Практическая работа № 5

5
ПРОКАРИОТЫ
Клетки прокариот характеризуются относительно
простым строением, однако обладают основными признаками живой клетки: имеют мембрану, генетический аппарат, каталитический аппарат для синтеза органических веществ, ферменты для расщепления органических веществ.
Плазмалемма образует единый цитоплазматический компартмент, без выраженных подразделений. Клетки содержат
одну единственную хромосому – нуклеоид, которая состоит
из одной кольцевой молекулы ДНК, морфологически
обособленное ядро отсутствует, поэтому их назвали прокариотами.
В природе встречаются различные типы бактерий. В зависимости от формы различаются:
- бациллы - бактерии в форме палочек (Escherichia coli)
- кокки – сферические бактерии (Micrococcus cerulyticus)
- диплококки – две сферические бактерии, окружены одной капсулой
(Diplococcus pneumoniae) – вызывает пневмонию.
- стрептококки – цепи кокков (Streptococcus pyogenes) – вызывают
ангину и скарлатину
- стафилококки – грозди кокков (Staphylococcus aureus) – вызывают
заболевания дыхательных путей
- спириллы – спираль со жгутиками (Spiryllum)
- вибрион – в форме запятой со жгутиками (Vibrio cholerae) – вызывает холеру.
81
Клеточная оболочка бактерий
В зависимости от структуры клеточной оболочки,
выделяются грамположительные и грамотрицательные
бактерии (рис.5.1).
Рис. 5.1. Структура грамположительных и грамотрицательных бактерий
82
Название зависит от цвета, который получают бактерии при окрашивании по Граму (основной краситель).
Клетки окружены плотной клеточной стенкой, которая состоит из муреина, представляющего собой пептидогликан.
Некоторые бактерии окружены слизистой капсулой, которая обеспечивает образование колоний. Капсулф, как и
клеточная стенка, выполняет также защитную роль в клетке. Таким образом, штаммы (бактерии одного вида, характеризующиеся определенными свойствами) пневмококков,
обладающих капсулой – вирулентны и вызывают пневмонию, в то же время штаммы, лишенные капсулы – авирулентны, так как они разрушаются фагоцитами.
Грамположительные бактерии
У грамположительных бактерий клеточная оболочка
состоит из плазмалеммы, покрытой толстой клеточной
стенкой, в состав которой входят тейхоевые кислоты, липотейхоевые кислоты и полисахариды.
Плазмалемма имеет структуру сходную с таковой у
эукариот. Фосфолипидный бислой взаимодействует с интегральными белками (белки-каналы) и полуинтегральными
(белки-ферменты). Бактериальные ферменты присоединены
к цитоплазматической поверхности мембраны, они катализируют активный транспорт веществ, процесс аэробного
дыхания, системы превращения энергии. Плазмалемма содержит Н+ АТФ-азу, нужные компоненты для синтеза фосфолипидов, пептидогликанов, липополисахаридов, содержит белки для связывания молекул ДНК. Бактериальная
плазмалемма представляет собой многофункциональную
структуру, которая может сочетать функции, выполняемые
различными органеллами у эукариот.
В грамположительных бактериях могут быть обнаружены мембранные, везикулярные или везикуломембранные структуры – мезосомы, которые образуются в
результате впячивания плазмалеммы. В настоящее время
83
предполагается, что мезосомы являются аналогами митохондрий эукариот и участвуют в процессах аэробного дыхания.
Клеточная стенка бактерий состоит из муреина,
представляющего собой полимер, образованный из цепей
N-ацетилглукозамина (NAG), N-ацетомурамовой кислоты
(NAM), связанных между собой аминокислотами (Dаминокислотами) (рис.5.2).
Рис. 5.2. Структура пептидогликана
Толщина клеточной стенки варьирует между 20 - 80
nm (у грамм - положительных бактерий) и составляет до
95% от сухого вещества клетки. На поверхности клеток
расположены и другие компоненты:
тейхоевые кислоты, представляющие собой
полимеры (носители отрицательных зарядов), плотно свя84
занные с пептидогликаном и задерживающие фиолетовые
кристаллы при окрашивании по Граму;
липотейхоевые кислоты – полимеры, состоящие из гликофосфатов и гликолипидов, которые прикреплены к плазмалемме: имеют антигенную, цитотоксическую
и адгезивную функции (Streptococcus pyogenes).
