Достижения кардиологии, кардиохирургии, анестезиологии и
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук На правах рукописи Головкин Алексей Сергеевич МЕХАНИЗМЫ СИНДРОМА СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА ПОСЛЕ ОПЕРАЦИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИСКУССТВЕННОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ 14.03.03 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: Доктор медицинских наук, академик РАМН Л.С. Барбараш Доктор медицинских наук, профессор Е.В. Григорьев Кемерово-2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41 ГЛАВА 3 ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ УПРАВЛЯЕМОЙ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ 55 ГЛАВА 4 ВЛИЯНИЕ ПЕРИОПЕРАЦИОННОГО СТРЕССА НА РАЗВИТИЕ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА 77 ГЛАВА 5 КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ: ИЗМЕНЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МОНОЦИТОВ ПРИ СИСТЕМНОМ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ ОТВЕТЕ 96 ГЛАВА 6 ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА 125 ГЛАВА 7 ВЛИЯНИЕ АЛАРМИНОВ НА ФУНКЦИЮ МОНОЦИТОВ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПАТОГЕНЕЗЕ СВО 181 ГЛАВА 8 ОЦЕНКА ЗНАЧИМОСТИ ГУМОРАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА 193 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 200 ВЫВОДЫ 219 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 222 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 223 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 226 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Достижения кардиологии, кардиохирургии, анестезиологии и реаниматологии в последнее время значительно расширили спектр и сложность оперативных вмешательств, выполняемых пациентам с сердечно-сосудистой патологией. При этом повышается сложность самих операций, увеличивается их продолжительность, удлиняется время искусственного кровообращения и пережатия аорты, расширяются показания к оперативному лечению, повышается уровень сложности курации пациентов [2]. Процедура проведения искусственного кровообращения включает в себя множество факторов, которые являются нефизиологичными и могут провоцировать запуск целого ряда патологических процессов, результатом которых может стать развитие системного воспаления. К негативным факторам оперативных вмешательств с применением искусственного кровообращения можно отнести длительную ишемию и реперфузию жизненно важных органов, в первую очередь миокарда, контакт клеток крови с инородными поверхностями фильтров, трубок и т.д., механическое повреждение тканей, обусловленное оперативным вмешательством, применение большого количества токсичных препаратов для проведения длительного анестезиологического пособия, гипотермия, выброс эндотоксинов [18; 154; 345]. Ранний послеоперационный период у пациентов, оперированных на открытом сердце в условиях искусственного кровообращения, сопровождается системным воспалительным ответом (СВО), который в 5-16% случаев осложняется полиорганной недостаточностью (СПОН) с высокой летальностью (по данным EACTA 2007) [333; 269]. При этом сама процедура искусственного кровообращения рассматривается как модель управляемой ишемии и реперфузии, в которой, безусловно, есть место кардиопротекции, а в ряде случаев и прекондиционированию, однако имеют место и повреждения тканей и органов. 4 Критерии диагностики СВО были приняты в 1992 году [138] и до сих пор остаются неизменными, однако очевидно, определение диагноза на основании этих критериев представляет трудности. Кроме того, эти критерии были описаны при диагностике сепсиса, а не «асептического» СВО. При этом методология диагностики последнего и возможная стадийность процесса до сих пор не определены. Недостатком диагностики СВО, применительно к пациентам после полостных оперативных вмешательств, в том числе выполненных в условиях искусственного кровообращения является то, что у кардиохирургических пациентов тахикардия и тахипноэ в большинстве клинических ситуаций не являются диагностически значимыми в виду проводимой противоаритмической терапии и продленной искусственной вентиляции легких. На температуру тела в значительной степени влияет применение анальгетиков, обладающих жаропонижающим эффектом. После проведенной операции со значительным повреждением тканей и органов лейкоцитоз со сдвигом формулы влево является естественной реакцией, а не проявлением осложненного СВО. Все это определяет необходимость поиска дополнительных, прежде всего лабораторных патогенетически обоснованных критериев диагностики СВО. Продолжает формироваться представление о СВО, уточняются и дополняются критерии его оценки, изучаются особенности течения этого процесса при различных состояниях и заболеваниях [59]. Успех оперативного вмешательства на сердце в условиях ИК нередко зависит от предупреждения и своевременного интенсивного лечения осложнений СВО, возникающих в послеоперационном периоде. Поэтому у этой категории пациентов представляет большой интерес изучение характера развития и особенностей оценки СВО, а так же способов прогнозирования его осложнений. Степень научной разработанности темы Существенный вклад в изучение системного воспалительного ответа как важного патогенетического фактора многих заболеваний и неотложных состояний 5 внесли В.А. Черешнев, Е.Ю. Гусев, J-M. Cavaillon, R.C. Bone, J-L. Vincent. В работах ученых представлены данные об основных механизмах развития системного воспалительного ответа. В частности, о важной роли дисбаланса цитокинов при формировании осложненных форм и полиорганной недостаточности. Исследования проводились на клиническом материале и экспериментальных моделях системного воспалительного ответа, в основном, инфекционного генеза. Вместе с тем механизмы развития СВО после проведения кардиохирургических операций в условиях искусственного кровообращения как самостоятельная тема не рассматривались. Актуальность и недостаточная разработанность проблемы и обусловили выбор темы диссертационного исследования. Цель исследования: оценить роль клеточных и гуморальных компонентов врожденного иммунитета в развитии системного воспалительного ответа после кардиохирургических операций, выполненных с использованием искусственного кровообращения. Задачи исследования: 1. Определить степень повреждения миокарда под действием окислительного стресса и вклад сердечного компартмента в развитие системного воспалительного ответа при проведении операции коронарного шунтирования, выполненной в условиях искусственного кровообращения. 2. Установить значение изменения миграционного потенциала субпопуляций циркулирующих моноцитов при системном воспалительном ответе, развивающимся после проведения кардиохирургических операций, выполненных в условиях искусственного кровообращения. 3. Определить патогенетическую значимость цитокинового дисбаланса в формировании системного воспалительного ответа, развивающегося после проведения кардиохирургических искусственного кровообращения. операций, выполненных в условиях 6 4. Определить формировании характер системного изменений функций воспалительного ответа эндотелия после при проведения кардиохирургических операций, выполненных в условиях искусственного кровообращения. 5. Определить патогенетическую значимость изменения сывороточного уровня лизосомальных ферментов и их ингибиторов, как маркеров активности иммунокомпетентных клеток. 6. Экспериментально обосновать триггерное влияние аларминов, образующихся в результате кардиохирургической операции, выполненной в условиях искусственного кровообращения, на инициацию системного патогенеза системного воспалительного ответа. 7. Разработать принципиальную схему воспалительного ответа, развивающегося после проведения кардиохирургической операции, выполненной в условиях искусственного кровообращения. Научная новизна Установлено, что, несмотря на проводимую во время операции коронарного шунтирования кардиопротекцию, происходит повреждение клеток миокарда, не только вследствие хирургического приема, но и окислительного стресса, инициированного ишемией и реперфузией, что подтверждается появлением маркеров цитолиза (КФК-МВ, АсТ, АлТ, БСЖК) в системном и в коронарном кровотоке в процессе проведения операции. При этом степень повреждения миокарда в отношении развития осложненного системного воспалительного ответа в послеоперационном периоде не играет прогностической роли. Впервые установлено, что развитие системного воспалительного ответа сопряжено с повышением миграционной способности CD14hiCD16+, CD14hiCD16–, CD14dimCD16+ субпопуляций моноцитов, о чем свидетельствует увеличение плотности селектиновых рецепторов CD62L при одновременном снижении плотности рецепторов межклеточной адгезии CD54. 7 Подтверждено ключевое значение дисбаланса цитокинов в патогенезе системного воспалительного ответа, инициированного кардиохирургической операцией, выполненной в условиях искусственного кровообращения. Формирование системного воспалительного ответа характеризуется увеличением уровня ИЛ 1RA, ИЛ 6, ИЛ 10 и снижением уровня ИЛ 12. При этом неосложненный системный воспалительный ответ характеризуется более высокими значениями ИЛ 6 в первые сутки после вмешательства, а ИЛ 10 – на седьмые. Высокие концентрации сывороточных ИЛ 10 и ИЛ 12 до операции являются прогностически неблагоприятным признаком в отношении развития осложненного системного воспаления. Впервые показано, что сердечный компартмент играет ключевую роль в развитии дисбаланса цитокинов (в первую очередь интерлейкинов 6 и 10). Подтверждено, что при формировании системного воспалительного ответа после проведения кардиохирургической операции в условиях искусственного кровообращения развивается дисфункция эндотелия, о чем свидетельствуют снижение значений sL-селектина, sE-селектина и увеличение – sP-селектина; снижение - sICAM-1 и увеличение sVCAM-1; повышение концентраций фактора Виллебранда, эндотелина и снижение моноцитарного белка хемотаксиса MCP-1. Впервые показано что системный воспалительный ответ связан с изменением активности иммунокомпетентных клеток, проявляющейся снижением сывороточных матричных металлопротеиназ (proMMP-1 и MMP-3), повышением – MMP-9, прокатепсина В и TIMP-2, а также снижении естественного антагониста катепсинов – цистатина С. В модельных экспериментах in vitro раскрыт механизм взаимного отягощения системного воспалительного ответа инфекционным компонентом, который может присоединяться вследствие транслокации кишечной флоры и формировать осложненные формы системного воспалительного ответа. Установлено, что цитозольная фракция кардиомиоцитов, с содержащимися в ней аларминами, является триггером продукции цитокинов (ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8, ИЛ 8 10, ФНО α) моноцитами, а совместное стимулирование с липополисахаридом оказывает потенцирующее действие. Установлено, что в развитии системного воспалительного ответа главным триггерным фактором является повреждение клеток с последующим запуском каскада воспалительных (клеточных и гуморальных) реакций, в центре которых находятся клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Обязательным условием формирования СВО является вовлечение эндотелия. Впервые составлена воспалительного проведения ответа принципиальная неинфекционного кардиохирургической схема генеза, операции, патогенеза системного развивающегося выполненной в после условиях искусственного кровообращения. Теоретическая значимость Углублены знания о роли нарушений клеточного и гуморального иммунитета, вкладе сердечного компартмента и дисбаланса цитокинов в развитие системного воспалительного ответа после проведения кардиохирургических операций, выполненных Полученные знания в условиях позволили создать искусственного схему кровообращения. патогенеза системного воспалительного ответа, которая может стать основой для формирования алгоритмов диагностики и профилактики осложнений кардиохирургических операций, выполняемых в условиях искусственного кровообращения. Практическая значимость Разработан и клинически апробирован патогенетически обоснованный способ ранней диагностики осложненного системного воспалительного ответа у пациентов, оперированных позволяющий на мониторировать в основании течение условиях искусственного динамической системного оценки кровообращения, уровня воспалительного sTREM-1 ответа в послеоперационном периоде коронарного шунтирования и тем самым повысить качество лечения. 9 Внедрение результатов работы Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения анестезиологии и реанимации ФГБУ НИИ Комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН и в учебный процесс кафедры патологической физиологии Кемеровской государственной медицинской академии и научно-образовательного центра «Молекулярной и клинической медицины при сердечно-сосудистой патологии» при отделе экспериментальной и клинической кардиологии ФГБУ НИИ КПССЗ СО РАМН. Основные положения, выносимые на защиту 1. Повреждение тканей сердечного компартмента кардиохирургической операции, выполняемой в при проведении условиях искусственного кровообращения является триггерным для последующего развития системного воспалительного ответа. Ведущими патогенетическими факторами являются окислительный стресс с повреждением мембран клеток, механическое, ишемическое и реперфузионное повреждение миокарда с цитолизом и выходом аларминов. 2. Ключевым фактором патогенеза системного воспалительного ответа, развивающегося после кардиохирургической операции, выполненной в условиях искусственного активность кровообращения, клеток является измененная моноцитарно-макрофагальной системы, функциональная проявляющаяся перераспределением общего пула и фенотипа циркулирующих моноцитов и колебанием сывороточных концентраций протеолитических ферментов. Повышается миграционная способность всех трех субпопуляций моноцитов, о чем свидетельствует увеличение плотности селектиновых рецепторов CD62L при одновременном снижении плотности рецепторов межклеточной адгезии CD54. При формировании системного воспалительного ответа характерно развитие дисфункции эндотелия, о чем свидетельствует снижение значений sL-селектина, sE-селектина и увеличение – sP-селектина; снижение - sICAM-1 и увеличение 10 sVCAM-1; повышение концентраций фактора Виллебранда, эндотелина и снижение моноцитарного белка хемотаксиса MCP-1. Развитие системного воспалительного ответа характеризуется снижением сывороточных матричных металлопротеиназ (proMMP-1 и MMP-3), повышением – MMP-9, прокатепсина В и TIMP-2, а также снижении естественного антагониста катепсинов – цистатина С. 3. Сердечный компартмент играет ключевую роль в развитии дисбаланса цитокинов, являющегося важным патогенетическим звеном формирования системного воспалительного ответа. Цитозольная фракция кардиомиоцитов, с содержащимися в ней аларминами, является триггером продукции цитокинов (ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8, ФНО α) моноцитами – основными участниками системного воспалительного ответа. Степень достоверности результатов проведенных исследований О достоверности результатов свидетельствует достаточная больных (165 пациентов), широкий спектр проведенных выборка лабораторных исследований, неоднократно повторенные модельные эксперименты in vitro. Автор непосредственно участвовал в получении исходных данных. Апробация работы Основные положения Всероссийской диссертации научно-практической доложены конференции и обсуждены на «Облитерирующие заболевания сосудов: проблемы и перспективы», Кемерово, 2009; Всероссийской научно-практической кардиологического конференции, центра посвященной «Актуальные 20-летию проблемы Кузбасского сердечно-сосудистой патологии», Кемерово, 2010; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2010; XVI Всероссийском Съезде сердечно-сосудистых хирургов, Москва, 2010; XII Всероссийской конференции «Технологии жизнеобеспечения при критических 11 состояниях», Москва, 2010; XIII Всероссийской конференции «Жизнеобеспечение при критических состояниях», Москва, 2011; IV съезде кардиологов Сибирского Федерального округа «Сердечно-сосудистые заболевания: от первичной профилактики до высоких технологий в повседневной практике», Кемерово 2011; Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук», Тюмень, 2011; Российском национальном конгрессе кардиологов, Москва, 2011; IX межрегиональной научно-практической конференции «Современные аспекты анестезиологии и интенсивной терапии», Новосибирск, 2012; Всероссийской научно-практической диагностики и конференции биотехнологии», «Актуальные Кемерово, проблемы 2012; V лабораторной объединенном иммунологическом форуме, Нижний Новгород, 2013. Публикации По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ, в том числе 17 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук; 2 в зарубежной печати, 1 монография и 1 патент РФ на изобретение. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 268 страницах машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Текст иллюстрирован 32 таблицами, 20 рисунками. Список литературы включает 369 источников, из них 307 зарубежных авторов. Личный вклад автора Анализ литературных данных по теме диссертации, организация выполнения исследования, проведение лабораторных работ по определению 12 концентраций растворимых маркеров методом иммуноферментного анализа и поверхностных клеточных маркеров методом проточной цитофлуориметрии, систематизация и анализ полученных результатов, их статистическая обработка, написание научных статей и диссертации выполнено лично автором. Лабораторные и экспериментальные исследования in vitro выполнены совместно с научным сотрудником лаборатории клеточных технологий НИИ КПССЗ СО РАМН Матвеевой В.Г. 13 ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Достижения кардиологии, кардиохирургии, анестезиологии и реаниматологии в последнее время значительно расширили спектр и сложность оперативных вмешательств, выполняемых пациентам с сердечно-сосудистой патологией. При этом повышается сложность самих операций, увеличивается их продолжительность, удлиняется время искусственного кровообращения (ИК) и пережатия аорты, расширяются показания к оперативному лечению, повышается уровень сложности курации пациентов [2]. В последнее время выполняется все большее количество операций по реваскуляризации миокарда в условиях искусственного кровообращения. Процедура проведения искусственного кровообращения включает в себя множество факторов, которые являются нефизиологичными и могут провоцировать запуск целого ряда патологических процессов, результатом которых может стать развитие системного воспаления [226]. К негативным факторам оперативных вмешательств с применением искусственного кровообращения можно отнести длительную ишемию и реперфузию жизненно важных органов, в первую очередь миокарда, контакт клеток крови с инородными поверхностями фильтров, трубок и т.д., механическое повреждение тканей, обусловленное оперативным вмешательством, применение большого количества токсичных препаратов для проведения длительного анестезиологического пособия, гипотермия, выброс эндотоксинов [4; 11; 18; 48; 154; 345]. В зависимости от происхождения системного воспалительного ответа после кардиохирургических операций все причины были разделены на зависящие от биоматериала и независящие [296; 315]. При этом подразумевается, что биоматериал зависимые связаны с составом синтетических материалов, из которых состоит контур искусственного кровообращения (таблица 1). 14 Таблица 1 Факторы, запускающие системный воспалительный ответ после кардиохирургических операций (по Shahzad G Raja, 2005) Группы факторов Непосредственный триггер Биоматериал зависимые факторы Тип экстракорпорального контура Тип оксигенатора и насоса Биоматериал независимые факторы 1. Факторы экстракорпоральной Состав первичного раствора перфузии Кардиоплегия Пульсирующий или непульсирующий тип перфузии Температура во время процедуры ИК 2. Предоперационный факторы Связанные с основным заболеванием (например, левожелудочковая недостаточность или диабет) 3. Факторы периоперационной Низкий сердечный выброс гемодинамики Висцеральная гипоперфузия 4. Анестезиологическая техника Торакальная эпидуральная анестезия Анестетики и фарм. препараты Функция легких во время ИК 5. Хирургические факторы Разрез и доступ Продолжительность Кардиотомия и инициация ИК 6. Общий стресс 7. Трансфузии 8. Послеоперационные факторы Заместительная почечная терапия Искусственная вентиляция легких 15 Все эти факторы могут оказывать дополнительное негативное влияние на функционирование иммунной системы. На этом фоне возможно возникновение осложнений не только инфекционного, но и неинфекционного генеза. К последним можно отнести развитие системного воспалительного ответа, который может приводить к развитию полиорганной недостаточности [138]. Ранний послеоперационный период у пациентов, оперированных на открытом сердце в условиях искусственного кровообращения, сопровождается системным воспалительным ответом (СВО), который в 5-16% случаев осложняется полиорганной недостаточностью (СПОН) с высокой летальностью (по данным EACTA 2007) [23; 50; 68; 269; 333]. При этом сама процедура искусственного кровообращения рассматривается как модель управляемой ишемии и реперфузии, в которой, безусловно, есть место кардиопротекции, а в ряде случаев и прекондиционированию, однако имеют место и повреждения тканей и органов. В последнее десятилетие достигнуты значительные успехи в понимании патофизиологических изменений в организме во время критических состояний. Продолжает формироваться представление о СВО, уточняются и дополняются критерии его оценки, изучаются особенности течения этого процесса при различных состояниях и заболеваниях [59]. Успех оперативного вмешательства на сердце в условиях ИК нередко зависит от предупреждения и своевременного интенсивного лечения осложнений СВО, возникающих в послеоперационном периоде. Поэтому у этой категории пациентов представляет большой интерес изучение характера развития и особенностей оценки СВО, а так же способов прогнозирования его осложнений. В настоящее время не вызывает большого сомнения сам факт развития системного воспаления неинфекционной природы после множественных травм, больших полостных хирургических операций, в том числе выполненных в условиях искусственного кровообращения, инсультов и т.д. Однако отношение к этому процессу неоднозначное. С одной стороны, системный воспалительный ответ – это реакция организма на воздействие высокой силы (как правило, 16 местное, но с дистантными эффектами) и в таком случае эту реакцию можно считать нормальной, физиологичной. С другой стороны, в ряде случаев СВО рассматривается как патологическая реакция в случаях, когда организм не может локализовать местное повреждение, что приводит к генерализации процесса, повреждении внутренних органов, развитию полиорганной недостаточности. В связи с этим различно отношение врачей и исследователей различных специальностей к СВО. Для анестезиологов-реаниматологов, хирургов, неврологов, травматологов и т.д. системный воспалительный ответ является патологической процессом, нуждающимся в незамедлительной коррекции. В понимании клинических иммунологов, патофизиологов СВО – естественная реакция организма на триггерный фактор, в случае отсутствия дополнительных осложнений (органных дисфункций и недостаточности) не нуждающийся в коррекции [29]. Во многом противоречия эти связаны с отсутствием четкого представления о патогенезе СВО неинфекционной этиологии. Развитие системных воспалительных реакций у пациентов с сепсисом давно находится в фокусе интереса очень большого числа исследователей разных специальностей. Однако понимание неинфекционного СВО и его осложненных форм еще только формируется [16]. Отсутствие четкого и однозначного представления о патогенезе СВО предопределяет трудности в его диагностике, определении критериев, позволяющих определять его наступление. В настоящее время используется критерии диагностики по Bone, принятые на заседании Согласительной комиссии Американского колледжа пульмонологов и Общества Критической медицины [93; 138], при котором основанием для диагностики СВО является наличие двух или более представленных клинико-диагностических критериев: температура тела более 38°С или менее 36°С; частота сердечных сокращений более 90 уд/мин; частота дыхания более 20 в минуту; уровень лейкоцитов крови более 12*109/л или менее 4*109/л; содержание молодых форм гранулоцитов более 10%. 17 Критерии диагностики были приняты в 1992 году и до сих пор остаются неизменными, однако очевидно, постановка диагноза на основании этих критериев представляет трудности. Кроме того, эти критерии были описаны при диагностике сепсиса, а не «асептического» СВО. При этом критерии диагностики последнего и возможная стадийность процесса до сих пор не определены. Недостатком предлагаемого способа диагностики СВО применительно к пациентам после полостных оперативных вмешательств, в том числе выполненных в условиях искусственного кровообращения является то, что у кардиохирургических пациентов тахикардия и тахипноэ в большинстве клинических ситуаций не являются диагностически значимыми в виду проводимой противоаритмической терапии и продленной искусственной вентиляции легких. На температуру тела в значительной степени влияет применение анальгетиков, обладающих жаропонижающим эффектом. После проведенной операции со значительным повреждением тканей и органов лейкоцитоз со сдвигом формулы влево является естественной реакцией, а не проявлением осложненного СВО. При этом само определение системного воспаления может отличаться. Так, Bone RC считает, что термин «системный воспалительный ответ» следует использовать при определении сепсиса либо клинических проявлений этого воспаления, сопровождающих такие заболевания и состояния как инфекция, панкреатит, ишемия, множественная травма, геморрагический шок [138]. Таким образом, в определении СВО (равно как и в критериях его диагностики) основоплагающей является клиническая картина, сопровождающая воспаление. В отличие от подхода Bone RC, с точки зрения иммунологов и патофизиологов, системное воспаление - типовой мультисиндромный, фазоспецифичный патологический процесс, развивающийся при системном повреждении и характеризующийся тотальной воспалительной реактивностью эндотелиоцитов, плазменных и клеточных факторов крови, соединительной ткани, а на заключительных этапах и микроциркуляторными расстройствами в жизненно важных органах и тканях [6; 59]. 18 Важно отметить сложные взаимоотношения системного воспаления, инфекции и полиорганной недостаточности. СВО может быть ассоциировано с большим количеством патологических состояний, таких как травма, ожоги, панкретит, ишемия, геморрагический шок и т.д. Кроме того, провоцировать системное воспаление может назначение препаратов, обладающих высокой медиаторной активностью, таких как фактор некроза опухоли и других цитокинов. Возможными осложнениями могут быть острый респираторный дистресс-синдром, шок, почечная недостаточность, полиорганная недостаточность [19; 28; 138]. Схематически эти взаимоотношения представлены на рисунке 1. Рисунок 1 Схема взаимоотношений СВО, СПОН и сепсис При этом системный воспалительный ответ нельзя рассматривать как синоним сепсиса или даже просто инфекционного процесса. Если для генерализованной инфекции, к которой относится и сепсис, системная воспалительная реакция является обязательным и непременным атрибутом, то локализованная процесс может протекать и без явлений системного воспаления. 19 Кроме того, существует масса примеров запуска СВО без инфекционного компонента (рисунок 2). В частности к таким ситуациям может относиться управляемая ишемия и реперфузия, сопровождающая проведение операции по реваскуляризации миокарда, когда кроме ишемии/реперфузии существует большое количество триггеров, к которым относятся механическое повреждение тканей с выходом большого количества аларминов, повреждение клеток вследствие развившегося окислительного стресса, контакт иммунокомпетентных клеток с большим количеством чужеродных материалов (трубок системы ИК, фильтров, оксигенаторов фармацевтических и т.д.), препаратов для использование проведения большого наркоза, количества кардиоплегии, поддержания функции жизненно важных органов. Рисунок 2 − Схема взаимоотношения СВО, сепсиса и инфекции (по Bone RC, 1992) Патогенетически определяют два основных варианта развития СВО: «продавливание» характерный для и «прорыв» сепсиса [59]. и Вариант некоторых «продавливание», постепенно наиболее развивающихся травматических процессов. В этом сценарии переход от классического 20 воспаления к системному происходит постепенно, факторы альтерации преодолевают на системном уровне барьеры антивоспалительной резистентности в течение нескольких суток. Вариант «прорыва», характерный для наиболее критичных травматических повреждений, молниеносного сепсиса, анафилактического шока, гемотрансфузионного шока, краш-синдрома, отравления биологическими ядами и эмболии околоплодными водами, проходит с молниеносным преодолением буферных систем противовоспалительной резистентности мощным повреждающим фактором. В этом случае этап предсистемного воспаления занимает несколько часов. При варианте «прорыв» очаг классического воспаления может отсутствовать либо его значение в развитии СВО несущественно. При этом для этих вариантов системного воспаления предполагается определенная последовательность фаз, которые могут завершаться либо выздоровлением, либо летальным исходом (рисунок 3). 1 фаза – фаза развития системного воспаления (маргинальная) соответствует понятию предсистемного воспаления. В этот период агенты системного повреждения преодолевают сопротивление факторов антивоспалительной резистентности. Длительность может составлять от 2 до 12 часов. 2 фаза – характеризуется первичного флогогенного гиперцитокинемией как удара (гиперэргическая) провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов. Фаза связана и с другими проявлениями генерализации внутренних механизмов. 3 фаза – депрессивная (гипоэргическая) - характеризуется относительно невысоким уровнем цитокинемии (про- и противовоспалительных цитокинов). Развитие оксидантного клинических и стресса менее клинико-лабораторных выражено. признаков Возможно появление микроциркуляторных расстройств, включая шок, полиорганную дисфункцию, те или иные признаки ДВС-синдрома (дессеминированного внутрисосудистого свертывания). В чистом 21 виде фаза встречается не часто, и проявляется в виде смешанных, «стертых» форм и межфазовых переходов. 4 фаза – вторичного флогогенного удара – характеризуется повторным развитием гиперэргической фазы и связана с действием факторов вторичного системного повреждения. Эта фаза может быть связана с высокой вероятностью развития критических осложнений. 5 фаза – разрешения – характеризуется умеренной гиперцитокинемией. Органные дисфункции и повреждения как правило не наблюдаются. Фаза может длиться до нескольких недель. По клиническим проявлениям может напоминать фазу развития системного воспаления. Предполагается, что при благоприятном течении пятая фаза может наступать сразу после первой и второй, миную третью и четвертую [59]. сплошные стрелки – наиболее вероятные направления развития СВО, пунктирные – менее вероятные Рисунок 3 Фазы развития системного воспаления (Черешнев В.А., Гусев Е.Ю, 2012) В настоящее время широкое распространение получает представление об участии различных компартментов в инициации и поддержании СВО. Воспаление 22 является типовым патологическим процессом, однако события, связанные с ним, в различных органах имеют отличия. Дисбаланс цитокинов в системном кровотоке, развивающийся при системном воспалительном ответе, является отражением сложной сети разнонаправленных регулирующих сигналов, модулируемых специфическими клетками микроокружения и различающихся в зависимости от компартмента [67; 106; 120] (рисунок 4). Рисунок 4 − Порочный круг развития системного воспаления и его распространение из одного компартмента в другой (Jean-Marc Cavaillon, Djillali Annane, 2006) Исходя из этого представления ткани сердца, подвергаемые ишемии и реперфузии во время оперативного вмешательства могут являться активными участниками воспаления. При этом ткани могут являться источником биологически активных веществ, инициирующих и поддерживающих системное воспаление за счет дистантного действия и вовлечения в процесс отдаленных органов. При этом триггером местного «стерильного» воспаления является ишемия/реперфузия, окислительный стресс, апоптотическое, некротическое, механическое повреждение тканей. 23 Одним из важных компонентов системного воспалительного ответа является активность гуморального иммунитета, проявляющаяся выбросом провоспалительных белков и дисбалансом цитокинов. При этом продуцентами цитокинов являются не только клетки иммунной системы, но и клетки других органов и тканей (эндотелиоциты, кардиомиоциты, макрофаги, гепатоциты и т.д.) [164]. Известна теория, что системный воспалительный ответ неинфекционного генеза может развиваться в ответ на повреждение тканей и реализовываться при участии инфламмасом [158]. Инфламмасомы представляют собой особый белковый комплекс, локализующийся в макрофагах и нейтрофилах, который приводит к запуску воспалительной реакции после контакта с паттернами микроорганизмов либо с эндогенными молекулами, образующимися при повреждении - DAMP (danger-associated molecular patterns) или аларминами, способными связываться с TOLL-подобными или с NOD-подобными рецепторами. Отдельно либо содружественно с PAMP (pathogen-associated molecular patterns) запускать врожденный иммунитет после ишемического и реперфузионного повреждения миокарда могут и алармины [43]. Алармины выделяются при гибели клеток, активируют клетки врожденной иммунной системы, а также запускают адаптивный иммунный ответ. В конечном итоге алармины восстанавливают гомеостаз за счет стимулирования восстановления тканей, поврежденных в результате травмы либо воспаления. В качестве аларминов могут выступать HMGB1, S100s, кристаллы мочевой кислоты, ИЛ 1 и т.д. [90]. Алармины, выделяясь из некротизированных или просто поврежденных клеток, запускают реакции местного и системного воспаления. Алармины, входя в состав инфламмасом стимулируют выход провоспалительных цитокинов, в первую очередь интерлейкина 1β [293]. Одним из наиболее значимых аларминов считается HMGB1 (high mobility group protein B1), который может выступать как активный провоспалительный цитокин сам по себе, а также способен стимулировать продукцию 24 провоспалительных цитокинов и хемокинов. В культуре моноцитов человека рекомбинантный HMGB1 вызывает выделение ФНО α, ИЛ 1α, ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8, MIP 1α, MIP 1β в количестве, эквивалентном септическим состояниям [174]. Таким образом, повреждение кардиомиоцитов в результате ишемии и реперфузии приводит к выходу во внеклеточное пространство значительного количества аларминов, которые могут стимулировать продукцию цитокинов. Сама по себе ишемия и последующая реперфузия могут приводить к гибели клеток, как путем некроза, так и путем апоптоза. Апоптоз и некроз считаются одними из основных составляющих гомеостаза [220]. Некроз возникает вторично, в ответ на внешние неблагоприятные факторы, приводящие к повреждению цитоплазматической мембраны. В результате клетка теряет способность сохранять ионный гомеостаз, происходит ее набухание, активируется лизис и разрывается цитоплазматическая мембрана. Содержимое цитоплазмы, включая лизосомальные ферменты, попадает в окружающие ткани, что является причиной воспалительной реакции, сосудистой пролиферации, инфильтрации тканей макрофагами, активации фибробластов, и, в конечном итоге, – формировании рубца [260; 318]. Существовавшее мнение, что некроз является единственной формой гибели кардиомиоцитов при ишемии миокарда в последнее время пересмотрено. Установлено, что апоптоз предшествует некрозу и является основным видом смерти кардиомиоцитов. Вскоре после ишемии апоптозу подвержены более 80%, а некрозу менее чем 20% клеток ишемизированной зоны (188). Поскольку апоптоз в отличие от некроза является энергозависимым процессом, клеточные стимулы и повреждения клеточных структур, ведущие к апоптозу, не могут быть чрезмерно сильными. Если же повреждения клетки значительны, процесс ее гибели становиться неуправляемым и представляет собой уже некроз. Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий, гибель клетки может пойти либо по апоптотическому, либо по некротическому пути [30]. А, следовательно, и инициация процессов воспаления (выхода аларминов) будет различной. 25 Апоптоз – это программируемая форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматических мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду, характеризуется отсутствием воспалительной реакции соседних клеток и формирования иммунного ответа. Смерть клеток через апоптоз происходит посредством активации каскада каспаз (caspase - cystein aspartic acid-specific protease). Известно более 10 представителей этого семейства внутриклеточных протеаз [263]. Инициирующие каспазы (каспазы-8, -9, -10, -12) принимают апоптотический сигнал и активируют эффекторные каспазы (каспазы-3, -6, -7, -14). Предполагается, что запуск инициирующих каспаз может иметь обратимый характер, в то время как запущенный каскад эффекторных каспаз делает гибель клетки неизбежной [61]. Известно три пути активации каспаз. Первый: внешний путь запускается через поверхностные клеточные рецепторы смерти, опосредованно через адаптерные протеины активирующие прокаспазу-8. Второй: внутренний путь связан с выходом из межмембранного пространства митохондрий биоактивных веществ одним из которых является цитохром С, который, соединяясь с фактором активации протеаз Apaf-1, (apoptosis protease-activating factor) и декстроаденозинтрифосфатом (дАТФ) активирует прокаспазу 9 [98; 132]. Каспаза-3 является узловым звеном внешнего и внутреннего пути апоптоза. Третий путь связан с локализованной в эндоплазматическом ретикулуме прокаспазой-12, которая активируется при избыточном накоплении внутриклеточного кальция и накоплении избыточного количества белка в эндоплазматическом рутикулуме [102] Существует мнение что, апоптоз кардиомиоцитов при глобальной ишемии запускается по митохондриальному пути [311] Большинство исследований показывают, что цитохром С высвобождается из митохондрий уже спустя 30-60 минут ишемии миокарда [94]. В то время как внешний путь активации апоптоза приобретает значение после реперфузии миокарда и не может быть индуцирован 26 одной гипоксией [161]. Однако существует мнение, что ишемия является достаточным триггером для запуска активации каспаз как по внутреннему так и по внешнему пути [69]. В пролонгированный период ишемии происходит увеличение количества некротических клеток [297; 365], тогда как апоптоз возрастает в ишемизированном миокарде в процессе реперфузии [108; 202; 307; 340]. Апоптоз кардиомиоцитов гипоперфузии обнаруживается между преимущественно центральной в пограничной ишемизированной областью зоне и неишемизированной сердечной тканью [71]. Он может быть инициирован либо через внутренний механизм, вызванный гипоксией и оксидативным стрессом, или внешним механизмом, связанным с гуморальными факторами [101; 256; 310]. При проведении кардиохирургических операций в ответ на выраженную гипоксическую агрессию, обусловленную применением ИК, формируется состояние окислительного стресса (ОС) [9; 34]. Основными повреждающими факторами, определяющими развитие ОС, являются гипоксия (ишемия), воспалительная и стрессорная реакция [22; 35; 36; 47]. Антиоксидантный потенциал больных ИБС часто оказывается недостаточным для компенсации развивающихся нарушений [24]. Антиоксидантная система играет ключевую роль в защите сердца от ишемического повреждения (супероксиддисмутаза, гемоксигеназа, каталаза, глютатионпероксидаза, глютатионредуктаза). Одной из причин оксидативного стресса может быть снижение эффективности этой системы. При ишемииреперфузии происходит торможение активности антиоксидантной системы, снижение уровня токоферола, запускается перекисное окисление липидов [248]. Таким образом, в миокарде отмечается резкий дефицит антиоксидантов, что служит пусковым моментом в запуске ОС. Восстановление коронарного кровотока (реперфузия) приводит к активному поступлению кислорода и глюкозы в клетки, вызывая резкую интенсификацию процессов свободнорадикального окисления и/или снижение резерва антиоксидантной защиты, результатом чего будет значительное накопление 27 активных форм кислорода (АФК) [49]. В свою очередь АФК, в частности Н2О2, индуцируют появление однонитевых разрывов ДНК, которые усиливают экспрессию главного проапоптотического белка р53, приводя к апоптотической гибели клеток [55]. Кроме того, активные формы кислорода обуславливают запуск программы апоптоза по митохондриальному пути с высвобождением растворимых межмембранных белков. Среди них имеется ряд ключевых апоптогенных факторов: цитохром С, прокаспазы-2, -3 и -9, белок AIF и эндонуклеаза G [5; 64]. Наряду с активными формами кислорода, существенную роль в патологических процессах, развивающихся при ишемии и последующей реперфузии миокарда, играют активные формы азота и их метаболиты. Окись азота (NO) – внутренняя регуляторная молекула, включенная в ряд физиологических процессов, как, например, регулирование тонуса сосудов и пролиферацию гладкомышечных клеток. NO синтезируется во всех типах клеток, в том числе эндотелиальных [264] и кардиомиоцитах [189; 265], из L-аргинина с помощью трех изоформ NO-синтаз (NOS). Две изоформы (eNOS и nNOS) постоянно экспрессируются и строго регулируются кальцием-кальмодулином и фосфорилированием, в то время как третья форма (iNOS) индуцируется в процессе воспаления и производит высокие уровни NO в течение более длительного периода [127]. В условиях ишемии происходит перегрузка клеток ионизированным кальцием. Этот процесс опосредован через нарушение проводимости кальциевых каналов, либо через эндоплазматического высвобождение ретикулума в ионизированного цитозоль. Повышение кальция в из цитоплазме ионизированного кальция приводит к пермеабилизации мембраны митохондрий и запуску апоптоза по митохондриальному пути [243]. Ионы кальция участвуют в развитии апоптоза путем прямой активации Са2+, Mg2+-зависимой эндонуклеазы и последующей межнуклеосомной деградации ДНК. В клетках миокарда кальций обеспечивает активность кальцинейрина и кальпаина, приводящих к разрушению цитоскелета и образованию апоптозных телец [168]. 28 В последнее время было установлено, что лизосомы наравне с клеточным ядром и митохондрией играют важную роль в апоптотической гибели клеток. Ряд факторов (активные формы кислорода, гипоксия, перегрузка клеток кальцием, цитокины, перерастяжение кардиомиоцитов) прямо или косвенно стимулируют пермеабилизацию лизосомальных мембран и высвобождение в цитозоль катепсинов – цистеиновых лизосомальных протеиназ [14]. В цитозоле катепсины могут запускать клеточную смерть различными путями [155], включая активацию каспаз, высвобождение проапоптотических факторов из митохондрий, а так же расщепление антиапоптотических белков семейства Всl 2, и Вid [131]. Катепсины являются непосредственными исполнителями апоптоза, в основе которого лежит протеолиз, обусловленный цистеиновыми протеазами типа каспаз, катепсинов, гранзима, калпаина [112; 222]. В частности катепсин D является основным посредником между стимулами апоптоза и белком p53, факторами некроза опухолей и интерфероном γ. Лизосомальная дезинтеграция с выходом катепсина D в цитозоль и митохондриальная – с выходом цитохрома С – считаются начальными стадиями апоптоза [262]. Способность макрофагов выделять эластолитические протеолитические протеазы предполагает, что гладкомышечные клетки могут использовать катепсины для миграции через артериальную стенку. Адгезия и миграция моноцитов, их превращение в макрофаги играют важную роль в патогенезе воспаления, в том числе возникающего в поврежденных тканях. Эти клетки могут использовать внеклеточные цистеиновые протеазы в качестве вспомогательных инструментов миграции. В экспериментах in vitro на гладкомышечных, эндотелиальных клетках и макрофагах показано, что провоспалительные цитокины интерлейкин 1β, фактор некроза опухоли α и интерферон γ стимулируют экспрессию и продукцию катепсинов S и К [159]. В то же время из указанных цитокинов только TNF α обладает угнетающим экспрессию и секрецию эффектом в отношении цистатина 29 С – естественного ингибитора катепсинов, и при этом только на эндотелиальные клетки [130]. Известно, что недостаток катепсина S приводит к снижению количества макрофагов, Т-клеток, и понижению уровня интерферона γ [137]. Кроме того, кроме непосредственного участия катепсинов в процессе воспаления, возможно их косвенное участие через снижение экспрессии трансформирующего фактора роста (TGF β) [354]. Дефицит катепсина К может снижать активность воспаления за счет повышения активности TGF β [167]. Эффект катепсинов уравновешивается цистатином С, который уменьшает воспаление в атеросклеротической бляшке [130]. Дефицит цистатина С способствует прогрессированию атеросклеротического процесса либо за счет увеличения размера бляшки, либо за счет увеличения эластолитической активности и деградации экстрацеллюлярного матрикса. В соответствии с этой гипотезой у людей в области атеросклеротического поражения имеется пониженный уровень цистатина С – естественного ингибитора катепсинов, тогда как неизмененные артерии экспрессируют большее его количество, особенно в гладкомышечных и эндотелиальных клетках [130]. Такая обратная регуляция протеаз и их ингибиторов менее выражена в случае матриксных металлопротеиназ (ММР) и их тканевых ингибиторов (TIMP). Так, в атеросклеротических бляшках у человека экспрессия TIMP изменена незначительно, либо повышается в той же степени, что и в неизменных сосудах [149; 160; 234]. В экспериментальных моделях на ApoE-дефицитных мышах в атеросклеротической бляшке регистрируется повышение TIMP-1, в то время как экспрессия катепсинов и их ингибиторов сохраняет взаимно обратную направленность [146]. В литературе приводится небольшое количество данных о взаимоотношении матриксных металлопротеиназ и катепсинов. Так, известно, что макрофаги синтезируют ММР-7, ММР-9 и катепсины B, L, S. При этом только катепсины выявляются в межклеточном пространстве. Ингибирование катепсинов L и S (но не ММР) полностью блокировало макрофагальную эластолитическую 30 активность. Таким образом, доказывается роль катепсинов как наиболее мощных макрофагальных эластаз [298]. Больше данных приводится по взаимодействию металлопротеиназ и катепсинов в отношении остеогенеза. При изучении процессов ремоделирования костной ткани установлено, что дефицит катепсина К компенсируется активностью ММР. В то же время есть данные об эффектах ММР в атеросклеротической бляшке. Так, указывается на протективную роль ММР-3 и ММР-9, стимулирующую роль ММР-12 и отсутствие эффекта – ММР-7 [148]. Кроме атеросклеротического процесса [57; 85] изучается участие матриксных металлопротеиназ в ремоделировании нормальных тканей, в том числе после оперативных вмешательств. В то же время есть указания на то, что активность ММР может провоцироваться ишемией и реперфузией и может ассоциироваться с рядом осложнений послеоперационного периода [124]. Матриксные металлопротеиназы вовлечены в процесс иммунного ответа на патоген, но также они могут участвовать в неконтролируемом повреждении тканей. Известно, что при сепсисе достоверно повышается уровень proMMP-1 и MMP-1, при этом повышенный уровень коррелирует со смертностью. В экспериментальных исследованиях установлено, что при сепсисе MMP-1 активно синтезируется эндотелиальными клетками. Блокирование MMP-1 приводит к уменьшению повреждения эндотелиального барьера, дессиминированного внутрисосудистого свертывания, проницаемости сосудов легких и цитокинового шторма при сепсисе. Все эти эффекты в эксперименте приводили к снижению летальности [63]. Воздействие ММР-1 и ММР-3 на макрофаги приводит к быстрому высвобождению ФНО α, который был заблокирован ингибиторами матриксных металлопротеиназ. Синтез и выброс ММР-9 макрофагами зависит от ФНО α и простагландинов. Потенциальная возможность ММР-1 и ММР-3 регулировать секрецию макрофагами простагландинов и ММР-9 указывает на их важную роль в патогенезе воспаления [235]. Кроме того, ММР-9 участвует в слущивании ICAM-1 с поверхности клеток [236]. 31 Интересно участие матриксной металлопротеиназы 9 в развитии воспаления при церебральной ишемии. При этом одним из основных триггеров восплительного процесса считается выход аларминов, в первую очередь HMGB-1, в межклеточное пространство из поврежденных клеток. Установлено, что HMGB1 вызывает активацию выброса ММР-9, причем происходит это через рецепторы TLR-4 [176]. На увеличение уровня экспрессии TLR4, но кардиомиоцитов, при различных патологических состояниях, а также на вовлечение этого механизма в процессы воспаления и ремоделирования после ишемии и реперфузии указывает целый ряд авторов [165; 195;351]. Кроме того, в экспериментах in vitro было установлено, что ММР-9 ответственна за стимуляцию выброса провоспалительных медиаторов, а также за индукцию апоптоза эндотелиальных клеток [109]. Сывороточный уровень ММР-9 коррелировал с соотношением ММР9/TIMP-1 в CD 14+ моноцитах, определяемом по уровню мРНК. Этот фактор подчеркивал значимость активности металлопротеиназ, как в циркулирующих моноцитах, так и в макрофагах в составе атеросклеротической бляшки. Таким образом подтверждается значение металлопротеиназ как в патогенезе атеросклероза как системного заболевания, так и в патогенезе системного воспаленеия [303]. В последнее время определено ведущее значение иммунной системы в формировании системного воспалительного ответа. Гиперпродукция провоспалительных цитокинов, оксидантный стресс, протеазнный взрыв – важные патогенетические составляющие фазы первичного флогогенного удара системного воспаления [59]. В этих процессах ключевую роль играет врожденная иммунная система [6; 17; 32]. Системой врожденного иммунитета распознаются высококонсервативные чужеродные молекулярные структуры, паттерны называемые (образы)) PAMPs через (патоген-ассоциированные специфические, наследственно закодированные рецепторы PRRs (паттерн-распознающие рецепторы). 32 Среди сигнальных PRRs центральное место занимают чрезвычайно чувствительные Toll-like рецепторы (TLR), которые управляют целым рядом эффекторных функций (хемотаксис, фагоцитоз, респираторный взрыв, дегрануляция нейтрофилов, синтез эффекторных и регуляторных молекул), а так же регулируют адаптивный иммунный ответ. В литературе последних лет предлагается выделять среди PAMPs ассоциированные с повреждением молекулярные паттерны (DAMPs) [111; 113]. TLRs способны обнаруживать PAMP. Имеется специфичность TLRs и их лигандов. Например, лигандами для TLR4 являются липополисахариды (LPS), кроме того, этот рецептор может быть активирован кристаллами мочевой кислоты [350], HMGB-1 [175; 363], кальций связывающим протеином A8 [252], сывороточным амилоидом A [213; 324]. Белки теплового шока 60 (Hsp 60) и Hsp 70 являются лигандами для TLR2, TLR4 и CD14 [172; 224] и т.