Краткий отчёт ОЧБ ФМБА России за 2013

ОТЧЕТ
ОБ ИТОГАХ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
ИНСТИТУТА ЗА 2013 ГОД
(краткий)
Санкт-Петербург 2014
СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
Краткое изложение результатов НИОКР, выполненных институтом в 2013 г.
3
Итоги внедрения результатов НИР
9
Международное сотрудничество
11
Основные задачи и направления перспективной научно-практической
11
деятельности
2
Краткое изложение результатов НИОКР, выполненных институтом в 2013 г.
Разработка радиозащитных и антитоксических средств на основе рекомбинантных
белков. Завершены клинические исследования новой лекарственной формы (мазь)
интерлейкина-1бета (ИЛ-1бета) для наружного применения Бетаприм у пациентов с
длительно незаживающими ранами различной этиологии. Убедительно продемонстрирована
высокая клиническая эффективность мази у больных с синдромом «диабетической стопы».
Подготовлен комплект документов для регистрации лекарственной формы ИЛ-1бета в виде
мази. Изучена радиозащитная эффективность жидкой лекарственной формы ИЛ-1бета в
комбинации с противовоспалительными препаратами. Показано, что в сочетании с
анальгином ИЛ-1бета полностью сохраняет радиозащитную активность, при этом также
нивелируется пирогенный эффект препарата, что создает предпосылки для успешного
создания комбинированного препарата ИЛ-1бета для индивидуального применения, не
обладающего
пирогенным
действием.
Разработаны
две
рецептуры
пероральной
лекарственной формы ИЛ-1бета для лечения острых и хронических поражений слизистой
оболочки желудка. После изучения язвозаживляющего действия установлено, что наиболее
перспективным направлением создания пероральной формы ИЛ-1бета является создание
капсулированной формы, содержащей цитокин в смеси с биодеградируемым полимером.
Разработка адресных систем доставки на основе биодеградируемых наноразмерных
частиц для получения новых лекарственных препаратов, предназначенных для терапии
острых и хронических заболеваний легких. В ходе выполнения проекта разработан метод
получения новых адресных систем доставки на основе биодеградируемых наноразмерных
частиц.
Наноразмерная
система
доставки
представляет
собой
водную
суспензию
полимерных частиц на основе хитозана и поливинилпирролидона. Наночастицы обладают
стабильностью в водной среде и способны сорбировать белки, пептиды и антибиотики.
Разработана панель синтетических противомикробных пептидов с использованием Востехнологии, оценена ингибирующая активность пептидов в отношении коллекционных и
госпитальных штаммов Staphylococcus aureus. Пептид SINP-58 показал наибольшую
противомикробную активность. Разработан метод включения в состав адресных систем
доставки
на
основе
биодеградируемых
наноразмерных
частиц
противомикробных
синтетических пептидов и антибиотиков. Наработаны опытные образцы трех препаратов,
содержащих
в
качестве
тиоуреидоиминометилпиридиния
активного
перхлорат
начала
и
ванкомицина
противомикробный
гидрохлорид,
пептид
SINP-58.
Показано, что разработанные препараты обладают противомикробной активностью в
отношении тест-культур микроорганизмов S. aureus ATCC 25923, S. aureus, MRSA.
3
Изучение механизмов действия метаболитных и бактериально-метаболитных
препаратов методами геномики и метаболомики. Исследовано влияние метаболитного и
бактериально-метаболитного препаратов Актофлор-С и Витафлор-форте на гемолитическую
активность патогенного штамма E. coli О75. Показано, что комплексы метаболитов
повышают уровень антагонистической активности штаммов L. аcidophilus Д№75 и Д№76 в
2-5 раз за счет индукции синтеза бактериоцина и снижения в популяции доли низкоактивных
клонов. Методом ГХ-МС проведен анализ метаболомов крови у животных, получавших
Актофлор-С и Витафлор-форте. По характеру изменения уровня метаболитов можно
полагать, что оба препарата оказывают непосредственное влияние как на хозяина, так и на
его микрофлору. При этом Витафлор-форте эффективнее стимулирует рост бифидобактерий
и бактерий, синтезирующих бутират, а Актофлор-С – энтеробактерий. Для штаммов L.