Снаружи клеточная стенка покрыта тонким липидным слоем, который защищает ее от воздействия лизоцима
– фермента, способствующего гидролизу межуглеводных
связей и разрушению муреина. Липидный слой защищает
клетку от воздействий пенициллина, который блокирует
процесс формирования связей между компонентами клеточной стенки грамположительных бактерий.
Грамотрицательные бактерии
Грамотрицательные
бактерии
характеризуются
наличием двух мембран: внутренней плазматической
мембраны, которая непосредственно взаимодействует с цитоплазмой, и внешней плазматической мембраны толщиной 7,5-10 nm, расположенной снаружи клетки. У большинства грамотрицательных бактерий внутренняя плазматическая мембрана соединена ковалентно с пептидогликаном посредством липопротеидов. У некоторых бактерий (E.
coli), внешняя и внутренняя мембраны соединены во многих точках, что приводит к прерывности муреиновой стенки.
Внутренняя плазматическая мембрана грамотрицательных бактерий имеет сходную с плазмалеммой грамположительных бактерий структуру и функции, но не образует мезосомы.
В периплазматическом пространстве расположен
муреиновый слой, толщиной в 3-10 nm, ковалентно связанный с внешней плазматической мембраной при помощи некоторых липопротеидов.
85
Внешняя плазматическая мембрана имеет асимметричное строение. Фосфоглицериды и кардиолипины расположены на внутренней стороне мембраны, а липиды А (гидрофобные молекулы) – на внешней стороне. Липиды А соединены с полисахаридами и образуют внешний липополисахаридный слой оболочки грамотрицательных бактерий.
Липополисахариды представляют собой комплексы,
состоящие из липида А с якорной функцией и углеводородных цепей с антигенными свойствами (антиген О).
В состав наружной мембраны только грамотрицательных бактерий входит специфический белок – порин,
который образует каналы для транспорта гидрофильных
веществ. Эти каналы обладают выборочной проницаемостью и являются препятствием для некоторых антибиотиков
(ампицилин), которые отрицательно воздействуют на грамположительные бактерии. Характерной особенностью
наружной мембраны бактерии является неспособность осуществлять активный транспорт из-за отсутствия специализированных ферментных комплексов.
Жгутики и пили
На поверхности бактериальных клеток расположены
нитевидные выросты двух типов: жгутики и пили.
Жгутики имеются обычно на поверхности бактерий,
реже у кокков. Они представляют собой микротрубочки,
толщиной 10 - 60 nm, состоящие из 3 -11 филаментов, компонентом которых является глобулярный белок флагеллин.
В отличие от жгутиков клеток эукариот, жгутики бактерий
не покрыты плазматической мембраной. Они соединяются с
плазмалеммой и клеточной стенкой с помощью одной пары
дисков у грамположительных бактерий и двумя парами
дисков у грамотрицательных. В связи с тем, что флагеллин
не обладает АТФ-азной активностью, жгутики не в состоянии совершать колебательные движения, в отличии от жгутиков эукариот. Движение жгутиков осуществляется в виде
86
вращения вокруг собственной оси. Источником энергии
движения служит градиент Н+ на поверхности плазматической мембраны. Жгутики обладают антигенными свойствами (антиген Н).
В зависимости от числа жгутиков различают следующие типы
бактерий:
- монотрихи – с 1 жгутиком (Vibrio сhoдerae);
- лофотрихи – с униполярным пучком жгутиков, расположенным на
одном конце (Bartonella baciliformes);
- амфитрихи – с биполярными пучками жгутиков (Spiririllum
serpens);
- перитрихи – окруженные жгутиками (E.coli).
Пили представляют собой тонкие выросты, расположенные на поверхности грамотрицательных клеток и состоящие из группы белков – пилинов. Число их варьирует
от нескольких до двухсот на клетку. Существует два типа
пилей: многочисленные короткие, участвующие в прикреплении клеток к субстрату, и 1-6 длинных пилей, названных
секс-пилями или F-пилями, которые участвуют в конъюгации бактерий. В процессе конъюгации происходит обмен
генетической информацией между клетками. Пили также
придают адгезивные свойства тем штаммам, которые паразитируют в других организмах.