д. В экспериментальных работах было убедительно показано участие TLR4 в ремоделировании миокарда после инфаркта. Кроме того, этот механизм рассматривается как возможная терапевтическая мишень в терапии инфаркта миокарда. В частности, использование липополисахарида с целью прекондиционирования позволяло уменьшить размер инфаркта [352]. Окисленные фосфолипиды, являясь побочным продуктом внутриклеточного окислительного взрыва, ингибируют активацию TLR и блокирует воспалительные реакции [254]. Таким образом, становится все более очевидной высокая значимость рецепторов врожденного иммунитета, а именно TOLL-подобных рецепторов, не только в противоинфекционном иммунитете, но и в реализации воспаления (местного и системного) при состояниях, ассоциированных с ишемией, реперфузией, окислительным стрессом. Общим конечным итогом активации рецепторов является высвобождение фактор транскрипции NF-κB, его миграция в ядро клетки и стимуляция транскрипции воспалительных многих провоспалительных регуляторных субстанций, генов, включая кодирующих синтез провоспалительные цитокины: ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 12, ИЛ 18, ИЛ 23, ФНО α, хемокины и другие 33 компоненты врожденного иммунитета. Моноциты и макрофаги, являясь основными носителями TLR и продуцентами цитокинов, вносят серьезный вклад в формирование гиперцитокинемии - важного патогенетического звена СВО [6; 37]. Фактически DAMP являются провоспалительными медиаторами в значительной степени активируемыми в условиях клеточного стресса и повреждения, которые в свою очередь в конечном итоге могут приводить к клеточной гибели [316]. Этими стимулами могут являться стерильные агенты продукты метаболизма собственных клеток, например кристаллы холестерина при атеросклерозе [266], или экзогенные токсины, например при асбестозе [205] (рисунок 5). Рисунок 5 - Участие клеток врожденного иммунитета в реализации «стерильного» воспаления (Shane E. Russell and Patrick T. Walsh, 2012 с добавлениями) 34 Таким образом, DAMP имеют решающее значение для инициации «стерильного» воспаления. При этом процесс ассоциируется с повышенной экспрессией эффекторных цитокинов, которая связана с адаптивной реакцией Тклеток. Быстрая реакция клеток выбросом цитокинов в ответ на воздействие указывает на их высокую значимость в патогенезе неинфекционного воспаления. Цитокины оказывают не только локальное действие, характеризующееся активацией комплекса сосудистых и тканевых изменений в зоне воспаления, но, попадая в кровоток, вызывают развитие системных реакций [99]. Системная воспалительная реакция носит, с одной стороны, компенсаторно- приспособительный характер, с другой стороны, при чрезмерной выраженности этих процессов развивается комплекс реакций повреждения и дезадаптации. Важным участником активации ранних воспалительных реакций и СВО признан триггерный рецептор, экспрессированный на миелоидных клетках-1 (TREM-1) Он [357]. впервые описан как активирующий рецептор воспалительного ответа в 2000 году группой швейцарских ученых A. Bouchon, J. Dietrich и Colonna M. J. Отличительная особенность TREM-1, делающая его привлекательным для изучения в аспекте СВО, связана с его способностью к активации всех эффекторных функции врожденного иммунитета и многократному усилению продукции цитокинов при совместной стимуляции с главными рецепторами врожденного иммунитета (Toll-подобные рецепторы и Nod-подобные рецепторы) [358]. До недавнего времени TREM-1 считался маркером сепсиса и инфекционного СВО. Умеренное повышение мембранной и растворимой формы TREM-1 (sTREM-1) наблюдается во время инфекций, вызванных бактериями, вирусами и грибами [119; 129], а значительное увеличение – при сепсисе и септическом шоке [357]. Однако за последние несколько лет появились научные исследования, указывающие на связь TREM-1 с СВО неинфекционного генеза [331; 343; 359]. Растворимая форма sTREM-1 высвобождается c поверхности клеток путем шеддинга (слущивания) мембранной формы матриксными металлопротеиназами 35 и может быть количественно определена в биологических жидкостях [241]. sTREM-1 является естественным рецептором-ловушкой, который, конкурируя за лиганд с мембранной формой TREM-1, снижает его активацию [66]. Связывание TREM-1 с лигандом вызывает сильную и немедленную активацию всех эффекторных механизмов, приводя к выраженной дегрануляции и респираторному взрыву нейтрофилов, умеренной стимуляции фагоцитоза [360], повышению продукции провоспалительных цитокинов, хемокинов и ингибированию синтеза ИЛ 10 [65]. В патогенезе системного воспалительного ответа важно участие эндокринной системы, особенно в отношении взаимной регуляции с иммунной системой. Патогенез иммунного ответа при хирургических вмешательствах и при травме можно рассматривать следующим образом: нарушения в клеточном иммунитете начинаются с повышения экспрессии Th2 клеток. Активация гипаталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем с выходом большого количества кортизола и катехоламинов, по-видимому, приводит к нарушению баланса Th1/Th2 клеток. Предполагается, что ключевую роль в регуляции иммунных нарушений играет снижение экспрессии и сигналинга интерлейкина 12 и повышение экспрессии T-регуляторных клеток (Treg). Кроме того, цитокины, продуцируемые Th2 повышают экспрессию аргиназы 1 в миелойдных супрессорных клетках, приводя, тем самым, к дефициту аргинина, что в дальнейшем снижает функциональную активность лимфоцитов [232]. Вместе с тем, не смотря на значительные достижения в изучении патогенеза системного воспалительного ответа как инфекционной, так и неинфекционной этиологии по-прежнему остается актуальной проблема диагностики этого состояния. Становиться очевидным, что признаки, предложенные Bone RC, не всегда пригодны для использования в клинической практике, слишком не специфичны, не позволяют определять фазу процесса и делать прогноз течения состояния. Необходима формулировка патогенетически обоснованного подхода к выбору лабораторных тестов диагностики СВО. Поскольку предполагается 36 важная роль иммунокомпетентных клеток, а также их функциональной активности в развитии системного воспаления, логичным представляется исследование клеточного звена иммунитета, а также PAMP и DAMP ассоциированных рецепторов на их поверхности. Септическое воспаление, в том числе системное является наиболее изученным как в отношении патогенеза, так и в плане лабораторной диагностики. В ряду послеоперационных осложнений септическое состояние, несмотря на постоянно совершенствуемые методы интенсивной терапии и антибиотикотерапии, занимает одно из ведущих мест среди причин смертности пациентов. Причины возникновения сепсиса до конца не изучены, вместе с тем, взаимосвязь данного состояния с эффективностью функционирования иммунной системы пациента не вызывает сомнения. Именно поэтому в клинической практике широко применяются методы и подходы, позволяющие оценить состояние защитных систем пациента в постоперационном периоде. К их числу относятся исследования абсолютного и относительного числа лимфоцитов, их основных субпопуляций [249] и доли апоптотических клеток [227], изучение функционального состояния фагоцитарного звена – циркулирующих моноцитов и нейтрофилов периферической крови [288], равно как и определения уровня про- и противовоспалительных цитокинов, С-реактивного белка и компонентов каскада комплемента в сыворотке крови [280]. Однако большую часть этих лабораторных тестов пока еще сложно назвать рутинными из-за длительного времени постановки, большой трудоемкости и высокой себестоимости, тем более в условиях клиники постановка всего спектра реакций в настоящее время не представляется возможным. Как уже отмечалось выше, при сепсисе имеет место нарушение основ функционирования как системы приобретенного иммунитета, основанной на лимфоцитах, так и реакций врожденного иммунитета, связанных с клетками моноцитарного и гранулоцитарного рядов. С этой точки зрения, выбор моноцитов периферической крови прогнозирования течения для оценки септического тяжести процесса состояния пациентов представляется и вполне 37 логичным и оправданным. Моноциты играют ведущую роль как в реализации реакций врожденного иммунитета (фагоцитоз, продукция активных форм кислорода и оксида азота NO, синтез и секреция различных медиаторов), так и в регуляции реакций приобретенного иммунитета (синтез иммунорегуляторных цитокинов, презентация антигена Т-лимфоцитам). При септическом состоянии наблюдается нарушение функционирования моноцитов, что характеризуется снижением фагоцитарной активности [288], уменьшением уровня продукции интерлейкина 1 и фактора некроза опухоли α в ответ на стимуляцию in vitro и снижением уровня экспрессии на мембране клеток молекул главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR [177]. Исследование уровня экспрессии HLA-DR с использованием методов проточной цитометрии получило наиболее широкое распространение в клиниколабораторной практике. Это связано как с высокой скоростью получения статистически достоверных результатов при их относительно низкой себестоимостью для лаборатории, так и с высокой надежностью данного показателя для прогноза состояния пациента и возможности быстрой корректировки тактики ведения больного в условиях стационара. Так, снижение экспрессии HLA-DR на циркулирующих CD14+ моноцитах является отличительным признаком изменения иммунного статуса у пациентов после таких стрессовых воздействий как травма, тяжелые операции, геморрагический шок, панкреатит, и сепсис [145]. Вместе с тем, значение изменения уровня HLADR на поверхности моноцитов в прогнозе исходов кардиохирургических операций еще изучается [139]. Моноциты выполняют ряд важных функций в запуске, поддержании и контроле иммунного ответа (фагоцитоз, продукция активных форм кислорода, секреция цитокинов и хемокинов, презентация антигенов, регулирование адаптивного иммунного ответа). В настоящее время известно, что моноциты неоднородная популяция. По выраженности экспрессии корецептора липополисахарида CD14 и низкоафинного рецептора Fcγ CD16 выделяют две субпопуляции моноцитов (CD14+CD16– и СD14+CD16+) [75; 369], по мнению 38 других исследователей, оправдано разделение на три (CD14hiCD16–, CD14hiCD16+, CD14dimCD16+) [163; 173; 180; 320]. Несмотря на эти разногласия, все авторы сходятся во мнении, что субпопуляции отличаются по функциональной активности, спектру цитокинов, продуцируемых при активации, набору и выраженности экспрессии рецепторов на поверхности клеток, что обуславливает выполнение различных функций в организме [75; 163; 173; 180; 320]. Особый интерес вызывает субпопуляция CD14dimCD16+, которая проявляет проатеросклеротическую активность и способствует прогрессированию ИБС [180; 320]. Благодаря различиям в экспрессии на поверхности хемокиновых рецепторов и рецепторов адгезии CD14dimCD16+ клетки обладают повышенной тропностью к эндотелию и миграционной активностью. Минорная субпопуляция CD14+CD16+ вовлечена в процессы связанные с системной воспалительной реакцией. Показано ее значительное увеличение у пациентов с сепсисом, ревматоидным артритом, СПИДом, атеросклерозом [369]. Клетки с фенотипом CD14+CD16+ активно продуцируют провоспалительные цитокины (ФНО α, ИЛ 1β, ИЛ 6), но имеют сниженную фагоцитарную активность, способность к респираторному взрыву и синтезу хемокинов в отличие от моноцитов CD14+CD16– [180]. Таким образом, именно моноцитарное звено клеточного иммунитета может быть наиболее эффективным и простым в использовании инструментом в диагностике системного воспалительного ответа. Однако, немаловажно значение гуморальных факторов. К сожалению, традиционные маркеры классического воспаления (так же как и лабораторные критерии по Bone) недостаточно эффективны в оценке динамических изменений, определении фаз СВО и их дифференциальной диагностике. С-реактивный белок – давно исследуемый маркер, хорошо зарекомендовавший себя в диагностике хронических форм воспалительного процесса. Однако в оценке острых состояний он малоэффективен [225]. Аналогичная ситуация и по другим белкам воспаления: фибриноген, церрулоплазмин и т.д. 39 Цитокины – короткоживущие молекулы, обладающие местным, а также отдаленным дистантным действием на органы и ткани. И в комплексной оценке фаз системного воспаления, их дифференциальной диагностики и прогностического потенциала их роль несомненна и значима [59]. Равно как и целесообразным является изучение спектра диагностически значимых цитокинов и динамика изменения их сывороточного уровня. Диагностическая роль катепсинов и их ингибиторов также еще недостаточно изучена, хотя и предполагается их возможное использование с этой целью. Так, в сыворотке пациентов с аневризмой аорты отмечен пониженный уровень цистатина С [130], в то время как разницы с группой здоровых доноров в уровне катепсинов В и L выявлено не было [70]. Отмечен повышенный уровень катепсина L в сыворотке у пациентов с более чем 10% стенозом хотя бы одной коронарной артерии по сравнению с уровнем у пациентов без такового [103]. Уровень сывороточного катепсина S также был повышен у пациентов с атеросклеротическим стенозом хотя бы одной коронарной артерии [194]. Дальнейшие исследования показали, что катепсин S может выступать как фактор риска атеросклероза [104]. Описывается участие катепсинов и цистатина С в процессах рестеноза. Так, в экспериментальной модели каротидной баллонной пластики на крысах показано увеличение экспрессии мРНК и уровня катепсинов S и К, в то время как экспрессия мРНК и уровень цистатина С не увеличивались. Таким образом, показана роль катепсинов в констриктивном ремоделировании сосудов [192]. Повышенные уровни цистатина С ассоциировались с летальностью, сердечно-сосудистыми катастрофами и застойной сердечной недостаточностью среди амбулаторных пациентов с ишемической болезнью сердца во всех случаях, когда повышение уровня цистатина С не было обусловлено поражением почек [87]. Повышенный уровень ММР-9 может оказаться прогностически значимым в отношении развития рестенозов после чрескожных коронарных вмешательств у больных со стенокардией [27]. 40 Уровень TIMP-1 оказывается важным прогностическим маркером любых летальных исходов при хронической сердечной недостаточности [348] Ряд авторов полагает, что сывороточный уровень sTREM-1 и ФНО α может помогать в дифференцировке сепсиса и СВО. Кроме того, sTREM-1 может отражать тяжесть сепсиса и совместно с биохимическими маркерами выступать как фактор прогноза [144]. Таким образом, изучение патогенеза неинфекционного системного воспалительного ответа после проведения процедуры управляемой ишемии и реперфузии миокарда, сопровождающей кардиохирургические операции является актуальной, но недостаточно изученной (в отличие от более исследованного инфекционного воспаления) проблемой современной медицинской науки. Необходимо исследование условий и факторов перехода неосложненного системного воспаления в его осложненные формы. Неизученными остаются вопросы инициации СВО после проведения полостных операций с использованием искусственного кровообращения, причины разного течения системного воспаления и условия перехода в осложненные формы, в том числе сопряженные с полиорганной недостаточностью. Изучение механизмов реализации, в том числе вовлечение иммунной системы (клеточного звена и гуморальных факторов), эндокринной систем, факторов поддержания гомеостаза могут открыть новые алгоритмы диагностики и прогнозирования СВО неинфекционного генеза. На основании изучения патогенеза системного воспаления, сопровождающего кардиохирургические вмешательства целесообразна разработка лабораторных критериев диагностики, а, возможно, и профилактики и терапии. 41 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнялась в рамках проведения регистра коронарного шунтирования в 2010-2012 гг в НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН (свидетельство о государственной регистрации базы данных №201262 «Электронный архив пациентов, перенесших операцию аортокоронарного шунтирования»). Работа была одобрена локальным этическим комитетом. Все пациенты, включенные в исследование, подписывали информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения были общими: сочетанная патология коронарных сосудов и клапанов сердца, острая инфекция и обострение хронической инфекции, сопутствующие аутоиммунные заболевания, наличие злокачественных новообразований, хирургические осложнения в послеоперационном периоде. Исследование проводилось у пациентов с ишемической болезнью сердца, стенокардией II-III ФК, хронической сердечной недостаточностью (ХСН) I-IIА (функциональный класс по NYHА II-III), в возрасте от 50 до 70 лет. В исследование было включено 165 пациентов. Диагноз ИБС устанавливали согласно Национальным рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов по диагностике и лечению стабильной стенокардии. При оценке функционального класса стенокардии применяли Канадскую классификацию, для характеристики хронической сердечной недостаточности использовали классификацию Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA). Всем пациентам была выполнена операция коронарного шунтирования при стандартизированной холодовой кровяной кардиоплегии и непульсирующем режиме искусственного внутривенная, на основе кровообращения фентанила перфузионным индексом 2,5-2,7 и (ИК). Анестезия мидазолама. ИК – тотальная проводили с л/мин/м2, однотипным гипертоническим, 42 гиперонкотическим перфузатом, и одинаковым объемом заполнения (1100 мл) средним артериальным давлением 60-80 мм рт. ст. и содержанием гемоглобина в крови не менее 75 г/л, в нормотермическом режиме. Для защиты миокарда использовали кровяную, холодовую кардиоплегию (соотношение крови и раствора 4:1). Доставку охлаждённого (4-7оС) кардиоплегического раствора к миокарду, с интервалом 15-20 мин., выполняли антеградно. Время ИК составило 88 мин (75-105 мин.), время пережатия аорты 57 мин (48-61 мин.), количество шунтируемых артерий 2,55 (2-3). В зависимости от особенностей течения послеоперационного периода все пациенты были разделены на 2 группы: с неосложненным и с осложненным системным воспалительным ответом. Критерии разделения пациентов по группам с осложненным и неосложненным системным воспалительным ответом. Поскольку в настоящее время нет четких клинических критериев для определения системного воспалительного ответа и его осложненных форм, кроме критериев Bone RC, которые мало подходят для работы отделения интенсивной терапии кардиохирургической клиники, было предложено использовать классификацию острых нарушений функций органов и систем при синдроме полиорганной недостаточности [58]. В соответствии с этой классификацией критерии включения в группу с неосложненным течением послеоперационного периода определялись по состоянию функции основных органов и систем (таблица 2). Для включения пациента в группу с осложненным СВО требовалось наличие критериев соответствующих дисфункций двух и более систем органов. Для динамической оценки тяжести органной недостаточности до операции и в 1-е сутки после операции была использована шкала SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessments Score / Sequential Organ Failure Assessment) (таблица 3). Суммарная оценка по шкале SOFA складывается из оценок выраженности недостаточности различных систем (дыхательной, сердечно-сосудистой, нервной, коагуляционной, функции печени, почек) [364]. 43 Таблица 2 Критерии включения пациентов по варианту течения системного воспалительного ответа (по Чаленко В.В., 1998) Система Неосложненный СВО Удовлетворительная функция: все показатели функции сердца в пределах нормы. Отсутствие Оценка функции потребности в сердца кардиотропной поддержке. Удовлетворительная функция: гемодинамика стабильная. Клинических Оценка функции признаков нарушений сосудистой периферической системы микроциркуляции нет (симптом белого пятна при надавливании менее 30 с). Функция дыхательной системы Удовлетворительная функция: показатели функции дыхания и газового состава крови в пределах нормы. Удовлетворительная функция: размеры печени, Оценка функции нормальные, показатели печени билирубина, ACT и АЛТ, отношение АСТ/АЛТ равно 1,0—1,3. Удовлетворительная функция: показатели минутного (почасового, суточного) диуреза, Функция почек электролитов, мочевины, креатинина крови, клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции в пределах нормы. Осложненный СВО Компенсированная недостаточность: пульс 40—60 уд/мин без клинических признаков острой недостаточности кровообра-щения; систолическое давление 80—100 мм рт. ст.; наличие любой аритмии без недостаточности кровообращения; на ЭКГ «диффузные мышечные изменения», сегменте ST на изолинии; нормальные показатели на фоне кардиотропной поддержки. Компенсированная недостаточность: систолическое АД более 80 мм рт. ст., умеренные признаки нарушений микроциркуляции: бледность (без анемии) кожных покровов, мраморность, умеренный цианоз/акроцианоз, умеренная пастозность нижних конечностей и/или отлогих мест. Компенсированная недостаточность: основные показатели газового состава крови в пределах нормы или не достигают границ, требующих ИВЛ, в том числе при ингаляции О2 через носовой катетер или маску. Компенсированная недостаточность: увеличение размеров печени (более чем на 2 см), билирубин 50—100 ммоль/л, АЛТ 1—5 ммоль/(ч.л), АСТ/АЛТ 0,5— 1,0. Компенсированная недостаточ-ность: лабораторные и функциональные показатели почек на фоне диуретической терапии в пределах нормы или не превышают следующие пределы; диурез не менее 500 мл/сут; мочевина не более 15 ммоль/л; креатин не более 0,300 ммоль/л; К+ не более 4,5 ммоль/л. 44 Окончание таблицы 2 Система Неосложненный СВО Удовлетворительная функция: показатели амилазы и глюкозы крови и мочи в пределах нормы. Осложненный СВО Компенсированная недостаточность: признаки острого панкреатита при Функция нормальных показателях амилазы крови поджелудочной и мочи. Наличие внутрисекреторной железы недостаточности, компенсируемой диетой, приемом антидиабетических препаратов или инсулином. Удовлетворительная Компенсированная недостаточность: Оценка острых функция: отсутствие наличие диареи с частотой стула до 4 нарушений каких-либо заболеваний, раз в сутки без водно-электролитных функции травм, операций на нарушений. желудочноорганах желудочнокишечного кишечного тракта и тракта проявлений их последствий. Удовлетворительная Компенсированная недостаточность: функция: гемодинамика систолическое АД поддерживается не Оценка функции стабильная. ниже 90 мм рт. ст. (при восполненном надпочечников ОЦК) инфузией глюкокортикоидных гормонов. Удовлетворительная Компенсированная недостаточность: Оценка функций функция: больной беспокойство, торможение или центральной контактен, адекватен, возбуждение с сохранением алло- и нервной алло- и аутопсихическая аутопсихической ориентации. Критика системы ориентация не нарушены, сохранена. критика сохранена. Не смотря на признанную неэффективность после проведения операций аортокоронарного шунтирования, проводилась оценка состояния здоровья пациента и вероятность неблагоприятного исхода по шкале APACHE II (Acute Phisiology And Chronic Health Evaluation) [80]. Прогнозирование риска развития осложнений и леатальности в послеоперационном периоде проводилось с использованием шкалы POSSUM (Physiological and Operative Severity Score for the enUmeration of Mortality) [97]. Оценка физического состояния пациента проводилась по классификации американской ассоциации анестезиологов - American Association of Anaesthetists (ASA) [78]. 45 Таблица 3 – Характеристика пациентов с системным воспалительным ответом Критерий Неосложненный СВО Осложненный (n=98) СВО(n=67) 0 баллов 1-3 балла 0-5 баллов 6-11 баллов 5 баллов, 10 баллов, риск летальности 1,2% риск летальности 4,9% 0-2 2 - + - + SOFA APACHE II POSSUM Кол-во критериев СВО по Bone RC Положительны жидкостный баланс Потребность в норадреналине Возраст пациентов в группе с неосложненным течением СВО (n=98) составил 59 (55;64) лет, соотношение мужчин и женщин было 3,3:1. В группе с осложненным СВО (n=67) возраст - 60 (55;65) лет, а соотношение мужчин:женщин – 2,4:1. Оценка уровня гуморальных маркеров. Стандартизовано кровь забиралась у пациентов из периферического системного кровотока до операции, на утро первых суток после вмешательства (18-20 часов), на седьмые сутки после операции. Кровь забиралась в сухие пробирки, подвергалась центрифугированию 15 минут при 1500 об/мин. Полученная сыворотка аликвотировалась и замораживалась при -70ºС. Исследование уровня основных сывороточных маркеров выполняли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с регистрацией полученных результатов на полуавтоматическом спектрофотометре «Униплан» (Россия) в соответствии с инструкциями производителя тест-систем (таблица 4). 46 Таблица 4 – Исследования, проведенные с использованием иммуноферментного анализа Название ИФА набора sCD 14 Прокальцитонин ИМА Кортизол vWF Эндотелин sICAM-1 L-selectin MCP-1 proCathepsin B Катепсин К Цистатин С ИЛ 1RA ИЛ 1β ИЛ 6 ИЛ 10 ИЛ 12 Р40/70 ФНО α ИФН γ sTREM-1 C-реактивный белок proMMP-1 MMP-3 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2 БСЖК тропонин I Иммуноглобулин А Иммуноглобулин М Иммуноглобулин G Фирма-изготовитель Hycult biotechnology RayBio Uscnk Алкор Био AD Diagnostics Biomerica eBioscience (Bender MedSуstems) eBioscience (Bender MedSуstems) eBioscience (Bender MedSуstems) R&D Systems Biomerica Biovendor eBioscience (Bender MedSуstems) eBioscience (Bender MedSуstems) eBioscience (Bender MedSуstems) eBioscience (Bender MedSуstems) Invitrogen eBioscience (Bender MedSуstems) eBioscience (Bender MedSуstems) R&D Diagnostics Bender MedSуstems R&D Diagnostics Invitrogen R&D Diagnostics eBioscience (Bender MedSуstems) R&D Diagnostics Hycult biotechnology Biomerica Serazym Serazym Serazym 47 Оценка выраженности окислительного стресса. В сыворотке крови определяли содержание первичных, вторичных и конечных продуктов липопероксидации: сопряженных триенов (СТ) [51]; малонового диальдегида (МДА) [52] и оснований Шиффа (ОШ) [51]. Состояние антиоксидантной системы оценивали по уровню суммарной антиоксидантной активности (АОА) сыворотки крови больных [44] и содержанию основного антиоксиданта сыворотки крови – αтокоферола [338]. Биохимические повреждения сердечная исследования. миокарда: фракция Сывороточный креатинфосфокиназы МВ (КФК-МВ), (КФК), уровень маркеров креатинфосфокиназы аспартатаминотрансферазы (АсТ), аланинаминотрансферазы (АлТ) проводили на автоматическом биохимическом анализаторе «Konelab» наборами фирмы «Termo scientific» CK, CK-MB, AST/GOT, ALT/GPT). Проточная лазерная цитометрия. Оценку состояния клеточного иммунитета выполняли с определением поверхностных клеточных маркеров. Для этого забор крови осуществляли в вакуумные пробирки с добавлением K3ЭДТА до операции, на первые и на седьмые сутки после таковой. Исследования выполнялись в день забора крови. Общий анализ крови с подсчетом количества лейкоцитов и лимфоцитов проводился на автоматическом гематологическом анализаторе MEK 6400 Nihon Kohden (Япония). Для исследования клеточного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови, в том числе популяций моноцитов были использованы моноклональные антитела, конъюгированные флюоресцирующими красителями и наборы для четырехцветного анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови Multi TEST (Becton Dickenson, США). Работа с системой Multi TEST проводилась в соответствии с рекомендациями производителя. В результате проводился подсчет абсолютного и относительного количества T- и Влимфоцитов, NK-клеток (Natural killers), иммунорегулятрного индекса (ИРИ) – соотношения CD4/CD8 клеток. Сбор и анализ полученных результатов 48 выполнялся с использованием программного обеспечения SimulSET Software 2000 (Becton Dickinson, USA). Анализ образцов периферической крови проводили в соответствие с инструкцией производителя. Вкратце, 100 мкл венозной крови было окрашено добавлением 20 мкл соответствующих моноклональных антител, несущих флуорисцирующую метку. Все процедуры выполнялись в соответствии с рекомендациями изготовителя реактивов - Becton Dickinson. В качестве изотипического контроля использовался аналогичный объем антител того же производителя. Клетки инкубировали с антителами при температуре 4°С в течение 30 минут. После этого для лизирования эритроцитов в каждую пробирку добавляли лизирующий рабочий буфер (BD FACS lysing solution, BD Bioscience), который получали путем десятикратного разведения FACS lysing solution. Объем составил 2 мл на пробу. После 10 минутной инкубации клетки отмывали (300g, 5 мин при 4°С) избытком забуференного фосфатами физиологического раствора. Полученный осадок ресуспендировали и фиксировали в 0,5 мл BD CellFIX. Цитофлуориметрический анализ проводили на проточном цитометре FACS Calibur BD в программе CellQuestPro с использованием единых настроек прибора для всех образцов. Для каждого из образцов проводили анализ не менее 3000 моноцитов. Для исключения дебриса, порог устанавливали по FS и CD45PC5. Популяцию моноцитов выделяли по CD14 в комбинации с боковым светорассеянием (SSC). По уровню экспрессии рецепторов CD14 и CD16, моноциты были разделены на три субпопуляции – CD14hiCD16–, CD14hiCD16+ и CD14dimCD16+. Использовали соответствующий изотипический контроль. Последовательность гейтирования субпопуляций моноцитов представлена на рисунке 6. Субпопуляцию CD14hi и CD14low разделяли по интенсивности флюоресценции CD14. Оценку плотности рецепторов на поверхности клеток проводили при помощи однопараметрических гистограмм по геометрической средней интенсивности флуоресценции клеток (geo. mean). 49 Б В А. Разделение клеток по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию. Б. Выделение популяции моноцитов по CD 45. В. Выделение моноцитов по CD 14. Г. Разделение моноцитов на субпопуляции по CD 14 и CD 16. Рисунок 6 – Последовательность гейтирования субпопуляций моноцитов Г 49 А 50 Мультиплексный анализ. Исследование уровня цитокинов в малом объеме проводилось одновременно во всех образцах после их размораживания методом мультиплексного анализа на проточном лазерном цитометре Beckton Dickinson (США). Использованы наборы BD Cytometric Bead Array (СВА) Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (BD Bioscience USA) для определения уровня цитокинов в биологических жидкостях. Этот метод применялся при оценке уровня цитокинов в надосадочной жидкости при проведении культуральных работ и при оценке вклада сердечного компартмента при исследовании крови коронарного синуса и периферического кровотока в процессе проведения операции с управляемой ишемией и реперфузией. Проведение мультиплексного анализа (рисунок 7): 1. Приготовление стандартов цитокинов. В соответствии с инструкцией изготовителя смешивали стандарт (Human cytokine Standards) с разводящим раствором (Assay diluent) для достижения целевых разведений (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256). 2. Подготовка бус с адсорбированными антителами к цитокинам. Смешивали вместе равные объемы взвеси бус одинакового размера, но различной интенсивностью флюоресценции в зависимости от вида адсорбированных на их поверхности антител к цитокинам (Human cytokine capture beads). Ресуспендировали бусы в эквивалентном объеме усиливающего буфера (serum enhancement buffer) для сыворотки. Инкубировали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 30 мин. 3. Окрашивание цитокинов в пробах. В пробирки вносили по 50 мкл подготовленных бус и исследуемой сыворотки либо стандартов. Во все пробирки добавляли 50 мкл реагента для детекции (Human PE detection reagent) и инкубировали 3 часа при комнатной температуре в защищенном от света месте. После инкубации пробы однократно отмывали промывочным буфером (Wash buffer) с последующим центрифугированием 5 минут при 200g. Супернатант осторожно аспирировали и вносили 300 мкл промывочного буфера для дальнейшего исследования на проточном цитометре. 51 А Б В через 25 минут после реперфузии. R2 – интерлейкин 2 R3– интерлейкин 4 R4– интерлейкин 6 R5– интерлейкин 10 R6– фактор некроза опухоли α R7– интерферон Рисунок 7 – Уровень цитокинов в коронарном синусе в процессе оперативного вмешательства 51 А. Уровень цитокинов на начало кардиоплегии; Б. Уровень цитокинов до реперфузии; В. Уровень цитокинов 52 4. Прибор был откалиброван и настроен в соответствии с инструкцией производителей. 5. Проведено исследование проб и стандартов на цитометре с использованием одних и тех же настроек для всех образцов. 6. Выполнено построение калибровочных графиков на каждый исследуемый цитокин по концентрациям и соответствующим им средним интенсивностям флюоресценции MIF (mean intensity of fluorescence). 7. Проведен расчет концентраций исследуемых цитокинов в сыворотке крови с использованием калибровочных графиков. Проведение экспериментов in vitro. Получение гомогената ушка передсердия и цитозольной фракции кардиомиоцитов. Резекция ушка левого предсердия была выполнена по медицинским показаниям и являлась необходимым и неотъемлемым этапом оперативного вмешательства. Полученный биоптат сразу помещали в жидкий азот и в дальнейшем хранили при – 140оC. Гомогенат клеток готовили в асептических условиях при помощи механического растирания биоптата ткани ушка левого предсердия в гомогенизаторе Потера с добавлением стерильного PBS. Полученную взвесь центрифугировали при 4оC со скоростью 1000 об/мин в течение 15 мин, супернатант аликвотировали, замораживали и хранили при – 70оC. Для стандартизации результатов в данной работе использовался один и тот же супернатант, полученный из биоптата одного ушка предсердия. Непосредственно перед проведением эксперимента супернатант размораживали, доводили до нужной концентрации культуральной средой, фильтровали через стерильный мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм, таким образом, получая цитозольную фракцию поврежденных кардиомиоцитов человека (ЦФК). Для удобства восприятия использовались процентные выражения (в 1мл. 1% ЦФК содержится 61,5мкг ткани ушка предсердия; 2% ЦФК – 123мкг ткани предсердия/мл, соответственно в 5% – 307,5мкг ткани/мл). 53 Выделение моноцитов из периферической крови. Моноциты получали методом адгезии на пластике мононуклеаров периферической крови. Для этого выделенные на градиенте плотности (Ficoll Hypaque 1,077g/mL г/мл (Sigma-Aldrich)) клетки двукратно отмывали в фосфатносолевом буфере (PBS), переносили в пластиковый 24-луночный планшет и инкубировали 1 час в питательной среде (RPMI-1640 с добавлением Lглутамина, 2% FBS, антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), 1% HEPES) при 37о и 5% СО2. Далее, не прикрепившиеся к пластику лимфоциты удаляли, а прикрепившиеся к поверхности лунок клетки использовали для последующей культивации со стимуляторами. По результатам цитофлюориметрического анализа, процент CD14 позитивных клеток, прикрепившихся к поверхности пластика, составил 76-80%. Определение относительного количества погибших моноцитов методом проточной цитофлюориметрии с использованием пропидия йодида (PI). Изолированные моноциты инкубировали в питательной среде при 37оС и 5% СО2, а так же с добавлением стимуляторов: ЦФК и/или LPS. Через 6, 12 и 24 часов культивации клетки снимали с поверхности пластика трипсином, который после отделения клеток связывали фетальной бычьей сывороткой. Далее клетки отмывали избытком PBS и окрашивали пропидия йодидом. Определяли относительное количество PI-позитивных клеток среди всей популяции, которые расценивались, как погибшие некрозом или находящиеся в стадии позднего апоптоза. Исследование проводили на проточном лазерном цитометре FACSCalibur (Beckton Dickenson, США). Статистическую обработку результатов выполняли программы «Statistica 7.0». Сравнение групп с помощью проводили методом дисперсионного анализа (ANOVA). Проводилась оценка нормальности распределния групп по Гауссу. Результаты представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-75%). Значимость различий оценивали непараметрическим U-критерием Манна-Уитни и W-критерием Вилкоксона. 54 Корреляционный анализ проводился с использованием критерия Спирмана. Достоверность отличий признавалась значимой при p<0,05. Для многомерного анализа использовался метод дискриминантного анализа. Применялся пошаговый вариант анализа с оценкой количества шагов, уровня значимости p, F-критерия. Оценка уровня дискриминации оценивалась по уровню ламбда Уилкса. Определение значимости идентифицирующего критерия проводилось после построения диаграммы рассеяния канонических значений, расчета классификационного значения и квадрата расстояния Мехалонобиса. 55 ГЛАВА 3 ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ УПРАВЛЯЕМОЙ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ Апоптоз и некроз считаются одними из основных составляющих гомеостаза [220]. Некроз возникает вторично, в ответ на внешние неблагоприятные факторы, приводящие к повреждению цитоплазматической мембраны. В результате клетка теряет способность сохранять ионный гомеостаз, происходит ее набухание, активируется лизис и разрывается цитоплазматическая мембрана. Содержимое цитоплазмы, включая лизосомальные ферменты, попадает в окружающие ткани, что является причиной воспалительной реакции, сосудистой пролиферации, инфильтрации тканей макрофагами, активации фибробластов, и в конечном итоге – формировании рубца [260]. Существовавшее мнение, что некроз является единственной формой гибели кардиомиоцитов при ишемии миокарда пересмотрено. Установлено, что апоптоз предшествует некрозу и является основным видом смерти кардиомиоцитов. Вскоре после ишемии апоптозу подвержены более 80%, а некрозу менее чем 20% клеток ишемизированной зоны [188]. В зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий, гибель клетки может пойти либо по апоптотическому, либо по некротическому пути [25; 31]. При этом если исследования по распространенности апоптоза в результате ишемии и реперфузии на экспериментальных моделях проводятся достаточно давно, то изучение миокарда человека и происходящих в нем процессов, а также распространенность программированной клеточной гибели и механизмов ее реализации представляет несомненный интерес. Тем более что свое повреждающее действие ИК оказывает на патологически измененный основным заболеванием (ИБС, ревматизм, инфекционный эндокардит, хроническая сердечная недостаточность) орган. 56 Изучение апоптоза и факторов его регуляции у пациентов, проходящих оперативное лечение с применением искусственного кровообращения оказывается значимым для уточнения степени повреждения миокарда в процессе оперативного вмешательства, сопровождаемого ишемией и реперфузией миокарда, прогнозирования возможных послеоперационных осложнений. Значение рецепторного пути в запуске апоптоза кардиомиоцитов в настоящее время ставится под сомнение. Однако, повышение количества таких лигандов, ответственных за запуск программы клеточной гибели, как CD95L, CD40L, FAS/APO-1 после операций с применением ИК может оказаться напрямую связанным с повреждением миокарда, либо с нарушением функционирования иммунной системы через повышенный уровень гибели иммунокомпетентных клеток. При этом массивное повреждение кардиомиоцитов через апоптоз может приводить к развитию синдрома гибернирующего миокарда и сердечной недостаточности, а лимфоцитов – к неадекватной воспалительной реакции и развитию осложненного системного воспалительного ответа. Коронарный синус является общим коллектором венозной крови, оттекающей от миокарда. В таком случае маркеры, определенные в этом биологическом материале могут в полной мере отражать активность происходящих процессов. Несмотря на проводимую в процессе операции кардиоплегию и исключение сердца из системного кровотока в тканях остается минимальная перфузия, а кровь, забранная из коронарного синуса в процессе искусственного кровообращения, может служить для оценки активности процессов воспаления в тканях сердца. Синхронно с забором крови из коронарного синуса забиралась кровь и из системного кровотока в следующие 3 этапа оперативного вмешательства: 1точка - в начале кардиоплегии; 2точка - в момент восстановления кровотока, через 10-15 секунд после снятия зажима с аорты; 57 3 точка - через 1 минуту по окончании ИК, что соответствовало 25-30 минуте реперфузии. Для оценки степени повреждения миокарда в процессе операции с применением ИК выполняли исследование уровня следующих маркеров повреждения миокарда: креатинфосфокиназа (КФК), креатинфосфокиназа сердечная фракция МВ (КФК-МВ), аспартатаминотрансфераза (АсТ), аланинаминотрансферазы (АлТ). Методом иммуноферментного анализа определяли концентрацию сердечной фракции белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP, БСЖК). При динамической оценке уровня маркеров повреждения в крови коронарного синуса (таблица 5) в процессе ИК отмечался подъем уровня КФК и КФК-МВ по сравнению с началом кардиоплегии. Зарегистрировано повышение уровня КФК-МВ в крови коронарного синуса на 71% в начале реперфузии, и на 97% к моменту окончания ИК относительно исходных значений. В периферической крови обнаружено более позднее увеличение уровня этого маркера повреждения по сравнению с кровью из коронарного синуса. Статистически достоверный подъем уровня КФК-МВ в периферической крови отмечался только к моменту окончания ИК (в начале реперфузии- 33,00±2,62 Ед/л, на момент окончания ИК- 42,00±2,93 Ед/л). Неспецифический маркер повреждения мышечной ткани КФК в крови коронарного синуса и в периферическом кровотоке достоверно (p<0,05) повышался лишь к концу ИК. Через сутки после операции уровень КФК-МВ в периферической крови составил 49,13±3,84 Ед/л и не отличался от значений на момент окончания ИК. Очевидно, что определение уровня КФК в крови коронарного синуса не может быть использовано в качестве маркера повреждения миокарда в силу позднего повышения и низкой специфичности. Однако факт повышения уровня этого неспецифического маркера указывает на массивное, в том числе механическое, повреждение тканей. 58 Таблица 5 – Динамика концентрации маркеров повреждения в крови коронарного синуса и в периферическом кровотоке в процессе кардиоплегии Параметр Начало кардиоплегии Начало реперфузии Окончание ИК Периферия Синус Периферия Синус Периферия БСЖК, мг/л 4,70±0,82 3,54±0,74 22,89±4,10 * 8,54±1,21 * 22,32±2,56 * 14,72±2,10 *,** КФК, Ед/л 226,93±39,15 226,75±40,94 214,47±26,14 225,58±31,23 277,41 ±28,69 * 283,75 ±33,17 * КФК-МВ, Ед/л 22,13±1,55 28,42±5,20 37,94±2,43 * 33,00±2,62 43,67 ±2,62 *,** 42,00 ±2,93 *,** АсТ, Ед/л 35,94±3,11 39,33±6,19 29,28±2,68 27,67±2,64 32,44 ±1,70 30,08 ±2,31 АлТ, Ед/л 24,58±3,36 24,00±3,17 17,63±2,28 14,42±2,30 17,78 ±1,97 14,58 ±1,64 Примечания: * p<0,05 в сравнении с началом кардиоплегии ** p<0,5 в сравнении с началом перфузии 59 Синус 59 Статистически достоверного изменения уровня ферментов АсТ и АлТ отмечено не было. Во всех контрольных точках исследования, как в крови коронарного синуса, так и в периферическом кровотоке тропонин I оставался отрицательным. Хотя тропонин I и обладает высокой специфичностью, но характеризует лишь глубокие структурные повреждения миокарда. Таким образом, эти маркеры продемонстрировали свою низкую информативность для динамической оценки состояния миокарда в процессе ИК. Актуальным является подбор адекватных маркеров повреждения миокарда и распространенности апоптоза кардиомиоцитов, диагностически значимых уже при оперативном вмешательстве. В последнее время все большее внимание исследователей привлекает белок, связывающий жирные кислоты (БСЖК, fatty acid-binding protein - FABP) как биохимический маркер повреждения миокарда. Сердечная фракция белка (H-FABP, БСЖК) считается наиболее специфичной в плане оценки повреждения миокарда. Поскольку известно, что БСЖК является растворимой цитозольной молекулой, то его высвобождение в случае некроза происходит быстрее молекул, входящих в структуру клетки, а также внутриклеточных ферментов. В результате подъем таких маркеров как тропонины T и I, креатинфосфокиназы-МВ, аспартатаминотрансферазы оказывается очень поздним и происходит лишь через 4-6 часов после кардиодеструкции [366]. Проводились исследования по определению возможностей использования БСЖК в качестве раннего маркера миокардиального повреждения при инфаркте миокарда [46], оценки распространенности некроза и эффективности тромболитической терапии. Однако уровень сердечной фракции БСЖК может иметь и иное трактование. В частности, его увеличение может служить маркером кардиальной ишемии, а не только некроза [88]. В настоящее время диагностическая и прогностическая значимость изменения уровня БСЖК активно изучается [54], в том числе после операций с применением ИК [7]. 60 До начала кардиоплегии уровень H-FABP в коронарном синусе и в периферическом кровотоке не отличался (4,70±0,82 мг/л и 3,54±0,74 мг/л соответственно) (рисунок 8). Зарегистрировано пятикратное повышение HFABP в крови коронарного синуса (22,89±4,10 мг/л) сразу после снятия зажима с аорты, и сохранение стабильно высоких значений (22,32±2,56 мг/л) на 25-30 минуте реперфузии. 30 мг/л * * 25 Коронарный синус Периферическая кровь 20 * 15 * ** 10 5 0 Начало кардиоплегии До реперфузии 25 минут реперфузии * p<0,05 по сравнению с началом кардиоплегии ** p<0,05 по сравнению с началом реперфузии Рисунок 8 – Динамика уровня H-FABP в крови коронарного синуса и в периферическом кровотоке в процессе кардиоплегии. В то же время в периферическом кровотоке отмечалось постепенное увеличение H-FABP в процессе реперфузии. Сразу после восстановления кровотока концентрация соответствовала 8,54±1,21 мг/л, и продолжала достоверно (p<0,01) повышаться, достигая 14,72±2,10 мг/л к моменту окончания ИК. Кровь из миокарда оттекает непосредственно в коронарный синус без смешивания и разведения кровью других областей. Этим 61 объясняются более быстрое и выраженное повышение H-FABP в крови коронарного синуса по сравнению с периферическим кровотоком. В случае отсутствия патологических процессов в организме, H-FABP в плазме не определяется. Установлено, что в крови здоровых доноров уровень белка не должен превышать 5 мг/л [38; 88; 162]. Интересным представляется подход ряда исследователей, при котором умеренный подъем уровня H-FABP (6-20 мг/л) трактуется как проявление ишемии [276], а более выраженный (6-2000 мг/л) – как проявление некроза [95]. Механизм появления H-FABP в крови до конца не ясен. Известно, что в случае острого инфаркта миокарда он попадает в кровь из разрушенных кардиомиоцитов. В основе повышения его уровня при транзиторной ишемии, предположительно, лежит изменение свойств мембраны кардиомиоцитов, позволяющее этому низкомолекулярному белку (15 кДА) выходить из клеток [8]. Таким образом, пятикратное повышение H-FABP в крови коронарного синуса, наблюдаемое сразу после восстановления кровотока и на протяжении ИК, характеризует высокую чувствительность и скорость реагирования данного маркера в процессе кардиоплегии. Обнаружено менее значительное повышение КФК-МВ в крови коронарного синуса, с момента восстановления кровотока в миокарде, по сравнению с подъемом H-FABP. Изоформа MB-КФК — это цитозольно расположенный гетеродимер с молекулярной массой 86 кДа. Механизм его повышения во время реперфузии при проведении ИК, возможно, подобен механизму повышения H-FABP при ишемии. Учитывая больший размер молекулы, его высвобождение происходит менее активно. Подъем уровня H-FABP, особенно в раннем периоде, может быть объяснен ишемическими, а не некротическими процессами [276]. Наличие ишемии миокарда подтверждается повышением уровня лактата в коронарном синусе с 17,65 (13,35;25,10) мг/дл до начала кардиоплегии до 32,40 (22,00;48,40) мг/дл перед реперфузией и 30,20 (20,80;46,40) мг/дл после таковой. За время кардиоплегии, сопровождающей искусственное 62 кровообращение, развитие выраженного некроза миокарда невозможно, т.к. на это требуется больше времени. Косвенным подтверждением служит отсутствие повышения тропонина I - специфичного маркера некроза миокарда и отсутствие дальнейшего подъема уровня КФК-МВ в периферической крови через сутки после операции по сравнению с таковым на момент окончания ИК. Однако, очевидно, что, не смотря на проводимую кардиопротекцию в процессе кардиоплегии, имеет место ишемические изменения мембраны кардиомиоцитов, которые при усугублении процессов ишемии могут привести к апоптозу и некрозу. Для оценки возможного влияния ишемии и реперфузии на запуск процессов апоптоза в миокарде была проведена оценка в коронарном синусе уровня основных триггеров рецепторного пути: sAPO-1/Fas, sCD40 и sFasL, а также уровень внутриклеточного белка p53. Установлено, что как в случае неосложненного, так и в случае осложненного течения послеоперационного периода концентрации указанных маркеров не имели тенденции к изменению в процессе проводимого оперативного вмешательства (таблица 6). Уровень белка p53, позволяющий косвенно оценивать распространенность апоптоза, также не увеличивался в процессе ИК. Апоптоз представляет из себя стадийный, длительно текущий процесс, который не успевает реализоваться лишь в течении ограниченного времени оперативного вмешательства. В тоже время уровень лактата, который может характеризовать степень гипоксии миокарда во время кардиоплегии, увеличивался в процессе проведения искусственного кровообращения как у пациентов с неосложненным течением СВО, так и у пациентов с осложненным послеоперационным периодом. Гипоксия может оказывать триггерное влияние на клетки как в плане запуска программы апоптоза, так и в отношении некроза. При этом если исходно уровень лактата в группе с осложненным СВО был ниже такового у пациентов с неосложненным течением, то далее в процессе кардиоплегии отмечалась инверсия – значения в группе с осложнениями были достоверно сниженными. 63 Таблица 6 – Уровень маркеров, связанных с апоптозом в крови коронарного синуса на разных этапах операции Маркер Группа СВО Начало До реперфузии 25 минут кардиоплегии sAPO-1/F as, пг/мл sCD40, пг/мл Неосложненный Осложненный Неосложненный Осложненный реперфузии 128,10 121,90 124,35 (110,80;136,50) (110,30;127,10) (113,30;142,00) 123,50 126,70 121,10 (121,50;132,60) (116,40;131,80) (112,60;131,50) 23,29 (18,68;36,40) 24,92 (20,56;32,46) 22,37 (15,96;26,72) 22,08 (19,38;25,10) 25,64 (17,93;32,36) 21,20 (16,82;22,80) Неосложненный 0,509 (0;0,730) 0,368 (0;0,612) Осложненный 0,574 (0;0,822) 0,374 (0;0,618) 19,40 40,50 40,50 (15,60;27,10) (28,10;52,60)*** (28,80;54,70)*** 14,10 27,20 0,471 (0;0,592) p53, пг/мл Неосложненный Лактат, мг/дл Осложненный (12,30;16,30)* Неосложненный 0,91 (0,69;0,96) Ca2+, ммоль/л Осложненный 0,90 (0,84;0,95) 0,516 (0,414;0,668) 28,40 , (22,00;32,40)** *** (21,50;32,70)**, *** 0,78 (0,71;0,83) 0,97 (0,80;1,04) 0,84 (0,78;0,86) 0,93 (0,86;1,13) Примечания: * - p<0,01 отличия между группами ** p=0,05 отличия между группами *** p<0,05 по сравнению с исходными значениями 64 В то же время показатели кислотно-щелочного состояния (pH, pCO2, pO2, BE, SO2) не отличались в процессе проведения кардиоплегии в группах пациентов с осложненным и неосложненным СВО. Таким образом, умеренная гипоксия, без существенного смещения кислотно-щелочного равновесия, сама по себе не является пусковым фактором повреждения клеток миокарда и не провоцирует развитие осложненных форм СВО. Уровень ионизированного кальция – одного из основных триггеров митохондриального пути запуска апоптоза – в группах достоверно не отличался и в динамике проведения кардиоплегии имел лишь тенденцию к повышению во время реперфузии. Однако имел достоверную (p<0,05) сильную отрицательную корреляционную связь с уровнем sAPO-1/Fas во все точки проведения исследования (-0,76; -0,71; -0,63). Что еще раз подтверждает наличие разных путей реализации программ апоптоза при проведении управляемой ишемии и реперфузии: митохондриальный и рецепторный. Цитокиновый дисбаланс при ишемии и реперфузии: вклад сердечного компартмента. Воспаление является типовым патологическим процессом, однако события, связанные с ним, в различных органах имеют отличия. Дисбаланс цитокинов в системном кровотоке, развивающийся при системном воспалительном ответе, является отражением сложной сети разнонаправленных регулирующих сигналов, модулируемых специфическими клетками микроокружения и различающихся в зависимости от компартмента [106; 120]. Одним из важных компонентов системного воспалительного ответа является активность гуморального иммунитета, проявляющаяся выбросом провоспалительных белков и дисбалансом цитокинов. При этом продуцентами цитокинов являются не только клетки иммунной системы, но и клетки других органов и тканей (эндотелиоциты, кардиомиоциты, макрофаги, гепатоциты и т.д.) [164]. В то же время еще изучается вклад 65 различных органов и тканей в развитии дисбаланса цитокинов при патологических состояниях. В частности, требует дополнительного исследования вопрос цитокинпродуцирующей активности миокарда в процессе контролируемой защищенной ишемии и реперфузии, сопровождающей проведение искусственного кровообращения. Развитие системного воспалительного ответа является закономерной реакцией на операционный стресс. Лабораторным подтверждением служило увеличение уровня СРБ и ИЛ-6 в сыворотке крови (таблица 7). Значения СРБ с 2,68(1,50;4,37) мг/л возрастали до 45,86(41,75;49,05) мг/л на первые сутки после операции и до 33,91(22,60;40,62) мг/л на седьмые. При этом если повышение концентрации СРБ носило более выраженный характер и сохранялось на седьмые сутки после операции, то значения интерлейкина 6 (0,99(0,87;1,23) пг/мл) после значительного подъема в первые сутки (8,44(3,75;13.52) пг/мл) к седьмым возвращались (1,64(1,27;2,55) пг/мл) к исходному уровню. Изменения уровня как провоспалительных - (ФНО α, ИЛ 1β, ИФН γ) так и противовоспалительных (ИЛ 4, ИЛ 10) цитокинов в динамике отмечено не было. Таким образом, полученные данные позволяют выдвинуть тезис о том, что при диагностике состояния пациента в случае неосложненного течения послеоперационного периода коронарного шунтирования с применением искусственного кровообращения определение уровня ключевых цитокинов не дает адекватной информации о происходящих в организме процессах воспалительного генеза. Для изучения вклада тканей сердца в развитие дисбаланса цитокинов в системном кровотоке на фоне кардиоплегии в процессе проведения искусственного кровообращения был изучен уровень цитокинов в крови коронарного синуса до начала кардиоплегии, перед реперфузией на высоте ишемии и через 25 минут после реперфузии. Коронарный синус является общим коллектором венозной крови, оттекающей от миокарда. Маркеры, определенные в локальной коронарной крови, отражают активность 66 происходящих процессов в миокарде. Несмотря на проводимую в процессе операции кардиоплегию и исключение сердца из системного кровотока, в тканях сохраняется минимальная перфузия, а кровь, забранная из коронарного синуса в процессе искусственного кровообращения, может служить для оценки активности процессов метаболизма и воспалительной реакции миокарда [123; 259]. Таблица 7 – Уровень цитокинов и СРБ в сыворотке крови у пациентов после операции коронарного шунтирования Параметр До операции ФНО-α, пг/мл 0,15 0,14 (0,13;0,18) (0,12;0,19) 2,35 2,36 (2,28;2,53) (2,16;2,54) (2,22;2,73) 0,021 0,021 0,023 (0,020;0,022) (0,020;0,023) (0,021;0,024) 1,14 3,13 1,14 (0,95;2,31) (2,02;6,21) (0,94;1,95) 1,26 1,23 1,14 (1,07;1,45) (1,08;1,56) (1,00;1,31) 0,99 8,44 1,64 (0,87;1,23) (3,75;13,52)* (1,27;2,55)** 2,68 45,86 33,91 (1,50;4,37) (41,75;49,05)*,** (22,60;40,62)*,** ИФН-γ, пг/мл 2,41 ИЛ-10, пг/мл ИЛ-4, пг/мл ИЛ-6, пг/мл СРБ, мг/л Седьмые сутки 0,15 (0,10;0,19) ИЛ-1β, пг/мл Первые сутки Примечания: *р<0,05 по сравнению с дооперационным уровнем **р<0,05 по сравнению с предыдущим периодом Синхронно с забором крови из коронарного синуса забиралась кровь из системного кровотока с целью дальнейшего определения уровня цитокинов и 67 эффекта компартментализации медиаторов СВО по направлению «периферические ткани, миокард – системный кровоток». Дополнительно забор крови осуществляли из системного кровотока до операции, через час и пять часов после операции, к исходу первых, третьих и седьмых суток послеоперационного периода. Исследование уровня цитокинов проводилось одновременно во всех образцах после их размораживания методом мультиплексного анализа на проточном лазерном цитометре Becton Dickinson (США). Использованы наборы BD Cytometric Bead Array (СВА) Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (BD Bioscience USA) для определения уровня цитокинов в биологических жидкостях, адаптированные для проведения высокоточных измерений малых концентраций. Исходный дооперационный уровень ИЛ 6 составил 1,04 (0,65;2,20) пг/мл, ИЛ 10 – 0,98 (0,48;1,80) пг/мл. При этом соотношение ИЛ 6/ИЛ 10 было равно 1,36 (0,71;2,24) (таблица 8). Анализируя концентрации исследуемых цитокинов в системном кровотоке до операции и в начале кардиоплегии, следует отметить, что уровень ИЛ 10 (11,50 (6,85;17,50) пг/мл) достоверно (p<0,01) превышал таковой до вмешательства (0,98 (0,48;1,80) пг/мл). С другой стороны, уровень ИЛ 6 в системном кровотоке до операции не отличался от такового на начало кардиоплегии. Таким образом, продемонстрирована более ранняя реакция не провоспалительного цитокина (ИЛ 6), а противовоспалительного (ИЛ 10) (таблица 9). При этом в начале кардиоплегии уровень обоих цитокинов в коронарном синусе и в системном кровотоке не различался. В дальнейшем, на высоте ишемии, перед реперфузией зафиксирован значительный (в 15,2 раза по сравнению с исходным) подъем уровня ИЛ 10 (177,90 (126,80;207,60) пг/мл) в коронарном синусе. При этом после реперфузии уровень ИЛ 10 остается высоким и достигает значений 210,10 (166,30;396,80) пг/мл. 68 Динамика уровня ИЛ 6 в крови коронарного синуса менее выражена. На высоте ишемии отмечается 5,5-кратное увеличение по сравнению с исходным (6,00 (5,70;15,70) пг/мл). После реперфузии концентрация цитокина продолжается повышаться (10,60 (10,30;35,60) пг/мл) (p<0,05). В периферическом кровотоке уровень цитокинов имел те же тенденции, однако и на высоте ишемии и после реперфузии был более высоким, чем в коронарном синусе. Соотношение ИЛ 6/ ИЛ 10 за время оперативного вмешательства не имело отличий между таковым в коронарном синусе и в системном кровотоке. При этом соотношение было явно смещено в антивоспалительную сторону и на высоте ишемии и после реперфузии эта ситуация только усугублялась. Высокий уровень по ходу операции провоспалительного интерлейкина 6 отмечен как в коронарном синусе, так и в периферическом кровотоке. При этом в послеоперационном периоде (1 час после окончания операции) продолжается увеличение значений этого показателя в системном кровотоке. Антивоспалительный ИЛ 10 демонстрировал иные тенденции. Высокий уровень в процессе оперативного вмешательства снижался уже через час после окончания операции. В раннем послеоперационном периоде уровень исследуемых цитокинов достоверно менялся по сравнению с исходными значениями. Уже через час после окончания операции уровень интерлейкина 6 в периферической крови в 43,5 раза превышал дооперационный (таблица 9). Через 5 часов уровень цитокина уже снижался (p=0,01) и оставался на этом уровне к исходу первых суток после операции. При этом значения превосходили исходные более чем в 36 раз. Прогрессивное снижение уровня цитокина продолжалось на третьи и седьмые сутки. Однако даже к исходу недели концентрация ИЛ 6 в дооперационные значения (рисунок 9). сыворотке пациентов превышала 69 Таблица 8 – Уровень сывороточных цитокинов у пациентов в периоперационном периоде коронарного шунтирования с применением искусственного кровообращения Параметр ИЛ 6, пг/мл ИЛ 10, пг/мл ИЛ 6/ ИЛ 10 До операции 1 час 5 часов 1 сутки 3 сутки 7 сутки 1,04 (0,65;2,20) 45,24 30,78 36,00 12,10 5,47 0,98 (0,48;1,80) 1,36 (0,71;2,24) (11,50;13,85)*,** (4,25;8,19)*,** 29,33 4,25 2,35 1,10 1,08 (8,10;49,00)* (2,80;15,80)*,** (1,37;4,30)*,** (0,85;1,23)** (0,78;1,80) 2,44 7,70 11,13 10,45 5,55 (0,84;5,28) (4,24;11,77)*,** (7,51;28,34)*,** (8,05;16,29)* (3,36;8,89)*,** Примечания: * p<0,05 по сравнению с исходным уровнем ** p<0,05 по сравнению с предыдущей точкой исследования 69 (39,40;57,90)*,** (24,31;47,76)*,** (15,10;47,20)* 70 Таблица 9 – Уровень цитокинов в крови коронарного синуса на разных этапах искусственного кровообращения Параметр Начало кардиоплегии До реперфузии 25 минут реперфузии кровоток синус кровоток синус кровоток ИЛ 6, 1,10 1,05 6,00 10,75 10,60 22,65 пг/мл (0,60;1,20) (0,60;2,90) (5,70;15,70)* (4,60;25,12) (10,30;35,60)*,** (8,05;37,95) ИЛ 10, 11,70 11,50 177,90 228,20 210,10 272,10 пг/мл (3,60;13,70) (6,85;17,50) (126,80;207,60)* (176,10;492,70) (166,30;396,80)* (183,85;634,35) 0,06 0,08 0,03 0,03 0,04 0,04 (0,05;0,32) (0,06;0,28) (0,03;0,15)* (0,02;0,08) (0,04;0,18) (0,03;0,14) ИЛ 6/ ИЛ 10 Примечания: * p<0,05 по сравнению с началом кардиоплегии в синусе ** p<0,05 по сравнению с дореперфузионным уровнем в синусе 70 синус 71 300 пг/мл ИЛ 6 250 ИЛ 10 200 150 100 50 Н и 7 су тк и су тк су тк и 3 5 1 ча со в ча с 1 ач ал о До оп ер ац ии ка рд ио пл ег ии До ре пе 25 рф ми уз ии ну тр еп ер фу зи и 0 Рисунок 9 – Динамика уровня интерлейкинов 6 и 10 в системном кровотоке в периоперационном периоде коронарного шунтирования Динамика уровня интерлейкина 10 в послеоперационном периоде была несколько отличной. Максимальный подъем также был отмечен через час после окончания операции. При этом был зафиксирован 30-кратный прирост концентрации цитокина. Снижение уровня ИЛ 10 было стремительным: через 5 часов разница с дооперационным уровнем была 4-кратная, а к исходу первых суток – 2,4-кратная. На третьи сутки послеоперационного периода концентрация не отличалась от исходной. Те же значения сохранялись и к седьмым суткам. Для индивидуальной оценки баланса исследуемых цитокинов проведен анализ соотношения уровня ИЛ 6 и ИЛ 10. До операции соотношение ИЛ 6/ИЛ 10 составляло 1,36 (0,71;2,24). В течение первых суток послеоперационного периода значения этого параметра возрастали, достигая к исходу первых суток 11,13 (7,51;28,34). Отмечается явное превалирование провоспалительного ИЛ 6 над противовоспалительным ИЛ 10. Между 1-ми и 72 3-ми сутками нет достоверных различий коэффициента. Только к исходу недели (7 сутки) зафиксировано изменение баланса цитокинов с тенденцией возвращения к исходным значениям - 5,55 (3,36;8,89). Известна теория, что системный воспалительный ответ неинфекционного генеза может развиваться в ответ на повреждение тканей и реализовываться при участии инфламмасом [158]. Инфламмасомы представляют собой особый белковый комплекс, локализующийся в макрофагах и нейтрофилах, который приводит к запуску воспалительной реакции после контакта с паттернами микроорганизмов либо с эндогенными молекулами, образующимися при повреждении - DAMP (danger-associated molecular patterns) или аларминами, способными связываться с TOLLподобными или с NOD-подобными рецепторами. Отдельно либо содружественно с PAMP (pathogen-associated molecular patterns) запускать врожденный иммунитет после ишемического и реперфузионного повреждения миокарда могут и алармины [43]. Алармины выделяются при гибели клеток, активируют клетки врожденной иммунной системы, а также запускают адаптивный иммунный ответ. В конечном итоге алармины восстанавливают гомеостаз за счет стимулирования восстановления тканей, поврежденных в результате травмы либо воспаления. В качестве аларминов могут выступать HMGB1, белки S100, кристаллы мочевой кислоты, ИЛ 1 и т.