М Е Т О Д И Ч Е С К... К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ ПО БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ
ОДЕССКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМ. И.И. МЕЧНИКОВА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ
ПО БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ, БЕЛКОВ,
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
для студентов биологического факультета
Одесса 2008
Печатается по решению
Ученого Совета
биологического факультета
ОНУ им. И.И. Мечникова
протокол № 10 от __4 июля_2008 г.
Практикум позволяет студентам овладеть методами качественного и
количественного анализа, которые могут быть использованы для выполнения курсовых и
дипломных работ, а также для работы по избранной специальности.
В учебное пособие введены контрольные вопросы и задания по программе
«Биоорганическая химия» для национальных университетов, что позволяет студентам
глубоко усвоить теоретический материал.
Пособие может быть использовано студентами других обучающих учреждений,
которые готовят специалистов по биологии, а также студентами медицинских вузов
Украины.
Методические указания составлены доц. Запорожченко А.В., проф. Петровым С.А.,
доц. Чернадчук С.С., доц. Захариевой З.Е., доц. Федорко Н.Л., доц. Вовчук И.Л., доц.
Сорокин А.В., доц. Будняк А.К. на основании учебного плана специальности, обобщая
учебную и научную литературу.
Утверждено на заседании кафедры биохимии
(протокол № 12 от _3 июня_2008 г.)
Зав. кафедрой
Доц. Запорожченко А.В.
Ученый секретарь
Доц. Федорко Н.Л.
Рецензенты:
доктор биологических наук, профессор Карпов Л.М.
доктор медицинских наук, профессор Леус Н.Ф.
доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Пахомова В.А.
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ
5
6
ТЕМА. 1. ОБЩИЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ
6
Лабораторная работа № 1
ОБНАРУЖЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АМИНОКИСЛОТ
6
Лабораторная работа № 2
РЕАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ С АЗОТИСТОЙ КИСЛОТОЙ
9
Лабораторная работа № 3
РЕАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ С НИНГИДРИДОМ
10
Лабораторная работа № 4
ИССЛЕДОВАНИЕ рН ВОДНЫХ РАСТВОРОВ АМИНОКИСЛОТ
11
Лабораторная работа № 5
АМФОТЕРНОСТЬ РАСТВОРОВ АМИНОКИСЛОТ
12
Лабораторная работа № 6
РЕАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ
13
Лабораторная работа № 7
ОБРАЗОВАНИЕ ХЕЛАТОВ АМИНОКИСЛОТ
14
Лабораторная работа № 8
ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ АМИНОКИСЛОТ
15
ТЕМА. 2. СВОЙСТВА ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТ
16
Лабораторная работа № 9
КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
16
Лабораторная работа № 10
РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА
17
Лабораторная работа № 11
РЕАКЦИЯ ФОЛИНА НА ТИРОЗИН И ЦИСТЕИН
18
Лабораторная работа № 12
ДИАЗОРЕАКЦИЯ (РЕАКЦИЯ ПАУЛИ)
19
Лабораторная работа № 13
РЕАКЦИЯ ШУЛЬЦА-РАСПАЙЛЯ
20
Лабораторная работа № 14
РЕАКЦИЯ АДАМКЕВИЧА
21
Лабораторная работа № 15
РЕАКЦИЯ НА АРГИНИН (САКАГУЧИ)
21
Лабораторная работа № 16
РЕАКЦИ НА АМИНОКИСЛОТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ СЕРУ
22
Лабораторная работа № 17
РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ 24
ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
31
Лабораторная работа № 18
ОБНАРУЖЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ)
32
Лабораторная работа № 19
НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
32
Лабораторная работа № 20
РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ
33
Лабораторная работа № 21
ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ
33
Лабораторная работа № 22
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛКА
36
Лабораторная работа № 23
ДИАЛИЗ БЕЛКОВ
37
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
40
ТЕМА 1. СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
40
Лабораторная работа № 24
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ
ГИДРОЛИЗА НУКЛЕОПРОТЕИДОВ
КИСЛОТ
ПУТЕМ 42
ТЕМА 2. ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
44
Лабораторная работа № 25
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
СОДЕРЖАНИЯ
КАМЗОЛОВОЙ И КНОРРЕ
НУКЛЕИНОВЫХ
НУКЛЕОТИДОВ
ПО
ВАСИЛЕНКО, 46
Лабораторная работа № 26
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИПЕРХРОМНОГО И ГИПОХРОМНОГО ЭФФЕКТА
НУКЛЕИНОВІХ КИСЛОТ РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
47
ЛИТЕРАТУРА
49
4
ВВЕДЕНИЕ
Биоорганическая химия изучает строение и биологические функции важнейших
компонентов живой материи, в первую очередь биополимеров и низкомолекулярных
биорегуляторов, уделяя главное внимание выяснению закономерностей взаимосвязи между
структурой и биологическим действием.
Биоорганическая химия – это фундаментальная наука на стыке химии и биологии,
она способствует раскрытию принципов функционирования живых систем. Но она имеет и
выраженную практическую направленность, являясь теоретической основой получения
новых ценных соединений для медицины, сельского хозяйства, ряда отраслей
промышленности.
Объекты изучения: аминокислоты, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты,
углеводы, липиды, биополимеры смешанного типа – гликопротеины, липопротеины,
гликолипиды и т.п.; витамины, токсины, пестициды и др.
Методы исследования: основной арсенал составляют методы органической химии,
однако для решения структурно-функциональных задач привлекаются разнообразные
физические, физико-химические, математические и биологические методы.
Основные задачи: выделение в индивидуальном состоянии изучаемых соединений с
помощью кристаллизации, перегонки, хроматографии, электрофореза, ультрафильтрации,
ультрацентрифугирования и т.п.; установление структуры, включая пространственное
строение, на основе подходов органической и физико-органической химии с применением
различных видов оптической спектроскопии, рентгеноструктурного анализа, ядерного
магнитного резонанса, дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма, методов
быстрой кинетики и т.п.; химический синтез и химическая модификация изучаемых
соединений, включая полный синтез аналогов и производных, - с целью подтверждения
структуры, выяснения связи строения и биологической функции, получения практически
ценных препаратов; биологическое тестирование полученных соединений in vitro и in vivо.
Настоящее учебное руководство по биоорганической химии включает классические
биохимические методы и новые методики. В процессе проведения лабораторных работ
студенты должны усвоить большой объем фактического материала и выполнить
практические части лабораторных работ из основных разделов курса биоорганической
химии.
Цель настоящего пособия – помочь студентам при изучении курса «Биоорганическая
химия» получить знания: о строении и свойствах важнейших компонентов живой материи, о
их биологических функциях;
умения: работать с химической посудой, реактивами, весоизмерительной техникой,
готовить растворы, работать с приборами, вести протоколы эксперимента;
навыки: самостоятельно работать с биологическим материалом, планировать и
проводить эксперимент, анализировать полученные данные, делать логичные выводы.
Каждое задание, формулы, расчеты и выводы к нему оформляются в виде протокола
в специальной тетради. Задание считается выполненным только после проверки и подписи
преподавателя.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ
ТЕМА 1. ОБЩИЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ (8 часов)
Аминокислота - органическая кислота, содержащая одновременно две
функциональные группы: кислую карбоксильную (-СООН) и основную аминогруппу (NH2).