аcidophilus (Д№75 и Д№76) построены нуклеотидные последовательности фрагментов генов,
гомологичных генам аминоацилазы, пептидазы и биотин карбоксилазы L. helveticus.
Полученные
последовательности
сопоставлены
с
известными
гомологичными
последовательностями ДНК, содержащимися в GenBank. По результатам мультилокусного
анализа оба штамма принадлежат группе бактерий, адаптированных к существованию в
молоке и молочных продуктах.
Создание новой технологии получения рекомбинантного эпоэтина альфа с
использованием бессывороточных сред и разработка лекарственной формы на его основе,
не содержащей белки животного происхождения. В результате проведенных работ линия
клеток – продуцент рекомбинантного эритропоэтина человека CHO/EPO SP/M – была
успешно адаптирована к культивированию в суспензии в коммерческой бессывороточной
среде. После оптимизации условий культивирования были подобраны добавки, позволившие
увеличить максимальный уровень эритропоэтина в культуральной среде до уровня порядка
40 мкг/мл, в то время как при адгезионном культивировании в сывороточной среде
концентрация целевого белка составляет около 8 мкг/мл. Рекомбинантный эритропоэтин был
очищен из бессывороточной среды с помощью иммуноаффинной хроматографии. При
анализе полученного белка было установлено, что он соответствует по параметрам
подлинности и биологической активности рекомбинантному эритропоэтину, получаемому
при культивировании клеток CHO/EPO SP/M в среде с фетальной сывороткой. Разработаны
три экспериментальных состава лекарственной формы эпоэтина альфа, не содержащих
человеческого
сывороточного
альбумина.
Наработаны
опытные
образцы
новой
лекарственной формы и заложены на хранение. При хранении в течение 9 месяцев
специфическая активность эпоэтина во всех образцах остается в пределах требований
нормативной документации.
4
Изучение пространственной структуры рекомбинантного белка теплового шока 70
человека и его доменов. Проведена наработка и контроль качества опытных образцов белка
теплового шока 70 (БТШ70) для обеспечения исследований. Рекомбинантный белок
характеризовался высокой степенью чистоты, равной 98,7%; его молекулярная масса
составила 69620 Да. Специфическая (шаперонная) биологическая активность БТШ70,
определенная с помощью шаперонного иммуноферментного анализа в реакции связывания с
субстратом – денатурированным карбоксиметилированным лактальбумином, составила 74%,
что является хорошим показателем активности белка. Этот показатель свидетельствует
также
о
сохранении
нативной
структуры
белка.
Подобраны
условия
и
методы
кристаллизации БТШ70 и его производных. Получены кристаллы БТШ70 в комплексе с
лигандами в наземных условиях.
Разработка нового лекарственного препарата, обладающего иммуностимулирующей
и
адъювантной
активностью,
на
основе
рекомбинантного
флагеллина.
Изучены
иммуностимулирующие, гемостимулирующие и радиозащитные свойства рекомбинантного
флагеллина
на
лабораторных
животных.
Подтвержден
радиозащитный
эффект
рекомбинантного флагеллина, сравнимый по выраженности с эффектом ИЛ-1бета.
Разработан состав лекарственной формы рекомбинантного флагеллина, представляющей
собой лиофилизат для приготовления раствора для инъекций, подтверждена сохранность и
стабильность ее биологической активности. Разработаны проекты технологических
регламентов получения субстанции и лекарственной формы препарата, а также проекты
ФСП на субстанцию и лекарственную форму. Проведена наработка субстанции и опытной
партии лекарственной формы рекомбинантного флагеллина.