д. [90]. Одним из наиболее значимых аларминов считается HMGB1 (high mobility group protein Box 1), который может выступать как активный провоспалительный цитокин сам по себе, а также способен стимулировать продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов. В культуре моноцитов человека рекомбинантный HMGB1 вызывает выделение ФНО α, ИЛ 1α, ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8, MIP 1α, MIP 1β в количестве, эквивалентном септическим состояниям [174]. Таким образом, повреждение кардиомиоцитов в результате ишемии и реперфузии приводит к выходу во 73 внеклеточное пространство значительного количества аларминов, которые могут стимулировать продукцию цитокинов. В нашем исследовании в ответ на ишемию и реперфузию миокарда зафиксирован высокий выброс тканями сердца интерлейкинов 6 и 10, в большей степени последнего. Важно отметить, что динамика уровня исследуемых цитокинов в коронарном синусе и в системном кровотоке не различалась. Увеличение уровня ИЛ 10 при повреждениях миокарда, связанных с ишемией-реперфузией, происходит преимущественно после реперфузии, но не ишемии. Имеются работы, показывающие регулирующее влияние ИЛ 10 на воспалительный ответ при ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда. В раннем реперфузионном периоде значительное повышение ИЛ 10 в циркулирующей крови снижает инфильтрацию ишемизированных тканей нейтрофилами и тромбоцитами, подавляет экспрессию ICAM-1 эндотелием. Так поддерживается проходимость сосудов сердца, поврежденных ишемией-реперфузией. Выработку ИЛ 10 стимулируют эндогенные и экзогенные факторы (LPS, TNFα, катехоламины, цАМФ), при этом в стресс-индуцированной продукции ключевую роль играют катехоламины. В синтезе ИЛ 10 могут участвовать различные клетки, однако основными источниками ИЛ 10 в раннем периоде ишемии-реперфузии миокарда считаются нейтрофилы, моноциты и макрофаги, а так же инфильтрирующие миокард лимфоциты [156; 341; 368]. Гиперпродукция ИЛ 10 способствует предотвращению развития избыточной воспалительной реакции и является мощным фактором тканевой репарации [164; 299]. Высокий уровень противовоспалительных цитокинов в периферической крови рассматривается как ограничительный фактор развития воспаления в других тканях и органах. Однако их высокий уровень в тканях не всегда может быть достаточным для предотвращения воспалительных реакций в органе [198]. 74 В экспериментах на лабораторных животных с моделированием ишемии-реперфузии и оценкой участия инфламмасом в реализации компенсаторных реакций было показано, что ишемизированные участки миокарда продуцируют повышенное количество ИЛ 6 по сравнению с неишемизированными. При этом аналогичной зависимости в отношении ИЛ 10 отмечено не было [106]. Повышенный выход ИЛ 6 можно объяснить реакцией на ишемию и предположить корреляцию этого показателя со степенью повреждения миокарда или с эффективностью кардиопротекции в процессе кардиоплегии. Однако объективных клинических и лабораторных данных в подтверждение этого предположения в нашем исследовании не было. Наоборот, ранний послеоперационный период пациентов протекал без осложнений, в том числе со стороны сердечно-сосудистой системы. Важной особенностью цитокинового баланса в начале оперативного стресса, является зафиксированная нами начальная реакция противовоспалительного ИЛ 10. Прежде чем в кровотоке повысится содержание провоспалительных цитокинов, первой защитной реакцией организма на оперативный стресс будет активация антивоспалительного звена. Далее в процессе оперативного вмешательства, как в системном кровотоке, так и в коронарном синусе сохраняется «антивоспалительное» соотношение цитокинов. Ранний послеоперационный период характеризуется смещением баланса в «провоспалительную» сторону. Это соотношение достигает своего максимума к исходу первых суток с последующим регрессом. Это соотносится с литературными данными о динамике цитокинов в раннем (1 сутки) послеоперационном периоде [76]. В нашем исследовании не обнаружено достоверных различий в уровне изучаемых цитокинов в коронарном синусе и в периферическом кровотоке в процессе контролируемой защищенной ишемии и реперфузии, сопровождающей проведение искусственного кровообращения. Цитокины являются короткоживущими и локально действующими молекулами, но при системном воспалительном ответе гиперцитокинемия является характерным 75 и важным патогенетическим звеном этого процесса. Поэтому повышение ИЛ 6 и ИЛ 10 в системном кровотоке и крови коронарного синуса свидетельствуют об активации СВО. Вместе с тем, предлагаемая модель изучения состояния миокарда по уровню маркеров в коронарном синусе продемонстрировала свою состоятельность. При этом уровень абсолютно специфичного маркера повреждения кардиомиоцитов - БСЖК повышался в крови коронарного синуса раньше и более значительно, чем в системном кровотоке, чего нельзя сказать о «классических» маркерах повреждения (КФК, КФК-МВ, тропонин I). Важно отметить изменение соотношения ИЛ 6/ИЛ 10 в периоперационном периоде коронарного шунтирования. Если до операции можно говорить о некотором балансе этих цитокинов (1,36 (0,71;2,24)), то в процессе ишемии и реперфузии отмечается явный сдвиг в «противовоспалительную» сторону со стабилизацией показателя на уровне 0,03. Сразу после операции происходит инверсия соотношения провоспалительного ИЛ 6 и противовоспалительного ИЛ 10. Уже через час после окончания операции баланс смещается в «провоспалительную» сторону (2,44 (0,84;5,28)) и продолжает усугубляться в течение первых суток, оставаясь таковым до третьих суток послеоперационного периода (10,45 (8,05;16,29)). Защищенная и контролируемая ишемия и реперфузия миокарда (кардиоплегия), сопровождающая процедуру искусственного кровообращения, оказываются значимыми факторами, стимулирующими выброс цитокинов. Значительный вклад в формирование системного цитокинового дисбаланса вносят собственные клетки сердца, что подтверждается синхронным изменением уровня цитокинов в коронарном и в системном кровотоке. В процессе оперативного вмешательства с защищенной контролируемой ишемией и реперфузией миокарда отмечается выраженное смещение баланса цитокинов в «противовоспалительную» сторону, а сразу после вмешательства – инверсия в «провоспалительную». 76 Таким образом, ишемия и реперфузия миокарда, сопровождающая операции, проводимые в условиях искусственного кровообращения стимулирует развитие системной воспалительной реакции. Это проявляется в выбросе ИЛ 10 и ИЛ 6 в кровь коронарного синуса, а также в системный кровоток. При этом, по-видимому, ключевым фактором в запуске этого процесса является ишемическое и реперфузионное повреждение тканей с выходом аларминов, которые через систему рецепторов врожденного иммунитета стимулируют продукцию и выброс цитокинов. 77 ГЛАВА 4 ВЛИЯНИЕ ПЕРИОПЕРАЦИОННОГО СТРЕССА НА РАЗВИТИЕ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА Динамика уровня кортизола. Оперативное вмешательство на сердце и магистральных артериях с использованием искусственного кровообращения представляет собой стресс, который требует напряжения компенсаторных реакций организма. Естественной реакцией последнего является выброс гормонов коры надпочечников, уровень которых характеризует адаптационные возможности организма. До операции уровень кортизола у пациентов разных групп не различался (таблица 10). Не было зафиксировано достоверных различий в уровне гормона надпочечников и в другие контрольные точки исследования (первые и седьмые гормональный сутки профиль послеоперационного пациентов двух периода). сравниваемых Однако групп был неодинаков. У пациентов с неосложненным СВО уровень кортизола достоверно (p=0,03) увеличивался сразу после операции: с 708,60 (368,10;946,90) нмоль/л до 1018,00 (477,60;1452,00) нмоль/л. Повышенный уровень сохранялся на седьмые сутки. Выброс катехоламинов является естественной и адекватной реакцией организма. В тоже время у пациентов с осложненным СВО уровень кортизола (558,15 (167,40;784,10) нмоль/л) имел лишь недостоверную тенденцию к повышению, как в первые (716,35 (276,15;1271,00) нмоль/л), так и на седьмые сутки послеоперационного периода (867,50 (640,50;1103,50) нмоль/л). Не смотря на то, что к исходу недели наблюдения уровень гормона достоверно превышал исходные значения, подобную динамику признать адекватной, нельзя, потому что к этому времени лечебные мероприятия уже были проведены и эффект был достигнут – органные дисфункции были компенсированы, осложнений не отмечалось. 78 Таблица 10 – Динамика уровня кортизола у пациентов с СВО Показатель Группы До операции СВО Неослож- Кортизол, ненный нмоль/л 1 сутки после 7 сутки после операции операции 1018,00 1044,50 708,60 (368,10;946,90) (477,60;1452,00)* (690,60;1247,00)** Ослож- 558,15 ненный 716,35 867,50 (167,40;784,10) (276,15;1271,00) (640,50;1103,50)** Примечания: * p<0,05 по сравнению с дооперационным уровнем ** p<0,01 по сравнению с дооперационным уровнем Известно, что активность коры надпочечников регулируется иммунной системой, и в первую очередь гуморальным звеном последней. В ответ на хирургическую агрессию уровень кортизола повышается. При этом степень повышения может зависеть от тяжести стресса [114; 178]. Этот процесс связан с цитокиновой регуляцией гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы. Такие цитокины как ИЛ 1, ИЛ 6, ФНО α, влияют на выделение релизинг-факторов, а также напрямую на гипофиз и надпочечники [362]. Установлено, что гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система преимущественно активируется после экстубации, что сопровождается повышением уровня адренокортикотропного гормона (АКТГ) и кортизола. При этом уровень АКТГ быстро возвращается к исходным значениям, а уровень кортизола остается повышенным в течение 48-72 часов [82]. В исследованиях на пациентах с установленным СВО после операций коронарного шунтирования, проведенных со стернотомией в условиях искусственного стимулированный кровообращения уровень было кортизола отмечено, что коррелировал базальный с и тяжестью операционного стресса [125]. При этом сам тест на определение уровня кортизола в крови рассматривается как прогностически значимый в отношении послеоперационных осложнений [84]. 79 Единого мнения относительно путей снижения адреналовой активности после операционного стресса нет. Наиболее вероятными являются следующие механизмы. ФНО α снижает активность синтеза кортизола посредством снижения чувствительности адреналовых рецепторов к АКТГ [361]. Макрофаги и нейтрофилы, активно пролиферирующие при СВО, синтезируют кортикостатины и дефензины. Последние, в свою очередь, ингибируют стероидную активность АКТГ [147]. Возможно выделение аткивированными стероидогенез. макрофагами К таким ряда факторам, факторов, в стимулирующих частности, относится трансформирующий ростовой фактор β [179; 334]. С другой стороны сам кортизол влияет на активированные моноциты и снижает уровень экспрессии ИЛ 1RA и ИЛ 1 [169; 203]. Кроме того, во время оперативного вмешательства используется большое количество препаратов, в том числе анестетиков, которые могут влиять на продукцию гормонов надпочечников [200]. В таком случае имеет значение качество и длительность анестезиологического пособия при проведении оперативного вмешательства. Известно, что адреналовая система и ее реакции на стресс связаны с уровнем лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови. В частности, в ответ на повышение уровня гормонов снижается уровень лимфоцитов и повышается уровень нейтрофилов. При этом наиболее подвержены снижению В-, NK-клетки и моноциты [151]. Таким образом, снижение активности адреналовой системы в ответ на операционную агрессию играет важную роль в патогенезе осложненного системного воспалительного ответа, что подтверждается нашими данными. Динамика уровня прокальцитонина у пациентов с СВО. Прокальцитониновый тест традиционно используют для дотверждения инфекционного начала воспалительной реакции. Однако в последенее время исследование уровня прокальцитонина проводят для оценки выраженности повреждения тканей и органов, а также операционного стресса [221; 290] 80 Исходный уровень прокальцитонина был выше в группе пациентов с осложненным СВО (таблица 11). То же соотношение было и в первые сутки послеоперационного периода. Только к исходу первой недели уровень прокальцитонина выравнивался в обеих группах. Таблица 11 – Динамика уровня прокальцитонина у пациентов с СВО Показатель Группы СВО Неослож- Прокальци- ненный тонин, нг/мл Осложненный 1 сутки после 7 сутки после операции операции 11,06 6,10 392,95 (2,30;181,45) (2,56;54,70) (150,80;500,50)** 142,97 253,20 374,00 (7,30;415,00) (37,60;398,20)* (193,50;471,60)** До операции Примечания: * p<0,05 отличия между группами ** p<0,05 по сравнению с предыдущим исследуемым периодом При этом в случае неосложненного течения как исходно (11,06 (2,30;181,45) нг/мл), так и к исходу первых суток (6,10 (2,56;54,70) нг/мл) уровень соответствовал нормальным значениям, определенным в исследованиях ряда авторов [143; 182; 282]. У пациентов с осложненным СВО исходный уровень прокальцитонина был повышен (142,97 (7,30;415,00) нг/мл) и сохранялся таковым и в первые (253,20 (37,60;398,20) нг/мл) и в седьмые сутки послеоперационного периода (374,00(193,50;471,60) нг/мл). Однако во всех группах во все точки исследования разброс значений был очень большим (рисунок 10), что указывает на высокую индивидуальность уровня маркера и, по-видимому, высокую зависимость от сопутствующих факторов. 81 А. Неосложненный СВО Б. Осложненный СВО Рисунок 10 – Динамика уровня прокальцитонина у пациентов с осложненным и неосложненным СВО Дискуссии о диагностической значимости прокальцитонина как маркера инфекции и инфекционного СВО ведутся и по сей день. При этом диагностическая значимость подтверждения бактериальной инфекции большого сомнения не вызывает. В нашем исследовании у пациентов как с осложненным, так и с неосложненным СВО инфекционных осложнений зафиксировано не было. Тем не менее, даже исходный уровень у пациентов этих групп различался, и различия эти сохранялись в первые сутки послеоперационного периода, т.е. на высоте послеоперационного системного воспалительного ответа. Таким образом, повышение уровня прокальцитонина оказывается маркером изолированной или множественной органной дисфункции [345]. Аналогичные результаты были получены при исследовании пациентов со скелетными травмами и развившейся множественной органной дисфункцией [284]. Кроме того, было описано повышение уровня прокальцитонина и провоспалительных цитокинов у пациентов с осложненным СВО после проведения операций по транскатетерной имплантации протеза аортального клапана в отличие от пациентов с неосложненным течением послеоперационного периода [337]. При сравнении динамики уровней прокальцитонина и sTREM-1 у пациентов 82 с сепсисом и проведенной операцией с применением искусственного кровообращения, было установлено, что описанные маркеры являются неспецифичными и могут значимо повышаться при остром неинфекционном воспалении [193]. ассоциированным Прокальцитонин с тяжестью может органных являться дисфункций, а маркером, не только инфекционных осложнений. Вместе с тем возможно объяснение повышенного уровня прокальцитонина у пациентов с осложненным СВО в первые сутки после операции транслокацией кишечной флоры в кровоток при усугубляющей течение основного процесса проведенной ишемии и реперфузии. Против этой версии указывает исходно повышенный уровень маркера у пациентов этой группы. У пациентов с осложненным СВО в первые сутки послеоперационного периода отмечена достоверная (p<0,05) положительная (0,83) корреляционная связь концентраций прокальцитонина с балльной оценкой тяжести органных дисфункций по SOFA. При этом у пациентов с неосложненным послеоперационным периодом такой зависимости не отмечено, по видимому, в виду отсутствия органных дисфункций как таковых (оценки по школе SOFA не превышали 2-3 баллов). Представляет интерес динамика уровня прокальцитонина к 7 суткам послеоперационного периода. В группе с неосложненным СВО к 7 суткам уровень повышается в 64 раза, при том, что отсутствуют проявления органных дисфункций и инфекционных осложнений. К седьмым суткам послеоперационного периода, скорее всего, все-таки имеет место транслокация кишечной флоры в системный кровоток. В таком случае имеющее место нарушение кровоснабжения кишечной стенки вследствие основного атеросклеротического процесса усугубляются проведенной процедурой ишемии и реперфузии. Однако подтверждаться это должно дополнительными тестами. 83 Таким образом, уровень прокальцитонина при оценке тяжести системного воспалительного ответа в большей степени отражает тяжесть органных дисфункций. В качестве маркера инфекционного воспаления может оцениваться только в совокупности с другими методами исследований и клинической картиной. Ишемия модифицированный альбумин. Ишемия- модифицированный альбумин (ИМА) – представляет собой обычный альбумин, который может связывать ионы кобальта, но эта его способность непостоянна. Считается, что нарушение структуры связывающего участка альбумина в ишемизированном миокарде снижает способность альбумина связывать кобальт. В условиях ишемии амино-терминальные молекулы сывороточного альбумина хуже связывают кобальт, медь и никель, по всей видимости, вследствие ацидоза, гипоксии, свободно-радикального повреждения, дефекта энерго-зависимых мембран, нарушения функций натриевых и кальциевых насосов. При этом образование ИМА связано с окислительным стрессом и ассоциированным с ним клеточным повреждением. Высвобождение свободных кислородных радикалов связано с модификацией N-терминального региона альбумина [314]. Поэтому повышение концентрации ишемия-модифицированного альбумина было предложено в качестве маркера ишемического повреждения миокарда. Предполагается, что ИМА повышается не только при кардиальной ишемии, но и при ишемии других органов, например при инсульте [215]. ИМА является высокочувствительным тестом и обладает высокой отрицательной предсказательной ценностью в оценке ишемии миокарда при инфаркте миокарда, нестабильной стенокардии [218]. Установлено, что ИМА в сыворотке повышается более значительно и медленнее регрессирует у пациентов с развившимся после операции коронарного шунтирования инфарктом миокарда [140]. В связи с этим было высказано предположение об использовании теста определения ИМА в периоперационном периоде с целью прогнозирования послеоперационного инфаркта миокарда. 84 Предполагается, что ИМА отражает раннюю стадию ишемии до развития некротических повреждений. Оценка уровня ИМА может иметь значение в оценке исходов послеоперационного периода и быть инструментом для оценки необходимости начала терапии (инотропная поддержка) при сердечной недостаточности [219]. Таблица 12 – Сывороточный уровень ишемия модифицированного альбумина у пациентов с СВО Показатель Группы 1 сутки после 7 сутки после операции операции 8,70 2,98 9,38 ненный (3,35;10,65) (0,69;5,40)** (4,38;19,26)**,*** Ослож- 4,23 1,02 5,59 ненный (1,66;7,19) (0,29;2,42)*,** (3,79;14,41)**,*** До операции СВО Неослож- ИМА, мг/мл Примечания: * p<0,05 отличия между группами ** p<0,01 по сравнению с дооперационным уровнем *** p<0,01 по сравнению с предыдущим исследуемым периодом В нашем исследовании (таблица 12) у пациентов разных групп (с осложненным и неосложненным СВО) исходный дооперационный уровень ИМА не различался. В обеих же группах в первые сутки послеоперационного периода отмечено значительное достоверное (p<0,01) снижение показателя. У пациентов с осложненным СВО снижение показателя было более выраженным (4,1-кратным) в сравнении с пациентами без такового (2,9кратным). Важно отметить, что и значения ИМА были достоверно (p<0,05) ниже у пациентов с осложненным течением и достигали 1,02 (0,29;2,42) мг/мл, по сравнению с 2,98 (0,69;5,40) мг/мл. В дальнейшем, модифицированного к седьмым альбумина суткам повышались значения (p<0,01) ишемически в группе с неосложненным течением до 9,38 (4,38;19,26) мг/мл и даже превышали 85 (p<0,05) дооперационные значения. При этом уровень ИМА в группе с осложненным СВО имел аналогичную динамику: увеличивался по сравнению с первыми сутками после операции (p<0,01), достигая 5,59 (3,79;14,41) мг/мл и превосходя дооперационные значения (p<0,01). Однако уровень этот между группами достоверно не различался. В литературе имеется очень мало указаний на ситуации, при которых снижается уровень ИМА. Объяснению механизмов такой реакции уделяется еще меньше внимания. Исследования уровня ишемия модифицированного альбумина у бегунов марафонских дистанций показало значительное снижение его уровня сразу после забега и повышение через сутки после окончания [216; 306]. При этом отсутствие значимой динамики в уровне кардиальных маркеров – тропонина I и миоглобина – указывало на отсутствие ишемии или некроза миокарда. Авторы предполагали причину снижения и последующего повышения в появлении гастроинтестинальной ишемии либо ишемии скелетных мышц. Снижение уровня ИМА отмечено в исследовании здоровых добровольцев непосредственно после моделированной ишемии предплечья. При этом была зафиксирована достоверная сильная отрицательная связь с уровнем лактата [217]. В то же время связи уровня ИМА с уровнем аммония зафиксировано не было. Авторами высказано предположение, что снижение уровня ИМА связано с увеличенной продукцией лактата ишемизированными скелетными мышцами. Таким образом, повышенный уровень лактата является помехой в активности ИМА. Важно учитывать факт мультифокального поражения сосудов разных артериальных бассейнов при атеросклерозе. От 13,5 до 94% пациентов с ишемической болезнью сердца имеют поражения сосудов других бассейнов, в том числе артерий нижних конечностей, сонных, мезентериальных артерий [45]. Даже в случае отсутствия клинически значимых поражений артерий кишечника в раннем послеоперационном периоде развиваются нарушения 86 трофики стенки кишки, что проявляется атонией, нарушением эвакуаторной функции, нарушением всасывания, нарушением микроциркуляции в стенке кишки [50; 166; 210; 255]. Ряд авторов рассматривает возможность в таких условиях транслокации кишечной микрофлоры с попаданием ее в кровоток [355]. С этим же часто связывают транзиторное повышение уровня прокальцитонина в отсутствии манифистирующей инфекции. Снижение уровня ИМА в раннем послеоперационном периоде согласуется с предположением авторов [216; 306] о гастроинтестинальной ишемии. В то же время значительное повышение уровня прокальционина к исходу первой недели послеоперационного периода может являться проявлением транслокации кишечной микрофлоры на фоне развившейся ишемии кишечника. Последнее может иметь значение при эволюции СВО, когда на фоне нарушения трофики стенки кишечника и нарушения перистальтики возможна транслокация кишечной флоры с попаданием в кровоток. При этом СВО может приобретать инфекционный компонент, формировать осложненные формы [15; 50]. Считается, что транслокация кишечной флоры может являться «мотором» для полиорганной недостаточности [33; 251] Таким образом, снижение в послеоперационном периоде уровня ИМА, причем в большей степени у пациентов с осложненным течением СВО может быть связано с усиленным свободнорадикальным окислением и накоплением лактата, развивающемся интраоперационно и в раннем послеоперационном периоде. Повышение послеоперационного уровня периода показателя может к косвенно седьмым указывать суткам на факт транслокации кишечной флоры в условиях вероятного мультифокального атеросклероза под воздействием интраоперационной управляемой ишемии и реперфузии. Интраоперационный окислительный стресс. При проведении кардиохирургических операций в ответ на выраженную гипоксическую 87 агрессию, обусловленную окислительного стресса применением (ОС) [9; 34]. ИК, формируется Основными состояние повреждающими факторами, определяющими развитие ОС, являются гипоксия (ишемия), воспалительная и стрессорная реакции [35; 36; 47]. Антиоксидантный потенциал больных ИБС часто оказывается недостаточным для компенсации развивающихся нарушений [1; 24]. Однако обратной стороной управляемой ишемии и реперфузии может быть гипероксия, развивающаяся при использовании экстракорпоральной перфузии и оксигенации. В экспериментальной модели экстрокорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО) было показано, что под влиянием процедуры ткани сердца снижают окислительный метаболизм субстратов, в том числе аминокислот, сохраняя при этом метаболическую активность, связанную с пируватом, и способность к синтезу белков [257]. В настоящее время в литературе есть единичные указания на взаимосвязь ЭКМО-индуцированной гипероксимии и продукции активных форм кислорода – важного патогенетического звена развития патологии. Хотя в теории гипероксимия может вызывать активацию тромбоцитов, их агрегацию и стимулировать тромбообразование посредством продукции значительного количества активных форм кислорода [171]. Предполагается, что тяжесть окислительного стресса и его последствий в раннем послеоперационном периоде может быть связана непосредственно с операционным периодом, гипоксией отдельных органов (в частности сердца) и эффективностью проводимой кардиоплегии. С целью оценки тяжести окислительного стресса в крови коронарного синуса определяли уровень диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА). Состояние антиоксидантной системы оценивали по уровню суммарной антиоксидантной активности (АОА) сыворотки. В начале кардиоплегии уровень исследуемых маркеров в группах пациентов не различался. Установлено, что уровень ДК в крови коронарного 88 синуса в процессе управляемой ишемии и реперфузии у пациентов в группе с неосложненным течением послеоперационного периода снижался (таблица 13). При стабильном уровне этого показателя в послеоперационном периоде регистрировался осложненный вариант СВО. На высоте ишемии и по окончании управляемой ишемии/реперфузии уровень МДА в группе пациентов с осложнениями был пониженным в сравнении с таковым в группе пациентов с неосложненным течением. Степень антиоксидантной активность крови коронарного синуса была стабильной во все периоды управляемой ишемии и реперфузии в обеих группах пациентов. При исследовании крови коронарного синуса в процессе управляемой ишемии и реперфузии установлено достоверное увеличение уровня лактата у пациентов обеих групп по сравнению с началом кардиоплегии (таблица 13). При этом в начале реперфузии (на высоте ишемии) концентрация лактата в крови коронарного синуса была достоверно выше (p<0,05) в группе с неосложненным течением послеоперационного периода. Такое же соотношение сохранялось и по окончании процедуры искусственного кровообращения. Таким образом, в процессе управляемой ишемии и реперфузии не смотря на проводимую кардиоплегию, окислительному стрессу и ткани сердца подвергаются действию гипоксии, что подтверждается повышенным уровнем ДК, МДА и лактата в крови коронарного синуса на всех этапах проведения вмешательства. 89 Таблица 13 – Уровень маркеров окислительного стресса в коронарном синусе в процессе операции у пациентов с разным вариантом течения СВО Начало кардиоплегии Параметр АОА, % ДК, мкмоль/л мкмоль/л Лактат, мг/дл Окончание ИК Неосложненный Осложненный Неосложненный Осложненный Неосложненный Осложненный СВО СВО СВО СВО СВО СВО 75,65 73,72 73,49 67,67 76,74 75,58 (69,22;79,50) (62,79;75,35) (67,09;79,68) (61,63;75,11) (70,35;79,93) (65,35;76,74) ** 36,72 35,08 29,63 31,08 30,08 30,36 (31,63;39,91) (30,90;37,63) (28,27;32,08) ** (28,72;34,90) (28,09;34,81) ** (26,72;35,27) 9,46 8,05 8,41 6,13 10,42 6,92 (7,84;13,27) (7,01;11,74) (6,87;13,00) (5,43;6,31) * (7,84;11,47) (6,04;7,18) * 19,40 14,10 40,50 27,20 40,50 28,40 (15,60;27,10) (12,30;16,30) * (28,10;52,60) ** (22,0;32,40) *, ** (28,80;54,70) ** (21,50;32,70) *, ** Примечание: * p<0,05 по сравнению с неосложненным течением ** p<0,05 по сравнению с началом кардиоплегии 89 МДА, Начало реперфузии 90 Установленная динамика интенсивности окислительного стресса может быть обусловлена недостаточными компенсаторными возможностями организма больных ИБС, которые в условиях длительно существующей ишемии миокарда существенно снижаются. При проведении ИК в ткани миокарда под влиянием гипоксии создаются условия для дополнительной генерации радикальных продуктов, повышения интенсивности окислительной деструкции белков и липидов, что в итоге может приводить к нарушению структуры и функции клеточных мембран и клеток в целом. Наиболее значимым патогенетическим фактором ИК является реперфузия, обуславливающая значительное повышение напряжения кислорода, что стимулирует дальнейшую активацию свободнорадикальных процессов. Воздействие ишемии/реперфузии, операционного стресса и механического повреждения тканей при выполнении КШ сопровождается существенным увеличением в сыворотке крови продуктов липопероксидации. Диеновые конъюгаты отражают обратимые процессы липопероксидации. Даже накопление таких продуктов не способно нанести выраженных повреждений непосредственно тканям и органам. Малоновый диальдегид относится к промежуточным продуктам липопероксидации. Его повышенные концентрации уже способны оказывать выраженное повреждающее действие на мембраны, а, следовательно, может резко ухудшать работу клеток и субклеточных систем. В нашем исследовании в случае снижения уровня диеновых конъюгатов в крови коронарного синуса послеоперационный период протекал без осложнений. Снижение уровня этих короткоживущих первичных продуктов ПОЛ оказывалось благоприятным фактором для пациентов. Сниженный в процессе кардиоплегии уровень МДА в крови коронарного синуса оказывался неблагоприяным послеоперационного осложненного СВО. фактором развития 91 Таким образом, выраженность окислительного стресса в тканях сердца в процессе управляемой ишемии/реперфузии, сопровождающей операции коронарного шунтирования влияет на течение послеоперационного периода в отношении тяжести системного воспалительного ответа. Осложненный СВО ассоциирован с более низким интраоперационным уровнем лактата и малонового диальдегида. Уровень диеновых конъюгатов у пациентов с неосложненным течением СВО динамически изменялся, в то время как отсутствие динамики уровня показателя приводило к развитию осложнений в послеоперационном периоде. Интраоперационное повреждение миокарда. Оценка динамики уровня маркеров повреждения миокарда в крови коронарного синуса могла бы позволить определить вклад сердечного компартмента в развитие послеоперационных осложнений, особенно с учетом результатов оценки выраженности процессов перекисного окисления липидов. Несмотря на проведение кардиопротекции в процессе управляемой ишемии и реперфузии, имеет место повреждение миокарда. Это подтверждается достоверной положительной динамикой уровня маркеров повреждения миокарда в крови коронарного синуса (КФК-МВ, БСЖК) в обеих группах пациентов. На высоте ишемии и после реперфузии было отмечено достоверное снижение уровня АсТ и АлТ относительно исходных значений. При этом такая динамика зафиксирована в обеих группах пациентов. 92 Таблица 14 – Уровень маркеров повреждения в коронарном синусе в процессе операции у пациентов с разными вариантами течения СВО Параметр Начало кардиоплегии Неосложненный БСЖК, мг/л КФК, Ед/л КФК-МВ, Ед/л АЛТ, Ед/л Осложненный Неосложненный Окончание ИК Осложненный Неосложненный Осложненный 2,90 2,50 13,51 14,48 17,03 17,95 (0,41;6,15) (1,59;3,69) (8,33;25,98)* (9,01;15,56)* (8,04;25,45)* (9,45;22,23)* 141,00 205,00 204,00 183,50 264,00 233,00 (83,00;256,00) (104,00;376,00) (90,50;250,50) (119,00;290,00) (131,00;349,50) (171,00;335,00) 19,00 24,00 39,00 40,50 46,00 39,50 (15,00;26,00) (22,00;26,00) (24,00;47,50)* (30,00;47,00)* (25,50;55,00)* (33,00;52,00)* 31,00 33,50 24,00 24,50 28,50 30,50 (25,00;62,00) (28,00;45,50) (21,00;31,50)* (22,00;29,00)* (25,50;36,50)** (26,00;37,00)** 20,00 29,00 13,00 16,00 13,00 18,50 (11,00;39,00) (16,00;35,00) (7,50;19,50)* (8,00;20,00)* (10,50;23,00)* (9,00;20,00)* Примечание: * p<0,01 по сравнению с началом кардиоплегии ** p<0,05 по сравнению с началом кардиоплегии 92 АСТ, Ед/л Начало реперфузии 93 Важно отметить, что, не смотря на наличие динамики уровня маркеров повреждения в крови коронарного синуса (БСЖК, КФК, КФК-МВ, АсТ, АлТ) в процессе проводимой управляемой ишемии и реперфузии, достоверных различий этих показателей между группами зафиксировано не было (таблица 14). Таким образом, в процессе управляемой ишемии и реперфузии, не смотря на проводимую кардиопротекцию, происходит повреждение миокарда, что подтверждается повышением уровня маркеров повреждения миокарда (БСЖК, КФК-МВ) в крови коронарного синуса. При этом степень повреждения, по-видимому, не играет прогностической роли в отношении развития осложненного СВО в послеоперационном периоде, поскольку достоверных отличий в уровне маркеров в процессе управляемой ишемии и реперфузии среди пациентов двух групп установлено не было. Подобное отсутствие влияния может также объясняться фактом активного влияния на сердечный выброс проведением катехоламиновой стимуляции, так как пациентам в ближайшем послеоперационном периоде после отлучения от искусственного кровообращения проводилась инфузия инотропных препаратов (адреналин, добутамин), что может нивелировать значимость повреждения миокарда через сниженный сердечный индекс. Становится очевидным важный вклад повреждения миокарда в процессе управляемой ишемии и рперфузии, а также механического повреждения формирование при проведении кардиохирургической операции в и характер течения системного воспалительного ответа. Алармины, выходящие из поврежденных клеток, являются триггерами для запуска клеточных реакций нейтрофилов, моноцитов, макрофагов, которые, в свою очередь, приводят к гиперцитокинемии, активации лизосомальных ферментов, манифестации эндотелиальной дисфункции, выбросу острофазовых белков и т.д. Было показано, что, не смотря на проводимую кардиоплегию, имеет место, достаточно выраженное повреждение клеток сердца. Однако на сколько выражены процессы повреждения 94 кардиомиоцитов и репаративные процессы в раннем послеоперационном периоде и вносят ли они вклад в патогенез системного воспалительного ответа? Таблица 15 – Уровень белка, связывающего жирные кислоты у пациентов с разными вариантами течения системного воспалительного ответа. Показатель 1 сутки после 7 сутки после операции операции 1,98 4,45 0,60 ненный (0,57;7,81) (2,89;9,71) (0,23;1,50)*,** Ослож- 1,59 4,45 0,91 ненный (0,47;4,18) (1,17;9,39)* (0,33;3,49)* Группы Неослож- БСЖК, мг/л До операции Примечания: * p<0,05 различия с предыдущим исследуемым периодом ** p<0,05 различия с дооперационным уровнем Очевидно, что исходный уровень БСЖК у пациентов разных групп не различался и составлял 1,98 (0,57;7,80) мг/л в случае дальнейшего неосложненного течения и 1,59 (0,47;4,18) мг/л – в случае осложненного СВО (таблица 15). Тенденция, выявленная в процессе проведения кардиоплегии при управляемой ишемии и реперфузии, когда фиксировалась склонность к более высоким значениям маркеров цитолиза в крови коронарного синуса у пациентов, с последующим осложненным послеоперационным периодом, подтверждалась и в первые сутки после вмешательства. Уровень БСЖК у пациентов первой группы повышался в 2,2 раза, однако повышение это было недостоверным. В случае осложненного СВО повышение было 2,8-кратным, статистически значимым (p<0,05). Зато дальнейшее снижение (p<0,05) показателя к 7 суткам приводило к тому, что уровень уже статистически не отличался от исходного и составлял 0,91 (0,33;3,49) мг/л. В отличие от такового у пациентов с неосложненным СВО, у которых снижение (p<0,01) уровня БСЖК к исходу недели после 95 вмешательства приводило к тому, что фиксировались достоверные отличия даже с исходным уровнем маркера. Значимость интраоперационного повреждения миокарда в патогенезе послеоперационных осложнений иллюстрирует динамика сывороточного уровня БСЖК с полиорганной недостаточностью, когда значения превышали исходные в 11,3 раза и составляли 18,04 (2,68;18,35) мг/л. Уровень маркера к исходу недели был ниже исходного в 8,3 раза и составлял 0,19 (0,10;0,27) мг/л. Предполагается, что скорость и степень снижения уровня БСЖК напрямую связана с функцией почек и почечной протеинурией [304]. В таком случае значительное снижение уровня маркера к исходу недели после вмешательства у пациентов с СВО может трактоваться как остаточные явления почечной дисфункции, имевшей место как компонент системного воспаления. Таким образом, повреждение кардиомиоцитов в процессе управляемой ишемии и реперфузии, сопровождающей кардиохирургические операции, может вносить существенный вклад в патогенез развивающегося в послеоперационном периоде системного воспаления. При этом, чем больше степень повреждения (подтвержденная динамикой лабораторных маркеров), тем больше риск развития тяжелых осложненных форм СВО. Значительное (ниже исходного уровня) снижение уровня БСЖК к исходу недели после проведения операции коронарного шунтирования в условиях управляемой ишемии и реперфузии связано, по-видимому, с дисфункцией почек и с почечной протеинурией. 96 ГЛАВА 5 КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ: ИЗМЕНЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МОНОЦИТОВ ПРИ СИСТЕМНОМ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ ОТВЕТЕ В ряду этих послеоперационных осложнений септическое состояние, несмотря на постоянно совершенствуемые методы интенсивной терапии и антибиотикотерапии, занимает одно из ведущих мест среди причин смертности пациентов. Причины возникновения сепсиса до конца не изучены, вместе с тем, взаимосвязь данного состояния с эффективностью функционирования иммунной системы пациента не вызывает сомнения. Вместе с тем, в патогенезе септических состояний и осложненного системного воспалительного ответа немало общих черт. В частности, в отношении функционирования иммунной системы, а именно ее клеточного звена. Именно поэтому в клинической практике широко применяются методы и подходы, позволяющие оценить состояние защитных систем пациента в послеоперационном периоде. К их числу относятся исследования абсолютного и относительного числа лимфоцитов, их основных субпопуляций [249] и доли апоптотических клеток [227], изучение функционального состояния фагоцитарного звена – циркулирующих моноцитов и нейтрофилов периферической крови [288], равно как и определения уровня про- и противовоспалительных цитокинов, С- реактивного белки и компонентов каскада комплемента в сыворотке крови [280]. Таким образом, первым этапом оценки состояния клеточного иммунитета у пациентов с системным воспалительным ответом после проведения кардиохирургических операций с использованием управляемой ишемии и реперфузии должно стать определение рутинных показателей: общее количество лейкоцитов, их субпопуляций в относительных и относительных величинах (таблица 16). 97 Таблица 16 – Состояние клеточного иммунитета у пациентов с СВО Группы СВО НеосложЛейкоциты ненный *109/мкл Осложненный Неосложненный CD45+, % Осложненный Неосложненный CD45+абс. Осложненный Неосложненный CD3+% Осложненный Неосложненный CD3+ абс. Осложненный Неосложненный CD3+CD8+% Осложненный Неослож+ + ненный CD3 CD8 абс. Осложненный Неосложненный CD3+CD4+% Осложненный Неослож+ + ненный CD3 CD4 абс. Осложненный Неосложненный CD4+/ CD8+ Осложненный Показатель До операции 6,35 (5,60;7,90) 6,80 (6,00;7,50) 33,00 (26,60;37,40) 37,05 (28,00;40,00) 2115,90 (1604,40;2519,50) 2019,30 (1917,50;2172,00) 75,0 (71,0;77,0) 76,0 (69,0;79,0) 1640,00 (1229,00;1858,00) 1460,50 (1312,00;1584,00) 23,0 (20,0;27,0) 21,0 (18,0;28,0) 493,90 (371,68;697,50) 432,01 (398,51;565,00) 48,0 (38,0;53,0) 49,0 (48,0;57,0) 1050,0 (759,49;1246,00) 959,01 (818,50;1179,31) 2,21 (1,73;2,73) 2,33 (1,62;2,74) 1 сутки после операции 12,45 (10,70;15,75)* 13,80 (11,00;15,80)* 6,00 (3,90;8,00)* 6,00 (3,00;7,00)* 753,00 (532,00;990,60)* 642,00 (420,00;796,50)* 60,0 (56,0;67,0)* 65,0 (53,0;72,0)* 464,50 (299,0;653,00)* 459,00 (218,00;514,00)* 22,0 (17,0;25,50) 23,0 (20,0;27,0) 156,28 (80,24;191,52)* 171,00 (67,20;195,84)* 31,0 (27,0;40,0)* 42,0 (33,0;46,0)* 191,91 (126,96;314,03)* 264,96 (120,0;294,71)* 1,46 (1,12;2,29)* 1,48 (1,35;2,06)* 7 сутки после операции 8,90 (7,90;10,50)*,** 9,80 (8,00;11,70)*,** 22,15 (18,00;26,80)*, ** 21,30 (13,10;27,05)** 1651,95 (1450,70;2036,80)* 1853,25 (1260,70;2765,85) 73,0 (66,0;79,0)* 73,0 (64,0;76,0)* 1345,00 (941,00;1709,00)* 1237,00 (928,00;1923,50)* 22,0 (18,0;25,0) 19,0 (17,0;23,0) 376,05 (246,62;586,09)* 328,22 (197,25;458,28)* 49,0 (41,0;54,0)* 56,0 (45,0;56,0)* 756,41 (587,88;1140,05)* 906,80 (735,91;1417,86)* 2,45 (1,58;3,02)* 2,81 (2,65;3,29)*,** 98 Окончание таблицы 16 Группы До операции 1 сутки после 7 сутки после Показатель СВО операции операции Неослож- 13,0 16,0 10,0 CD3ненный (10,0;15,0) (11,0;29,0) (8,0;13,0)*,** CD16+CD56+ Ослож- 12,0 16,0 8,0 % ненный (10,0;17,0) (12,0;29,0) (6,0;12,0)* Неослож- 282,58 112,77 177,09 CD3ненный (191,72;394,50) (82,88;208,21)* (124,0;234,82)* CD16+CD56+ Ослож- 220,50 69,12 205,45 абс. ненный (183,56;369,09) (43,0;143,37)* (109,39;352,28)* Неослож- 10,0 15,0 13,0 ненный (7,0;12,0) (12,0;22,0)* (10,0;18,0)*,** + CD3 CD19 % Ослож- 11,0 17,0 16,0 ненный (8,0;14,0) (16,0;20,0)* (14,0;20,0)** Неослож- 208,88 104,47 237,05 + ненный (170,77;243,50) (70,21;170,10)* (172,38;321,11)* CD3 CD19 абс. Ослож- 221,22 109,00 349,50 ненный (164,0;272,00) (49,00;137,00)* (212,79;411,04)*,** Примечания: *p<0,01 в сравнении с предыдущим исследуемым периодом; **p<0,01 в сравнении с дооперационным уровнем Исходный уровень лейкоцитов периферической крови у пациентов с последующим неосложненным и осложненным системным воспалительным ответом не различался (6,35 (5,60;7,90)*109/мкл и 6,80 (6,00;7,50)*109/мкл). Равно как и в обеих группах уровень этот не отличался от принятых референсных значений этого показателя для условно здоровых людей (49*109/мкл). Проведенное хирургическое вмешательство со всем комплексом триггерных факторов закономерно провоцировало реакцию клеточного иммунитета с повышением уровня лейкоцитов периферической крови (p<0,01). Их значения соответствовали 12,45 (10,70;15,75)*10 9/мкл и 13,80 (11,00;15,80)*109/мкл для пациентов обеих групп. При этом как в группе пациентов с неосложненным СВО, так и в группе с осложненным СВО уровень лейкоцитов превышал 12*109/мкл, т.е. порог, определенный Bone R.C., как диагностически значимый для клинического определения диагноза синдрома системного воспалительного ответа. 99 Поскольку у всех пациентов не было зарегистрировано инфекционных осложнений, а системный воспалительный ответ разрешался, к исходу первой недели после операции уровень лейкоцитов закономерно снижался (p<0,01). Хотя и оставался повышенным в сравнении с исходным уровнем, демонстрируя напряжение репаративных процессов послеоперационного периода. Динамика изменения относительного и абсолютного количества лимфоцитов у пациентов обеих групп была схожей. В первые сутки после вмешательства отмечалось снижение уровня этой популяции, а к исходу первой недели – восстановления. При этом к исходным значениям возвращалось лишь абсолютное количество лимфоцитов (CD 45+ - клеток). Качественный состав лейкоцитов менялся. В первые сутки доля CD 45позитивных клеток составляла 6,00 (3,90;8,00)% и 6,00 (3,00;7,00)% у пациентов с неосложненным и осложненным СВО соответственно, по сравнению с 33,00 (26,60;37,40)% и 37,05 (28,00;40,00)% до операции. К исходу недели содержание клеток составило 22,15 (18,00;26,80)% и 21,30 (13,10;27,05)%. В послеоперационном периоде менялся субпопуляционный состав лимфоцитов. Снижение относительного и абсолютного количества CD3+ клеток в первые сутки после операции было более выраженным у пациентов с неосложненным СВО. Исходно их было 75,0 (71,0;77,0)%, а именно 1640,00 (1229,00;1858,00) в мкл. В первые сутки этот уровень достоверно (p<0,01) снижался до 60,0 (56,0;67,0)% и 464,50 (299,0;653,00) в мкл соответственно. В случае осложненного СВО количественная реакция Т-клеток была менее выраженной: с 76,0 (69,0;79,0)% и 1460,50 (1312,00;1584,00) в мкл их уровень снижался (p=0,03) до 65,0 (53,0;72,0)% и 459,00 (218,00;514,00) в мкл соответственно. Далее к седьмым суткам у пациентов обеих групп восстанавливался исходный уровень T-клеток как в относительных, так и в абсолютных единицах. 100 Уровень CD 19 позитивных клеток у пациентов обеих групп менялся однотипно: в первые сутки их абсолютное количество уменьшалось (p<0,01), в то время как относительное количество увеличивалось (p<0,01). В дальнейшем, к седьмым суткам их уровень повышался и абсолютное количество не отличалось от исходных значений, а в случае осложненного СВО даже имело недостоверную тенденцию к превышению исходных значений. В тоже время удельный вес В-клеток достоверно превышал таковой до оперативного вмешательства. Абсолютное количество NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) в первые сутки после вмешательства снижалось (p<0,01): со 282,58 (191,72;394,50) в мкл до 112,77 (82,88;208,21) в мкл в случае неосложненного СВО и с 220,50 (183,56;369,09) в мкл до 69,12 (43,0;143,37) в мкл в случае осложненного. При этом также как и в случае с В-клетками, относительное их количество увеличивалось (p<0,01). В дальнейшем, к седьмым суткам относительное количество NK-клеток снижалось и было даже ниже исходных значений: 10,0 (8,0;13,0)% при неосложненном и 8,0 (6,0;12,0)% при осложненном СВО. Однако абсолютное количество популяции в кровотоке восстанавливалось и уже достоверно не отличалось от исходных значений у пациентов обеих групп. Субпопуляции Т-клеток также демонстрировали снижение в первые сутки после вмешательства. Относительное и абсолютное количество CD3+CD4+ снижалось, однако в случае осложненного СВО это снижение было менее выраженным. Если в абсолютных значениях это снижение было 3,6-кратным, то в случае неосложненного СВО – 5,5-кратным. На седьмые сутки отмечалось возвращение абсолютного количества T-хелперов к исходному уровню. При этом в случае осложнений уровень составлял 95% от исходного, а в случае гладкого течения послеоперационного периода – 72%. Схожим было изменение уровня CD3+CD8+ клеток: снижение в первые сутки после вмешательства, с последующим восстановлением исходного уровня. Отличием может служить лишь отсутствие динамики процентного 101 содержания этих клеток в течение всего периода наблюдения у пациентов обеих групп. Закономерным отображением изменения уровня популяций Т-клеток является динамика, так называемого, иммуно-регуляторного индекса (ИРИ), т.