Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» СО РАМН Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН На правах рукописи Каня Олег Витославович РОЛЬ ФАКТОРОВ РОСТА В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ ПОСТИНФАРКТНОЙ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ МИОКАРДА 14.03.02 – патологическая анатомия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, Шурыгин Михаил Геннадьевич доктор биологических наук, профессор Лушникова Елена Леонидовна Иркутск, Новосибирск – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Обозначения и сокращения .................................................................................... 3 Введение ................................................................................................................... 4 Глава 1. Обзор литературы ................................................................................... 11 Глава 2. Материал и методы, использованные в исследовании ....................... 31 3.1. Характеристика исследованного патологоанатомического материала . 31 3.2. Моделирование ишемического повреждения миокарда ......................... 32 3.3. Морфологические и морфометрические исследования .......................... 33 3.4. Иммуногистохимические исследования .................................................. 33 3.5. Иммунофлюоресцентные исследования ................................................... 35 3.6. Методы статистического анализа ............................................................... 37 Глава 3. Результаты собственных исследований ................................................ 38 3.1. Анализ экспрессии маркеров дифференцировки фибробластов при инфаркте миокарда ............................................................................................ 38 3.2. Морфометрический анализ влияния факторов роста на фибробластическую фазу воспаления при экспериментальном инфаркте миокарда ............................................................................................................. 52 3.3. Неоангиогенез в условиях измененной концентрации факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда .................................................. 55 3.4. Влияние факторов роста на состояние процессов окислительного фосфорилирования при экспериментальном инфаркте миокарда................ 63 3.5. Влияние факторов роста на репарацию и ремоделирование миокарда в зоне ишемического повреждения .................................................................. 67 3.6. Влияние изменения уровня факторов роста на апоптоз в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза .......................................... 74 Заключение............................................................................................................. 76 Выводы ................................................................................................................... 87 Список использованных источников ................................................................... 89 3 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ антиFGF– антитела к фибробластическому фактору роста; антиVEGF – антитела к вазоэндотелиальному фактору роста; ИМ – инфаркт миокарда; ПИКС – постинфарктный кардиосклероз; α-SMA – гладкомышечный актин α; CD (cluster designation) – маркер клеточной поверхности; Col 1A1 – коллаген 1A1; CTGF – фактор роста соединительной ткани; EGF (epidermal growth factor) – эпидермальный фактор роста; ERK – киназа, регулируемая внеклеточными сигналами; ЕТ – эндотелин; FGF (fibroblast growth factor) – фибробластический фактор роста; FGF1 – кислый фибробластический фактор роста; FGF2 – основной фибробластический фактор роста; IGF (insulin-like growth factor) — инсулинподобный фактор роста; IL-6 – интерлейкин 6; HMGB1 – белок из группы ядерных негистоновых белков HMG; JNK – киназа N-концевой части фактора транскрипции Jun; GM-CSF – колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов; LSP (Lymphocyte-specific protein) — лимфоцитспецифический протеин; MAPK – митогенактивируемая протеинкиназа; ММР – матриксная металлопротеаза; OxPhos – окислительное фосфорилирование; PDGF – тромбоцитарный фактор роста; РКС – фосфокиназа С; PLC – фосфолипаза C; PLD – фосфолипаза D; SAPK – активируемая стрессом протеинкиназа; STAT – -активатор транскрипции; TGF (transforming growth factor) — трансформирующий фактор роста; TNF-α – фактор некроза опухоли альфа; TLR4 – толл-подобный рецептор 4; VEGF (vasoendothelial growth factor) – вазоэндотелиальный фактор роста. 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Увеличение среднего возраста населения привело к тому, что заболевания, сопровождающиеся нарушением кровоснабжения тканей, такие как атеросклероз и его варианты в виде ишемической болезни сердца и инсультов головного мозга, стали одной из наиболее актуальных проблем медицины. Эти заболевания являются ведущей причиной инвалидизации и смертности населения в развитых странах. Несмотря на определенные успехи в профилактике и лечении ишемических повреждений органов, в том числе и сердца, проблема все еще далека от разрешения [Avezum A. et al., 2005, Fox K. et al., 2006]. Изучение процессов репаративной регенерации миокарда и попытки управления этим процессом являются одними из основных научных направлений медико-биологических исследований в связи с высоким уровнем заболеваемости инфарктом миокарда, а также с быстрым развитием и прогрессированием сердечной недостаточности у лиц, перенесших инфаркт миокарда. Репаративные процессы в миокарде после перенесенного инфаркта обусловливают так называемое постинфарктное ремоделирование миокарда, для которого характерны развитие крупноочагового или диффузного мелкоочагового кардиосклероза и, как правило, гипертрофическое ремоделирование кардиомиоцитов. Изучению структурных основ и молекулярно-биологических механизмов постинфарктного ремоделирования миокарда посвящено большое количество работ [Вихерт А.М., 1974; Митин К.С., 1974; Нагорнев В.А., 1977; Непомнящих Л.М., 1991; Автандилов Г.Г. и др., 1984; Park T.S. et al., 2008; Wende A.R. et al., 2012]. В то же время следует отметить, что каждое десятилетие появляются новые подходы к исследованию механизмов регуляции репаративных процессов в миокарде и новые подходы к их стимуляции, что имеет большое практическое значение. В последние годы достигнуты значительные успехи в разработке методов восстановления поврежденной мышцы сердца с использованием достижений клеточных биотехнологий. Однако серьезная проблема заключается в том, что естественная репарация поврежденного миокарда происходит преимущественно за счет быстрого развития соединительнотканного рубца, который после своего формирования крайне медленно подвергается трансфор- 5 мации и существенно замедляет (или делает невозможным) восстановление контрактильной способности поврежденного миокарда [Chin M.T., Murry C.E., 2012]. В то же время ранее проведенными в Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН и Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН исследованиями была показана возможность активного влияния на развитие рубцовой ткани в очаге постинфарктного кардиосклероза, а также пролиферативный потенциал кардиомиоцитов и эндотелиоцитов при изменении в крови и миокарде уровня таких факторов роста, как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF2) [Шурыгин М.Г. и др., 2007; Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г., 2008; Дремина Н.Н. и др., 2009]. В этих исследованиях были изучены возможности индукции регенераторных реакций миокарда в постинфарктный период и установлены основные морфогенетические эффекты фактора роста эндотелия сосудов и имплантированных в мышцу сердца клеток мононуклеарной фракции костного мозга [Ларионов П.М. и др., 2009; Непомнящих Л.М. и др., 2009, 2010]. С учетом данных о неоднородности популяции клеток фибробластического ряда, а также способности клеток мезенхимального происхождения при наличии определённых стимулов менять направление дифференцировки [Mao Q. et al., 2013], представляется актуальным исследование соотношения популяций клеток фибробластического ряда и их синтетических потенций при подобных воздействиях. Это позволит лучше понять механизмы репарации миокарда после инфаркта при естественном течении и при изменении уровня регуляторных пептидов из группы ростовых факторов. Цель исследования – изучить взаимосвязь дифференцировки фибробластов и репаративной регенерации миокарда в постинфарктный период с концентрацией в крови факторов роста FGF2 и VEGF. Задачи исследования: 1. Определить роль в развитии постинфарктного кардиосклероза резидентных и гематогенных клеток-предшественников фибробластов. 2. Изучить соотношение различных форм клеток фибробластического ряда на разных стадиях репарации при инфаркте миокарда. 3. Определить роль основного фактора роста фибробластов и VEGF в 6 дифференцировке клеток фибробластического ряда и их синтетической активности в процессе репарации при инфаркте миокарда. 4. Исследовать связь неоангиогенеза в зоне инфаркта миокарда с количественными изменениями пула клеток фибробластического ряда. Научная новизна. Определен вклад резидентных и циркулирующих клеток-предшественников фибробластов в развитие репаративной регенерации миокарда в постинфарктный период. Впервые показано, что наряду с резидентными фибробластами повышение уровня фактора роста эндотелия сосудов обусловливает миграцию в очаг поражения гематогенных клетокпредшественников фибробластов с фенотипом CD34+CD45+, которые в качестве источников пластического материала способствуют репарации зоны инфаркта миокарда. Впервые исследован процесс постинфарктной репарации миокарда с точки зрения популяционной динамики клеток фибробластического ряда. Установлено, что дифференцировка фибробластов в области формирования постинфарктного кардиосклероза в фиброкласты стимулируется при повышенном уровне VEGF. Дифференцировка в неактивные фиброциты нарушается как при уменьшении, так и при увеличении уровня факторов роста фибробластов и эндотелия сосудов, при этом активные клетки подвергаются каспаз-зависимому апоптозу. Впервые изучена синтетическая активность клеток фибробластического ряда (экспрессия проколлагена и матриксной металлопротеазы) в области развития крупноочагового кардиосклероза при разных уровнях ростовых факторов. Продемонстрировано значительное усиление процесса ремоделирования формируемого рубца при увеличении уровня факторов роста, особенно VEGF. На основании исследования уровня продукции эндотелина и состояния системы окислительного фосфорилирования выявлены новые патогенетические механизмы регуляции обеспечения трофики в зоне репаративной регенерации, связанные с уровнем стимуляции тирозинкиназных рецепторов VEGF. Установлено значительное повышение продукции эндотелина при высоком уровне VEGF. Гиперпродукция эндотелина при отсутствии гладкомышечных клеток в сосудах грануляционной ткани способна поддерживать повышенный объемный кровоток в области репарации за счет известного меха- 7 низма повышенной выработки NO при связывании эндотелина ETB рецепторами. Разработан способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда, основанный на оценке динамики клеточной и внеклеточной локализации матриксной металллопротеиназы в зоне ишемического повреждения. Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы определяется получением новых знаний о роли факторов роста фибробластов и эндотелия сосудов в реализации фибробластической фазы репарации при инфаркте миокарда, регуляции синтетической функции фибробластов и изменении соотношений между пулами активных синтезирующих фибробластов, фиброкластов и фиброцитов. Большое значение имеет выявление повышенной продукции эндотелина и связанной с ним высокой активности системы окислительного фосфорилирования, что позволяет с учетом известных фактов о эффектах эндотелина предложить патогенетический механизм поддержания высокого уровня процессов энергообеспечения в области репаративной регенерации. Установление факта наличия в зоне репарации при повышенном уровне вазоэндотелиального фактора роста плюрипотентных мезенхимальных клеток костномозгового происхождения, способных дифференцироваться, в том числе, и в кардиомиоцитарном направлении, открывает дополнительные перспективы разработки новых способов оптимизации репаративных процессов при инфаркте миокарда. Для патологоанатомической практики важное значение имеет разработка способа определения давности инфаркта миокарда, основанная на оценке распределения матриксной металлопротеазы внутри клеток и во внеклеточном матриксе в зоне инфаркта миокарда. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. При естественном течении инфаркта миокарда и при снижении концентрации факторов роста – FGF2 или VEGF – основным источником пластического материала для репаративного процесса являются резидентные фибробласты. При повышении уровня циркулирующего фактора роста эндотелия сосудов в зону формирования постинфарктного кардиосклероза в дополнение к резидентным клеткам мигрируют костномозговые клетки- 8 предшественники фибробластов. 2. Локализация и уровень экспрессии матриксной металлопротеазы MMP9 в зоне репарации позволяет определять давность инфаркта миокарда, в том числе и в случае рецидивирующего течения и повторных инфарктов миокарда. 3. Изменение естественной динамики факторов роста приводит к нарушению процесса трансформации фибробластов в фиброциты, с преимущественной их элиминацией путем апоптоза. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международной конференции «International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology» (Новосибирск, 2010); международной научной конференции «Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М.Кожова» (Иркутск, 2010); международной конференции «OZBIO2010 combined conferences» (Melbourne, 2010); международной конференции «Генетична і регенеративна медицина: проблеми та перспективи» (Київ, 2010); международном конгрессе «Asian Congress on Biotechnology» (Shanghai, 2011); ежегодных научно-практических конференциях Иркутского отделения Российского общества патологоанатомов (Иркутск, 2010, 2011, 2012, 2013), конференциях Иркутского областного патологоанатомического бюро (2013, 2014), межлабораторной научной конференции в ФГБУ Научно- исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2014). Внедрение результатов исследований. В рамках выполнения диссертационной работы разработан оригинальный способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда (патент RU 2518333 от 06 декабря 2012 г. «Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда»; опубл. 10.06.2014 Бюл. № 16). Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 6 в ведущих рецензируемых научных журналах по списку ВАК. 1. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Каня О.В. Факторы роста как индукторы ангиогенеза// Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М.Кожова: Тезисы докл. междунар. научн. конф. – Иркутск, 2010. – С. 347. 2. Shurygin M.G., Shurygina I.A., Dremina N.N., Kanya O.V. Regulatory 9 effects of fibroblast and vasoendothelial growth factors in experimental myocardial infarction // International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology (BGRS/SB-2010) in Novosibirsk, Russia, 20-27 June 2010. http://conf.nsc.ru/files/conferences/BGRSSB2010/abstracts/6532/6533/Shurygin_f gf_NSC_2010.doc 3. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Каня О.В. Динамика плотности рецепторов к фактору роста фибробластов при экспериментальном инфаркте миокарда // Сибирский медицинский журнал. – 2010. – № 2. – С. 20-22. 4. Shurygin M.G., Shurygina I.A., Dremina N.N., Kanya O.V. Cardioprotective effect of vasoendothelial growth factor at myocardial infarction // OZBIO2010 combined conferences. – Melbourne, 2010. – P. 219. 5. Shurygin M.G., Dremina N.N., Shurygina I.A., Kanya O.V. Modulation of postinfarction cardiosclerosis by changes of FGF2 and VEGF level in early stages of myocardial infarction // Asian Congress on Biotechnology. – Shanghai, 2011. – P. 238. 6. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г., Аюшинова Н.И., Каня О.В. Фибробласты и их роль в развитии соединительной ткани // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). – 2012. – Т. 110, № 3. – С. 8-12. 7. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Экспрессия эндотелина при экспериментальном инфаркте миокарда в условиях измененной концентрации фибробластического и вазоэндотелиального факторов роста // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2013. – № 1 (89). – С. 125-129. 8. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Матриксная металлопротеаза 9 и ремоделирование при инфаркте миокарда // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2013. – № 2-1 (90). – С. 138-141. 9. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Прекондиционирование как защита от ишемического повреждения миокарда // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2013. – № 2-2 (90). – С. 206-210. 10. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Ангиогенез как адаптивный механизм при ишемии // Бюллетень Восточно- 10 Сибирского научного центра СО РАМН. – 2013. – № 5 (93). – С. 192-195. 11. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Каня О.В. Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда // Патент RU 2518333; Заявка № 2012152730 от 06 декабря 2012 г.; опубл. 10.06.2014 Бюл. № 16. 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В последние десятилетия исследованиям возможностей регенерации тканей и органов уделяется чрезвычайное внимание. Даже произошло формирование целого раздела отрасли медицинской науки – регенеративной медицины. В рамках этого направления активно изучаются возможности добиться полноценной репаративной регенерации с восстановлением (или минимизацией потери) структуры и функции органов, повреждённых в результате заболевания, механической травмы или других неблагоприятных воздействий [Gersh B.J. et al., 2009; Nakagawa T., 2014]. При этом диапазон методов, применяемых для достижения конечной цели, чрезвычайно широк – от использования клеточных технологий до биоинженерных решений с попытками воссоздания структуры сложных тканей из набора единичных клеток аналогами метода 3D печати [Kanashiro-Takeuchi R.M. et al., 2011; Templin C. et al., 2011; Ye K.Y., Black L.D., 2011; Schulman I.H., Hare J.M., 2012; Kawaguchi N. et al., 2013; Di Stefano B., Graf T., 2014]. Одним из наиболее активно изучаемых разделов репаративной регенерации является репарация миокарда, особенно после его ишемического повреждения. Такое внимание к исследованиям восстановительных процессов при инфарктах миокарда отчасти обусловлено высоким уровнем заболеваемости, быстрым развитием и прогрессированием сердечной недостаточности у лиц, перенёсших инфаркт миокарда в анамнезе, а также крайне плохой способностью миокарда к регенерации в постнатальный период [Rozenberg V.D., Nepomnyashchikh L.M., 2003; Roger V.L. et al, 2011; Лушникова Е.Л. и др., 2013; Шальнова С.А. и др., 2012; Rui L. et al., 2014]. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в разработке методов восстановления повреждённой мышцы сердца. Направлений в данных исследованиях несколько – это попытки минимизации ишемического повреждения, как профилактического характера (т. н. «прекондиционириование миокарда») [Fryer R.M. et al., 2002; Salloum F. et al., 2003; Liem D.A. et al., 2005. Downey J.M., Cohen M.V., 2009], так и воздействия после эпизода ишемического повреждения («посткондиционирование») [Zhao Z.Q. et al., 2003; Vinten-Johansen J. et al., 2005; McFalls E.O. et al., 2007; 12 Zang W.J. et al., 2007; Argaud L. et al., 2008; Murphy E., Steenbergen C., 2008]. Активно используется введение локально в миокард или удалённо в другие ткани культур клеток, как дифференцированных зрелых, так и стволовых клеток с разной степенью потенций к дифференцировке [Непомнящих Л.М. и др., 2005; Ларионов П.М. и др., 2009; Larionov P.M. et al., 2009; Сергеевичев Д.С. и др., 2010; Abdelwahid E. et al., 2011; Laflamme M.A., Murry C.E., 2011; Karantalis V. et al., 2012; Pawani H., Bhartiya D., 2013; Hastings C.L. et al., 2014; Matar A.A., Chong J.J., 2014]. In vitro удалось добиться формирования культур клеток с кардиомиоцитарным вектором дифференцировки из первичных стволовых клеток [Min J.Y. et al., 2002; Laflamme M.A. et al., 2007; Fernandes S. et al., 2010; Pearl J.I. et al., 2011] или плюрипотентных клеток, полученных из зрелых фибробластов [Budniatzky I. et al., 2014]. Даже проведены успешные попытки ex vivo заселения соединительнотканного каркаса сердца грызуна клетками миоцитарного ряда и эндотелиоцитами, что привело к формированию стенок полостей, обладающих способностью к сокращению и по строению очень близких к естественно сформированному сердцу [Thavandiran N. et al., 2013; Soler-Botija C. et al., 2014]. Однако вследствие низкого пролиферативного потенциала кардиомиоцитов естественная репарация повреждённого миокарда происходит за счёт быстрого развития соединительнотканного рубца, который после своего формирования крайне медленно подвергается трансформации и служит серьёзным препятствием для восстановления контрактильной части миокарда [Розенберг В.Д., Непомнящих Л.М., 2003; Непомнящих Л.М., 2007; Chin M.T., Murry C.E., 2012]. Поэтому остаётся актуальным вопрос регуляции пролиферативной активности клеток в очаге ишемического повреждения, целью которого должно являться разумное снижение пролиферативной и синтетической активности фибробластов и одновременное усиление регенераторной способности кардиомиоцитов или клеток-предшественников с кардиомиоцитарным направлением дифференцировки. Большинство изменений, развивающихся как вследствие ишемического 13 повреждения, так и в качестве адаптивного ответа на него, замыкаются на достаточно узкий спектр внутриклеточных путей реализации ответа. Показано, что адаптация ткани к ишемии сопровождается активацией ряда тирозинкиназ [Maslov L.N. et al., 2009; Zhang J. et al., 2009; Cheng Y. et al., 2013]. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в редокссигнализации путем аутофосфорилирования их собственных тирозинов внутри клеток. Фосфорилирование тирозинкиназ связано с активацией фосфолипаз C (PLC) и D (PLD), приводящих к активации множества киназ, включая фосфокиназу С (РКС) и митоген-активирующую протеинкиназу (МАРК). Механические напряжения, например, в периинфарктной зоне, действуют через потенциальные механорецепторы (интегрины, цитоскелетные и сарколеммаотные протеины) и являются триггером для многих внутриклеточных путей передачи сигнала – MAP-киназ, JAK-, активатора транскрипции STAT, кальцийневрин-зависимого пути. Активация по этим путям приводит к активации сходных последующих факторов транскрипции, таких как NF-kB и AP-1, что требуется для индукции основных генов, ответственных за синтез цитокинов, включая TNF-α и IL-6 [Beg A.A., Baltimore D., 1996]. В процессе функционирования внутриклеточных сигнальных механизмов необходимы один или несколько участков MAP-киназного каскада. Среди трех различных семейств MAP-киназ известны два, регулируемые внеклеточным стрессом: активируемая стрессом протеинкиназа (SAPK), известная также как c-Jun-концевая киназа (JNK), и p38 MAP-киназа [Шурыгина И.А. и др., 2009; Lochner A. et al., 2009; Sucher R. et al., 2009]. Каждая из киназ выполняет в клетке различные функции, так как они имеют разные клеточные мишени и участвуют в различных механизмах передачи сигнала. Повидимому, активация индуцируемых стрессом протеинкиназ необходима для адаптации тканей к ишемии [Flacke J.P. et al., 2009]. Раздельные исследования миогенного и ангиогенного эффектов ишемии in vitro на миобластах и эндотелиальных клетках выявили, что миобласты экспрессируют рецепторы HMGB1 RAGE и TLR4 и в процессе дифференцировки эта экспрессия уменьшается. HMGB1 экскретируется дифференцированными миобластами и усиливает хемотаксическую активность мио- 14 генных клеток. Этот эффект частично связан с RAGE и ингибируется при введении BoxA. HMGB1 стимулирует образование тубулярных структур эндотелиоцитами посредством активации путей трансдукции, связанных с extracellular signal-regulated kinase (ERK) и JNK [De Mori R. et al., 2007]. С киназными механизмами очень тесно связаны регуляторы клеточного роста, относящиеся к различным группам ростовых факторов. При этом многие из них являются индукторами нуклеарных сигналов, изменяющих геномкодируемое состояние клетки. Наибольшее значение в сигнальных системах при ишемическом повреждении среди ростовых факторов отводится 2 группам – фактору роста эндотелия сосудов (Vasoendothelial Growth Factor, VEGF) и фактору роста фибробластов (Fibroblast Growth Factor, FGF) [Isner J.M., Asahara T., 1999]. Проведёнными ранее исследованиями показано, что уровень VEGF и FGF меняется при развитии инфаркта миокарда [Шурыгин М.Г. и др., 2007]. VEGF и FGF существенно влияют на постинфарктное ремоделирование, в частности улучшают реперфузию за счёт неоваскуляризации [Шурыгин М.Г. и др., 2005; Дремина Н.Н. и др., 2009; Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., 2010], действуют как факторы выживания эндотелия [Дремина Н.Н. и др., 2008], влияют на динамику фаз воспаления [Шурыгин М.Г. и др., 2006, 2007; Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г., 2007; Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., 2010], изменяют плотность коллагеновых волокон в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза [Шурыгин М.Г. и др., 2006, 2008]. Кроме того, установлено, что вазоэндотелиальный фактор роста стимулирует митотическую активность кардиомиоцитов [Дремина Н.Н. и др., 2009; Непомнящих Л.М. и др., 2010]. Отмечено, что FGF2 ограничивает цитолиз при инфаркте миокарда [Шурыгин М.Г. и др., 2008], в то время как VEGF таким эффектом не обладает [Шурыгин М.Г. и др., 2008]. С точки зрения возможностей пролиферации органспецифических клеточных элементов все органы и ткани могут быть классифицированы на три группы: 1. Органы и ткани, клеточные элементы которых обладают активной 15 или практически неограниченной пролиферацией, достаточной для полного восполнения дефекта структуры в зоне повреждения (эпителий кожи, слизистых оболочек дыхательных путей, слизистой желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы; гемопоэтическая ткань и др.) [Schepeler T., et al., 2014]. 2. Ткани с ограниченными регенерационными способностями (сухожилия, хрящи, связки, костная ткань, периферические нервные волокна) [Rothrauff B.B., Tuan R.S., 2014]. 3. Органы и ткани, где органоспецифические клеточные элементы, как считалось до последнего времени, практически не способны к пролиферации (сердечная мышца, клетки центральной нервной системы) [Kikuchi K., Poss K.D., 2012; Doppler S.A. et al., 2013]. При повреждении тканей и органов 1 группы возможно полное восстановление повреждённых тканей, ткани второй и третьей труппы из-за ограниченных способностей к регенерации способны к несовершенной репарации через развитие грануляционной соединительной ткани с формированием на месте повреждения соединительно-тканного рубца. Неадекватное формирование рубца порой приводит к развитию заболеваний. Например, избыточный рост соединительной ткани является одним из основных факторов патогенеза (кардиосклероз и связанная с ним сердечная недостаточность, контрактуры суставов, спаечная болезнь, пневмосклероз, цирроз печени, келоидные рубцы), а недостаточное образование соединительной ткани сопровождается несостоятельностью швов, что является актуальной проблемой в хирургии [Järvinen T.A., Ruoslahti E., 2013]. Соединительная ткань является комплексом клеток, волокон и основного вещества, которые объединяются общностью происхождения и выполняемых функций и представляют собой единое целое. Универсальность определяется широким распространением соединительной ткани в организме: она образует строму внутренних органов, основу кожи, серозной и синовиальной оболочек, связки, сухожилия, апоневрозы, оболочки мышц и нервов, участвует в образовании сосудистой стенки. Именно повсеместное распространения соединительной ткани в организме опре- 16 деляет её универсальные свойства и участие в регуляторных механизмах. Разновидности соединительной ткани различаются между собой составом и соотношением клеток, волокон, а также физико-химическими свойствами аморфного межклеточного вещества [Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И., 2009]. Соединительные ткани подразделяются на три вида: 1. Собственно соединительную ткань (рыхлая волокнистая, плотная неоформленная, плотная оформленная); 2. Соединительные ткани со специальными свойствами (ретикулярная, жировая, слизистая); 3. Скелетные ткани (хрящевая, костная, цемент и дентин зуба). Регуляция функций соединительной ткани осуществляется на всех уровнях организации — на уровне клетки, органа, организма. На клеточном уровне имеют значение межклеточные контакты посредством эффекторных веществ, тесно связанных с мембраной клетки, и медиаторов, выделяемых в межклеточное пространство. Взаимоотношение между элементами соединительной ткани осуществляется по принципу обратной связи, что в нормальных условиях обеспечивает адекватность ответов, а при патологии высокую приспособляемость и надёжность [Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И., 2009]. Постэмбриональный гистогенез соединительной ткани в нормальных физиологических условиях направлен на поддержание тканевого гомеостаза. Существенную роль в этих процессах играют межклеточные внутритканевые взаимодействия, индуцирующие и ингибирующие факторы (такие как интегрины, межклеточные адгезивные факторы, функциональные нагрузки, гормоны, оксигенация, факторы роста). Главными компонентами соединительных тканей являются: 1. волокнистые структуры коллагенового и эластического типов; 2. основное (аморфное) вещество; 3. клеточные элементы (фибробласты, макрофаги, лаброциты, адвентициальные клетки, плазматические клетки, перициты, адипоциты). Особый интерес представляют фибробласты – именно они являются преобладающей популяцией клеток рыхлой волокнистой соединительной 17 ткани, занимают одно из ключевых мест при формировании соединительной ткани [Flavell S.J. et al., 2008]. К дифферону фибробластов относятся следующие клетки: 1. малодифференцированные фибробласты; 2. прогениторные клетки фибробластического ряда; 3. дифференцированные или зрелые клетки, или собственно фибробласты; 4. фиброциты; 5. миофибробласты; 6. фиброкласты. Различные формы фибробластов образуют межклеточное вещество соединительной ткани (коллаген, эластин, протеогликаны, гликопротеины) (фибробласты) [Flavell S.J. et al., 2008], поддерживают его в определённом структурном состоянии (фиброциты), и разрушают его при определённых условиях (фиброкласты). Благодаря этим свойствам фибробластов осуществляется одна из функций волокнистой соединительной ткани — репаративная (пластическая). Плазмолемма фибробластов является важной рецепторной зоной, которая опосредует воздействие различных регуляторных факторов. Недавние исследования показали, что фибробласты способны модифицировать качество, выраженность и длительность воспалительной инфильтрации [Parsonage G. et al., 2005]. В настоящее время выделяют три различных источника фибробластов: малодифференцированные фибробласты, локальный эпителиально- мезенхимальный переход, а также образование из косто-мозговых предшественников [Postlethwaite A.E. et al., 2004]. Основной источник фибробластов – малодифференцированные фибробласты. Под действием стимуляции эти фибробласты могут пролиферировать и генерировать новые фибробласты. Локальный эпителиально-мезенхимальный переход – это центральный механизм дифференцировки клеток при формировании органов и тканей [Kalluri R., Neilson E.G., 2003]. Однако ряд исследователей считает, что фибробласты могут образовываться при помощи данного механизма и во взрослом организме при воспа- 18 лении или тканевом повреждении. При этом должна произойти дезагрегация эпителиальных клеток. Эпителий теряет полярность, соединения, десмосомы и цитокератиновые соединительные филаменты. Комбинация цитокинов, разрушение базальной мембраны, действие матричных металлопротеаз и трансформирующего фактора роста бета играют важную роль в индукции локального эпителиально-мезенхимального перехода [Zeisberg M.et al., 2003]. Недавно было обнаружено, что фибробласты могут образовываться из костномозговых клеток-предшественников, которые циркулируют в периферической крови. Эти прогениторные клетки фибробластического ряда составляют около 0.05% клеток периферической крови [Phillips R.J. et al., 2004; Quan T.E. et al., 2004]. К сожалению, в англоязычной литературе им присвоено название «фиброцит», что создаёт путаницу в терминологии и ошибочно подчёркивает низкую активность этих клеток. Прогениторные клетки секретируют различные цитокины, такие как PDGF и TGFb, и способны стимулировать популяцию резидентных фибробластов. Доказано, что эти клетки медиируют репарацию соединительной ткани [Yang L., 2002; Schmidt M. et al., 2003; Moore B.B. et al., 2005]. Считают, что эти клетки способны дифференцироваться в миофибробласты [Abe R. et al., 2001; Bellini A., Mattoli S., 2007]. Циркулирующие прогениторные клетки фибробластического ряда имеют маркеры как лейкоцитов (CD45+, LSP-1), так и моноцитов (CD11a+, CD11b+, CD13+, CD32+, CD64+) и прогениторных клеток (CD34+, CD105+), а также экспрессируют продукты, присущие фибробластам (коллаген I типа, фибронектин, виментин, матричную металлопротеазу-9). При развитии фиброза могут быть задействованы все три механизма привлечения фибробластов в патологический очаг. Пристальное внимание учёных привлекает ещё одна разновидность фибробластов — миофибробласты. Это фибробласты, имеющие некоторые признаки гладкомышечных клеток, т.к. способны в значимых количествах синтезировать гладкомышечный актин [Powell D.W., 2000]. Считают, что эта клетка по своей дифференцировке лежит между фибробластами и гладкомышечными клетками. Морфологически эти клетки идентифицированы около 19 века назад, сейчас этим клеткам приписывают свойства паракриннных клеток. Считают, что они играют важную роль в регуляции таких фундаментальных процессов, как подвижность, пролиферация, дифференцировка, апоптоз, репарация тканей, воспаление и иммунный ответ [Powell D.W. et al., 1999]. Миофибробласты имеют цитоплазматические актиновые микрофиламенты, часто образуют синцитии [Powell D.W., 2000]. До настоящего времени нет единого представления об источнике миофибробластов. Ряд авторов считают, что миофибробласты образуются из костномозговых клеток-предшественников, которые циркулируют в периферической крови – прогениторных клеток фибробластического ряда [Abe R. et al., 2001]. Возможными источниками данных клеток называются также резидентные фибробласты и гладкомышечные клетки [Powell D.W., 2000]. Индуцируют активацию и пролиферацию миофибробластов многие цитокины (IL-1, IL-4, IL-6, IL-8), факторы роста (TGF-α (трансформирующий фактор роста-α), TGF-β, EGF (эпидермальный фактор роста), GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов), PDGF-AA (тромбоцитарный фактор роста-АА), PDGF-BB, aFGF (кислый фибробластический фактор роста), bFGF, IGF-I (инсулинподобный фактор роста-I), IGF-II), а также альдостерон, тромбин, ангиотензин II, эндотелин [Powell D.W. et al., 1999]. При этом наиболее выраженным активирующим эффектом обладает TGF-β. Источником TGF-β в поврежденной ткани могут быть лейкоциты, клетки паренхимы и эпителия, а также сами миофибробласты. PDGF также отвечает за пролиферацию миофибробластов [Jobson T.M. et al., 1998]. Миофибробласты играют ключевую роль в заживлении раны. Миофибробласты активируются после повреждения ткани. В течение репаративного процесса они выделяют провоспалительные цитокины, эйкозаноиды, NO, факторы роста, а также секретируют коллаген и другие белки внеклеточного матрикса. В ответ на провоспалительные цитокины, секретируемые поврежденными эпителиальными клетками и лейкоцитами, миофибробласты начинают секретировать белки внеклеточного матрикса и факторы роста. После завершения процесса репарации они подвергаются апоптозу [Powell D.W., 2000]. 20 Схема дифференцировки циркулирующих в крови прогениторных клеток фибробластического ряда в фибробласты и миофибробласты представлена на рис. 1 (цит. по Bellini A., Mattoli S., 2007). Внешние стимулы приводят к дифференцировке прогениторных клеток фибробластического ряда (на рисунке обозначены как «Fybrocyte» согласно терминологии, используемой в англоязычной литературе) в фибробласты и миофибробласты при репаративном процессе. Сами прогениторные клетки выделяют факторы роста, такие как фактор роста соединительной ткани (CTGF) и трансформирующий фактор роста β (TGF-β), которые могут индуцировать пролиферацию малодифференцированных резидентных фибробластов и их дифференциацию в миофибробласты. Дифференциация прогениторных клеток фибробластического ряда в миофибробласты приводит к потере поверхностных маркеров CD45 и CD34 (фенотип CD45-CD34-). Рис. 1. Схема дифференциации циркулирующих в крови прогениторных клеток фибробластического ряда в фибробласты и миофибробласты. Endothelial cell – эндотелиоцит, monocyte – моноцит, macrophage – макрофаг, eosinophil – эозинофил, epithelial cell – эпителиальная клетка, fibrocyte – прогениторная клетка фибробластического ряда, resident fibroblast – малодифференцированный резидентный фибробласт, lesional fibroblast – фибробласт, myofibroblast – миофибробласт, ET-1 – эндотелин 1, CTGF – фактор роста соединительной ткани, TGF-β – трансформирующий фактор роста β; CD45, CD34, MMP-9 (металлопротеаза 9), collagen I, collagen I-III, fibronectin, α-SMA (гладкомышечный актин α) – маркеры клеток фибробластического ряда. 21 Еще одной разновидностью клеток фибробластического ряда являются фиброциты. Этим термин длительно используют как в России, так и в большей части неанглоязычной зарубежной литературы для обозначения неактивных клеток, имеющих минимальное количество цитоплазмы, слабо развитую эндоплазматическую сеть и потерявшие способность к синтезу протеинов. Это долгоживущие формы клеток, которые регулируют метаболизм и механическую стабильность матрикса соединительной ткани. Фиброкласты – клетки с высокой фагоцитарной и гидролитической активностью, принимают участие в «разрушении» межклеточного вещества. Они сочетают в себе структурные признаки фибриллообразующих клеток (развитую гранулярную эндоплазматическую сеть, аппарат Гольджи, относительно крупные, но немногочисленные митохондрии), а также лизосомы с характерными для них гидролитическими ферментами. Выделяемый ими за пределы клетки комплекс ферментов расщепляет цементирующую субстанцию коллагеновых волокон, после чего происходят фагоцитоз и внутриклеточное переваривание коллагена [Kesiс L.G. et al., 2005]. Для фиброкластов характерна высокая активность ферментных систем, в частности матриксных металлопротеиназ (MMP). Миофибробласты также секретируют матриксные металлопротеиназы (MMP), но только типы 1, 2 и 3, разрушающие базальные мембраны и матрикс [Macdonald T.T., Pender S.L., 1998]. Это играет важную роль в ремоделировании ткани при повреждении. Матриксные металлопротеиназы представляют собой семейство структурно связанных протеолитических ферментов, которые содержат в активном центре ион Zn2+. За то, что данные металлопротеиназы способны разрушать различные типы белков внеклеточного матрикса эти ферменты были названы матриксными [Woessner J.F., 1991; Соловьева Н.И., 1998; Close D.R., 2001; Hidalgo M., Eckhardt G.S., 2001]. ММP играют важную роль в разных процессах жизнедеятельности: в эмбриональном развитии, в ремоделировании тканей, ангиогенезе [Liotta L.A. et al., 1991; Bergers G. et al., 1999], пролиферации, миграции и дифференциации клеток, апоптозе, сдерживании роста опухолей [Matrisian L.M., 1999], росте нервной ткани, заживлении ран, в том числе после инфаркта миокарда и инсульта [Nagase H., Woessner J.F., 1999; 22 Lehrke M. et al. 2009; Jefferis B.J. et al., 2010]. На ряду с этим они задействованы в расщеплении мембранных рецепторов, выбросе апоптозных лигандов, таких как FAS, а также в активации и деактивации цитокинов и хемокинов. В настоящее время данное семейство насчитывает 30 MMP [Bode W. et al., 1999; Nagase H., Woessner J.F., 1999; Troeberg L., Nagase H., 2007]. По субстратной специфичности и структурной организации в семействе ММP выделяют пять подсемейств, при этом ММP9 относится к семейству желатиназ [Соловьева Н.И., 2000]. Основной биологической функцией ММP является удаление компонентов внеклеточного матрикса. Вместе с тем ферменты регулируют и действие ростовых факторов: сосудистого эндотелиального фактора роста, рецептора фактора роста фибробластов, эпителиального фактора роста и инсулиноподобного фактора роста [Sternlicht M.D., Werb Z., 2001]. А такие ферменты, как ММP2, 3, 7, 9 способствуют также активации трансформирующего фактора роста β, который является хемоатрактантом для моноцитов, высвобождая его из матрикса [Mohammed F.F., Smookler D.S., 2003]. MMP1 разрушает коллаген I, II и III типа. MMP2 разрушает денатурированный коллаген I и III типа и нативный коллаген IV типа. MMP3 деградирует ламинин, фибронектин, протеогликаны, казеин и коллаген IV типа. Металлопротеиназы регулируются тканевым ингибитором металлопротеаз, также секретируемым миофибробластами [Powell D.W., 2000]. Известно также, что все ММP обладают субстратной специфичностью: так, желатиназы расщепляют коллаген IV, V типов, а также эластин, фибронектин, ламинин и желатин. И при инфаркте миокарда MMP способны активно разрушать компоненты экстрацеллюлярного матрикса и участвовать в нарушении структуры соединительной ткани [Galis Z.S. et al., 1994; Loftus I.M. et al., 2000]. ММP9 имеет высокое сродство к денатурированному коллагену, но также способна расщеплять нативный коллаген VI, V и XI типов, эластин, а также IL-8, активирующий пептид соединительной ткани III, пластиночный фактор-4, субстанцию Р, амилоидный пептид β. В зависимости от места расщепления этих молекул ММP9 может понижать или повышать их биологическую активность [Van den Steen P.E. et al., 2002]. 