Потому и такое название - «аминокислота».
В пределе рН растворов от 4,0 до 9,0 все аминокислоты существуют в форме
цвитерионов (zwitter-ion= диполярный ион) – с протонированной аминогруппой (NH3+) и
диссоциированной карбоксильной группой - (- СОО -). Такая себе двусторонняя (кислоосновная) молекула или амфолит - молекула, обладающая свойством «двусторонности» амфотерности (греч. amphoteros- двусторонний).
CH 3  CH  COO 
|
NH 3
Аминокислоты отличаются друг от друга химической природой радикала R,
представляющего группу атомов в молекуле аминокислоты, связанную с α-углеродным
атомом и не участвующую в образовании пептидной связи при синтезе белка.
R  CH 2  СН  COOH
|
NH 2
Аминокислоты классифицируются в зависимости от природы радикалов, хотя были
предложены и другие основы. В частности, различают ароматические и алифатические
аминокислоты, а также асминокислоты, содержащие серу или гидроксильные группы. Часто
классификация основана на природе заряда аминокислоты.
Рациональная классификация, основанная на полярности радикалов, выделяет 4
класса аминокислот:
1.
неполярные, или гидрофобные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, триптофан,
пролин, фенилаланин, метионин);
2.
полярные (гидрофильные незаряженные) (глицин, серин, треонин, цистеин,
тирозин, аспарагин, глутамин);
3.
отрицательно заряженные (аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота);
4.
положительно заряженные при физиологических значениях рн (при рн 6,0 -7,0)
(лизин, аргинин, гистидин).
Лабораторная работа № 1
ОБНАРУЖЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АМИНОКИСЛОТ
Все природные аминокислоты, за исключением гликола, оптически активны.
Изучение оптических свойств аминокислот возможно с помощью поляриметра или
поляризационного микроскопа.
Поляриметр. Работу начинают с ознакомления с поляриметром – прибором для
определения угла вращения поляризованного света (рис. 1).
6
Исследуемая жидкость наливается в трубку (кювету), плотно завинчивающуюся с
обоих концов прозрачными крышками. Трубка с жидкостью помещается в поляриметр
между двумя поляризующими свет призмами. Луч света от натриевой лампы проходит через
первую призму (поляризатор 1) и, поляризовавшись в ней, проходит через кювету 2, которая
вставляется в гнездо 5. Если исследуемая жидкость оптически активна, то плоскость
поляризации света, прошедшего через трубку, будет отличаться от плоскости поляризации
светового потока, вошедшего в трубку. Изменение вращения плоскости поляризации тем
больше, чем выше концентрация поляризующего вещества, поэтому, зная изменение угла
вращения света, прошедшего через трубку определённой длины, легко вычислить
содержание оптически активного вещества, например сахара, или решить обратную задачу –
найти удельное вращение вещества, зная его концентрацию в растворе. Для определения
угла поляризации светового потока, вышедшего из трубки, на его пути поставлена
вращающаяся призма-анализатор 3, со шкалой, позволяющей определить угол её поворота.
Призмы прибора сделаны так, что световой поток, вышедший из призмы-анализатора, виден
в окуляре 3 в форме круга, разделённого на две половины.
Если плоскости поляризации
призмы-поляризатора и анализатора
совпадают, то обе половины поля
зрения
имеют
одинаковую
интенсивность
освещённости.
Это
имеет место в случае, когда трубка
заполнена
водой,
а
анализатор
установлен на 0º. Если в трубку
поместить
оптически
активный
раствор, одна из половин поля зрения
потемнеет,
и
для
достижения
одинаковой освещённости
обоих
половин анализатор нужно повернуть
на некоторый угол. Зная этот угол,
можно вычислить содержание
оптически
активного
вещества
или его удельное вращение.
Рис.1. Поляриметр
Помимо поляриметров описанного типа выпускаются портативные поляриметры
(рис. 4). Прибор такого типа используется в предлагаемой работе. Луч света, отразившись от
зеркала 1, попадает на поляризующую призму 2, которая пропускает только поляризованные
в одной плоскости лучи света. Пучок поляризованного света проходит затем через
помещённую в гнездо 8 кювету (трубку) 3, куда налит исследуемый раствор. Если этот
раствор оптически активен, то плоскость поляризации света при прохождении его через
кювету измениться.. Для того чтобы определить угол вращения света , прошедшего через
кювету, на его пути поставлена вращающаяся поляризационная призма (анализатор) 4, угол
поворота которой отсчитывается по шкале через окуляр 5.
В описываемой модели прибора анализирующая призма устроена так, что в окуляре
6 видно поле, разделённое на три части (рис. 4 в). В зависимости от угла поворота
анализирующей призмы яркость полей изменяется: более ярким делается то центральное
поле, то боковые поля. Вращая призму за кольцо 7, добиваются одинаковой освещённости
всех трёх полей зрения и после этого делают отсчёт по шкале через окуляр 5. Шкала прибора
(рис. 4 г) разделена на градусы (от -20º до +20º. Отрицательными считаются значения,
лежащие влево от нуля. Отсчёт выполняется с помощью нониуса.
Окуляры поляриметра снабжены вращающимися в оправах линзами, это позволяет
добиться чёткого изображения полей и шкалы.
7
Работа с нониусом. Прежде чем приступить к исследованию мутаротации,
необходимо вспомнить правила работы с нониусом.
Количество градусов отсчитывается по шкале (рис. 4 г). Если нуль нониуса
расположен между двумя делениями верхней шкалы, например 1º и 2º, записывают то из
этих значений, которое ближе к нулю, в данном случае 1º. Количество десятых долей градуса
определяют, помня, что их указывает то деление нониуса, которое совпадает с делением
основной шкалы. Так, Если с делением основной шкалы совпало седьмое деление нониуса,
записывают шесть десятых долей градуса. В нашем примере отсчёт составил 1,7º. Работая с
поляриметром, следует помнить, что правая половина нониуса используется только при
углах вращения больше 0º, т. е. когда нуль нониуса стоит правее нуля верхней шкалы, нужно
пользоваться левой половиной шкалы нониуса.
При отсчётах, близких к 20º, необходимая для отсчёта шкала нониуса выходит за
пределы верхней шкалы. В этом случае отсчёт делают по другой половине нониуса и
найденное количество десятых вычитают из 1º. Полученная при этом разность является
искомым количеством десятых долей. Например, нуль нониуса остановился между + 19º и
+20º. Отсчёт по правой половине нониуса сделать невозможно, так как она вышла за пределы
верхней шкалы. Делают отсчёт по левой половине шкалы нониуса. Пусть, например, с
делением верхней шкалы совпадает второе деление (считая от нуля) левой половины
нониуса (т. е. 0,2º). Количество десятых составляет 1º-0,2º = 0,8º. Ответ 19,8º.
Подготавка поляриметр к работе. Для этого направляют зеркало 1 (см. рис. 4 а) на
источник света (окно или осветитель), и, меняя его наклон, добиваются наилучшего
освещения полей зрения, наблюдаемых через окуляр 6. На этом этапе работы следует
обратить внимание на то, чтобы кювета 3 была сухая, так как остатки раствора в ней мешают
регулировке освещения. Регулировку освещения можно провести также при вынутой кювете.