е. соотношения CD4+/ CD8+. Исходный уровень у пациентов двух групп не различался (2,21 (1,73;2,73) и 2,33 (1,62;2,74)) и находился в пределах референсных значений, применимых к здоровым донорам. Снижение обеих популяций клеток приводило к снижению ИРИ в первые сутки после вмешательства. Более высокий уровень CD3+CD4+ и более низкий CD3+CD8+ у пациентов с осложненным СВО на седьмые сутки после операции закономерно приводил к тому, что ИРИ у больных этой группы хоть и не достоверно, но был выше, чем таковой у пациентов без осложнений и составлял 2,81 (2,65;3,29). Кроме того, значения индекса достоверно (p=0,04) превышали исходные значения, в отличие от пациентов с неосложненным течением, у которых уровень возвращался к исходным (2,45 (1,58;3,02)). Очевидно, что выполнение стандартного иммунофенотипирования с определением общего количества лимфоцитов, T-, B- и NK-клеток у пациентов в периоперационном периоде не представляется достаточно информативным тестом для оценки состояния клеточного звена иммунитета. Таким образом, системный воспалительный ответ, развивающийся после кардиохирургических операций с использованием управляемой ишемии и реперфузии сопровождается выраженной реакцией клеточного иммунитета, проявляющейся повышением уровня в первые лейкоцитов сутки после периферической вмешательства крови. При этом абсолютное количество лимфоцитов и их популяций (CD3+, CD3-CD19+, CD3-CD16+CD56+, CD3+CD4+, CD3+CD8+) снижается. К седьмым суткам послеоперационного периода уровень лейкоцитов снижается, а субпопуляционный состав стремиться вернуться к исходным значениям. Однако в случае неосложненного СВО реакция лимфоцитов отстает, и уровень CD45+ оказывается достоверно ниже исходного, в отличие от 102 такового у пациентов с осложненным вариантом. А уровень CD3-CD19+ у пациентов с осложнениями на седьмые сутки превышал исходные значения. Уровень В-клеток восстанавливался быстрее у пациентов с осложненным СВО. При этом все выявленные изменения отражают лишь общую закономерность реагирования иммунной системы в ответ на значительное повреждение, связанное с проведением тяжелой полостной операции с применением искусственного кровообращения и анестезиологическим пособием. Как уже отмечалось, при сепсисе имеет место нарушение основ функционирования как системы приобретенного иммунитета, основанной на лимфоцитах, так и реакций врожденного иммунитета, связанных с клетками моноцитарного и гранулоцитарного рядов. С этой точки зрения, выбор моноцитов периферической крови для оценки тяжести состояния пациентов и прогнозирования течения септического процесса представляется вполне логичным и оправданным. Так же логичным представляется исследование моноцитов как основного звена патогенеза любого воспалительного процесса, в том числе системного. Моноциты играют ведущую роль как в реализации реакций врожденного иммунитета (фагоцитоз, продукция активных форм кислорода и оксида азота NO, синтез и секреция различных медиаторов), так и в регуляции реакций приобретенного иммунитета (синтез иммунорегуляторных цитокинов, презентация антигена Т-лимфоцитам). При септическом состоянии имеет место нарушение основ функционирования моноцитов, что характеризуется снижением фагоцитарной активности [288], уменьшение уровня продукции ИЛ 1 и ФНО α в ответ на стимуляцию in vitro и снижением уровня экспрессии на мембране клеток молекул главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR [177]. Моноциты составляют 5-10% от общего количества лейкоцитов крови человека и выполняют ряд важных функций в запуске, поддержании и контроле иммунного ответа. Они образуются в костном мозге, циркулируют в крови от 24 до 72 ч, затем мигрируют в ткани, где, при наличии 103 определенного микроокружения, дифференцируются в макрофаги или дендритные клетки. Не активированные в течение этого времени моноциты погибают апоптозом. Популяция моноцитов не является однородной. В настоящее время классификация моноцитов находится в стадии формирования. В зависимости от экспрессии на поверхности низкоафинного рецептора Fcγ CD16 и корецептора липополисахарида CD14, некоторые авторы выделяют две популяции циркулирующих в кровотоке моноцитов – CD14+CD16– и СD14+CD16+ [75; 369]. По мнению других, по уровню экспрессии CD16 на поверхности моноцитов, оправдано дополнительное разделение субпопуляции СD14+CD16+ еще на две – CD14hiCD16+ и CD14dimCD16+ [163; 173; 320]. Эти разногласия усложняют интерпретацию результатов, полученных разными исследователями. Тем не менее, все авторы сходятся во мнении, что клетки различных популяций отличаются по функциональной активности, спектру секретируемых при активации цитокинов, набору и выраженности экспрессии рецепторов на поверхности клеток, что обуславливает выполнение различных функций в организме. Аналогичное разделение моноцитов на популяции показано и для модельных животных – у мышей известны две основные субпопуляции моноцитов, получивших в литературе название «воспалительной» Gr1+ (Ly6C+) и «патрулирующей» Gr1–(Ly6C–) [180; 211; 342]. Моноциты Gr1+ выполняет важную функцию в защите от инфекции и заживлении тканей [342]. При активации они способны к фагоцитозу, секреции антимикробных факторов, цитокинов, стимуляции пролиферации Т-эффекторов [250]. Клетки «патрулирующей» или Gr1– популяции моноцитов прикрепляются к эндотелию и, двигаясь вдоль капилляров, мелких вен и артерий, осуществляют наблюдение за состоянием эндотелия [180]. Предполагается, что, в случае ишемического повреждения миокарда, моноциты Gr1– принимают участие в репарации тканей, привлекая в очаг 104 фибробласты, стимулируя ангиогенез и отложение коллагена [342]. Эта субпопуляция участвует в элиминации иммунных комплексов из циркуляторного русла, подавляет пролиферацию CD4+-лимфоцитов и играет важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний [211]. С помощью молекулярно-биологических методов было показано, что спектр экспрессируемых генов Gr1+ моноцитов мыши соответствует таковому CD14hiCD16– и CD14hiCD16+ популяции моноцитов человека [180]. В норме CD14hiCD16–, активностью, приблизительно которые продукцией 90-95% моноцитов характеризуются активных форм крови выраженной кислорода, являются фагоцитарной оксида азота, миелопероксидазы, лизоцима, а так же хемокинов IL-8, CCL2, CCL3 [180]. В литературе клетки с данным фенотипом получили название «классических» моноцитов. Минорная субпопуляция CD14hiCD16+ моноцитов обладает сниженной фагоцитарной активностью и ограниченной способностью к респираторному «взрыву», синтезу хемокинов по сравнению CD14+CD16–, но активно продуцирует провоспалительные цитокины (ФНО α, ИЛ 1β, ИЛ 6) [335; 180]. Моноциты CD14hiCD16+ вовлечены в процессы, связанные с системной воспалительной реакцией, что позволяет рассматривать данную популяцию клеток как «провоспалительную». Показано ее значительное увеличение у пациентов с сепсисом, ревматоидным артритом, СПИДом, атеросклерозом [369]. Мышиным Gr1– клеткам соответствуют человеческие моноциты CD14dimCD16+, которые так же экспрессируют на своей поверхности CD16. Благодаря особенностям в экспрессии на поверхности хемокиновых рецепторов и рецепторов адгезии, моноциты с фенотипом CD14dimCD16+ обладают повышенной тропностью к эндотелию и высокой миграционной активностью. Это обстоятельство определяет их распределение в организме. Известно что, в циркулирующей крови их содержится всего лишь до 25% от общего количества [319]. Моноциты CD14dimCD16+ вызывают особый 105 интерес у кардиологов, поскольку проявляют проатеросклеротическую активность и способствуют прогрессированию ИБС [180; 320]. Учитывая важную роль моноцитов в развитии воспалительной реакции и продукции цитокинов, а так же отсутствие ясности в вопросах, касающихся участия различных субпопуляций моноцитов крови в развитии СВО неинфекционного генеза в дальнейшем исследовалась динамика количественного и качественного состава популяций моноцитов (CD14CD16) крови пациентов в периоперационном периоде коронарного шунтирования, выполненного в условиях управляемой ишемии и реперфузии. Предварительное разделение лейкоцитов на популяции проводили по прямому и боковому светорассеянию. При анализе моноцитов периферической крови, экспрессирующих на своей поверхности CD14, выявлялось четкое разделение на две субпопуляции: CD14hi и CD14dim (рисунок 11). по оси абсцисс: прямое светорассеяние (FCS-Height), по оси ординат: боковое светорассеяние (SSC-Height), область R4 – моноциты Рисунок 11 – Выделение популяции моноцитов в образцах периферической крови по прямому и боковому светорассеянию Проводился анализ моноцитов по трем субпопуляциям. Для 106 исключения дебриса, порог устанавливали по FS и CD45PC5. Популяцию моноцитов выделяли по CD14 в комбинации с боковым светорассеянием (SSC). По уровню экспрессии рецепторов CD14 и CD16, моноциты были разделены на три субпопуляции – CD14hiCD16–, CD14hiCD16+ и CD14dimCD16+. На рисунке 12 представлена динамика субпопуляционного состава в периоперационном периоде коронарного шунтирования. А Б В А. До операции; Б. Первые сутки после операции; В. 7 сутки после операции R2 - CD14hiCD16R3 - CD14hiCD16+ R4 - CD14dimCD16+ Рисунок 12 – Субпопуляционный состав моноцитов по CD14, CD16 в динамике периоперационного периода коронарного шунтирования 107 Таблица 17 – Абсолютный и относительный состав субпопуляций моноцитов периферической крови у пациентов с СВО Показатель Группы До операции 1 сутки после 7 сутки после операции операции 0,411 0,435 0,572 СВО НеосложCD 14hiCD16-, ненный (0,350;0,517) (0,301;0,589) (0,396;0,790)** абс. Ослож- 0,353 0,556 0,564 ненный (0,274;0,577) (0,264;0,736) (0,427;0,926)** 85,75 75,90 86,50 НеосложCD 14hiCD16-, ненный (81,30;90,40) (72,15;80,25)* (80,35;91,20)* % Ослож- 84,30 79,50 83,40 ненный (77,70;88,80) (73,80;86,50) (80,00;88,60)* 0,023 0,100 0,064 НеосложCD14hiCD16+, ненный (0,015;0,039) (0,067;0,128)* (0,031;0,102)*,** абс. Ослож- 0,022 0,100 0,065 ненный (0,017;0,047) (0,059;0,193)* (0,033;0,097)*,** 4,60 19,30 8,45 НеосложCD14hiCD16+, ненный (3,65;10,50) (14,00;23,40)* (5,05;12,90)*,** % Ослож- 6,70 17,50 8,70 ненный (4,20;9,50) (10,90;21,90)* (4,80;11,20)* 0,023 0,015 0,023 (0,014;0,040) (0,009;0,033) (0,017;0,039) Ослож- 0,026 0,014 0,029 ненный (0,015;0,030) (0,008;0,032) (0,021;0,058)* 5,40 2,75 3,80 (3,58;8,85) (1,65;4,05)* (2,90;5,70)*,** Ослож- 5,40 2,20 4,95 ненный (4,10;10,30) (1,90;3,60)* (3,00;9,30)*,** НеосложCD14dimCD16+, ненный абс. НеосложCD14dimCD16+, ненный % Примечание: *p<0,01 по сравнению с предыдущим исследуемым периодом; ** p<0,01 по сравнению с дооперационным уровнем 108 Динамика субпопуляционного состава моноцитов представлена в таблице 17. Наиболее консервативной оказалась самая «многочисленная» популяция CD14hiCD16- клеток. Абсолютное их количество у пациентов разных групп в первые сутки после операции менялось недостоверно. Только к седьмым суткам после вмешательства отмечалось достоверное (p<0,01) увеличение количества клеток у пациентов с осложненным и неосложненным СВО. Эта популяция еще называется «классической» и обеспечивает постоянство моноцитов. Основными функциями этих клеток является фагоцитарная активность, антимикробицидных поступлении синтез факторов, инфекционного т.е. агента. факторов активность, Однако в хемотаксиса необходимая случае и при проведения кардиохирургической операции по реваскуляризации миокарда в условиях управляемой ишемии и реперфузии развивается системный воспалительный ответ неинфекционного генеза и, следовательно, количественная реакция CD14hiCD16- в первые сутки после вмешательства нехарактерна. С другой стороны, предполагается, что на фоне атеросклеротического поражения мезентериальных сосудов и в условиях нарушения микроциркуляции, сопровождающей развитие системного воспалительного ответа возможна транслокация кишечной флоры, что должно приводить к реакции иммунной системы. моноцитов В такой к ситуации седьмым увеличение количества суткам после вмешательства «классических» представляется логичным. Иной была динамика количества клеток с фенотипом CD14hiCD16+. В первые сутки после вмешательства у пациентов обеих групп их количество увеличивалось (p<0,01) больше, чем в 5 раз. В дальнейшем отмечалась отрицательная динамика количества клеток. Однако, к седьмым суткам у пациентов как с неоосложненным, так и с осложненным СВО сохранялся повышенный (p<0,01) уровень относительно исходных значений. Такое резкое увеличение «провоспалительным» количества CD14hiCD16+ моноцитам, через клеток, сутки после относящихся к вмешательства 109 закономерно. Активность этих клеток связана, в первую очередь, с продукцией провоспалительных цитокинов, являющихся непременным атрибутом системного воспалительного ответа. Сохраняющийся высокий уровень к седьмым потенциальную суткам активность после вмешательства моноцитов в демонстрирует отношении поддержания воспаления. В отличие от двух других субпопуляций, количество CD14dimCD16+ клеток в первые сутки после вмешательства имело тенденцию к снижению. В случае неосложненного СВО уровень остается стабильным и к седьмым суткам послеоперационного периода. С другой стороны у пациентов с осложненным СВО количество CD14dimCD16+ к седьмым суткам увеличивается (p=0,04). Тем не менее, именно эта субпопуляция моноцитов демонстрирует свою количественную консервативность. Учитывая тропность клеток CD14dimCD16+ к эндотелию, а так же выполнение ими патрулирующих функций в отношении эндотелия, в том числе в микроциркуляторном русле представляется логичным большая лабильность этой субпопуляции клеток в реализации системного воспалительного ответа. Предположительно вовлечение эндотелия и отчасти развитие последующих микроциркуляторных расстройств связано именно с этой минорной популяцией клеток. В дальнейшем была проведена оценка экспрессии поверхностных рецепторов CD14 и CD16 на моноцитах по средней интенсивности флюоресценции MIF (mean intensity of fluorescence), соответствующей геометрической средней интенсивности флюоресценции для выделенной группы клеток (рисунок 13). Фактически MIF характеризует уровень экспрессии данных молекул на клеточной поверхности. 110 По оси абсцисс: интенсивность флуоресценции CD14, по оси ординат: число клеток, несущих CD14. Область М1 – моноциты с высоким уровнем экспрессии CD14 (далее CD14hi), область М2 – моноциты с низким уровнем экспрессии CD14 (далее CD14low). Рисунок 13 – Однопараметрическая гистограмма, характеризующая уровень экспрессии CD14 на моноцитах Результаты оценки MIF на поверхности моноцитов у пациентов с разным течением системного воспалительного ответа представлены в таблице 18. CD14 является мембранным белком, компонентом рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2, распознающего липополисахарид. Исходя из функции рецептора выраженность его экспрессии может быть связана, в том числе, с инфекционным воспалением. Однако, учитывая активность комплекса с входящими в его состав TOLL-подобными рецепторами, можно предположить активность и в отношении DAMP, т.е. эндогенных молекулярных паттернов. CD16 является рецептором Fc-фрагмента IgG и посредством его стимуляции происходит, в том числе, активация продукции и выброса провоспалительных цитокинов. 111 Таблица 18 – Динамика интенсивности флюоресценции рецепторов CD14 и CD16 на субпопуляциях моноцитов CD14hiCD16MIF CD/СВО MIF CD14 Неосложненный MIF CD14 320,7 (213,1;1006,4) 329,6 (231,7;1042,2) ненный 1-е сутки 7-е сутки после после операции операции 236,5 267,9 (177,6;408,1) (194,4;385,1) ** 211,2 (147,8;660,2) ** *** 283,6 CD14dimCD16+ 1-е сутки 7-е сутки после после операции операции до операции 283,1 353,0 (219,3;1119,7) (275,2;632,3) 321,5 327,6 266,7 (202,3;348,5) **, *** 329,9 до операции 34,8 (27,4;115,0) 35,5 (237,5;677,6) (213,4;1025,0) (228,9;1105,5) (249,6;753,3) (25,5;95,3) MIF CD16 Неосложненный MIF CD16 Ослож- 26,8 (23,8;82,2) 31,0 (26,8;92,4) ненный 31,3 (26,1;49,3) 49,3 (28,6;70,9) Примечания: * p=0,03 различия между группами ** p<0,01 отличия с предыдущим исследуемым периодом *** p<0,01 отличия с исходным уровнем 26,8 186,0 (23,9;32,2) (107,7;265,0) 25,7 233,0 (24,0;38,7) (145,8;334,0) 1-е сутки 7-е сутки после после операции операции 46,2 30,2 (35,1;121,2) (24,4;93,5) ** ** 46,9 28,3 (33,5;112,7) (25,5;46,2) ** 155,4 (92,2;202,1) * 210,7 (173,0;246,6) * ** 165,4 (98,6;279,5) 221,2 (113,3;282,9) 111 Ослож- до операции CD14hiCD16+ 112 Уровень экспрессии CD14 на поверхности CD14hiCD16- моноцитов в первые сутки после вмешательства снижался (p<0,01) у пациентов как с осложненным, так и с неосложненным СВО. При этом к седьмым суткам у пациентов без осложнений MIF сохраняется на более низком уровне, чем до вмешательства (p<0,01). В случае развития осложненного СВО интенсивность флюоресценции на поверхности CD14hiCD16- не отличается от таковой исходной. Субпопуляцию CD14hiCD16+ называют «провоспалительной» благодаря активному фагоцитозу, продукции АФК, миелопероксидазы, лизоцима, а так же хемокинов ИЛ8, CCL2, CCL3 [180]. Моноциты СD14hiCD16- обладают сниженной способностью к фагоцитозу, респираторному взрыву, но активно вырабатывают ФНО α, ИЛ 1β. Обе субпопуляции продуцируют значительное количество ИЛ 6 и умеренное ИЛ 10. Вопрос происхождения субпопуляции CD14hiCD16+ до сих пор остается открытым, но накопленная в последние годы информация все больше свидетельствует об их дифференцировке из моноцитов с фенотипом CD14hiCD16-. Ana Merino в своих экспериментах in vitro удалось получить субпопуляцию CD14hiCD16+ из клеток CD14hiCD16– методом культивирования в присутствии ИЛ 4, ИЛ 10 и GM-CSF [320]. Подобные результаты можно найти у Skinner N.A. только в качестве стимулятора были использованы липополисахарид, стафилококковый энтеротоксин и пептидогликан [302]. Предполагается, что в процессе активации моноциты становятся позитивными по CD16, в то время как экспрессия CD14 на них снижается. Плотность экспрессии CD14 на поверхности CD14hiCD16+ моноцитов у пациентов с неосложненным СВО менялась волнообразно. Так, в первые сутки после вмешательства отмечалось увеличение MIF по сравнению с исходным уровнем (283,1 (219,3;1119,7) и 353,0 (275,2;632,3) соответственно), с последующим снижением к седьмым суткам 266,7 (202,3;348,5). При этом к исходу недели интенсивность флюорисценции 113 CD14 у моноцитов была ниже, чем до операции. В случае развития осложненного системного воспалительного ответа в течение всего периода наблюдения достоверной разницы в показателях MIF не отмечалось. Таким образом, «провоспалительная» субпопуляция моноцитов у пациентов с осложненным СВО хоть и увеличивалась в количестве, но демонстрировала отсутствие функционального напряжения. Уровень экспрессии CD14 не менялся, что отчасти демонстрирует их сниженную функциональную активность. Минорная субпопуляция CD14dimCD16+ в отношении динамики уровня экспрессии CD14 не проявляла отличий у пациентов разных групп. В первые сутки после вмешательства отмечалось увеличение показателя (p<0,01), а к седьмым суткам – снижение до исходных значений. Субпопуляция CD14hiCD16+ в отношении MIF CD16 демонстрировала определенную консервативность. В течение всего периода наблюдения показатель на моноцитах периферической крови достоверно не менялся как у пациентов с неосложненным, так и с осложненным СВО (таблица 18). Иная ситуация была в отношении минорной субпопуляции CD14dimCD16+. Динамика уровня MIF на моноцитах пациентов обеих групп была недостоверной, однако имелась тенденция к ее снижению. Таким образом, с учетом индивидуальных особенностей исходного уровня, в первые сутки после вмешательства зафиксирована достоверная (p=0,03) разница в экспрессии CD16 на поверхности CD14dimCD16+ у пациентов с осложненным и неосложненным системным воспалительным ответом. При этом у пациентов с осложнениями показатель был выше. К седьмым суткам динамика в уровне MIF CD16 практически отсутствовала и у пациентов разных групп показатель не различался. Однако имелась некоторая тенденция к сохранению более высоких осложнениями. Таким образом, так значений у пациентов с называемая «патрулирующая» субпопуляция моноцитов так же демонстрирует свою функциональную активность, в первую очередь у пациентов с осложненным СВО. 114 Подтверждается предположение об участии именно этой популяции в реализации расстройств функционирования эндотелия при развитии системного воспалительного ответа. Полученные результаты дают основания предполагать, что в ответ на альтерацию тканей, связанную с оперативным вмешательством и искусственным кровообращением, имеет место выход клеток моноцитарного ряда (с высоким и низким уровнем экспрессии CD14) в ткани с последующей дифференцировкой свидетельствуют в об тканевые активации макрофаги. моноцитов Наши CD14hiCD16– результаты в раннем послеоперационном периоде с соответственным снижением на поверхности экспрессии CD14 и появлением рецептора CD16, в результате чего происходит увеличение клеток с фенотипом CD14hiCD16+. Миграция моноцитов в ткани, их превращение в тканевые макрофаги и активность последних являются важными аспектами развития и поддержания процесса воспаления. субпопуляционного Выше состава была показана моноцитов динамика периферической изменения крови при системном воспалительном ответе после операций по реваскуляризации миокарда, выполненных в условиях управляемой ишемии и реперфузии. При этом изменяется не только количественный состав субпопуляций моноцитов, но и их функциональный потенциал, проявляющийся изменением уровня экспрессии основных кластеров дифференцировки на их поверхности, а именно CD14 и CD16. Для оценки потенциальной миграционной способности субпопуляций моноцитов и их возможной активности по взаимодействию с клетками эндотелия предполагается оценка экспрессии дополнительных поверхностных клеточных маркеров. CD62L – гликопротеин, поверхностный клеточный рецептор, относящийся к классу молекул межклеточной адгезии, селектинов. Известно его участие в роллинге лейкоцитов вдоль сосудистой стенки [62]. Кроме того, этот рецептор играет ключевую роль в рекрутировании моноцитов из кровотока в ткани и лимфоидные органы при 115 развитии воспаления [126]. Предпринимаются попытки использовать этот маркер в диагностических целях. В частности, установлена диагностическая значимость определения CD62L на поверхности нейтрофилов и моноцитов для ранней диагностики инфекции новорожденных [157]. Как и большинство исследуемых поверхностных клеточных маркеров, CD62L обладает высокой степенью вариабельности у каждого пациента (таблица 19). Так, исходная MIF CD62L на CD14hiCD16- составляла 250,9 (160,3;360,3) у пациентов с неосложненным СВО и 346,5 (211,9;509,0) - с осложненным. Однако в силу большого разброса значений у разных пациентов разницу была недостоверной (p=0,07). В дальнейшем интенсивность флюоресценции повышалась как в случае отсутствия осложнений (p<0,01), так и в случае осложненного СВО (p=0,02). А вот к седьмым суткам динамика поверхностной экспрессии CD62L у пациентов разных групп менялась. Если у пациентов с гладким послеоперационным периодом MIF снижалась и практически соответствовала исходным значениям, то в случае осложнений экспрессия селектина продолжала увеличиваться, и в 1,8 раза превышала первоначальный уровень (p<0,01). С другой стороны на CD14hiCD16+ моноцитах динамика была, скорее, обратной. В первые сутки после операции отмечалось увеличение MIF в 1,4 раза в случае неосложненного (p=0,02) и в 1,9 раза в случае осложненного (p<0,01) СВО. Однако в дальнейшем в случае «гладкого» течения послеоперационного периода отмечалось продолжающееся нарастание плотности рецепторов, которое к седьмым суткам превышало (p<0,01) в 1,9 раза исходные значения. А в случае формирования осложненного СВО, наоборот, отмечалось снижение уровня флюорисценции. Хотя уровень экспрессии CD62L и превышал исходные в 1,6 раза. 116 Таблица 19 – Динамика интенсивности флюоресценции рецепторов CD62L на субпопуляциях моноцитов CD14hiCD16- MIF CD/СВО до операции Неосложненный CD62L Осложненный 250,9 (160,3;360,3) 346,5 (211,9;509,0) 1-е сутки 7-е сутки после после операции операции 356,4 304,4 (202,0;700,4) (203,8;675,6) ** *** 428,7 623,8 (296,3;851,9) (263,6;816,5) ** *** до операции 74,9 (56,5;98,4) 71,8 (51,3;92,8) CD14dimCD16+ 1-е сутки 7-е сутки после после операции операции 104,0 140,9 (68,8;227,3) (60,6;172,1) ** *** 134,0 115,6 (65,3;259,6) (73,8;212,9) ** Примечания: * p=0,02 отличия между группами ** p<0,01 различия с предыдущим исследуемым периодом *** p<0,01 различия с исходным уровнем *** до операции 6,4 (3,6;8,0) 7,7 (4,6;10,5) 1-е сутки 7-е сутки после после операции операции 24,7 7,6 (12,9;45,6) (5,6;15,6) *, ** ** 43,0 11,0 (26,7;94,2) (7,6;22,8) *,** **, *** 116 CD62L CD14hiCD16+ 117 Несмотря на самую низкую плотность рецепторов CD62L на поверхности субпопуляции CD14dimCD16+, пожалуй, именно изменение этой фракции моноцитов можно признать наиболее значимым (таблица 19). Увеличение MIF на моноцитах пациентов с осложненным системным воспалительным ответом в первые сутки после операции было 5,6 кратным (p<0,01): с 7,7 (4,6;10,5) до 43,0 (26,7;94,2). В случае неосложненного течения послеоперационного периода увеличение экспрессии было менее выраженным (3,8 кратным), но, тем не менее, значимым (p<0,01). MIF увеличилась с 6,4 (3,6;8,0) до 24,7 (12,9;45,6). При этом уровень флюорисценции CD62L на минорной популяции был достоверно (p=0,02) ниже, чем таковой на моноцитах пациентов с осложненным СВО. В дальнейшем, плотность экспрессии снижалась на моноцитах пациентов обеих групп, однако в случае осложненного СВО уровень этот к седьмым суткам оставался повышенным (p<0,01) на 42,8% по сравнению с исходными значениями, а при «гладком» течении послеоперационного периода – достоверно не отличался (18,7%). Таким образом, развитие системного воспалительного ответа в первые сутки послеоперационного выполненного в периода условиях коронарного управляемой ишемии шунтирования, и реперфузии, сопровождается увеличением плотности селектиновых рецепторов на поверхности всех трех субпопуляций моноцитов. При этом в случае формирования осложненного СВО уровень поверхностной экспрессии на всех субпопуляциях более высокий, чем в случае неосложненного СВО. При этом в случае осложненного СВО к седьмым суткам на поверхности CD14hiCD16- моноцитов экспрессия CD62L продолжает повышаться, а на поверхности CD14hiCD16+ и CD14dimCD16+моноцитов - снижаться. На поверхности мембран лейкоцитов и эндотелиальных клеток присутствует в небольших количествах молекула клеточной адгезии ICAM-1 (CD 54). При этом ее уровень экспрессии стимулируется провоспалительными цитокинами, в частности ИЛ 1 и ФНО α. Основная 118 функция рецептора – способствование проникновению клеток из кровотока в ткани. Известно о повышенной экспрессии при ряде заболеваний, ассоциированных с воспалением, в первую очередь инфекционной природы [356]. В ряде случаев представляется обоснованным исследовать соотношение адгезионных рецепторов на поверхности клеток, в частности CD62L/CD54. При этом динамическое изменение этого соотношения может иметь диагностическое, и даже прогностическое значение [135]. Действительно, выраженность экспрессии CD54 на всех субпопуляциях моноцитов была крайне не высока (таблица 20). При этом наибольшая отмечалась на CD14dimCD16+ клетках. Послеоперационный период с развившимся СВО ассоциировался со снижением экспрессии ICAM-1 на всех субпопуляциях моноцитов. В первые сутки после операции на поверхности CD14hiCD16- моноцитов в случае неосложненного СВО уровень экспрессии снижался на 15%, в то время как в случае развития осложненного СВО – на 37%. К исходу недели на моноцитах пациентов обеих групп восстанавливался до исходных значений. На поверхности CD14hiCD16+ уровень экспрессии CD54 также снижался (p=0,04). При этом в случае неосложненного СВО в первые сутки после вмешательства этот показатель составлял 85% от исходного, а при осложненном СВО – 63%. Кроме того, в отсутствие осложнений к седьмым суткам экспрессия ICAM на поверхности CD14hiCD16+ моноцитов возвращалась к исходному уровню, а при осложненном СВО экспрессия продолжала снижаться, была ниже исходных значений (p<0,05). Уровень MIF составлял 24,75 (21,50;32,15). 119 Таблица 20 – Динамика интенсивности флюоресценции рецепторов CD54 на различных субпопуляциях моноцитов до и после операции CD14hiCD16- СВО до операции Неослож- 20,80 ненный (18,15;27,60) 20,80 ненный (18,60;22,50) 1-е сутки 7-е сутки 17,70 20,35 (14,80;19,70) (17,80;24,55) * 13,10 (11,60;16,90) * * 19,00 до операции 1-е сутки 33,75 CD14dimCD16+ 7-е сутки 28,60 31,55 до операции 1-е сутки 50,05 35,30 7-е сутки 43,97 (24,00;37,00) (26,50;41,90)(35,70;52,95) (30,40;39,35) (28,15;38,00) (42,75;56,55) * * * 36,60 26,20 24,75 45,40 33,20 46,40 (22,30;27,80) (21,50;32,15) (31,60;35,20)(38,95;57,05) (16,35;22,20) (31,00;37,30) (44,50;54,30) * ** * Примечания:* p<0,01 достоверность отличий с предыдущим исследуемым периодом ** p<0,05 достоверность отличий с исходным уровнем 119 Ослож- CD14hiCD16+ 120 Как уже было отмечено, уровень экспрессии CD54 на поверхности CD14dimCD16+ был наибольшим из всех субпопуляций моноцитов. И, так же как и в случае с другими субпопуляциями, экспрессия снижалась. Однако динамика этого снижения не отличалась в случае различного варианта течения СВО и в первые сутки после операции показатель MIF составлял 70,5% от исходного в случае неосложненного СВО и 73,1% в случае осложненного. Экспрессия ICAM на поверхности минорной CD14dimCD16+ субпопуляции на седьмые сутки послеоперационного периода не отличалась от исходных значений при любом из двух рассматриваемых вариантов течения системного воспалительного ответа. Установлено, что сывороточный уровень катехоламинов, в частности кортизола, а также их терапевтическое использование не оказывают влияние на уровень экспрессии CD54 на поверхности моноцитов [190]. Традиционно считается, что снижение уровня экспрессии поверхностных клеточных маркеров, в том числе CD54 и CD62, является следствием слущивания (шеддинга), и является признаком функциональной активности, миграции клеток, активности ферментов (в частности матриксных металлопротеиназ) [92; 327]. С другой стороны снижение экспрессии мембранных форм ICAM-1 сопровождалось снижением уровня растворимых форм (sICAM-1). Хотя и очевидно, что источником растворимых форм молекул межклеточной адгезии являются не только циркулирующие моноциты [53]. По-видимому, повышение экспрессии CD62L на поверхности моноцитов связано с необходимостью миграции клеток из кровотока в ткани. Выход клеток моноцитарного ряда является защитной реакций организма, однако с другой стороны, активность этих клеток очагах воспаления, а также в системном кровотоке является дополнительным фактором альтерации, трансформацией воспаления из локального в системное с формированием патогенетических связей и соответствующей клинической картины. Появление большого количества клеток с высокой экспрессии селектина 121 необходимо для облегченной миграции сквозь сосудистую стенку большого количества иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления. В дальнейшем, по мере разрешения системного воспаления и снижения потребности в такой миграции в периферическом кровотоке уменьшается количество моноцитов, равно как и снижается выраженность экспрессии селектина на их поверхности. Однако в случае формирования осложненного системного воспалительного ответа потребность в клетках с высокой экспрессией сохраняется, что подтверждается сохраняющейся (или даже повышающейся) MIF на поверхности «классических» и «патрулирущих» моноцитов. При этом, скорее всего, именно последняя популяция, не смотря на свою малочисленность в системном кровотоке, и незначительную количественную динамику в послеоперационном периоде, играет наибольшую роль в «экстренной» миграции моноцитов, а многочисленная популяция «классических» - представляет собой функциональный резервный пул. Таким образом, различная степень выраженности экспрессии рецепторов и разная динамика, отмеченная при исследовании периферических моноцитов у пациентов с разными вариантами течения системного воспалительного ответа, указывает на высокую значимость и вовлеченность клеток, несущих рецептор в патогенез СВО. Таким образом, полученные результаты демонстрируют участие клеточного иммунитета в реализации системного воспалительного ответа, развившегося после проведения коронарного шунтирования, выполненного в условиях управляемой ишемии и реперфузии. Реакция в виде лейкоцитоза (за счет увеличения количества гранулоцитов) сопровождается относительной и абсолютной лимфопенией. Последнее достигается за счет снижения количества всех основных популяций клеток: T-клеток (CD3+CD4+ и CD3+CD8+), В-клеток (CD3-CD19+) и NK-клеток (CD3-CD16+CD56+). Такое снижение объясняется высоким потреблением в очагах воспаления и, отчасти, выходом клеток в ткани. В последующем к седьмым суткам послеоперационного периода отмечается стабилизация популяционного 122 состава иммунокомпетентных клеток периферической крови (восстановление относительного и абсолютного количества). Однако описанные изменения являются достаточно грубыми и ожидаемыми. Для оценки более тонких механизмов развития системной воспалительной реакции необходимо исследование иных немногочисленных популяций клеток. Ранее высказывалось положение о значительном вкладе клеток моноцитарно-макрофагального периферической крови с ряда, а именно (CD14+CD16+) фенотипом в моноцитов патогенезе инфекционного и неинфекционного воспаления, в том числе системной воспалительной реакции [369]. В связи с этим дальнейшему изучению подверглись субпопуляции моноцитов с фенотипом (провоспалительные) и CD14hiCD16- CD14dimCD16+ (классические), CD14hiCD16+ (патрулирующие). Установлена целесообразность разделения моноцитов именно на 3 субпопуляции. При этом обоснованием для подобного деления кроме экспрессии CD14 и CD16 является разность в реагировании (изменения относительного и абсолютного количества клеток субпопуляций, экспрессии поверхностных клеточных рецепторов) в процессе развития разных вариантов системного воспалительного ответа после коронарного шунтирования, выполненного в условиях управляемой ишемии и реперфузии. Установлено, что в первые сутки после вмешательства происходит значительное увеличение количества CD14hiCD16+ клеток, при том, что популяции CD14hiCD16- и CD14dimCD16+ достоверно количественно не меняются, хотя и отмечается тенденция к увеличению абсолютного количества «классических» моноцитов у пациентов с осложненным СВО. По-видимому, тенденция связана с повышенной потребностью в пуле фагоцитирующих клеток в первую очередь у этой группы пациентов. Уменьшение количества «провоспалительных» цитокинпродуцирующих моноцитов к седьмым суткам послеоперационного периода демонстрирует депрессию напряжения процессов воспаления. Кроме 123 того, снижения пула этой популяции сопряжено со снижением уровня провоспалительных цитокинов в системном кровотоке. А увеличение пула «патрулирующих» CD14dimCD16+ (в первую очередь у пациентов с осложненным СВО) указывает на участие моноцитов в контроле за состоянием сосудистой стенки и возможной дисфункцией эндотелия, развивающейся в результате системного воспалительного ответа. Плотность поверхностных рецепторов, оцененная по средней интенсивности флюоресценции, в первые сутки после вмешательства снижалась в отношении ЛПС-специфичных CD14 на субпопуляции «классических» моноцитов, но повышалась на «патрулирующих». Однако наиболее значимым оказалось снижение плотности CD16 рецепторов на поверхности CD14dimCD16+ клеток. Мало того, MIF на моноцитах пациентов с осложненным СВО была достоверно выше, чем у пациентов с неосложненным СВО. Таким образом, подчеркивается значимость именно минорной CD14dimCD16+ субпопуляции в патогенезе системного воспаления. Ранние взаимодействия между моноцитами и эндотелиальными клетками играют важнейшую роль в регулировании пролиферации эндотелиоцитов. При этом эффекты моноцитов специфичны именно для эндотелиальных клеток, потому что контактное взаимодействие с гладкомышечными клетками медиаторных эффектов не вызывает [301] Одно из основных свойств и назначений циркулирующих моноцитов – это их способность мигрировать в ткани и превращаться в тканевые макрофаги. Для выполнения этой функции, в числе других, на поверхности клеток имеются CD62L. Именно этот маркер продемонстрировал наибольшую разницу в экспрессии у пациентов с разными вариантами течения системного воспалительного ответа и в первые сутки после вмешательства повышался на всех субпопуляциях моноцитов. Так, на поверхности CD14hiCD16- моноцитов у пациентов с осложненным СВО плотность рецепторов увеличивалась не только в первые сутки после вмешательства (как в случае неосложненного СВО), но и на седьмые сутки. 124 CD14dimCD16+ моноциты реагировали более значительным увеличением плотности рецепторов CD62L на своей поверхности в случае осложненного СВО по сравнению с неосложненным. При этом «положительный баланс» сохранялся и на седьмые сутки послеоперационного периода. Таким образом, изменение субпопуляционного состава моноцитов периферической крови имеет большое значение в патогенезе СВО, а преимущественное изменение уровня селектиновых рецепторов на их поверхности указывает способности этих клеток. на наибольшую значимость миграционной 125 ГЛАВА 6 ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА Дисбаланс цитокинов при системном воспалительном ответе. Ранее было высказано предположение об участие ряда цитокинов и их ингибиторов в патогенезе СВО [39; 89; 133; 321; 328]. Вместе с тем, предполагается, что характер реагирования цитокинов (соотношение ИЛ 1β и ИЛ 1RA, ФНО и ИЛ 10), наравне с природой СВО (инфекционный и неинфекционный), вовлечения триггерных рецепторов лейкоцитов (лиганды TOLL-подобных рецепторов или целые бактерии) будут иметь ключевое значение в оценке исходов и типа иммунного ответа [308]. Интерлейкин 1 рассматривается как один из основных и ключевых факторов развития иммунного ответа, в том числе при стерильном воспалении [230; 281; 312]. Интерлейкин 1 принято считать одним из основных регуляторов иммунного ответа. Он участвует в стимуляции синтеза цитокинов, а именно ИЛ 6, ФНО α, ИЛ 12, ИЛ 23, ИФН α, ИЛ 8, активации лимфоцитов, стимулирует экспрессию молекул адгезии на эндотелиоцитах, прокоагуляционную активность, активирует фагоцитоз, повышает активность NO-синтазы, усиливает метаболизм арахидоновой кислоты с увеличением продукции простогландинов, участвует в активации кроветворения и продукции белков острой фазы воспаления. ИЛ 1 проявляет нейрорегуляторную активность, участвую в регуляции температуры тела, синтеза гормонов гипоталама-гипофизарной системы. Кроме того, он является одним из основных звеньев трансформации местного воспаления в системное, в том числе и в развитии его осложненных форм. 126 Таблица 21 – Цитокиновый профиль пациентов до и после коронарного шунтирования Показатель СВО Неосложненный Осложненный ИЛ 1β, пг/мл ИЛ 1RA, пг/мл До операции 1 сутки 0,021 0,021 (0,020;0,023) (0,020;0,022) 0,021 0,021 (0,020;0.022) (0,020;0,022) 7 сутки 0,023 (0,021;0,024) 0,023 (0,021;0,028) 2053,00 2636,00 Неослож843,60 (1364,80;4096,00) (1358,60;3834,00) ненный (565,00;1412,60) *** *** 1801,80 865,70 (1357,40;3072,00) (423,60;1049,80) *** Неослож40,82 1,98 (0,65;2,39) ненный (20,22;111,76)*** ИЛ 6, пг/мл Ослож27,28 1,47 (0,51;2,14) ненный (10,58;54,90)*,*** Неослож7,04 1,00 (0,64;3,01) ненный (2,99;13,84)*** ИЛ 10, пг/мл Ослож2,64 6,73 ненный (0,82;5,41)* (2,87;16,18)*** Неослож3,14 (0,12;7,15) 5,60 (1,68;10,52) ненный ИЛ6/ИЛ10 Ослож0,38 (0,09;4,87) 2,97 (0,98;7,39) ненный Неослож14,06 6,19 ненный (7,45;47,62) (4,74;11,73)*** ИЛ 12, пг/мл Ослож67,74 8,77 ненный (15,87;115,10)* (6,71;26,44)*,*** Неослож0,15 (0,10;0,19) 0,14 (0,13;0,17) ненный ФНО α, пг/мл Ослож0,15 (0,14;0,19) 0,17 (0,15;0,27) ненный Неослож2,44 (2,28;2,54) 2,41 (2,21;2,55) ненный ИФН γ, пг/мл Ослож2,42 (2,28;2,53) 2,32 (2,08;2,48) ненный Примечания: * p<0,05 отличия между группами Осложненный 2312,00 (1886,80;2830,00) *** 6,76 (2,52;8,73)**, *** 2,61 (1,08;6,11)**, *** 1,31 (0,86;2,92)** 3,49 (1,50;4,84) *, ** 4,02 (1,07;13,76) 1,42 (0,22;5,02)* 16,63 (6,84;42,32) **, *** 45,43 (7,76;70,88) **, *** 0,13 (0,12;0,18) 0,15 (0,12;0,20) 2,41 (2,23;2,81) 2,29 (2,22;2,48) ** p<0,05 отличия с 1 сутками послеоперационного периода *** p<0,05 отличия с дооперационным уровнем 127 Известно, что массивная продукция ИЛ 1β и ИЛ 1α развивается при ишемии, а блокада сигнальных каскадов, связанных с ИЛ 1 может значительно снизить повреждение тканей и продукцию других цитокинов [77; 201; 208; 209]. Высвобождение одного из основных аларминов – интерлейкина 1α, развивающееся после некроза и индуцированной гипоксией клеточной гибели, является основным триггерным шагом в запуске воспалительного каскада [183]. При этом запуск этот реализуется через активацию нейтрофилов [313; 346]. С другой стороны предполагается, что инициированная инфламмосомами продукция макрофагами ИЛ 1β играет важную роль в поддержании местного воспаления [185]. В нашем исследовании интерлейкин 1β не продемонстрировал своей диагностической значимости (таблица 21). Его уровень в сыворотке крови пациентов не менялся в динамике периоперационного периода. Причем уровень этот был стабильным как у пациентов с осложненным, так и с неосложненным течением системного инициированного оперативным воспалительного вмешательством с ответа, использованием управляемой ишемии/реперфузии. В связи с этим вполне закономерен поиск других растворимых молекул, значимых при развитии неинфекционного системного воспалительного ответа. ИЛ 1 играет большую роль в развитии острого воспаления после ишемического и реперфузионного повреждения сердца, которое приводит к апоптозу и некрозу кардиомиоцитов. Антагонист рецептора интерлейкина 1 (ИЛ 1RA) является ингибитором эффектов ИЛ 1α и ИЛ 1β, ассоциированных с развитием воспаления. В экспериментальных работах показано, что ИЛ 1RA повышает толерантность миокарда к ишемическому и реперфузионному повреждению, а также снижает уровень апоптоза клеток [270]. Антагонист рецептора интерлейкина 1 расценивается как самый ранний чувствительный маркер противовоспалительной активности, в 128 первую очередь в случае отсутствия инфекционного компонента воспаления [100; 197]. Имеются данные об информативности уровня интерлейкина 6 и ИЛ 1RA как маркеров послеоперационных осложнений у пациентов, оперированных по поводу рака легкого [206]. При этом уровень ИЛ 1RA оказывался диагностически значимым уже в первые сутки послеоперационного периода, а ИЛ 6 – к 7 суткам. Эти результаты подтверждают перспективность ИЛ 1RA как раннего и чувствительного маркера в оценке послеоперационного периода у пациентов после полостных вмешательств с развившимся СВО. При обследовании пациентов с ишемическим инсультом было установлено, что повышенный уровень кортизола, ИЛ 10, ИЛ 1RA и сниженное количество состоявшегося лимфоцитов события были в период ассоциированы до 72 часов с риском после развития последующей инфекции. При этом только уровень ИЛ 1RA оказался независимым признаком, ассоциированным с риском развития инфекционных осложнений [283]. Исходный уровень рецепторного антагониста интерлейкина 1 у пациентов двух групп не различался и составлял 843,60 (565,00;1412,60) пг/мл в случае последующего неосложненного течения и 865,70 (423,60;1049,80) пг/мл в случае осложненного (таблица 21). В первые сутки после операции уровень аналита достоверно (p<0,01) повышался до 2053,00 (1364,80;4096,00) пг/мл и 1801,80 (1357,40;3072,00) пг/мл соответственно. На этом этапе уровень так же не различался. При этом прирост уровня ИЛ 1RA был практически одинаковым. В случае неосложненного течения – 2,43 раза, а при осложненном СВО – в 2,08 раза относительно исходных значений. На седьмые сутки послеоперационного периода у пациентов с неосложненным течением уровень аналита превышает исходный в 3,12 раза, а в случае купированных осложнений – в 2,67 раза. 129 С другой стороны в случае развития тяжелых осложнений, а именно синдрома полиорганной недостаточности динамика маркера была иная. Исходный уровень у пациентов этой группы составлял 789,90 (503,00;1003,20) пг/мл. Уже на утро первых суток послеоперационного периода уровень аналита повышался в 4,36 раза по сравнению с исходным и составлял 3444,00 (2514,00;6570,00) пг/мл. Повышение это более выраженное, чем в случае неосложненного СВО и осложненного СВО, которое можно расценивать как пограничный или абортивный процесс. К седьмым суткам уровень ИЛ 1RA по прежнему превышал исходные значения в 4,87 раза и составлял 3846,00 (2533,00;4892,00) пг/мл. Таким образом, динамика не провоспалительного интерлейкина 1β, а его рецепторного антагониста является наиболее значимой в случае развития осложненного и неосложненного системного воспалительного ответа после оперативного вмешательства на сердце с применением управляемой ишемии и реперфузии. При этом прирост сывороточного уровня рецепторного антагониста интерлейкина 1 оказывается более выраженным в случае неуправляемого течения СВО и формирования что интерлейкин полиорганной недостаточности. Традиционно считается, 6 является провоспалительным цитокином. Однако при обследовании здоровых доноров было установлено, что ИЛ 6 в физиологических концентрациях стимулирует противовоспалительную, а не провоспалительную активность. При этом ИЛ 6 самостоятельно, без участия ФНО стимулирует повышение уровня ИЛ 1RA и ИЛ 10. Кроме того, ИЛ 6 стимулирует повышение уровня кортизола, повышение количества циркулирующих нейтрофилов и снижение количества лимфоцитов [186]. Интраоперационная динамика, а также изменения уровня интерлейкинов 6 и 10 были описаны ранее в главе 3. Исходный дооперационный уровень интерлейкина 6 у пациентов разных групп не различался и составлял 1,98 (0,65;2,39) пг/мл при 130 неосложненном СВО и 1,47 (0,51;2,14) пг/мл в случае дальнейшего развития осложненных форм системного воспаления. Традиционно интерлейкин 6 демонстрирует быстрое реагирование на повреждение с достаточно длительным сохранением повышенного уровня в сыворотке крови. В первые сутки послеоперационного периода в отсутствие явных клинических различий отмечалась достоверная (p<0,05) разница уровня ИЛ 6 у пациентов двух групп. При этом у пациентов с неосложненным течением он был выше (40,82 (20,22;111,76) пг/мл), чем у пациентов с осложненным СВО (27,28 (10,58;54,90) пг/мл). К исходу седьмых суток уровень цитокина закономерно снижается. У пациентов с неосложненным СВО до 6,76 (2,52;8,73) пг/мл, а с осложненным – до 2,61 (1,08;6,11) пг/мл. Характерной особенностью динамического профиля ИЛ 6 у пациентов разных групп можно считать более слабый ответ одного из основных провоспалительных цитокинов у пациентов с осложненным течением СВО. По-видимому, сниженное реагирование на операционный стресс и ишемию/реперфузию является одним из патогенетических звеньев перехода системного воспалительного ответа к его осложненным формам. При этом можно отметить, что уровень интерлейкина 6 у пациентов разных групп к седьмому дню послеоперационного периода снижался, но оставался повышенным значениями. Таким воспалительного (p<0,01) образом, маркера, ИЛ быстро в сравнении 6 с дооперационными подтверждает реагирующего на свое значение стресс, но и сохраняющего свои повышенные значения в течение продолжительного времени, даже в отсутствие триггера. Противовоспалительный интерлейкин 10 давно рассматривается как диагностически и прогностически более значимый маркер выраженности воспалительной реакции и связанной с ней клинической картиной. При этом установлено, что уровень интерлейкина 10 гораздо быстрее реагирует на ишемические и реперфузионные повреждения, операционный стресс. В то же 131 время его уровень как быстро повышается, так и стремительно снижается в случае отсутствия либо прекращения действия триггерного фактора. Известно, что ИЛ 10 может ингибировать продукцию ФНОα и ИЛ 6 макрофагами [184]. При исследовании инфекционного СВО было установлено отсутствие диагностически значимого повышения ИЛ 10 и TGF β, в отличие от ИЛ 4 [79]. Хотя другие авторы [117; 287] находили достоверное увеличение уровня ИЛ 10, ИЛ 6, ИЛ 8 и TNF α у пациентов с сепсисом и септическим СВО. При чем уровни ИЛ 6 и ИЛ 10 позиционировались как критические и прогностически наиболее значимые. В нашем исследовании исходный дооперационный уровень ИЛ 10 у пациентов с последующим неосложненным и осложненным СВО отличался (p<0,05). При этом у пациентов в первом случае он составил 1,00 (0,64;3,01) пг/мл, а во втором - 2,64 (0,82;5,41) пг/мл. Динамика уровня цитокина в интраоперационном и раннем (первые сутки) послеоперационном периоде была описана ранее. К исходу первых суток у пациентов обеих групп уровень ИЛ 10 был повышен (p<0,01) относительно исходных значений, однако достоверно не различался и составлял 7,04 (2,99;13,84) пг/мл в случае неосложненного СВО и 6,73 (2,87;16,18) пг/мл в случае осложненного течения. При этом в первой группе повышение было 7-кратным, а во второй – 2,5-кратным. Дальнейшее течение послеоперационного периода характеризовалось продолжающимся снижением показателей уровня цитокина. К седьмым суткам уровень ИЛ 10 в обеих группах не отличался от исходных значений. При этом, так же как и в предоперационном периоде, уровень аналита у пациентов с осложнениями в послеоперационном периоде достоверно (p<0,01) превышал таковой у пациентов первой группы. Не смотря на, казалось бы, низкую информативность ИЛ 10 в качестве маркера наступающих осложнений послеоперационного периода, его нельзя списывать со счетов. В случае начала синдрома полиорганной 132 недостаточности и развития системной тканевой деструкции (по Черешневу В.А.) его уровень значительно возрастает. Таким образом, ИЛ 10 уже исходно был повышен у пациентов в случае развития осложненного СВО после коронарного шунтирования, выполненного в условиях управляемой ишемии и реперфузии. Динамика уровня цитокина у пациентов с неосложненным СВО принципиально не отличается от таковой у пациентов с признаками осложненного ответа. В то же время развитие полиорганной недостаточности сопровождается гиперэргической реакцией с более чем 16-кратным повышением уровня интерлейкина 10 уже к исходу первых суток после вмешательства. Исследования последнего времени продемонстрировали высокую патогенетическую значимость интерлейкина 12. В частности, было установлено, что именно этот цитокин участвует в инициации атеросклероза и ассоциируется с повышенной ригидностью артериальной стенки [207]. Есть указания на высокую значимость интерлейкина 12 при оценке тяжести и прогноза инфаркта миокарда [13] Ряд авторов предполагает, что интерлейкин 12 играет ключевую роль в развитии иммунных нарушений после механического повреждения, связанного с оперативным вмешательством и травмой. В результате происходит снижение экспрессии и сигналинга интерлейкина 12 и повышение экспрессии T-регуляторных клеток (Treg) [232]. При обследовании пациентов, оперированных по поводу аневризмы брюшной аорты с длительным периодом интраоперационной ишемии и последующей реперфузией было отмечено снижение уровня интерлейкина 12 через сутки после вмешательства. При этом на основании сравнения интра- и послеоперационной динамики уровня цитокина с таковым у пациентов, оперированных без эпизода ишемии и реперфузии, было установлено, что оперативная травма приводила к повышению уровня аналита, а ишемические и реперфузионные повреждения - к его снижению. Кроме того, было высказано предположение, требующее дополнительного изучения, что 133 снижение уровня ИЛ 12 после операций с управляемой ишемией и реперфузией может быть связано с более высоким риском послеоперационных осложнений [136]. В нашем исследовании исходный уровень интерлейкина 12 у пациентов с осложнившимся и неосложнившимся в последующем послеоперационным СВО различался (p<0,01). При этом у пациентов с осложненным СВО он был выше (67,74 (15,87;115,10) пг/мл), чем у пациентов с неосложненным послеоперационным периодом (14,06 (7,45;47,62) пг мл). Так же как и в случае с интерлейкином 10 отмечается достоверное отличие исходного уровня цитокина в направлении повышения у пациентов с последующим осложнившимся послеоперационным периодом. В первые сутки после вмешательства уровень цитокина снижается у пациентов обеих групп. При этом в случае неосложненного СВО значения ИЛ 12 снижались в 2,2 раза, а в случае осложнений – в 7,7 раза. К исходу первых суток послеоперационного периода уровень цитокина достоверно (p=0,05) отличался и был более высоким в случае осложненного СВО (8,77 (6,71;26,44) пг/мл), чем в случае неосложненного СВО - 6,19 (4,74;11,73) пг/мл. Полученные данные указывают на то, что более высокий уровень ИЛ 12 в первые сутки после вмешательства с использованием управляемой ишемии и реперфузии оказывается менее благоприятным в плане развития осложнений. Притом, что, учитывая повышенный исходный уровень цитокина, динамика снижения в первые сутки была более значительная именно у пациентов с осложнившимся течением послеоперационного периода. К седьмым суткам уровень ИЛ 12 опять повышается у пациентов обеих групп. При этом в случае отсутствия осложнений уровень этот оказывается выше дооперационного (p<0,05), а в случае осложненного СВО оказывается ниже дооперационного (p<0,01). Ряд исследователей указывали на то, что в послеоперационном периоде снижается продукция ИЛ 12 моноцитами и макрофагами, что, в свою 134 очередь, приводит к снижению продукции ИФН γ [212]. Было высказано предположение, что продукция ИФН γ снижается после проведения операций на сердце и связана она с развивающейся в послеоперационном периоде иммуносупрессией [289; 339]. Однако в нашем исследовании не было выявлено значимых изменений в уровне интерферона γ как в динамике периоперационного периода, так и у пациентов разных групп во всех точках исследования. Фактор некроза опухоли является одним из основных провоспалительных цитокинов, участвующих в регуляции иммунного ответа. Кроме этого, ФНО α ингибирует АКТГ-зависимую (адренокортикотропный гормон) продукцию кортизола, что является важным патогенетическим звеном развития СВО [367]. В эксперименте по моделированию системного воспалительного ответа при использовании экстрокорпоральной мембранной оксигенации было зафиксировано значительное увеличение уровня сывороточного ФНО α и ИЛ 8 в течение первых 2 часов от начала проведения вмешательства [278]. Притом, что их уровень в тканях увеличивался незначительно. Увеличение сывороточного уровня цитокинов связано с дегрануляцией тучных клеток и выходом из них ранее синтезированных молекул. В тоже время известно, что происходит снижение продукции ФНО моноцитами, активированными эндотоксином [308], что также является проявлением иммуносупрессии, связанной с СВО. Тем не менее, в нашем исследовании сывороточный уровень фактора некроза опухоли α оставался стабильным в динамике периоперационного периода и у пациентов разных групп не различался. Полученные результаты ставят под сомнение значимость сывороточного ИФН γ и ФНО α в патогенезе системного воспалительного ответа. Таким образом, не смотря на ожидания, «привычные» цитокинымаркеры воспаления (ИЛ 1β, ФНО α, ИФН γ) не продемонстрировали 135 динамических изменений у пациентов с осложненным и неосложненным СВО, инициированным коронарным шунтированием, выполненным в условиях управляемой ишемии и реперфузии. С другой стороны, изменение уровня рецепторного антагониста интерлейкина 1 в динамике периоперационного периода указывает на его значительный вклад в патогенез системного сывороточного уровня воспалительного рецепторного ответа. При антагониста этом прирост интерлейкина 1 оказывается более выраженным в случае неуправляемого течения СВО и формирования полиорганной недостаточности и может иметь большую диагностическую и прогностическую значимость. Такая динамика уровня рецепторного антагониста (при полном отсутствии динамических изменений сывороточногоИЛ 1β) может быть связана с достаточно массивным повреждением клеток, связанным с ишемическими и реперфузионными повреждениями, и, как следствие, массивному выходу аларминов. При этом одним из основных является внутриклеточный интерлейкин 1α. Сывороточный уровень интерлейкина 6 – одного из основных провоспалительных цитокинов, отличался у пациентов разных групп в динамике послеоперационного периода. При этом, у пациентов с осложненным СВО динамика прироста не такая выраженная как у пациентов с неосложненным СВО и у пациентов с полиорганной недостаточностью. Повидимому, сниженное реагирование на операционный стресс и ишемию/реперфузию является одним из патогенетических звеньев перехода системного воспалительного ответа к его осложненным формам. Динамика уровня интерлейкина 10 у пациентов с неосложненным СВО принципиально не отличается от таковой у пациентов с признаками осложненного ответа. В то же время развитие полиорганной недостаточности сопровождается гиперэргической реакцией с более чем 16-кратным повышением уровня интерлейкина 10 уже к исходу первых суток после вмешательства. Подтверждается предположение о значимости степени 136 выраженности реакции цитокинового статуса в патогенезе СВО и его осложненных форм. Уровень ИЛ 12 у пациентов с осложненным и неосложненным СВО также изменялся неодинаково. Более высокий уровень ИЛ 12 в первые сутки после вмешательства с использованием управляемой ишемии и реперфузии оказывается менее благоприятным в плане развития осложнений. Динамика снижения в первые сутки была более значительная именно у пациентов с осложнившимся течением послеоперационного периода. Обращает на себя факт различия исходного уровня ряда цитокинов у пациентов с последующим осложненным и неосложненным течением послеоперационного периода. Так, уровень ИЛ 10 и ИЛ 12 до вмешательства был достоверно выше у пациентов с осложненным СВО. и это при том, что у пациентов исходно не было обнаружено достоверных клинический различий в степени органных дисфункций и тяжести течения основного заболевания. Подтверждается высокая не только диагностическая но и прогностическая значимость ИЛ 10 и ИЛ 12 в развитии СВО. При этом, по-видимому, эти изменения связаны с активностью моноцитарно-макрофагального звена иммунитета. Участие протеолитических лизосомальных ферментов в патогенезе системного воспалительного – ответа. металлопротеиназ (ММР) важных ремоделировании экстрацеллюлярного Значение ферментов, матрикса в матриксных участвующих в прогрессировании атеросклеротического процесса активно изучается многими исследователями [57; 85]. Известно их участие в развитии атеросклеротической бляшки, провокации ее нестабильности и разрыва. Также они участвуют и в ремоделировании нормальных тканей, в том числе после оперативных вмешательств. В то же время есть указания на то, что активность ММР 137 может провоцироваться ишемией и реперфузией и может ассоциироваться с рядом осложнений послеоперационного периода [124]. Известно участие лизосомальных ферментов, а именно металлопротеиназ, в процессах острого и хронического воспаления при различных заболеваниях [240; 244]. При этом в ряде случаев уровень металлопротеиназ и их ингибиторов может выступать в качестве маркера активности воспалительного процесса [325]. При изучении динамики воспалительного процесса после кардиохирургических операций с использованием ИК установлено, что послеоперационный период ассоциируется с повышенным сывороточным уровнем TIMP-1 и ММР-9. Кроме того, это повышение связывают с послеоперационными процессами репарации. Однако в более позднем периоде (до 30 суток) повышенный уровень ММР-9, равно как и соотношение ММР-9/TIMP-1 уже не связано с интраоперационными изменениями активности металлопротеиназ [326]. Исходные значения сывороточного proММР-1 (коллагеназы) у пациентов с осложненным и неосложненным СВО достоверно не отличались (таблица 22). Однотипной была динамика в послеоперационном периоде. Если в первые сутки после вмешательства отмечалось умеренное снижение (p<0,01) уровня неактивной протеаза, то к с седьмым суткам зафиксирован значительный прирост. При этом в случае неосложненного течения послеоперационного периода этот прирост был 2,5-кратным относительно исходных значений, а в случае осложненного СВО – 2,2-кратными. Повидимому, повышение уровня proMMP-1 связано с активностью макрофагов и эндотелиальных клеток [63; 235]. Однако связи с уровнем фактора некроза опухоли α, по крайней мере с его сывороточным уровнем, отмечено не было поскольку значения этого цитокина не изменялись у пациентов с осложненным и неосложненным СВО в течении послеоперационного периода. 