23 В последние годы активно изучается система протеолиза при воспалительных процессах различного генеза, сердечно-сосудистых, инфекционных, аутоиммунных, аллергических заболеваниях, а также злокачественной трансформации клеток [Kim H.E. et al., 2000; Hoekstra R. et al., 2001; Rudek M.A. et al., 2001; Mohammed F.F., Smookler D.S., 2003]. Необходимо заметить, что работ, посвященных определению активности ММP в клинической кардиологии, не много, и в основном они представлены экспериментальными исследованиями. Установлено, что активация MMP наступает при изменении соотношения в системе протеазы- антипротеазы. Значительно расширяющиеся исследования MMP при кардиологической патологии демонстрируют значимые эффекты на течение заболеваний различных подсемейств MMP, таких как стромелизины, коллагеназы и желатиназы. Предполагается, что при инфаркте миокарда, сердечной недостаточности, ремоделировании левого желудочка специфическая роль принадлежит активности ММP3 и MMP9. Установлено, что при инфаркте миокарда пиковый уровень MMP9 в сыворотке в большей мере отражает объем сформировавшейся зоны инфарцирования [Kelly D. et al., 2007]. Достаточно интересным является и факт полиморфизма генов ММP3, ММP9, связанных с восприимчивостью к сердечно-сосудистым заболеваниям, атеросклерозу артерий, инфаркту миокарда, аневризме аорты. Вместе с тем активность ММP2 и ММP7, представителей подсемейств желатиназ, и неклассифицированных ММP при кардиологической патологии остается не до конца не изученной, в клиническом и экспериментальном материале имеются противоречивые данные. Внеклеточный матрикс – это комплекс коллагена, гликопротеинов и протеогликанов. Белки матрикса выполняют несколько функций. Одна из основных – взаимодействие компонентов соединительной ткани [Ma Y. et al., 2012]. Через взаимодействие с клеточными рецепторами – интегринами – они инициируют межклеточные взаимодействия. Они взаимодействуют и с факторами роста, секретируемыми при повреждении тканей [Schuppan D. et al., 1998; Dobaczewski M. et al., 2010; Ponticos M., Smith B.D., 2014]. Межклеточное вещество, или внеклеточный матрикс (substantia 24 intercellularis), соединительной ткани состоит из коллагеновых и эластических волокон, а также из основного (аморфного) вещества. Межклеточное вещество образуется, с одной стороны, путём секреции соединительнотканными клетками, а с другой — из плазмы крови, поступающей в межклеточные пространства [Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И., 2009]. Коллагеновые структуры, входящие в состав соединительных тканей организмов человека и животных, являются наиболее представительными её компонентами, образующими сложную организационную иерархию. Основу всей группы коллагеновых структур составляет волокнистый белок – коллаген, который определяет свойства коллагеновых структур [Ricard-Blum S., 2011]. Коллаген составляет более 30% общей массы белков тела, причём около 40% его находится в коже, около 50% - в тканях скелета и 10% - в строме внутренних органов. Коллагеновые волокна в составе разных видов соединительной ткани определяют их прочность. В рыхлой волокнистой соединительной ткани они располагаются в различных направлениях в виде волнообразно изогнутых, спиралевидно скрученных, округлых или уплощенных в сечении тяжей толщиной 1-3 мкм и более [Perumal S. et al., 2008]. Внутренняя структура коллагенового волокна определяется фибриллярным белком – коллагеном, который синтезируется на рибосомах гранулярной эндоплазматической сети фибробластов [Buehler M.J., 2006]. Различают 28 типов коллагена, отличающихся молекулярной организацией, органной и тканевой принадлежностью [Ricard-Blum S., 2011]. Например коллаген I типа встречается главным образом в соединительной ткани кожи, сухожилиях, костях, роговице глаза, склере, стенке артерий и др.; коллаген II типа входит в состав гиалиновых и фиброзных хрящей, стекловидного тела и роговицы глаза; коллаген III типа находится в дерме кожи плода, в стенках крупных кровеносных сосудов, а также в ретикулярных волокнах (например, органов кроветворения); коллаген IV типа – встречается в базальных мембранах, капсуле хрусталика (в отличие от других типов коллагена он содержит гораздо больше боковых углеводных цепей, а также гидрооксилизина и гидрооксипролина); V тип коллагена присутствует в хорионе, амнионе, 25 эндомизии, перимизии, коже, а также вокруг клеток (фибробластов, эндотелиальных, гладкомышечных), синтезирующих коллаген. Коллаген IV и V типа не образует выраженных фибрилл [Shoulders M.D., Raines R.T., 2009]. Основу соединительной ткани составляет коллаген I и III типов. По данным иммуноморфологического анализа, коллаген III типа составляет основу коллагеновых волокон соединительной ткани и незрелых волокон грануляционной ткани, в то время как грубые и зрелые волокна состоят в основном из коллагена I типа. В процессе биосинтеза коллагена при рубца вначале преобладает коллаген III типа. Предполагается, что этот коллаген синтезируют неполностью дифференцированные фибробласты, и что он, за счёт своей структурной стабильности, обеспечивает более благоприятные биомеханические параметры формируемого рубца в период недостаточной зрелости волокон коллагена I типа. Суммарное накопление коллагена в ткани рубца является главным фактором, определяющим механические свойства последнего [Sun Y., Weber K.T., 2000]. Типы I, III, IV и VIII секретируются и миофибробластами [Musso O. et al., 1998]. Кроме того, миофибробласты секретируют фибронектин и тенасцин. Миофибробластами секретируются и такие компоненты базальной мембраны, как ламинин и коллаген IV типа. Гликопротеины играют большую роль в формировании структуры межклеточного вещества соединительной ткани и также определяют его функциональные особенности (фибронектин, фибриллин, ламинин и др.). Фибронектин – главный поверхностный гликопротеин фибробласта. В межклеточном пространстве он связан главным образом с интерстициальным коллагеном. Полагают, что фибронектин обусловливает липкость, подвижность, рост и специализацию клеток. Фибронектин, скрепляющий соединительнотканные клетки и межклеточный матрикс также называют «молекулярным клеем». Благодаря этим свойствам, фибронектин в репаративном процессе играет роль первичного каркаса для последующего упорядоченного расположения фибробластов и коллагеновых волокон, а также обеспечивает необходимый минимум механической прочности грануляционно-фиброзной ткани на ранней стадии ее развития [Grinnell F. et al., 1988; Valenick L.V. et al., 26 2005]. Фибриллин формирует микрофибриллы, усиливает связь между внеклеточными компонентами. Ламинин – компонент базальной мембраны, состоящий из трех полипептидных цепочек, связанных: между собой дисульфидными соединениями, а также с коллагеном V типа и поверхностными рецепторами клеток [Hohenester E., Yurchenco P.D., 2013]. При развитии воспалительного процесса интенсивно размножающиеся фибробласты продуцируют кислые мукополисахариды – основной компонент межклеточного вещества соединительной ткани (гиалуроновую кислоту, хондроитинсерную кислоту, глюкозамин, галактозамин). В рамках репаративной регенерации – процесса ликвидации структурных повреждений после действия патогенных факторов – в тканях с ограниченным пролиферативным потенциалом фибробластам отводится ключевая роль [Chen W., Frangogiannis N.G., 2013]. При этом в результате репаративной регенерации в зоне повреждения образуется не специфическая для данного органа ткань, а рубец, что получило название неполной регенерации или субституции. Репаративная регенерация включает в себя процессы распада поврежденных клеток, дедифференцировки жизнеспособных клеток и их последующей пролиферацией (при наличие столовых клеток способность пролиферировать получают именно они), вторичную дифференцировку, установление межклеточных связей (интеграцию). Стимуляторами фибробластов при репаративной регенерации являются фагоцитирующие макрофаги, которые продуцируют факторы роста фибробластов, усиливая их пролиферацию и синтез коллагена. При избыточном образовании коллагеновых волокон активируются процессы катаболизма коллагена и отмечается снижение синтетической активности фибробластов. Регулирующее влияние на пролиферативную, коллагенсинтетическую и коллагенолитическую функции фибробластов в очаге воспаления оказывают лимфоциты, нейтрофилы и лаброциты [Stramer B.M. et al., 2007]. В ответ на действие альтерирующего фактора возникают, как правило, явления пролиферации фибробластов, усиление их функциональной активно- 27 сти, сопровождающееся формированием фибробластического барьера и инкапсулированием очага воспаления. Восстановление и замещение поврежденных тканей начинается с выхода из сосудов молекул фибриногена и образования фибрина, который формирует своеобразную сетку, каркас для последующего клеточного размножения. Уже по этому каркасу распределяются в очаге репарации быстро образующиеся фибробласты. Деление, рост и перемещение фибробластов возможны только после их связывания с фибрином или коллагеновыми волокнами. Эта связь обеспечивается особым белком – фибронектином. Размножение фибробластов начинается по периферии зоны воспаления, обеспечивая формирование фибробластического барьера [Lee Y.S. et al., 2012; Klingberg F. et al., 2013]. Фибробласты вместе с вновь образованными сосудами создают грануляционную ткань. Это, по существу, молодая соединительная ткань, богатая клетками и тонкостенными капиллярами. Основными функциями грануляционной ткани являются: защитная – предотвращение влияния факторов окружающей среды на очаг воспаления и репаративная – заполнение дефекта и восстановление анатомической и функциональной полноценности повреждённых тканей. Грануляционная ткань постепенно превращается в волокнистую ткань, называемую рубцом. В рубцовой ткани уменьшается количество сосудов, они запустевают, уменьшается количество макрофагов, тучных клеток, снижается активность фибробластов. При развитии грануляционной ткани одним из ведущих клеточных компонентов становятся эндотелиоциты. Безусловно, при таком вкладе в формирование пластического материала для репаративного процесса становится очень важной паракринная регуляция, которую осуществляют эндотелиоциты в периоды своей пролиферации и последующего затухания неоангиогенеза. В ряде работ [Krenning G. et al., 2010; Ieda M., 2013] освещаются множественные механизмы взаимодействия эндотелиоцитов с клеточным и матриксным окружением в сердечной стенке. При этом эндотелиоцит, как прави- 28 ло, является зависимым звеном во множественной межклеточной стимуляции. Сам же эндотелиоцит обладает паракринными свойствами, оказывающими определяющее влияние на состояние кровотока по сосудам. Наиболее важными из них являются оксид азота NO и эндотелины. Обращает на себя внимание упоминаемая функционалная связь между эндотелинами и тирозинкиназными рецепторами, к которым относятся рецепторы факторов роста. Эндотелины – группа биологически активных пептидов широкого спектра действия, являющихся одним из важнейших регуляторов функционального состояния эндотелия. Впервые эндотелин был идентифицирован в 1988 г. в культуре эндотелиальных клеток аорты свиньи и рассматривался как эндотелиевый фактор с высокой вазомоторной активностью [Itoh Y. et al., 1988; Yanagasawa M. et al., 1988; Inoue A. et al., 1989]. Хорошо известно, что проэндотелин (Big-эндотелин) секретируется эндотелием сосудов и состоит из 38 аминокислотных остатков. В дальнейшем, благодаря эндотелинпревращаюшему ферменту, который находится внутри и на поверхности эндотелия, образуются три эндотелиновых изомера: эндотелин-1 эндотелин-2 и эндотелин-3 [Yanagisawa M., Masaki T., 1989; Spinar J. et al., 2002]. Состоят эндотелины из 21 аминокислотного остатка с двумя бисульфидными связями. Известно, что после расщепления Big-эндотелина вазомоторная активность эндотелина повышается в 140 раз. Идентифицированы эндотелины в таких тканях, как легкие, почки, мозг, периферические эндокринные ткани, плацента. Эндотелин-1, в отличие от эндотелина-2 и эндотелина-3, продуцируется эндотелиальными клетками и может синтезироваться на поверхности подлежащих гладкомышечных клеток, нейронах, астроцитах, эндометрии, гепатоцитах, мезангиоцитах, клетках Сертоли, эндотелиоцитах молочных желез, тканевых базофилах [Мордовин В.Ф. и др., 2001]. Эндотелин-2 присутствует в почках, кишечнике, миокарде, плаценте, матке, а эндотелин-3 считается относительно специфичным для головного мозга, где он образуется в наибольшем количестве [Гозмаков О.А., 2001]. Эндотелин-1 не накапливается в эндотелиальных клетках, но очень быстро образуется под воздействием многих факторов: адреналина, ангио- 29 тензина-II, вазопрессина, тромбина, цитокинов и механических воздействий. В минимальных концентрациях эндотелин действует на эндотелиальные рецепторы ETB, вызывая высвобождение факторов релаксации, а в более высоких, при которых сохраняется часть эндотелина, не связавшаяся с рецепторами эндотелия, – активирует рецепторы ETA на гладкомышечных клетках, стимулируя стойкую вазоконстрикцию [Levin E.R., 1995]. Таким образом, при помощи одного и того же фактора реализуются две противоположные сосудистые реакции (сокращение и расслабление), вызываемые различными механизмами. Самым распространенным из эндотелинов считается эндотелин-1. Именно он является маркером коронарного атеросклероза и коронарной эндотелиальной дисфункции, нарушения функционирования печени, снижения функции почек. Кроме того, высокий уровень эндотелина в плазме наблюдается при таких состояниях, как ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, нарушение ритма сердца, а также после гемодиализа и эпизодов значительного подъема артериального давления [Суворов А.В. и др., 2002]. Основными активаторами синтеза эндотелина-1 в организме являются гипоксия, ишемия, острый стресс [Willey K.E. Davenport A.P., 2001]. Эти факторы активируют транскрипцию иРНК и синтез предшественников эндотелина через механизмы, связанные с белками цитоплазматической мембраны эндотелиоцитов [Патарая С.А. и др., 2000]. В то же время, катехоламины, ангиотензин II, липопротеины высокой плотности, факторы роста, тромбин, тромбоксан А2, Са2+ – ионофор активируют внутриклеточные механизмы синтеза эндотелина-1 [Rothermund L. et al., 2000]. К ингибиторам синтеза эндотелина-1 и эндотелина-2 относят натрийуретические пептиды, а синтеза эндотелина-3 – простагландин Е2, простациклин и оксид азота (NO). Достаточно много работ посвящено изменению уровня эндотелина в периферической крови при сердечно-сосудистой патологии, в частности при инфаркте миокарда. В частности, установлено, что при острой ишемии миокарда повышается уровень эндотелина 1 в периферической крови, а его концентрация коррелирует с тяжестью патологического процесса [Суворов А.В. 30 и др., 2002]. При осложнённом течении инфаркта миокарда уровень эндотелина-1 в плазме сохраняется в высокой концентрации и в подострый период [Bohm F. et al., 2005]. Однако работ, посвящённых тканевому распределению эндотелина при инфаркте миокарда, в доступной литературе нами не найдено. С учетом данных о неоднородности популяции клеток фибробластического ряда, а также способности клеток мезенхимального происхождения при наличии определённых стимулов менять направление дифференцировки [Mao Q. et al., 2013], представляется актуальным исследование соотношения популяций клеток фибробластического ряда и их синтетических потенций при подобных воздействиях. Также важным с нашей точки зрения является взаимосвязь эндотелиоцитов и фибробластов в динамике репаративного процесса при изменении уровня стимуляции факторами роста. Это позволит лучше понять механизмы репарации миокарда после инфаркта при естественном течении и при изменении уровня регуляторных пептидов из группы ростовых факторов. 31 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ИССЛЕДОВАНИИ Проведено патологоанатомическое исследование миокарда людей, умерших вследствие инфаркта миокарда, и миокарда экспериментальных животных, у которых воспроизводили инфаркт миокарда. 2.1. Характеристика исследованного патологоанатомического материала Патологоанатомический материал получен от 29 наблюдений умерших от трансмурального инфаркта миокарда и одного случая постинфарктного кардиосклероза. Вскрытия умерших производили в централизованной прозектуре ГБУЗ «Иркутское областное патологоанатомическое бюро», обслуживающей ГБУЗ ОКБ г. Иркутска, имеющее специализированное кардиореанимационное отделение (29 случаев) и другие стационары (1 случай). В 26 случаев диагноз острого инфаркта миокарда был установлен на основании клинической картины, данных электрокардиографии, реакции кардиоспецифических ферментов и подтвержден на вскрытии. В трех случаях диагноз инфаркта миокарда первично выставлен на патологоанатомическом вскрытии. В 4 случаях диагноз острого инфаркта миокарда, как одна из первоначальных причин смерти, был в сочетании с другими нозологическими формами (язвенной болезни желудка осложненной кровотечением, туберкулезом, мегалобластной анемией, кишечными свищами). Для гистологического исследования материал фиксировали в забуференном растворе 10% нейтрального формалина в течение суток. Оценка давности инфаркта миокарда проводилась на основании гистологических критериев: некроз кардиомиоцитов, нейтрофильная инфильтрация и характер ее распределения, инфильтрация лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, пролиферация кровеносных сосудов, фибробластов, коллагеновые волокна. Исследование проведено на базе ГБУЗ «Иркутское областное патологоанатомическое бюро» (нач. бюро — к.м.н. Гришина Г.П.) 32 2.2. Моделирование ишемического повреждения миокарда Для реализации задач диссертационного исследования исследовался экспериментальный материал, полученный при моделировании инфаркта миокарда методом диатермокоагуляции околоконусной межжелудочковой артерии крысы [Шурыгин М.Г. и др., 2007]. Эксперимент выполнялся в соответствии с нормами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) согласно протоколу, одобренному Комитетом по биомедицинской этике НЦРВХ СО РАМН. Исследование проводилось на базе отдела экспериментальной хирургии с виварием ФГБУ «НЦРВХ» СО РАМН (зав. отделом — д.б.н. Лепехова С.А.). Исследован материал от 250 самок крыс линии Wistar весом 220-250 г в возрасте 9 мес: 1. Контрольная группа (50 животных) – моделирование инфаркта миокарда; 2. Группа животных FGF – моделирование инфаркта миокарда, введение FGF2 (Sigma, Cat. N F0291, Lot 124K0797) внутрисердечно в полость левого желудочка в дозе 100 нг однократно через 1.5 ч. после операции по моделированию инфаркта миокарда (50 животных); 3. Группа животных антиFGF – моделирование инфаркта миокарда, введение блокатора активности FGF2 (моноклональных антител к FGF2 Sigma, Cat. N F6162, Lot 025K4835) в дозе 2 мкг внутрисердечно в полость левого желудочка трёхкратно через 1.5, 6 часов и 3-е суток после моделирования инфаркта миокарда (50 животных). 4. Группа животных VEGF – моделирование инфаркта миокарда, введение VEGF (VEGF164 rat recombinant, Sigma, Cat. N V3638-10UG, Lot 064K1239) внутрисердечно в полость левого желудочка в дозе 100 нг (однократно через 1.5 ч. после операции по моделированию инфаркта миокарда (50 животных); 5. Группа животных антиVEGF – моделирование инфаркта миокарда, введение блокатора активности VEGF (моноклональных антител к VEGF — Sigma, Cat. N V1253, Lot 044K1711) в дозе 1 мкг внутрисердечно в полость 33 левого желудочка трёхкратно через 1.5, 6 часов и 3-е суток после моделирования инфаркта миокарда (50 животных). Выведение животных из эксперимента – в сроки 2 ч., 6 ч., 12 ч., 1, 3, 7, 14 и 30 суток после моделирования инфаркта миокарда. Сердце экспериментального животного фиксировали в забуференном растворе 10% нейтрального формалина для дальнейшего гистологического и гистохимического исследования. 2.3. Морфологические и морфометрические исследования Для гистологического исследования материал фиксировали в забуференном растворе 10% нейтрального формалина в течении суток. Проводка гистологического материала проводилась в автоматическом процессоре TissueTek VIP6 c использованием изопропилового спирта. Заливали объекты в гистомикс с применением системы заливки Tissue-Tek VIP5. Микротомия образцов с толщиной срезов 5 мкм выполнялась на санных и роторных микротомах фирмы Leica. Все срезы объектов окрашивались гематоксилином и эозином. В случаях инфаркта миокарда в стадии организации срезы также окрашивались по ван Гизону [Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1982]. Морфометрические исследования осуществляли с помощью программы ImageJ (США) с набором модулей для медицинской морфометрии от Wayne Rasband. Использовали планиметрический метод. Подсчет проводили на микрофотографиях (объектив - 40х, фоторегистрирующая система Nikon с 5 МПикс сенсором размером 2/3''). 2.4. Иммуногистохимические исследования Срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Депарафинировали препараты последовательно в толуоле — 5 минут, затем последовательно в спиртах 100º, 96º, 90º, 70º и 50º по 1 минуте. Выдерживали в дистиллированной воде 10 минут. Для демаскирования антигенов препараты помещали в цитратный буфер (pH=6.0), помещали в микроволновую печь мощностью 800W и нагревали при 100% мощности 8 минут, затем при 60% мощности 10 минут. 34 Охлаждали до 25ºC в цитратном буфере (pH=6.0), промывали дистиллированной водой 2 раза по 5 минут. Образец ткани обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002). Для инактивации эндогенной пероксидазы на каждый препарат наносили по 50 мкл 3% Н2О2, выдерживали 5 минут. Отмывали Трис-буфером (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Затем наносили 50 мкл 0.4% раствора казеина, инкубировали 5 минут, отмывали Трис-буфером (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Затем на каждый препарат наносили первичные антитела. Инкубировали во влажной камере при температуре 25ºC и 100% влажности в течение 1 часа. Отмывали Трис-буфером (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Затем на препараты наносили по 50 мкл раствора, содержащего 10% сыворотку в Трис-буфере (рН=7.6), инкубировали во влажной камере при температуре 25ºC 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Затем наносили вторичные антитела Novolink Polymer (Novocastra, REF=7112, Lot 711236), меченные пероксидазой, по 50 мкл, инкубировали во влажной камере при температуре 25ºC 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Добавляли по 50 мкл субстратной смеси, содержащей 50 мкл 1.74% 3'3'диаминобензидина в 1 мл 0.05% Н2О2 (Novocastra, REF=RE7105, Lot 710550), выдерживали 5 минут. Отмывали водой. Срезы докрашивали 0.02% раствором гематоксилина 3 минуты. Отмывали водой. Дегидратировали последовательно в спиртах 70⁰, 90⁰, 96⁰, 100⁰ по 1 минуте. Затем в толуоле 5 минут. Помещали в заключающую среду Permanent Slide Mounting Medium (Novocastra, REF=7137, Lot 713708) под покровные стекла. Микроскопическое исследование проводили с использованием светового микроскопа Nikon 80i. В качестве первичных антител применяли: 1. Антитела к ММР9 rabbit monoclonal antibody IgG (Epitomics, Clone 1D: EP1254, Cat. N 2551-1, Lot YG 113001P), рабочее разведение 1:200; 2. Антитела к эндотелину ET-1/2/3 (H-38) rabbit polyclonal IgG (Santa 35 Cruz, Cat. N Sc-98727, Lot #G2209), рабочее разведение 1:300; 3. Антитела к коллагену I типа Col 1A1 (D-13) goat polyclonal IgG (Santa Cruz, Cat. N Sc-25974, Lot # BO310), рабочее разведение 1:300. 2.5. Иммунофлюоресцентные исследования Срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли-Lлизином. Депарафинировали препараты последовательно в толуоле — 2 раза по 10 минут, затем последовательно в спиртах 100º, 96º, 90º, 70º по 3 минуты. Выдерживали в дистиллированной воде 10 минут. Затем препараты помещали в цитратный буфер (pH=6.0), помещали в микроволновую печь мощностью 800W и нагревали при 100% мощности 8 минут, затем при 60% мощности 10 минут. Охлаждали до 25ºC в цитратном буфере (pH=6.0), промывали в фосфатносолевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002). Наносили Image-iT FX signal enhancer (Invitrogen. Cat. N I36933, Lot 681688), инкубировали во влажной камере при температуре 25ºC 30 минут. Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Наносили 2% раствор нормальной сыворотки козы (Normal goat serum, Invitrogen, REF PCN 5000, Lot 757418A), инкубировали при температуре 25ºC 30 минут. Наносили первые первичные антитела в рабочем разведении, инкубировали во влажной камере при температуре 25ºC 60 минут. Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Наносили вторичные антитела, нкубировали во влажной камере при температуре 25ºC 30 минут. Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Наносили вторые первичные антитела в рабочем разведении, инкубировали во влажной камере при температуре 25ºC 60 минут. 36 Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Наносили вторичные антитела, инкубировали во влажной камере при температуре 25ºC 30 минут. Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Наносили DAPI (Biotium, Cat. N 40011, Lot 8D0605), рабочее разведение 1:50, инкубировали 10 минут. Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут. Заключали в Fluoromount (Diagnostic Biosystems, REF K024, Lot P 939-B). В качестве первичных антител использовали: 1. антитела к CD34 (ICO 115) mouse monoclonal IgG (Santa Cruz, Cat. N Sc-7324, Lot # C 0909), рабочее разведение 1:300; 2. антитела к CD45 (ОХ 30) mouse monoclonal IgG 2а (Santa Cruz, Cat. N Sc-53047, Lot #В 2409), рабочее разведение 1:300; 3. anti-OxPhos Complex IV subunit I monoclonal antibody (Invitrogen, Cat. N D 0589, Lot 459600), рабочее разведение 1:200; 4. pro-Caspase-3 rabbit monoclonal antibody IgG (Epitomics, Cat.N 1061-s Lot YF041501), разведение 1:500. В качестве вторичных антител использовали: 1. AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11029, Lot 898236), рабочее разведение 1:300; 2. AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11031, Lot 822389), рабочее разведение 1:300; 3. AlexaFluor 568 goat anti-rabbit IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11036 Lot 757102), разведение 1:300. Визуализацию специфического свечения флюорохромных меток проводили на исследовательском микроскопе Nikon Eclipse 80i с приставкой для эпифлюоресценции DIH-M. В качестве фильтров для выделения требуемых диапазонов флюоресценции использовались Nikon DAPI (возбуждение 325375 нм, дихроичное зеркало 400 LP, эмиссия 435-485 нм), Nikon B-2A (возбуждение 450-490 нм, дихроичное зеркало 505 LP, эмиссия ≥515 нм), Nikon TRITC (возбуждение 528-553 нм, дихроичное зеркало 565 LP, эмиссия 590- 37 650 нм). В качестве регистратора использовали камеру Nikon DS-Fi1c, подключенную к контроллеру Nikon DS-U2, с использованием программного обеспечения Nikon Elements. Сведение каналов выполняли в программе ImageJ (NIH, USA) с использованием плагина Stacks – Multi-D. Исследование выполнено на базе лаборатории патофизиологии тканей и функциональной морфологии ФГБУ «НЦРВХ» СО РАМН (зав. лабораторией – д.м.н. Шурыгина И.А.) 2.6. Методы статистического анализа В работе применяли следующие методы статистического анализа: анализ таблиц сопряжённости, вариационный (ANOVA/MANOVA) анализ, корреляционный анализы [Гланц С., 1999, Glantz S.A., Slinker B.K., 2000]. При анализе таблиц сопряжённости оценивали значения статистики Пирсона (χ2), число степеней свободы (df) и достигнутый уровня значимости (р). В случае опровержения гипотезы равенства групповых средних по результатам дисперсионного анализа при одновременном сравнении более 2 групп применяли попарное сравнение групп с помощью контрастов Шеффе. При исследовании корреляции между группами с качественными данными или параметрическими данными с распределением, отличающимся от нормального, использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. При проведении всех видов статистического анализа критический уровень значимости критериев принимали равным 0.05. Анализ данных проводили с использованием статистических пакетов Statistica for Windows и R-project. 38 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Анализ экспрессии маркеров дифференцировки фибробластов при инфаркте миокарда Материалом для исследования послужили 29 наблюдений умерших от трансмурального инфаркта миокарда и один случай постинфарктного кардиосклероза. Вскрытия умерших производили в централизованной прозектуре ГБУЗ «Иркутское областное патологоанатомическое бюро», обслуживающей ГБУЗ ОКБ г. Иркутска, имеющей специализированное кардиореанимационное отделение. В 15 (50%) случаях возраст умерших был старше 65лет. Средний возраст — 63.7 года. Распределение случаев по возрасту представлено на рис. 2. Преобладали мужчины – 18 случаев инфаркта миокарда, женщин – 11 случаев (рис. 3). 10 8 6 4 2 0 30‐40 лет 40‐50 лет 50‐60 лет 60‐70 лет 70‐80 лет 80‐90 лет Рис. 2. Распределение больных инфарктом миокарда по возрасту. мужчины женщины Рис. 3. Распределение больных инфарктом миокарда по полу. 39 Все случаи возникновения инфаркта миокарда распределены по группам: до 1 суток – 4 случая, 24-47 часов – 11 случаев, 2-3суток – 2 случая, 4-6 суток – 3 случая, 7-13 суток – 5 случаев, 2-3 недели – 1 случай, 3-4 недели – 1 случай, свыше месяца (постинфарктный кардиосклероз) – 1случай. Оценка давности инфаркта миокарда проводилась на основании гистологических критериев: некроз кардиомиоцитов, нейтрофильная инфильтрация и характер ее распределения, инфильтрация лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, пролиферация кровеносных сосудов, фибробластов, коллагеновые волокна. В четырех случаях давность инфаркта миокарда была до 1 суток: 2 случая давностью до 6 часов, два случая – от 6 до 23 часов. Инфаркт миокарда давностью до шести часов характеризовался нераномерным кровенаполнением сосудов, лейкостазами, контрактурами, глыбчатым распадом кардиомиоцитов, исчезновением поперечнополосатой исчерченности. В сроки 6-23 часа присоединялся некроз кардиомиоцитов со слабой нейтрофильной инфильтрацией (рис. 4). В одиннадцати случаях давность инфаркта миокарда составляла 24 – 47 часов. Морфологические изменения для данного срока характеризовались некрозом кардиомиоцитов с полным и неполным кариолизисом, диффузной нейтрофильной инфильтрацией в зоне некроза. Инфаркт миокарда давностью 2 – 3 суток имел место в двух случаях. Морфологически изменения характеризовались некрозом кардиомиоцитов, в формированием лейкоцитарного вала на границе с неизмененным миокардом. В трех случаев инфаркта миокарда давностью 4-6 суток на границе некротизированного миокарда наряду с нейтрофильной, макрофагальной и лимфоцитарной инфильтрацией имела место пролиферация фибробластов (рис. 5). Инфаркт миокарда давностью 7 – 13 суток, 5 случаев, характеризовался инфильтрацией лимфоцитами, плазматическими клетками, пролиферацией фибробластов, замещающих некротическую ткань (рис. 6 – 8). В 1 случае давность инфаркта была 2-3 недели. Морфологически изменения характеризовались замещением зоны некроза грануляционной тканью с созреванием сосудов синусоидального типа. Клеточная инфильтрация представлена лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками (рис. 9). 40 Рис. 4. Мужчина 77лет. Трансмуральный инфаркт миокарда, некротическая стадия (давность до суток). Кардиомиоциты с утраченной поперечной исчерченности, глабчатым распадом. Пикноз ядер. Кровоизлияния. Редкие нейтрофилы. Окраска гематоксилином и эозином. Рис. 5. Мужчина 73года. Геморрагический инфаркт миокарда, некротическая стадия (давность 4 – 6 суток). Вновь образованные сосуды, фибробласты, кровоизлияния, гипертрофия кардиомиоцитов по периферии. Окраска гематоксилином и эозином. 41 Рис. 6. Мужчина 41 года. Трансмуральный инфаркт миокарда, фаза организации (давность 7 – 13 суток). Пролиферация фибробластов, вновь образованные сосуды, инфильтрация лимфоцитами. Окраска гематоксилином и эозином. Рис. 7. Мужчина 48 лет. Трансмуральный инфаркт миокарда, фаза организации. Пролиферация фибробластов с тонкими коллагеновыми волокнами, тонкостенные сосуды, лимфоциты, макрофаги. Окраска гематоксилином и эозином. 42 Рис. 8. Мужчина 48лет. Трансмуральный инфаркт миокарда, фаза организации (давность 7 – 13 суток). Пролиферация фибробластов, тонкие коллагеновые волокна. Лимфоциты. Окраска гематоксилином и эозином. Рис. 9. Мужчина 60 лет. Трансмуральный инфаркт миокарда, фаза организации. Зона инфаркта миокарда замещена грануляционной тканью с пучками коллагеновых волокон. Инфильтрация лимфоцитами и макрофагами. Тонкостенные сосуды. Окраска гематоксилином и эозином. 43 Инфаркт миокарда давностью 3 – 4 недели (1 случай) – зона некроза замещена соединительной тканью со слабой инфильтрацией лимфоцитами, гемосидерофагами. Коллаген в соединительной ткани был представлен в виде тонких волокон и пучков; наблюдался разной степени выраженности отек (рис. 10). В одном случае имел место сформированный постинфарктный кардиофиброз. Для оценки динамики клеточных популяций в зоне ишемического повреждения при инфаркте миокарда нами оценена экспрессия CD34, CD45, ММР9, проколлагена (Col1A1). Как известно, фенотип CD34+ характерен для клеток со слабой дифференцировкой, плюрипотентных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов, CD45+ - для клеток, имеющих костномозговое происхождение, в то же время фенотип CD34+CD45+ отмечается у прогениторных клеток фибробластического ряда и предшественников кроветворных клеток. Так как предшественники мегакарио-, лейко-, лимфо- и эритроцитарных ростков локализуются в костном мозге и не попадают в периферический кровоток, то выявление клеток с таким фенотипом в очаге повреждения означает приход прогениторных клеток, служащих в дальнейшем одним из источников роста фибробластов в зоне повреждения. При окрашивании на наличие маркеров CD34 и CD45 установлено, что в зоне инфаркта миокарда СD45+ клетки появляются с первых суток патологического процесса, положительные находки выявляются до 10 – 14-х суток, в более поздние сроки (до 21-х суток) удавалось выявить единичные положительно окрашенные клетки. CD34+ клеток в зоне инфаркта выявить не удалось, соответственно, не удалось обнаружить и клеток, несущих одновременно маркеры CD34+ и CD45+ (рис. 11, 12). Как известно, ММP9 в высоких концентрациях присутствует в нейтрофилах. В нашем исследовании в ранние сроки (до 3 суток) в зоне ишемического повреждения во всех исследуемых группах регистрировались окрашенные положительно на ММР9 нейтрофилы. 44 Рис. 10. Мужчина 71год. Трансмуральный инфаркт миокарда фаза организации (давность 3 – 4 недели). Зона инфаркта замещена пучками коллагеновых волокон, отек. Окраска гематоксилином и эозином. Рис. 11. Большое количество CD45+ клеток в зоне инфаркта миокарда (давность 11 суток). Иммунофлюоресценция (первичные антитела к CD45, вторичные меченные AlexaFluor 568, докраска ядер DAPI). 45 Рис. 12. CD45+ клетки в зоне инфаркта миокарда (давность 21 сутки). Иммунофлюоресценция (первичные антитела к CD45, вторичные меченные AlexaFluor 568, докраска ядер DAPI). Рис. 13. Ярко окрашенные нейтрофилы в сосудах периинфарктной зоны и во внеклеточном матриксе, 9 часов после инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ММР9, докрашивание гематоксилином). 46 Рис. 14. Яркая окраска внеклеточного матрикса (давность 2 суток) после инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ММР9, докрашивание гематоксилином). Рис. 15. Ярко окрашенные фиброкласты в зоне постинфарктного кардиосклероза, 14 суток после инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ММР9, докрашивание гематоксилином). 47 Причем при летальных исходах, случившихся в течение нескольких часов после развития инфаркта, регистрировались ярко окрашенные нейтрофилы в сосудах периинфарктной зоны, а также ярко окрашенные нейтрофилы в зоне инфаркта (рис. 13). В срок давности инфаркта от 1 до 2-х суток фиксировали дегрануляцию нейтрофилов, потерю окраски цитоплазмы нейтрофилов. Параллельно с этим было зафиксировано появление яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта, что отражает диффузию ММР9 из выделенных нейтрофилами гранул в ткани (рис. 14). В случае летальных исходов в более поздние сроки (3 – 30 суток) появлялась специфическая окраска клеток фибробластического ряда в пограничной зоне. Наличие MMP9 в фибробластах связывают с необходимостью перестройки внеклеточного матрикса при образовании и созревании соединительной ткани. При этом максимальная выраженность окраски отмечена на 7 – 14 сутки (рис. 15). После 30 суток специфическая окраска в зоне постинфарктного кардиосклероза не регистрировалась. Таким образом, окрашивание на ММP9 на гистологических препаратах в разные сроки после развития инфаркта миокарда отражает как динамику цитолитического процесса и выход ММP9 в зону повреждения в ранние сроки патологического процесса, так и функциональную активность ряда клеток по ремоделированию фибриллярных белков в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза в поздние сроки. При этом в ранние сроки основным источником ММP9 в зоне повреждения являются нейтрофилы, мигрирующие в очаг ишемического повреждения во время нейтрофильной фазы воспаления. В поздние сроки окраска на ММР9 клеток фибробластического ряда с максимумом окраски на 7 - 4 сутки отражает появление в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза клеток с фиброкластической активностью, одной из основных функций которых является перестройка внеклеточного матрикса. Известно, что ремоделирование миокарда, происходящее после эпизода ишемического повреждения, имеет очень важный аспект — перестройку соединительнотканного каркаса. При этом развивается ферментативное расщепление существовавших ранее соединительнотканных волокон (преимущественно коллагена) и синтез нового межуточного вещества, орга- 48 низующегося согласно новым условиям механических нагрузок органа. Наибольшую роль в этом процессе отводят ферментам группы металлопротеиназ. Интенсивность окраски фиброкластов в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза отражает активность перестройки внеклеточного матрикса в сроки 7 – 14 суток после перенесенного инфаркта миокарда. Снижение активности данного процесса сопровождается снижением интенсивности и последующим исчезновением специфической окраски. В связи с четко выраженной стадийностью применение окраски на ММP9 при инфаркте миокарда удобно использовать для определения давности возникновения инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании. Для исследования активности клеток по синтезу новых соединительнотканных волокон была исследована экспрессия проколлагена в зоне репарации некротизированных при инфаркте миокарда тканей и прилегающих зонах. Единичные клетки, экспрессирующие проколлаген I А1, в зоне инфаркта миокарда впервые обнаружены на 3-и сутки патологического процесса, находки оставались немногочисленными и на 4-6 сутки. Их количество нарастало к 7 – 13-м суткам (рис. 16), с 14 до 30 суток сохранялось большое количество таких клеток в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза, однако интенсивность окраски этих клеток несколько снижалась (рис. 17). Однако слабо выраженную положительную окраску удалось выявить в зоне постинфарктного кардиосклероза при сроке давности инфаркта миокарда более 1 месяца (рис. 18). Это свидетельствует о сохраняющейся – пусть и незначительной – синтетической активности фибробластов в области постинфарктного кардиосклероза и о продолжающемся ремоделировании постинфарктной зоны. Нами также изучена экспрессия эндотелина в тканях сердца при инфаркте миокарда. Как известно, эндотелиальные клетки увеличивают продукцию эндотелина в ответ на гипоксию, оксидированные формы липопротеидов низкой плотности, провоспалительные цитокины. При инфаркте миокарда в первые сутки зарегистрирована подчеркнутость сосудов в зоне некроза миокарда. В остальные сроки сохранялась окраска эдотелиоцитов, в основном в периинфарктной зоне. При этом макси- 49 мальная интенсивнсть окраски отмечена на 7-13 сутки (рис. 19 – 21). Рис. 16. Ярко окрашенные фибробласты в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза, 8 суток после инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ColIA1, докрашивание гематоксилином). Рис. 17. Фибробласты в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза, 21 сутки после инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ColIA1, докрашивание гематоксилином). 50 Рис. 18. Фибробласты, экспрессирующие ColIA1 в зоне постинфарктного кардиосклероза. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ColIA1, докрашивание гематоксилином). Рис. 19. Окраска эндотелиоцитов на ЕТ-1/2/3 в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. 7 суток. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином). 51 Рис. 20. Окраска эндотелиоцитов на ЕТ-1/2/3 в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. 15 суток. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET1/2/3, докрашивание гематоксилином). Рис. 21. Окраска эндотелиоцитов на ЕТ-1/2/3 в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. 28 суток. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET1/2/3, докрашивание гематоксилином). 52 В отсутствии в сосудах гладкомышечных клеток, имеющих доминирующие ETA рецепторы (при активации которых развивается вазоспазм), выделяемый эндотелин связывается с ETB рецепторами на эндотелиоцитах, что приводит к активации синтеза и экскреции NO и, как следствие, - вазодилатации посткапиллярного русла. Также для миокарда описано связывание эндотелина с Gq-протеином, приводящее к ускорению реполяризации (развитие положительного хронотропного эффекта) и активация пути передачи сигнала IP3. Усиление стимуляции IP3 вызывает высвобождение в кардиомиоцитах Ca2+ саркоплазматическим ретикулумом, что дает положительный инотропный эффект. 3.2. Морфометрический анализ влияния факторов роста на фибробластическую фазу воспаления при экспериментальном инфаркте миокарда Для изучения влияния факторов роста на процессы ремоделирования миокарда при экспериментальном инфаркте у крыс проводили количественную оценку клеточных элементов в динамике процесса формирования постинфарктного рубца в зоне инфаркта. При изучении морфологической картины выявлено, что у животных фибробластическая фаза начиналась с 3 суток, когда в зоне некроза формировалась грануляционная ткань. На 7 сутки в зоне некроза происходило замещение некротизированных тканей молодой соединительной тканью. На 14-30 сутки наблюдали созревание соединительной ткани. При этом интенсивность пролиферации фибробластов и сроки максимальной выраженности фибробластической фазы, а также трансформация активных фибробластов в фиброциты в группах различались. Так, в большинстве групп максимальная плотность фибробластов на единицу площади зоны инфаркта миокарда приходилась на 7 сутки. В контрольной группе она составила 202 [176-211]. В группе VEGF в этот срок она определена как 295 [249-340], достоверно превышая показатель группы контроля (р=0,0046). Интересно, что и в группе антиVEGF этот показатель достоверно превышал данные контрольной группы — 306 [272-369] (р=0,0025). 53 В группе антиFGF при пиковой выраженности количества фибробластов на 7 сутки имелась тенденция к снижению плотности фибробластов на единицу площади по сравнению с группой контроля (167 [151-215]), однако различия были недостоверны. В группе FGF отмечено длительное сохранение в зоне репарации высокой плотности фибробластов – на 7-е и 14-е сутки, при этом если на 7-е сутки плотность не отличалась от показателей в контрольной группе – 205 [192 – 275], то сохранение высокой плотности и на 14-е сутки – 204.5 [179 – 246] приводило к достоверным отличиям от группы контроля в этот срок – 95,5 [83,5 – 108] (р=0,00009). Отмечено, что изменение концентрации вазоэндотелиального фактора роста существенно влияло на длительность обнаружения в зоне репарации высокой плотности активных фибробластов. Так, если в контрольной группе после пиковых значений на 7-е сутки в последующие сроки количество фибробластов значительно снижается (на 14-е сутки – 95,5 [83,5-108], на 30-е сутки – 80 [70,5 – 84]), в группе VEGF этот показатель превышал значения контрольной группы: на 14-е сутки – 252,5 [220 – 282] (р=0,00009), на 30-е сутки – 132 [125 – 148] (р=0,00009). Аналогичная картина наблюдалась и в группе антиVEGF: на 14-е сутки – 250,5 [233 – 260] (p=0,00009), на 30-е сутки – 195,5 [139 – 237] (p=0,00009). Для установления, какой из факторов роста в большей степени влияет на пролиферацию фибробластов в зоне репарации, нами было проведено сравнение групп VEGF и FGF, антиVEGF и антиFGF между собой. Установлено, что в нашем исследовании повышение VEGF в системном кровотоке в большей степени стимулировало рост фибробластов по сравнению с FGF. Так, плотность фибробластов в зоне репарации в группе VEGF во все сроки наблюдения превышала значения в группе FGF. Различия были достоверны на 7 (295 [249 – 340] в сравнении с 205 [192 – 275], р=0,0257) и 30 сутки (132 [125 – 148] в сравнении с 88 [81 – 122], р=0,0036). Однако при снижении содержания факторов роста за счет введения антител, фибробластические клетки большую чувствительность демонстрировали к снижению уровня FGF. Плотность фибробластов в зоне репарации в группе антиVEGF во все сроки наблюдения достоверно превышала показатели группы антиFGF: на 3-и сутки 299 [130 – 481] и 132,5 [92 – 148], p=0,0257; 54 на 7-е сутки – 306 [272 – 369] и 167 [151 – 215], p= 0,0008; на 140е сутки – 250,5 [233 – 260] и 131,5 [121 – 147], p=0,0002; на 30-е сутки – 195,5 [139 – 237] и 88,5 [81 – 96], p= 0,0003. Полученные данные обобщены на рис. 22. Plot of Means and Conf. Intervals Active Fibroblastes 400 350 300 Кол-во/п.з. 250 200 150 100 50 0 h02 h06 h12 h24 s03 Срок ИМ s07 s14 s30 Group a-FGF Group FGF Group Control Group VEGF Group antiVEGF Рис. 22. Динамика плотности активных фибробластов в зоне репаративной регенерации при экспериментальном инфаркте миокарда. Интересно влияние факторов роста на динамику трансформации фибробластов в фиброциты в зоне репарации. Так, в группе контроля, начиная с 14 суток, в зоне репарации превалировали фиброциты. Применение как факторов роста, так и антител к ним нарушало трансформацию фибробластов в фиброциты, в результате чего до конца наблюдения в данных группах фибробласты превалировали над фиброцитами, при попарном сравнении с группой контроля во всех случаях зафиксирована достоверность отличий как на 14-е, так и на 30-е сутки наблюдения. В группах с измененной концентрацией VEGF эти изменения были наиболее наглядными. При этом наиболее выраженные изменения в трансформации фибробластов в фиброциты отмечены в 55 группе антиVEGF. Было высказано предположение, что наблюдаемые изменения в снижении количества фиброцитов обусловлены тем, что механизмы выведения активных фибробластов через запуск апоптоза при нарушении естественного уровня стимуляции ростовыми факторами превалирует над трансформацией фибробластов в фиброциты. 