Добившись оптимального освещения, переходят к фокусировке окуляров 5 и 6. Для этого
вращают подвижные оправы этих окуляров до получения наиболее чёткого изображения.
При работе с поляриметром не следует забывать, что наилучшие условия видимости
создаются, когда глаз расположен к окуляру 6. При попытке смотреть в этот окуляр издали
поле зрения в нём кажется очень слабо освещённым.
После того как поляриметр подготовлен к работе, необходимо определить нулевую
точку, т. е. тот отсчёт, который получается при заполнении кюветы чистым растворителем (
в данной работе водой). Для этого одну из крышек кюветы (рис.4 б) отвинчивают, вынимают
из неё стекло и заполняют кювету водой так, чтобы избыток воды стоял над краями в виде
мениска. Мениск накрывают стеклом, вынутым из крышки, и убеждаются в том, что в
кювету не попали пузырьки воздуха. Если в кювету попал воздух, стекло снимают,
добавляют воду и вновь накрывают мениск стеклом. Завинчивают кювету крышкой и
8
помещают её в поляриметр. Вращая призму-анализатор за кольцо 7 (см. рис. 4 а) влево и
вправо, добиваются одинаковой освещённости всех трёх частей поля зрения. Делают отсчёт
по шкале в окуляре 5. Поворачивают кольцо 7 и вновь добиваются одинакового освещения
всех трёх полей. Снова делают отсчёт. Аналогичным образом повторяют отсчёт ещё один раз
и берут среднюю величину из трёх отсчётов. Вынимают кювету, отвинчивают крышку и
выливают воду.
Полученные данные занести в таблицу:
№
Угол вращения света
Показатели
Среднее значение
Название аминокислот
1
2
3
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 2
РЕАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ С АЗОТИСТОЙ КИСЛОТОЙ
Принцип метода.  -аминогруппы в аминокислотах реагируют с азотистой
кислотой с выделением азота.
Химизм реакции:
CH 3  CH  COOH  O  N  OH  CH 3  CH  COOH  H 2 O  N 2 
|
|
OH
NH 2
А
 -Оксипропионовая
Аланин
зотистая
кислота
ки
слота
Так как азотистая кислота в свободном состоянии не устойчива, то вместо неё берут
смесь нитрита натрия и какой-либо сильной кислоты. Азотистая кислота вытесняется из соли
этой кислотой и реагирует с аминокислотой.
Реактивы: Гликокол, 5%-ный раствор
Нитрит натрия, 5%-ный раствор
Азотная кислота конц.
Ход работы
Берут 2 микрохимические пробирки. В первую из них вносят 6 капель 5%-ного
раствора гликокола и 1 каплю азотной кислоты. Вторая пробирка является контрольной – в
нее вносят 6 капель воды и 1 каплю азотной кислоты. В каждую пробирку добавляют по 3
капли раствора нитрита натрия и встряхивают. В первой пробирке, где имелась
аминокислота, отмечается интенсивное выделение пузырьков газообразного азота. В
9
контрольной же пробирке образование азота не происходит, там появляются лишь
одиночные пузырьки окислов азота, возникающих при разрушении азотистой кислоты.
Полученные данные занести в таблицу:
№
Количество добавленного вещества в каплях
Выделение
пробирк
N2
Гликокол
Н2О
HNO3
NaNO2
и
1
6
1
3
N2↑
2
6
1
3
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 3
РЕАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ С НИНГИДРИДОМ
Принцип метода. Все  -аминокислоты, взаимодействуя с нингидридом образуют
продукты, окрашенные в синий или фиолетовый цвет. Эту реакцию дают также и белки.
Взаимодействие аминокислот с нингидридом может быть рассмотрено на примере
гликокола.
Химизм реакции:
Как видно из уравнения реакции, в образовании цветного продукта принимает
участие азот аммиака, образующегося из  -аминогруппы. Таким образом, нингидридовая
реакция выявляет свободные  -аминогруппы. Чем больше свободных  -аминогрупп
содержит белок, тем интенсивнее окраска, образующаяся при взаимодействии его с
нингидридом.
Реактивы: Нингидрин, 0,2%-ный спиртовой раствор
Гликокол, 0,1%-ный раствор
Белок яичный, 10%-ный раствор
Ход работы
Смешивают в микрохимической пробирке по 2 капли растворов нингидрида и
гликокола. Нагревают пробирку и отмечают появление синего окрашивания.
Повторяют опыт, взяв вместо гликокола раствор белка. В этом опыте окраска
появляется медленно, она менее интенсивна, так как белок имеет меньше свободных
аминогрупп на единицу веса, чем аминокислоты.
10
Окраска, возникающая при взаимодействии аминокислот с нингидридом, варьирует
в зависимости от строения взятой в опыт аминокислоты, от рН раствора и ряда других
условий опыта.
Полученные данные занести в таблицу:
Количество добавленного вещества в каплях
№
пробирки
Гликокол
Белок
Н2О
Нингидрин
1
2
2
2
2
2
3
2
2
Окраска
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 4
ИССЛЕДОВАНИЕ рН ВОДНЫХ РАСТВОРОВ АМИНОКИСЛОТ
Принцип метода. Реакция водных растворов аминокислот зависит от количества
свободных амино- и карбоксильных групп, имеющихся в молекуле исследуемой
аминокислоты.
В водных растворах моноаминомонокарбоновых аминокислот карбоксильная и
аминогруппы взаимно нейтрализуются, образуя внутреннюю соль:
CH 3  CH  COO 
|
NH 3
аминокислот обнаруживают
Водные растворы таких
реакцию, близкую к
нейтральной.
Моноаминодикарбоновые аминокислоты образуют кислые растворы, так как на
образование внутренних солей расходуется только одна из двух карбоксильных групп, а
другая диссоциирует с образованием Н+ ионов.
Диаминомонокарбоновые аминокислоты в водных растворах дают щелочную
реакцию, так как в их молекуле при образовании внутренней соли одна аминогруппа
остается свободной. рН Водных растворов аминокислот можно определить
колориметрическим методом.
Оборудование и реактивы:
Шкала для определения рН (из набора Михаэлиса)
Универсальный индикатор
Гликокол, 0,1%-ный раствор
Аспарагиновая кислота, 0,1%-ный раствор
Лизин, 0,1%-ный раствор
Ход работы
В 3 микрохимические пробирки вносят по 3 капли растворов аминокислот: в первую
пробирку - гликокола, во вторую - лизина, в третью — аспарагиновой кислоты. Добавляют в
каждую, пробирку по 5 капель универсального индикатора. После смешивания сопоставляют
окраску в каждой пробирке со шкалой.
11
Найденные по шкале значения рН занести в таблицу:
Группы аминокислот
Моноаминомонокарбоновые
Моноаминодикарбоновые
Диаминомонокарбоновые
Представители
Окраска
рН
Гликокол
Аспарагиновая
Лизин
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 5
АМФОТЕРНОСТЬ РАСТВОРОВ АМИНОКИСЛОТ
Аминокислоты являются амфотерными соединениями. В зависимости от реакции
среды они ведут себя либо как кислоты, либо как основания. В присутствии кислоты
аминокислота образует с ней соль за счёт аминогруппы.