Внутриклеточные компоненты
Бактерии не содержат мембранных клеточных органелл, таких как ЭПС, АГ, лизосомы, пероксисомы, митохондрии. Некоторые виды бактерий содержат фотосинтезирующие мембраны, пузырьки. Бактериальные клетки содержат рибосомы с коэффициентом осаждения 70S (30S +
50S), ответственные за синтез белков. Рибосомы могут быть
разбросаны в цитоплазме или ассоциировать с информационной РНК. В цитоплазме могут находиться резервные вещества в форме гликогена и др.
87
Многочисленные бактерии образуют эндоспоры –
структуры, способствующие выживанию вида в неблагоприятных условиях. Были обнаружены споры, сохранившиеся в латентном состоянии свыше 25 млн лет. Эндоспоры
имеют толстую клеточную стенку, содержащую белки и
обезвоженную цитоплазму.
Генетический аппарат бактериальных клеток
Генетический материал бактериальной клетки
представлен нуклеоидом и плазмидами.
Нуклеоид составляет главную часть бактериального
генома и представлен кольцевой молекулой ДНК, длиной
≈ в 1 μm, включающей около 5х106 нуклеотидных пар. Нуклеоид прикрепляется к плазматической мембране точкой
начала репликации. Бактерии интенсивно делятся, в связи с
чем репликация ДНК происходит непрерывно. Поскольку
бактерии не содержат микротрубочек и не образуется веретено деления, которое могло бы обеспечить распределение
генетической информации, деление клетки по типу митоза
является
невозможным.
Для обеспечения сегрегации нуклеоидов в дочерние клетки, они отделяются друг от друга в результате роста выпячивания
плазматической мембраны, и после образования
разделительной
стенки
нуклеоиды попадают в
разные клетки (рис.5.3).
С химической точки зрения нуклеоид соРис. 5.3. Этапы деления бактериальной
стоит на 80% из ДНК (для
клетки
сравнения у эукариот –
88
40%), белков и РНК. Белки нуклеоида имеют основные
свойства, характерные для гистоновых белков, которые
обеспечивают упаковку ДНК у эукариот. Двухцепочечная
ДНК взаимодействует с белками при помощи механизма
скручивания. Каждые 40 тыс. нуклеотидов (40 kb) ДНК физически ассоциирует с основными белками, образуя петли
(рис.5.4.). Механизм стабилизации гиперспирализованных
структур не совсем ясен, возможно, участие в нем молекул
РНК.
Рис. 5.4. Этапы конденсации ДНК у прокариот
Функционально большинство последовательностей
ДНК представляют уникальные последовательности структурные гены. Гены, кодирующие основные классы рибосомальной РНК, группируются в тандем и повторяются 7
раз в геноме E.coli.
Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы
ДНК, которые реплицируются самостоятельно и составляют
0,05 – 10% бактериального генома. Они ответственны за
синтез различных метаболитов (аминокислот, антибиотиков, факторов устойчивости к антибиотикам и др.). Для репликации и транскрипции плазмиды используют продукты
экспрессии нуклеоидных генов, в то время как инициация
репликации управляется плазмидными генами. По числу
89
копий в геноме различают плазмиды с малым числом копий
(1-5) – обычно это большие молекулы, число и деятельность
которых находятся под строгим контролем нуклеоида;
плазмиды со средним числом копий (10-50) – молекулы
средних размеров, находятся под частичным контролем
нуклеоида; плазмиды с высоким числом копий (свыше 50) –
малые полуавтономные молекулы.
По роду деятельности в клетке различают:
- плазмиды R которые придают клетке устойчивость к
антибиотикам;
- плазмиды Col, которые обеспечивают синтез колицинов
– белков, способных уничтожать бактерии, не содержащих
эти плазмиды;
- плазмиды F (секс плазмиды) обеспечивают перенос генов во время коньюгации бактерий.