Разработка
противоинфекционных
и
противовоспалительных
лекарственных
препаратов аэрозольного применения на основе рекомбинантных цитокинов. Цель
исследования - создание лекарственных препаратов аэрозольного применения на основе
рекомбинантных цитокинов для профилактики и лечения инфекционных, аллергических и
воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей и легких. Получено разрешение
Минздрава России № 275 от 26 апреля 2013 года на проведение клинических исследований
препарата Интерфераль® при лечении рецидивирующего респираторного папилломатоза у
взрослых. Изучена фармакокинетика и доказана безопасность применения препарата
Интерфераль®. Рекомендовано исследование препарата в терапии рецидивирующего
респираторного папилломатоза гортани у детей. Завершена регистрация препарата
Интерфераль®, аэрозоль для местного применения 100 000 МЕ, для лечения гриппа и острых
респираторных заболеваний у взрослых; подготовлен и представлен в Минздрав России
комплект документов для получения разрешения на проведение клинических исследований
5
(КИ) препарата при лечении гриппа и ОРВИ у детей и подростков. Проведено доклиническое
изучение сухих аэрозольных препаратов на основе рекомбинантных белков интерферона
альфа-2b и рецепторного антагониста интерлейкина-1. С целью получения разрешения на
проведение клинического исследования препарата Интерфераль ®, порошок для ингаляций,
при бронхиальной астме подготовлен Протокол КИ с приложениями. Подготовлена и
проведена IIb фаза КИ препарата Ралейкин®, аэрозоль для местного применения 0,5 %, в
ГОУ ВПО СПбГМУ им. И.П. Павлова на кафедре госпитальной терапии. Полученные
данные свидетельствуют о высоком уровне безопасности и эффективности исследуемого
аэрозольного препарата при лечении интермиттирующего аллергического ринита. В
Департамент государственного регулирования обращения лекарственных средств Минздрава
России представлен комплект документов с целью регистрации препарата Ралейкин ®,
аэрозоль для местного применения 0,1 %, 0,5 %, в качестве лекарственного средства при
аллергическом и сезонном рините.
Разработка селективных гемосорбентов для экстракорпоральной коррекции при
терапии критических состояний. Разработаны регламенты на синтез гемосорбентов и
получение колонок, заполненных гемосорбентами на основе гранулированного агарозного
носителя Сепаропор и моноклональных антител к цитокинам ИЛ-1β, ФНОα, ИЛ-6 и
анафилатоксину комплемента С5а и на основе макропористой целлюлозной матрицы,
модифицированной
октил/децилглицидиловым
эфиром,
для
проведения
колоночной
адсорбции цитокинов, анафилатоксина комплемента и ЛПС из плазмы крови. Получены
опытные образцы колонок, заполненных гемосорбентами, для удаления циркулирующих при
сепсисе патогенных факторов из плазмы крови, названные Гемос-КСГ-2-ИЛ-1β, Гемос-КСГ2-ФНОα, Гемос-КСГ-2-ИЛ6, Гемос-КСГ-2-С5а, Гемос К-2, Гемос К-4. Подготовлены
проекты технических условий на колонку гемосорбционную однократного применения для
проведения колоночной адсорбции цитокинов и анафилатоксина комплемента и колонку
гемосорбционную однократного применения с целлюлозным сорбентом Сфероцелл С-80.
Отработаны режимы перфузии плазмы крови, содержащей объекты-мишени для удаления, с
использованием аппарата «Гемма». Показана высокая эффективность удаления
ИЛ-1β,
ФНОα, ИЛ-6 и анафилатоксина комплемента С5а, ЛПС из плазмы крови.