Химизм реакции:
CH 2  COOH  HCl  CH 2  COOH + Cl|
|
NH 3
NH 2
Диссоциация карбоксильных групп аминокислоты в присутствии сильных кислот
подавлена.
При добавлении щёлочи к раствору аминокислоты образуется соль за счёт
карбоксильных групп аминокислоты.
Химизм реакции:
CH 2  COOH  NaOH  CH 2  COOH  Na 
|
|
NH 2
NH 2
 H 2O
Указанные реакции объясняют значительную буферную ёмкость растворов
аминокислот. При титровании раствора аминокислоты щёлочью или кислотой рН сдвигается
значительно меньше, чем при добавлении щёлочи или кислоты к воде. Убедиться в этом
можно, выполнив следующий опыт.
Реактивы: Гликокол, 5%-ный раствор
Едкий натр. 0,4%-ный раствор
Соляная кислота, 0,4%-ный раствор
Фенолфталеин. 0,5%-ный спиртовой раствор
Метилоранж, 0,1%-ный раствор
Ход работы
Для проведения опыта берут 4 микрохимические пробирки. В пробирку 1 вносят 5
капель 5%-ного раствора гликокола, в пробирку 2— 5 капель воды. Добавляют в обе
пробирки по капле раствора фенолфталеина. В пробирку 2 добавляют 1 каплю
раствора едкого натра — появляется фиолетовое окрашивание. Добавляют по каплям 0,4%ный раствор едкого натра в пробирку 1, добиваясь совпадения окраски в обеих пробирках.
12
Количество добавленных капель подсчитывают. Чтобы объем жидкости в обеих пробирках
все время был одинаков, в процессе титрования щелочью содержимого первой пробирки во
вторую добавляют по каплям воду — столько же сколько щелочи в пробирку 1.
Количество капель раствора едкого натра,
пошедшее на титрование гликокола,
записывают в таблицу. В пробирку 3 вносят 5 капель раствора гликокола, в пробирку 4 —
столько же воды. В каждую пробирку добавляют по капле метилоранжа.
В пробирку 4 вносят 1 каплю соляной кислоты — содержимое пробирки окрашивается в розовый цвет. Гликокол, находящийся в пробирке 3, оттитровывают 0,4%-ной
кислотой, считая капли, до такой же окраски. Чтобы объем жидкости в обеих пробирках был
одинаков, в процессе титрования добавляют в пробирку 4 воду по каплям — столько же,
сколько кислоты в пробирку 3.
Результат опыта занести в таблицу:
Используемые реактивы (капли)
Варианты
ФенолАминоМетилопыта
Н2О фталеи NaOH
HCl
кислота
оранж
н
1
5
1
х
2
5
1
1
3
5
1
х
4
5
1
1
Построить калибровочную кривую:
Варианты
Н2О
рН
Индикатор
опыта
1 капля
NaOH
2 капли
3 капли
1 капля
HCl
2 капли
3 капли
Общий
объем
пробы
Общий объем
пробы (капли)
Окраска
раствора
фиолетовая
розовая
Окраска
Рассчитать ИЭТ по формуле: ИЭТ= ∑ рН+ рН / 2
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 6
РЕАКЦИЯ АМИНОКИСЛОТ С ФОРМАЛЬДЕГИДОМ
Принцип метода. Аминокислоты реагируют с формальдегидом, образуя
метиленовые производные. При этом взаимодействует аминогруппа аминокислоты и
карбонильная группа формальдегида.
Химизм реакции:
H
CH 3  CH  COOH
CH 3  CH  COOH
H
|
|

 H 2O
O  C
H
NH 2
N C
H
Аланин
Формальдегид
Метиленовое производное аланина
13
В результате этой реакции аминогруппа оказывается связанной и теряет свои
основные свойства.
Карбоксильная группа остается свободной, поэтому метиленовые
производные аминокислот имеют, кислый характер. Освободившиеся в результате реакции
карбоксильные группы можно оттитровать щелочью. Количество щелочи, пошедшее на
титрование, эквивалентно количеству, аминогрупп, связанных формальдегидом. Описанный
способ определения
количества аминогрупп был разработан Зеренсеном и получил
название метода формолтитрования.
Реактивы: Гликокол, 5%-ный раствор
Фенолфталеин, 0,5%-ный спиртовой раствор
Едкий натр. 0,4%-ный раствор
Формоловая смесь
Ход работы
В микрохимические пробирки вносят по 5 капель раствора исследуемых
аминокислот, добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и по каплям едкий натр до
слаборозовой окраски (обычно достаточно одной капли). Добавляют 5 капель формоловой
смеси и встряхивают. Формальдегид связывает аминогруппы и реакция раствора сдвигается
в кислую сторону - фенолфталеин обесцвечивается. Добавляют в пробирку по каплям
раствор едкого натра до появления розовой окраски. Отмечают, сколько капель 0,4%-ного
едкого натра требуется для связывания карбоксильных групп в 5 каплях раствора
аминокислот.
Результат опыта занести в таблицу:
Используемые реактивы (капли)
Варианты Амино- ФенолОкраска Формоловая
NaOH
NaOH
опыта
кислота фталеин
раствора
смесь
1
5
1
х
5
х
2
5
1
х
5
х
Слаборозовая
3
5
1
х
5
х
4
5
1
х
5
х
Окраска
раствора
розовая
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 7
ОБРАЗОВАНИЕ ХЕЛАТОВ АМИНОКИСЛОТ
Принцип метода. При взаимодействии с ионами меди, кобальта и ряда других
металлов аминокислоты образуют особые комплексные соединения, называемые хелатами.
Термин «хелаты» -произошёл от греческого слова «хела», что значит «клешня». От этого, же
слова произведены английский термин «хелатор» - «клешневатель». Хелаторами называют
такие органические соединения, которые способны вступать во взаимодействие с ионами
некоторых металлов и одновременно с (помощью, двух различных
химических
функциональных групп) захватывать металл с двух сторон как бы в клешни. При этом между
«клешневателем» и металлом возникают две связи (ковалентная и координационная) и в
силу этого образуется гетероциклическое кольцо. Описанный выше процесс называют
хелатообразованием, а образующийся в результате продукт — хелатом. Примером может
служить медный хелат гликокола. Приведенная ниже формула этого соединения показывает,
что ион металла действительно как бы захвачен в клешни молекулами аминокислоты:
14
O  C O
OC  O
|
Cu
|
H 2C  NH 2
H 2 N  CH 2
Медный хелат гликокола
Согласно принятой классификации хелаты относят к внутрикомплексным
соединениям. Аминокислоты, вошедшие в состав хелатных комплексов, резко меняют свои
свойства, в частности они не дают реакцию с нингидрином. Хелаты, в состав которых входят
медь, кобальт и некоторые другие цветные металлы, являются окрашенными соединениями.
Реактивы: Гликокол, 0,1%-ный раствор
Гликокол, 5%-ный раствор
Медь сернокислая, 5%-ный раствор
Нингидрин, 0,2%-ный раствор в спирте
Ход работы
1.