138 Таблица 22 – Уровень матриксных металлопротеиназ у пациентов с СВО до и после операции коронарного шунтирования Показатель СВО НеосложproMMP-1, ненный нг/мл Осложненный До операции 1 сутки 7 сутки 5,00 (2,71;8,11) 15,71 (6,09;26,25) ** **, *** 3,21 (2,23;6,16) 12,80 (6,63;31,15) 5,75 (3,57;12,44) ** **, *** 20,34 Неослож9,08 (5,64;22,20) 15,20 (8,57;29,39) (12,73;40,21) **, ненный ** *** MMP-3, нг/мл 17,77 Ослож9,45 (7,47;18,98) 8,83 (4,37;19,07) (13,49;23,14) **, ненный *** 771,20 562,60 Неослож263,19 (342,92;1182,00) (202,36;1171,00) ненный (186,66;476,60) ** ** MMP-9, нг/мл 659,75 750,95 Ослож304,40 (305,68;1250,00) (528,00;999,20) ненный (138,84;554,70) ** ** 623,25 Неослож475,12 472,80 (540,50;1033,50) ненный (359,60;738,00) (371,30;908,50) TIMP-1, ** нг/мл Ослож428,45 458,50 557,00 ненный (319,42;554,75) (335,60;732,00) (484,20;763,50) Неослож83,00 68,45 68,10 (63,65;76,75) ненный (68,05;104,35) ** (65,80;78,30) ** TIMP-2, нг/мл Ослож76,10 76,00 72,80 (67,55;78,05) ненный (65,90;109,65) (66,00;90,25) * Неослож1,03 0,56 0,62 (0,27;1,07) ненный (0,44;2,46) ** (0,22;2,03) *** MMP9/TIMP-1 Ослож0,99 1,14 0,67 (0,27;1,14) ненный (0,31;2,23) *** (0,58;1,75) ** Неослож19,01 14,39 6,12 (3,82;13,05) ненный (9,99;21,76) ** (10,26;18,90) ** MMP9/TIMP-2 Ослож10,43 10,34 6,34 (3,59;6,97) ненный (7,84;16,42) ** (6,45;13,76) ** Примечания: * p<0,05 отличий между группами 6,26 (4,49;10,56) ** p<0,05 отличия с дооперационным уровнем *** p<0,05 отличий с 1 сутками послеоперационного периода 139 Исходный уровень ММР-3 (стромелизин) отличался недостоверно (p=0,06). Однако у пациентов с развившимся в последствии осложненным СВО имелась тенденция к более низким значениям показателя. В первые сутки после операции в случае неосложненного СВО отмечалось 1,7-кратное снижение уровня металлопротеиназы, в то время как при зафиксированных осложнениях такой динамики отмечено не было. В тоже время за счет достаточно большой разницы в исходных значениях и выраженной динамики уровня протеазы у пациентов с неосложненным течением в первые сутки после операции показатели сывороточного уровня ММР-3 не различались. Так же как и в случае proMMP-1 на седьмые сутки послеоперационного периода отмечается уверенное увеличение уровня ММР-3 у пациентов обеих групп, причем этот уровень превышал исходные значения. Тем не менее, отсутствие изменения сывороточного стромелизина в первые сутки послеоперационного периода у пациентов с осложненным течением СВО указывает воспаления, на возможное участие ММР-3 развивающегося после в патогенезе системного оперативных вмешательств с использованием управляемой ишемии и реперфузии. Синтез и секреция металлопротеиназ находится под контролем цитокинов, интегринов и химических агентов, таких как липополисахарид, простагландин Е. При этом основными их продуцентами являются активированные макрофаги, нейтрофилы, фибробласты, а активация синтеза происходит преимущественно под воздействием провоспалительных цитокинов [96; 118; 134]. Учитывая результаты нашего исследования, где показано, что у пациентов с осложненным СВО после операций на открытом сердце, выполненной в условиях управляемой ишемии и реперфузии, отмечается изменение цитокинового профиля в сторону снижения активности провоспалительных цитокинов, становится объяснимым и понятным факт пониженной активности сывороточных металлопротеиназ, в частности ММР- 140 3. При том, что триггером к запуску цитокинового каскада, активации нейтрофилов и макрофагов является повреждение клеток с выходом аларминов, продуктов апоптоза в органах и тканях [56]. Имеет место пониженная цитокиновая активация продукции протеаз эффекторными клетками (активированными макрофагами, нейтрофилами, фибробластами) в первые сутки послеоперационного периода. ММР-9 относится к классу желатиназ, активно участвующих в разрушении промежуточного коллагена. Известно, что активность этой металлопротеиназы повышена в очаге воспаления и напрямую связана с количеством лейкоцитов и макрофагов [204]. Ингибирование ММР-9 (желатиназа) при экспериментальном инсульте и стерильном СВО приводило к снижению негативных проявлений системного воспаления, таких как повреждение головного мозга, отека, неврологического дефицита. Таким образом демонстрируется важное значение ММР-9 в патогенезе СВО [238] Установлено, что при ишемическом инсульте уровень ММР-9 и ММР-2 достоверно увеличивается, в то время как уровень TIMP-2 снижался [286]. Регулирование активности ММР-9 осуществляется не только за счет цитокинов, но также за счет неустойчивой системы оксидант/антиоксидант, действием гормонов [181; 309; 329]. Так, пероксинитрит, образующийся сразу после реперфузии миокарда может значительно повышать активность ММР-9 [277]. Матриксные металлопротеиназы выступают в качестве эффекторов окислительного стресса, развивающегося при проведении искусственного кровообращения [267]. Подтверждением важного участия окислительного стресса в развитии воспаления в миокарде после управляемой ишемии и реперфузии является эффективность использования антиметаболита и антиоксиданта пируват при проведении кардиоплегии. В результате уменьшается нейтрофильная инфильтрация миокарда, повышается уровень TIMP-2 и не регистрируется ожидаемое повышение ММР-9 [295]. 141 Ранее было показано, что при реперфузии после ишемии миокарда значительно увеличивается выход ММР-9 в кровь. При этом уровень желатиназы положительно коррелировал с длительностью периода ишемии и отрицательно с механической функцией миокарда [214]. Все эти результаты указывают на участие ММР-9 в ремоделировании миокарда после управляемой ишемии и реперфузии и на потенциальное участие этой протеазы в процессах воспаления, инициированных тем же фактором. Исходный сывороточный уровень ММР-9 у пациентов не различался. Через сутки после операции уровень ММР-9 повышался у пациентов обеих групп (p<0,01). При этом в случае неосложненного СВО это увеличение было более выраженным – в 2,9 раза, а при наличии осложненного СВО – менее выраженным – в 2,1 раза. На седьмые сутки послеоперационного периода характер динамики менялся. В случае отсутствия осложнений, у пациентов отмечалась тенденция к снижению уровня металлопротеиназы (p=0,23). В случае развития осложнений концентрация ММР-9 в сыворотке крови фактически не менялась (p=0,94) и достигала 750,95 (528,00;999,20) нг/мл. Таким образом, из изучаемых металлопротеиназ только сывороточный уровень ММР-9 увеличивался в первые сутки послеоперационного периода (в отличие от proMMP-1 и ММР-3), а к седьмым суткам послеоперационного периода оставался на высоком уровне, превышающем исходные. Это согласуется с указанием, что ММР-9 в значительном количестве выделяется в миокарде в первый час реперфузии [237]. Кроме того, у пациентов с неосложненным СВО имелась тенденция к снижению уровня желатиназы, в отличие от такового у пациентов с осложненным СВО. По-видимому, процесс системного воспаления приводил, в том числе, и к повышенной активности металлопротеиназ (по крайней мере, ММР-9), которая, в свою очередь, может участвовать как в процессах послеоперационного ремоделирования миокарда, так и в прогрессировании атеросклеротического процесса и дестабилизации бляшки, в том числе 142 некоронарной локализации. Кроме того, ММР-9 участвует в реакции шединга (слущивания) рецепторов с поверхности клеток (в частности TREM1), что приводит к накоплению в кровотоке большого количества растворимых форм, активно участвующих в развитии и поддержании системной воспалительной реакции [26]. Таким образом, зафиксирована взаимосвязь между уровнем ММР-9 и развитием послеоперационных осложнений, связанных с системным воспалением и органными дисфункциями у кардиохирургических больных. Естественными антагонистами металлопротеиназ являются их тканевые ингибиторы (TIMP) и α2-макроглобулин [261; 322]. При этом TIMP могут ингибировать все известные металлопротеиназы, но обладают некоторой избирательностью. К примеру, TIMP-1 плохо ингибирует MT1MMP, MT3-MMP, MT5-MMP и MMP-19 [347]. TIMP-1 обладает меньшей гомологией, чем TIMP-2 и TIMP-4, которые обладают большим взаимным сродством [247]. В связи с этим вполне ожидаема разница в активности металлопротеиназ после ишемии и реперфузии. Кроме того, активность TIMP-1 регулируется различными цитокинами и ростовыми факторами, в то время как TIMP-2 и TIMP-4 подвержены этим влияниям в меньшей степени [349]. Однако TIMP-1 является одним из основных блокаторов протеиназ. При экспериментальном моделировании ишемии и реперфузии миокарда было показано, что удаление ММР-9 и повышение уровня TIMP-1 приводит к уменьшению зоны инфаркта, что еще раз показывает высокую патогенетическую значимость матриксных металлопротеиназ (и вообще активности нейтрофилов их экспрессирующих) и их тканевых ингибиторов при ишемических и реперфузионных повреждениях, а также сопровождающих их процессах воспаления [258]. После инфаркта миокарда отмечается преимущественное увеличение уровня ММР-9. TIMP-1 умеренно увеличивается в первые сутки после инфаркта, в то время как TIMP-2 увеличивается преимущественно в 143 отдаленные сроки после события. При этом динамика соотношений MMP/TIMP могут иметь как диагностическое, так и прогностическое значение [332]. Было установлено, что проведение управляемой ишемии и реперфузии миокарда при выполнении операций по реваскуляризации сопровождалось снижением активности TIMP-1. При этом уровень этого тканевого ингибитора обратно коррелировал со временем пережатия аорты и прямо с механической функцией сердца [214]. В нашем исследовании исходный уровень тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 в группах пациентов с неосложненным и осложненным СВО не отличался и составлял соответственно 475,12 (359,60;738,00) нг/мл и 428,45 (319,42;554,75) нг/мл (таблица 22). В первые сутки после операции концентрация TIMP-1 в сыворотке пациентов двух групп также не различалась, равно, как не было отмечено и динамики по сравнению с исходным уровнем. Патогенетическая значимость этого факта становится особенно важной на фоне достоверного значительного прироста уровня ММР-9. Лишь на седьмые сутки послеоперационного периода отмечается достоверное (p<0,05) увеличение уровня TIMP-1, но только у пациентов с неосложненным СВО. В то время как в случае развития осложнений отмечается лишь статистически недостоверная тенденция к повышению этого показателя. Уровень TIMP-1 на седьмые сутки послеоперационного периода составляет 623,25 (540,50;1033,50) нг/мл и 557,00 (484,20;763,50) нг/мл в группах пациентов с неосложненным и осложненным СВО соответственно. Повышение уровня тканевых ингибиторов матриксных протеиназ является сдерживающим, лимитирующим фактором чрезмерной деструктивной активности самих протеаз. При этом тканевые ингибиторы оказываются последней линией регуляции при недостаточной эффективности эпигенетических, биохимических, антиоксидантных механизмах регуляции. 144 По-видимому, одной из причин недостоверной положительной динамики уровня TIMP-1 является течение собственно управляемой ишемии и реперфузии и проводимой кардиоплегии. Ранее нами было показано, что именно у пациентов с осложнившимся в послеоперационном периоде СВО уже в процессе вмешательства отмечалось снижение уровня лактата, и малонового диальдегида в крови коронарного синуса. Эти аналиты могут выступать в качестве миокардиальной маркеров гипоксии и выраженности окислительного интраоперационной стресса. Кроме того, подтверждением этого предположения может являться динамика уровня ишемия-модифицированного альбумина (ИМА), который в значительной степени снижается в первые сутки послеоперационного периода, причем в большей степени у пациентов с осложненным СВО. Этот маркер также отражает выраженность окислительного стресса и ассоциированного с ним клеточного повреждения. После ишемии и реперфузии миокарда развивается дисбаланс ММP и TIMP, который, в первую очередь, связан с повышенной активностью матриксных металлопротеиназ. Кроме того, ингибиторная активность TIMP может резко уменьшаться вследствие гиперпродукции пероксинитрита как результата окислительного стресса, сопровождающего ишемию и реперфузию [191; 214]. В экспериментальных работах было показано, что размер инфаркта миокарда не коррелирует с тканевым соотношением ММР/TIMP [352]. Для оценки баланса между уровнем матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов чаще всего используют соотношение MMP-9/TIMP-1. По данным исследователей [305] в группе здоровых доноров этот показатель составил 0,11±0,03. 145 СВО 3 * ** * осложненный СВО 2,5 ** *** 2 1,5 1 0,5 0 До операции 1 сутки после операции 7 сутки после операции * p<0,01 по сравнению с предыдущим исследуемым периодом ** p<0,05 по сравнению с предыдущим исследуемым периодом *** p<0,01 по сравнению с дооперационным уровнем Рисунок 14 – Динамика соотношения ММР-9/TIMP-1 у пациентов с осложненным и неосложненным СВО после коронарного шунтирования В нашем исследовании (рисунок 14) у пациентов обеих групп исходно это соотношение не различалось и составляло 0,62 (0,27;1,07) и 0,67 (0,27;1,14) в случае неосложненного и осложненного СВО соответственно. По-видимому, преобладание TIMP-1 связано с основным хроническим процессом (атеросклерозом), воспалительного генеза. Этим объясняется различие с балансом, наблюдаемым у здоровых доноров. В первые сутки после вмешательства отмечается однонаправленная динамика ММР-9/TIMP-1 у пациентов обеих групп. У пациентов с неосложненным СВО соотношение увеличивается (p<0,01) до 1,03 (0,44;2,46), а в случае развивающихся осложнений – до 0,99 (0,31;2,23) (p<0,05). А вот в дальнейшем, к седьмым суткам динамика изменения соотношения протеиназа/ингибитор менялась. Если в случае неосложненного течения послеоперационного периода этот показатель снижался и 146 возвращался к исходному осложненного СВО уровню отмечалось (0,56 (0,22;2,03)), повышение, то в достоверно случае (p<0,01) отличающееся от исходных значений – 1,14 (0,58;1,75). 120 нг/мл Неосложненный * Осложненный 100 * ** 80 60 40 20 0 До операции 1 сутки 7 сутки * p<0,01 по сравнению с предыдущим исследуемым периодом ** p<0,05 достоверность отличий между группами Рисунок 15 – Динамика уровня TIMP-2 при разных вариантах течения СВО Показательной оказывается динамика TIMP-2 (рисунок 15). Притом, что исходный уровень этого тканевого ингибитора у пациентов двух групп не различался: 68,10 (63,65;76,75) нг/мл (неосложненный СВО) и 72,80 (67,55;78,05) нг/мл (осложненный СВО), динамика уровня в послеоперационном периоде различалась. У пациентов с осложненным СВО на первые и на седьмые сутки после операции динамика уровня показателя отсутствовала: 76,10 (65,90;109,65) нг/мл и 76,00 (66,00;90,25) нг/мл соответственно. В послеоперационным тоже время периодом уже у пациентов в первые с неосложненным сутки зафиксировано достоверное (p<0,01) увеличение показателя до 83,00 (68,05;104,35) нг/мл. В дальнейшем, к исходу первой недели уровень TIMP-2 снижался и уже не отличался от исходных дооперационных значений – 68,45 (65,80;78,30) 147 нг/мл. Важно отметить, что в этот период у пациентов с осложненным и неосложненным течением СВО достоверно (p=0,009) различался сывороточный уровень тканевого ингибитора металлопротеиназы 2. Соотношение ММР-9/TIMP-2 менялось в сторону увеличения у пациентов обеих групп (p<0,01). Причем увеличение это более выраженное у пациентов с неосложненным СВО: с 6,12 (3,82;13,05) до 19,01 (9,99;21,76). В то время как в случае осложненного периода – с 6,34 (3,59;6,97) до 10,43 (7,84;16,42). При этом соотношение оставалось на том же уровне у пациентов обеих групп и на седьмые сутки послеоперационного периода. Таким образом, после выполненной операции коронарного шунтирования в условиях искусственного кровообращения демонстрируется повышенная, по сравнению с дооперационной, активность металлопротеиназ и пониженная активность их ингибиторов в большей степени у пациентов с неосложненным СВО. Подтверждается гипотеза о развитии СВО при пониженной активности иммунной системы и связанных с ее активностью механизмов, к числу которых относится активность протеаз, индуцированная ишемией и реперфузией с развитием окислительного стресса и повреждением клеток. Катепсины и их естественный ингибитор. Катепсины относятся к семейству цистеиновых протеаз, локализующихся в лизосомах и эндосомах и функционирующих внутриклеточных в или направлении деградации фагоцитированных нежелательных протеинов. Катепсины представляют собой достаточно гетерогенную группу ферментов. На основе специфики их субстратов им были присвоены названия: катепсин A, B, C, D, E, G, H, K, L. В последнее время эти лизосомальные протеазы привлекают внимание исследователей как важные факторы развития сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ассоциированных с воспалением [14]. Адгезия и миграция моноцитов, их превращение в макрофаги играют важную роль в патогенезе воспаления, в том числе возникающего в 148 поврежденных тканях. Эти клетки могут использовать внеклеточные цистеиновые протеазы в качестве вспомогательных инструментов миграции. Катепсины S и К участвуют в деградации коллагена и эластина [110; 300]. В экспериментальных исследованиях показана повышенная экспрессия лизосомальных катепсинов S, L и B в области атеросклеротического повреждения сосуда. В то же время в области неизмененной сосудистой стенки повышенной экспрессии катепсина S не отмечено [146]. Есть данные, что катепсин S обладает антитромботической активностью [105]. Однако механизм, посредством которого катепсин оказывает влияние на тромбоз остается недостаточно изученным. Эффект катепсинов уравновешивается цистатином С, который уменьшает воспаление в атеросклеротической бляшке [130]. Предполагается, что у людей в области атеросклеротического поражения имеется пониженный уровень цистатина С – естественного ингибитора катепсинов, тогда как неизмененные артерии экспрессируют большее его количество, особенно в гладкомышечных и эндотелиальных клетках [130]. Такая обратная регуляция протеаз и их ингибиторов менее выражена в случае матриксных металлопротеиназ и их тканевых катепсины являются ингибиторов. В настоящее время установлено, что непосредственными исполнителями апоптоза, в основе которого лежит протеолиз, обусловленный цистеиновыми протеазами типа каспаз, катепсинов, гранзима, калпаина [112; 222]. В сыворотке пациентов с аневризмой аорты отмечен пониженный уровень цистатина С [130], в то время как разницы с группой здоровых доноров в уровне катепсинов В и L выявлено не было [70]. Описывается участие катепсинов и цистатина С в процессах рестеноза. Так, в экспериментальной модели каротидной баллонной пластики на крысах показано увеличение экспрессии мРНК и уровня катепсинов S и К, в то время как экспрессия мРНК и уровень цистатина С не увеличивались. Таким 149 образом, показана роль катепсинов в констриктивном ремоделировании сосудов [192]. Повышенные уровни цистатина С ассоциировались с летальностью, сердечно-сосудистыми катастрофами и застойной сердечной недостаточностью среди амбулаторных пациентов с ишемической болезнью сердца во всех случаях, когда повышение уровня цистатина С не было обусловлено поражением почек [87]. В настоящее время в отношении катепсинов нет однозначно определенных значений нормы или хотя бы референсных значений. Однако в доступной литературе при обследовании здоровых доноров того же возраста по материалам исследователей соседних регионов установлен уровень прокатепсина В равный 67,8±0,15 нг/мл [20]. В нашем исследовании (таблица 23) дооперационный уровень прокатепсина В у пациентов с развившимся осложненным и неосложненным СВО не отличался и составлял 47,70 (35,04;63,06) пг/мл и 50,74 (41,64;57,70) нг/мл соответственно. При этом уровень этот был несколько меньшим, чем данные литературы, описывающие значения у здоровых доноров [20]. В первые сутки после операции отмечено достоверное (p<0,01) одинаковое 1,5 кратное увеличение уровня протеазы при разных вариантах течения послеоперационного периода. В дальнейшем профиль активности прокатепсина В у пациентов разных групп менялся. В случае неосложненного СВО уровень протеазы оставался на том же уровне, что и в первые сутки послеоперационного периода (77,32 (55,84;112,00) нг/мл), но превышал (p<0,01) исходные значения. Однако при наличии признаков осложненного СВО на седьмые сутки после операции отмечается продолжение роста (p<0,05) уровня сывороточного прокатепсина В. В этот период уровень протеазы составлял 113,62 (54,96;184,60) нг/мл и в 2,4 раза превышал исходный дооперационный. 150 Таблица 23 – Сывороточный уровень катепсинов и их естественных ингибиторов у пациентов с осложненным и неосложненным СВО Показатель Прокатепсин В, нг/мл операции 78,05 77,32 (59,34;112,22) (55,84;112,00) * *** 72,39 113,62 (62,94;112,70) (54,96;184,60) * **,*** 4,53 (3,25;7,17) 3,82 (3,00;7,42) 4,14 (3,40;6,42) 6,50 (3,41;7,12) 6,15 (3,23;6,94) 6,45 (3,45;7,31) 1064,00 1193,00 50,74 ненный (41,64;57,70) Ослож- 47,70 ненный (35,04;63,06) Осложненный Неослож- нг/мл операции Неослож- Катепсин К, ненный Цистатин С, 7 сутки после До операции Неосложпмоль/л 1 сутки после СВО 1210,50 ненный (1025,00;1354,00) Ослож- 1300,00 ненный (1157,00;1452,00) (866,50;1210,00) (1044,00;1438,00) * * 1133,00 1248,00 (998,90;1263,00) (1099,00;1488,00) * * Примечания: * p<0,01 достоверность отличий с предыдущим периодом ** p<0,05 достоверность отличий с предыдущим периодом *** p<0,01 достоверность отличий с исходным уровнем Сывороточный уровень катепсина К у пациентов с осложненным и неосложненным СВО не отличался во все контрольные точки исследования (таблица 23). Равно как не было отмечено какой-либо динамики уровня маркера внутри каждой из изучаемых групп. Исследование уровня естественного ингибитора катепсинов – цистатина С продемонстрировало иную, чем у прокатепсина В динамику. В 151 первые сутки после вмешательства значения показателя снижались (p<0,01): с 1210,50 (1025,00;1354,00) нг/мл до 1064,00 (866,50;1210,00) нг/мл в случае неосложненного СВО и с 1300,00 (1157,00;1452,00) нг/мл до 1133,00 (998,90;1263,00) нг/мл – в случае осложненного СВО. В дальнейшем, к седьмым суткам значения возвращались к исходным. Таким образом, в послеоперационном периоде отмечалась волнообразная динамика со снижением концентрации и последующему (к седьмым суткам) возврату к исходным значениям. Динамика уровня прокатепсина В была совершенно отличной. Сразу после вмешательства отмечалось повышение сывороточного маркера с дальнейшим его увеличением. При чем повышение это было более выраженным в случае осложненного СВО. В экспериментах in vitro на гладкомышечных, эндотелиальных клетках и макрофагах показано, что провоспалительные цитокины (интерлейкин 1β, фактор некроза опухоли α и интерферон γ) стимулируют экспрессию и продукцию катепсинов S и К [159]. Так реализуется активность катепсинов в поддержании процессов воспаления, которые, безусловно, имеют место после проведения любого оперативного вмешательства. Однако в нашем исследовании не было зафиксировано изменение уровня катепсина K в послеоперационном периоде (до семи суток после операции). Так же как не зафиксирован и выброс в системный кровоток провоспалительных цитокинов интерлейкина 1β, ФНО α и интерферона γ. Полученные нами данные согласуются с данными литературы относительно регуляторного влияния цитокинов на выброс катепсина К. В послеоперационном периоде у пациентов, которым проводилось коронарное шунтирование не отмечено повышение уровня провоспалительных цитокинов и катепсина К в периферической крови. Отсутствие достоверной динамики и корреляции с подъемом уровня прокатепсина В и цистатина С ставит под сомнение значение провоспалительных цитокинов в регуляции выброса цистеиновых протеаз in vivo. 152 Тем не менее, не исключается участие катепсина B в поддержании воспаления и высвобождение из лизосом в ответ на альтерацию. Катепсины могут выступать как основные посредники между стимулами апоптоза, белком р53, цитокинами. Повышение уровня прокатепсина B в послеоперационном периоде шунтирующих операций, по-видимому, связано с активацией процессов апоптоза, вызванного ишемией и реперфузией, сопровождавших кардиоплегию. Катепсин B активирует каспазы и запускает процессы апоптоза, локализуясь в цитоплазме и ядре находящихся в апоптозе (каспаза 3-позитивных) макрофагов в атероме человека [81]. В дальнейшем будет проявляться атерогенный эффект катепсинов, которые можно рассматривать в качестве стимуляторов атеросклероза. Таким образом, после проведения операции коронарного шунтирования в условиях управляемой ишемии и реперфузии отмечается выраженный дисбаланс ферментных систем, участвующих в инициации и поддержании процессов воспаления и ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса, а также их ингибиторов. При этом в первые сутки после вмешательства отмечается снижение уровня proMMP-1, MMP-3 и повышение – ММР-9 и прокатепсина В. Реакция естественных антагонистов была неодинаковой: сывороточный уровень TIMP-1 оставался на исходном уровне, а TIMP-2 и цистатина С – повышался. При этом зафиксированы отличия дисбаланса протеаз у пациентов с осложненным и неосложненным системным воспалительным ответом. Осложненный СВО характеризовался менее активными реакциями в первые сутки послеоперационного периода: уровень MMP-3 не снижался, повышение уровня ММР-9 было менее выраженным, динамика уровня TIMP-1 и TIMP-2 отсутствовала. Динамика уровня иммуноглобулинов у пациентов с СВО. Несмотря на проводимые в последнее время исследования по-прежнему недостаточно известно об иммуноглобулинах, как о важных участниках гуморального иммунного ответа. И это не смотря на то, что известно о влиянии оперативного вмешательства, выполняемого с применением искусственного 153 кровообращения, на дисбаланс T-хэлперов, участвующих в обеспечении противовоспалительной гуморальной регуляции [60; 187]. Проведение коронарного шунтирования в условиях искусственного кровообращения приводило к дисбалансу иммуноглобулинов. Уровень IgE достоверно увеличивался только к 5 дню послеоперационного периода, в то время как до третьего дня он оставался неизменным. С другой стороны уровень IgM и IgG достоверно снижался в первые сутки. Авторами высказывается предположение, что изменения в послеоперационном периоде уровня иммуноглобулинов связано с нарушением соотношения и активности Th1/Th2 клеток. Вместе с тем транзиторное снижение уровня IgM и IgG не приводит к значимым клиническим событиям. При исследовании уровня основных классов иммуноглобулинов у пациентов с сепсисом и септическим шоком было установлено, что плазматические IgM и IgG имели тенденцию к повышению, а на 5-7 сутки терапии не выходили за пределы референсных величин. При том, что на начало заболевания IgM и IgG был понижен. Наиболее выраженное снижение было зафиксировано для IgG, которое сохранялось до 4 суток терапии. Уровень IgA был практически неизменным за весь период наблюдения. В тоже время аналогично не было отмечено взаимосвязи пониженного уровня иммуноглобулинов с повышением смертности, заболеваемости и тяжести септического шока. Хотя и была отмечена корреляция между гипогаммаглобулинемией и сниженным уровнем белков плазмы [86]. Вместе с тем подход к необходимости терапии нарушения баланса иммуноглобулинов в послеоперационном периоде еще не определен. Если одни авторы [187] полагают, что коррекция такого рода нарушений не требуется, то другие [231] настаивают на более активной тактике, утверждая, что терапия иммуноглобулинами безопасна и эффективна в отношении первичной легочной дисфункции и полиорганной недостаточности. 154 Таким образом, очевидно, что иммуноглобулины являются важным фактором гуморального иммунного ответа, однако значение их дисбаланса, развивающегося управляемой после оперативных ишемии и вмешательств реперфузии в с использованием патогенезе системного воспалительного ответа и его осложненных форм еще недостаточно изучено. Таблица 24 – Уровень иммуноглобулинов у пациентов с СВО до и после коронарного шунтирования Показатель СВО До операции Неослож- 1704,25 ненный (1370,00;1987,00) Ослож- 1461,50 ненный (1190,50;1479,00) IgA Неослож- 411,75 ненный (319,50;570,00) Ослож- 435,00 ненный (411,25;485,75) IgM Неослож- 1304,75 ненный (1204,50;1810,50) Ослож- 1606,50 ненный (1530,50;1655,00) IgG 1 сутки 7 сутки 1381,00 1440,50 (944,50;1481,50) (1329,00;2019,00) * 1104,50 (917,50;1388,00) * ** 1378,50 (1053,00;1481,00) 280,50 536,62 (260,50;357,75) (433,50;651,50) * ** 320,75 556,25 (218,57;335,00) (396,50;582,00) * ** 981,50 1322,00 (675,00;1404,00) (924,50;1529,00) * 959,50 (828,00;1400,00) * ** 1364,00 (1204,00;1575,00) Примечания: * p<0,05 отличия с дооперационным уровнем ** p<0,05 отличия с первыми сутками послеоперационного периода 155 Исходный дооперационный уровень IgA, IgM и IgG у пациентов с последующим осложненным и неосложненным системным воспалительным ответом не различался (таблица 24). Закономерной реакций на операционный стресс, сопровождавшийся управляемой ишемией и реперфузией, было снижение всех изучаемых классов иммуноглобулиной в первые сутки после вмешательства. При этом IgA снижался в равной степени у пациентов обеих групп. Однако к седьмым суткам достоверно (p<0,01) увеличивался уровень иммуноглобулина лишь у пациентов с неосложненным СВО. В случае наличия осложнений отмечалась лишь недостоверная тенденция к увеличению. Вместе с тем уровень IgA у пациентов обеих групп к седьмым суткам не отличался от исходного. Аналогичная динамика была отмечена и в отношении IgM и IgG, уровень которых после вмешательства снижался у пациентов обеих групп. При этом достоверных различий между ними не отмечалось. К исходу недели уровень обоих классов иммуноглобулинов возвращался к исходным значениям и достоверно от них не отличался. Равно как и не было зафиксировано достоверных различий между группами пациентов с осложненным неосложненным СВО. Таким образом, полученные результаты согласуются с ранее полученными данными ряда авторов, которые указывали на наличие иммуносупрессии после проведение кардиохирургических вмешательств с использованием управляемой ишемии и реперфузии. Это состояние проявлялось достоверным снижением уровня основных классов иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) в первые сутки после хирургической операции. В дальнейшем, к седьмым суткам послеоперационного периода, сывороточный уровень всех классов антител возвращался к исходным значениями. Причем это происходило без использования специфической иммуностимулирующей и иммуномодулирующей терапии. При этом 156 различий в динамике уровня иммуноглобулинов у пациентов с осложненным и неосложненным СВО отмечено не было. Полученные данные указывают не то, что вклад иммуносупрессивных нарушений, проявляющихся в дисбалансе сывороточных иммуноглобулинов в раннем послеоперационном воспалительного ответа после периоде, в патогенез хирургического системного вмешательства с использованием управляемой ишемии и реперфузии незначителен, а специфическая коррекция этих нарушений, по-видимому, нецелесообразна. Динамика растворимых рецепторных маркеров. Липополисахарид (ЛПС) является наиболее важным компонентом эндотоксина и играет ключевую роль в развитии Грамм-негативного сепсиса. Он связывается с мембранной формой CD14, экспрессирующейся на миелоидных клетках, а также с растворимой формой (sCD14) [107; 292; 294]. Комплекс ЛПС-sCD14 активирует эпителиальные и эндотелиальные клетки посредством TOLLподобных рецепторов, что может быть дополнительным повреждающим фактором при сепсисе [170; 291]. Существует несколько стимулов для воспалительных реакций, включая выработку липополисахарид связывающего белка (ЛСБ), который совместно с растворимой формой CD14 (sCD14) выступает в качестве активатора преимущественно в начальной стадии воспаления [141; 228; 275]. Клетки, казалось бы, не участвующие непосредственно в воспалительных реакциях, такие как гепатоциты, эндотелиоциты, кардиомиоциты, не только способствуют развитию воспаления, но и обладают выраженной аутокринной активностью. В результате развивается повреждение клеток, и даже их гибель, что может приводить к органным дисфункциям [245; 272]. ЛСБ и sCD14 играют двоякую роль в развитии воспалительной реакции. Совместно они связывают липополисахарид, что усиливает воспаление на ранней стадии. Активированные макрофаги выделяют провоспалительне цитокины, такие как ИЛ 6, ИЛ 1β, ФНО α, запуская, таким 157 образом, воспаление [228]. С другой противовоспалительный эффект ЛСБ стороны, может проявляться и sCD14 в поздних стадиях посредством механизма отрицательной обратной связи [72; 229]. Таким образом, исследование уровня sCD14 в динамике послеоперационного периода коронарного шунтирования с использрванием управляемой ишемии и реперфузии представляется обоснованным с позиции регуляторного влияния как в случае инфекционного, так и в случае «стерильного» воспаления, инициированного окислительным стрессом и повреждением клеток. Исходный уровень sCD14 у пациентов с осложненным и неосложненным СВО не отличался и составлял 1398,40 (1184,80;1780,00) нг/мл и 1356,80 (1260, 00;1665,60) нг/мл соответственно (таблица 25). В послеоперационном периоде динамика была однотипной: в первые сутки уровень аналита у пациентов обеих групп достоверно (p<0,01) повышался. Повышение сывороточного уровня растворимого рецептора, по-видимому, связано с инициацией процесса воспаления и соотносится с результатами других исследователей. К седьмым суткам послеоперационного периода уровень sCD14 снижается (p<0,01), хотя и оказывается повышенным (p<0,01) по сравнению с исходными значениями. При этом у пациентов с осложненным СВО имеется тенденция к более высокому уровню растворимой формы рецептора (1948,80 (1680,80;2408,80) нг/мл), чем в случае неосложненного течения (1695,20 (1406,40;2271,20) нг/мл). К седьмым суткам после вмешательства должно проявляться противовоспалительное действие sCD14, реализующиеся по механизму отрицательной обратной связи. Таким образом проявляется фаза разрешения СВО. 158 Таблица 25 – Динамика уровня sCD14 у пациентов с системным воспалительным ответом Показатель sCD14, нг/мл СВО До операции Неослож- 1356,80 ненный 7 сутки после операции операции 1695,20 2360,80 (1260,00;1665,60) (2097,60;2867,20)* Осложненный 1 сутки после 1398,40 (1406,40;2271,20) *, ** 1948,80 2518,40 (1184,80;1780,00) (2016,00;3003,20)* (1680,80;2408,80) *, ** Примечания:* p<0,01 отличия с предыдущим исследуемым периодом ** p<0,01 отличия с исходным уровнем Важно отметить, что динамика уровня маркера у пациентов с разными вариантами развития СВО имела однотипный и схожий по силе характер. С одной стороны это подтверждает единый генез системного воспалительного ответа (первичное неинфекционное повреждение, вызванное операционным стрессом, ишемией/реперфузией и т.д.), с другой стороны ставит под сомнение возможность развития осложненного СВО посредством (триггерного рецептора, присоединения инфекционного компонента. Растворимая экспрессируемого форма на TREM-1 миелойдных клетках). Важным участником активации ранних воспалительных реакций и СВО признан триггерный рецептор, экспрессированный на миелоидных клетках-1 (TREM-1) [357]. Он впервые описан как активирующий рецептор воспалительного ответа в 2000 году группой швейцарских ученых A. Bouchon, J. Dietrich и Colonna M. J. Отличительная особенность TREM-1, делающая его привлекательным для изучения в аспекте СВО, связана с его способностью к активации всех эффекторных функции врожденного иммунитета и многократному усилению 159 продукции цитокинов при совместной стимуляции с главными рецепторами врожденного иммунитета (Toll-подобные рецепторы и Nod-подобные рецепторы) [358]. До недавнего времени он считался маркером сепсиса и инфекционного СВО. Однако за последние несколько лет появились научные исследования, указывающие на связь TREM-1 с СВО неинфекционного генеза [331; 343; 359]. Растворимая форма sTREM-1 высвобождается с поверхности клеток путем шеддинга (слущивания) металлопротеиназами и может мембранной быть формы количественно матриксными определена в биологических жидкостях. Учитывая способность этого рецептора к амплификации воспалительного ответа и появившиеся немногочисленные доказательства участия этого рецептора в развитии неинфекционного СВО, представляется перспективным исследовать возможность использования растворимой формы TREM-1 как маркера выраженности СВО и его осложнений в периоперационном периоде прямой реваскуляризации миокарда в условиях управляемой ишемии и реперфузии [142; 144]. В группах пациентов не отмечено отличий по исходному содержанию sTREM-1 в крови (таблица 26). В случае неосложненного течения СВО концентрация sTREM-1 составляла 58,06 (46,53;109,20) пг/мл, а при наличии осложненного СВО – 67,46 (54,71;77,90) пг/мл. Однако к исходу первых суток после операции в обеих группах пациентов наблюдалось повышение уровня sTREM-1. У пациентов с развившимся в дальнейшем осложненным СВО, показатель был достоверно выше (р=0,028) и составил 131,10 (130,50;135б10) пг/мл, в то время как в случае неосложненного течения – 74,98 (58,99;107,90) пг/мл. При этом прирост концентрации маркера в первой группе был 1,3-кратным, а во второй – 1,9-кратным. 160 Таблица 26 – Динамика уровня sTREM-1 (пг/мл) в сыворотке крови у различных групп пациентов 1-е сутки после 7-е сутки после операции операции 58,06 74,98 101,20 (46,53;109,20) (58,99;107,90) * (68,45;162,55) * 67,46 131,10 157,50 (54,71;77,90) (130,50;135,10) *,** (134,00;249,30) * 64,50 98,16 150,95 (57,42;82,76) (79,10;133,45) (105,36;183,95) * Группы До операции Неосложненный СВО Осложненный СВО Почечные дисфункции Примечания: * р<0,05 - различия с дооперационным уровнем ** р<0,03 - различия с группой с неосложненным СВО На седьмые сутки послеоперационного периода продолжалось повышение уровня исследуемого показателя до 101,20 (68,45;162,55) пг/мл в случае неосложненного СВО и до 157,50 (134,00;249,30) пг/мл – в случае наличия осложнений. Однако достоверных отличий в группах по содержанию sTREM-1 не было. Вместе с тем имелась тенденция к более высокому уровню у пациентов с осложнениями. При этом в случае неосложненного СВО концентрация маркера превышала исходные значения в 1,7 раза, а в случае наличия осложнений – в 2,3 раза. В процессе анализа показателей выяснилось, что абсолютные значения sTREM-1 плохо отражают реальную динамику в силу значительных различий в исходном уровне. Для устранения этого недостатка было предложено оценивать коэффициент прироста концентрации sTREM-1, который рассчитывался по формуле: К= концентрация в момент исследования /концентрация исходная (до операции) 161 Проведен подсчет коэффициента и его сравнение в различных группах методом дисперсионного анализа. Обнаружено, что в 1-е сутки после операции, пациенты с развившимся в дальнейшем осложненным СВО, имели достоверно более высокий коэффициент 1,68 (1,56-2,47) относительно групп с гладким течением послеоперационного периода (1,19 (0,98-1,36), р<0,001) и нарушениями функции почек (1,31 (1,18-1,98), р=0,049) (рисунок 16). *–р<0,05 между указанными группами; #–р достоверность различий коэффициента в данной группе на 7-е сутки по сравнению с 1-ми сутками. Рисунок 16 – Динамика коэффициента прироста концентрации sTREM-1 в сыворотке крови у различных групп пациентов На 7 сутки послеоперационного периода коэффициент был достоверно выше у пациентов с осложненным течением СВО (1,76 (1,72-3,76) и почечными дисфункциями (2,38 (2,24-2,70) по сравнению с группой без осложнений (1,29 (1,03-1,46) (р<0,001 и р<0,001 соответственно). Таким образом, в случае неосложненного течения послеоперационного периода, на 1-е и на 7-е сутки значения коэффициента оставались 162 относительно концентрации стабильными был (1,19-1,29), незначителен. Через соответственно, 18 часов после прирост операции коэффициент повышался более чем в 1,5 раза у пациентов с развившимися в дальнейшем осложнениями, связанными с СВО. В группе пациентов с почечными дисфункциями повышение коэффициента до 2,38 происходило к 7 суткам. В литературе отсутствуют указания на механизмы и пути элиминации sTREM-1. Обнаруженное нами повышение содержания sTREM-1 в крови пациентов с почечными дисфункциями, позволяет предположить участие почек в элиминации sTREM-1 из организма. Динамика повышения sTREM-1 по отношению к исходному значению может объективно свидетельствовать о формировании осложненного течения послеоперационного периода с развитием полорганной дисфункции и системного воспалительного ответа. Предлагаемый коэффициент можно использовть в качестве диагностического и прогностического критерия развития осложненных форм СВО. Иллюстрациями эффективности предлагаемого метода могут явиться клинические примеры. Клинический пример 1. Пациент И., 58 лет, история болезни №5644. Диагноз: «Мультифокальный атеросклероз. Ишемическая болезнь сердца. Стенокардия II ФК. Стеноз общей сонной артерии справа 30%. Гипертоническая болезнь III, риск 4». Концентрация sTREM-1 до операции составляла – 97,11 пг/мл. 31.08.2010г. в условиях искусственного кровообращения выполнена полная реваскуляризация миокарда в объеме 1 маммарокоронарного и 2 аортокоронарных анастомозов. Длительность искусственного кровообращения – 85 минут, пережатия аорты – 64 минуты, продолжительность операции – 300 минут. Переведен в реанимацию со стабильными показателями гемодинамики без симпатомиметической поддержки. Экстубация через 2,5 часа после перевода из операционной при адекватном газовом составе артериальной и венозной крови. В раннем 163 послеоперационном периоде состояние пациента стабильное, соответствовало объему и тяжести перенесенной операции. На следующий день температура в диапазоне 36,1-36,7; ЧСС не более 82 в мин; частота дыхания не более 18 при PaCO2 артериальной крови на самостоятельном дыхании не менее 34 мм рт.ст. В периферической крови: количество лейкоцитов – 9,2*109, молодых форм гранулоцитов – 5%. Стандартные критерии диагностики указывают на отсутствие осложненного системного воспалительного ответа. Уровень sTREM-1 – 75,96 пг/мл. Индекс прироста sTREM-1 – 0,78. Отсутствие осложненного СВО подтверждено. Прогнозировано неосложненное течение послеоперационного периода в отношении развития осложненного СВО. 01.09.2010г. в стабильном состоянии пациент переведен в кардиохирургическое отделение. Выписан из стационара 10.09.2010 в удовлетворительном состоянии. Клинический пример 2. Пациент Л., 68 лет, история болезни №4493. Диагноз «Мультифокальный атеросклероз. Ишемическая болезнь сердца. Постинфарктный кардиосклероз (2007г.). Стенокардия III ФК. Стеноз внутренней сонной артерии слева 40%. Гипертоническая болезнь III, риск 4». Концентрация sTREM-1 до операции составила - 54,71 пг/мл. 01.07.2010г. в условиях искусственного реваскуляризация миокарда аортокоронарных кровообращения кровообращения в объеме анастомозов. – 93 1 выполнена маммарокоронарного Длительность минуты, пережатия аорты полная и 2 искусственного – 69 минут, продолжительность операции – 285 минут. Переведен в отделение реанимации со стабильными показателями гемодинамики, без симпатомиметической поддержки. Экстубация через 3 часа после перевода из операционной при адекватном газовом составе артериальной и венозной крови. Через 8 часов после операции отмечается прогрессирование вазоплегии, потребовавшей инфузии адреналина с целью поддержания адекватных значений среднего артериального давления. Отмечалось ухудшение газового состава артериальной и венозной крови, в связи с чем 164 реинтубирован с переводом на ИВЛ. Снижение темпа диуреза, потребовавшее стимуляции фуросемидом на фоне коррекции относительной гиповолемии. Предположено развитие осложненного СВО. Однако, количество лейкоцитов – 10,4*109, молодых форм гранулоцитов 8%; температура в послеоперационном периоде в диапазоне 36,0-37,2; ЧСС не более 86 в мин; частота дыхания и PaCO2 артериальной крови в качестве диагностических критериев СВО были недостоверны, т.к. пациент находился на ИВЛ. Уровень sTREM-1 – 135,10 пг/мл. Индекс прироста sTREM-1 – 2,47. Диагноз осложненного системного воспалительного ответа подтвердился. Состояние больного в течение 2 суток послеоперационного периода ухудшалось за счет развития и прогрессирования полиорганной недостаточности. На седьмые сутки послеоперационного периода индекс прироста sTREM-1 составил 4,56. С целью экстракорпорального очищения крови в течение двух суток проводилась продленная вено-венозная гемофильтрация, на фоне которой достигнута положительная динамика в виде регресса клинико-лабораторных проявления полиорганной недостаточноти. 12.07.2010г. пациент в стабильном состоянии переведен в кардиохирургическое отделение. Приведенные выше клинические примеры демонстрируют диагностическую и прогностическую значимость динамической оценки уровня sTREM-1 после операций коронарного шунтирования в условиях искусственного кровообращения. Так, оба пациента были сопоставимы по объему выполненного вмешательства, продолжительности искусственного кровообращения, пережатия аорты и длительности операции. При этом, несмотря на то, что состояние пациента из клинического примера 2 в раннем послеоперационном периоде прогрессивно ухудшалось за счет развития СВО и прогрессирования полиорганной недостаточности, анализ общепринятых диагностических критериев СВО не позволил вовремя выявить развитие последнего. При этом индекс прироста sTREM-1 в первые сутки после операции составлял - 2,47, а на седьмые – 4,56, что свидетельствовало не 165 только о формировании СВО, но и об осложненном характере его течения – развитии полиорганной недостаточности. Таким образом, прирост sTREM-1 в 1-е сутки послеоперационного периода более чем в 1,5 раза может свидетельствовать о выраженности системного воспалительного ответа и возможных будущих осложнениях, связанных с ним. Высокие значения коэффициента в более поздний срок сопровождают осложненный СВО и, кроме того, коррелируют с нарушением функции почек. TREM-1 участвует в активации эффекторных функций врожденного иммунитета и индукции адаптивного иммунного ответа [65; 357]. Ранее было показано, что уровень sTREM-1 в плазме коррелирует с тяжестью септического процесса и является высокочувствительным (96%) и специфичным (89%) маркером септических процессов [65; 241]. Однако клинические исследования последних лет свидетельствуют, что sTREM-1 повышается у пациентов с неспецифической активацией воспалительного ответа, включая операции с ИК, кровопотерей и гемотрансфузией, кардиоплегией и реанимацией [193]. Увеличение экспрессии поверхностной формы TREM-1 на моноцитах, а так же содержания sTREM-1 в плазме обнаружено у пациентов после хирургических операций с доклинической стадией СВО без септического процесса [343], у больных острым панкреатитом [359], контузионными повреждениями легких [331]. При этих состояниях тяжесть процесса коррелирует с уровнем экспрессии TREM-1 на моноцитах. Следовательно, у этой категории больных TREM-1 не может быть использован в качестве маркера инфекционных осложнений, но может служить показателем тяжести воспалительного процесса. Установлено, что в организме растворимая форма TREM-1 образуется в результате шеддинга (протеолитического отщепления) мембранной части TREM-1 с поверхности миелоидных клеток матриксными металлопротеиназами [241]. Поэтому повышение уровня sTREM-1 в крови в 166 ранней фазе воспаления косвенно отражает увеличение экспрессии мембранной формы TREM-1. Зарегистрированное нами повышение содержания sTREM-1 в плазме пациентов, перенесших операцию на сердце с применением ИК и кардиоплегии, согласуется с предположением Adib-Conquy о том, что увеличение TREM-1 больше отражает системное воспаление, чем инфекционный процесс [193]. Обследованные нами пациенты также не имели септических осложнений в послеоперационном периоде. Участие эндотелия в патогенезе СВО и динамика растворимых маркеров его функции. Запущенные процессы воспаления оказывают влияние на эндотелиальные клетки. Выброс провоспалительных цитокинов, в первую очередь ИЛ 1 и ФНО α, приводит к активации эндотелиоцитов, выделяющих молекулы хемотаксиса (ИЛ 8, MCP-1 - monocyte chemotactic protein). В начальной фазе взаимодействия лейкоцитов и эндотелиоцитов происходит контакт лейкоцитарных селектинов и их рецепторов. При этом сам процесс называется роллингом лейкоцитов [273]. На следующем этапе происходит активация различных интегринов на поверхности лейкоцитов, что приводит к активации молекул адгезии (например ICAM-1 – intercellular cell adhesion molecule-1, VCAM-1 - vascular cell adhesion molecule-1.) на поверхности цитокин-активированных эндотелиоцитов [74]. Примененные транскриптомные технологии показали, что в первую очередь лейкоциты участвуют в повышенной продукции факторов воспаления и хемотаксиса (ИЛ 6, ИЛ 10, ФНО α, ИФН γ, MCP-1, MIP 1β (macrophage inflammatory protein)) в ответ на процедуру искусственного кровообращения, сопровождающую кардиохирургические операции [353]. Исследования, проведенные на нокаутированных мышах показали, что дефицит Е- и Р-селектина повышает устойчивость к летальным исходам при моделировании септического шока [242]. В процесс трансмиграции лейкоцитов через слой эндотелиальных клеток вовлечен PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1) [253]. 