Доклинические
исследования
лекарственного
средства
-
гуманизированного
моноклонального антитела против иммуноглобулинов Е человека для лечения аллергических
заболеваний. Проведено масштабирование и оптимизация технологического процесса
получения субстанции рекомбинантных гуманизированных антител против IgE человека. В
результате отработана технология ферментации штамма-продуцента в реакторе с рабочим
объемом 25 л с выходом 0,35 г/л рекомбинантных антител. Разработана готовая
6
лекарственная форма рекомбинантных гуманизированных антител против IgE человека в
виде лиофилизата для приготовления раствора для подкожного введения, изучены ее
физико-химические свойства и стабильность. Изучена специфическая фармакологическая
активность субстанции рекомбинантных антител. Установлено, что полученные антитела
ингибируют IgE-опосредованную мобилизацию внутриклеточного кальция и дозозависимо
подавляют продукцию гистамина клетками RBL-2H3, а также уменьшают активацию
базофилов периферической крови человека, вызванную IgE. Проведено доклиническое
исследование фармакокинетики готовой лекарственной формы рекомбинантных антител на
лабораторных мышах при однократном внутривенном и подкожном введениях. Проведено
доклиническое
исследование
острой
и
хронической
токсичности,
реактогенности,
раздражающего действия и специфических видов токсичности препарата рекомбинантных
антител. Установлено, что препарат нетоксичен, не обладает раздражающим действием и
специфическими видами токсичности. Разработан проект протокола КИ лекарственного
средства на основе рекомбинантных гуманизированных антител против IgE человека,
проекты брошюры исследователя и инструкции по применению. Разработаны рекомендации
по использованию результатов проведенной НИОКР в терапии аллергических заболеваний, а
также в дальнейших исследованиях.
Доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантного
белка теплового шока для иммунотерапии глиобластом и меланом. Проведено углубленное
изучение фармакокинетики и специфической фармакологической активности субстанции
белка теплового шока 70 (БТШ70) человека. Показано, что применение субстанции БТШ70 в
дозе 1,25 мг/кг на моделях глиобластомы крысы С6 и меланомы мыши В16 F10 позволяет
снизить скорость роста опухолей на 42-48% и 51-55%, соответственно. Результаты изучения
фармакокинетики подтвердили целесообразность внутриопухолевого способа введения
БТШ70. Проведены доклинические исследования острой токсичности, реактогенности,
раздражающего действия и влияния на системы и органы животных субстанции и
лекарственной
формы
рекомбинантного
БТШ70
человека,
результаты
которых
свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих
рекомендованную для человека дозу в сотни и тысячи раз. Разработаны лабораторные
регламенты получения субстанции и лекарственной формы БТШ70. В соответствии с
регламентами наработаны опытные образцы субстанции и лекарственной формы БТШ70.
Изучены физико-химические свойства лекарственной формы рекомбинантного БТШ70.
Разработан проект фармакопейной статьи предприятия на субстанцию рекомбинантного
БТШ70. Проведено исследование стабильности образцов препарата «Рекомбинантный белок
теплового шока 70 человека», лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 мг,
7
хранящихся при температуре от 2 до 8 С, в результате которого показано, что лекарственная
форма стабильна при хранении в течение 6 месяцев. Подготовлен проект опытнопромышленного регламента получения субстанции рекомбинантного белка теплового шока
70 человека.
Доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантного
интерлейкина-7 для лечения вторичных иммунодефицитов. Подготовлен обзор научной
литературы по вопросам биологии интерлейкина-7 (ИЛ-7), а также возможностей его
применения в клинике. Показано, что лекарственный препарат на основе рекомбинантного
ИЛ-7 человека может быть чрезвычайно перспективным средством для лечения различных,
прежде всего, Т-клеточных иммунодефицитов, включая рефракторную CD4-лимфопению у
пациентов с ВИЧ-инфекцией на фоне высокоактивной антиретровирусной терапии,
лимфопению после лучевой, химиотерапии и трансплантации костного мозга, а также
возрастных
иммунодефицитов.