К 3 каплям раствора сернокислой меди добавляют в пробирку столько же
капель 5%-ного раствора гликокола. Появляется синяя окраска вызванная образованием
хелата. Сравнивают ее с окраской сернокислой меди, для чего вносят в другую пробирку 3
капли раствора сернокислой меди и столько же капель воды.
2.
В пробирку вводят 2 капли 0,1%-иого раствора гликокола и добавляют 2 капли
раствора сернокислой меди. Встряхивают и, добавив 2 капли раствора нингидрина,
нагревают. Темно-синее окрашивание, даваемое гликоколом с нингидрином, не появляется.
Делают контрольный опыт — к 2 каплям 0,1%-ного раствора гликокола добавляют 2 капли
раствора нингидрина и нагревают. Возникает интенсивная синяя окраска.
Результат опыта занести в таблицу:
Используемые реактивы (капли)
АминоВарианты
кислота
Н2О
CuSO4
Нингидрин
опыта
0,1%
0,5%
1
3
3
2
3
3
3
2
2
2
4
2
2
t°С
Окраска
раствора
+
+
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 8
ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ АМИНОКИСЛОТ
Аминокислоты,
нанесённые
на
поверхность
фильтровальной
бумаги,
флюоресцируют при освещении ультрафиолетовым светом. Это явление используется при
анализе биологического материала.
Оборудование и реактивы: Люминесцентный осветитель
Бумага фильтровальная
Гликокол, 0,1%-ный или 5%-ный раствор
15
Ход работы
На лист бумаги наносят 1 каплю раствора аминокислоты. После высушивания
рассматривают бумагу, поместив её перед осветителем в затемнённом помещении. В месте
нанесения раствора аминокислоты видна коричневая флюоресценция.
ТЕМА 2. СВОЙСТВА ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТ (16 часов)
Многие аминокислоты как свободные, так и входящие в состав белков дают
специфические цветные реакции, с помощью которых их можно обнаружить. Некоторые из
этих реакций используются для количественного определения отдельных аминокислот и
белка.
Лабораторная работа № 9
КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
Принцип метода. Реакция основана на способности ароматических соединений
легко нитроваться, с образованием окрашенных нитропроизводных. В эту реакцию
вступают аминокислоты, имеющие в своей молекуле ароматическое кольцо. Тирозин и
триптофан при нагревании с концентрированной азотной кислотой образуют
нитропроизводные, окрашенные в желтый цвет. Эта реакция характерна также и для
белков, содержащих тирозин и триптофан. Аминокислота фенилаланин нитруется с трудом,
на этом основании ее участие в ксантопротеиновой реакции подвергается сомнению.
Ксантопротеиновая реакция не является строго специфичной. Поскольку она
обусловлена нитрованием ароматического кольца, то ее дает многие циклические
соединения, не являющиеся аминокислотами, например фенол.
Химизм реакции:
16
Реактивы: Азотная кислота конц.
Аммиак конц.
Фенол, 2%-ный раствор
Тирозин, 0,05%-ный раствор
Белок яичный, 10%-ный раствор
Ход работы
Берут 3 микрохимические пробирки. В первую вносят 2 капли раствора фенола, во
вторую – 2 капли раствора тирозина или триптофана, а в третью – столько же капель
раствора белка. В каждую пробирку добавляют по капле азотной кислоты. Нагревают
пробирки и отмечают появление желтого окрашивания. После охлаждения добавляют по 23 капли едкого натра или аммиака в каждую пробирку, при этом желтая окраска сменяется
на оранжевую.
Схема опыта:
№
Вариант
проопыта
бирки
1
Фенол
Тирозин
2
(триптофан)
3
Белок
HNO3
Используемые реактивы
NaOH или
t °С
Окраска
(NH4OH)
Окраска
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 10
РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА
Принцип метода. Реакция обусловлена наличием
в тирозине свободного
фенольного
гидроксила. При добавлении к раствору тирозина реактива Миллона
(содержащего смесь азотнокислых солей окиси и закисание ртути) раствор окрашивается в
красный цвет. Реакцию дают и белки, содержащие тирозин. Реакция не является строго
специфичной, так как ее дают и некоторые другие фенолы. Однако в условиях изучения
аминокислотного состава гидролизатов белков реакция Миллона может рассматриваться
как специфичная для тирозина, ибо белки не содержат других веществ, которые содержали
бы фенольный гидроксил.
Химизм реакции:
17
Реактивы: Реактив Миллона
Тирозин, 0,05%-ный
Белок яичный, 10%-ный
Фенол,2%-ный
Ход работы
Берут 3 микрохимические пробирки. В первую вносят 2-3 капли раствора тирозина,
во вторую – столько же белка, в третью – фенола. Добавляют в каждую пробирку по капле
раствора Миллона и нагревают. В пробирках с тирозином и фенолом возникает кирпичнокрасное окрашивание, в пробирке с белком белый осадок, образовавшийся после добавления
реактива, краснеет при нагревании.
Схема опыта:
№
проВариант опыта
бирки
1
Тирозин
2
Белок
3
Фенол
Используемые реактивы
Реактив Миллона
t °С
Окраска
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 11
РЕАКЦИЯ ФОЛИНА НА ТИРОЗИН И ЦИСТЕИН
Принцип
метода.
Реактив
Фолина
содержит
соли
фосфорно-18–
вольфрамовомолибденовой кислоты. Это соединение легко восстанавливается в щелочной
среде фенолами с образованием синего окрашивания. Реакцию дает не только сам фенол, но
и другие соединения, содержащие фенольный гидроксил, в частности тирозин, фолликулин.
Реактив Фолина дает синее окрашивание также и с цистином, однако лишь после
того, как цистин будет восстановлен с помощью сульфита натрия и калия.
Реактивы : Реактив Фолина
Едкий натр, 10%-ный
Фенол, 2%-ный
Тирозин 0,05%-ный
Белок яичный
Ход работы
Подготовляют 3 микрохимические пробирки. В первую вносят 2 капли раствора
фенола, во вторую – столько же тирозина, в третью – белка. Добавляют в каждую пробирку
по 2 -3 капли раствора едкого натра и по капле реактива Фолина. Отмечают появление
синего окрашивания.
Способностью восстанавливать реактив Фолина в синее соединение обладает не
только свободный тирозин, но и белок. Можно было бы ожидать, что интенсивность
окраски, возникающей при взаимодействии реактива Фолина с белком, пропорциональна
содержанию в белке тирозина и цистеина. В действительности, оказалось, что если белок
обработать предварительно солями меди, то даваемая им с реактивом Фолина окраска
намного превышает ту, которую могли бы дать только название аминокислоты. Считают, что
в составе белковой молекулы, образующей медный комплекс, с реактивом Фолина
18
взаимодействуют также и другие аминокислоты, а поэтому интенсивность возникающего
окрашивания, в известной мере, пропорциональна содержанию белка. Лоури и сотрудники
использовали этот принцип для количественного определения белка.