167 В то время как экспрессия ICAM-1 и VCAM-1 в значительной степени связана с провоспалительными стимулами, экспрессия PECAM-1 остается практически неизменной [239; 246]. Ранее было установлено, что применение искусственного кровообращения при коронарном шунтировании вызывает умеренную эндотелиальную активацию и выход цитокинов. При этом применение технологии линейного кровотока оказывает более выраженное влияние на эти функции, что, потенциально, может провоцировать более выраженное системное воспаление и продление сроков восстановления [268]. Исследование уровня основных маркеров эндотелиальной дисфункции в срок до трех дней после операции коронарного шунтирования с использованием искусственного кровообращения продемонстировало разную динамику. Так, уровень sP-селектина, sE-селектина и АПФ (ангиотензин превращающего фермента) повышался в сравнении с исходным уровнем, в то время как значения vWF (фактор Виллебранда) и тетранектина снижались. По мнению авторов, описанная динамика уровня маркеров указывает на выраженные повреждения и нарушение функции эндотелия в интра- и раннем послеоперационном периоде [271]. Клеточные адгезионные молекулы (CAM–cell adhesion molecules) локализуются на поверхности клеток. В сыворотке могут определяться растворимые формы этих молекул. Однако факторы, регулирующие их уровень и взаимоотношения с уровнем поверхностных рецепторов еще недостаточно изучены и активно исследуются [153]. Растворимые формы освобождаются с поверхности активированных клеток (эндотелиоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) за счет протеолитической активности. Предполагается, что уровень растворимых молекул коррелирует с уровнем их поверхностной экспрессии и экспрессии мРНК. Сывороточный уровень sICAM -1 и sVCAM-1, но не E-селектина, повышался у пациентов после проведения операции с использованием искусственного кровообращения. В то же время, при проведении 168 экспериментов in vitro было установлено, что экспрессия VCAM-1 и ICAM-1 на эндотелиальных клетках снижалась после их культивирования с плазмой пациентов, прошедших процедуру ИК. Таким образом, повышенный сывороточный уровень молекул адгезии может быть связан не только с поверхностной клеточной экспрессией, но и с активностью гуморальных сывороточных факторов. В результате предполагается, что эндотелиальная активность является не первичной, но важной составляющей патогенеза СВО [153]. Растворимые формы селектинов появляется путем шеддинга (слущивания) с мембран клеток, в первую очередь нейтрофилов. При обследовании пациентов во время и после кардиохирургических операций было установлено, что во время операции уровень поверхностной экспрессии маркера на нейтрофилах не менялся, притом, что сывороточный уровень снижался. Вместе эти результаты указывают на то, что интраоперационно шеддинг L-селектина с поверхности нейтрофилов не происходил [122]. При этом в ряде исследований было показано отсутствие увеличения уровня растворимых молекул межклеточной адгезии [115]. В других исследованиях [83] было показано увеличение уровня E-селектина, VCAM-1, ICAM-1 и L-селектина у пациентов после выполненной в условиях искусственного кровообращения операции. В тоже время аналогичной динамики не было отмечено у пациентов после абдоминальных и торакальных операции не сопряженных с ИК. При обследовании пациентов с повреждением легких и с острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) было установлено, что уровень sL-селектина у этих пациентов был достоверно ниже, чем в контрольной группе. Уровень sICAM-1, sVCAM-1 и тромбомодулина у пациентов с ОРДС был выше, чем пациентов только с повреждением легких. Кроме того, были обнаружены достоверные различия в уровне молекул адгезии между выжившими и умершими пациентами. Была обнаружена взаимосвязь между 169 механизмами воспаления и коагуляции у пациентов с ОРДС и острым повреждением легких [323; 336]. При обследовании пациентов со стабильной и нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда было установлено, что молекулы адгезии, а именно sE-селектин, sVCAM-1 и sPECAM-1 достоверно увеличивались при острых событиях, в то время как повышение sICAM-1 было недостоверным, а уровень sP-селектина не отличался от таковых при стабильных состояниях. На основании полученных данных был сделан вывод о патогенетической значимости изменения уровня молекул адгезии при острых коронарных событиях и при повреждении миокарда [330]. Остается неясным, играют ли растворимые молекулы клеточной адгезии важную физиологическую роль или являются лишь промежуточной формой на пути выведения из циркуляции [153; 233]. Моноцитарный белок хемотаксиса (monocyte chemoattractant protein – MCP) относится к большому семейству хемокинов. Он привлекает мононуклеарные клетки и, соответственно, может быть обнаружен в очагах воспаления. Этот белок играет важную роль в патогенезе атеросклероза, провоцируя нестабильность бляшки за счет привлечения моноцитов/макрофагов, стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток. Кроме того, МСР индуцирует экспрессию других хемокинов, тканевых факторов, матричных металлопротеиназ, молекул клеточной адгезии и провоспалительных цитокинов [150; 317]. В экспериментальных работах было установлено, что кардиальный эндотелин-1 стимулирует выброс провоспалительных цитокинов, провоцирует интерстициальный отек и воспалительную кардиомиопатию, могущую приводить к сердечной недостаточности и смерти [121]. Значимость определения уровня эндотелина-1 подтверждается исследователями [279]. У пациентов с сепсисом установлена достоверная выраженная корреляционная связь между уровнем эндотелина-1 и уровнем прокальцитонина, натриуретического пропептида, С-реактивного белка, а 170 также тяжестью органных дисфункций, определенных по шкале SOFA. Таким образом, подчеркивается важное значение эндотелина в патогенезе нарушения функций жизненно важных органов. При анализе сывороточного уровня селектинов (таблица 27) была отмечена исходная разница в содержании sP-селектина. У пациентов с последующим неосложненным СВО значения составляли 134,70 (104,90;203,90) нг/мл, в то время как у пациентов с послеоперационными осложнениями - 100,37 (79,42;118,80) нг/мл. Дальнейшая динамика уровня растворимого P-селектина у пациентов разных групп различалась. В случае неосложненного СВО отмечалась лишь недостоверная тенденция к повышению уровня аналита. В первые сутки после операции были достигнуты значения 167,95 (111,90;250,20) нг/мл. У пациентов с осложненным течением уровень селектина повышался. Не смотря на то, что уровень маркера у пациентов разных групп достоверно не отличался (p>0,05), динамика прироста у пациентов второй группы была достоверной (p<0,05). В дальнейшем, к седьмым суткам уровень sP-селектина снижался в случае неосложненного течения послеоперационного периода и достигал исходных, дооперационных значений - 132,40 (84,53;196,60) нг/мл. В случае развившейся осложненной формы системного воспалительного ответа динамика уровня селектина была обратной. Его уровень повышался (p<0,05) и в 1,8 раза превышал исходные значения для пациентов этой группы. Таким образом, прогрессивное повышение (до 7 суток послеоперационного периода) уровня sP-селектина является диагностически и прогностически неблагоприятным в плане развития осложненных форм СВО. 171 Таблица 27 – Динамика уровня сывороточных селектинов у пациентов с разным течением СВО Показатель sL- СВО До операции Неослож- 1247,60 ненный (1080,00;1479,20) Ослож- 1228,30 ненный (1096,20;1549,60) 1 сутки после 7 сутки после операции операции 1091,40 (958,20;1225,40) ** селектин, нг/мл НеосложsPселектин, нг/мл селектин, нг/мл (1017,80;1427,20) 1054,50 (950,80;1199,80) ** 1165,10 (1073,20;1323,40) 134,70 167,95 132,40 ненный (104,90;203,90) (111,90;250,20) (84,53;196,60) ** Ослож- 100,37 127,40 180,05 ненный (79,42;118,80) * (114,65;187,40) (138,10;207,55) ** *** 39,54 19,48 27,73 ненный (21,40;54,10) (11,12;33,46) ** (13,23;34,85) Ослож- 31,70 15,62 28,43 ненный (23,31;35,95) (10,10;20,58) ** (19,48;50,70) ** Неослож- sE- 1165,40 Примечания: * p<0,05 отличия между группами ** p<0,05 отличия с предыдущим исследуемым периодом *** p<0,05 отличия с исходным уровнем Исходный уровень sL-селектина у пациентов двух групп не различался и составлял соответственно 1247,60 (1080,00;1479,20) нг/мл и 1228,30 (1096,20;1549,60) нг/мл в случае дальнейшего неосложненного и осложненного СВО. Дальнейшая динамика в группах также не различалась. В первые сутки послеоперационного периода отмечалось снижение уровня показателя до 1091,40 (958,20;1225,40) нг/мл (p<0,01) в случае отсутствия осложнений и до 1054,50 (950,80;1199,80) нг/мл (p<0,05) в случае развития 172 осложненных форм СВО. К седьмым суткам уровень sL-селектина возвращался к исходным значениям и не отличался от таковых для обоих вариантов течения послеоперационного периода. Динамика уровня sE-селектина демонстрировала определенную значимость. Так, исходный уровень не отличался у пациентов обеих групп и составлял 39,54 (21,40;54,10) нг/мл и 31,70 (23,31;35,95) нг/мл в случае дальнейшего неосложненного и осложненного течения соответственно. В первые сутки отмечалось достоверное (p<0,05) снижение уровня маркера у пациентов обеих групп, при этом в случае осложнений он достигал 15,62 (10,10;20,58) нг/мл, а без таковых - 19,48 (11,12;33,46) нг/мл. Далее, к седьмым суткам отмечалась тенденция к повышению. При этом уровень в обоих случаях не отличался от исходного. Однако, в случае осложненного СВО динамика по сравнению с первыми сутками была достоверной и более выраженной (p<0,01). Мембранные формы изученных селектинов располагаются на поверхностях клеток разных типов. L- и Е- селектины присущи лейкоцитам, и, в первую очередь, нейтрофилам. Кроме того, Е- и P-селектины специфичны для эндотелиальных клеток, а Р – еще и для тромбоцитов. Полученные данные по динамике уровня растворимых форм, образующихся преимущественно путем шеддинга с поверхности клеток указывают на важный вклад этих молекул в патогенез СВО. При этом полученные данные не всегда соотносятся с результатами других авторов, тем более что результаты эти порой противоречивы. Важно отметить, что уровень sL- и sEселектинов в первые сутки послеоперационного периода снижался у пациентов обеих групп, а на седьмые сутки возвращался к исходным значениям. Динамика уровня sP-селектина была обратной. В первые сутки после операции отмечался прирост уровня маркера, при чем в случае осложненного послеоперационного периода к сывороточный уровень аналита продолжал повышаться. седьмым суткам 173 Если учитывать предположение о взаимосвязи сывороточного уровня селектинов и их поверхностных клеточных форм, можно предположить, в первую очередь, участие эндотелиоцитов и тромбоцитов, как основных клеток, несущих на себе P-селектин, в патогенезе СВО, особенно в отношении развития пограничных и осложненных форм. Однако, уровень sEселектина, также присутствующего в достаточно больших количествах на поверхности эндотелиальных клеток, имел отрицательную динамику. Повидимому, речь идет о разной скорости шеддинга и накопления растворимых форм селектинов, а также, возможно, о разной скорости элиминации в результате нарушения функции органов, сопровождающем системный воспалительный ответ. Таким образом, можно говорить о значимости растворимых форм селектинов, а также клеток – их источников (эндотелиоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) в патогенезе СВО. При этом наибольшей дифференциально-диагностической значимостью в отношении течения системного воспалительного ответа обладает sP-селектин. Поверхностные клеточные молекулы адгезии участвуют в процессе роллинга лейкоцитов и взаимном эндотелиоцитов. Растворимые формы распознавании лейкоцитов и образуются путем слущивания мембранных форм и могут представлять интерес, как в плане понимания патогенеза, так и в качестве диагностического критерия. Исходный уровень sICAM-1 у пациентов с разным течением послеоперационного периода не различался (таблица 28) и составлял 443,60 (353,90;529,60) нг/мл в случае дальнейшего неосложненного СВО и 437,90 (352,25;526,60) нг/мл у пациентов с осложнившимся послеоперационным периодом. В первые сутки после операции уровень растворимых межклеточных молекул адгезии снижался у пациентов обеих групп. Однако в случае неосложненного СВО снижение это было достоверным (p<0,05), а при формировании осложненного СВО – недостоверным и фиксировалась лишь тенденция. 174 Таблица 28 – Динамика уровня сывороточных молекул клеточной адгезии у пациентов с СВО Показатель 1 сутки после 7 сутки после операции операции 443,60 377,90 453,60 СВО До операции НеосложsICAM-1, ненный (353,90;529,60) (324,00;473,80)* (347,30;576,80)* нг/мл Ослож- 437,90 388,90 470,45 ненный (352,25;526,60) (319,50;519,05) (379,60;687,70)* 483,30 480,60 482,90 НеосложsICAM-2, ненный (407,00;798,80) (332,40;576,00) (424,40;633,80) МЕ/мл Ослож- 631,20 457,10 578,80 ненный (429,00;777,70) (359,40;607,10)* (428,70;729,80)* НеосложsPECAM-1, ненный нг/мл 35,83 (31,42;43,25) Ослож- 36,40 ненный (28,85;45,28) Неослож- 47,08 (31,26;55,48) 39,37 (32,15;49,45)** 50,65 (37,54;60,53)** 429,75 485,92 579,75 (381,25;637,25) (379,25;666,75)* (442,12;682,00)** Ослож- 611,50 744,75 619,75 ненный (508,35;687,75) (508,22;1057,25) (540,25;925,75) sVCAM-1, ненный нг/мл 38,22 (31,56;47,07) Примечание: * p<0,05 отличия с предыдущим исследуемым периодом ** p<0,05 отличия с исходным уровнем К седьмым суткам послеоперационного периода уровень sICAM-1 повышался (p<0,01) у пациентов обеих групп: до 453,60 (347,30;576,80) нг/мл в случае неосложненного СВО и до 470,45 (379,60;687,70) нг/мл в случае осложненного. При этом уровень достоверно не отличался от такового до оперативного вмешательства, а у пациентов с осложненным СВО даже имел тенденцию к повышению. 175 Уровень sICAM-2 в предоперационном периоде достоверно не различался у пациентов двух групп, однако имелась тенденция к более высоким значениям у пациентов с последующим осложненным СВО (631,20 (429,00;777,70) МЕ/мл), в сравнении с пациентами без такового 483,30 (407,00;798,80) МЕ/мл). С другой стороны в первые сутки после операции у пациентов с СВО уровень этой растворимой молекулы межклеточной адгезии не менялся, в то время как в случае осложнений достоверно (p<0,01) снижался до 457,10 (359,40;607,10) МЕ/мл. К исходу первой недели послеоперационного периода в случае отсутствия осложнений уровень sICAM-2 продолжает быть стабильным - 482,90 (424,40;633,80) МЕ/мл, в то время как у пациентов с осложненным СВО отмечается повторное повышение (p<0,05) уровня до 578,80 (428,70;729,80) МЕ/мл. Как и у прочих молекул межклеточной адгезии, исходный уровень sPECAM-1 у пациентов обеих групп не различался. Через сутки после вмешательства разницы также не было, равно, как и не фиксировалась динамика внутри групп. Однако, к исходу первой недели уровень маркера достоверно (p<0,05) отличался от исходных значений у пациентов обеих групп. При этом в случае неосложненного СВО увеличение уровня составило 3%, а осложненного – 39%. Не смотря на то, что достоверной разницы исходного уровня sVCAM-1 у пациентов разных групп отмечено не было, была отмечена тенденция к более высоким значениям у пациентов с последующим осложненным СВО 611,50 (508,35;687,75) нг/мл в отличие от пациентов без такового - 429,75 (381,25;637,25) нг/мл. В первые сутки после операции у пациентов обеих групп уровень маркера повышался, при этом в случае неосложненного СВО достоверно (p<0,05) - до 485,92 (379,25;666,75) нг/мл, а при осложненном – лишь тенденция – до 744,75 (508,22;1057,25) нг/мл. При этом такая разница связана, по-видимому, с отличиями в исходном уровне маркера. К исходу первой недели у пациентов с неосложненным СВО продолжается повышение sVCAM-1 и уровень достоверно превышает (p<0,01) исходные значения. В 176 случае осложненного СВО достоверной динамики маркера не было и к седьмым суткам уровень не отличался от исходного - 619,75 (540,25;925,75) нг/мл. Таким образом, в динамике послеоперационного периода у пациентов с разным течением системного воспалительного ответа после вмешательств с использованием управляемой ишемии и реперфузии отмечается разный профиль изменений сывороточного уровня молекул межклеточной адгезии. При этом наиболее значимым представляется изменение уровня sICAM-2, который значимо снижается в первые сутки после операции, в дальнейшем повышаясь в случае осложненного СВО и находится на стабильном уровне в случае неосложненного СВО. С другой стороны, динамика sVCAM-1 в группах была иной. Если в отсутствие осложнений в послеоперационном периоде уровень увеличивался и к седьмым суткам достоверно превышал исходные значения, то в случае осложненного СВО имелась, лишь тенденция к повышению, а к исходу недели уровень не отличался от первоначального. Полученные данные не в полной мере соотносятся с результатами [153], которые установили увеличение sICAM -1 и sVCAM-1 у пациентов после операций с применением искусственного кровообращения. В нашем исследовании фиксируется не увеличение, а снижение уровня sICAM-1 после операции, причем достоверное в случае неосложненного СВО и недостоверное – в случае осложненных форм. Равно как и увеличение сывороточного VCAM-1 мы отметили лишь в случае СВО без дополнительных, отягощающих факторов. По-видимому, нужно признать правоту ряда авторов [21; 153; 239; 246], указывающих на важное значение гуморальных факторов в изменении уровня растворимых молекул адгезии. Таким образом, еще раз доказывается взаимосвязь и регулирующее влияние гуморальных факторов в реализации дисфункции эндотелия при разных формах системного воспалительного ответа инициированного кардиохирургической операцией с использованием управляемой ишемии и реперфузии. 177 Таблица 29 – Динамика маркеров эндотелиальной дисфункции у пациентов с СВО Показатель 1 сутки после 7 сутки после операции операции 139,20 164,70 СВО До операции Неослож 61,67 ненный (28,27;80,93) Ослож- 58,80 148,80 ненный (43,96;68,44) (88,36;167,50)* Неослож 0,742 1,110 0,770 Эндотелин, ненный (0,504;1,290) (0,928;1,489) (0,571;0,886)* моль/мл Ослож- 0,587 1,487 0,699 ненный (0,459;0,834) (1,019;1,832)* (0,521;0,970)* Неослож 663,75 421,20 675,00 Фактор фон Виллебранда, ед/мл MCP-1, пг/мл ненный Осложненный (89,30;156,50)* (121,60;210,50)** 170,70 (106,80;190,20) *, ** (528,25;832,50) (285,47;624,50)* (482,75;1004,00)* 605,00 329,05 608,00 (443,05;740,00) (257,60;411,05)* (464,55;718,00)* Примечания: * p<0,05 отличия с предыдущим исследуемым периодом ^^ p<0,05 отличия с исходным уровнем Исходный уровень фактора Виллебранда (таблица 29) не отличался у пациентов двух групп и в первые сутки после операции увеличивался в 2,2 раза (p<0,05) в случае неосложненного СВО и в 2,5 раза (p<0,01) в случае осложненного. При этом к седьмым суткам послеоперационного периода в случае развившихся осложнений уровень продолжал повышаться (p<0,05) и достигал значений 170,70 (106,80;190,20) ед/мл, а в случае неосложненного течения сохранялся практически на том же уровне (164,70 (121,60;210,50)) ед/мл, но превышал исходные значения (p<0,05). 178 Динамика сывороточного уровня эндотелина у пациентов разных групп отличалась. Исходные значения традиционно были сопоставимы - 0,742 (0,504;1,290) моль/мл и 0,587 (0,459;0,834) моль/л у пациентов первой и второй групп соответственно. В первые сутки после вмешательства у пациентов с неосложненным СВО отмечается недостоверное, 1,5-кратное увеличение уровня маркера, в то время как в случае наличия осложненных реакций – достоверное (p<0,01) 2,5-кратное увеличение. В дальнейшем у пациентов обеих групп отмечается достоверное снижение (p<0,05) уровня показателя, достигающее исходных значений в обоих случаях. А вот динамика уровня моноцитарного белка хемотаксиса была однотипной у пациентов обеих групп. Отмечалось достоверное (p<0,01) снижение уровня показателя по сравнению с дооперационными значениями до 421,20 (285,47;624,50) пг/мл и 329,05 (257,60;411,05) пг/мл для неосложненного и осложненного СВО соответственно. Дальнейшее повышение уровня показателя приводило к не отличавшемуся от исходных значений уровню. Таким образом, достоверная положительная динамика уровня эндотелина у пациентов с осложненным СВО (в отличие от пациентов без такового) указывает на важное значение этого фактора в патогенезе воспалительных реакций и регулировании функции эндотелия. Так, ранее была показана связь между уровнем эндотелина и уровнем прокальцитонина, натрий уретичского пропептида, С-реактивного белка и тяжестью органных дисфункций [279]. Немаловажной может оказаться стимуляция эндотелином выброса провоспалительных интерстециальный отек, цитокинов воспалительная и опосредованный кардиомиопатия и острая миокардиальная дисфункция вплоть до сердечной недостаточности [121]. Однако в отношении динамики уровня фактора фон Виллебранда наши результаты не согласуются с данными других исследователей [271], которые указывали на снижение уровня этого показателя после операции коронарного шунтирования. Тем не менее, полученные нами данные об увеличении 179 уровня маркера подчеркивают значение vWF в патогенезе СВО как мощного фактора регуляции функции эндотелия и тромбообразования. Снижение в первые сутки после операции уровня MCP-1 указывает, скорее всего, на повышенное потребление этого мощного фактора хемотаксиса. Очевидна высокая потребность хемотаксических факторов при «прорыве» местного воспаления в системное. С этими веществами связана активная миграция моноцитов в ткани и их превращение в тканевые макрофаги. При этом без активности этих клеток невозможна реализация воспаления, в том числе системного. Таким образом, при формировании системного воспалительного ответа после кардиохирургических операций с использованием управляемой ишемии и реперфузии обязательно происходит изменение функционирования эндотелиоцитов, в том числе в отношении всех этапов их взаимодействия с иммунокомпетентными клетками (агрегация, роллинг, адгезия, миграция и дегрануляция). Выраженная динамика (в том числе отличительная для осложненного и неосложненного СВО) отмечена для целого ряда растворимых сывороточных молекул, участвующих в реализации этих этапов. Уровень sL- и sE-селектинов в первые сутки послеоперационного периода снижался у пациентов обеих групп, а на седьмые сутки возвращался к исходным значениям. Динамика уровня sPселектина была обратной. При этом именно этот маркер демонстрировал свои дифференциально-диагностические потенции в отношении характера течения СВО. Значимым представляется изменение уровня sICAM-2, который значимо снижается в первые сутки после операции, в дальнейшем повышаясь в случае осложненного СВО и находится на стабильном уровне в случае неосложненного СВО. Фиксируется не увеличение, а снижение уровня sICAM-1 после операции, причем достоверное в случае неосложненного СВО и недостоверное – в случае осложненных форм. Равно как и увеличение сывороточного VCAM-1 мы отметили лишь в случае СВО без дополнительных, отягощающих факторов. Достоверная положительная 180 динамика уровня эндотелина у пациентов с осложненным СВО (в отличие от пациентов без такового) указывает на важное значение этого фактора в патогенезе воспалительных реакций и регулировании функции эндотелия. Увеличение уровня vWF и снижение MCP-1 также указывает на их патогенетическую значимость. 181 ГЛАВА 7 ВЛИЯНИЕ АЛАРМИНОВ НА ФУНКЦИЮ МОНОЦИТОВ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПАТОГЕНЕЗЕ СВО Изначально СВО после кардиохирургических операций, выполняемых в условиях управляемой ишемии и реперфузии, протекает по типу «стерильного воспаления», но в ряде случаев может происходить присоединение инфекционного компонента. При этом одним из важных компонентов системного воспалительного ответа является активность гуморального иммунитета, проявляющаяся повышением уровня провоспалительных белков и дисбалансом цитокинов. В настоящее время важная роль в развертывании СВО отводится иммунной системе, а формирующееся понятие об аларминах позволяет объяснить некоторые механизмы стерильного СВО [43; 293]. Ранее нами было показано негативное влияние управляемой ишемии и реперфузии на ткани сердца и подтверждено повреждение клеток вследствие окислительного стресса. Кроме того, операции на сердце сопровождаются выраженным механическим повреждением тканей миокарда на этапах доступа, основного операционного приема и ушивания. Неблагоприятные воздействия достаточной силы и продолжительности вызывают гибель клеток и немедленное выделение ими во внеклеточную среду эндогенных молекул или аларминов, которые в норме содержатся внутри клеток. Алармины активируют систему врожденного иммунитета, вызывая воспаление и способствуя восстановительным и репаративным процессам [90]. Однако в случае обширного повреждения тканей возможна генерализация воспалительных факторов реакций, альтерации таких как и формирование острофазный ответ, системных лихорадка, лейкоцитоз, стресс-реакцию нейроэндокринной системы и т.д. [293]. В 182 большинстве своем эти реакции обусловлены прямым и регуляторным действием цитокинов, выделяемых, в первую очередь, иммунокомпетентыми клетками. При этом продуцентами цитокинов являются не только клетки иммунной системы, но и клетки других органов и тканей (эндотелиоциты, кардиомиоциты, макрофаги, гепатоциты и т.д.). Однако роль «тканевой продукции» и значение продуктов деструкции тканей в активации продукции и выброса цитокинов при различных патологических состояниях недостаточно изучена. Иммунная система реагирует примерно однотипным комплексом защитных реакций как на внедрение патогена так и на эндогенные молекулы поврежденных клеток (алармины). Многие алармины, подобно РАМР, являются лигандами для TLRs и NLRs [73; 90]. Так, HMGB-1 (амфотерин) является лигандом для TLR2 и TLR4, белок теплового шока 60 (Hsp 60) и Hsp 70 – для TLR2, TLR4 и CD 14 [172; 224]. В результате активируются сигнальные каскады, приводящие к синтезу ключевых медиаторов провоспалительного ответа, включая цитокины и хемокины. Моноциты и макрофаги, являясь основными носителями TLR и продуцентами цитокинов, вносят серьезный вклад в формирование гиперцитокинемии - важного патогенетического звена СВО [6]. Доказано реперфузией активирующее тканей действие на иммунную поврежденных систему [344]. ишемией Однако, и прямое активирующее действие продуктов механического повреждения миокарда на иммунокомпетентные клетки остается не изученным. Для оценки механизмов развития цитокинового дисбаланса и оценки значимости повреждения миокарда в этом процессе после операций с применением искусственного кровообращения была проведена серия экспериментов in vitro. Концепция исследования заключалась в определении влияния аларминов, выделяемых при повреждении клеток миокарда на цитокинпродуцирующую функцию иммунокомпетентных клеток. Алармины 183 представляют собой эндогенные молекулы, которые выделяются при неапоптотической гибели клеток. Они активируют клетки врожденной иммунной системы, а также запускают адаптивный иммунный ответ. В конечном итоге алармины восстанавливают гомеостаз за счет стимулирования восстановления тканей, поврежденных в результате травмы, либо воспаления. В качестве аларминов могут выступать HMGB1, S100s, кристаллы мочевой кислоты, ИЛ 1 и т.д. [43; 90]. Для создания модели механически поврежденных тканей миокарда была приготовлена цитозольная фракция кардиомиоцитов человека без применения химических реагентов и ферментов. В сравнении и для оценки комбинированного влияния эндотоксина мы использовали липополисахарид (LPS) – основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий. На модели моноцитов здорового донора in vitro оценивали влияния цитозольной фракции кардиомиоцитов, липополисахарида и их сочетания на цитокинпродуцирующую функцию и уровень поверхностной экспрессии активирующих рецепторов врожденного иммунитета моноцитов. Взвесь моноцитов здорового донора культивировали в присутствии раствора лизированных клеток миокарда ушка левого предсердия, полученных методом краевой биопсии на финальном этапе операции аортокоронарного шунтирования. Резекция ушка левого предсердия была выполнена по медицинским показаниям и являлась необходимым и неотъемлемым этапом оперативного вмешательства. Полученный биоптат сразу помещали в жидкий азот и в дальнейшем хранили при – 140оC. Гомогенат клеток готовили в асептических условиях при помощи механического растирания биоптата ткани ушка левого предсердия в гомогенизаторе Потера с добавлением стерильного PBS. Полученную взвесь центрифугировали при 4оC со скоростью 1000g в течение 15 мин, супернатант аликвотировали, замораживали и хранили при – 70оC. Непосредственно перед проведением эксперимента супернатант 184 размораживали, доводили до нужной концентрации культуральной средой, получая цитозольную фракцию поврежденных кардиомиоцитов человека (ЦФК). Использовались процентные выражения (в 1мл. 1% ЦФК содержится 61,5мкг ткани ушка предсердия; 2% ЦФК – 123мкг ткани предсердия/мл, соответственно в 5% – 307,5мкг ткани/мл). Моноциты получали методом адгезии на пластике мононуклеаров периферической крови с последующей селекцией и определением количества CD 14 позитивных клеток. Изолированные моноциты инкубировали в питательной среде при 37 оС и 5% СО2, а так же с добавлением стимуляторов: ЦФК и/или LPS. Через 6, 12 и 24 часов культивации клетки снимали с поверхности пластика трипсином, который после отделения клеток связывали фетальной бычьей сывороткой. В состав цитозольной фракции гомогената кардиомиоцитов входит большое количество компонентов, которые, в зависимости от концентрации, могут обладать различными цитотоксическими свойствами. В основу подбора оптимальной концентрации ЦФК для проведения эксперимента, был положен принцип максимальных стимулирующих свойств при минимальной цитотоксичности. стимулирующую определения Для сравнения активность оптимальных LPS. изучали На этом концентраций и цитотоксичность этапе и предварительного времени регистрации результатов, был выполнен эксперимент. Содержание Hsp70 в ЦФК. Уровень Hsp70 в сыворотке крови пациентов до операции коронарного шунтирования соответствовал 0,060 (0,029 – 0,087) нг/мл. Концентрация Hsp70 в ЦФК составила 10,2 нг/мл, что превышало содержание этого аналита в сыворотке крови пациентов перед операцией более чем в 100 раз. Соответственно, в 1% разведении ЦФК концентрация Hsp70 0,102 нг/мл, 2% ЦФК – 0,204 нг/мл, 5% ЦФК – 0,51нг/мл. 185 Изучение цитотоксичности различных концентраций ЦФК и LPS по отношению к моноцитам. Количество клеток погибших некрозом или находящихся в поздней стадии апоптоза оценивали по относительному содержанию PI+ клеток. Для этого клетки отмывали избытком PBS и окрашивали пропидия йодидом (PI). Определяли относительное количество PI-позитивных клеток среди всей популяции, которые расценивались, как погибшие некрозом или находящиеся в стадии позднего апоптоза. В качестве контрольной постановки проводили культивацию клеток в питательной среде без добавления стимулирующих агентов. А. Б. Рисунок 17 – Динамика количества PI+ моноцитов в процессе 24 часовой инкубации с различными концентрациями LPS и ЦФК (А. Стимуляция липополисахаридом; Б. Стимуляция ЦФК) Моноциты продемонстрировали низкую устойчивость к воздействию стимуляторов и культивации в целом. В течение 24 часов наблюдения в контроле прогрессивно увеличивалось относительное количество PI+ моноцитов и к концу суток составило 19%. (рисунок 17 А, Б). Этот факт вполне объясним, если учесть, что время жизни моноцитов в циркулирующей 186 крови от 24 до 72 ч, затем не мигрировавшие в ткани клетки погибают апоптозом. Присутствие LPS и ЦФК увеличивало количество погибших моноцитов. Через сутки инкубации с различными концентрациями LPS и ЦФК 1 и 2% относительное содержание PI+ клеток составило около 30%. При этом количество погибших клеток и динамика процесса были сопоставимы при культивации с различным количеством ЛПС (1, 2, 5 нг/мл) и взвесью аларминов, выделенных из кардиомиоцитов в концентрации 1% и 2%. В то же время ЦФК 5% вызывала гибель более 50% моноцитов, что может свидетельствовать в пользу высокой цитотоксичести цитозольной фракции кардиомиоцитов и входящих в ее состав аларминов. При этом выраженность цитотоксичности находится в прямой зависимости от концентрации. Оценка уровня синтеза цитокинов моноцитами при воздействии различных концентраций ЦФК и LPS (липополисахарида).Для изучения уровня продукции цитокинов моноцитами был забран объем культивационной среды через 6, 12, и 24 часов инкубации клеток без- и с добавлением стимуляторов. Определение уровня цитокинов в среде выполнено с использованием набора СВА Inflammation Kit (BD), позволяющем в 50 мкл среды определять одновременно 6 различных цитокинов (ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8, ИЛ 10, ФНО α, ИЛ 12). Пробоподготовку и настройку проточного лазерного цитометра осуществляли по протоколу фирмы производителя. Воздействие различных концентраций LPS и ЦФК на моноциты приводило к увеличению продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ 1β, ИЛ 8, ИЛ 6, ИЛ 10, ФНО α). 187 Инкубация моноцитов в присутствие LPS 1 нг/мл и 5 нг/мл сопровождалась значительным повышением уровня провоспалительных цитокинов (рисунок 18). В то же время результаты влияния LPS 0,1 нг/мл мало отличались от контрольных значений, отражая низкую стимулирующую активность. ИЛ 8 40000 ИЛ 1β 500 пг/мл пг/мл 400 30000 300 20000 200 10000 100 часы 0 часы 0 0 3 6 12 24 0 3 ИЛ 6 200 3000 150 2000 100 1000 50 часы 0 3 6 12 24 ФНО α 4000 пг/мл 0 6 12 24 пг/мл часы 0 0 3 6 12 24 ИЛ 10 60 пг/мл Контроль 50 ЛПС 1 нг/мл 40 ЛПС 5 нг/мл 30 20 10 часы 0 0 3 6 12 24 Рисунок 18 – Динамика содержания цитокинов в культивационной среде в течение 24 часовой инкубации моноцитов с ЛПС 188 ИЛ 8 12000 ИЛ 1β пг/мл 200 пг/мл 10000 150 8000 100 6000 4000 50 2000 часы 0 часы 0 0 3 6 12 0 24 3 ИЛ 6 1400 6 12 24 ФНО α 120 пг/мл 1200 пг/мл 100 1000 80 800 60 600 40 400 200 часы 0 20 часы 0 0 3 6 12 24 0 3 6 12 24 ИЛ 10 25 пг/мл Контроль 20 ЦФК 1% 15 ЦФК 2% 10 5 часы 0 0 3 6 12 24 Рисунок 19 – Динамика содержания цитокинов в культивационной среде в течение 24 часовой инкубации моноцитов с ЦФК ЦФК 1% и 2% стимулировала выработку моноцитами провоспалительных цитокинов (рисунок 19). Для проведения дальнейших исследований нами была выбрана ЦФК 2% с достаточной стимулирующей активностью и одновременно минимальной цитотоксичностью по отношению к моноцитам. Продукция ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 10 и ФНО α под влиянием LPS в концентрации 5 нг/мл многократно превышал ответ на ЦФК 2%, поэтому, для лучшей совместимости и наибольшей наглядности результатов 189 совместной стимуляции ЦФК и LPS в эксперименте был использован LPS в концентрации 1 нг/мл. Динамика синтеза цитокинов моноцитами имела определенную закономерность. Максимальный уровень продукции ИЛ 1β в ответ на ЦФК регистрировался через 6 часов инкубации, при добавлении LPS 1 нг/мл и 5 нг/мл содержание ИЛ 1β в среде повышалось на протяжении 24 часов. Так же прогрессивно увеличивалась выработка ИЛ 8 в ответ на LPS и ЦФК. Максимальная продукция ИЛ 6 и ФНО α при инкубации моноцитов в присутствии ЦФК и LPS приходилась на 12 часов культивации. Аналогичная динамика наблюдалась и в отношении ИЛ 10. Сопоставление времени пиков максимальной концентрации цитокинов показало, что оптимальным временем регистрации результатов синтеза ИЛ 1β является 6 и 12 часов стимуляции, для всех остальных цитокинов 12 часов. Влияние LPS, ЦФК и их комбинации на цитокинпродуцирующую функцию моноцитов. Инкубация моноцитов в присутствии LPS и ЦФК приводила к достоверному повышению в среде концентрации ИЛ 1β, ИЛ 8, ИЛ 6, ФНО α (таблица 30), что свидетельствует об активации моноцитов и усилении синтеза провоспалительных цитокинов. Через 12 часов воздействия на моноциты ЦФК, LPS и их комбинации регистрировалось достоверно более высокое содержание ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8 и ФНО α по сравнению с контрольными значениями. Аналогичные результаты получены для ИЛ 1β на 6 часу инкубации с теми же стимуляторами. Уровень синтеза всех исследуемых цитокинов в ответ на ЦФК был ниже, чем на LPS (таблица 30). 190 Таблица 30 – Содержание цитокинов в среде через 6 и 12 часов инкубации моноцитов в присутствии LPS, ЦФК и их комбинации Группы 6 часов 12 часов ИЛ 1β, пг/мл ИЛ 8, пг/мл ИЛ 6, пг/мл ФНО α, пг/мл Контроль 4,0 (3,9;4,1) 3,2 (3,1;3,3) 848,4 (804,8;872,8) 1,7 (1,6;1,9) 0,7(0,7;0,9) ЦФК 2% 6,3 (5,4;13,1)* 4,9 (4,2;10,9)* 1345,4 (1323,1;1723,6)* 12,7 (6,2-16,3)* 1,2 (1,1;3,1)* LPS 1нг/мл 15,4 (9,6;19,6)*,** 38,6 (24,2;48,9)*,** 2688,5 (2012,7;3325)*,** 57,9 (45,4;63,1)*,** Совместное воздействие LPS и ЦФК 32,8 (29,9;34,9) *,**,*** 50,7 (44,9;61,2) *,**,*** 5576,0 (4369,6;6245,6) *,**,*** 108,8 (89,4;150,3) *,**,*** 33,0 (26,6;39,1) *,**,*** 69,3 (58,1;74,2) **** 22,4 (17,2;27,7) **** Сумма результатов 20,8 (15,9;32,7) 42,8 (29,1;59,8) 4011,6 (3358,1;5048,6) изолированной **** **** **** стимуляции LPS и ЦФК Примечания: * – р<0,02 по сравнению с контролем ** – р<0,02 по сравнению с ЦФК *** – р<0,02 по сравнению с LPS **** – р<0,02 по сравнению с совместным воздействием LPS и ЦФК 21,3 (16,0;24,6)*,** 190 ИЛ 1β, пг/мл 191 Примечательно, что через 12 часов совместного воздействия LPS и ЦФК на моноциты содержание в среде ИЛ 8, ИЛ 6, ИЛ 1β и ФНО α было достоверно выше суммы изолированной стимуляции LPS и ЦФК (таблица 30). Такой же эффект наблюдается для ИЛ 1β через 6 часов инкубации. Таким образом, отмечается потенцирующее действие липополисахарида и цитозольной фракции клеток в отношении стимуляции продукции цитокинов моноцитов здорового донора. В литературе описано влияние аларминов на моноциты и макрофаги в условиях получения лизатов из клеток предварительно стимулированных патогенами [152]. Эта модель хорошо описывает изменения, связанные с высвобождением аларминов, в ответ на инфекционные воздействия и не затрагивает вопросов механического повреждения клеток и тканей. Тем не менее, важную роль в развития системной воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде играет массивный выброс различных аларминов из поврежденных тканей. В ЦФК исследовали концентрацию внеклеточного Hsp70, который является эндогенным сигналом тревоги и активатором иммунной системы [43]. По данным литературы, в первые 5 часов после операции АКШ в сыворотке крови пациентов регистрируется значительное увеличение содержания Hsp70 с его последующим резким снижением практически до исходных значений. Такая концентрацией ИЛ 6 и кинетика Hsp70 хорошо коррелирует с манифестацией воспалительного ответа в послеоперационном периоде [199]. Механически поврежденная ткань миокарда может являться источником внеклеточного Hsp70 и об этом свидетельствует его высокая концентрация в приготовленной ЦФК. При этом стимулирующее влияние ЦФК на моноциты коррелировало с содержанием в ней Hsp70. Так, содержание Hsp70 в активирующей моноциты 2% и 5% ЦФК было в несколько раз выше, чем в сыворотке крови, а в слабо стимулирующей 1% 192 ЦФК концентрация Hsp70 незначительно превышала аналогичные показатели сыворотки. Обнаружен синергизм и потенцирование действия LPS и ЦФК на внеклеточный синтез провоспалительных цитокинов моноцитами, поскольку результат совместного влияния LPS и ЦФК превышает сумму результатов изолированной стимуляции. Этот важный вывод согласуется с результатами других исследователей, показывающих, что алармины не только активируют воспаление поврежденных тканей, но и действуют в синергизме с патогенами микроорганизмов, усиливая воспалительную реакцию клеток врожденного иммунитета [196; 293]. Показано, что механически поврежденная ткань миокарда может являться источником аларминов, в частности внеклеточного Hsp70. При этом обнаружено соответствие содержания Hsp70 в среде и уровня синтеза моноцитами провоспалительных цитокинов, а так же поверхностной экспрессии TLR4. Подтвержден синергизм и потенцирование влияния LPS и ЦФК на синтез провоспалительных цитокинов моноцитами. Таким образом, в экспериментах in vitro показано, что обширные повреждения тканей, в частности миокарда, могут провоцировать переход местного воспаления к системному воспалительному ответу. Операция на сердце, выполняемая в условиях управляемой ишемии и реперфузии связана с гипоперфузией внутренних органов, приводящей к ишемическому повреждению кишечной стенки, нарушению барьерной функции кишечника и транслокации в кровь бактерий и других токсических продуктов, так же создает предпосылки для развития осложненных форм СВО. Повреждение тканей в результате ишемии и реперфузии и последующая возможная транслокация кишечной флоры (присоединение инфекционного компонента) могут являться дополнительными взаимоотягощающими факторами развития СВО, при том что в эксперименте in vitro показано потенцирующее влияние аларминов и ЛПС на провоспалительную активность моноцитов. 193 ГЛАВА 8 ОЦЕНКА ЗНАЧИМОСТИ ГУМОРАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА В соответствии с определением, системное воспаление - типовой мультисиндромный, фазоспецифичный развивающийся системном при патологический повреждении и процесс, характеризующийся тотальной воспалительной реактивностью эндотелиоцитов, плазменных и клеточных факторов крови, соединительной ткани, а на заключительных этапах и микроциркуляторными расстройствами в жизненно важных органах и тканях [6; 59]. Таким образом, системный воспалительный ответ характеризуется вовлечением в процесс разных органов и тканей, с возможным формированием их дисфункции и даже недостаточности. В клинических ситуациях необходима оценка дисфункции этих органов и систем, динамический мониторинг посредством специфичных маркеров. При этом выбор этих маркеров представляет собой порой непростую задачу. воспалительный Внимание ответ, исследователей развивающийся в привлекает условиях системный инфекционного воспаления. В такой ситуации ключевым моментом является верификация инфекционного агента, а оценка недостаточности органов и систем также не представляет больших сложностей вследствие яркой клинической картины и стандартизированных методов инструментальной и клинической диагностики органных дисфункций. Попытки найти диагностические маркеры и целые диагностические панели продолжаются и по сей день. В качестве таковых рассматриваются цитокины, прокальцитонин, NF-kappaB и т.д. [10; 91; 223; 274; 285]. Предлагается использование интегральных показателей, характеризующих ключевые звенья патогенеза СВО. При этом учитывают взаимосвязи 194 следующих параметров: признаки системной альтерации, количественные и полуколичественные характеристики системной воспалительной реакции, «классические» критерии эндотелиоцитов, СВО, маркеры нейроэндокринного маркеры патологической микротромбообразования, дистресса, активации показатели признаки органной дисфункции/недостаточности [42]. Ряд авторов предпринимал попытки поиска гуморальных факторов, прогнозирующих неблагоприятный исход СВО [12; 40], в том числе и инфекционного генеза [128]. В частности, при исследовании летальности при сепсисе было установлено, что сывороточный уровень ИЛ 6 (26 нг/мл), ФНО α (12 нг/мл), MIP-2 (14 нг/мл), ИЛ 1RA (65 нг/мл), ФНО soluble receptor I (3 нг/мл) и ФНО soluble receptor II (14 нг/мл ) является достоверным предиктором 24-часовой летальности [116ш]. Учитывая неоспоримую значимость клеточного иммунитета, предпринимаются попытки оценки морфологических изменений клеток иммунной системы в плане определения диагноза и прогноза системного воспалительного ответа [41]. Логичным представляется поиск факторов (маркеров) патогенетически связанных с системным воспалительным ответом и, с одной стороны, вносящих вклад в формирование системной реакции, а с другой стороны, являющихся следствием и важным патогенетическим звеном СВО. В связи с этим целесообразно провести дискриминантный анализ изученных лабораторных маркеров на определение принадлежности пациента к той или иной группе, применительно к варианту течения СВО. По определению, цель дискриминантного анализа заключается в том, чтобы на основе измерения различных характеристик (признаков, параметров) объекта, классифицировать его, то есть отнести к одной из нескольких групп (классов) некоторым оптимальным способом [3]. Кроме того, поскольку такой вид анализа является многомерным, его можно провести и с целью нивелирования ошибки первого уровня и установить наличие реально 195 значимых факторов (и их вклад) в возможную классификацию групп. В нашем случае проведение пошагового дискриминантного анализа позволит определить влияние уровня отдельных гуморальных факторов на верификацию типа течения системного воспалительного ответа. Для проведения анализа были использованы 26 гуморальных факторов, уровень которых оценивался вмешательства, в первые выполненного в сутки после условиях кардиохирургического управляемой ишемии и реперфузии, в качестве переменных, а вариант течения системного воспалительного ответа рассматривался в качестве зависимой (таблица 31). Таблица 31 – Результаты пошагового дискриминантного анализа сывороточных маркеров в отношении определения системного воспалительного ответа № Параметр Ламбда Уилкса F-критерий p шага 1 ИЛ 10 0,652 6,16 0,0027 2 vWF 0,678 9,05 0,0002 3 ИЛ 6 0,629 3,62 0,0293 4 ИЛ 1RA 0,655 6,52 0,0001 5 ИМА 0,638 4,63 0,0113 6 Кортизол 0,614 1,95 0,1450 7 sICAM-1 0,624 3,10 0,0480 8 БСЖК 0,616 2,20 0,1139 9 sVCAM-1 0,605 1,03 0,3573 10 Цистатин С 0,613 1,93 0,1495 11 proMMP-1 0,612 1,77 0,1750 12 ИЛ 12 0,605 1,03 0,3567 В результате проведенного анализа определено 12 шагов с суммарной ламбда Уилкса 0,596. Не смотря на то, что этот показатель оказался 196 достаточно высок, и это указывает на сравнительно невысокую мощность дискриминации, полученная модель будет работать с точностью 66%. Из 12 значимых параметров (F>1,0), 6 продемонстрировали повышенную значимость (F>3,0), а также статистическую достоверность p<0,05. Этими критериями оказались: фактор фон Виллебранда, ИЛ 10, ИЛ 1RA, ИМА, ИЛ 6, sICAM-1. Таким образом, из всего спектра изучаемых маркеров наибольшую значимость имели цитокины, а именно противовоспалительный ИЛ 10 и провоспалительные ИЛ 6 и ИЛ 1RA. Подтверждается положение о гиперпродукции цитокинов, как основного патогенетического фактора развития системного воспалительного ответа. Однако обычно наибольшее внимание уделяется провоспалительным факторам, таким как фактор некроза опухолей, интерлейкин 6 и интерлейкин 1β. Но в нашем исследовании демонстрируется высокая значимость именно ИЛ 10, особенно в качестве быстрореагирующего маркера, уровень которого очень лабилен, и повышается уже в процессе оперативного вмешательства, и снижается в течение считанных часов после такового. Вовлечение эндотелия в системную воспалительную реакцию также является ожидаемым результатом. Кроме того, повреждение эндотелия и вовлечение иммунокомпетентных клеток во взаимодействие с эндотелиальным слоем при их миграции в ткани, очаги воспаления, является значимым фактором именно системности (вовлечения отдаленных органов и систем) происходящих процессов. При этом по данным дискриминантного анализа наиболее характерными для определения варианта течения СВО являются изменения сывороточного уровня фактора Виллебранда и sICAM-1. Свою значимость в верификации варианта течения системного воспалительного ответа продемонстрировал ишемия модифицированный альбумин. Этот маркер по-прежнему остается недостаточно изученным, особенно применительно к развитию системных воспалительных реакций после вмешательств с использованием управляемой ишемии и реперфузии. 197 Тем не менее, оказывается, что выраженность окислительного стресса и состояние компенсаторных (буферных) систем играет важную, возможно ключевую роль в запуске системного воспалительного ответа, ассоциированного с ишемией и реперфузией. При этом закономерным результатом оказывается высокая значимость (F=2,20) БСЖК в определении групповой принадлежности. Уровень маркера, который при умеренном увеличении подтверждает гипоксию тканей, а при значительном – повреждение и деструкцию, увеличивается в ответ на интраоперационный окислительный стресс. Очевидно, что ключевым участником формирования системного воспалительного ответа оказывается клеточное звено иммунитета, а именно моноцитарно-макрофагальная система. Для уточнения вклада изученных маркеров, характеризующих субпопуляции моноцитов, в дифференцировку вида системного воспалительного ответа (неосложненный, осложненный) был проведен пошаговый дискриминантный анализ (таблица 32). Таблица 32 – Результаты пошагового дискриминантного анализа характеристик субпопуляций моноцитов в отношении определения системного воспалительного ответа № Параметр шага Ламбда F-критерий p Уилкса 1 MIF CD16 на CD14hiCD16- 0,640 13,03 0,003 2 CD 14hiCD16-, абс. 0,456 5,84 0,032 3 MIF CD54 на CD14hiCD16+ 0,488 7,09 0,020 4 MIF CD14 на CD14hiCD16- 0,414 4,18 0,063 5 MIF CD54 на CD14hiCD16- 0,347 1,59 0,231 6 MIF CD14 на CD14dimCD16+ 0,336 1,13 0,307 В результате определено 6 шагов. При этом суммарная ламбда Уилкса для получившейся схемы составила 0,306, что говорит о достаточно высокой 198 мощности дискриминации. Разделение пациентов на группы по варианту течения системного воспалительного ответа (неосложненный, осложненный) с использованием получившейся шкалы будет иметь точность 94,7%. Значимыми оказались критерии, характеризующие, в первую очередь, CD14hiCD16- и CD14hiCD16+ моноциты. Активность клеток напрямую связанная с интенсивностью поверхностной экспрессии рецепторов. Для клеток указанных субпопуляций этими рецепторами оказались CD 16, CD 14, т.е. тропные к липополисахариду и Fc-фрагменту иммуноглобулина. По уровню поверхностной экспрессии этих рецепторов и происходит разделение на субпопуляции, а функциональная активность и значимость, связанная с инициацией воспаления, в первую очередь, инфекционного. Полученные данные указывают на вовлечение тех же механизмов клеточной активности при неинфекционном системном воспалительном ответе, что и при инфекции. Обращает на себя внимание значимость плотности рецепторов CD 54 на CD14hiCD16+ и CD14hiCD16-. Рецептор молекулы межклеточной адгезии ICAM участвует в процессе миграции иммунокомпетентных клеток в ткани. Значимость показателя на «провоспалительных» и «патрулирующих» моноцитах указывает на высокую функциональную активность клеток в отношении трансмиграции. Механизм этот является неспецифическим, и направленное движение клеток происходит, в первую очередь, в сторону очага инфекционного воспаления. Однако при развитии неинфекционного СВО очевидно не только увеличение численности циркулирующих в кровотоке моноцитов, но и их направленное движение в ткани. Повидимому, такое движение является одним из компонентов (на равнее с гуморальным) компартментализации неинфекционного воспаления с вовлечением органов и тканей. Таким образом, для определения варианта течения системного воспалительного ответа наиболее значимыми являются ИЛ 10, ИЛ 6, ИЛ 1RA, vWF, ИМА, sICAM-1, что подчеркивает ключевое значение про- и 199 противовоспалительных цитокинов, а также маркеров эндотелиальной дисфункции в патогенезе системного воспалительного ответа. Важность циркулирующих моноцитов подтверждается результатами анализа клеточного звена. Наибольшая значимость в дифференцировке СВО принадлежит CD14hiCD16экспрессии CD 54. и CD14hiCD16+ моноцитам, а также уровне 200 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В связи со значительным прогрессом хирургических методик, технологий жизнеобеспечения, реперфузионных защиты повреждений, органов терапии от ишемических критических и состояний увеличивается спектр и сложность оперативных вмешательств, выполняемых пациентам с сердечно-сосудистой патологией. При этом повышается сложность самих операций, увеличивается их продолжительность, удлиняется время искусственного кровообращения и пережатия аорты, расширяются показания к оперативному лечению, повышается уровень сложности курации пациентов. Проведение кровообращения, этиология и любых операций сопряжено патогенез с в условиях инициацией которого, особенно искусственного системного на воспаления, начальных этапах, недостаточно изучены. При этом давно и всесторонне изучается системный воспалительный ответ инфекционной природы, а также синдром полиорганной недостаточности, являющийся крайним проявлением многих терминальных состояний, в том числе инициированных СВО. На фоне этого представляется обоснованным воспалительного ответа, изучение развивающегося патогенеза после системного кардиохирургических вмешательств, особенно с применением искусственного кровообращения. В результате проведенного исследования установлено, что, несмотря на проводимые интраоперационно мероприятия по органопротекции, отмечается достаточно выраженное повреждение клеток миокарда, что подтверждается динамикой уровня маркеров цитолиза в коронарном и системном кровотоке. Зарегистрировано повышение уровня КФК-МВ в крови коронарного синуса на 71% в начале реперфузии, и на 97% к моменту окончания ИК относительно исходных значений. В периферической крови 201 обнаружено более позднее увеличение уровня этого маркера повреждения по сравнению с кровью из коронарного синуса. В процессе оперативного вмешательства в крови коронарного синуса в 5 раз увеличивается уровень H-FABP – чувствительного и специфичного маркера повреждения миокарда. Уровень H-FABP у пациентов с неосложненным СВО повышался в 2,2 раза. В случае статистически осложненного значимым СВО (p<0,05). повышение было Значимость 2,8-кратным, интраоперационного повреждения миокарда в патогенезе послеоперационных осложнений иллюстрирует динамика сывороточного уровня H-FABP с полиорганной недостаточностью, когда значения превышали исходные в 11,3 раза и составляли 18,04 кардиомиоцитов сопровождающей (2,68;18,35) в процессе мг/л. Таким управляемой кардиохирургические образом, ишемии операции, и повреждение реперфузии, может вносить существенный вклад в патогенез развивающегося в послеоперационном периоде системного воспаления. При этом, чем больше степень повреждения (подтвержденная динамикой лабораторных маркеров), тем больше риск развития тяжелых осложненных форм СВО. При этом подъем уровня H-FABP, особенно в раннем периоде, может быть объяснен ишемическими, а не некротическими процессами. Наличие ишемии миокарда также подтверждается повышением уровня лактата в коронарном синусе с 17,65 (13,35;25,10) мг/дл до начала кардиоплегии до 32,40 (22,00;48,40) мг/дл перед реперфузией и до 30,20 (20,80;46,40) мг/дл после таковой. За время кардиоплегии, сопровождающей искусственное кровообращение, развитие выраженного некроза миокарда невозможно, т.