3.3. Неоангиогенез в условиях измененной концентрации факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда Как известно, ангиогенез – один из наиболее важных биологических процессов, происходящих в организме млекопитающих [Бузиашвили Ю.И. и др., 2000]. Перспективно применение различных ангиогенных факторов при ишемии, способных улучшить реперфузию за счёт неоваскуляризации. Известно, что ангиогенной активностью обладают многие цитокины, основными из которых являются эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фибробластический фактор роста (FGF) [Freedman S.B., Isner J.M., 2002]. VEGF и FGF запускают процессы ремоделирования существующих сосудов и истинного ангиогенеза – формирования новых сосудов [Isner J.M., Asahara T., 1999; Carmeliet P., Jain R.K., 2000; Carmeliet P., 2005]. Полагают, что кислый (FGF1) и основной (FGF2) факторы роста фибробластов индуцируют ангиогенез за счёт стимуляции роста эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток [Conway E.M. et al., 2001]. Считают, чтоFGF1 экспрессируется в ишемизированном миокарде и может играть ключевую роль в формировании коллатералей [Schaper W., Ito W.D., 1996]. Подобный эффект отмечен и для FGF2 при многократном введении препарата [Unger E.F. et al., 1994]. Однако по наблюдению Lazarous D.F. et al. (1995) длительная терапия с применением FGF2 в эксперименте не приводила к каким-либо структурным или вазопролиферативным эффектам через 6 мес. после начала терапии [Lazarous D.F. et al., 1995]. По данным Sato K. et al. (2000) однократное интраперикардиальное и интракоронарное введение FGF2 ведет к улучшению перфузии и контрактильности миокарда, однако однократное внутривенное применение препарата не эффективно [Sato K. et al., 2000]. 56 При оценке количества эндотелиоцитов на единицу площади в зоне инфаркта миокарда установлено, что у животных контрольной группы в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда (от 2 часов (50.0 [43.0 – 54.0] до 1 суток (38.0 [29.0 – 43.0])) наблюдалось закономерное снижение количества эндотелиоцитов в зоне инфаркта миокарда. К 3-м суткам с началом роста грануляционной ткани в зоне ишемического повреждения закономерно отмечалось увеличение количества эндотелиоцитов (124.5 [68.0 – 144.0]). К 7 суткам количество эндотелиоцитов в зоне некроза достигало максимума (167.5 [118.0 – 185.0]). К 14-м суткам уменьшение плотности сосудов совпадало со снижением количества эндотелиоцитов (96.0 [93.5 – 103.5]). На 30-е сутки плотность эндотелиоцитов не отличалась от измеренной на 14-е сутки (96.5 [90.0 – 104.0]). При искусственном повышении концентрации в крови основного фибробластического фактора роста динамика плотности эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения в сроки от 2 часов до 7 суток не отличалась от показателей контрольной группы. Однако на 14 сутки у этой группы сохранялась высокая плотность эндотелиоцитов (151.5 [99.0 – 161.0]), в то время как у контрольной группы к этому сроку плотность эндотелиоцитов снижалась (96.0 [93.5 – 103.5]), различия между группами в этот срок статистически достоверны (р=0.044). К 30 суткам различия нивелировались. При повышении уровня вазоэндотелиального фактора отмечена тенденция повышения выживаемости эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения, в итоге к 1 суткам после начала эксперимента количество эндотелиоцитов на единицу площади в группе VEGF (65.5 [40.0 – 91.0]) достоверно превышало показатели группы контроля (38.0 [29.0 – 43.0], p=0.0099). Кроме того, как и при повышении уровня FGF2 на 14-е сутки у этой группы сохранялась высокая плотность эндотелиоцитов. При искусственном снижении уровня FGF2 за счет введения блокирующих антител резко снижалась выживаемость эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда по сравнению с группой контроля. Так, через сутки после моделирования патологического процесса плотность эндотелиоцитов в зоне некроза (7.5 [1.0 – 22.0]) была в 5 раз ниже, чем в группе контроля (38.0 [29.0 – 43.0]) (р=0.0017). 57 Такая же тенденция отмечена на 3 (80.5 [38.0 – 144.0] по сравнению с 124.5 [68.0 – 144.0] в группе контроля) и 7 сутки (109.5 [75.0 – 190] по сравнению с 167.5 [118.0 - 185.0] в группе контроля). На 14 и 30 сутки плотность эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения не отличалась от показателей контрольной группы. Искусственное снижение вазоэндотелиального фактора роста приводило к достоверному снижению количества эндотелиоцитов на 3 (51.0 [41.0 62.0] по сравнению с 124.5 [68.0 - 144.0] в контрольной группе, р= 0.0012) и 7 сутки патологического процесса (61.5 [51.0 - 83.0] по сравнению с 167.5 [118.0 - 185.0] в контрольной группе, р= 0.00004). Пик плотности эндотелиоцитов на единицу площади препарата в этой группе приходился на 14 сутки (129.0 [83.0 – 139.0]), недостоверно превышая в этот срок показатели контрольной группы. Однако на конечную точку наблюдения - 30 сутки - данный показатель у животных группы антиVEGF был достоверно ниже, чем в группе контроля (57.0 [42.0 - 92.0] и 96.5 [90.0 - 104.0] соответственно, р= 0.044) (рис. 23). Means and Conf. Intervals Endoteliocytes 200 Кол-во/п.з. 150 100 50 0 h02 h06 h12 h24 s03 Срок ИМ s07 s14 s30 Group a-FGF Group FGF Group Control Group VEGF Group antiVEGF 58 Рис. 23. Динамика плотности эндотелиоцитов в зоне репаративной регенерации при экспериментальном инфаркте миокарда. При исследовании взаимосвязи роста сосудов и пролиферацией клеток соединительной ткани в очаге репарации при инфаркте миокарда в контрольной группе не выявлено достоверной корреляции между количеством эндотелиоцитов, отражающим активность ангиогенеза, и показателями динамики клеток фибробластического ряда. Однако в случае изменения концентрации факторов роста наблюдалась статистически достоверная связь этих показателей. При этом выявленные зависимости носили неоднозначный характер. В группах FGF2 и VEGF наблюдалась закономерная положительная сильная корреляционная связь (r=0.77 и r=0.79 соответственно) между количеством фибробластов и эндотелиоцитов. При введении антител к VEGF не выявлено достоверных зависимостей. Но определялась сильная корреляция количества эндотелиоцитов и фибробластов в группе антиFGF. Это можно объяснить тем, что на 3-и сутки заканчивается отрицательная динамика эндотелиоцитов, вызванная снижением выживаемости клеток в условиях гипоксии при отсутствии фактора роста, и идет параллельная пролиферация сосудистого и соединительнотканного компонентов. Учитывая полученные нами данные о характере экспрессии эндотелина при инфаркте миокарда у людей, а также данные литературы о таких эффектах эндотелина, как регуляция роста и выживаемости самих синтезирующих эти пептиды эндотелиоцитах и окружающих их клеток, нами исследована продукция эндотелинов при экспериментальном инфаркте миокарда. Выявлено, что у животных контрольной группы наблюдалась нежная окраска на эндотелин в зоне инфаркта миокарда и периинфарктной зоне, начиная с 1-х суток после моделирования патологического процесса. Пик окраски наблюдался на 3 сутки, когда выявлялась достаточно яркая окраска в области грануляций (рис. 24). К 7-м суткам интенсивность окраски значительно снижалась, в этот срок отмечалась подчеркнутость сосудов в пограничной и инфарктной зонах. В более поздние сроки специфическая окраска не регистрировалась. В интактной зоне специфическая окраска не регистрировалась весь период 59 наблюдения. Рис. 24. Контрольная группа, 3 суток, нежная неяркая окраска на эндотелин в пограничной зоне. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ЕТ-1/2/3, докрашивание гематоксилином. Рис. 25. Группа VEGF, 3 суток, яркая окраска на эндотелин в зоне инфаркта миокарда. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ЕТ-1/2/3, докрашивание гематоксилином). 60 Применение факторов роста резко усиливало окраску пограничной и инфарктной зон уже через 1 сутки после моделирования инфаркта миокарда. К 3-м суткам интенсивность окраски резко нарастала (рис. 25, 26), затем медленно снижалась и регистрировалась до 14-х суток. Причем в группе VEGF в срок 1 и 3 суток регистрировалась окраска сосудов в интактном миокарде. Применение антител к факторам роста снижало интенсивность окраски инфарктной и периинфарктной зон в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда (с 1 по 3 сутки), особенно это явление было характерно для животных группы анти-VEGF. Так, на 3 сутки в группе анти-VEGR регистрировалась очень бледная окраска инфарктной и периинфарктной зон (рис. 40) и чуть более яркая – в группе анти-FGF (рис. 41). К 7-м суткам интенсивность окраски резко нарастала, достигая максимума, а к 14-м суткам вновь снижалась. Причем у животных группы анти-VEGR зафиксирована окраска сосудов в зоне интактного миокарда (рис. 27). Изменение динамики выработки эндотелина в ответ на введение факторов роста свидетельствует о сдвиге и повышении экспрессии этого регулятора на более ранние этапы репарации миокарда после факта его ишемического повреждения. Вероятно, это объясняется, с одной стороны, большей сохранностью клеток в зоне ишемического повреждения при высоких концентрациях ростовых факторов, способностью их к ответу на стимуляцию в условиях гипоксии, а с другой стороны – повышением готовности генного аппарата клеток к ответу на стимулы, активирующие транскрипцию генов в ответ на экстрацеллюлярные сигналы. С учетом эффекта взаимодействия данного лиганда с ETB рецепторами эндотелиальных клеток, приводящего к вазодилатации, выявленная динамика свидетельствует об увеличении объемного кровотока в зоне повреждения и прилежащих к ней областях миокарда. Таким образом, нами установлено значительное воздействие факторов роста на интенсивность ангиогенеза и функциональную активность эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения и периинфарктной зоне при экс- 61 периментальном инфаркте миокарда. Рис. 26. Группа VEGF, 3 суток, яркая окраска на эндотелин в пограничной зоне. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином). Рис. 27. Группа антиVEGF, 3 суток, минимальная выраженность окраски на эндотелин в пограничной зоне. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином). 62 Рис. 28. Группа антиFGF, 3 суток, очень слабо выраженная окраска на эндотелин в зоне инфаркта. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином). Рис. 29. Группа антиVEGF, 7 суток, слабое окрашивание на эндотелин сосудов в интактном миокарде. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ET-1/2/3, докрашивание гематоксилином). 63 3.4. Влияние факторов роста на состояние процессов окислительного фосфорилирования при экспериментальном инфаркте миокарда Для оценки уровня и особенностей тканевого распределения акимвности комплексов окислительного фосфорилирования нами произведено иммунофлюоресцентное исследование на OxPhos комплекс. Окраска на anti-OxPhos Complex IV выявила закономерное изменение распределения окраски в зоне ишемического повреждения по сравнению с зоной интактного миокарда. Так, у животных контрольной группы уже через 2 часа после моделирования инфаркта миокарда наблюдалась неравномерность окраски в зоне инфаркта миокарда. Вследствие ишемии в кардиомиоцитах наблюдалось формирование участков с неравномерным распределением выявляемого в данной окраске комплекса с цитохромом с, локализующегося в митохондриях. С 1-х суток наблюдалась легкая неравномерность распределения окраски в кардиомиоцитах пограничной зоны и отсутствие окраски в зоне инфаркта миокарда, свидетельствующая о резком уменьшении содержания комплексов, обеспечивающих сопряжение окислительно-восстановительных реакций с переносом энергии на макроэрги (рис. 30, 31). Неравномерность окраски сохранялась до 14-х суток наблюдения. В то же время в группе VEGF глыбчатость и неравномерность окраски в зоне ишемического повреждения зарегистрирована начиная с 2 часов после моделирования инфаркта миокарда. К 7 суткам картина значительно отличалась от наблюдаемой в контрольной группе – интенсивность и неравномерность окраски в кардиомиоцитах периинфарктной зоны достигала максимума, при этом регистрировалась окраска комплексов OxPhos в фибробластах зоны формирования постинфарктного кардиосклероза (Рис. 32, 33). Неравномерность и глыбчатость окраски сохранялись в последующие сроки наблюдения. Неравномерность распределения окраски на anti-OxPhos Complex IV subunit I отмечена и в группе антиVEGF (рис. 34, 35), при этом неравномерность окраски отмечалась также в периинфарктной зоне, зона инфаркта миокарда не окрашивалась. 64 Рис. 30. Контрольная группа, 3 суток, неравномерная окраска кардиомиоцитов в пограничной зоне, минимальные зоны окраски в зоне инфаркта миокарда. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к anti-OxPhos Complex IV, вторичные антитела, меченные AlexaFluor 568). Рис. 31. Контрольная группа, 7 суток, неравномерная окраска кардиомиоцитов в пограничной зоне, отсутствие окраски в зоне инфаркта миокарда. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к anti-OxPhos Complex IV, вторичные антитела, меченные AlexaFluor 568. Окраска ядер DAPI). 65 Рис. 32. Группа VEGF, 3 суток, неравномерная окраска кардиомиоцитов в пограничной зоне, единичных фибробластов в зоне инфаркта миокарда. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к anti-OxPhos, вторичные антитела, меченные AlexaFluor 488, Окраска ядер DAPI). Рис. 33. Группа VEGF, 7 суток, ярко выраженная неравномерность окраски клеток в пограничной зоне. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к anti-OxPhos, вторичные антитела, меченные AlexaFluor 488, Окраска ядер DAPI). 66 Рис. 34. Группа антиVEGF, 3 суток, неравномерная окраска кардиомиоцитов в пограничной зоне, отсутствие окраски в зоне инфаркта миокарда. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к anti-OxPhos Complex IV subunit I, вторичные антитела, меченные Alexa fluor 568). Рис. 35. Группа антиVEGF, 7 суток, лёгкая неравномерность окраски кардиомиоцитов в пограничной зоне. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к anti-OxPhos Complex IV, вторичные антитела, меченные AlexaFluor 488. Окраска ядер DAPI). 67 Выявленные особенности подтверждают тот факт, что у животных с введением факторов роста клетки в очаге ишемического повреждения клетки сохраняют свою жизнеспособность, и у выживших клеток сохраняется достаточно высокий уровень ферментов окислительного фосфорилирования. Неравномерность распределения выявляемого комплеска OxPhos, вероятно, связана с изменением условий функционирования и перестройкой структуры клеток. Таким образом, при введении экзогенных факторов роста внутрисердечно в инфарктной зоне активность комплексов окислительного фосфорилирования восстанавливалась быстрее в сравнении с контрольной группой животных и со снижением уровня факторов роста. 3.5. Влияние факторов роста на репарацию и ремоделирование миокарда в зоне ишемического повреждения Для оценки динамики клеточных популяций в зоне ишемического повреждения при экспериментальном инфаркте миокарда и влиянии на этот процесс вазоэндотелиального и фибробластического факторов роста нами оценена экспрессия CD34, CD45, ММР9, проколлагена (Col1A1). Как известно, фенотип CD34+ характерен для клеток со слабой дифференцировкой, плюрипотентных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов, CD45+ - для клеток, имеющих костномозговое происхождение, в то же время фенотип CD34+CD45+ отмечается у прогениторных клеток фибробластического ряда и предшественников кроветворных клеток. Так как предшественники мегакарио-, лейко-, лимфо- и эритроцитарных ростков локализуются в костном мозге и не попадают в периферический кровоток, то выявление клеток с таким фенотипом в очаге повреждения означает приход прогениторных клеток, служащих в дальнейшем одним из источников роста фибробластов в зоне повреждения. У животных контрольной группы CD34+ и CD45+ клетки в зоне ишемического повреждения впервые обнаружены через 1 сутки после моделирования инфаркта миокарда. Причем если на 1 и 3 сутки процесса CD34+ клетки были немногочисленными, то CD45+ - выявлялись только единичные 68 клетки. Сочетание CD34+CD45+ обнаружить не удалось. На 7, 14 и 30 сутки регистрировалось небольшое число CD34+ клеток, единичные CD45+ выявлялись на 7 и 14 сутки. При искусственном повышении уровня VEGF в периинфарктной зоне с 1-х по 14-е сутки выявлялось большое число клеток, несущих маркеры CD34+ и CD45+. Причем клетки, одновременно экспрессирующие оба маркера, выявлялись с 1-х по 14-е сутки с максимумом на 14-е сутки (рис. 36). При искусственном подавлении активности вазоэндотелиального фактора роста CD34+ клетки в зоне ишемического повреждения регистрировались с 1-х по 7-е сутки с максимумом на 3-и сутки, CD45+ были немногочисленны и выявлялись только на 3-и и 7-е сутки (рис. 37). Одновременного наличия обоих кластеров дифференцировки на клетках в очаге ишемического повреждения при его репарации у этой группы животных не выявлено. Выявленные особенности типирования источников и дифференцированности клеток в участке репаративной регенерации после ишемического повреждения миокарда свидетельствуют о том, что в обычных условиях практически все клетки имеют локальный генез, а при активации пролиферативной активности происходит их частичная дедифференцировка. В условиях значительного повышения уровня ростовых факторов в участке репарации появляются клетки с фенотипом CD34+CD45+, описанные в литературе как прогениторы клеток фибробластического ряда с достаточно низким уровнем дифференцировки (в зависимости от направления дифференцировки могут выступать в качестве предшественников тканей мезенхимального происхождения). Ремоделирование миокарда, происходящее после эпизода ишемического повреждения, имеет и еще один очень важный аспект — перестройку соединительнотканного каркаса. При этом развивается ферментативное расщепление существовавших ранее соединительнотканных волокон (преимущественно коллагена) и синтез нового межуточного вещества, организующегося согласно новым условиям механических нагрузок органа. Наибольшую роль в этом процессе отводят ферментам группы металлопротеаз. 69 Рис. 36. Группа VEGF, 3 суток, зона инфаркта миокарда. Большое количество CD34+ клеток и CD45+ клеток, наличие клеток CD34+CD45+ (виделены). Иммунофлюоресценция (CD34 мечены AlexaFluor 488, CD45 мечены AlexaFluor 568, докраска ядер DAPI). Рис. 37. Группа антиVEGF, 3 суток, зона инфаркта миокарда. Большое количество CD34+ клеток, единичная CD45+ клетка. Иммунофлюоресценция (CD34 мечены AlexaFluor 488, CD45 мечены AlexaFluor 568, докраска ядер DAPI). 70 Как известно, металлопротеаза 9 в высоких концентрациях присутствует в нейтрофилах. Невысокие концентрации этого фермента характерны для определенных клеток фибробластического ряда – фиброкластов. В нашем исследовании в ранние сроки (до 3 суток) в зоне ишемического повреждения во всех исследуемых группах регистрировались окрашенные положительно на ММР9 нейтрофилы. В более поздние сроки отмечалась окраска клеток фибробластического ряда. Так, в контрольной группе с 3-х по 30-е сутки наблюдалась окраска единичных клеток фибробластического ряда (рис. 38). При искусственном повышении уровня факторов роста положительные на ММР9 клетки фибробластического ряда также регистрировались с 3 по 30 сутки, однако их количество было значительно выше, чем в контрольной группе (рис. 39). При искусственном подавлении активности факторов роста удавалось зафиксировать лишь единичные положительно окрашенные на ММР9 клетки фибробластического ряда в зоне ишемического повреждения (рис. 40). Синтетическую активность фибробластов, обеспечивающую образование внеклеточного матрикса вновь образуемой соединительной ткани, оценивали по экспрессии Col1A1. У контрольной группы животных наблюдали положительную окраску клеток фибробластического ряда на 3-и и 7-е сутки (рис. 41). Применение антител к факторам роста снижало интенсивность окраски на Col1A1 (рис. 42, 43). Все это свидетельствует о том, что при высокой активности факторов роста в начальные периоды после эпизода ишемического повреждения формируется программа репарации, при которой за счет длительного существования клеток соединительной ткани с достаточно высоким уровнем экспрессии MMP9 и Col1A1 длительно сохраняется высокая скорость ремоделирования формирующегося рубца. 71 Рис. 38. Контрольная группа, 3 суток, зона инфаркта миокарда, окрашивание единичных клеток фибробластического ряда на ММР9. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ММР9, докрашивание гематоксилином). Рис. 39. Группа VEGF, 3 суток, зона инфаркта миокарда, окрашивание большого количества клеток фибробластического ряда на ММР9. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ММР9, докрашивание гематоксилином). 72 Рис. 40. Группа антиVEGF, 3 суток, зона инфаркта миокарда, отсутствие окрашивания на ММР9. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к ММР9, докрашивание гематоксилином). Рис. 41. Контрольная группа, 7 суток, пограничная зона, интенсивное окрашивание клеток фибробластического ряда на Col1A1. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к Col1A1, докрашивание гематоксилином). 73 Рис. 42. Группа антиVEGF, 7 суток, пограничная зона, отсутствие окрашивания клеток фибробластического ряда на Col1A1. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к Col1A1, докрашивание гематоксилином). Рис. 43. Группа антиFGF, 7 суток, зона инфаркта миокарда, низкоинтенсивное окрашивание клеток фибробластического ряда на Col1A1. Иммуногистохимия (краситель DAB, первичные антитела к Col1A1, докрашивание гематоксилином). 