Схема опыта:
№
про- Вариант опыта
бирки
1
Фенол
2
Тирозин
3
Белок
Сделать вывод:
Используемые реактивы
Реактив
NaOH
Фолина
Окраска
Лабораторная работа № 12
ДИАЗОРЕАКЦИЯ (РЕАКЦИЯ ПАУЛИ)
Принцип метода. При обработке диазореактивом в щелочной среде гистидин и
тирозин образуют окрашенное в оранжевый цвет соединение.
Химизм реакции:
Реактивы: Диазореактив
Углекислый натрий, 10%-ный раствор
Гистидин, 0,05%-ныйраствор
Тирозин, 0,05%-ный раствор
Белок яичный, 10%-ный раствор
Ход работы
В одну микрохимическую пробирку вносят 2 капли раствора гистидина, в другую –
столько же тирозина и третью – белка. В каждую пробирку добавляют по 1 капле раствора
углекислого натрия и по 5 -10 капель диазореактива. Отмечает появление желтого или
оранжевого окрашивания.
В обычных условиях реакция эта не является специфичной для гистидина, так как в
такую реакцию вступает тирозин, а также некоторые фенолы. Однако, создав специальные
условия, Коссель и Куче использовали диазореакцию для количественного определения
гистидина. Эти специальные условия заключались в следующем.
19
Подлежащий исследованию гидролизат обрабатывается фосфорновольфрамовой
кислотой, которая осаждает количественно аминокислоты: аргинин, гистидин, лизин
которые могут служить помехой при количественном определении гистидина с помощью
реакции диазотирования, остаются в растворе. Осадок тщательно промывается, гистидин и
сопровождающие его аминокислоты переводятся в раствор, в котором гистидин
определяется количественно с помощью колориметрического метода, основанного на
реакции Паули.
Схема опыта:
№
проВариант опыта
бирки
1
Гистидин
2
Тирозин
3
Белок
Используемые реактивы
NaСО3
Диазореактив
Окраска
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 13
РЕАКЦИЯ ШУЛЬЦА-РАСПАЙЛЯ
Принцип метода. Реакция обусловлена взаимодействием триптофана с
оксиметилфурфуролом, образующемся при действии концентрированной серной кислоты на
сахарозу, добавляемую к раствору белка.
Реактивы: Сахароза, 0, 01%-ный
Серная кислота, конц.
Белок яичный, 10%-ный раствор
Триптофан, 0,3%-ный раствор
Ход работы. В одну микрохимичкскую пробирку вносят 4 капли раствора
триптофана, в другую – 3 капли раствора белка. В каждую пробирку добавляют по капле
раствор сахарозы и встряхивают. Осторожно вводят в пробирку по стенке 10 капель
концентрированной серной кислоты. Верхний слой в пробирке с триптофаном окрашивается
в желтый цвет продуктами окислениями сахарозы, а на границе с опустившейся на дно
серной кислотой возникает вишнево-красное кольцо. В пробирке с белком на границе
раствора белка и серной кислоты также красное кольцо.
Проделывая реакцию Шульца-Распайля, следует избегать введения избытка
сахарозы, так как в этом случае возникает коричневая окраска, маскирующая реакцию на
триптофан.
Схема опыта:
№
проВариант опыта
бирки
1
Триптофан
2
Белок
3
Используемые реактивы
Сахароза
Сделать вывод:
20
H2SO4, конц.
Окраска
Лабораторная работа № 14
РЕАКЦИЯ АДАМКЕВИЧА
Принцип метода. При взаимодействии триптофана с глиоксилиевой кислотой
образуется соединение фиолетового цвета. В качестве источника глиоксилиевой кислоты
обычно используют ледяную кислоту, содержащую примесь глиоксилиевой.
Химизм реакции:
Реактивы: Ледяная уксусная кислота
Серная кислота конц.
Белок яичный, 10%-ный раствор
Триптофан, 0,3-ный раствор
Ход работы
Берут 2 микрохимические пробирки. В одну из них вводят 3 капли раствора
триптофана, в другую – 3 капли раствора белка. Добавляют в каждую пробирку по 3 капли
уксусной кислоты и нагревают, не доводя до кипения. Охлаждают и добавляют по стенке 10
капель концентрированной серной кислоты. Слой с исследуемой жидкостью появляется
фиолетовое кольцо.
Схема опыта:
№
пробирки
1
2
3
Используемые реактивы
Вариант опыта
СН3СООН
t °С
H2SO4, конц.
Окраска
Триптофан
Белок
Сделать вывод:
Лабораторная работа № 15
РЕАКЦИЯ НА АРГИНИН (САКАГУЧИ)
Принцип метода. Аргинин в щелочной среде взаимодействуя с гипобромитом и αнафталом, дает продукт, окрашенный в кирпично-красный или малиново-красный цвет.
Химизм реакции:
21
Реактивы: α – Нафтол, 0,1%-ный раствор
Щелочной раствор гипобромита натрия
Аргинин, 0,1%-ный раствор
Белок яичный, 10%-ный раствор
Ход работы
В одну микрохимическую пробирку вводят по 1 капле раствора аргинина, в другую
– белка. Добавляют в каждую пробирку по 1 капле растворов α -нафтола и гипобромита.
Свободный аргинин дает кирпично-красное окрашивание, аргинин в составе белка –
малиново-красное окрашивание.
Схема опыта:
№
про- Вариант опыта
бирки
1
Аргинин
2
Белок
Сделать вывод:
Используемые реактивы
Гипобромит
α – Нафтол
натрия
Окраска
Лабораторная работа № 16
РЕАКЦИ НА АМИНОКИСЛОТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ СЕРУ
Принцип метода. Содержащие серу аминокислоты, особенно цистин и цистеин, при
кипячении со щелочью* теряют серу в виде сероводорода. Сероводород взаимодействует со
щелочью, образует сульфиды, которые можно обнаружить с помощью следующих реакций:
при добавлении ацетата сульфиды образуют коричневый или даже черный осадок сульфида
свинца; при добавлении раствора нитропруссида сульфид дает красно-коричневое
окрашивание.
*Одной из ошибок, ведущих к нечетким результатом в описанных работах, является недостаточно
продолжительное нагревание исследуемого раствора со щелочью.
Реактивы: Едкий натр, 30%-ный раствор
Уксуснокислый свинец, 5%-ный раствор
Нитропруссид натрия, 10%-ный раствор
Цистин, 0,1%-ный раствор
Белок яичный, 10%-ный раствор
22
Реакция с уксуснокислым свинцом (реакция Фоля).
Ход работы
В одну микрохимическую пробирку вносят 3 капли 0,4%-ного цистеина, в другую –
столько же белка. Добавляют в каждую пробирку по 3 капли 30%-ного едкого натра и
осторожно нагревают в течение 2 мин. После охлаждения добавляют каплю ацетата свинца.
Жидкость окрашивается в темно-коричневый цвет.
1. СH2SH
CH2OH
│
│
CHNH2 + 2 NaOH  CHNH2 + Na2S + H2O
│
│
COOH
COOH
цистеин
серин
2. (СН3СОО)2Рb + 2 NaOH  Рb(ONa)2 + СН3СООН
ацетат свинца
плюмбит
натрия
3.