Разработан
План
доклинических
исследований
лекарственного средства на основе рекомбинантного интерлейкина-7 человека. Создана
лабораторно-экспериментальная
технология
получения
субстанции
рекомбинантного
интерлейкина-7 человека. Получены лабораторные образцы и исследованы физикохимические и биологические свойства рекомбинантного ИЛ-7 человека. Показано, что
полученный белок полностью гликозилирован, обладает биологической активностью,
взаимодействует со специфическими антителами, при дегликозилировании обладает
расчетной молекулярной массой. Изучена специфическая активность рекомбинантного ИЛ-7
человека в экспериментах in vitro. Установлено, что белок стимулирует пролиферацию Вклеточного ростка в костном мозге, ранних предшественников Т-клеток в тимусе, а также
зрелых форм Т-лимфоцитов в тимусе и селезенке. Проведена разработка и предварительная
(частичная) валидация методов анализа лекарственного средства на основе ИЛ-7 человека.
Доклинические исследования лекарственного средства для лечения диабета 2-го типа
на основе рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-1. Проведено
доклиническое исследование безопасности лекарственного средства для лечения диабета 2го типа на основе рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-1: острой и
хронической
токсичности,
реактогенности,
раздражающих
свойств,
аллергенности,
иммунотоксичности, репродуктивной токсичности, мутагенности и риска канцерогенного
действия. Состояние животных после острого введения препарата свидетельствует о
хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих максимальную
терапевтическую в сотни раз. Подострое и хроническое ежедневное подкожное введение
препарата экспериментальным животным не оказывало вредного воздействия на основные
адаптационные системы (нервную, сердечно-сосудистую, кроветворную, выделительную,
8
дыхательную), обмен веществ, общее состояние и развитие, основные гомеостатические
параметры организма. Было показано, что препарат не обладает специфическими видами
токсичности и раздражающим действием. Разработан комплект документов для получения
разрешения на проведение клинических исследований лекарственного средства на основе
рекомбинантного ИЛ-1ра при диабете 2-го типа, включающий проект протокола
клинического
исследования,
брошюру исследователя,
инструкцию
по
применению
лекарственного средства. Разработаны рекомендации и предложения по использованию
результатов проведенной НИОКР в дальнейших исследованиях.
Доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантного
ингибитора белков острой фазы воспаления для лечения воспалительных и аутоиммунных
заболеваний. Подготовлен аналитический обзор информационных источников о функциях
белков острой фазы воспаления, в особенности, интерлейкина-6 (ИЛ-6), а также об
антицитокиновой терапии, направленной на снижение активности ИЛ-6 в организме
человека. Разработан план доклинических исследований лекарственного средства на основе
рекомбинантного ингибитора белков острой фазы воспаления - гуманизированных
моноклональных
антител
к
ИЛ-6.
Проведены
адаптация
штамма-продуцента
гуманизированных моноклональных антител к ИЛ-6 к суспензионному культивированию в
бессывороточной среде и оптимизация условий культивирования. Получены лабораторные
образцы
и
проведено
исследование
физико-химических
и
биологических
свойств
рекомбинантных гуманизированных антител к ИЛ-6. Анализ свойств полученных
лабораторных образцов показал, что по молекулярной массе и субъединичному составу
образцы представляют собой полноразмерные антитела с константными областями IgG1
человека. Антитела обладают биологической активностью, дозозависимо ингибируя ИЛ-6зависимую пролиферацию клеток линии В9. Разработаны три модели для исследования
специфической
фармакологической
активности
лекарственного средства
на основе
рекомбинантных гуманизированных моноклональных антител к ИЛ-6. Разработаны методы
контроля качества субстанции рекомбинантных гуманизированных антител к ИЛ-6.