74 3.6. Влияние изменения уровня факторов роста на апоптоз в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза Для проверки гипотезы о стимуляции апоптолических процессов, выдвинутой при выявлении уменьшения плотности неактивных фибробластов к окончанию формирования рубца в области инфаркта миокарда, нами изучен уровень экспрессии в области репарации зимогена каспаза-3, являющимся доминантным по отношению к реализации апоптотического пути. При исследовании патологоанатомического материала выявлено, что в процессе реализации программы репарации имеется небольшой процент клеток с повышением экспресси каспазы-3 (рис. 44). Так же и при естественном течении инфаркта миокарда в контрольной группе животных наблюдались единичные клетки с положительной окраской на каспазу-3 (рис. 45). В то же время в группах с измененным уровнем факторов роста, особенно в группе VEGF, плотность положительно окрашенных на каспазу-3 клеток была значительно выше (рис. 46). Это подтверждает выдвинутое предположение. Рис. 44. Положительная окраска на caspase-3. 21 сутки ИМ. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к caspase-3, вторичные меченные AlexaFluor 568). 75 Рис. 45. Единичная caspase-3 положительная клетка. Контрольная группа, 7 сутки. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к caspase-3, вторичные меченные AlexaFluor 568). Рис. 46. Активация экспресии caspase-3. Группа FGF, 7 сутки. Иммунофлюоресценция (первичные антитела к caspase-3, вторичные меченные AlexaFluor 568). 76 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время воздействия, направленные на ограничение объёма некроза ишемизированных тканей, носят в большей степени профилактический характер. Профилактические воздействия эффективны в случае их применения до возникновения длительной ишемии, заканчивающейся развитием некроза. Однако в практической деятельности чаще встречаются ситуации, при которых нет возможности провести профилактическую подготовку к предполагаемому ишемическому воздействию, и необходимой становится защита тканей от уже развившегося ишемического повреждения. Как можно видеть из предшествующего анализа, адаптация ткани к ишемии сопровождается активацией ряда тирозинкиназ [Zhang J., et al., 2009; Maslov L.N. et al., 2009]. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в редокс-сигнализации путем аутофосфорилирования их собственных тирозинов внутри клеток. С киназными механизмами очень тесно связаны регуляторы клеточного роста, относящиеся к различным группам ростовых факторов. При этом многие из них являются индукторами нуклеарных сигналов, изменяющих геномкодируемое состояние клетки. Наибольшее значение в сигнальных системах при ишемическом повреждении среди ростовых факторов отводится 2 группам – фактору роста эндотелия сосудов и фактору роста фибробластов [Isner J.M., Asahara T., 1999]. VEGF – один из важнейших факторов существования и роста эндотелия [Marti H.H., Risau W. , 1999; Ylä-Herttuala S. et al., 2007; Kajdaniuk D. et al., 2011; Katoh M., 2013]. Он индуцирует ангиогенез и пролиферацию эндотелиоцитов. Это гликопротеин, который секретируется различными клетками в виде димера с молекулярной массой 34-45 кДа. К числу клеток-продуцентов VEGF относятся макрофаги, эпителиальные клетки лёгких и почек, мышечные клетки и др., однако, как правило, этот фактор не секретируется клетками эндотелия [Mac Gabhann F., Popel A.S., 2008]. Экспрессию VEGF регулируют многие факторы. Например, тканевая гипоксия, которая наблюдается при ишемии, стимулирует аутокринную и па- 77 ракринную экспрессию VEGF. Зафиксировано увеличение экспрессии VEGF в миокарде при ишемии, причём, так как в эксперименте не наблюдалось значимого некроза кардиомиоцитов, исследователи склонны считать данное увеличение следствием стимуляции именно секреции фактора роста [Chad H.G. et al., 2004]. Другим ведущим внеклеточным стимулятором внутриклеточных киназных путей является фактор роста фибробластов FGF [House S.L. et al., 2011; Itoh N., Ohta H., 2013]. Основной фактор роста фибробластов – один из наиболее консервативных белков. У разных видов животных отмечается высокая гомология этого фактора. Например, у быка и человека в пределах 146 аминокислотных остатков он отличается только на два остатка. Принято считать, что такая высокая консервативность свидетельствует о фундаментальных функциях белка. В целом ростовые факторы семейства FGF обладают широким спектром мишеней и биологических активностей для реализации адаптогенного ответа при ишемическом повреждении. Они являются мощными модуляторами клеточной дифференцировки, пролиферации, подвижности и выживаемости. Ни один из известных к настоящему времени факторов не обладает таким широким спектром эффектов на такое большое количество клеточных типов, как основной и кислотный факторы роста фибробластов. Кроме активации фибробластов в плане пролиферативного эффекта клетками-мишенями FGF являются эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки сосудов и др. [Senger D.R., Van De Water L., 2000; Poole T.J. et al., 2001; Monti M. et al., 2013]. Безусловно, открытие ростовых факторов и изучение их роли в процессах репарации привело к попыткам использования их как перспективного средства при состояниях, сопровождающихся недостатком кровоснабжения. В качестве лекарственных средств использовались выделенные ростовые факторы или кодирующие их плазмиды – в виде нативных субстанций или трансфекцией посредством аденовирусного вектора [Khurana R. et al., 2001; Tímár J. et al., 2001; Bashir R. et al., 2002; Dulak J. et al., 2006; Lavu M. et al., 2011; Williams P.D., Kingston P.A., 2011; Giacca M., Zacchigna S., 2012]. 78 Рассуждая о перспективах данного направления воздействия на состояния, связанные с ишемическим повреждением миокарда, необходимо отметить нерешённость ряда вопросов по использованию изменения уровней ростовых факторов для минимизации последствий инфаркта миокарда и быстрейшего восстановления структуры и функции после такого события. Прежде всего это то, что при инфаркте миокарда репарация происходит преимущественно за счёт быстрого развития соединительнотканного рубца. Сформированная соединительная ткань исключает восстановление контрактильной способности поврежденного миокарда [Chin M.T., Murry C.E., 2012] и, более того, создают дополнительную нагрузку на сохранившийся миокард [Лебединский В.Ю. и др., 1991]. Ранее было продемонстрировано, что путём изменения уровня таких факторов роста, как VEGF и FGF2 можно повлиять на развитие рубцовой ткани в очаге постинфарктного кардиосклероза, а также пролиферативный потенциал кардиомиоцитов и эндотелиоцитов – в том числе осуществляя индукцию регенераторных реакций миокарда в постинфарктный период (Шурыгин М.Г. и др., 2007; Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г., 2008; Дремина Н.Н. и др., 2009). Нами изучено влияние изменённых концентраций факторов роста VEGF и FGF2 на дифференцировку фибробластов и процессы репаративной регенерации миокарда в постинфарктный период. Исследование проведено на патологоанатомическом материале от 30 человек с различными сроками инфаркта миокарда, а также на экспериментальной модели инфаркта миокарда у 250 самок крыс линии Wistar. В модельном эксперименте исследования проведены в 5 группах по 50 жифотных каждая – группа контроля, группы с повышенным уровнем факторов роста – VEGFA и FGF2, а также с пониженным уровнем факторов роста – антиVEGF и антиFGF2. В рамках эксперимента обеспечено наблюдение за животными в течение 30 суток, с 8 временными точками – 2, 6, 12, 24 часа, 3, 7, 14 и 30 суток. Использован комплекс современных морфологических исследований (световая микроскопия; морфометрия; иммуногистохимическое окрашивание на MMP9, Col1A1, эндотелин; иммунофлюоресцентное окра- 79 шивание на CD34, CD45, anti-OxPhos Complex IV, pro-Caspase 3). В результате проведённых исследований патологоанатомического материала выявлено, что во всех наблюдаемых в рамках работы случаев инфаркта миокарда наблюдалась классическая картина, зависевшая от срока, прошедшего с момента инфаркта. Динамику различных дифферонов фибробластов в зоне инфаркта миокарда оценивали по экспрессии CD34, CD45, ММР9 и проколлагена (Col1A1). Фенотип CD34+ характерен для клеток со слабой дифференцировкой, плюрипотентных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов, CD45+ – для клеток, имеющих костномозговое происхождение, а фенотип CD34+CD45+ свидетельствует о принадлежности к прогениторным клеткам костномозгового происхождения – предшественникам фибробластов. При мечении маркеров CD34 и CD45 установлено, что в зоне инфаркта миокарда у людей СD45+-клетки появлялись с первых суток патологического процесса и регистрировались до 10 – 14 сут. В более поздние сроки (до 21 сут) выявлялись единичные положительно окрашенные клетки. CD34+клетки в зоне инфаркта не выявлялись, соответственно, не регистрировались и клетки, несущие одновременно маркеры CD34+ и CD45+. Это свидетельствует о том, что фибробласты в зоне формирования рубца имеют своим источником резидентные фибробласты, активируемые при некрозе миокарда. ММP9, выявляемая в клетках фибробластного ряда, свидетельствует о принадлежности этой клетки к дифферону фиброкластов. При исследовании патологоанатомического материала в ранние сроки (до 3 сут) в зоне ишемического повреждения во всех исследуемых группах регистрировались окрашенные положительно на ММР9 нейтрофилы. Причем при летальных исходах, развившихся в течение нескольких часов после инфаркта миокарда, регистрировались нейтрофилы с ярко окрашенными гранулами в сосудах периинфарктной зоны, а также в зоне инфаркта. В дальнейшем наблюдалась дегрануляция и потеря окраски цитоплазмы нейтрофилов на MMP9. Это сопровождалось появлением яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта. Наблюдаемые явления однозначно можно трактовать как диффузию ММР9 из выделенных нейтрофилами гра- 80 нул в ткани. Клетки, имеющие фенотипические признаки фибробластов и положительную окраску цитоплазмы на MMP9, впервые выявлялись в зоне инфаркта с 3 суток, локализуясь в пограничной зоне. В дальнейшем их количество и интенсивность окраски увеличивались, достигая максимума к 7 – 14-м суткам. После 30 суток специфическая окраска на MMP9 в зоне постинфарктного кардиосклероза не регистрировалась. Таким образом, в ранние сроки основным источником ММP9 в зоне повреждения являются нейтрофилы, а в поздние сроки окраска на ММР9 в зоне инфаркта обусловлена формированием пула фиброкластов с функциональной активностью, направленной на ремоделирование фибриллярных белков в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. В связи с выраженной стадийностью применение окраски на ММP9 при инфаркте миокарда удобно использовать для определения давности возникновения инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании. При этом в случаях повторных инфарктов будет регистрироваться наложение признаков ранней фазы (в зависимости от времени – MMP9 в гранулах внутри нейтрофилов либо в межклеточном пространстве) на проявления поздней фазы (наличие фиброкластов). Активные фибробласты, синтезирующие проколлаген, в единичных количествах выявлялись с 3 сут патологического процесса. Количество их прогрессивно увеличивалось до 2 недель. В дальнейшие сроки при сохранении большого количества проколлаген позитивных клеток в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза наблюдалось снижение интенсивности их окраски. Но и в области сформированного постинфарктного кардиосклероза обнаруживаются активно синтезирующие коллаген фибробласты, что является свидетельством продолжающихся процессов ремоделирования. На модели инфаркта миокарда у крыс нами исследованы наличие у клеток в очаге повреждения кластеров дифференцировки CD34 и CD45, а также синтетическая активность клеток фибробластического ряда при естественном течении процесса и при изменении уровня основного фактора роста фибробластов. У животных контрольной группы CD34+ и CD45+-клетки в зоне ише- 81 мического повреждения впервые выявлялись через 1 сут после моделирования инфаркта миокарда, но фенотипа CD34+CD45+, как и при инфаркте миокарда у людей, обнаружить не удалось. Небольшое число CD34+-клеток регистрировалось вплоть до 30 суток, а единичные CD45+-клетки выявлялись только до 14-х суток. При связывании факторов роста антителами временные интервалы наблюдения малодифференцированных клеток и клеток, имеющих костномозговое происхождение, укорачивались. Это является свидетельством уменьшения стимулирующего влияния циркулирующих в системном кровотоке факторов роста, уровень которых повышается при инфаркте миокарда [Шурыгин М.Г., 2007; Дремина Н.Н., 2008], на мобилизацию клеточных элементов из костного мозга или миграцию циркулирующих элементов в зону повреждения. Также снижается уровень стимуляции клеток к переходу в менее дифференцированное состояние. Иная картина наблюдалась при искусственном повышении уровня факторов роста. Но если в группе FGF2 факты ко-локализации CD34 и CD45 были сомнительны, то у животных группы VEGF в периинфарктной зоне клетки, одновременно экспрессирующие оба маркера, выявлялись с 1-х по 14-е сутки с максимумом на 14-е сутки. Выявленные особенности источников клеток в зоне репаративной регенерации после ишемического повреждения миокарда свидетельствуют о том, что в обычных условиях практически все клетки имеют тканевый генез, а при активации пролиферативной активности происходит их частичная дедифференцировка. В условиях значительного повышения уровня ростовых факторов (в частности, VEGF) в участке репарации появляются клетки с фенотипом CD34+CD45+, описанные в литературе как прогениторные клетки фибробластического ряда с достаточно низким уровнем дифференцировки. Так как в зависимости от направления дифференцировки они могут выступать в качестве предшественников тканей мезенхимального происхождения, то имеется возможность изменения вектора дифференцировки этих клеток в кардиомиоцитарном направлении. Это открывает новые перспективы регенеративной медицины в отношении влияния на исходы репарации при инфаркте миокарда. Ограничиваю- 82 щим фактором может стать не слишком большой удельный вес прогениторов в клеточном пластическом материале, а также сдвиг максимума их присутствия в очаге формирования постинфарктного кардиосклероза на более поздние, чем желательно для запуска регенерации миокарда, сроки. Изменения уровня факторов роста кроме влияния на динамику клеток, несущих признаки определенных кластеров дифференцировки, влияли и на плотность фибробластов в области инфаркта миокарда. При этом если мы, учитывая действия факторов роста по стимуляции митотической активности, видим ожидаемое повышение плотности клеток в группах VEGF и FGF в сравнении с контролем, то причина увеличения популяции фибробластов в группе антиVEGF не ясна. При снижении уровня FGF2 наблюдается некоторое снижение количества фибробластов в сравнении с контролем, но на отдалённых сроках наблюдения. Также интересен тот факт, что в нашем исследовании повышение VEGF в системном кровотоке в большей степени стимулировало рост фибробластов по сравнению с FGF2. Плотность фибробластов в зоне репарации достоверно была выше в группе VEGF на 7-е и 30-е сутки. С чем связано данное явление? Предположение, что VEGF может оказывать более выраженное митотическое влияние на фибробласты в сравнении с FGF2, опровергается фактом хорошего пролиферативного потенциала и при низких уровнях VEGF. Остается предположение, что при высоких уровнях VEGF имеется дополнительное влияние на фибробласты со стороны эндотелиального компонента, функционирование которого очень сильно зависит от уровня VEGF [Дремина Н.Н., 2008]. Применение как факторов роста, так и антител к ним нарушало трансформацию фибробластов в фиброциты, в результате чего до конца наблюдения в данных группах наблюдался сдвиг соотношения в пользу активных фибробластов. При попарном сравнении с группой контроля во всех случаях зафиксирована достоверность отличий как на 14-е, так и на 30-е сутки наблюдения. Наблюдаемые изменения в снижении количества фиброцитов при сохранении общих тенденций в динамике плотности фибробластов могут быть 83 объяснены тем, что механизмы выведения активных фибробластов через запуск апоптоза при нарушении естественного уровня стимуляции ростовыми факторами превалирует над дифференцировкой фибробластов в фиброциты. Подтверждение данной гипотезы мы получили, выявив значительное повышение в клетках зоны репарации экспрессии каспазы 3 в группах животных с изменением концентрации ростовых факторов. Дифферон фиброкластов в области инфаркта миокарда у животных в экспериментальном исследовании формировался к 3 суткам. Наблюдаемое количество MMP9 положительных фибробластоподобных клеток в контроле было незначительным, но такие клетки выявлялись до конца наблюдения. При снижении уровня факторов роста частота их выявления была ещё ниже. Хоть при искусственном повышении уровня факторов роста положительные на ММР9 клетки фибробластического ряда также регистрировались с 3-х по 30-е сутки, однако их количество было значительно выше, чем в контрольной группе. Это свидетельствует о том, что при высокой активности факторов роста в начальные периоды после эпизода ишемического повреждения формируется программа репарации, при которой за счёт длительного существования клеток соединительной ткани с достаточно высоким уровнем экспрессии матриксных металлопротеиназ и коллагена длительно сохраняется высокая скорость ремоделирования формирующегося рубца. С учетом опубликованных в литературе данных о более выраженной лейкоцитарной фазе воспаления в зоне инфаркта миокарда при повышении уровня факторов роста [Шурыгин М.Г., 2007; Дремина Н.Н., 2008] это свидетельствует о том, что высокий уровень экспрессии желатиназ в области инфакта миокарда в сроки более 3 суток не является механизмом компенсации недостаточности разрушения соединительнотканного каркаса на ранних стадиях. В то же время синтетическая активность фибробластов в отношении проколлагена, отражающая активность образования внеклеточного матрикса вновь формируемой соединительной ткани, была достаточно высокой. Снижение интенсивности экспрессии Col1A1 выявлено только в группах со снижением концентрации ростовых факторов. 84 Ещё одним клеточным компонентом для реализации репаративного процесса в миокарде являются эндотелиоциты. Так как и FGF2, и особенно VEGF запускают процессы ангиогенеза, ожидаемо и изменение ответа эндотелиоцитов в зоне постинфарктной репарации на изменение концентраций этих факторов. Действительно, дополнительное введение FGF2 способствовало некоторому росту популяции эндотелиоцитов, но статистически значимой эта разница в сравнении с контролем была только к концу 2-й недели процесса. При повышении уровня VEGF эндотелиоциты в зоне ишемического повреждения в ранние сроки погибают медленнее, и их плотность к концу 1-х суток выше, чем в контроле. Также и на более поздних сроках количество эндотелиоцитов на единицу площади выше в группе VEGF. При снижении уровня ростовых факторов количество эндотелиоцитов значимо снижается, однако, если при недостатке FGF2 значимо меньшая популяция эндотелиоцитов в зоне повреждения с суток до недели от развития инфаркта миокарда и в дальнейшем нормализуется, то искусственное снижение уровня VEGF вызывает значимое отставание количества эндотелиоцитов от показателей контрольной группы в сроки 3-7 и 30 суток. При исследовании взаимосвязи роста сосудов и динамики популяции фибробластов в очаге репарации при инфаркте миокарда в контрольной группе не выявлено достоверной корреляции. Но при повышенной стимуляции FGF2 и VEGF наблюдалась закономерная положительная сильная корреляционная связь между количеством фибробластов и эндотелиоцитов – коэффициент ранговой корреляции в группе FGF2 r=0.77, в группе VEGF r=0.79. При введении антител к VEGF динамика клеточных популяций фибробластов и эндотелиоцитов не демонстрировала достоверных зависимостей. Но определялась сильная корреляция плотности эндотелиоцитов и фибробластов в группе анти-FGF (r=0.94). Так как известные взаимосвязи между ангиогенезом при репарации повреждения и ростом популяции фибробластов не позволяют объяснить настолько сильные выявляемые взаимосвязи, не исключается влияние особенностей проведения эксперимента на полученный результат. Учитывая то, 85 что FGF2 является витальным фактором при гипоксии и митогеном, то наблюдаемые при обеднении FGF2 сдерживание пролиферации фибробластов и отрицательная динамика эндотелиоцитов по окончании введения антител сменяются одновременной пролиферацией сосудистого и соединительнотканного компонентов. Интересные результаты получены и при исследовании синтетической функции эндотелия в зоре репарации в отношении эндотелинов. Во-первых, очень важным является тот факт, что продукция эндотелина возрастает только в сосудах, прилегающих к зоне повреждения – там, где идет развитие воспалительного процесса и запуск механизмов репарации миокарда. Во-вторых, сроки повышения экспресии эндотелинов с 1 по 7 (у людей с 1 суток по 2 недели) соответствуют времени от предшествующего запуску клеточной пролиферации в зоне повреждения до пика пролиферативной реакции. В-третьих, нам известно о разнонаправленном эффекте эндотелина на различные типы клеток, несущих на мембране рецепторы к этому полипептиду. Основное действие – на ETA рецепторы, активация которых приводит к резкому сокращению гладкомышечных клеток. Также эндотелины связываются с ETB рецепторами на эндотелиоцитах, и это приводит к активации синтеза и экскреции NO и вызывает вазодилатацию. При этом в области репарации в сроки 3-7 суток происходит развитие широкой сети капилляров, что обеспечивает большое рецепторное поле с ETB рецепторами при отсутствии гладкомышечных клеток. Таким образом повышение синтеза эндотелина может быть важным патофизиологическим механизмом поддержания повышенного объемного кровотока в области роста грануляционной ткани и активного фибропластического процесса. Применение факторов роста резко усиливало экспрессию эндотелина в зоне инфаркта и прилегающим к ней участкам миокарда через 1 сут после моделирования инфаркта миокарда. После прохождения пика выработки эндотелина на 3-и сутки интенсивность окраски убывала, но регистрировалась до 14-х суток. В дополнении к этому в группе VEGF в сроки 1 и 3 сут регистрировалась окраска сосудов в «интактном» миокарде. Применение антител к факторам роста снижало интенсивность окраски 86 на эндотелин инфарктной и периинфарктной зон в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда (с 1-х по 3-и сутки), особенно это было характерно для животных группы анти-VEGF. После прекращения введения антител (по плану эксперимента последнее введение осуществлено на 3-и сутки) к 7-м суткам интенсивность окраски на эндотелин резко нарастала, достигая максимума, а к 14-м суткам вновь снижалась. Столь значимая динамика выработки эндотелина в ответ на изменение концентрации факторов роста свидетельствует о функциональных связях между стимуляцией рецепторов факторов роста и синтезом эндотелина [Lygnos M.C. et al., 2006]. Усиление трофики в тех областях, где происходит повышение выработки эндотелина, регистрируется при исследовании комплекса окислительного фосфорилирования. Уровень его активации зависит от обеспеченности субстратами окисления, кислородом и неразобщенностью процессов окисления и фосфорилирования. Но при этом отмечается и формирование неравномерности внутриклеточного распределения митохондрий с активными комплексами OxPhos. Выявленные особенности косвенно подтверждают предположение о влиянии связанной с концентрацией факторов роста экспрессии эндотелина на метаболическое обеспечение миокарда. Неравномерность распределения выявляемого цитохрома с, вероятно, связана с изменением условий функционирования и перестройкой структуры клеток. 