Na2S + Pb(ONa)2 + 2H2O  PbS + 4NaOH
сернистый свинец
Схема опыта:
№
про- Вариант опыта
бирки
1
Цистин
2
Белок
3
Используемые реактивы
NaOH
t °С
(СН3СОО)2Рb
Окраска
Сделать вывод:
Реакция с нитропрусидом натрия.
Ход работы
Берут 2 микрохимические пробирки. В одну из них вносят 3 капли раствора белка,
в другую 3 капли 0,1%-ного раствора цистина. В обе пробирки добавляют по 3 капли 30%ного раствора едкого натра и осторожно нагревают в течение 2 мин. После охлаждения
добавляют в каждую из пробирок по 1 капле раствора нитропруссида натрия. В пробирках
возникает красно-коричневое окрашивание.
Схема опыта:
№
про- Вариант опыта
бирки
1
Цистин
2
Белок
3
Используемые реактивы
NaOH
t °С
Нитропруссид
Сделать вывод:
23
Окраска
ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ:
Назовите α-аминокислоты, входящие в состав природных белков.
Какие характеристики АК можно использовать при их классификации?
Какие альфа-аминокислоты относятся к алифатическим?
Какие АК относятся к гетероциклическим?
Что собой представляют: - моноаминодокарбоновые АК
- диаминомонокарбованы АК
6.
Перечислите АК, содержащее – SH и – ОН 7.
На какие классы делят АК в зависимости от полярности радикала?
8.
К какому классу относятся АК с :
а. положительно заряженными радикалами,
б. отрицательно заряженными радикалами. Перечислите.
9. Какие аминокислоты имеют незаряженный R? (перечислите)
10. Укажите специфическую реакцию на циклические АК.
11. Для фенилаланина ксантопротеиновая реакция является специфичной?
12. С помощью уксуснокислого свинца в щелочной среде какие аминокислоты
можно обнаружить?
13. Какие качественные реакции Вы знаете на обнаружение триптофана?
14. Какая АК дает красное окрашивание в кислой среде с альдегидом?
15. С какой аминокислотой оксиметилфурфурол дает красно-вишневое
окрашивание?
1.
2.
3.
4.
5.
Лабораторная работа № 17
РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ
В настоящее время для разделения и количественного определения аминокислот
широко используется метод хроматографии – динамического разделения смеси веществ.
Обычно хроматография основана на распределении исследуемого вещества между
двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент). Неподвижная фаза главным образом
представляет собой сорбент с развитой поверхностью, а подвижная - поток газа (пара,
флюида - вещество в сверхкритическом состоянии) или жидкости. Поток подвижной фазы
фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента.
В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую,
флюидную (или сверхкритическую хроматографию с флюидом в качестве элюента) и
жидкостную хроматографию. В качестве неподвижной фазы используют твердые (или
твердообразные) тела и жидкости. В соответствии с агрегатным состоянием подвижной и
неподвижной фаз различают следующие виды хроматографии: 1) газо-твердофазную
хроматографию,
или
газоадсорбционную
хроматографию;
2)
газо-жидкостную
хроматографию (газо-жидко-твердофазную); 3) жидко-твердофазную хроматографию; 4)
жидко-жидкофазную хроматографию; 5) флюидно-твердофазную хроматографию; 6)
флюидно-жидко-твердофазную хроматографию.
По геометрии сорбционного слоя неподвижной фазы различают колоночную и
плоскослойную хроматографию. К плоскослойной относятся тонкослойная хроматография и
бумажная хроматография. В колоночной хроматографии обычно выделяют капиллярную
хроматографию, в которой сорбент расположен на внутренних стенках колонки, а центр,
24
часть колонки остается незаполненной сорбентом, т.е. открытой для потока элюента
(хроматография на открытых капиллярных колонках).
В зависимости от способа ввода пробы и способа перемещения хроматографических
зон по слою сорбента различают следующие варианты хроматографии: проявительный (или
элюентный), фронтальный и вытеснительный. В наиболее часто используемом
проявительном варианте анализируемую смесь периодически импульсно вводят в поток
подвижной фазы; в колонке анализируемая смесь разделяется на отдельные компоненты,
между которыми находятся зоны подвижной фазы. Во фронтальном варианте
хроматографии, пробу, содержащую разделяемые вещества, непрерывно подают в колонку.
Можно также подавать в колонку одновременно пробу и подвижную фазу. Во фронтальной
хроматографии только первый, наименее сорбируемый компонент можно получить в чистом
виде на выходе из колонки, вторая и последующая зоны содержат по два и более
компонентов разделяемой смеси. В вытеснительном варианте хроматографии в колонку
после подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество (вытеснитель), которое
сорбируется лучше любого из разделяемых компонентов. В вытеснительной хроматографии
образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ.
Существует несколько разновидностей хроматографического метода анализа,
различающихся по механизму разделения веществ. Важнейшими из них являются
следующие:
- адсорбционная хроматография, основанная на различной способности отдельных
соединений адсорбироваться на тех или иных сорбентах;
- ионообменная хроматография, основанная на различной способности разделяемых
веществ к ионному обмену с тем или иным ионитом;
- распределительная хроматография, основанная на различной растворимости
разделяемых веществ в двух частично смешивающихся жидкостях;
- диффузионная хроматография, основанная на разделении веществ по скорости
диффузии внутрь сорбента; к этому типу хроматографии относится гель-фильтрационная
хроматография;
- хроматография по сродству, метод основанный на применении нерастворимых
форм биологически активных веществ, обладающих сродством к разделяемым веществам.
Одним из методов, позволяющих определять аминокислотный состав белков,
является распределительная хроматография на бумаге, основные принципы которой сводятся
к следующему.
Если мы возьмем полоску хроматографической бумаги, нанесем на один из ее
концов 1 каплю раствора, содержащего смесь аминокислот, а затем погрузим конец бумаги
в смесь некоторых органических растворителей, то постепенно, пропитывая бумагу,
растворитель начнет продвигаться вверх по полоске. В зависимости от химического
строения различных аминокислот скорость их перемещения окажется неодинаковой,
нанесенная в начале опыта в одном месте смесь аминокислот разделится на свои
компоненты, которые распложаться в различных местах хроматографической бумаги.
Обнаружить это можно, рассматривая лист (хроматограмму) в ультрафиолетовом свете или
обработав хроматограмму, раствором нингидрина. В обоих случаях мы обнаружим ряд
пятен, соответствующих отдельным аминокислотам, входившим в состав смеси. Определив в
контрольных опытах быстроту продвижения отдельных аминокислот, можно установить,
какие аминокислоты входили в состав исследуемой смеси, а исследовав интенсивность
окраски пятен, дать ответ о примерном количественном содержании отдельных аминокислот
в смеси.
Оборудование и реактивы: Сушильный шкаф
Цилиндр ёмкостью на 50 мл с хорошо пригнанной
пробкой
Цилиндр на 25 мл
Пипетка на 5 мл
25
Микропипетка
Карандаш простой
Линейка с делениями
Хроматографическая бумага
н-Бутанол
Уксусная кислота ледяная
Нингидрин, 0,5 %-ный раствор в ацетоне
Исследуемый материал: Смесь аминокислот, стандарты аминокислот.