Итоги внедрения результатов НИР
По результатам научной деятельности в 2013 году институтом получено 5 патентов и
1 свидетельство на товарный знак:
- Патент на изобретение № 2487547 «Сухой пробиотически активный препарат
«Витафлор-П», заявка № 2012103999, дата приоритета 07.02.2012 г., дата публикации
20.07.2013 г.;
- Патент на изобретение № 2491956 «Способ лечения вагинальных инфекций», заявка
№ 2009117809, дата приоритета 14.05.2009 г., дата публикации 10.09.2013 г.;
9
- Патент на изобретение № 2495048 «Пептид, обладающий антиатеросклеротическим
действием, и композиция для профилактики и лечения атеросклероза сосудов», заявка
№ 2012115397, дата приоритета 18.04.2012 г., дата публикации 10.10.2013 г.;
- Патент на изобретение № 2499043 «Стимулятор пролиферации регуляторных Тлимфоцитов и способ их стимуляции», заявка № 2012140939, дата приоритета 26.09.2012 г.,
дата публикации 20.11.2013 г.;
- Патент на полезную модель № 126255 «Устройство для получения кисломолочного
напитка», заявка № 2012102871, дата приоритета 20.01.2012 г., дата публикации
27.03.2013 г.;
- Свидетельство на товарный знак № 495976 «НИИ особо чистых биопрепаратов»,
заявка № 2012722297, дата подачи заявки 04.07.2012 г., дата регистрации 11.09.2013 г.
Подано 7 заявок на выдачу патентов РФ на изобретения:
- Заявка на изобретение № 2013104332 от 29.01.2013 г. «Композиция для лечения
токсической лейкопении «Беталейкин-5»;
- Заявка на изобретение № 2013131428 от 10.07.2013 г. «Штамм бактерий E.coli –
продуцент белка теплового шока 70 и способ получения препарата белка теплового шока
человека»;
- Заявка на изобретение № 2013131429 от 10.07.2013 г. «Штамм клеток СНО-ОМА 3/1
– продуцент гуманизированного антитела против иммуноглобулина Е человека и антитело
против иммуноглобулина Е человека»;
- Заявка на изобретение № 2013131430 от 10.07.2013 г. «Способ лечения сахарного
диабета 2 типа»;
- Заявка на изобретение № 2013140067 от 28.08.2013 г. «Способ терапии опухолевых
заболеваний»;
- Заявка на изобретение № 2013145847 от 15.10.2013 г. «Способ определения
нейтрализующей активности антител к иммуноглобулину Е»;
- Заявка на изобретение № 2013156340 от 19.12.2013 г. «Способ лечения эпилепсии».
Получено регистрационное удостоверение на препарат Интерфераль®, аэрозоль для
местного применения 100 000 МЕ (Рег. удостоверение ЛП-001989 от 30.01.2013 г.).
По результатам научной деятельности в 2013 году институтом опубликовано 26
научных статей в ведущих отечественных и зарубежных журналах, 5 учебных пособий, 27
тезисов докладов на российских и международных конференциях, защищена 1 докторская и
2 кандидатские диссертации.
10
Международное сотрудничество
В 2013 г. ведущие специалисты института приняли участие в работе 2
международных мероприятий, таких как научно-методическая конференция «Грипп, острые
респираторные вирусные инфекции и их осложнение: диагностика, лечение и профилактика»
(Республика Казахстан, г.Астана) и Международная выставка-ярмарка FIHAV-2013
(Республика Куба, г.Гавана). Двое молодых специалистов института с целью повышения
квалификации приняли участие в работе международной конференции PEGS Europe (5th
Annual Protein & Antibody Engineering Summit, Португалия, г.Лиссабон) и обучающего
семинара по клеточным технологиям «Animal cell technology course», организованного
Европейским обществом по технологиям клеток животных (Испания, г. Льяфранк).
Основные
задачи
и
направления
перспективной
научно-практической
деятельности
Перспективный план включает продолжение исследований по государственным
контрактам с ФМБА России, Минпромторгом России и Минобрнауки России, Федеральным
космическим агентством и ОАО «РКК «Энергия», финансируемым из средств федерального
бюджета в рамках Государственного отраслевого заказа ФМБА России, ФЦП «Национальная
система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014
годы)»,
«Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской
Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» и Федеральной космической
программы России на 2006-2015 годы.
11