87 ВЫВОДЫ 1. Повышение в крови уровня фактора роста эндотелия сосудов и основного фактора роста фибробластов обусловливает миграцию в очаг поражения гематогенных клеток-предшественников фибробластов с фенотипом CD34+CD45+, которые в качестве источников пластического материала способствуют репарации зоны инфаркта миокарда. При экспериментальном инфаркте миокарда максимальная миграция костномозговых клеток отмечается 14-м суткам. Повышение уровня фактора роста эндотелия сосудов стимулирует дифференцировка фибробластов в направлении фиброкластов. Дифференцировка в неактивные фиброциты нарушается как при уменьшении, так и при увеличении уровня факторов роста фибробластов и эндотелия сосудов, при этом активные клетки подвергаются каспаз-зависимому апоптозу. 2. Выраженность неоангиогенеза в зоне репарации миокарда при ишемическом повреждении коррелирует с количественными характеристиками пула клеток фибробластического ряда, однако при снижении выживаемости эндотелиоцитов и их медленном росте в условиях недостаточности VEGF нарастание пула фибробластов не нарушается. 3. При инфаркте миокарда у людей в эндотелиоцитах в зоне формирующегося рубца активируется экспрессия эндотелина с максимальной интенсивностью в периинфарктной зоне на 7 – 13-е сутки. При естественном течении экспериментального инфаркта миокарда у крыс выработка эндотелина в зоне репарации активируется с 3-х суток. Увеличение концентрации факторов роста значительно усиливает экспрессию эндотелина в периинфарктной и инфарктной зонах уже через 1 сут после моделирования инфаркта миокарда с максимумом на 3-и сутки. Снижение стимуляции клеток факторами роста при использовании антител, особенно к VEGF, снижает продукцию эндотелина клетками вновь образующихся сосудов и смещает максимум экспрессии эндотелина к 7-м суткам. 4. Уровень факторов роста определяет активность перестройки соединительнотканного каркаса в зоне формирования рубца при инфаркте миокарда. Повышение концентрации FGF2 и VEGF способствует увеличению числа фиброкластов и повышению экспрессии MMP9 (3-х по 30-е сутки). Сниже- 88 ние концентрации FGF2 и VEGF способствует подавлению дифференцировки фибробластов в фиброкласты. 5. При естественном течении процесса репарации миокарда после инфаркта миокарда у людей экспрессия проколлагена в очаге формирования рубца регистрируется с 3-х суток, достигая максимума к 7 – 13-м суткам и в незначительной степени регистрируется в период постинфарктного кардиосклероза, свидетельствуя о продолжающемся ремоделировании постинфарктной зоны. Снижение уровня факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда приводит к уменьшению экспрессии проколлагена IA1. 6. В ранние сроки (до 3 сут) постинфарктного ремоделирования миокарда ММР9-позитивные нейтрофилы присутствуют в зоне ишемического повреждения. В поздние сроки (7 – 14 сут) в зоне инфаркта происходит формирование пула ММР9-позитивных фиброкластов с функциональной активностью, направленной на ремоделирование фибриллярных белков в зоне постинфарктного кардиосклероза. 89 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Автандилов Г.Г., Яблучанский Н.И., Салбиев К.Д., Непомнящих Л.М. Количественная морфология и математическое моделирование инфаркта миокарда. – Новосибирск: Наука, 1984. – 288 с. 2. Бузиашвили Ю.И., Picano E., Амбатьелло С.Г. , Мацкеплишвили С.Т. Ангиогенез как антиишемический механизм // Кардиология. – 2000. – № 12. – С. 82-86. 3. Вихерт A.М. К вопросу об этиологии, патогенезе и гистогенезе атеросклероза // Кардиология. – 1974. – № 12. – C. 61-66. 4. Гланц С. Медико-биологическая статистика. – М.: Практика, 1999.– 459 с. 5. Гозмаков О.А. Эндотелин в кардиологии: молекулярные, физиологические и патологические аспекты (обзор) // Кардиология. – 2001. – № 2. – С. 50-58. 6. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. – М.: Медицина, 1982.– 302 с. 7. Дремина Н.Н. Морфофункциональный анализ влияния фактора роста эндотелия сосудов на репаративные процессы при моделировании инфаркта миокада. Автореф. дис. ... канд. биол. наук / Научно- исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии СО РАМН. – Новосибирск, 2008. – 24 c. 8. Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г. Влияние фактора роста эндотелия сосудов на ремоделирование миокарда при инфаркте левого желудочка// Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2008. – № 2. – С. 8687. 9. Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г. Влияние FGF2 на динамику клеток фибробластического ряда в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2007. – № 1. – С. 210-211. 10. Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А. Изменение микроциркуляторного компонента миокарда под воздействием фактора роста эндотелия сосудов в постинфарктный период // Бюллетень Восточно-Сибирского 90 научного центра СО РАМН. – 2008. – № 4. – С. 73-75. 11. Дремина Н.Н., Шурыгина И.А., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Влияние эндотелиального фактора роста на постинфарктное ремоделирование миокарда крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 9. – С. 330-336. 12. Ларионов П.М., Чернявский А.М., Кузнецова И.В., Лушникова Е.Л., Бондарь В.Ю., Углова Е.В., Бочарова А.В., Субботина О.А., Непомнящих Л.М., Караськов А.М. Регенерация кардиомиоцитов перирубцовой зоны миокарда при лазерном тоннелировании и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2009. – № 4. – С. 201-205. 13. Лебединский В.Ю., Шурыгин М.Г., Дудкин В.В. Внутримиокардиальное давление (природа, способы измерения и регистрации). – Иркутск, 1991. – 76 с. 14. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П., Южик Е.И., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Пролиферативная активность кардиомиоцитов при хронической гиперхолестеринемии // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2013. – № 4. – С. 231-237. 15. Митин К.С. Электронно-микроскопический анализ изменений сердца при инфаркте. – М.: Медицина, 1974. – 203 с. 16. Мордовин В.Ф., Рипп Т.М., Соколов С.Е. и др. Динамика показателей эндотелийзависимой вазодилатации и гипотензивная эффективность эналаприла у пациентов с артериальной гипертензией // Кардиология. – 2001. – № 6. – С. 31-33. 17. Нагорнев В.А. Морфологические основы ишемической болезни сердца // Ишемическая болезнь сердца. – Л., 1977. – С. 14-25. 18. Непомнящих Л.М. Морфогенез важнейших общепатологических процессов в сердце. – Новосибирск: Наука, 1991. – 352 с. 19. Непомнящих Л.М. Регенераторно-пластическая недостаточность сердца: молекулярно-биологические механизмы и морфологические основы // Архив патологии. – 2007. – Т. 69, № 3. – С. 3-12. 20. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Гольдштейн Д.В. Способны ли 91 современные клеточные технологии устранить биологические ограничения тканеспецифической регенерации миокарда? // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2005. – № 2. – С. 63. 21. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Ларионов П.М., Шурыгин М.Г. Регенерация миокарда: пролиферативный потенциал кардиомиоцитов и индукция кардиомиогенеза при альтернативной и пластической недостаточности сердца // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2010. – № 5. – С. 3-11. 22. Непомнящих Л.М., Молодых Н.А., Лушникова Е.Л., Клинникова М.Г., Молодых О.П. Регенераторные реакции миокарда при развитии пластической недостаточности кардиомиоцитов в онтогенезе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 12. – С. 693-699. 23. Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И. Соединительная ткань (гистофизиология и биохимия) / под ред. С. П. Миронова. Т. 1. – Москва, 2009. – 380 с. 24. Патарая С.А., Преображенский Д.В., Сидоренко Б.А., Масенко В.П. Биохимия и физиология семейства эндотелинов // Кардиология. – 2000. – Т.40, № 6. – С. 78-85. 25. Розенберг В.Д., Непомнящих Л.М. Патоморфологические критерии ремоделирования постинфарктного сердца// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2003.- Т. 135, № 1.- С. 110. 26. Сергеевичев Д.С., Ларионов П.М., Субботин Д.В., Лушникова Е.Л., Новрузов Р.Б., Караськов А.М., Непомнящих Л.М. Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при интрамиокардиальной имплантации клеток мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2010. – № 2. – С. 82-87. 27. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции // Журн. Биоорганической химии. – 1998. – Т. 24. – С. 217-226. 28. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы: регуляция активности и роль в процессе онкогенеза // Вопр. мед. химии. – 2000. – № 5. – С. 30–31. 29. Суворов А.В., Горева В.В., Суворов М.А. Изменение липидного профиля, пероксидазных свойств крови и уровня эндотелина-1 у больных 92 стенокардией напряжения при лечении нифедипином GITS и фелодипином // Нижнегородский мед. журн. – 2002. – № 3. – С. 7-11. 30. Шальнова С.А., Конради А.О., Карпов Ю.А., Концевая А.В., Деев А.Д., Капустина А.В., Худяков М.Б., Шляхто Е.В., Бойцов С.А. Анализ смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в 12 регионах Российской Федерации, участвующих в исследовании «Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в различных регионах России» // Российский кардиологический журнал. – 2012. – № 5 (97). – C. 6-11. 31. Шурыгин М.Г. Роль ангиотензиновой системы и фактора роста фибробластов в патогенезе постинфарктного кардиосклероза. Автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Восточно-Сибирский научный центр СО РАМН. – Иркутск, 2007. – 38 c. 32. Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н. Влияние фактора роста фибробластов на механические свойства левого желудочка при постинфарктном кардиосклерозе // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2006. – № 6. – С. 178-179. 33. Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Малышев В.В., Шурыгина И.А. Динамика клеточных реакций в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза при подавлении активности FGFb в эксперименте // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2006. – № 5. – С. 251-256. 34. Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Малышев В.В., Шурыгина И.А. Количественная гистопатология инфаркта миокарда при воздействии основного фактора роста фибробластов // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2006. – № 5. – С. 257-261. 35. Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Шурыгина И.А., Мачхин И.Н. Основные активаторы ангиогенеза и их применение в кардиологии (обзор литературы) // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2005. – № 6. – С. 199-207. 36. Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Шурыгина И.А., Мачхин И.Н., Антипина С.Л. Способ определения относительной площади волокон коллагена в гистологическом препарате. – Патент на изобретение RUS 2332665, 29.11.2006. 93 37. Шурыгин М.Г., Малышев В.В., Дремина Н.Н. Закономерности ремоделирования миокарда при постинфарктном кардиосклерозе. – Иркутск, 2007. – 196 c. 38. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А. Влияние уровня FGF2 на динамику фаз воспаления при постинфарктном кардиосклерозе // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2010. – № 4. – С. 34-37. 39. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А. Фактор роста фибробластов как стимулятор ангиогенеза при инфаркте миокарда // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. – 2010. – Т. 30, № 6. – С. 89-92. 40. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н. Влияние основного фибробластического фактора роста на выраженность цитолиза при экспериментальном инфаркте миокарда // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2008. - № 6. – С. 58-60. 41. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н. Влияние фактора роста фибробластов на механоморфоз левого желудочка при экспериментальном постинфарктном кардиосклерозе // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. – 2008. – № 2. – С. 73-77. 42. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина H.H. Влияние фактора роста эндотелия сосудов на выраженность цитолиза при экспериментальном инфаркте миокарда // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2008. – № 1. – С. 68-71. 43. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н. Влияние фактора роста эндотелия сосудов на уровень коллагенообразования в процессе развития постинфарктного кардиосклероза // Сибирский медицинский журнал (г. Иркутск). – 2008. – Т. 78, № 3. – С. 53-55. 44. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н. Динамика факторов роста эндотелия сосудов и фибробластического фактора роста при экспериментальном инфаркте миокарда // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2007. – № 6. – С. 169-174. 45. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н. Способ коррекции плотности соединительной ткани. Патент на изобретение RUS 2392960, 94 26.09.2008. 46. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г., Зеленин Н.В., Гранина Г.Б. Роль MAP-киназных механизмов в регуляции клеточного роста (обзор литературы) // Сибирский медицинский журнал (г. Иркутск). – 2009. – Т. 89. № 6. – С. 3640. 47. Abe R., Donnelly S.C., Peng T., Bucala R., Metz C.N. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites // J. Immunol. – 2001. – Vol. 166. – P. 7556–7562. 48. Abdelwahid E., Siminiak T., Guarita-Souza L.C., Teixeira de Carvalho K.A., Gallo P., Shim W., Condorelli G. Stem cell therapy in heart diseases: a review of selected new perspectives, practical considerations and clinical applications // Curr. Cardiol. Rev. – 2011. – Vol. 7, N 3. – P. 201-212. 49. Argaud L., Gateau-Roesch O., Augeul L. et al.Increased mitochondrial calcium coexists with decreased reperfusion injury in postconditioned (but not preconditioned) hearts // J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2008. – Vol. 294, N 1. – P. H386-H391. 50. Avezum A., Makdisse M., Spencer F. et al.Impact of age on management and outcome of acute coronary syndrome: observations from the Global Registry of Acute Coronary Events (GRACE) // Am. Heart J. – 2005. – Vol. 149, N 1. - P. 67-73. 51. Bashir R., Vale P.R., Isner J.M., Losordo D.W. Angiogenic gene therapy: pre-clinical studies and phase I clinical data // Kidney Int. – 2002. – Vol. 61, Suppl. 1. – S. 110-114. 52. Beg A.A., Baltimore D. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death // Science. – 1996. – Vol. 274. – P. 782–784. 53. Bellini A., Mattoli S. The role of the fibrocyte, a bone marrow-derived mesenchymal progenitor, in reactive and reparative fibroses // Laboratory Investigation. – 2007. – Vol. 87. – P. 858–870. 54. Bergers, G., Javaherian K., Lo K.M., Folkman J., Hanahan D. Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice // Science. – 1999. – N 284 (5415). – P. 808-812. 55. Bode W., Fernandez-Catalan С., Tschesche H. et al. Structural properties 95 of matrix metalloproteinases // Cell. Mol. Life Sci. – 1999. – Vol. 55. – P. 639–652. 56. Bohm F., Beltran E., Pernow J. Endothelin receptor blockade improves endothelial function in atherosclerotic patients on angiotensin converting enzyme inhibition // J. Intern. Med. – 2005. – Vol. 257. – P. 263-271. 57. Budniatzky I., Gepstein L. Concise review: reprogramming strategies for cardiovascular regenerative medicine: from induced pluripotent stem cells to direct reprogramming // Stem Cells Transl. Med. – 2014. – Vol. 3, N 4. – P. 448-457. doi: 10.5966/sctm.2013-0163. 58. Buehler M.J. Nature designs tough collagen: explaining the nanostructure of collagen fibrils // Proc Natl Acad Sci USA. – 2006. – Vol. 103, N 33. – P. 12285-12290. 59. Carmeliet P. Angiogenesis in life, disease and medicine // Nature. – 2005. – Vol. 438. – P. 932-936. 60. Carmeliet P., Jain R.K. Angiogenesis in cancer and other diseases // Nature. – 2000. – Vol. 407. – P. 249-257. 61. Chad H.G., Biswas S.S., Yin B. et al.Therapeutic angiogenesis in chronically ischemic porcine myocardium: comparative effects of bFGF and VEGF // Ann. Thor. Surg. – 2004. – Vol. 77, N 3. – P. 812-818. 62. Chen W., Frangogiannis N.G. Fibroblasts in post-infarction inflammation and cardiac repair // Biochim. Biophys. Acta. – 2013. – Vol. 1833, N 4. – P. 945-953. doi: 10.1016/j.bbamcr.2012.08.023. 63. Cheng Y., Jiang S., Hu R., Lv L. Potential mechanism for endothelial progenitor cell therapy in acute myocardial infarction: Activation of VEGFPI3K/Akte-NOS pathway // Ann. Clin. Lab. Sci. – 2013. – Vol. 43, N 4. – P. 395401. 64. Chin M.T., Murry C.E. Is it possible to transform cardiac scar tissue into beating heart muscle in humans? // Regen. Med. – 2012. – Vol. 7, N 5. – P. 623625. doi: 10.2217/rme.12.54. 65. Close D. R. Matrix metalloproteinase inhibitors in rheumatic diseases // Ann. Rheum. Dis. – 2001. – Vol. 60, № 3. – P. 62-67. 66. Conway E.M., Collen D., Carmeliet P. Molecular mechanisms of blood vessel growth // Cardiovasc. Res. – 2001. – Vol. 49, N 3. – P. 507-521. 96 67. De Mori R., Straino S., Di Carlo A. et al. Multiple effects of high mobility group box protein 1 in skeletal muscle regeneration // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2007. – Vol. 27, N 11. – P. 2377-2383. 68. Di Stefano B., Graf T. Hi-TEC reprogramming for organ regeneration // Nat. Cell Biol. – 2014. – Vol. 16, N 9. – P. 824-825. doi: 10.1038/ncb3032. 69. Dobaczewski M., Gonzalez-Quesada C., Frangogiannis N.G. The extracellular matrix as a modulator of the inflammatory and reparative response following myocardial infarction // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2010. – Vol. 48, N 3. – P. 504511. doi: 10.1016/j.yjmcc.2009.07.015. 70. Doppler S.A., Deutsch M.A., Lange R., Krane M. Cardiac regeneration: current therapies-future concepts // J. Thorac. Dis. – 2013.- Vol. 5, N 5. – P. :683697. doi: 10.3978/j.issn.2072-1439.2013.08.71. 71. Downey J.M., Cohen M.V. Why do we still not have cardioprotective drugs? // Circ. J. – 2009. – Vol. 73, N 7. – P. 1171-1177. 72. Dulak J., Zagorska A., Wegiel B, Loboda A., Jozkowicz A. New strategies for cardiovascular gene therapy: regulatable pre-emptive expression of proangiogenic and antioxidant genes // Cell Biochem. Biophys. – 2006. – Vol. 44, N 1. – P. 31-42. 73. Fernandes S., Naumova A.V., Zhu W.Z., Laflamme M.A., Gold J., Murry C.E. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2010. – Vol. 49, N 6. – P. 941–949. 74. Flacke J.P., Kumar S., Kostin S.et al. Acidic preconditioning protects endothelial cells against apoptosis through p38- and Akt-dependent Bcl-xL overexpression // Apoptosis. – 2009. – Vol. 14, N 1. – P. 90-96. 75. Flavell S.J., Hou T.Z., Lax S., Filer A.D., Salmon M., Buckley C.D. Fibroblasts as novel therapeutic targets in chronic inflammation // Brit. J. Pharmacol. – 2008. – Vol. 153. – P. S241–246. 76. Fox K., Garcia M.A., Ardissino D. et al. Task force on the management of stable angina pectoris of the European Society of Cardiology; ESC Committee for Practice Guidelines (CPG). Guidelines on the management of stable angina pectoris: executive summary: the task force on the management of stable angina 97 pectoris of the European Society of Cardiology // Eur. Heart J. – 2006. – Vol. 27, N 11. – P. 1341–1381. 77. Freedman S.B., Isner J.M. Therapeutic angiogenesis for coronary artery disease // Ann. Intern. Med. – 2002. – Vol. 136. – P. 54-71. 78. Fryer R.M., Auchampach J.A., Gross G.J. Therapeutic receptor targets of ischemic preconditioning // Cardiovasc. Res. – 2002. – Vol. 55, N 3. – P. 520 – 525. 79. Hastings C.L., Roche E.T., Ruiz-Hernandez E., Schenke-Layland K., Walsh C.J., Duffy G.P. Drug and cell delivery for cardiac regeneration// Adv. Drug. Deliv. Rev. – 2014. – Aug 27. pii: S0169-409X(14)00180-X. doi: 10.1016/ j.addr.2014.08.006. 80. Hidalgo M., Eckhardt G.S. Development of matrix metalloproteinase in- hibitors in cancer therapy // J. Nation. Cancer Inst. – 2001. – Vol. 93, № 3. – P. 178-193. 81. Hoekstra R., Eskens F.A.L.M., Verweij J. Matrix metalloproteinase inhibitors: current developments and future perspectives // The Oncologist. – 2001. – Vol. 6, № 5. – P. 415-427. 82. Hohenester E., Yurchenco P.D. Laminins in basement membrane assembly // Cell Adh. Migr. – 2013. – Vol. 7, N 1. – P. 56-63. doi: 10.4161/cam.21831. 83. House S.L., House B.E., Glascock B., Kimball T., Nusayr E., Schultz J.E., Doetschman T. Fibroblast Growth Factor 2 Mediates Isoproterenol-induced Cardiac Hypertrophy through Activation of the Extracellular Regulated Kinase // Mol. Cell. Pharmacol. – 2010. – Vol. 2, N 4. – P. 143-154. 84. Ieda M. Heart development and regeneration via cellular interaction and reprogramming // Keio J. Med. – 2013. – Vol. 62, N 4. – P. 99-106. 