться к определенным субстратам и
задерживаться на них имеет важное функциональное значение, поскольку большинство
физиологических и патологических реакций, в которых участвует нейтрофил,
совершается в тканях. Адгезия фагоцитирующих клеток к субстрату является одним из
факторов их активации, необходимым для осуществления последующих событий
фагоцитоза, начиная от распластывания фагоцита на поверхности клетки-мишени и
кончая перевариванием убитой клетки-мишени. Адгезия фагоцитирующих клеток к своим
мишеням обусловлена наличием на поверхности этих клеточных элементов рецепторов
для молекул объекта (собственных или связавшихся с ней). При исследовании адгезивной
способности фагоцитирующих клеток крови под воздействием КФС было установлено ее
повышение. Максимальные показатели адгезивной активности отмечались через 30 мин.
Установленное нами усиление адгезивной активности фагоцитов под действием КФС
может быть одним из возможных механизмов активации бактерицидной активности
клеток.
Одним из характерных признаков стимуляции фагоцитирующих клеток является
снижение внутриклеточного содержания АТФ-азы и 5`-нуклеотидазы плазматической
мембраны клеток, поэтому с целью дифференцировки активированных и покоящихся
клеток исследователями используется тест по определению активности этого фермента.
Снижение уровня этого фермента, играющего важную роль в регуляции аденозинового
обмена, рассматривается как проявление биохимических процессов, сопровождающих
активацию фагоцитов. Нами установлено, что под воздействием КФС на монослой
фагоцитов определяется отчетливое снижение внутриклеточного содержания АТФ-азы и
5`-нуклеотидазы.
Статистически значимо показатели отличались от контроля через уже через 15 мин
воздействия КФС. Минимальные показатели количества этих ферментов наблюдались
через 45 мин и составляли для АТФ-азы -17,1±1,7 и для 5`-нуклеотидазы -12,2±1,1.
Повышение внутриклеточного содержания 5`-нуклеотидазы после 2-х ч воздействия КФС,
на наш взгляд, связано с усилением синтеза пуриновых нуклеотидов клетками, так как
известно, что в этом процессе принимает участие указанный фермент.
Для отражения степени активации кислородзависимого метаболизма фагоцитов, а именно
функции гексозомонофосфатного шунта, и связанной с ним наработки свободных
радикалов кислорода, используется гистохимический метод с нитросинимтетразолием
(НСТ-тест).
При исследовании фагоцитов после воздействия на них КФС было выявлено
статистически значимое повышение показателей НСТ-теста (относительно контрольных).
Максимальное значение индекса стимуляции составило 108,6±10,9 % после 2-х ч
воздействия КФС. Полученные нами данные о повышении показателей НСТ-теста в
фагоцитирующих клетках крови под влиянием КФС указывают на регуляторное действие
этого прибора на кислородзависимый метаболизм изученной популяции клеток, что
может проявляться в повышении их бактерицидной активности.
Известно, что система фагоцитов, являясь звеном быстрого реагирования, играет
важнейшую роль не только в антибактериальной, но и в противоопухолевой защите
организма, а также в аллергических реакциях немедленной гиперчувствительности. В
настоящее время данную систему рассматривают как совокупность иммунокомпетентных
и иммунорегуляторных клеток, участвующих в межклеточных контактах и
взаимодействиях,
формирующих
иммунный
гомеостаз.
От
функциональной
полноценности данных клеток во многом зависит генез, течение и исход многих
патологических
состояний.
Реактивные
формы
кислорода,
произведенные
стимулированными фагоцитами, используются этими клетками для уничтожения
поглощенных микроорганизмов. При стимуляции фагоцитов на первом этапе происходит
образование – супероксидного анионного радикала путем передачи ему электрона от
молекулярного кислорода, тогда как на втором супероксидный анион преобразовывается в
следующий мощный окислительный компонент – перекись водорода (H2O2).
Комплексное исследование состояния клеток врожденного иммунитета показало
выраженное стимулирующее воздействие КФС. Это может стать решающим фактором,
определяющим перспективность его применения в качестве иммуностимулирующего
средства, в частности для повышения естественной резистентности организма к
возбудителям различных инфекционных заболеваний.