Генетическая рекомбинация
бактерий
Рис. 5.5. Коньюгация бактерий и перенос фактора F
Рекомбинация генетического материала между разными бактериальными клетками представляет собой источ90
ник генетической изменчивости и является очень важным
процессом для естественного отбора в борьбе за существование.
Существуют три типа переноса наследственного материала от одной клетки к другой: конъюгация, трансформация и трансдукция.
Конъюгация представляет собой процесс переноса
генетического материала от одной бактерии к другой посредством пилей. Для этой цели осуществляется контакт
между одной бактерией-носительницей плазмиды F (F+) и
другой, у которой отсутствует плазмида F (F-). Клетка F+
выступает в качестве донора генетического материала, а
клетка F- - акцептора. Из клетки донора передается одноцепочечная копия плазмиды F. В клетке-акцепторе одноцепочечная молекула превращается в двухцепочечную и принимает кольцевидную форму. В результате обе клетки становятся F+ и могут в дальнейшем выступать в качестве доноров генетической информации (рис. 5.5).
Рис. 5.6. Интеграция фактора F в бактериальный
геном. Образование бактерий Hfr
91
В некоторых случаях фактор F+ интегрируется в нуклеоид, а соответствующие штаммы носят название Hfr
(High frequency recombination). Клетка Hfr служит донором
при коньюгации с клеткой
F-, перенося в клеткуакцептор одноцепочечную
копию целого нуклеоида
(рис.5.6).
В некоторых случаях процесс коньюгации
прерывается и в результате происходит перенос
только фрагмента нуклеоида. Иногда в клетках Hfr,
фактор F вырезается из
нуклеоида, унося с собой
фрагмент нуклеоида. В
таком случае рекомбинантная молекула носит
название
фактора
F'
(плазмида F') (рис.5.7).
Рис. 5.7. Рекомбинация между плазмиКлетки с плазмидой F' модой и нуклеоидом. Образование факгут участвовать в процессе
тора F'
коньюгации.
Генетическая трансформация характеризуется
проникновением в клетку бактерии чужеродной ДНК. Клетки, способные к трансформации, называются компетентными клетками и могут быть получены в лабораторных условиях при инкубации в режиме низких температур в присутствии ионов Са 2+, Cs+ и др. Практическое значение генетической трансформации состоит в возможности внедрения
интересующих нас генов (например, гена инсулина) в бактерии с целью получения белков, которые могут быть ис92
пользованы в качестве медицинских препаратов. В лабораторных условиях для трансформации используются плазмиды семейств R и Сol. В природе была описана трансформация пневмококков и кишечной палочки с кольцевой ДНК.
Для того чтобы молекулы ДНК не подвергались гидролизу
ферментами хозяина, они принимают кольцевую форму или
интегрируются в геном хозяина.
Трансдукция представляет собой перенос наследственной информации от одной клетки к другой при участии бактериофагов. Лизогенные бактериофаги способны
интегрироваться в геном клетки хозяина. В некоторых случаях под воздействием экзогенных факторов (облучение,
температура, рН), ДНК бактериофага вырезается из нуклеоида, захватывая какой-то его фрагмент. Вырезанная ДНК
вируса с фрагментом нуклеоида переходит в цитоплазму,
вирусные частицы размножаются, что приводит к разрушению клетки-хозяина. Инфицируя другие клетки, бактериофаг переносит часть генетической информации разрушенной клетки.
Генетическая рекомбинация у бактерий имеет медицинское значение. В первую очередь речь идет о возможности получения фармацевтических препаратов с помощью
трансформированных бактерий. Наряду с положительными
эффектами, существуют отрицательные: путем генетической рекомбинации в природе возникают популяции патогенных бактерий, устойчивых к медицинским препаратам,
что значительно осложняет лечение бактериозов.
Контроль знаний:
1. Дайте определение: прокариота, муреин, нуклеоид,
плазмида, коньюгация, мезосома, трансдукция, трансформация.
2. Каковы компоненты прокариотической клетки?
3. В чем особенности клеточной оболочки у бактерий?
4. Какова характеристика бактериального генома?
93
5. Какие типы генетической рекомбинации существуют у
бактерий?
6. В чем состоит биологическая и медицинская роль генетической рекомбинации у бактерий?
94