к. на это требуется больше времени. Косвенным подтверждением служит отсутствие повышения тропонина I - специфичного маркера некроза миокарда и отсутствие дальнейшего подъема уровня КФК-МВ в периферической крови через сутки после операции по сравнению с таковым на момент окончания ИК. 202 Гипоксия может оказывать триггерное влияние на клетки как в плане запуска программы апоптоза, так и в отношении некроза. При этом если исходно уровень лактата в группе с осложненным СВО был ниже такового у пациентов с неосложненным течением, то далее в процессе кардиоплегии отмечалась инверсия – значения в группе с осложнениями были достоверно сниженными. Таким образом, умеренная гипоксия, без существенного смещения кислотно-щелочного равновесия, сама по себе не является пусковым фактором повреждения клеток миокарда и не провоцирует развитие осложненных форм СВО. Немаловажную роль в процессах повреждения играет клеточный апоптоз, хотя слабовыраженная динамика уровня маркеров, ассоциированных, прежде всего, с рецепторным путем, указывает на большую значимость митохондриального пути. Установлено, что как в случае неосложненного, так и в случае осложненного течения послеоперационного периода концентрации sAPO-1/Fas, sCD40 и sFasL в крови коронарного синуса не имели тенденции к изменению в процессе проводимого оперативного вмешательства. Уровень белка p53, позволяющий косвенно оценивать распространенность апоптоза, также не увеличивался в процессе ИК. По-видимому, главным инициирующим фактором запуска каскада реакций, приводящих, в конечном счете, к развитию в раннем послеоперационном периоде системного воспалительного ответа, является ишемия и реперфузия и связанный с этим окислительный стресс, что подтверждается повышенным уровнем ДК, МДА и лактата в крови коронарного синуса на всех этапах проведения вмешательства. Установленная динамика интенсивности окислительного стресса может быть обусловлена недостаточными компенсаторными возможностями организма больных ИБС, которые в условиях длительно существующей ишемии миокарда существенно снижаются. При проведении ИК в ткани миокарда под влиянием гипоксии создаются условия для дополнительной 203 генерации радикальных продуктов, повышения интенсивности окислительной деструкции белков и липидов, что в итоге может приводить к нарушению структуры и функции клеточных мембран и клеток в целом. Наиболее значимым патогенетическим фактором ИК является реперфузия, обуславливающая значительное повышение напряжения кислорода, что стимулирует дальнейшую активацию свободнорадикальных процессов. Воздействие ишемии/реперфузии, операционного стресса и механического повреждения тканей при выполнении КШ сопровождается существенным увеличением в сыворотке крови продуктов липопероксидации. При этом выраженность окислительного стресса в тканях сердца в процессе управляемой ишемии/реперфузии, сопровождающей операции коронарного шунтирования влияет на течение послеоперационного периода в отношении тяжести системного воспалительного ответа. Осложненный в послеоперационном периоде СВО ассоциирован с более низким интраоперационным уровнем лактата и малонового диальдегида. Уровень диеновых конъюгатов у пациентов с неосложненным течением СВО динамически изменялся, в то время как отсутствие динамики уровня показателя приводило к развитию осложнений в послеоперационном периоде. Компартментализация системного воспалительного ответа представляет собой отдельную малоизученную проблему патогенеза этого состояния. Действиетльно, вовлечение органов и тканей обеспечивает системность процесса с одной стороны, с другой – предопределяет тяжесть органных дисфункций, поддержание патологического состяния. Очевидно, что цитокины, являясь обязательными участниками воспалительного процесса, в том числе системного, оказываются за счет своего дистантного действия эффекторами, переносчиками воспаления. В результате происходит формирование порочного круга с гиперпродукцией, в первую очередь, провоспалительных цитокинов, вовлечением отдаленных органов с эффектом компартментализации СВО. 204 Наравне с обусловленным механическим этапами повреждением хирургического клеток и вмешательства тканей, (доступ, хирургический прием и ушивание), окислительный стресс приводит к цитолизу с выходом во внеклеточное пространство клеточного содержимого, которое обладает инфламаторным действием. В первую очередь провоспалительный эффект реализуется за счет аларминов – молекул, способных связываться с поверхностными рецепторами врожденного иммунитета (TOLL, NOD) иммунокомпетентных клеток. В экспериментах in vitro было показано, что стимуляция моноцитов цитозольной фракцией кардиомиоцитов, с содержащимися в ней аларминами, приводит к активации клеток и стимуляции продукции цитокинов. При этом аналогичное стимулирование моноцитов липополисахаридом – неотъемлимым компонентом клеточной стенки бактерий, приводит к однонаправленным, но более выраженным реакциям. В то же время совместное стимулирование ЛПС и цитозольной фракцией кардиомиоцитов приводит к потенцированию действию этих стимуляторов. Представленная модель демонстрирует один из наиболее значимых механизмов инициации иммунокомпетентных системного клеток (в воспаления первую очередь с вовлечением моноцитарно- макрофагального ряда) в ответ на повреждение кардиомиоцитов. При этом продемонстрировано, что присоединение бактериальной инфекции будет оказывать потенцирующий (а не простой суммирующий) эффект на иммунокомпетентные клетки в отношении продукции цитокинов. Дисбаланс цитокинов – одно из основных проявлений и патогенетических звеньев системного вопалительного ответа. Установлено, что выбросом цитокинов (в первую очередь интерлейкинов 6 и 10) организм реагирует на самое оперативное вмешательство, что детектируется в системном кровотоке уже по ходу операции. Кроме того, значимым оказывается вклад сердечного компартмента в развитии цитокинового 205 дисбаланса, на что указывает приоритетное увеличение уровня ИЛ 10 и ИЛ 6 в крови коронарного синуса. Высокий уровень по ходу операции провоспалительного интерлейкина 6 отмечен как в коронарном синусе, так и в периферическом кровотоке. При этом в послеоперационном периоде (1 час после окончания операции) продолжается увеличение значений этого показателя в системном кровотоке. Антивоспалительный ИЛ 10 демонстрировал иные тенденции. Высокий уровень в процессе оперативного вмешательства снижался уже через час после окончания операции. В экспериментах на лабораторных животных с моделированием ишемии-реперфузии и оценкой участия инфламмасом в реализации компенсаторных реакций было показано, что ишемизированные участки миокарда продуцируют повышенное количество ИЛ 6 по сравнению с неишемизированными [106]. Увеличение уровня ИЛ 10 при повреждениях миокарда, связанных с ишемией-реперфузией, происходит преимущественно после реперфузии, но не ишемии. В раннем реперфузионном периоде значительное повышение ИЛ 10 в циркулирующей крови снижает инфильтрацию ишемизированных тканей нейтрофилами и тромбоцитами, подавляет экспрессию ICAM-1 эндотелием. Таким образом, поддерживается проходимость сосудов сердца, поврежденных ишемией-реперфузией. В синтезе ИЛ 10 могут участвовать различные клетки, однако основными источниками ИЛ 10 в раннем периоде ишемии-реперфузии миокарда считаются нейтрофилы, моноциты и макрофаги, а так же инфильтрирующие миокард лимфоциты [156; 341; 368]. Исследование сывороточного уровня цитокинов – главных участников системного воспалительного ответа - в послеоперационном пероиде коронарного шунтирования, выполненного в условиях управляемой ишемии и реперфузии продемонстрировало следующие тенденции. Установлено, что динамика не провоспалительного интерлейкина 1β, а его рецепторного антагониста является наиболее значимой в случае развития осложненного и 206 неосложненного системного воспалительного ответа после оперативного вмешательства на сердце с применением управляемой ишемии и реперфузии. При этом прирост сывороточного уровня рецепторного антагониста интерлейкина 1 оказывается более выраженным в случае неуправляемого течения СВО и формирования полиорганной недостаточности. Такая динамика уровня рецепторного антагониста (при полном отсутствии динамических изменений сывороточногоИЛ 1β) может быть связана с достаточно массивным повреждением клеток, связанным с ишемическими и реперфузионными повреждениями, и, как следствие, массивному выходу аларминов. При этом одним из основных является внутриклеточный интерлейкин 1α. Характерной особенностью динамического профиля ИЛ 6 у пациентов разных групп можно считать более слабый ответ одного из основных провоспалительных цитокинов у пациентов с осложненным течением СВО. По-видимому, сниженное реагирование на операционный стресс и ишемию/реперфузию является одним из патогенетических звеньев перехода системного воспалительного ответа к его осложненным формам. ИЛ 10 уже исходно был повышен у пациентов в случае развития осложненного СВО после коронарного шунтирования, выполненного в условиях управляемой ишемии и реперфузии. Динамика уровня цитокина у пациентов с неосложненным СВО принципиально не отличалась от таковой у пациентов с признаками осложненного ответа. В нашем исследовании исходный уровень интерлейкина 12 у пациентов с осложнившимся и неосложнившемся в последующем послеоперационным СВО различался (p<0,01). При этом у пациентов с осложненным СВО он был выше, чем у пациентов с неосложненным послеоперационным периодом. В первые сутки после вмешательства уровень цитокина снижается у пациентов обеих групп. При этом в случае неосложненного СВО значения ИЛ 12 снижались в 2,2 раза, а в случае осложнений – в 7,7 раза. К исходу первых суток послеоперационного 207 периода уровень цитокина достоверно (p=0,05) отличался и был более высоким при осложненном СВО (8,77 (6,71;26,44) пг/мл), чем при неосложненном СВО - 6,19 (4,74;11,73) пг/мл. К седьмым суткам уровень ИЛ 12 опять повышается у пациентов обеих групп. При этом в случае отсутствия осложнений уровень этот оказывается выше дооперационного (p<0,05), а в случае осложненного СВО оказывается ниже дооперационного (p<0,01). Обращает на себя факт различия исходного уровня ряда цитокинов у пациентов с последующим осложненным и неосложненным течением послеоперационного периода. Так, уровень ИЛ 10 и ИЛ 12 до вмешательства был достоверно выше у пациентов с осложненным СВО и это при том, что у пациентов исходно не было обнаружено достоверных клинический различий в степени органных дисфункций и тяжести течения основного заболевания. Подтверждается высокая не только диагностическая, но и прогностическая значимость ИЛ 10 и ИЛ 12 в развитии СВО. При этом, по-видимому, эти изменения связаны с активностью моноцитарно-макрофагального звена иммунитета. Клетки моноцитарно-макрофагального ряда оказываются важными продуцентами цитокинов – основных медиаторов воспаления. Однако повышение продукции цитокинов является не единственной реакцией иммунокомпетентных клеток. На фоне развития СВО в системном кровотоке отмечаются изменения уровня лизосомальных протеаз – катепсинов и матриксных металлопротеиназ, а также их естественных ингибиторов. Лизосомальные ферменты могут участвовать в инициации апоптоза, деструкции внеклеточного матрикса, фагоцитарной активности иммунокомпетентных клеток, активации местного и системного воспаления. Учитывая результаты нашего исследования, где показано, что у пациентов с осложненным СВО после операций на открытом сердце, выполненной в условиях управляемой ишемии и реперфузии, отмечается изменение цитокинового профиля, становится объяснимым и понятным факт пониженной активности сывороточных металлопротеиназ, в частности ММР- 208 3. При том, что триггером к запуску цитокинового каскада, активации нейтрофилов и макрофагов является повреждение клеток с выходом аларминов, продуктов апоптоза в органах и тканях [56]. Имеет место пониженная цитокиновая активация продукции протеаз эффекторными клетками (активированными макрофагами, нейтрофилами, фибробластами) в первые сутки послеоперационного периода. По-видимому, процесс системного воспаления приводил, в том числе, и к повышенной активности металлопротеиназ (по крайней мере, ММР-9), которая, в свою очередь, может участвовать как в процессах послеоперационного ремоделирования миокарда, так и в прогрессировании атеросклеротического процесса и дестабилизации бляшки, в том числе некоронарной локализации. Кроме того, ММР-9 участвует в реакции шединга (слущивания) рецепторов с поверхности клеток (в частности TREM1), что приводит к накоплению в кровотоке большого количества растворимых форм, активно участвующих в развитии и поддержании системной воспалительной реакции. Таким образом, зафиксирована взаимосвязь между уровнем ММР-9 и развитием послеоперационных осложнений, связанных с системным воспалением и органными дисфункциями у кардиохирургических больных. Повышение уровня тканевых ингибиторов матриксных протеиназ является сдерживающим, лимитирующим фактором чрезмерной деструктивной активности самих протеаз. При этом тканевые ингибиторы оказываются последней линией регуляции при недостаточной эффективности эпигенетических, биохимических, антиоксидантных механизмов регуляции. После ишемии и реперфузии миокарда развивается дисбаланс MMP и TIMP, который, в первую очередь, связан с повышенной активностью матриксных металлопротеиназ. Кроме того, ингибиторная активность TIMP может резко уменьшаться вследствие гиперпродукции пероксинитрита как результата окислительного стресса, сопровождающего ишемию и реперфузию [191; 214]. 209 Таким образом, шунтирования в после условиях выполненной управляемой операции ишемии и коронарного реперфузии демонстрируется повышенная, по сравнению с дооперационной, активность металлопротеиназ и пониженная активность их ингибиторов в большей степени у пациентов с неосложненным СВО. Подтверждается гипотеза о развитии СВО при пониженной активности иммунной системы и связанных с ее активностью механизмов, к числу которых относится активность протеаз, индуцированная ишемией и реперфузией с развитием окислительного стресса и повреждением клеток. Не исключается участие катепсина B, динамика изменения которого оказалось значимой, в поддержании воспаления в ответ на альтерацию. Катепсины могут выступать как основные посредники между стимулами апоптоза, белком р53, цитокинами. Повышение уровня прокатепсина B в послеоперационном периоде шунтирующих операций, по-видимому, связано с активацией процессов апоптоза, вызванного ишемией и реперфузией, сопровождавших кардиоплегию. При формировании системного воспалительного ответа после кардиохирургических операций с использованием управляемой ишемии и реперфузии обязательно происходит изменение функционирования эндотелиоцитов, в том числе в отношении всех этапов их взаимодействия с иммунокомпетентными клетками (агрегация, роллинг, адгезия, миграция и дегрануляция). Выраженная динамика (в том числе отличительная для осложненного и неосложненного СВО) отмечена для целого ряда растворимых сывороточных молекул, участвующих в реализации этих этапов. Уровень sL- и sE-селектинов в первые сутки послеоперационного периода снижался у пациентов обеих групп, а на седьмые сутки возвращался к исходным значениям. Динамика уровня sP-селектина была обратной. При этом именно этот маркер демонстрировал свои дифференциально- диагностические потенции в отношении характера течения СВО. Значимым представляется изменение уровня sICAM-2, который снижается в первые 210 сутки после операции, в дальнейшем повышаясь в случае осложненного СВО и находится на стабильном уровне в случае неосложненного СВО. Фиксируется не увеличение, а снижение уровня sICAM-1 после операции, причем достоверное в случае неосложненного СВО и недостоверное – в случае осложненных форм. Равно как и увеличение сывороточного VCAM-1 мы отметили лишь в случае СВО без дополнительных, отягощающих факторов. Достоверная положительная динамика уровня эндотелина у пациентов с осложненным СВО (в отличие от пациентов без такового) указывает на важное значение этого фактора в патогенезе воспалительных реакций и регулировании функции эндотелия. Увеличение уровня vWF и снижение MCP-1 также указывает на их патогенетическую значимость. Со стороны клеточного иммунитета закономерной реакцией является увеличение количества лейкоцитов, преимущественно за счет гранулоцитов и В-клеток, в то время как количество Т-клеток снижается. Однако, повидимому, ключевую роль в реализации системного воспаления играют клетки моноцитарно-макрофагального звена иммунитета. Кроме общего увеличения количества моноцитов периферической крови, меняется и их субпопуляционный состав. Наиболее консервативной оказалась самая «многочисленная» популяция CD14hiCD16- клеток. Абсолютное их количество у пациентов разных групп в первые сутки после операции менялось недостоверно. Только к седьмым суткам после вмешательства отмечалось достоверное (p<0,01) увеличение количества клеток у пациентов с осложненным и неосложненным СВО. Основными функциями этих клеток является фагоцитарная активность, синтез факторов хемотаксиса и антимикробицидных факторов, т.е. та активность, которая необходима при поступлении инфекционного агента. Однако в случае проведения кардиохирургической операции по реваскуляризации миокарда в условиях управляемой ишемии и реперфузии развивается системный воспалительный ответ неинфекционного генеза и, следовательно, количественная реакция CD14hiCD16- в первые сутки после 211 вмешательства нехарактерна. С другой стороны, предполагается, что на фоне атеросклеротического поражения мезентериальных сосудов и в условиях нарушения микроциркуляции, сопровождающей развитие системного воспалительного ответа возможна транслокация кишечной флоры, что должно приводить к реакции иммунной системы. В такой ситуации увеличение количества CD14hiCD16- клеток к седьмым суткам после вмешательства представляется объяснимым. Иной была динамика количества клеток с фенотипом CD14hiCD16+. В первые сутки после вмешательства у пациентов обеих групп их количество увеличивалось (p<0,01) больше, чем в 5 раз. В дальнейшем отмечалась отрицательная динамика количества клеток. Однако, к седьмым суткам у пациентов как с неоосложненным, так и с осложненным СВО сохранялся повышенный (p<0,01) уровень относительно исходных значений. Такое резкое увеличение количества CD14hiCD16+ клеток через сутки после вмешательства закономерно. Активность этих клеток связана, в первую очередь, с продукцией непременным провоспалительных цитокинов, системного воспалительного атрибутом являющихся ответа. Сохраняющийся высокий уровень к седьмым суткам после вмешательства демонстрирует потенциальную активность моноцитов в отношении поддержания воспаления. В отличие от двух других субпопуляций, количество CD14dimCD16+ клеток в первые сутки после вмешательства имело тенденцию к снижению. В случае неосложненного СВО уровень остается стабильным и к седьмым суткам послеоперационного периода. С другой стороны у пациентов с осложненным СВО количество CD14dimCD16+ к седьмым суткам увеличивается (p=0,04). Тем не менее, именно эта субпопуляция моноцитов демонстрирует свою количественную консервативность. Учитывая тропность клеток CD14dimCD16+ к эндотелию, а так же выполнение ими патрулирующих функций в отношении эндотелия, в том числе в микроциркуляторном русле, представляется логичным большая 212 лабильность этой субпопуляции клеток в реализации системного воспалительного ответа. Предположительно вовлечение эндотелия и отчасти развитие последующих микроциркуляторных расстройств связано именно с этой минорной популяцией клеток. Проведена оценка средней интенсивности флуорисценции рецепторов на поверхности моноцитов. Полученные результаты дают основания предполагать, что в ответ на альтерацию тканей, связанную с оперативным вмешательством и искусственным кровообращением, имеет место выход клеток моноцитарного ряда (с высоким и низким уровнем экспрессии CD14) в ткани с последующей дифференцировкой в тканевые макрофаги. Наши результаты свидетельствуют об активации моноцитов CD14hiCD16– в раннем послеоперационном периоде с соответственным снижением на поверхности экспрессии CD14 и появлением рецептора CD16, в результате чего происходит увеличение клеток с фенотипом CD14hiCD16+. Миграция моноцитов в ткани, их превращение в тканевые макрофаги и активность последних являются важными аспектами развития и поддержания процесса воспаления. субпопуляционного состава Была показана моноцитов динамика периферической изменения крови при системном воспалительном ответе после операций по реваскуляризации миокарда, выполненных в условиях управляемой ишемии и реперфузии. При этом изменяется не только количественный состав субпопуляций моноцитов, но и их функциональный потенциал, проявляющийся изменением уровня экспрессии основных кластеров дифференцировки на их поверхности, а именно CD14 и CD16. На поверхности моноцитов меняется уровень экспрессии многих рецепторных молекул, в том числе рецепторов CD 62L и CD 54. При этом в случае формирования осложненного СВО уровень поверхностной экспрессии CD 62L на CD14hiCD16+, CD14hiCD16-, CD14dimCD16+ субпопуляциях более высокий, чем в случае неосложненного СВО. При этом в случае осложненного СВО к седьмым суткам на поверхности CD14hiCD16- 213 моноцитов экспрессия CD 62L продолжает повышаться, а на поверхности CD14hiCD16+ и CD14dimCD16+моноцитов - снижаться. Послеоперационный период с развившимся СВО ассоциировался со снижением экспрессии ICAM-1 (CD 54) на всех субпопуляциях моноцитов. В первые сутки после операции на поверхности CD14hiCD16- моноцитов в случае неосложненного СВО уровень экспрессии снижался на 15%, в то время как в случае развития осложненного СВО – на 37%. На поверхности CD14hiCD16+ уровень экспрессии CD 54 также снижался (p=0,04). При этом в случае неосложненного СВО в первые сутки после вмешательства этот показатель составлял 85% от исходного, а при осложненном СВО – 63%. Кроме того, в отсутствие осложнений к седьмым суткам экспрессия ICAM на поверхности «провоспалительных» моноцитов возвращалась к исходному уровню, а при осложненном СВО экспрессия продолжала снижаться, была ниже исходных значений (p<0,05). Эти рецепторы обеспечивают контакт иммунокомпетентных клеток с клетками эндотелия. Это момент оказывается важным при миграции клеток в ткани, в очаги воспаления. Трансформация моноцитов в макрофаги является важным компонентом воспалительной реакции. С другой стороны с поверхности клеток, металлопротеиназ в том происходит числе моноцитов, слущивание под действием поверхностных клеточных рецепторов (селектинов, молекул межклеточной адгезии) с образованием циркулирующих растворимых форм. Последние, в свою очередь, могут самостоятельно приводить к микроциркуляторным расстройствам, а также могут являться маркерами развивающейся эндотелиальной дисфункции. В результате всех этих процессов развиваются нарушения микроциркуляции (в том числе с возможным микротромбообразованием), которые являются основным патогенетическим звеном системного воспалительного ответа. Значимость нарушений в патогенезе нашла свое отражение в определении системной воспалительной реакции по Черешневу В.А. 214 Нарушения микроциркуляции могут играть дополнительную важную роль в патогенезе СВО у пациентов с атеросклерозом, оперированных в объеме коронарной реваскуляризации в условиях искусственного кровообращения. В большинстве случаев атеросклеротическое поражение коронарного русла сочетается с поражением других сосудистых бассейнов с формированием мультифокального атеросклероза. У ряда пациентов в качестве сопутствующего заболевания может выступать сахарный диабет либо нарушение толерантности к углеводам, которые, в свою очередь, являются самостоятельным фактором нарушения микроциркуляции. Мультифокальный атеросклероз может ассоциироваться с поражением мезентериальных сосудов. При этом поражение это может быть не диагностированным вследствие своей компенсированности либо субкомпенсированности. В свою очередь операция на сердце в условиях ИК связана с гипоперфузией внутренних органов, приводящей к ишемическому повреждению кишечной стенки, нарушению барьерной функции кишечника и транслокации в кровь бактерий и других токсических продуктов. И все это на фоне микроциркуляторных расстройств, вызванных неинфекционным СВО, развивающемся в послеоперационном периоде. Все основные патогенетические звенья системного воспалительного ответа неинфекционного генеза представлены на принципиальной схеме (рисунок 20). 215 215 Рисунок 20 – Принципиальная схема патогенеза системного воспалительного ответа после проведения операции в условиях искусственного кровообращения 216 Варианты течения системного воспалительного ответа, а также причины и условия его перехода в полиорганную недостаточность, приводящую к летальным исходам, все еще изучаются и пока еще далеки от полной ясности. По-видимому, наиболее близкой к истине и адекватной в использовании является классификация В.А. Черешнева [59] по которой выделяется 5 фаз развития СВО: 1 – маргинальная, 2 – первичного флогогенного удара, 3 – гипоэргическая, 4 – вторичного флогогенного удара, 5 – разрешения. У пациентов с системным воспалительным ответом, развивающимся в первые сутки послеоперационного периода коронарного шунтирования, выполненного в условиях искусственного кровообращения в большинстве случаев регистрируется фаза первичного флогогенного удара с гиперцитокинемией провоспалительных и противовоспалительных регуляторных молекул. Такой ответ можно считать наиболее благоприятным, поскольку он сразу может переходить в фазу разрешения. Пациентов с именно таким вариантом течения воспалительного ответа мы относили к группе с неосложненным течением СВО. Адекватная по силе реакция иммунной системы приводила к наиболее благоприятному течению послеоперационного периода. Однако у пациентов, которых мы характеризовали как «осложненный СВО», клинико-лабораторная картина состояния в первые сутки после операции была иной. У пациентов этой группы отмечались более низкие значения цитокинов, и, вообще, регистрировалась менее выраженная динамика основных катехоламинов, изучаемых лизосомальных растворимых ферментов, маркеров маркеров (цитокинов, эндотелиальной дисфункции). В совокупности с менее значимой динамикой и маркеров клеточного иммунитета становится очевидным, что реакция иммунной системы на хирургическое вмешательство у этих пациентов оказывается недостаточной, неадекватной. По описанию состояние пациентов соответствует гипоэргической фазе системного воспалительного ответа. Предполагается, что эта фаза может наступать после гиперэргической фазы 217 флогогенного удара. При этом авторы классификации не детализируют последовательность наступления третьей фазы, вероятность ее наступления после гиперэргической фазы признается маловероятной, а непосредственный переход из первой, маргинальной не рассматривается вовсе. Однако у обследованных пациентов через одинаковый промежуток времени после окончания оперативного вмешательства (в пределах 1 суток) регистрируется клинико-лабораторная картина, свойственная разным фазам СВО: гиперэргическая либо гипоэргическая. Таким образом, либо наступление гипоэргической фазы происходит стремительно, а гиперэргическая оказывается столь непродолжительной, что ее не удается зафиксировать в избранные временные промежутки исследования и выбранными методами, либо наступление этой фазы происходит непосредственно после инициаторной, маргинальной. При этом, по-видимому, причинами такого ослабленного иммунного ответа являются анатомо-функциональные особенности иммунной системы, предположительно обусловленные генетическим детерминированием. Последовательность гиперэргической патогенетическим либо наступления гипоэргической фазы: сразу после маргинальной, является фактором системного воспалительного после важным ответа неинфекционной природы. Кроме того, верификация третьей фазы СВО играет важную роль с клинической точки зрения, поскольку наиболее вероятным последующим сценарием развития событий является наступление фазы вторичного флогогенного удара с последующим выходом в полиорганную недостаточность с возможным летальным исходом. Сценарий дальнейшего, после гипоэргической фазы, разрешения системного воспаления с благоприятным исходом считается менее вероятным. Повидимому, последний вариант становится реальным при применении дополнительных методов интенсивной терапии. В связи с этим становиться очевидной целесообразность разделения вариантов течения системного воспалительного ответа неинфекционной 218 природы после проведения операции коронарного шунтирования в условиях управляемой ишемии и реперфузии. Это деление, связанное со стадийностью процесса, отражает закономерности течения СВО и его возможный переход в полиорганную недостаточность. 219 ВЫВОДЫ 1. Несмотря на проводимую во время операции коронарного шунтирования кардиопротекцию, происходит повреждение клеток миокарда, не только вследствие хирургического приема, но и окислительного стресса, инициированного ишемией и реперфузией. При этом степень повреждения в отношении развития осложненного системного воспалительного ответа в послеоперационном периоде не играет прогностической роли. 2. Развитие повышением системного миграционная воспалительного способности ответа CD14hiCD16+, сопряжено с CD14hiCD16–, CD14dimCD16+ субпопуляций моноцитов, о чем свидетельствует увеличение плотности селектиновых рецепторов CD62L при одновременном снижении плотности рецепторов межклеточной адгезии CD54. Эти изменения в большей степени выражены при развитии осложненного системного воспалительного ответа. 3. При системном воспалительном ответе, инициированном кардиохирургической операцией, выполненной в условиях искусственного кровообращения, развивается дисбаланс цитокинов, характеризующийся увеличением сывороточных концентраций ИЛ 1RA, ИЛ 6, ИЛ 10 и снижением - ИЛ 12. Сердечный компартмент играет ключевую роль в развитии дисбаланса цитокинов, являющегося важным патогенетическим звеном формирования системного воспалительного ответа. При этом для неосложненного системного воспалительного ответа характерными оказываются более высокие значения ИЛ 6 в первые сутки после вмешательства, а ИЛ 10 – на седьмые. Повышенные значения ИЛ 10 и ИЛ 12 до операции оказываются прогностически неблагоприятными в отношении развития осложненного системного воспалительного ответа. 4. При формировании системного воспалительного ответа после проведения кардиохирургических операций, выполненных в условиях 220 искусственного кровообращения характерно развитие дисфункции эндотелия, о чем свидетельствует снижение значений sL-селектина, sEселектина и увеличение – sP-селектина; снижение - sICAM-1 и увеличение sVCAM-1; повышение концентраций фактора Виллебранда, эндотелина и снижение моноцитарного белка хемотаксиса MCP-1. 5. Системный воспалительный ответ связан с изменением активности иммунокомпетентных клеток, проявляющейся снижением сывороточных матричных металлопротеиназ (proMMP-1 и MMP-3), повышением – MMP-9, прокатепсина В и TIMP-2, а также снижении естественного антагониста катепсинов – цистатина С. 6. Цитозольная фракция кардиомиоцитов, с содержащимися в ней аларминами, является триггером продукции цитокинов (ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8, ИЛ 10, ФНО α) моноцитами, при этом совместное стимулирование с липополисахаридом оказывает потенцирующее действие. В экспериментах in установлен vitro механизм взаимного отягощения системного воспалительного ответа инфекционным компонентом, который может присоединяться вследствие транслокации кишечной флоры и формировать осложненные формы. Транслокация косвенно подтверждается увеличением прокальцитонина и волнообразной динамикой сывороточных концентраций ишемия-модифицированного альбумина. 7. В развитии системного воспалительного ответа после проведения кардиохирургических операций, выполненных в условиях искусственного кровообращения главным триггерным фактором является повреждение клеток с последующим запуском каскада воспалительных (клеточных и гуморальных) реакций, в центре которых находятся клетки моноцитарномакрофагального ряда. Обязательным условием формирования системного воспалительного ответа компартментализация отражение в является воспаления. разработанной вовлечение Описанные принципиальной эндотелия закономерности схеме, и нашли отражающей специфические факторы патогенеза системного воспалительного ответа, 221 развивающегося после проведения кардиохирургических операций, выполняемых в условиях искусственного кровообращения. Схема позволит разрабатывать патогенетически обоснованные алгоритмы диагностики, профилактики и лечения СВО. 222 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для диагностики осложненного системного воспалительного ответа, развивающегося у пациентов после операции коронарного шунтирования, выполненной в условиях искусственного кровообращения кроме определения традиционных клинико-лабораторных показателей, необходимо оценивать коэффициент прироста концентрации растворимой формы триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках (sTREM-1) в сыворотке крови пациента по формуле: K=sTпо/sTи, где К – коэффициент прироста концентрации sTREM-1; sTпо – концентрация sTREM-1, определяемая в крови пациента в послеоперационном периоде; sTи – концентрация sTREM-1, определяемая до оперативного вмешательства, при этом развитие осложненного системного воспалительного ответа диагностируют при К≥1,5. 223 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ APACHE II - Acute Phisiology And Chronic Health Evaluation Apaf-1 - apoptosis protease-activating factor 1 ASA - American Association of Anaesthetists CAM - cell adhesion molecules CD - cluster of differentiation DAMP - danger-associated molecular patterns H-FABP - fatty acid-binding protein HMGB1 - high mobility group protein Box 1 Hsp - heat shock protein ICAM - intercellular cell adhesion molecule Ig - иммуноглобулин LPS, ЛПС - липополисахарид MCP - monocyte chemotactic protein MIF - mean intensity fluorescence MIP - macrophage inflammatory protein NOS - NO-синтаза PAMP - pathogen-associated molecular patterns PBS - фосфатный буферный раствор PECAM - platelet endothelial cell adhesion molecule PI - пропидия йодид POSSUM - Physiological and Operative Severity Score for the enUmeration of Mortality PRR - pattern recognition receptor SOFA - Sepsis-related Organ Failure Assessments Score / Sequential Organ Failure Assessment TGF - transforming growth factor, трансформирующий фактор роста Th - T-helper TIMP - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 224 TLR - TOLL-like receptor Treg - T-регуляторные клетки TREM-1 - триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках-1 VCAM - vascular cell adhesion molecule vWF - фактор фон Виллебранда АКТГ - адренокортикотропный гормон АлТ - аланинаминотрансфераза АОА - антиоксидантная активность АсТ - аспартатаминотрансфераза АТФ - аденозинтрифосфат АФК - активные формы кислорода БСЖК - белок, связывающий жирные кислоты ДК - диеновые конъюгаты ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИБС - ишемическая болезнь сердца ИК - искусственное кровообращение ИЛ - интерлейкин ИМА - ишемия-модифицированный альбумин ИРИ - иммуно-регуляторный индекс ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон КФК - креатинфосфокиназа КФК-МВ - креатинфосфокиназа сердечная фракция КШ - коронарное шунтирование ЛСБ - липополисахарид связывающий белок МДА - малоновый диальдегид ММР - матриксная металлопротеиназа ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром ОС - окислительный стресс 225 ОШ - основания Шиффа ПОЛ - перекисное окисление липидов РНК - рибонуклеиновая кислота СВО - системный воспалительный ответ СПОН - синдром полиорганной недостаточности СРБ - С-реактивный белок СТ - сопряженные триены ФНО - фактор некроза опухолей ЦФК - цитозольная фракция кардиомиоцитов ЭКМО - экстрокорпоральная мембранная оксигенация 226 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Афанасьева, А. Н. Синдромы эндогенной интоксикации и системного воспалительного ответа : общность и различия / А. Н. Афанасьева, И. Н. Одинцова, В. В. Удут // Анестезиология и реаниматология. – 2007. – № 4. – С. 67–71. 2. Бокерия, Л. А. Сердечно-сосудистая хирургия – 2011. Болезни и врожденные аномалии системы кровообращения / Л. А. Бокерия, Р. Г. Гудкова. – М. : НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2012. – 196 с. 3. Боровиков, В. П. Популярное введение в программу STATISTICA / В. П. Боровиков. – М. : Компьютер-Пресс, 1998. – 268 с. 4. Бутров, А. В. Диагностика и коррекция кислотно-основного состояния у больных в критическом состоянии / А. В. Бутров, С. В. Галенко, В. А. Мороз // Consilium medicum. – 2007. – Т 9, № 7. – С. 82–86. 5. Владимирская, Е. Б. Механизмы апоптотической смерти клеток / Е. Б. Владимирская // Гематология и трансфузиология. – 2002. – № 2. – С. 35–40. 6. Гусев, Е. Ю. Системное воспаление с позиции теории типового патологического процесса / Е. Ю. Гусев, В. А. Черешнев, Л. Н. Юрченко // Цитокины и воспаление. – 2007. – Т. 6, № 4. – С. 9–21. 7. Дементьева, И. И. Сердечный белок, связывающий жирные кислоты, в оценке повреждений миокарда в кардиологии и кардиохирургии / И. И. Дементьева, Ю. А. Морозов, М. А. Чарная // Врач скорой помощи. – 2010. – № 1. – С. 53–58. 8. Динамика уровня белка, связывающего жирные кислоты, и мозгового натрийуретического пептида у больных ишемической болезнью сердца на фоне нагрузочной пробы и баллонной коронарной ангиопластики / 227 И. В. Сергиенко, В. П. Масенко, А. Е. Семеноваи др. // Кардиология. – 2006. – № 12. – С. 26–29. 9. Дубинина, Е. Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е. Е. Дубинина // Вопр. мед. химии. – 2001. – Т. 47, № 6. – С. 561–581. 10. Железникова, Г. Ф. Цитокины как предикторы течения и исхода инфекций / Г. Ф. Железникова // Цитокины и воспаление. –2009. – Т. 8, № 1. – С. 10–17. 11. Замятин, М. Н. Безопасность анестезии : уроки истории и новые перспективы / М. Н. Замятин // Научные труды НМХЦ им. Н. И. Пирогова. – М., 2010 – Т. 3, – С. 132–147. 12. Заявка на изобретение. Российская Федерация, МПК7 G 01 N 33/49 Способ определения интегрального индекса развития системной воспалительной реакции при критических состояниях человека / Черешнев В. А., Гусев Е. Ю., Юрченко Л. Н., Зотова Н. А., Дронишинец Н. Н.; заявитель Институт иммунологии и физиологии УрО РАН. – № 2005108368/15; заявл. 24.03.2005; опубл. 10.09.2006. 13. Зыков, М. В. Клиническая и прогностическая значимость интерлейкина-12 у пациентов с инфарктом миокарда / М. В. Зыков, О. Л. Барбараш, В. В. Кашталап // Медицинская иммунология. – 2011. – Т. 13, № 2/3. – С. 219–226. 14. Катепсин D – его физиологическая роль и использование в медицине (обзор литературы) / А. М. Герасимов, Н. Ю. Борзова, Н. В. Керимкулова и др. // Клиническая лаборатор. диагностика. – 2009. – № 3. – С. 3–5. 15. Кишечный эндотоксин как вероятный индуктор системного воспалительного ответа при ВИЧ-инфекции / Г. Р. Хасанова, О. И. Биккинина, В. А. Анохина и др. // Практическая медицина. – 2012. – № 56. – С. 52–55. 228 16. Клиническая оценка параметров иммунитета у хирургических больных с синдромом системного воспалительного ответа / Г. В. Булава, М. М. Абакумов, В. Б. Хватов и др. // Хирургия. – 2007. – № 8. – С. 24–28. 17. Козлов, В. К. Дисфункция иммунной системы в патогенезе сепсиса / В. К. Козлов, Л. И. Винницкий // Общая реаниматология. – 2005. – Т. 1, № 4. – С. 65–76. 18. Козлов, В. К. Иммунопатогенез и цитокинотерапия хирургического сепсиса : пособие для врачей / В. К Козлов. – СПб. : изд-во « Ясный свет», 2002. – 48 с. 19. Козлов, В. К. Сепсис: этиология, иммунопатогенез, концепция современной иммунотерапии / В. К. Козлов. – СПб. : Диалект, 2006. – 304 с. 20. Концентрация прокатепсина В и ингибитора цистеиновых протеаз цистатина С в биологических жидкостях при развитии опухолей / Е. А. Гашенко, В. А. Лебедева, В. Ф. Коваленко и др. // Бюл. СО РАМН. – 2010. – Т. 30, № 4. – С. 110–115. 21. Коршунов, Г. В. Молекулярные маркеры системного воспалительного ответа и гемокоагуляции при эндопротезировании тазобедренного сустава / Г. В. Коршунов, Д. М. Пучиньян, С. Г. Шахмартова // Клиническая лаборатор. диагностика. – 2012. – № 2. – С. 50–52. 22. Левит, Д. А. Острое катаболическое состояние при синдроме системного воспалительного ответа различной этиологии. Попытка клинического анализа / Д. А. Левит, И. Н. Лейдерман // Вестн. интенсив. терапии. – 2006. – № 2. – С. 9–14. 23. Лобачева, Г. В. Факторы риска развития ранних осложнений и их коррекция у больных после операций на открытом сердце : автореф. дис. …д-ра мед. наук : 14.00.37 / Г. В. Лобачева. – М., 2000. – 46 с. 24. Львовская, Е. И. Процессы перекисного окисления липидов в норме и особенности протекания ПОЛ при физических нагрузках / Е. И. Львовская. – Челябинск, 2005. – 88 с. 229 25. Манских, В. Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение / В. Н. Манских // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 11. – С. 909–915. 26. Матвеева, В. Г. Роль триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках, в активации врожденного иммунитета / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, Е. В. Григорьев // Общая реаниматология. – 2011. – Т. VII, № 3. – С. 61–65. 27. Матриксные металлопротеиназы, C-реактивный белок и маркеры тромбинемии у больных со стабильной стенокардией и рестенозами после чрескожных коронарных вмешательств / А. Землянская, Е. П. Панченко, А. Н. Самко и др. // Кардиология. – 2004. – Т. 44, № 11. – С. 4–12. 28. Межирова, Н. М. Патофизиологические и диагностические аспекты синдрома системного воспалительного ответа / Н. М. Межирова, В. В. Данилова, С. С. Овчаренко // Медицина неотложных состояний. – 2011. – № 1-2. – С. 32–33. 29. Методология изучения системного воспаления / Е. Ю. Гусев, Л. Н. Юрченко, В. А. Черешнев и др. // Цитокины и воспаление. – 2008. – Т. 7, № 1. – С. 15–23. 30. Мушкабаров, Н. Н. Молекулярная биология : учеб. пособие для мед. вузов / Н. Н. Мушкабаров, С. Л. Кузнецов. – М. : ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – 536 с. 31. Мушкабаров, Н. Н. Молекулярная биология / Н. Н. Мушкабаров, С. Л. Кузнецов. – М. : ООО «Медицинское информационное агентство, 2003. – 544 с. 32. Некоторые аспекты формирования системного воспалительного ответа у больных в критическом состоянии / И. М. Устьянцева, О. И. Хохлова, О. В. Петухова и др. // Общая реаниматология. – 2010. – № 4. – С. 56– 59. 230 33. Никитенко, Н. И. Роль транслокации бактерий в патогенезе хирургической инфекции / Н. И. Никитенко, В. В. Захаров, А. В. Бородин // Хирургия. – 2001. – № 2. – С. 63–66. 34. Окислительный стресс : патологические состояния и заболевания / Е. Б. Меньщикова, Н. К. Зенков, В. З. Ланкин и др. – Новосибирск : АРТА, 2008. – 284 с. 35. Окислительный стресс : прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньщикова, В. З. Ланкин, И. А. Бондарь и др. – М. : Фирма «Слово», 2006. – 140 с. 36. Орлов, Ю. П. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия при критических состояниях / Ю. П. Орлов // Вестн. интенсив. терапии. – 2008. – № 1. – С. 73–77. 37. Особенности развития острофазного ответа и цитокинемии при системной воспалительной реакции инфекционного и неинфекционного генеза / Д. А. Левит, И. Н. Лейдерман, Е. Ю. Гусев и др. // Инфекции в хирургии. – 2007. – Т. 1. – С. 33–37. 38. Острый коронарный синдром без подъемов сегмента ST на ЭКГ. Прогностическое значение определния сердечной формы белка, связывающего жирные кислоты. Результат 12-месячного наблюдения / А. Д. Эрлих, А. Г. Катруха, И. Р. Трифонов и др. // Кардиология. – 2005. – № 5. – С. 13–21. 39. Оценка цитокинового профиля у больных с тяжелым сепсисом методом проточной флюориметрии (Bio-Plex-анализа) / А. А. Останин, О. Ю. Леплина, Е. Я. Шевела и др. // Цитокины и воспаление. – 2004. –Т. 3, № 1. – С. 20–27. 40. Пат. 2122212 Российская Федерация МПК6 G 01 N 33/86 Способ определения системного воспаления / Балл Б. С., Левин Р. А., Вордло С. С. – № 95113187/14; заявл. 14.07.1995; опуб. 20.11.1998; Бюл. № 6. – 3 с. 231 41. Пат. 2328219 Российская Федерация МПК7 A 61 B 10/00, G 01 N 33/48 Способ диагностики системного воспалительного ответа организма при критических состояниях / Фурсов А. А., Салмина А. Б., Михуткина С. В., Малиновская Н. А., Соколович А. Г., Линев К. А., Беляев К. Ю., Успенская Ю. А., Инжутова А. И., Данилович А. В., Гайгольник Д. В., Эйдемиллер Н. С., Зиньковская С. Ю. ; патентообладатель ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия». – № 2007109001/14; заявл. 12. 03.2007; опуб. 10.07.2008; Бюл. № 11. – 3 с. 42. Пат. 2335771 Российская Федерация, МПК7 G 01 N 33/53 Способ диагностики и прогноза системного воспаления с верификацией фаз и стадий / Гусев Е. Ю., Юрченко Л Н., Черешнев В. А., Зотова Н. В., Копалова Ю. А.; заявитель Институт иммунологии и физиологии УрО РАН ; пат. поверенный Мурзакаева В. З. – № 2006124894/14 ; заявл. 11.07.06 ; опубл. 20.01.08, Бюл. № 2. – 5 с. 43. Пинегин, Б. В. Алармины – эндогенные активаторы воспаления и врожденного иммунитета / Б. В. Пинегин, М. И. Карсонова // Иммунология. – 2010. – № 5. – С. 246–255. 44. Промыслов, М. Ш. Модификация метода определения суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови / М. Ш. Промыслов, М. Д. Демчук // Вопр. мед. химии. – 1990. – № 4. – С. 90–92. 45. Распространенность и клиническая значимость мультифокального атеросклероза у пациентов с ишемической болезнью сердца / О. Л. Барбараш, М. В. Зыков, В. В. Кашталап и др. // Кардиология. – 2011. – № 8. – С. 66–71. 46. Рябов, В. В. Определение белка, связывающего жирные кислоты, в диагностике острого инфаркта миокарда / В. В. Рябов, Т. Е. Суслова, В. А. Марков // Бюл. СО РАМН. – 2005. – №3 (117). – С. 26–29. 47. Свободнорадикальное окисление при ишемической болезни сердца. / Н. Н. Крайнова, Е. Н. Гуськова, Н. П. Милютина и др. // Известия 232 высших учеб. заведений. Северо-Кавказский регион. Естеств. науки. – Ростов н/Д., 2007. – № 6. – С. 64–67. 48. Системный воспалительный ответ при экстремальной хирургической агрессии / Ю. Л. Шевченко, Ю. И. Гороховатский, О. А. Азизова и др. – М. : РАЕН, 2009, – 276 с. 49. Скулачев, В. П. О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода / В. П. Скулачев // Биохимия. – 1998. – Т. 63, № 12. – P. 1570–1579. 50. Соколова, О. В. Факторы, определяющие возникновение осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта в раннем послеоперационном периоде / О. В. Соколова // Вестн. Национ. медико-хирург. Центра им. Н. И. Пирогова. – 2012. – Т. 7, № 1. – С. 128–133. 51. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови / И. А. Волчегорский, А. Г. Налимов, Б. Г. Яровинский и др. // Вопр. мед. химии. – 1989. – № 1. – С. 127–129. 52. Стальная, И. Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И. Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии. – М. : Медицина, 1977. – С. 391. 53. Талаева, Т. В. Механизмы взаимодействия клеток крови и сосудистой стенки в реализации воспалительного и иммунного ответов / Т. В. Талаева // Украинский ревматолог. журн. – 2001. – Т. 3-4, № 5-6. – С. 45–52. 54. Трифонов, И. Р. Характеристика сердечного белка, связывающего жирные кислоты, как маркера некроза миокарда в часто встречающихся клинических ситуациях : автореф. дис. ... д-ра мед. наук : 14.00.06 / И. Р. Трифонов. – М., 2009. – 47 с. 55. Тронов, В. А. Роль эксцизионных механизмов репарации ДНК и индукции апоптоза / В. А. Тронов, В. М. Константинов, И. И. Краморенко // Биохимия. – 2002. – Т. 67, вып.7. – С. 882–889. 233 56. Турна, А. А. Матриксные металлопротеиназы и сердечно-сосудистые заболевания / А. А. Турна, Р. Т. Тогузов // Артериальная гипертензия. – 2009. – Т. 15, № 9. – С. 532–538. 57. Факторы и механизмы развития коронарного атеросклероза / Ю. И. Рагино, А. М. Чернявский, А. М. Волков и др. – Новосибирск : Наука, 2011. – 168 с. 58. Чаленко, В. В. Классификация острых нарушений функций органов и систем при синдроме полиорганной недостаточности / В. В. Чаленко // Анестезиология и реаниматология. – 1998. – № 2. – С. 25–30. 59. Черешнев, В. А. Иммунологические и патофизиологические механизмы системного воспаления / В. А. Черешнев, Е. Ю. Гусев // Медицинская иммунология. – 2012. – Т. 14, № 1-2. – С. 9–20. 60. Черний, В. И. Нарушения иммунитета при критических состояниях : особенности диагностики / В. И. Черний // Журн. «Внутренняя медицина». – 2007. – Т. 2, № 2. – С. 12–23. 61. Широкова, А. В. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и водного баланса клетки / А. В. Широкова // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 5. – P. 385–394. 62. Экспрессия маркеров адгезии CD62L, CD44 и CXCR4 на NK-клетках при онкологических заболеваниях / Ю. В. Перфильева, Н. Абдолла, Е. А. Кустова и др. // Цитокины и воспаление. – 2012. – Т. 11, № 1 – С. 86– 90. 63. A matrix metalloprotease-PAR1 system regulates vascular integrity, systemic inflammation and death in sepsis / S. L. Tressel, N. C. Kaneider, S. Kasuda et al. // EMBO Mol Med. – 2011. – Vol. 3, № 7. – P. 370–384. 64. A mitochondrial perspective on cell death / P. Bernardi, V. Petronilli, F. Di Lisa et al. // Trends Biochem. Sci. – 2001. – Vol. 26, № 2. – P. 112–117. 65. A role for triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in host defense during the early-induced and adaptive phases of the immune response / J. R. 234 Bleharski, V. Kiessler, C. Buonsanti et al. // J. Immunol. – 2003. – Vol. 170, № 7. – P. 3812–3818. 66. A soluble form of the triggering receptor expressed on myeloid cells-1 modulates the inflammatory response in murine sepsis / S. Gibot, M. N. Kolopp-Sarda, M. C. Bene et al. // J. Exp. Med. – 2004. – Vol. 200, № 11. – P. 1419–1426. 67. A two-compartment mathematical model of endotoxin-induced inflammatory and physiologic alterations in swine / G. Nieman, D. Brown, J. Sarkar et al. // Crit Care Med. – 2012. – Vol. 40, № 4. – P. 1052–1063. 68. Abdominal complications after cardiopulmonary procedures / O. A. Gonzalez, M. A. Orozco, Z. L. Barrera et al. // Rev Gastroenterol Mex. – 1999. – Vol. 64, № 2. – P. 61–69. 69. An induction of cardioplegic arrest immediately activates the myocardial apoptosis signal pathway / U. M. Fischer, C. S. Cox, Jr., G. A. Laine et al. // Am J Physiol Heart Circ Physiol – 2007 Vol. 292. H1630-H1633 70. Activity of enzymes with different subcellular localization in the blood plasma of patients with aortic aneurysm / M. Gacko, R. Ostapowicz, L. Chrostek et al. // Med SciMonit. – 2005. – Vol. 11, № 4. – P. CR211– CR213. 71. Acute myocardial infarction in humans is associated with activation of programmed myocyte cell death in the surviving portion of the heart / G. Olivetti, F. Quaini, R. Sala et al. // J Mol Cell Cardiol. – 1996. – Vol. 28, № 9. – P. 2005–2016. 72. Acute-phase concentrations of lipopolysaccharide (LPS)-binding protein inhibit innate immune cell activation by different LPS chemotypes via different mechanisms / L. Hamann, C. Alexander, C. Stamme et al. // Infect Immun. – 2005. – Vol. 73, № 1. – P. 193–200. 73. Adib-Conquy, M. Stress molecules in sepsis and systemic inflammatory response syndrome / M. Adib-Conquy, J. M. Cavaillon // FEBS Letters. – 2007. – Vol. 581, № 19. – P. 3723–3733. 235 74. Alon, R. From rolling to arrest on blood vessels : leukocyte tap dancing on endothelial integrin ligands and chemokines at sub-second contacts / R. Alon, S. Feigelson // SeminImmunol. – 2002. – Vol. 14, № 2. – P. 93–104. 75. Alterations in the number of circulating leucocytes, phenotype of monocyte and cytokine production in patients undergoing cardiothoracic surgery / M. J. Hiesmayr, A. Spittler, A. Lassnigg et al. // Clin. Exp. Immunol. – 1999. – Vol. 115, № 2. – P. 315–323. 76. Alterations of the cytokine network in patients undergoing cardiopulmonary bypass / A. Sablotzki, M. Dehne, I. Welters et al. // Perfusion. – 1997. – Vol. 12, № 6. – P. 393–403. 77. Anakinra, a recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, inhibits apoptosis in experimental acute myocardial infarction / A. Abbate, F. N. Salloum, E. Vecile et al. // Circulation. – 2008. – Vol. 117, № 20. – P. 2670– 2683. 78. Anon. New classification of physical status // Anesthesiology. – 1963. – Vol. 24. – Р. 111. 79. Anti-inflammatory response of IL-4, IL-10 and TGF-beta in patients with systemic inflammatory response syndrome / D. Torre, R. Tambini, S. Aristodemo et al. // Mediators Inflamm. – 2000. – Vol. 9, № 3-4. – P. 193– 195. 80. APACHE-acute physiology and chronic health evaluation: a physiologically based classification system / W. A. Knaus, J. E. Zimmerman, D. P. Wagner et al. // Critical Care Medicine. – 1981. – Vol. 9, № 8. – Р. 591-597. 81. Apoptotic death of inflammatory cells in human atheroma / W. Li, H. Dalen, J. W. Eaton et al. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2001. – Vol. 21, № 7. – P. 1124–1130. 82. Arafah, B. M. Hypothalamic pituitary adrenal function during critical illness: limitations of current assessment methods / B. M. Arafah // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. – 2006. – Vol. 91, № 10. – P. 3725–3745. 236 83. Are circulating adhesion molecules specifically changed in cardiac surgical patients? / J. Boldt, B. Kumle, M. Papsdorf et al. // Ann Thorac Surg. – 1998. – Vol. 65, № 3. – P. 608–614. 84. Assessing adrenal status in patients before and immediately after coronary artery bypass graft surgery / M. Debono, L. Sheppard, S. Irving et al. // European Journal of Endocrinology. – 2011. – Vol. 164, № 3. – P. 413–419. 85. Assessment of MMP-9, TIMP-1, and COX-2 in normal tissue and in advanced symptomatic and asymptomatic carotid plaques / L. A. V Baroncini, L. S. Nakao, S. G. Ramos et al. // Thrombosis Journal. – 2011. – Vol. 9, № 1. – P. 6. 86. Assessment of plasmatic immunoglobulin G, A and M levels in septic shock patients / F. Venet, R. Gebeile, J. Bancel et al. // IntImmunopharmacol. – 2011. – Vol. 11, № 12. – P. 2086–2090. 87. Association of cystatin C with mortality, cardiovascular events, and incident heart failure among persons with coronary heart disease: data from the Heart and Soul Study / J. H. Ix, M. G. Shlipak, G. M. Chertow et al. // Circulation. – 2007. – Vol. 115, № 2. – P. 173–179. 88. Azzazy, H. M. Unbound Free Fatty Acids and Heart-Type Fatty Acid– Binding Protein : Diagnostic Assays and Clinical Applications / H. M. Azzazy, M. M. Pelsers, R. H. Christenson // Clinical Chemistry. – 2006. – Vol. 52, № 1. – P. 19–29. 89. Bhatia, M. Acute pancreatitis as a model of SIRS / M. Bhatia // Front Biosci. – 2009. – № 14. – P. 2042–2050. 90. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins : all we need to know about danger / M. Bianchi // J Leukoc Biol. – 2007. – Vol. 81, № 1. – P. 1–5. 91. Biomarkers for the differentiation of sepsis and SIRS: the need for the standardisation of diagnostic studies / T. C. Hall, D. K. Bilku, D. Al Leswas et al. // Ir J Med Sci. – 2011. – Vol. 180, № 4. – P. 793–798. 237 92. Biomarkers of Endothelial Cell Activation Serve as Potential Surrogate Markers for Drug-induced Vascular Injury / J. Zhang, A. F. DeFelice, J. P. Hanig et al. // Toxicologic Pathology. – 2010. – Vol. 38, № 6. – P. 856–871. 93. Bone, R. C. The ACCP-SCCM consensus conference on sepsis and organ failure / R. C. Bone, W. J. Sibbald, C. L. Sprung // Chest. – 1992. – Vol. 101, № 6. –P. 1481–1483. 94. Borutaite, V. Mitochondria in apoptosis of ischemic heart / V. Borutaite, G. C. Brown // FEBS Letters. – 2003. – Vol. 541, № 1-3. – P. 1–5. 95. Brain- and heart-type fatty acid-binding proteins in the brain: tissue distribution and clinical utility / M. M. Pelsers, T. Hanhoff, D. van der Voort et al. // Clin Chem. – 2004. – Vol. 50, № 9. – P. 1568–1575. 96. Brinckerhoff, C. E. Joint destruction in arthritis : metalloproteinase in the spotlight / C. E. Brinckerhoff // Arthritis Rheum. – 1991. – Vol. 34, № 9. – P. 1073–1075. 97. Brooks, M. J. Comparison of Surgical Risk Score, POSSUM and pPOSSUM in higher-risk surgical patients / M. J. Brooks, R. Sutton, S. Sarin // Br. J. of Surgery 2005. – Vol. 92, № 10. – P. 1288–1292. 98. Buja, L. M. Modes of myocardial cell injury and cell death in ischemic heart disease / L. M. Buja, M. L. Entman // Circulation. – 1998. – Vol. 98, № 14. – P. 1355–1357. 99. Busbridge, N. J. Stress and the single cytokine: interleukin modulation of the pituitary-adrenal axis / N. J. Busbridge, A. B. Grossman // Molecular and Cell Endocrinology. – 1991. – Vol. 82, № 2-3. –P. 209–214. 100. Can the Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL-1ra) Be a Marker of AntiInflammatory Response to Enteral Immunonutrition in Malnourished Patients after Pancreaticoduodenectomy? / R. Slotwinski, W. L. Olszewski, M. Slotkowski et al. // JOP. J Pancreas. – 2007. – Vol. 8, № 6. – P. 759–769. 101. Cardioplegic arrest induces apoptosis signal-pathway in myocardial endothelial cells and cardiac myocytes / U. M. Fischer, O. Klass, U. Stock et al. // Eur J Cardiothorac Surg. – 2003. – Vol. 23, № 6. – P. 984–990. 238 102. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta / T. Nakagawa, H. Zhu, N. Morishima et al. // Nature. – 2000. – Vol. 403, № 6367. – P. 98–103. 103. Cathepsin L expression and regulation in human abdominal aortic aneurysm, atherosclerosis, and vascular cells / J. Liu, G. K. Sukhova, J. T. Yang et al. // Atherosclerosis. – 2006. – Vol. 184, № 3. – Р. 302–311. 104. Cathepsin S, a novel biomarker of adiposity: relevance to atherogenesis / S. Taleb, D. Lacasa, J. P. Bastard et al. // FASEB J. – 2005. – Vol. 19, № 11. – Р. 1540–1542. 105. Cathepsin S–deficient mice display a prothrombotic phenotype / S. M. Day, J. L. Reeve, L. Mundada et al. // Circulation. – 2002. – Vol. 106. – P. 195. 106. Cavaillon, J. M. Compartmentalization of the inflammatory response in sepsis and SIRS / J. M. Cavaillon, D. Annane // Journal of Endotoxin Research. – 2006. – Vol. 12, № 3. – P. 151–170. 107. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein / S. D. Wright, R. A. Ramos, P. S. Tobias et al. // Science. – 1990. – Vol. 249, № 4975. – P. 1431–1433. 108. Cerivastatin and hypercholesterolemia reduce apoptosis of cardiomy- ocytes in guinea pig papillary muscle subjected to hypoxia/reoxygenation / R. Dworakowski, D. Dworakowska, I. Kocic et al. // Pharmacol Rep. – 2006. – Vol. 58, № 3. – P. 420–426. 109. Chan, P. S. Role of MMP-9 in Inflammation and Apoptosis of Retinal Capillary Cells in Diabetes / P. S. Chan, R. A. Kowluru // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2008. – Vol. 49. – E-Abstract 4915. 110. Chapman, H. A. Emerging roles for cysteine proteases in human biology / H. A. Chapman, R. J. Riese, G. P. Shi // Annu Rev Physiol. – 1997. – Vol. 59. – P. 63–88. 111. Chen, G. Y. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage / G. Y. Chen, G. Nuñez // Nature Reviews Immunol. – 2010. – Vol. 10, № 12. – Р. 826–837. 239 112. Chwieralski, C. E. Cathepsin-regulated apoptosis / C. E. Chwieralski, T. Welte, F. Bühling // Apoptosis. – 2006. – Vol. 11, № 2. – P. 143–149. 