85. Inoue A., Yanagisawa M., Kimura S. et al. The human endothelin family: three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1989. – Vol. 86, N 8. – P. 28632867. 86. Isner J.M., Asahara T. Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization // J. Clin. Invest. – 1999. – Vol. 103, N 9. – P. 1231-1236. 98 87. Itoh N., Ohta H. Pathophysiological roles of FGF signaling in the heart // Front. Physiol. – 2013. – Vol. 4. – P. 247. doi: 10.3389/fphys.2013.00247. 88. Itoh Y., Yanagisawa M., Ohkubo S. et al. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding the precursor of a human endothelium-derived vasoconstrictor peptide, endothelin: identity of human and porcine endothelin // FEBS Lett. – 1988. – Vol. 231, N 2. – P. 440-444. 89. Järvinen T.A., Ruoslahti E. Targeted Antiscarring Therapy for Tissue Injuries // Adv. Wound Care (New Rochelle). – 2013. – Vol. 2, N 2. – P. 50-54. 90. Jefferis B.J., Whincup P., Welsh P. et al. Prospective study of matrix metalloproteinase-9 and risk of myocardial infarction and stroke in older men and women // Atherosclerosis. – 2010. – Vol. 208, N 2. – P. 557-563. 91. Jobson T.M., Billington C.K., Hall I.P. Regulation of proliferation of human colonic subepithelial myofibroblasts by mediators important in intestinal inflammation // J. Clin. Invest. – 1998. – Vol. 101. – P. 2650-2657. 92. Galis Z.S., Sukhova G.K., Lark M.W. Increased expression of matrix metalloproteinase and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques // J. Clin. Invest. – 1994. – Vol. 94, № 6. – P. 2493-2503. 93. Gersh B.J., Simari R.D., Behfar A., Terzic C.M., Terzic A. Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective // Mayo Clin. Proc. – 2009. – Vol. 84, N 10. – P. 876-892. doi: 10.1016/S0025-6196(11)60505-3. 94. Giacca M., Zacchigna S. VEGF gene therapy: therapeutic angiogenesis in the clinic and beyond // Gene Ther. – 2012. – Vol. 19, N 6. - P. 622-629. doi: 10.1038/gt.2012.17. 95. Glantz S.A., Slinker B.K. Primer of applied regression and analysis of variance. – N.Y.: McGraw-Hill / Appleton & Lange, 2000. – 949 p. 96. Grinnell F., Toda K., Takashima A. Role of fibronectin in epithelialization and wound healing // Prog. Clin. Biol. Res. – 1988. – Vol. 266. – P. 259-272. 97. Kajdaniuk D., Marek B., Borgiel-Marek H., Kos-Kudła B. Vascular endothelial growth factor (VEGF) - part 1: in physiology and pathophysiology // Endokrynol. Pol. – 2011. – Vol. 62, N 5. – P. 444-455. 98. Kalluri R., Neilson E.G. Epithelial–mesenchymal transition and its implications for fibrosis // J. Clin. Invest. – 2003. – Vol. 112. – P. 1776–1784. 99 99. Kanashiro-Takeuchi R.M., Schulman I.H., Hare J.M. Pharmacologic and genetic strategies to enhance cell therapy for cardiac regeneration // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2011. – Vol. 51, N 4. – P. 619 – 625. doi: 10.1016/j.yjmcc.2011.05.015. 100. Karantalis V., Balkan W., Schulman I.H., Hatzistergos K.E., Hare J.M. Cell-based therapy for prevention and reversal of myocardial remodeling // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2012. – Vol. 303, N 3. – P. H 256-270. doi: 10.1152/ajpheart.00221.2012. 101. Katoh M. Therapeutics targeting angiogenesis: genetics and epigenetics, extracellular miRNAs and signaling networks // Int. J. Mol. Med. – 2013. – Vol. 32, N 4. – P. 763-767. doi: 10.3892/ijmm.2013.1444. 102. Kawaguchi N., Hatta K., Nakanishi T. 3D-culture system for heart regeneration and cardiac medicine // Biomed. Res. Int. – 2013. – Vol. 89. – P. 59-67. doi: 10.1155/2013/895967. 103. Kelly D., Cockerill G., Ng L.L., Thompson M., Khan S., Samani N.J., Squire I.B. Plasma matrix metalloproteinase-9 and left ventricular remodelling after acute myocardial infarction in man: a prospective cohort study // Eur. Heart. J. – 2007. – Vol. 28. – P. 711–718. 104. Kesiс L.G., Petroviс A.S., Buriс N.B. et al. Fibroclast as a helping factor of collagenolysis in periodontal disease of diabetic patients // Acta Stomatologica Naissi. – 2005. – Vol. 21. – P. 365-370. 105. Kikuchi K., Poss K.D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms // Annu Rev. Cell Dev. Biol. – 2012.- Vol. 28. – P. 719-41. doi: 10.1146/annurevcellbio-101011-155739. 106. Kim H.E., Dalal S.S., Young E. et al. Disruption of the myocardial extracellular matrix leads to cardiac dysfunction // J. Clin. Invest. – 2000. – Vol. 106. – P. 857-866. 107. Khurana R., Martin J.F., Zachary I. Gene therapy for cardiovascular disease: a case for cautious optimism // Hypertension. – 2001. – Vol. 38, N 5. – P. 1210-1216. 108. Klingberg F., Hinz B., White E.S. The myofibroblast matrix: implications for tissue repair and fibrosis // J. Pathol. – 2013. – Vol. 229, N 2. – P. 298309. doi: 10.1002/path.4104. 100 109. Krenning G., Zeisberg E.M., Kalluri R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis // J. Cell Physiol. – 2010. – Vol. 225, N 3. – P. 631637. doi: 10.1002/jcp.22322 110. Laflamme M.A., Chen K.Y., Naumova A.V., Muskheli V., Fugate J.A. et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts // Nat. Biotechnol. – 2007. – Vol. 25, N 9. – P. 1015–1024. 111. Laflamme M.A., Murry C.E. Heart regeneration // Nature. – 2011. – Vol. 473 (7347). – P. 326–335. 112. Larionov P.M., Sergeevichev D.S., Chernyavskii A.M., Novruzov R.B., Subbotin D.V., Karaskov A.M., Lushnikova E.L., Nepomnyashchikh L.M. Angiomatosis and ectopic ossification in the dog myocardium after intramyocardial implantation of autologous bone marrow mononuclears in experimental coronary disease // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2009. – Vol. 147, N 5. – P. 644-649. 113. Lavu M., Gundewar S., Lefer D.J. Gene therapy for ischemic heart disease // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2011. – Vol. 50, N 5. – P. 742-750. doi: 10.1016/ j.yjmcc.2010.06.007. 114. Lazarous D.F., Scheinowitz M., Shou M., et al. Effects of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart // Circulation. – 1995. – Vol. 91, N 1. – P. 145-153. 115. Lee Y.S., Wysocki A., Warburton D., Tuan T.L. Wound healing in development // Birth. Defects Res. C Embryo Today. – 2012. – Vol. 96, N 3. – P. 213222. doi: 10.1002/bdrc.21017. 116. Lehrke M., Greif M., Broedl U.C. et al. MMP-1 serum levels predict coronary atherosclerosis in humans // Cardiovasc. Diabetol. – 2009. – Vol. 8. – P. 50-58. 117. Levin E.R. Endothelins // N. Engl. J. Med. – 1995. – Vol. 333, N 6. – P. 356-363. 118. Liem D.A., Hekkert M.L., Manintveld O.C. et al. Myocardium tolerant to an adenosine-dependent ischemic preconditioning stimulus can still be protected by stimuli that employ alternative signaling pathways // Am. J. Physiol. Heart. 101 Circ. Physiol. – 2005. – Vol. 288, N 3. – H. 1165-1172. 119. Liotta L.A., Steeg P.S., Stetler-Stevenson W.G. Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation // Cell. – 1991. – Vol. 64, N 2. – P. 327-336. 120. Lochner A., Marais E., Genade S. et al. Protection of the ischaemic heart: investigations into the phenomenon of ischaemic preconditioning // Cardiovasc. J. Afr. – 2009. – Vol. 20, N 1. – P. 43-51. 121. Loftus I.M., Naylor A.R., Goodall S. et al. Increased matrix MMP9 activity in unstable carotid plaques: а potential role in acute plaque disruption // Stroke. – 2000. – Vol. 31, № 1. – P. 40-47. 122. Lygnos M.C., Pappa K.I., Papadaki H.A., Relakis C., Koumantakis E., Anagnou N.P., Eliopoulos G.D. Changes in maternal plasma levels of VEGF, bFGF, TGF-beta1, ET-1 and sKL during uncomplicated pregnancy, hypertensive pregnancy and gestational diabetes // In Vivo. – 2006. – Vol. 20, N 1. – P. 157-163. 123. Ma Y., Halade G.V., Lindsey M.L. Extracellular matrix and fibroblast communication following myocardial infarction // J. Cardiovasc. Transl. Res. – 2012. – Vol. 5, N 6. – P. 848-857. doi: 10.1007/s12265-012-9398-z. 124. Macdonald T.T., Pender S.L. Proteolytic enzymes in inflammatory bowel disease // Inflamm. Bowel Dis. – 1998. – Vol. 4. – P. 157-164. 125. Mac Gabhann F., Popel A.S. Systems biology of vascular endothelial growth factors // Microcirculation. – 2008. – Vol. 15, N 8. – P. 715-738 126. Mao Q., Lin C.X., Liang X.L., Gao J.S., Xu B. Mesenchymal stem cells overexpressing integrin-linked kinase attenuate cardiac fibroblast proliferation and collagen synthesis through paracrine actions // Mol. Med. Rep. – 2013. – Vol. 7, N 5. – P. 1617-1623. doi: 10.3892/mmr.2013.1348. 127. Marti H.H., Risau W. Angiogenesis in ischemic disease // Thromb. Haemost. – 1999. – Vol. 82, Suppl. 1. – P. 44-52. 128. Maslov L.N., Lishmanov Y.B., Oeltgen P.R. et al. Activation of peripheral delta2 opioid receptors increases cardiac tolerance to ischemia/reperfusion injury. Involvement of protein kinase C, NO-synthase, KATP channels and the autonomic nervous system // Life Sci. – 2009. – Vol. 84, N 19-20. – P. 657-663. 129. Matar A.A., Chong J.J. Stem cell therapy for cardiac dysfunction // 102 Springerplus. – 2014. – Vol. 3. – P. 440. doi: 10.1186/2193-1801-3-440. 130. Matrisian L.M., Cancer biology: extracellular proteinases in malignancy // Curr. Biol. – 1999. – Vol. 9, N 20. – P. R776-778. 131. McFalls E.O., Kelly R.F., Hu Q. et al. The energetic state within hibernating myocardium is normal during dobutamine despite inhibition of ATPdependent potassium channel opening with glibenclamide // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2007. – Vol. 293, N 5. – P. H 2945-2951. 132. Min J.Y., Yang Y., Converso K.L., Liu L., Huang Q., Morgan J.P., Xiao Y.F. Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in postinfarcted rats // J. Appl. Physiol. – 2002. – Vol. 92, N 1. – P. 288–296. 133. Mohammed F.F., Smookler D.S. Metalloproteinases, inflammation, and rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. – 2003. – Vol. 62, N 2. – P. 1143-1147. 134. Monti M., Donnini S., Morbidelli L., Giachetti A., Mochly-Rosen D., Mignatti P., Ziche M. PKCε activation promotes FGF-2 exocytosis and induces endothelial cell proliferation and sprouting // J. Mol. Cell. Cardiol. – 2013. – Vol. 63. – P. 107-117. doi: 10.1016/j.yjmcc.2013.07.006. 135. Moore B.B., Kolodsick J.E., Thannickal V.J., Cooke K., Moore T.A., Hogaboam C., Wilke C.A., Toews G.B. CCR2-mediated recruitment of fibrocytes to the alveolar space after fibrotic injury // Am. J. Pathol. – 2005. – Vol. 166, N 3. – P. 675-684. 136. Murphy E., Steenbergen C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury // Physiol. Rev. – 2008. – Vol. 88, N 2. – P. 581-609. 137. Musso O., Rehn M., Saarela J. et al. Collagen XVIII is localized in sinusoids and basement membrane zones and expressed by hepatocytes and activated stellate cells in fibrotic human liver // Hepatology. – 1998. – Vol. 28. – P. 98107. 138. Nagase H., Woessner J.F. Matrix Metalloproteinases // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274, N 31. – P. 21491–21494. 139. Nakagawa T. Strategies for developing novel therapeutics for sensorineural hearing loss // Front Pharmacol. – 2014. – Vol. 5. – P. 206. doi: 10.3389/fphar.2014.00206. 103 140. Park T.S., Hu Y., Noh H.L., Drosatos K. et al. Ceramide is a cardiotoxin in lipotoxic cardiomyopathy // J. Lipid. Res. – 2008. – Vol. 49, N 10. – P. 21012112. doi: 10.1194/jlr.M800147-JLR200. 141. Parsonage G., Filer A.D., Haworth O., Nash G.B., Rainger G.E., Salmon M. et al. A stromal address code defined by fibroblasts // Trends Immunol. – 2005.– Vol. 26. – P. 150–156. 142. Pawani H., Bhartiya D. Pluripotent stem cells for cardiac regeneration: overview of recent advances & emerging trends // Indian J. Med. Res. – 2013. – Vol. 137, N 2. – P. 270-282. 143. Pearl J.I., Lee A.S., Leveson-Gower D.B., Sun N. et al. Short-term immunosuppression promotes engraftment of embryonic and induced pluripotent stem cells // Cell Stem Cell. – 2011. – Vol. 8, N 3. – P. 309–317. 144. Perumal S., Antipova O., Orgel J.P. Collagen fibril architecture, domain organization, and triple-helical conformation govern its proteolysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2008. – Vol. 105, N 8. – P. 2824-2829. doi: 10.1073/ pnas.0710588105. 145. Phillips R.J., Burdick M.D., Hong K., Lutz M.A., Murray L.A., Xue Y.Y. et al. Circulating fibrocytes traffic to the lungs in response to CXCL12 and mediate fibrosis // J. Clin. Invest. – 2004. – Vol. 114. – P. 438–446. 146. Ponticos M., Smith B.D. Extracellular matrix synthesis in vascular disease: hypertension, and atherosclerosis // J. Biomed. Res. – 2014. – Vol. 28, N 1. – P. 25-39. doi: 10.7555/JBR.27.20130064. 147. Poole T.J., Finkelstein E.B., Cox C.M. The role of FGF and VEGF in angioblast induction and migration during vascular development // Dev. Dyn. – 2001. – Vol. 220, N 1. – P. 1-17. 148. Postlethwaite A.E., Shigemitsu H., Kanangat S. Cellular origins of fibroblasts: possible implications for organ fibrosis in systemic sclerosis // Curr. Opin. Rheumatol. – 2004. – Vol. 16. – P. 733–738. 149. Powell D.W. Myofibroblasts: paracrine cells important in health and disease // Ttransactions of the American clinical and climatological association.– 2000. – Vol. 111. – P. 271-293. 150. Powell D.W., Mifflin R.C., Valentich J.D., Crowe S.E., Saada J.I., West 104 A.B. Myofibroblasts: I. Paracrine cells important in health and disease // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 1999. – Vol. 46. – P. C1-C19. 151. Powell D.W., Mifflin R.C., Valentich J.D., Crowe S.E., Saada J.I., West A.B. Myofibroblasts: II. Intestinal subepithelial myofibroblasts // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 1999. – Vol. 46. – P. C183-C201. 152. Quan T.E., Cowper S., Wu S.P., Bockenstedt L.K., Bucala R. Circulating fibrocytes: collagensecreting cells of the peripheral blood // Int. J. Biochem. Cell. Biol. – 2004. – Vol. 36. – P. 598-606. 153. Ricard-Blum S. The collagen family // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. – 2011. – Vol. 3, N 1. – a004978. doi: 10.1101/cshperspect.a004978. 154. Roger V.L., Go A.S., Lloyd-Jones D.M., Adams R.J. et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association // Circulation. – 2011. – Vol. 123, N 4. – P. e18–e209. 155. Rozenberg V.D., Nepomnyashchikh L.M. Postinfarction remodeling of the heart: types of pathomorphological changes in the right ventricle // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2003. – Vol. 136, N 3. – P. 291-295. 156. Rothermund L., Pinto Y.M., Hocher B. et al. Cardiac endothelin system impairs left ventricular function in rennin-dependent hypertension via sarcoplasmic reticulum Ca 2+ uptake // Circulation. – 2000. – Vol. 102. – P. 1582-1588. 157. Rothrauff BB, Tuan RS. Cellular therapy in bone-tendon interface regeneration // Organogenesis. – 2014. – Vol. 10, N 1. – P. 13-28. doi: 10.4161/ org.27404. 158. Rudek M.A., Figg W.D., Dyer V. et al. Phase I clinical trial of oral COL-3, a matrix metalloproteinase inhibitor, in patients with refractory metastatic cancer // J. Clin. Oncol. – 2001. – Vol. 19, N 2. – P. 584-592. 159. Rui L., Yu N., Hong L., Feng H., Chunyong H., Jian M., Zhe Z., Shengshou H. Extending the time window of mammalian heart regeneration by thymosin beta 4 // J. Cell Mol. Med. – 2014. – Oct 6. doi: 10.1111/jcmm.12421. 160. Salloum F., Yin C., Xi L., Kukreja R.C. Sildenafil induces delayed preconditioning through inducible nitric oxide synthase-dependent pathway in mouse heart // Circ. Res. – 2003. – Vol. 92, N 6. – P. 595-597. 161. Sato K., Laham R.J., Pearlman J.D. et al. Efficacy of intracoronary ver- 105 sus intravenous FGF-2 in a pig model of chronic myocardial ischemia // Ann. Thorac. Surg. – 2000. – Vol. 70, N 6. – P. 2113-2118. 162. Schaper W., Ito W.D. Molecular mechanisms of coronary collateral vessel growth // Circ. Res. – 1996. – Vol. 79, N 5. – P. 911-919. 163. Schepeler T., Page M.E., Jensen K.B. Heterogeneity and plasticity of epidermal stem cells // Development. – 2014. – Vol. 141, N 13. – P. 2559-2567. doi: 10.1242/dev.104588. 164. Schmidt M., Sun G., Stacey M.A., Mori L., Mattoli S. Identification of circulating fibrocytes as precursors of bronchial myofibroblasts in asthma // J. Immunol. – 2003. – Vol. 171, N 1. – P. 380-389. 165. Schulman I.H., Hare J.M. Key developments in stem cell therapy in cardiology // Regen. Med. – 2012. – Vol. 7, Suppl. 6. – P. 17-24. 166. Schuppan D., Schmid M., Somasundaram R. et al. Collagens in the liver extracellular matrix bind hepatocyte growth factor // Gastroenterology. – 1998. – Vol. 114. – P. 139-152. 167. Senger D.R., Van De Water L. VEGF expression by epithelial and stromal cell compartments: resolving a controversy // Am. J. Pathol. – 2000. – Vol. 157, N 1. – P. 1–3. 168. Shoulders M.D., Raines R.T. Collagen structure and stability // Annu Rev. Biochem. – 2009. – Vol. 78. – P. 929-958. 169. Soler-Botija C., Bagó J.R., Llucià-Valldeperas A., Vallés-Lluch A. et al. Engineered 3D bioimplants using elastomeric scaffold, self-assembling peptide hydrogel, and adipose tissue-derived progenitor cells for cardiac regeneration // Am. J. Transl. Res. – 2014. – Vol. 6, N 3. – P. 291-301. 170. Sternlicht M.D., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior // Аnnu. Rev. Cell. Dev. Biol. – 2001. – Vol. 17. – P. 463–516. 171. Stramer B.M., Mori R., Martin P. The Inflammation – Fibrosis Link? A Jekyll and Hyde Role for Blood Cells during Wound Repair // J. Investigative Dermatology. – 2007. – Vol. 127. – P. 1009–1017. 172. Sucher R., Gehwolf P., Kaier T. et al. Intracellular signaling pathways control mitochondrial events associated with the development of ischemia/ reperfusion-associated damage // Transpl. Int. – 2009. – Vol. 22, N 9. – P. 922-930. 106 173. Sun Y., Weber K.T. Infarct scar: a dynamic tissue // Cardiovasc. Res. – 2000. – Vol. 46, N 2. – P. 250-256. 174. Templin C., Lüscher T.F., Landmesser U. Cell-based cardiovascular repair and regeneration in acute myocardial infarction and chronic ischemic cardiomyopathy-current status and future developments // Int. J. Dev. Biol. – 2011. – Vol. 55, N 4-5. – P. 407-417. doi: 10.1387/ijdb.103219ct. 175. Tímár J., Döme B., Fazekas K., Janovics A., Paku S. Angiogenesisdependent diseases and angiogenesis therapy // Pathol. Oncol. Res. – 2001. – V l. 7, N 2. – P. 85-94. 176. Thavandiran N., Dubois N., Mikryukov A., Massé S. et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 2013. – Vol. 110, N 49. – P. E4698-4707. doi: 10.1073/pnas.1311120110. 177. Troeberg L., Nagase H. Analysis of TIMP expression and activity // Methods Mol. Med. – 2007. – Vol. 135. – P. 251–267. 178. Unger E.F., Banai S., Shou M. et al. Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model // Am. J. Physiol. – 1994. – Vol. 266, N 4, Pt. 2. – P. H. 1588-1595. 179. Van den Steen P.E., Dubois B., Nelissen I., Rudd P.M., Dwek R.A., Opdenakker G. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) // Critical. Rev. Biochem. Mol. Biol. – 2002. – Vol. 37, N 6. – P. 375–536. 180. Valenick L.V., Hsia H.C., Schwarzbauer J.E. Fibronectin fragmentation promotes alpha4beta1 integrin-mediated contraction of a fibrin-fibronectin provisional matrix // Exp. Cell. Res. – 2005. – Vol. 309, N 1. – P. 48-55. 181. Vinten-Johansen J., Zhao Z.Q., Zatta A.J. et al. Postconditioning – a new link in nature's armor against myocardial ischemia-reperfusion injury // Basic. Res. Cardiol. – 2005. – Vol. 100, N 4. – P. 295-310. 182. Wende A.R., Symons J.D., Abel E.D. Mechanisms of lipotoxicity in the cardiovascular system // Curr. Hypertens. Rep. – 2012. – Vol. 14, N 6. – P. 517531. doi: 10.1007/s11906-012-0307-2. 183. Willey K.E. Davenport A.P. Nitric oxide-medulation of the endothelin-1 107 signaling pathway in the human cardiovascular system // Brit. J. Pharmacology. – 2001. – Vol. 132. – P. 213-220. 184. Williams P.D., Kingston P.A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease // Cardiovasc. Res. – 2011. – Vol. 91, N 4. – P. 565-576. doi: 10.1093/cvr/cvr197. 185. Woessner J.F. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling // FASEB J. – 1991. – Vol. 5, N 8. – P. 2145-2154. 186. Yanagasawa M., Kurihara H., Kimura S., Tomobe Y. et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells // Nature. – 1988. – Vol. 332, N 6163. – P. 411-415. 187. Yanagisawa M., Masaki T. Molecular biology and biochemistry of the endothelins // Trend. Pharmacol. Sci. – 1989. – Vol. 10. – P. 374-378. ; 188. Spinar J., Spinarova L., Vitovec J. et al. Big endothelin and chronic heart failure // Vnitr. Lek. – 2002. – Vol. 48. – P. 3-7. 189. Yang L. Peripheral blood fibrocytes from burn patients: identification and quantification of fibrocytes in adherent cells cultured from peripheral blood mononuclear cells // Lab. Invest. – 2002. – Vol. 82, N 9. – P. 1183-1192. 190. Ye K.Y., Black L.D. Strategies for tissue engineering cardiac constructs to affect functional repair following myocardial infarction // J. Cardiovasc. Transl. Res. – 2011. – Vol. 4, N 5. – P. 575-591. doi: 10.1007/s12265-011-9303-1. 191. Ylä-Herttuala S., Rissanen T.T., Vajanto I., Hartikainen J. Vascular endothelial growth factors: biology and current status of clinical applications in cardiovascular medicine // J. Am. Coll. Cardiol. – 2007. – Vol. 49, N 10. – P. 10151026. 192. Zang W.J., Sun L., Yu X.J. Cardioprotection of ischemic postconditioning and pharmacological post-treatment with adenosine or acetylcholine // Sheng. Li. Xue. Bao. – 2007. – Vol. 59, N 5. – P. 593-600. 193. Zeisberg M., Hanai J., Sugimoto H., Mammoto T., Charytan D., Strutz F. et al. BMP-7 counteracts TGF-beta1-induced epithelial-tomesenchymal transition and reverses chronic renal injury // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9. – P. 964–968. 194. Zhang J., Li X.X., Bian H.J.et al. Inhibition of the activity of Rhokinase reduces cardiomyocyte apoptosis in heart ischemia/reperfusion via sup- 108 pressing JNK-mediated AIF translocation // Clin. Chim. Acta. – 2009. – Vol. 401, N 1-2. – P. 76-80. 195. Zhao Z.Q., Corvera J.S., Halkos M.E. et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2003. – Vol. 285, N 2. – P. H. 579-588.