113. Cinel, I. Molecular biology of inflammation and sepsis: a primer / I. Cinel, S. M. Opal // Crit. Care Med. – 2009. – Vol. 37, № 1. – Р. 291–304. 114. Circadian rhythm of cortisol is altered in postsurgical patients / T. K. McIntosh, D. A. Lothrop, A. Lee et al. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. – 1981. – Vol. 53, № 1. – P. 117–122. 115. Circulating adhesion molecules in cardiac operations : influence of highdose aprotinin / J. Boldt, C. Osmer, E. Schindler et al. // Ann Thorac Surg. – 1995. – Vol. 59, № 1. – P. 100–105. 116. Circulating Cytokine/Inhibitor Profiles Reshape the Understanding of the SIRS/CARS Continuum in Sepsis and Predict Mortality / M. F. Osuchowski, K. Welch, J. Siddiqui et al. // The Journal of Immunology. – 2006. – Vol. 177, № 3. – P. 1967–1974. 117. Clinical evaluation of circulating interleukin-6 and interleukin-10 levels after surgery-induced inflammation / K. Miyaoka, M. Iwase, R. Suzuki et al. // J Surg Res. – 2005. – Vol. 125, № 2. – P. 144–150. 118. Collagen degradation in a murine myocarditis model : relevance of matrix metalloproteinase in association with inflammatory induction / J. Li, P. L. Schwimmbeck, C. Tschope et al. // Cardiovasc. Res. – 2002. – Vol. 56, № 2. – P. 235–247. 119. Colonna, M. TREM–1 (Triggering Recept Expressed on Myeloid Cells): A New Player in Acute Inflammatory Responses / M. Colonna, F. Facchetti // The Journal of Infectious Diseases. – 2003. – Vol. 187, suppl. 2. – P. S397– S401. 120. Compartmentalization of the Inflammatory Response during Acute Pancreatitis. Correlation with Local and Systemic Complications / T. L. Dugernier, P. F. Laterre, X. Wittebole et al. // Am J Respir Crit Care Med. – 2003. – Vol. 168, № 2. – P. 148–157. 240 121. Conditional cardiac overexpression of endothelin-1 induces inflammation and dilated cardiomyopathy in mice / L. L. Yang, R. Gros, M. G. Kabir et al. // Circulation. – 2004. – Vol. 109, № 2. – P. 255–261. 122. Conformational activation of CD11b without shedding of L-selectin on circulating human neutrophils / Y. Orr, J. M. Taylor, S. Cartland et al. // Journal of Leukocyte Biology. – 2007. – Vol. 82, № 5. – P. 1115–1125. 123. Coronary Sinus Catheter Placement / C. J. Langenberg, H. G. Pietersen, G. Geskes et al. // CHEST. – 2003. – Vol. 124, № 4. – P. 1259–1265. 124. Correlation Between MMP-3, TIMP-3 Expression and Neuronal Apoptosis After Ischemia -Reperfusion Injury in Rates / Z. Xiaohong, M. Abuhamed, Y. Y. Xu et al. // American Journal of Immunology. – 2007. – Vol. 3, № 2. – P. 25–30. 125. Cortisol response in relation to the severity of stress and illness / I. E. Widmer, J. J. Puder, C. Konig et al. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. – 2005. – Vol. 90, № 8. – P. 4579–4586. 126. Critical but divergent roles for CD62L and CD44 in directing blood monocyte trafficking in vivo during inflammation / H. Xu, A. Manivannan, I. Crane et al. // Blood. – 2008. – Vol. 112, № 4. – P. 1166–1174. 127. Critical timing of L-arginine treatment in post-ischemic myocardial apoptosis – role of NOS isoforms / F. Liang, E. Gao, L. Tao et al. // Cardiovascular Research. – 2004. – Vol. 62, № 3. – P. 568–577. 128. Current trends in inflammatory and immunomodulatory mediators in sepsis / M. Aziz, A. Jacob, W. L. Yang et al. // Journal of Leukocyte Biology. – Vol. 93, № 3. – P. 329–342. 129. Cutting Edge : Expression Patterns of surface and Soluble Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1 in Human Endotoxemia / S. Knapp, S. Gibot, A. de Vos et al. // J. Immunol. – 2004. – Vol. 173, № 12. – P. 7131–7134. 241 130. Cystatin C deficiency in human atherosclerosis and aortic aneurysms / G. P. Shi, G. K. Sukhova, A. Grubb et al. // J Clin Invest. – 1999. – Vol. 104, № 9. – P. 1191–1197. 131. Cysteine cathepsins trigger caspase-dependent cell death through cleavage of bid and antiapoptotic Bcl-2 homologues / G. Droga-Mazovec, L. Bojic, A. Petelin et al. // J Biol Chem. – 2008. – Vol. 283, № 27. – P. 19140–19150. 132. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade / P. Li, D. Nijhawan, I. Budihardjo et al. // Cell. – 1997. – Vol. 91, № 4. – P. 479–489. 133. Dahiya, P. Burns as a model of SIRS / P. Dahiya // Front Biosci. – 2009. – № 14. – P. 4962-4967. 134. Davies, M. J. Reactive oxygen species, metalloproteinases, and plaque stability / M. J. Davies // Circulation. – 1998. – Vol. 97, № 24. – P. 2382– 2383. 135. Decreased Expression of CD62L and CD54 Correlates with Poor Cytogenetic Risk Group In Myelodysplastic Syndromes / C. Alhan, T. M. Westers, C. Cali et al. // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts). – 2010. – Vol. 116. – Abstract 2915. 136. Decreased serum level of IL-12 in the course of ischemia and reperfusion during abdominal aortic surgery / M. Jedynak, B. Mroczko, A. Siemiatkowski et al. // Folia HistochemCytobiol. – 2011. – Vol. 49, № 3. – P. 465–471. 137. Deficiency of cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice / G. K. Sukhova, Y. Zhang, J. H. Pan et al. // J Clin Invest. – 2003. – Vol. 111, № 6. – P. 897–906. 138. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine / R. C. Bone, R. A. Balk, F. B. Cerra et al. // Chest. – 1992. – Vol. 101, № 6. – P. 1644–1655. 242 139. Delayed recovery of human leukocyte antigen-DR expression after cardiac surgery with early non-lethal postoperative complications: only an epiphenomenon? / A. Franke, W. Lante, L. G. Zoeller et al. // Interact Cardiovasc Thorac Surg. – 2008. – Vol. 7, № 2. – P. 207–211. 140. Detection of perioperative myocardial infarction with ischemia-modified albumin / S. Y. Dong, X. J. Wang, F. Xiao et al. // Asian CardiovascThorac Ann. – 2012. – Vol. 20, № 3. – P. 252–256. 141. Dexamethasone Pretreatment Provides Antiinflammatory and Myocardial Protection in Neonatal Arterial Switch Operation / R. Heying, E. Wehage, K. Schumacher et al. // Ann Thorac Surg. – 2012. – Vol. 93, № 3. – P. 869– 876. 142. Diagnostic accuracy of sTREM-1 to identify infection in critically ill patients with systemic inflammatory response syndrome / J. Latour-Perez, A. Alcala-Lopez, M. A. Garcia-Garcia et al. // Clin Biochem. – 2010. – Vol. 43, № 9. – P. 720–724. 143. Diagnostic value of procalcitonin : the influence of cardiopulmonary bypass, Aprotinin, SIRS and sepsis / U. Boeken, P. Feindt, T. Petzold et al. // Thoracic Cardiovasc Surg. – 1998. – Vol. 46, № 6. – P. 348–514. 144. Diagnostic Value of Soluble Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1 in Critically ill, Postoperative Patients with Suspected Sepsis / L. Li, Z. Zhu, J. Chen Guan et al. // A. J. of the Medical Sciences. – 2013. – Vol. 345, № 3. – P. 178–184. 145. Differential down-regulation of HLA-DR on monocyte subpopulations during systemic inflammation / O. Y. Kim, A. Monsel, M. Bertrand et al. // Critical Care. – 2010. – Vol. 14, № 2. – P. R61. 146. Differential expression of cysteine and aspartic proteases during progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice / S. Jormsjo, D. M. Wuttge, A. Sirsjo et al. // Am J Pathol. – 2002. – Vol. 161, № 3. – P. 939– 945. 243 147. Distribution and characterization of immunoreactive corticostatin in the hypothalamic–pituitary–adrenal axis / T. Tominaga, J. Fukata, Y. Hayashi et al. // Endocrinology. – 1992. – Vol. 130, № 3. – P. 1593–1598. 148. Divergent effects of matrix metalloproteinases 3, 7, 9, and 12 on atherosclerotic plaque stability in mouse brachiocephalic arteries. / J. L. Johnson, S. J. George, A. C. Newby et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2005. – Vol. 102, № 43. – P. 15575–15580. 149. Divergent regulation by growth factors and cytokines of 95 kDa and 72 kDa gelatinases and tissue inhibitors or metalloproteinases-1, -2, and -3 in rabbit aortic smooth muscle cells / R. P. Fabunmi, A. H. Baker, E. J. Murray et al. // Biochem J. – 1996. – Vol. 315, Pt. 1. – P. 335–342. 150. Dragomir, E. Monocyte chemoattractant protein-1-a major contributor to the inflammatory process associated with diabetes / E. Dragomir, M. Simionescu // Arch Physiol Biochem. – 2006. – Vol. 112, № 4-5. – P. 239– 244. 151. Effects of stress on immune cell distribution. Dynamics and hormonal mechanisms / F. S. Dhabhar, A. H. Miller, B. S. McEwen et al. // The Journal of Immunology. – 1995. – Vol. 154, № 10. – P. 5511–5527. 152. Endogenous signals released from necrotic cells augment inflammatory responses to bacterial endotoxin / R. El Mezayen, M. El Gazzar, M. C. Seeds et al. // Immunol Lett. – 2007. – Vol. 111, № 1. – P. 36–44. 153. Endothelial Cell Adhesion Molecules and Cardiopulmonary Bypass / M. P. Vallely, P. G. Bannon, C. F. Hughes et al. // Asian CardiovascThorac Ann. – 2001. – Vol. 9. – P. 349–355. 154. Endotoxin release in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass : pathophysiology and possible therapeutic strategies. An update / S. Kats, J. P. Schonberger, R. Brands et al. // Eur. Journal of Cardio-thoracic Surgery. – 2011. – Vol. 39, № 4. – P. 451–458. 244 155. Enhanced myocardial cathepsin B expression in patients with dilated cardiomyopathy / J. Ge, G. Zhao, R. Chen et al. // European Journal of Heart Failure. – 2006. – Vol. 8, № 3. – P. 284–289. 156. IL-10 Is Induced in the Reperfused Myocardium and May Modulate the Reaction to Injury / N. G. Frangogiannis, L. H. Mendoza, M. L. Lindsey et al. // The Journal of Immunology. – 2000. – Vol. 165, № 5. – P. 2798–2808. 157. Evaluation of adhesion molecules CD64, CD11b and CD62L in neutrophils and monocytes of peripheral blood for early diagnosis of neonatal infection / F. Genel, F. Atlihan, N. Gulez et al. // World J Pediatr. – 2012. – Vol. 8, № 1. – P. 72–75. 158. Expression of apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain, a pyrin N-terminal homology domain-containing protein, in normal human tissues / J. Masumoto, S. Taniguchi, J. Nakayama et al. // J Histochem Cytochem. – 2001. – Vol. 49, № 10. – P. 1269–1275. 159. Expression of the elastolytic cathepsins S and K in human atheroma and regulation of their production in smooth muscle cells / G. K. Sukhova, G. P. Shi, D. I. Simon et al. // J Clin Invest. – 1998. – Vol. 102, № 3. – P. 576– 583. 160. Expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 in human atheroma and regulation in lesion-associated cells: a potential protective mechanism in plaque stability / R. P. Fabunmi, G. K. Sukhova, S. Sugiyama et al. // Circ Res. – 1998. – Vol. 83, № 3. – P. 270–278. 161. Fas pathway is a critical mediator of cardialmyocyte death and MI during ischemia-reperfusion in vivo / P. Lee, P. Sata, M. Lefer et al. // Am. J. Physiol. – 2003. – Vol. 284, № 2. – P. H456–H463. 162. Fatty-acid-binding protein as a plasma marker for the estimation of myocardial infarct size in humans / J. F. Glatz, A. H. Kleine, F. A. van Nieuwenhoven et al. // Br Heart J. – 1994. – Vol. 71, № 2. – P. 135–140. 245 163. Fractalkine Preferentially Mediates Arrest and Migration of CD16 + Monocytes / P. Ancuta, R. Rao, A. Moses et al. // JEM. – 2003. – Vol. 197, № 12. – P. 1701–1707. 164. Frangogiannis, N. G. Regulation of the Inflammatory Response in Cardiac Repair / N. G. Frangogiannis // Circ Res. – 2012. – Vol. 110, № 1. – P. 159– 173. 165. Frantz, S. Post-infarct remodelling: contribution of wound healing and inflammation / S. Frantz, J. Bauersachs, G. Ertl // Cardiovascular Research. – 2009. – Vol. 81, № 3. – P. 474–481. 166. Gastrointestinal complications following cardiac surgery. An analysis of 1477 cardiac surgery patients / R. A. Perugini, R. K. Orr, D. Porter et al. // Arch Surg. – 1997. – Vol. 132, № 4. – P. 352–357. 167. Gene profiling of cathepsin K deficiency in atherogenesis : profibrotic but lipogenic / S. Lutgens, N. Kisters, E. Lutgens et al. // J. Pathol. – 2006. – Vol. 210, № 3. – P. 334–343. 168. Gill, C. Losing heart : the role of apoptosis in heart disease – a novel Therapeutic target? / C. Gill, R. Mestril, A. Samali // FASEB J. – 2002. – Vol. 16, № 2. – P. 135-146. 169. Glucocorticoids suppress interleukin-1 receptor antagonist synthesis following induction by endotoxin / E. Arzt, J. Sauer, T. Pollmächer et al. // Endocrinology. – 1994. – Vol. 134, № 2. – P. 672–677. 170. Hailman, E. Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein accelerates the binding of LPS to CD14 / E. Hailman, H. S. Lichenstein, M. M. Wurfel // J Exp Med. – 1994. – Vol. 179, № 1. – P. 269–277. 171. Hayes, R. A. Is hyperoxaemia helping or hurting patients during extracorporeal membrane oxygenation? Review of a complex problem / R. A. Hayes, K. Shekar, J. F. Fraser // Perfusion. – 2013. – Vol. 28, № 3. – P. 184–193. 246 172. Heat shock up-regulates expression of Toll-like receptor-2 and Toll-like receptor-4 in human monocytes via p38 kinase signal pathway / J. Zhou, H. An, H. Xu et al. // Immunology. – 2005. – Vol. 114, № 4. – P. 522–530. 173. Heterogeneity of Human Monocytes: An Optimized Four-Color Flow Cytometry Protocol for Analysis of Monocyte Subsets / T. Tallone, G. Turconi, G. Soldati et al. // J. of Cardiovasc. Trans. Res. – 2011. – Vol. 4, № 2. – P. 211–219. 174. High mobility group 1 protein (YMG-1) stimulates proinflamatory cytokine synthesis in human monocytes / U. Anderson, H. Wang, K. Palmblad et al. // J. Exp. Med. – 2000. – Vol. 192, № 4. – P. 565–570. 175. High mobility group box 1 protein interacts with multiple Toll-like receptors / J. S. Park, F. Gamboni-Robertson, Q. He et al. // Am J Physiol Cell Physiol. – 2006. – Vol. 290, № 3. – Р. 917–924. 176. High-Mobility Group Box 1 Promotes Metalloproteinase-9 Upregulation Through Toll-Like Receptor 4 After Cerebral Ischemia / J. Qiu, J. Xu, Y Zheng et al. // Stroke. – 2010. – Vol. 41, № 9. – P. 2077–2082. 177. HLA-DR as a marker for increased risk for systemic inflammation and septic complications after cardiac surgery / W. Oczenski, H. Krenn, R. Jilch et al. // Intensive Care Med. – 2003. – Vol. 29, № 8. – P. 1253–1257. 178. Hormonal responses to graded surgical stress / B. Chernow, H. R. Alexander, R. C. Smallridge et al. // Archives of Internal Medicine. – 1987. – Vol. 147, № 7. – P. 1273–1278. 179. Hotta, M. Differential effects of transforming growth factor type beta on the growth and function of adrenocortical cells in vitro / M. Hotta, A. Baird // PNAS. – 1986. – Vol. 83, № 20. – P. 7795–7799. 180. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors / J. Cros, N. Cagnard, K. Woollard et al. // Immunity. – 2010. – Vol. 33, № 3. – P. 375–386. 181. Hydrocortisone suppresses intranuclear activator-protein-1 (AP–1) binding activity in mononuclear cells and plasma matrix metalloproteinase 2 and 9 247 (MMP–2 and MMP–9) / A. Aljada, H. Ghanim, P. Mohanty et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2001. – Vol. 86, № 12. – P. 5988–5991. 182. Hyperprocalcitoninemia in patients with noninfectious SIRS and pulmonary disfunction associated with pulmonary bypass / M. Hensel, T. Volk, W. D. Docke et al. // Anaesthesiology. – 1998. – Vol. 89, № 1. – P. 93–104. 183. Identification of a key pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells / C. J. Chen, H. Kono, D. Golenbock et al // Nat. Med. – 2007. – Vol. 13, № 7. – P. 851–856. 184. IL-10 receptor dysfunction in macrophages during chronic inflammation / R. Avdiushko, D. Hongo, H. Lake-Bullock et al // J. Leukoc. Biol. – 2001. – Vol. 70, № 4. – P. 624–632. 185. IL-1alpha and IL-1beta recruit different myeloid cells and promote different stages of sterile inflammation / P. Rider, Y. Carmi, O. Guttman et al. // J. Immunol. 2011. – Vol. 187, № 9. – P. 4835–4843. 186. IL-6 enhances plasma IL-1ra, IL-10, and cortisol in humans / A. Steensberg, C. P. Fischer, C. Keller et al. // Am J Physiol Endocrinol Metab. – 2003. – Vol. 285, № 2. – P. E433–E437. 187. Immunoglobulin levels and lymphocyte subsets following cardiac operations: further evidence for a T-helper cell shifting / W. Lante, A. Franke, C. Weinhold et al. // Thorac Cardiovasc Surg. – 2005. – Vol. 53, № 1. – P. 16–22. 188. In situ apoptosis assay for the detection of early acute myocardial infarction. / R. H. Bardales, S. Hailey, S. S. Xie et al. // Am J Pathol. – 1996. – Vol. 149, № 3. – P. 821–829. 189. In situ identification of messenger RNA of endothelial type nitric oxide synthase in rat cardiac myocytes / T. Seki, H. Hagiwara, K. Naruse et al. // Biochem Biophys Res Commun. – 1996. – Vol. 218, № 2. – P. 601–605. 190. In Vivo Exposure to High or Low Cortisol Has Biphasic Effects on Inflammatory Response Pathways of Human Monocytes / M. P. Yeager, P. 248 A. Pioli, K. Wardwell et al. // Anesth Analg. – 2008. – Vol. 107, № 5. – P. 1726–1734. 191. Inactivation of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 by peroxynitrite / E. R. Frears, Z. Zhang, D. R. Blake et al. // FEBS Lett. – 1996. – Vol. 381, № 1-2. – P. 21–24. 192. Increased expression of elastolytic cysteine proteases, cathepsins S and K, in the neointima of balloon-injured rat carotid arteries / X. W. Cheng, M. Kuzuya, T. Sasaki et al. // Am. J. Pathol. – 2004. – Vol. 164, № 1. – P. 243– 251. 193. Increased Plasma Levels of Soluble Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 1 and Procalcitonin After Cardiac Surgery and Cardiac Arrest Without Infection / M. Adib-Conquy, M. Monchi, C. Goulenok et al. // Shock. – 2007. – Vol. 28, № 4. – P. 406–410. 194. Increased serum cathepsin S in patients with atherosclerosis and diabetes / J. Liu, L. Ma, J. Yang et al. // Atherosclerosis. – 2006. – Vol. 186, № 2. – Р. 411–419. 195. Increased toll-like receptor 4 in the myocardium of patients requiring left ventricular assist devices / E. J. Birks, L. E. Felkin, N. R. Banner et al. // J Heart Lung Transplant. – 2004. – Vol. 23, № 2. – Р. 228–235. 196. Increasing numbers of hepatic dendritic cells promote HMGB1 mediated ischemia-reperfusion injury / A. Tsung, N. Zheng, G. Jeyabalan et al. // J. Leukoc. Biol. – 2007. – Vol. 81, № 1. – P. 119–128. 197. Induction of Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL-1ra) Following Surgery Is Associated with Major Trauma / E. M. Ó Nualláin, P. Puri, K. Mealy et al. // Clinical Immunology and Immunopathology. – 1995. – Vol. 76, № 1. –P. 96–101. 198. Inflammasome Activation of Cardiac Fibroblasts Is Essential for Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury / M. Kawaguchi, M. Takahashi, T. Hata et al. // Circulation. – 2011. – Vol. 123, № 6. – P. 594–604. 249 199. Inflammatory Response After Open Heart Surgery : Release of Heat-Shock Protein 70 and Signaling Through Toll-Like Receptor-4 / B. Dybdahl, A. Wahba, E. Lien et al. // Circulation. – 2002. – Vol. 105, № 6. – P. 685–690. 200. Inhibition of adrenal steroidogenesis by the anesthetic etomidate / R. L. Wagner, P. F. White, P. B. Kan et al. // New England Journal of Medicine. – 1984. – Vol. 310, № 22. – P. 1415–1421. 201. Inhibition of caspase1 reduces human myocardial ischemic dysfunction via inhibition of IL-18 and IL-1beta / B. J. Pomerantz, L. L. Reznikov, A. H. Harken et al // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2001. – Vol. 98, № 5. – P. 2871–2876. 202. Inhibition of hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in metallothioneinover- expressing cardiomyocytes / G. W. Wang, Z. Zhou, J. B. Klein et al. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2001. – Vol. 280, № 5. – P. H2292– 2299. 203. Inhibition of lipopolysaccharide-induced monocyte interleukin-1 receptor antagonist synthesis by cortisol : involvement of the mineralocorticoid receptor / J. Sauer, M. Castren, U. Hopfner et al. // The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. – 1996. – Vol. 81, № 1. – P. 73–79. 204. Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevent cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure / S. Heymans, A. Luttun, D. Nuyens et al. // Nat. Med. – 1999. – Vol. 5, № 10. – P. 1135–1142. 205. Innate immune activation through Nalp3 inflammasome sensing of asbestos and silica / C. Dostert, V. Pétrilli, R. van Bruggen et al. // Science. – 2008. – Vol. 320, № 5876. – P. 674–677. 206. Interleukin 6 and interleukin 1 receptor antagonist as early markers of complications after lung cancer surgery / T. J. Szczesny, R. Slotwinski, A. Stankiewicz et al. // European Journal of Cardio-thoracic Surgery. – 2007. – Vol. 31, № 4. – P. 719–724. 250 207. Interleukin-12 Is Associated With Arterial Stiffness in Healthy Individuals / K. Yong, G. Dogra, N. Boudville et al. // Am J Hypertens. – 2013. – Vol. 26, № 2. – P. 159–162. 208. Interleukin-1alpha expression precedesIL-1beta after ischemic brain injury and is localized to areas of focal neuronal loss and penumbral tissues / N. M. Luheshi, K. J. Kovacs, G. Lopez- Castejon et al. // J. Neuroinflammation. – 2011. – № 8. – P. 186. 209. Interleukin1receptor blockade reduces tumor necrosis factor production, tissue injury, and mortality after hepatic ischemia-reperfusion in the rat / M. Shito, G. Wakabayashi, M. Ueda et al // Transplantation. – 1997. – Vol. 63, № 1. – P. 143–148. 210. Intraabdominal complications after cardiopulmonary bypass / S. K. Ohri, J. B. Desai, J. A. Gaer et al. // Ann Thorac Surg. – 1991. – Vol. 52. – P. 826– 831. 211. Involvement of CD11b+ GR-1low cells in autoimmune disorder in MRLFaslpr mouse / Y. Iwata, K. Furuichi, K. Kitagawa et al. // Clin. Exp. Nephrol. – 2010. – Vol. 14, № 5. – P. 411–417. 212. Is interferon gamma suppression after cardiac surgery caused by a decreased interleukin-12 synthesis? / A. Franke, W. Lante, E. Kurig et al. // Ann Thorac Surg. – 2006. – Vol. 82, № 1. – P. 103–109. 213. Is serum amyloid A an endogenous TLR4 agonist? / S. Sandri, D. Rodriguez, E. Gomes et al. // J Leukoc Biol. – 2008. – Vol. 83, № 5. – Р. 1174–1180. 214. Ischaemia-reperfusion injury activates matrix metalloproteinases in the human heart / M. M. Lalu, E. Pasini, C. J. Schulze et al. // European Heart Journal. – 2005. – Vol. 26, № 1. – P. 27–35. 215. Ischemia Modified Albumin, a Marker of Acute Ischemic Events : A Pilot Study / S. S. Talwalkar, M. Bon-Homme, J. J. Miller et al. // Ann. of Clin. Lab. Sci. – 2008. – Vol. 38, № 2. – P. 132–137. 251 216. Ischemia-Modified Albumin Concentrations in Patients with Peripheral Vascular Disease and Exercise-Induced Skeletal Muscle Ischemia / D. Roy, J. Quiles, R. Sharma et al. // Clinical Chemistry. – 2004. – Vol. 50, № 9. – P. 1656–1660 217. Ischemia-modified albumin during skeletal muscle ischemia / E. ZapicoMuniz, M. Santalo-Bel, J. Merce-Muntanola et al. // Clin Chem. – 2004. – Vol. 50, № 6. – P. 1063–1065. 218. Ischemia-Modified Albumin Improves the Usefulness of Standard Cardiac Biomarkers for the Diagnosis of Myocardial Ischemia in the Emergency Department Setting / S. Anwaruddin, J. L. Januzzi, A. L. Baggish et al. // Am J ClinPathol. – 2005. – Vol. 123, № 1. – P. 140–145. 219. Ischemia-modified albumin use as a prognostic factor in coronary bypass surgery / M. Kanko, S. Yavuz, C. Duman et al. // Journal of Cardiothoracic Surgery. – 2012. – № 7. – P. 3. 220. Khoynezhad, A. Apoptosis : Pathophysiology and therapeutic implications for the cardiac surgeon / A. Khoynezhad, Z. Jalali, A. J. Tortolani // Ann Thorac Surg. –2004. – Vol. 78, № 3. – P. 1109–1118. 221. Kibe, S. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care / S. Kibe, K. Adams, G. Barlow // J Antimicrob Chemother. – 2011. – Vol. 66, suppl 2. – P. ii33–ii40. 222. Kidd, V. J. Proteolytic regulation of apoptosis / V. J. Kidd, J. M. Lahti, T. Teitz // Semin Cell Dev Biol. – 2000. – Vol. 11, № 3. – P. 191–201. 223. Kitajima, I. Establishment of the rapid, hypersensitive testing systems for sepsis/SIRS / I. Kitajima, H. Niimi // RinshoByori. – 2012. – Vol. 60, № 1. – P. 46–51. 224. Kono, H. How dying cells alert the immune system to danger / H. Kono, K. L. Rock // Nat Rev Immunol. – 2008. – Vol. 8, № 4. – P. 279–289. 225. Kritchevsky, S. B. Inflammatory markers and cardiovascular health in older adults / S. B. Kritchevsky, M. Cesari, M. Pahor // Cardiovasc Res. – 2005. – Vol. 66, № 2. – Р. 265–275. 252 226. Laffey, J. G. The Systemic Inflammatory Response to Cardiac Surgery / J. G. Laffey, J. F. Boylan, D. C. Cheng // Anesthesiology. – 2002. – Vol. 97, № 1. – P. 215–252. 227. Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock / D. E. Wesche, J. L. Lomas-Neira, M. Perl et al. // J. Leuk. Biol. – 2005. – Vol. 78, № 2. – P. 325–337. 228. Lipopolysaccharide- binding protein (LBP) and markers of acute-phase response in patients with multiple organ dysfunction syndrome (MODS) following open heart surgery / A. Sablotzki, J. Borgermann, W. Baulig et al. // Thorac Cardiovasc Surg. – 2001. – Vol. 49, № 5. – P. 273–278. 229. Lipopolysaccharide binding protein and sCD14 are not produced as acute phase proteins in cardiac surgery / M. Kudlova, P. Kunes, M. Kolackova et al. // Mediators Inflamm. – 2007. – Vol. 2007, № 2007. – P. 72356. 230. Lukens, J. R. IL-1family cytokines trigger sterile inflammatory disease / J. R. Lukens, J. M. Gross, T. D. Kanneganti // Front. Immun. – 2012. – Vol. 3. – P. 315. 231. Management of immune dysfunction after adult cardiac surgery / J. S. Rankin, O. Oguntolu, R. S. Binford et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. – 2011. – Vol. 142, № 3. – P. 575–580. 232. Marik, P. E. The immune response to surgery and trauma : Implications for treatment / P. E. Marik, M. Flemmer // J Trauma Acute Care Surg. – 2012. – Vol. 73, № 4. – P. 801–808. 233. Mason, J. C. The clinical importance of leucocyte and endothelial cell adhesion molecules in inflammation / J. C. Mason, D. O. Haskard // Vasc Med Rev. – 1994. – Vol. 5. – P. 249–275. 234. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice / S. Ishibashi, J. L. Goldstein, M. S. Brown et al. // J Clin Invest. – 1994. – Vol. 93, № 5. – P. 1885–1893. 235. Matrix Metalloproteinase (MMP)-1 and MMP-3 Induce Macrophage MMP9: Evidence for the Role of TNF-α and Cyclooxygenase-2 / M. Steenport, K. 253 M. F. Khan, B. Du et al. // The Journal of Immunology. – 2009. – Vol. 183, № 12. – P. 8119–8127. 236. Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9/gelatinase B) proteolytically cleaves ICAM-1 and participates in tumor cell resistance to natural killer cellmediated cytotoxicity / E. Fiore, C. Fusco, P. Romero et al. // Oncogene. – 2002. – Vol. 21, № 34. – P. 5213–5223. 237. Matrix-dependent mechanism of neutrophil-mediated release and activation of matrix metalloproteinase 9 in myocardial ischemia/reperfusion / M. Lindsey, K. Wedin, M. D. Brown et al. // Circulation. – 2001. – Vol. 103, № 17. – P. 2181–2187. 238. McColl, B. W. Systemic Inflammation Alters the Kinetics of Cerebrovascular Tight Junction Disruption after Experimental Stroke in Mice / B. W. McColl, N. J. Rothwell, S. M. Allan // The Journal of Neuroscience. – 2008. – Vol. 28, № 38. – P. 9451–9462. 239. Mechanisms of cell activation by heavy metal ions / M. Wagner, C. L. Klein, T. G. van Kooten et al. // J Biomed Mater Res. – 1998. – Vol. 42. – P. 443–452. 240. Metalloproteinases and Airway Remodeling in Asthma / M. Krausfilarska, M. Kosińska, A. Tomkowicz // Adv Clin Exp Med. – 2007. – Vol. 16, № 3. – P. 417–423. 241. Metalloproteinases Shed TREM-1 Ectodomain from LipopolysaccharideStimulated Human Monocytes / V. Gómez-Piña, A. Soares-Schanoski, A. Rodríguez-Rojas et al. // J. Immunol. – 2007. – Vol. 179, № 6. – P. 4065– 4073. 242. Mice genetically lacking endothelial selectins are resistant to the lethality in septic peritonitis / A. Matsukawa, N. W. Lukacs, C. M. Hogaboam et al. // Exp Mol Pathol. – 2002. – Vol. 72, № 1. – P. 68–76. 243. Mitochondrial calcium and the permeability transition in cell death / J. J. Lemasters, T. P. Theruvath, Z. Zhong et al. // Biochim Biophys Acta. – 2009. – Vol. 1787, № 11. – P. 1395–1401. 254 244. MMP protein and activity levels in synovial fluid from patients with joint injury, inflammatory arthritis, and osteoarthritis / I. Tchetverikov, L. S. Lohmander, N. Verzijl et al. // Ann Rheum Dis. – 2005. – Vol. 64, № 5. – P. 694–698. 245. Modulation of the inflammatory response in the cardiomyocyte and macrophage / S. D. Bradford, K. Hunter, Y. Wu et al. // J Extra Corpor Technol. – 2001. – Vol. 33, № 4. – P. 167–174. 246. Molecular basis of endothelial dysfunction in sepsis / K. Peters, R. E. Unger, J. Brunner et al. // Cardiovascular Research. – 2003. – Vol. 60, № 1. – P. 49–57. 247. Molecular cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinase 4 / J. Greene, M. Wang, Y. E. Liu et al. // J Biol Chem. – 1996. – Vol. 271, № 48. – P. 30375–30380. 248. Molecular mechanisms of apoptosis in the cardiac myocyte / N. H. Bishopric, P. Andreka, T. Slepak et al. // Curr. Opin. Pharmacol. – 2001. – Vol. 1, № 2. – P. 141–150. 249. Monitoring immune dysfunctions in the septic patient : A new skin for the old ceremony / G. Monneret, F. Venet, A. Pachot et al. // Mol. Med. – 2008. – Vol. 14, № 1-2. – P. 64–78. 250. Monocyte-mediated defense against microbial pathogens / N. V. Serbina, T. Jia, T. M. Hohl et al. // Annu. Rev. Immunol. – 2008. – Vol. 26. – P. 421– 452. 251. Moore, F. A. The role of the gastrointestinal tract in postinjury multiple organ failure / F. A. Moore // Am J Surg. – 1999. – Vol. 178, № 6. – P. 449– 453. 252. Mrp8 and Mrp14 are endogenous activators of Toll-like receptor 4, promoting lethal, endotoxin-induced shock / T. Vogl, K. Tenbrock, S. Ludwig et al. // Nat. Med. – 2007. – Vol. 13, № 9. – Р. 1042–1049. 253. Muller, W. A. Migration of leukocytes across endothelium and beyond : molecules involved in the transmigration and fate of monocytes / W. A. 255 Muller, G. J. Randolph // J Leukoc Biol. – 1999. – Vol. 66, № 5. – P. 698– 704. 254. Multi-Hit Inhibition of Circulating and Cell-Associated Components of the Toll-Like Receptor 4 Pathway by Oxidized Phospholipids / E. von Schlieffen, O. V. Oskolkova, G. Schabbauer et al. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2009. – Vol. 29, № 3. – Р. 356–362. 255. Mutlu, G. M. GI complications in patients receiving mechanical ventilation / G. M. Mutlu, E. A. Mutlu, P. Factor // Chest. – 2001. – Vol. 119, № 4. – P. 1222–1241. 256. Myocardial ischemia, stunning, inflammation, and apoptosis during cardiac surgery : a review of evidence / A. Anselmi, A. Abbate, F. Girola et al. // Eur J Cardiothorac Surg. – 2004. – Vol. 25, № 3. – P. 304–311. 257. Myocardial oxidative metabolism and protein synthesis during mechanical circulatory support by extracorporeal membrane oxygenation / C. M. Priddy, M. Kajimoto, D. R. Ledee et al. // A. J. P. – 2013. – Vol. 304, № 3. – P. H406–H414. 258. Myocardial protection from ischemia/ reperfusion injury by targeted deletion of matrix metalloproteinase-9 / A. M. Romanic, S. M. Harrison, W. Bao et al. // Cardiovascular Research. – 2002. – Vol. 54, № 3. – P. 549–558. 259. Myocardium is a major source of proinflammatory cytokines in patients undergoing cardiopulmonary bypass / S. Wan, J. M. DeSmet, L. Barvais et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. – 1996. – Vol. 112, № 3. – P. 806–811. 260. Myocyte Death, Growth, and Regeneration in Cardiac Hypertrophy and FailureAnversa / B. Nadal-Ginard, J. Kajstura, A. Leri et al. // Circ. Res. – 2003. – Vol. 92, № 2. – P. 139–150. 261. Nagase, H. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs / H. Nagase, R. Visse, G. Murphy // Cardiovascular Research. – 2006. – Vol. 69, № 3. – P. 562–573. 256 262. New functional aspects of cathepsin D and cathepsin / T. Tsukuba, K. Okamoto, Y. Yasuda et al. // E. Mol Cells. – 2000. – Vol. 10, № 6. – P. 601– 611. 263. Nicholson, D. W. Caspases : killer proteases // D. W. Nicholson, N. A. Thornberry // Trends Biochem Sci. – 1997. – Vol. 22, № 8. – P. 299–306. 264. Nitric oxide synthase in cultured endocardial cells of the pig / R. Schulz, J. A. Smith, M. J. Lewis et al. // Br J Pharmacol. – 1991. – Vol. 104, № 1. – P. 21–24. 265. Nitric oxide-dependent parasympathetic signaling is due to activation of constitutive endothelial (type III) nitric oxide synthase in cardiac myocytes / J. L. Balligand, L. Kobzik, X. Han et al. // J Biol Chem. – 1995. – Vol. 270, № 24. – P. 14582–14586. 266. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals / P. Duewell, H. Kono, K. J. Rayner et al. // Nature. – 2010. –Vol. 464, № 7293. – P. 1357–1361. 267. Occurrence of oxidative stress during reperfusion of the human heart / R. Ferrari, O. Alfieri, S. Curello et al. // Circulation. – 1990. – Vol. 81, № 1. – P. 201–211. 268. Off-pump coronary artery bypass surgery versus standard linear or pulsatile cardiopulmonary bypass: endothelial activation and inflammatory response / F. Onorati, A. S. Rubino, S. Nucera et al. // European Journal of Cardiothoracic Surgery. – 2010. – Vol. 37, № 4. – P. 897–904. 269. Organ damage during cardiopulmonary bypass by Andrew Snell and BarboraParizkova from edited by Andrew Snell and Barbora Parizkova from: Cardiopulmonary Bypass / S. Ghosh, F. Falter, D. J. Cook // Cardiopulmonary Bypass. – Cambridge, UK : CambridgeUniversity Press, 2009. – P. 140-153. 270. Overexpression of Interleukin-1 Receptor Antagonist Provides Cardioprotection Against Ischemia-Reperfusion Injury Associated With 257 Reduction in Apoptosis / K. Suzuki, B. Murtuza, R. T. Smolenski et al. // Circulation. – 2001. – Vol. 104, № 12, suppl. – P. I308–I313. 271. Panagiotopoulos, I. Alterations in biomarkers of endothelial function following on-pump coronary artery revascularization / I. Panagiotopoulos, G. Palatianos, A. Michalopoulos // Journal of Clinical Laboratory Analysis. – 2010. – Vol. 24, iss. 6. – P. 389–398. 272. Paparella, D. Cardiopulmonary bypass induced inflammation: pathophysiology and treatment. An update / D. Paparella, T. M. Yau, E. Young // Eur J Cardiothorac Surg. – 2002. – Vol. 21, № 2. – P. 232–244. 273. Patel, K. D. Selectins: critical mediators of leukocyte recruitment / K. D. Patel, S. L. Cuvelier, S. Wiehler // Semin Immunol. – 2002. – Vol. 14, № 2. – P. 73–81. 274. Patterns of Gram-stained fecal flora as a quick diagnostic marker in patients with severe SIRS / K. Shimizu, H. Ogura, K. Tomono et al. // Dig Dis Sci. – 2011. – Vol. 56, № 6. – P. 1782–1788. 275. Pavcnik-Arnol, M. Lipopolysaccharide- binding protein, lipopolysaccharide, and soluble CD14 in sepsis of critically ill neonates and children / M. Pavcnik-Arnol, S. Hojker, M. Derganc // Intensive Care Med. – 2007. – Vol. 33, № 6. – P. 1025–1032. 276. Pericardial fluid level of heart-type cytoplasmic fatty acid-binding protein (H-FABP) is an indicator of severe myocardial ischemia / K. Tambara, M. Fujita, S. Miyamoto et al. // Int J Cardiol. – 2004. – Vol. 93, № 2-3. – P. 281–284. 277. Peroxynitrite formation from human myocardium after ischemiareperfusion during open heart operation / Y. Hayashi, Y. Sawa, O. Shtake et al. // Ann Thorac Surg. – 2001. – Vol. 72, № 2. – P. 571–576. 278. Plasma concentrations of inflammatory cytokines rise rapidly during ECMO-related SIRS due to the release of preformed stores in the intestine / R. B. McILwain, J. G. Timpa, A. R. Kurundkar et al. // Lab Invest. – 2010. – Vol. 90, № 1. – P. 128–139. 258 279. Plasma Endothelin-1 Levels in Septic Patients / M. Piechota, M. Banach, R. Irzmanski et al. // J Intensive Care Med. – 2007. – Vol. 22, № 4. – P. 232– 239. 280. Plasma pro- and anti-inflammatory cytokine levels and outcome prediction in unselected critically ill patients / I. Dimopoulou, S. Orfanos, A. Kotanidou et al. // Cytokine. – 2008. – Vol. 41, № 3. – P. 263–267. 281. Platelet interleukin-1alpha drives cerebrovascular inflammation / P. Thornton, B. W. McColl, A. Green- halgh et al. // Blood. – 2010. – Vol.115, №17. - P. 3632–3639. 282. Postoperative plasma concentrations of procalcitonin after different types of surgery / M. Meisner, K. Tschaikowsky, A. Hutzler et al. // Intensive Care Med. – 1998. – Vol. 24, № 7. – P. 680–684. 283. Post-stroke infection: a role for IL-1ra? / P. Tanzi, K. Cain, A. Kalil et al. // Neurocrit Care. – 2011. – Vol. 14, № 2. – P. 244–252. 284. Procalcitonin and C-reactive protein during the early posttraumatic systemic inflamatoryresponce syndrome / O. Mimoz, J. F. Benoist, A. R. Edouard et al. // Intensive Care Med. – 1998. – Vol. 24, № 2. – P. 185–188. 285. Procalcitonin as a diagnostic marker in systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and sepsis / K. Hryckiewicz, J. Juszczyk, A. Samet et al. // Przegl Epidemiol. – 2006. – Vol. 60, № 1. – P. 7–15. 286. Profiles of Matrix Metalloproteinases, Their Inhibitors, and Laminin in Stroke Patients Influence of Different Therapies / S. Horstmann, P. Kalb, J. Koziol et al. // Stroke. – 2003. – Vol. 34, № 9. – P. 2165–2170. 287. Prognostic value of cytokines in SIRS general medical patients / M. Rodriguez-Gaspar, F. Santolaria, A. Jarque-Lopez et al. // Cytokine. – 2001. – Vol. 15, № 4. – P. 232–236. 288. Prognostic value of phagocytic activity of neutrophils and monocytes in sepsis. Correlation to CD64 and CD14 antigen expression / D. D. Danikas, M. Karakantza, G. L. Theodorou et al. // Clin. Exp. Immunol. – 2008. – Vol. 154, № 1. – P. 87–97. 259 289. Proinflammatory and antiinflammatory cytokines after cardiac operation: different cellular sources at different times / A. Franke, W. Lante, V. Fackeldey et al. // Ann Thorac Surg. – 2002. – Vol. 74, № 2. – P. 363–370. 290. Pro-inflammatory cytokines after different kinds of cardio-thoracic surgical procedures: is what we see what we know? / A. Franke, W. Lante, V. Fackeldey et al. // European Journal of Cardio-thoracic Surgery. – 2005. – Vol. 28, № 4. – P. 569–575. 291. Protective roles of mast cells against enterobacterial infection are mediated by Toll-like Receptor / V. Supajatura, H. Ushio, A. Nakao et al. // J Immunol. – 2001. – Vol. 167, № 4. – P. 2250–2256. 292. Pugin, J. A. critical role for monocytes and CD14 in endotoxin-induced endothelial cell activation / J. Pugin, R. J. Ulevitch, P. S. Tobias // J Exp Med. – 1993. – Vol. 178, № 6. – P. 2193–2200. 293. Pugin, J. How tissue injury alarms the immune system and causes a systemic inflammatory response syndrome / J. Pugin // Annals of Intensive Care. – 2012. – Vol. 2, № 1. – P. 27. 294. Pugin J. Lipopolysaccharide activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14 / Pugin J., Schürer-Maly C. C., Leturcq D. // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1993. – Vol. 90, №. 7. – P. 2744-2748. 295. Pyruvate-Enriched Cardioplegia Suppresses Cardiopulmonary BypassInduced Myocardial Inflammation / M. G. Ryou, D. C. Flaherty, B. Hoxha et al. // Ann Thorac Surg. – 2010. – Vol. 90, № 5. – P. 1529 –1536. 296. Raja, S. G. Modulation of Systemic Inflammatory Response after Cardiac Surgery / S. G. Raja, G. D. Dreyfus // Asian Cardiovasc Thorac Ann. – 2005. – Vol. 13, № 4. – P. 382–395. 297. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart / E. A. Dumont, C. P. Reutelingsperger, J. F. Smits et al. // Nat Med. – 2001. – Vol. 7, № 12. – P. 1352–1355. 260 298. Reddy, V. Y. Pericellular mobilization of the tissue-destructive cysteine proteinases, cathepsins B, L, and S, by human monocyte-derived macrophages / V. Y. Reddy, Q. Y. Zhang, S. J. Weiss // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1995. – Vol. 92, № 9. – P. 3849–3853. 299. Regulation and functions of the IL-10 family of cytokines in inflammation and disease / W. Ouyang, S. Rutz, N. K. Crellin et al. // Annu Rev Immunol. – 2011. – № 29. – P. 71–109. 300. Regulation of collagenase activities of human cathepsins by glycosaminoglycans / Z. Li, Y. Yasuda, W. Li et al. // J Biol Chem. – 2004. – Vol. 279, № 7. – P. 5470–5479. 301. Regulation of Endothelial Cell Proliferation by Primary Monocytes / S. Y. Schubert, A. Benarroch, J. Ostvang et al. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2008. – Vol. 28, № 1. – P. 97–104. 302. Regulation of Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 on CD14dimCD16+ monocytes in response to sepsis-related antigens / N. A. Skinner, C. M. MacIsaac, J. A. Hamilton et al. // Clin. Exp. Immunol. – 2005. – Vol. 141, № 2. – P. 270–278. 303. Relation of Matrix Metalloproteinase-9/Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Ratio in Peripheral Circulating CD14+ Monocytes to Progression of Coronary Artery Disease / S. Brunner, J. O. Kim, H. Methe et al. // American Journal of Cardiology. – 2010. – Vol. 105, Iss. 4. – Р. 429– 434. 304. Relationship between heart-type fatty acid-binding protein levels and coronary artery disease in exercise stress testing: an observational study / H. Arı, M. Tokaз, Y. Alihanoğlu et al. // Anadolu Kardiyol Derg. – 2011. – Vol. 11, № 8. – P. 685–691. 305. Relationships of adiponectin and matrix metalloproteinase-9 to tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio with coronary plaque morphology in patients with acute coronary syndrome / M. Cheng, S. Hashmi, X. Mao et al. // Can J Cardiol. – 2008. – Vol. 24, № 5. – P. 385–390. 261 306. Release characteristics of cardiac biomarkers and ischemiamodified albumin as measured by the albumin cobalt-binding test after a marathon race / F. S. Apple, H. E. Quist, A. P. Otto et al. // Clin. Chem. – 2002. – Vol. 48, № 7. – P. 1097–1100. 307. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes / R. A. Gottlieb, K. O. Burleson, R. A. Kloner et al. // J Clin Invest. – 1994. – Vol. 94, № 4. – P. 1621–1628. 308. Reprogramming of circulatory cells in sepsis and SIRS / J. M. Cavaillon, C. Adrie, C. Fitting et al. // Innate Immunity – 2005. – Vol. 11, № 5. – P. 311– 320. 309. Response to sex hormones differs in atherosclerosis-susceptible and resistant mice / M. Potier, M. Karl, S. J. Elliot et al. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. – 2003. – Vol. 285, № 6. – P. E1237–E1245. 310. Role of apoptosis in myocardial stunning after open heart surgery / J. P. Schmitt, J. Schroder, H. Schunkert et al. // Ann Thorac Surg. – 2002. – Vol. 73, № 4. – P. 1229–123515. 311. Role of apoptosis in reperfusion injury / F. Eefting, B. Rensing, J. Wigman et al. // Cardiovascular Research. – 2004. – Vol. 61, № 3. – P. 414–426. 312. Role of IL-1alpha and IL-1beta inischemic brain damage / H. Boutin, R. A. Le Feuvre, R. Horai et al. // J. Neurosci. – 2001. – Vol. 21, № 15. – P. 5528– 5534. 313. Roles of neutrophils in the regulation of the extent of human inflammation through delivery of IL-1 and clearance of chemokines / A. Basran, M. Jabeen, L. Bingle et al. // J. Leukoc Biol. – 2013. – Vol. 93, № 1. – P. 7–19. 314. Roy, D. IMA—the role of oxidative stress / D. Roy, J. C. Kaski // Europace. – 2007. – Vol. 9, № 9. – P. 854–855. 315. Rubens, F. D. The inflammatory response to cardiopulmonary bypass : a therapeutic overview / F. D. Rubens, T. Mesana // Perfusion. – 2004. – Vol. 19, suppl. 1. –P. S5–S12. 262 316. Russell, S. E. Sterile inflammation – do innate lymphoid cell subsets play a role? / S. E. Russell, P. T. Walsh // Front Immunol. – 2012. – № 3. –P. 246. 317. Rydzewska-Rosołowska, A. Enoxaparin decreases serum MCP-1 concentration during haemodialysis-preliminary report / A. RydzewskaRosołowska, J. Borawski, M. Myśliwiec // NDT Plus. – 2009. – Vol. 2, № 5. – P. 429–430. 318. Searle, J. Necrosis and apoptosis : distinct modes of cell death with fundamentally different significance / J. Searle, J. F. Kerr, C. J. Bishop // Pathol. Ann. – 1982. – Vol. 17, № 2. – P. 229–259. 319. Selective mobilization of CD14+CD16+ monocytes by exercise / B. Steppich, F. Dayyani, R. Gruber et al. // Am. J. Physiol Cell Physiol. – 2000. – Vol. 279, № 3. – P. 578–586. 320. Senescent CD14+ CD16+ Monocytes Exhibit Proinflammatory and Proatherosclerotic Activity / A. Merino, P. Buendia, A. Martin-Malo et al. // J. Immunol. – 2010. – Vol. 186, № 3. – P. 1809–1815. 321. Sepsis as a model of SIRS / M. Bhatia, M. He, H. Zhang et al // Front Biosci. – 2009. – № 14. – P. 4703–4711. 322. Sequence identity between the alpha 2-macroglobulin receptor and low density lipoprotein receptor-related protein suggests that this molecule is a multifunctional receptor / D. K. Strickland, J. D. Ashcom, S. Williams et al. // J Biol Chem. – 1990. – Vol. 265, № 29. – P. 17401–1744. 323. Serial changes in neutrophil-endothelial activation markers during the course of sepsis associated with disseminated intravascular coagulation / S. Gando, T. Kameue, N. Matsuda et al. // Thromb Res. – 2005. – Vol. 116, № 2. – P. 91–100. 324. Serum amyloid A induces G-CSF expression and neutrophilia via Toll-like receptor 2 / R. L. He, J. Zhou, C. Z. Hanson et al. // Blood. – 2009. – Vol. 113, № 2. – Р. 429–437. 325. Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in ankylosing spondylitis : MMP-3 is a reproducibly sensitive and specific 263 biomarker of disease activity / C. H. Chen, K. C. Lin, D. T. Y. Yu et al. // Rheumatology. – 2006. – Vol. 45, № 4. – P. 414–420. 326. Serum MMP-9 and TIMP-1 concentrations and MMP-9 activity during surgery-induced inflammation in humans / J. Helmersson-Karlqvist, T. Akerfeldt, L. Gunningberg et al. // Clin. Chem. Lab Med. – 2012. – Vol. 50, № 6. – P. 1115–1119. 327. Shedding of soluble ICAM-1 into the alveolar space in murine models of acute lung injury / M. P. Mendez, S. B. Morris, S. Wilcoxen et al. // AJP Lung Physiol. – 2006. – Vol. 290, № 5. – P. L962–L970. 328. Sikora, J. P. Soluble cytokine receptors sTNFR I and sTNFR II, receptor antagonist IL-1ra, and anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-13 in the pathogenesis of systemic inflammatory response syndrome in the course of burns in children / J. P. Sikora, W. Kuzanski, E. Andrzejewska // Med SciMonit. – 2009. – Vol. 15, № 1. – P. CR26–CR31. 329. Siwik, D. A. Oxidative stress regulates collagen synthesis and matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts / D. A. Siwik, P. J. Pagano, W. S. Colucci // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2001. – Vol. 280, № 1. – P. 53–60. 330. Soluble levels of cell adhesion molecules (CAMs) in coronary artery disease / M. R. Mashru, V. K. Shah, S. L. Soneji et al. // Indian Heart J. – 2010. – Vol. 62, № 1. – P. 57–63. 331. Soluble triggering receptor on myeloid cells-1 is expressed in the course of non-infectious inflammation after traumatic lung contusion : a prospective cohort study / T. M. Bingold, B. Pullmann, S. Sartorius et al. // Critical Care. – 2011. – Vol. 15, № 2. – P. R115. 332. Specific Temporal Profile of Matrix Metalloproteinase Release Occurs in Patients After Myocardial Infarction : Relation to Left Ventricular Remodeling / C. S. Webb, D. D. Bonnema, S. H. Ahmed et al. // Circulation. – 2006. – Vol. 114, № 10. – P. 1020–1027. 264 333. Study on the relationship of APACHE III and levels of cytokines in patients with systemic inflammatory response syndrome after coronary artery bypass grafting. / Y. Q. Mei, Q. Ji, H. Liu et al. // Biol Pharm Bull. – 2007. – Vol. 30, № 3. – P. 410–414. 334. Suppression of ACTH-induced steroidogenesis by supernatants from LPStreated peritoneal exudate macrophages / J. C. Mathison, R. D. Schreiber, A. C. La Forest et al. // Journal of Immunology. – 1983. – Vol. 130. – P. 2757– 2762. 335. Surface phenotype analysis of human monocyte to macrophage maturation / R. Andreesen, W. Brugger, C. Scheibenbogen et al. // J. Leukoc. Biol. – 1990. – Vol. 47, № 6. – P. 490–497. 336. Systemic inflammation and disseminated intravascular coagulation in early stage of ALI and ARDS: role of neutrophil and endothelial activation / S. Gando, T. Kameue, N. Matsuda et al. // Inflammation. – 2004. – Vol. 28, № 4. – P. 237–244. 337. Systemic inflammatory response syndrome predicts increased mortality in patients after transcatheter aortic valve implantation / J. M. Sinning, A. C. Scheer, V. Adenauer et al. // Eur. Heart. J. – 2012. – Vol. 33, № 12. – P. 1459–1468. 338. Tailor, S. L. Sensitive fluorometric method for tissue tocopherol analysis / S. L. Tailor, M. P. Lambden, A. L. Tappel // Lipids. – 1976. – Vol. 11, № 7. – P. 530–538. 339. T-cell reactivity and its predictive role in immunosuppression after burns / S. Zedler, R. C. Bone, A. E. Baue et al. // Crit. Care Med. – 1999. – Vol. 27, № 1. – P. 66–72. 340. The critical role of caspases activation in hypoxia/reoxygenation induced apoptosis / F. Y. Ho, W. P. Tsang, S. K. Kong et al. // Biochem Biophys Res Commun. – 2006. – Vol. 345, № 3. – P. 1131–1137. 341. The Effect of Conventional and Mini-Invasive Cardiopulmonary Bypass on Neutrophil Activation in Patients Undergoing Coronary Artery Bypass 265 Grafting / M. Kolackova, J. Krejsek, V. Svitek et al. // Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation. – 2012. – Vol. 2012. – 152895. 342. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions / M. Nahrendorf, F. K. Swirski, E. Aikawa et al. // J. Exp. Med. – 2007. – Vol. 204, № 12. – P. 3037–3047. 343. The increased expression of TREM-1 on monocytes is associated with infectious and noninfectious inflammatory processes / E. Ferat-Osorio, N. Esquivel-Callejas, I. Wong-Baeza et al. // J Surg Res. – 2008. – Vol. 150, № 1. – P. 110–117. 344. The innate immune response in reperfused myocardium / L. Timmers, G. Pasterkamp, V. C. de Hoog et al. // Cardiovascular Research. – 2012. – Vol. 94, № 2. – P. 276–283. 345. The systemic inflammatory response syndrome following cardiac surgery: different expression of proinflammatory cytokines and procalcitonin in patients with and without multiorgan dysfunctions / A. Sablotzki, I. Friedrich, J. Mühling et al. // Perfusion March. – 2002. – Vol. 17, № 2. – P. 103–109. 346. The transcription of the alarmin cytokine interleukin-1 alpha is controlled by hypoxia inducible factors 1 and 2 alpha in hypoxic cells / P. Rider, I. Kaplanov, M. Romzova et al // Front Immunol. – 2012. – № 3. – P. 290. 347. Threonine 98, the pivotal residue of tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-1 in metalloproteinase recognition / M. H. Lee, M. Rapti, V. Kna¨uper et al. // J Biol Chem. – 2004. – Vol. 279, № 17. – P. 17562–17569. 348. Tissue inhibitor of metalloproteinases levels in patients with chronic heart failure: An independent predictor of mortality / S. Frantz, S. Störk, K. Michels et al. // European Journal of Heart Failure. – 2008. – Vol. 10, № 4. – Р. 388–395. 349. Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions / D. E. Gomez, D. F. Alonso, H. Yoshiji et al. // Eur J Cell Biol. – 1997. – Vol. 74, № 2. – P. 111–122. 266 350. TLR2 signaling in chondrocytes drives calcium pyrophosphate dehydrate and monosodium urate crystal-induced nitric oxide generation / R. LiuBryan, K. Pritzker, G. S. Firestein et al. // J Immunol. – 2005. – Vol. 174, № 8. – Р. 5016–5023. 351. Toll4 (TLR4) expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium / S. Frantz, L. Kobzik, Y. D. Kim et al. // J Clin Invest. – 1999. – Vol. 104, № 3. – Р. 271–280. 352. Toll-like receptor 4 modulates myocardial ischaemia–reperfusion injury: Role of matrix metalloproteinases / H. Stapel, S. C. Kim, S. Osterkamp et al. // European Journal of Heart Failure. – 2006. – Vol. 8, № 7. – P. 665–672. 353. Transcriptomic and Proteomic Patterns of Systemic Inflammation in OnPump and Off-Pump Coronary Artery Bypass Grafting / V. Tomic, S. Russwurm, E. Möller et al. // Circulation. – 2005. – Vol. 112, № 19. – P. 2912–2920. 354. Transforming growth factor-beta mediates balance between inflammation and fibrosis during plaque progression / E. Lutgens, M. Gijbels, M. Smook et al. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2002. – Vol. 22, № 6. – P. 975– 982. 355. Translocation of bacterial NOD2 agonist and its link with inflammation / O. Y. Kim, A. Monsel, M. Bertrand et al. // Crit. Care. – 2009. – Vol. 13, № 4. – P. R124. 356. Transmigration of blood leukocytes into the peritoneal cavity is related to the upregulation of ICAM-1 (CD54) and Mac-1 (CD11b/CD18) adhesion molecules / T. Liberek, M. Chmielewski, M. Lichodziejewska-Niemierko et al. // Perit Dial Int. – 2004. – Vol. 24, № 2. – P. 139–146. 357. TREM1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock / A. Bouchon, F. Facchetti, M. A. Weigand et al. // Nature. – 2001. – Vol. 410, № 6832. – P. 1103–1107. 358. Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) amplifies the signals induced by the NACHT-LRR (NLR) pattern recognition receptors / 267 M. G. Netea, T. Azam, G. Ferwerda et al. // J. Leukocyte Biol. – 2006. – Vol. 80, № 6. – P. 1454–1461. 359. Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 expression on monocytes is associated with inflammation but not with infection in acute pancreatitis / E. Ferat-Osorio, I. Wong-Baeza, N. Esquivel-Callejas et al. // Critical Care. – 2009. – Vol. 13, № 3. – P. R69. 360. Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1 in Neutrophil Inflammatory Responses: Differential Regulation of Activation and Survival / M. P. Radsak, H. R. Salih, H. Rammensee et al. // J. Immunol. – 2004. – Vol. 172, № 8. –P. 4956–4963. 361. Tumor necrosis factor as a potent inhibitor of adrenocorticotropin inducedcortisol production and steroidogenic P450 enzyme gene expression in cultured human fetal adrenal cells / M. Jaattela, V. Ilvesmaki, R. Voutilainen et al. // Endocrinology. – 1991. – Vol. 128, № 1. – P. 623–629. 362. Turnbull, A. V. Regulation of the hypothalamic–pituitary–adrenal axis by cytokines: actions and mechanisms of action / A. V. Turnbull, C. L. Rivier // Physiological Reviews. – 1999. – Vol. 79, № 1. – P. 1–71. 363. Van Beijnum, J. R. Convergence and amplification of toll-like receptor (TLR) and receptor for advanced glycation end products (RAGE) signaling pathways via high mobility group B1 (HMGB1) / J. R. van Beijnum, W. A. Buurman, A. W. Griffioen // Angiogenesis. – 2008. – Vol. 11, № 1. – Р. 91– 99. 364. Vincent, J. Organ dysfunctions as an outcome measure : The SOFA Score / J. Vincent // Sepsis. – 1997. – Vol. 1, № 1. – Р. 53–54. 365. Visualisation of cell death in vivo in patients with acute myocardial infarction / L. Hofstra, I. H. Liem, E. A. Dumont et al. // Lancet. – 2000. – Vol. 356, № 9225. – P. 209–212. 366. Wu, AHB. Cardiac markers / AHB Wu. – Totowa, NJ : Humana Press, 2003. – 467 p. 268 367. Xia, H. M. Tumor necrosis factor alpha affect hydrocortisone expression in mice adrenal cortex cells mainly through tumor necrosis factor alphareceptor 1 / H. M. Xia, Y. Fang, P. L. Huang // Chin Med J. – 2011. – Vol. 124, № 17. – P. 2728–2732. 368. Yang, Z. Crucial Role of Endogenous Interleukin-10 Production in Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury / Z. Yang, B. Zingarelli, C. Szabу // Circulation. – 2000. – Vol. 101, № 9. – P. 1019–1026. 369. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes : their role in infection and inflammation / L. Ziegler-Heitbrock // J. of Leukocyte Biology. – 2007. – Vol. 81, № 3. – P. 584–592.