Подготовка смеси для хромотографии. Перед началом опыта готовят в цилиндре на
25 мл бутаноловый растворитель. Для этого к 4 мл бутанола добавляют 1 мл уксусной
кислоты и 5 мл дистиллированной воды. Смешивают жидкости осторожным встряхиванием
и дают отстояться образовавшейся эмульсии. При стяни эмульсия делится на два слоя.
Верхний слой, используемый в дальнейшей работе, постепенно делается совершенно
прозрачным.
В качестве камеры для хроматографии используют цилиндр ёмкостью на 50мл (рис.
6 а). В этот цилиндр переносят пипеткой верхний слой бутанолового растворителя из
первого цилиндра. Достаточно перенести столько растворителя, чтобы на дне цилиндра,
служащего хроматографической камерой, образовался слой, высотой 7—10 мм. Следует
обратить особое внимание на то, чтобы при заполнении цилиндра растворителем не
намочить его стенки.
Рис. 6. Хроматографическое разделение смеси аминокислот.
а – модель прибора для восходящей хроматографии;
б – полоса хроматографической бумаги с отмеченным на ней местом нанесения
смеси аминокислот;
в – проявлённая хроматограмма;
г – один из возможных способов сушки хроматограммы.
1.
Восходящая хроматография
Ход работы
1. Нанесение смеси аминокислот на бумагу. На полоске хроматографической
бумаги, необходимого размера, на расстоянии 2,5 см от нижнего края проводят стартовую
линию, на которой наносят исследуемую смесь из аминокислот (рис. 6 б). Затем на эту же
хроматограмму микропипеткой наносят стандартные растворы аминокислот. Диаметр пятен,
образовавшихся на бумаге, не должен превышать 5 мм. Необходимо помнить, что при всех
манипуляциях хроматографическую полоску можно держать только за конец,
противоположный пятнам. Полоску после нанесения раствора сушат на воздухе или в
сушильном шкафу (при 70-90º С).
2. Хроматография. Время от времени рассматривают хроматографическую бумагу
на просвет и, убедившись, что пятно высохло, опускают её в камеру для хроматографии.
Место, где была нанесена смесь, должно находиться в нижнем конце бумажной полоски,
26
оно ни в коем случае не должно помещаться в растворитель, налитый на дно камеры.
Следует осторожно опускать полоску на дно камеры (без толчков и брызг). Цилиндр
закрывают пробкой. Бутаноловый растворитель впитывается в бумажную полоску и
поднимается по ней вверх. Если описанные выше этапы работы проделаны правильно, то
растворитель идёт ровным горизонтальным фронтом. После того как он поднимается на 1315 см, считая от нижнего конца полоски, разделение аминокислот заканчивают. Для этого
полоску вынимают за верхний конец, отмечают карандашом границу растворителя и сушат
полоску на воздухе (лучше под тягой) или в сушильном шкафу.
3.
Проявление.
Для
обнаружения
пятен
аминокислот
высохшую
хроматографическую полоску равномерно опрыскивают из пульвизатора раствором
нингидрина и, высушив на воздухе (под тягой), прогревают 2-3 мин в сушильном шкафу при
70-90º С, следя за тем, чтобы полоска не прикасалась к стенкам шкафа. В процессе
прогревания на хроматограмме выступают пятна, соответствующие местам локализации
аминокислот (рис. 6 в). Измеряют расстояние от места нанесения аминокислот до
отмеченной карандашом границы, до которой поднялся по бумаге растворитель. Вычисляют
коэффициенты подвижности аминокислот ( Rf ). Для этого делят путь, пройденный
аминокислотой от места нанесения, на путь пройденный растворителем (также считая от
места нанесения).
Пример. Фронт растворителя прошёл 107 мм. Пятно гликокола отошло от места
нанесения на 12 мм, а пятно лейцина – на 53 мм.
Отсюда коэффициенты подвижностей:
12
 0,12
107
53
Rf глейцина 
 0,50
107
Rf гликокола 
Описанная модель хроматографической камеры позволяет ознакомиться с
хроматографией на бумаге. Разумеется, для анализа аминокислот такая камера оказалась бы
слишком примитивной. Камеры, используемые с этой целью, имеют значительно больший
объём и позволяют хроматографировать на больших листах бумаги одновременно несколько
исследуемых препаратов и на этом же листе проводить хроматографию аминокислот –
«свидетелей».
Рис. 7. А - камера для нисходящей хроматографии.
1 –крышка;
2 – кюветы с растворителем, в которых закрепляют свисающие листы бумаги;
3 – корпус камеры;
4 –поддон с растворителем.
Б – отдельная камера с листом хроматографической бумаги.
27
Результаты хроматографии улучшаются, если растворитель продвигается по листу
бумаги сверху вниз. Для этого его наливают в длинную кювету, закреплённую в верхней
части камеры, и закрепляют листы бумаги так, чтобы верхние края их были погружены в
кювету (рис. 7). Нижний край листа свисает свободно, не касаясь дна камеры. Растворитель,
налитый на дно камеры, служит только для насыщения его парами всего объёма камеры.
Этот метод хроматографии называется нисходящей хроматографией, тогда как
хроматография с продвижением растворителя вверх получила название восходящей.
2. Нисходящая хроматография
В качестве хроматографической камеры используют высокие стеклянные банки с
выступом в верхней части. На выступ в строго горизонтальном положении ставят лодочку специальный стеклянный сосуд для растворителя.
Ход работы
1. Из хроматографической бумаги вырезают полоску шириной 5 см и длиной,
примерно соответствующей высоте камеры. На расстоянии 10 см от конца полоски проводят
простым карандашом стартовую линию, в середине которой отмечают точку старта. На
стартовую точку микропипеткой наносят 0,005-0,01 мл смеси аминокислот (в несколько
приемов, диаметр мокрого пятна не более 5 мм), периодически просушивая бумагу над
электрической плиткой (или над настольной лампой).
2. На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество нижнего
слоя растворителя, а в установленную лодочку - верхний слой растворителя. Хроматограмму
с нанесенной смесью аминокислот помещают в камеру так, чтобы ближний к старту конец
был опущен в лодочку и зафиксирован в ней предметным стеклом, а другой висел
вертикально, не касаясь стенок камеры. Камеру закрывают крышкой и оставляют при
комнатной температуре на 18-20 часов.
3. Растворитель продвигается по хроматограмме сверху вниз, и когда фронт его
приблизится к нижнему краю бумаги, хроматограмму вынимают из камеры и высушивают
под тягой. Затем ее обрабатывают 0,5% раствором нингидрина и помещают в сушильный
шкаф при 60-70оС на 10-15 минут для развития окраски, после чего на ней появляются пятна
сине-фиолетового или лилового цвета, соответствующие аминокислотам. Вычисляют
коэффициенты подвижности аминокислот ( Rf ).
3. Радиальная (круговая ) хроматография
Хроматографической камерой служит эксикатор.
Ход работы
1. Хроматографическую бумагу вырезают в форме диска, диаметр которого
соответствует внутренним размерам диаметра эксикатора. В центр диска (на точку старта)
наносят микропипеткой в несколько приемов 0,005-0,01 мл исследуемой смеси аминокислот.
Нанесение смеси следует проводить очень аккуратно, слегка касаясь микропипеткой
стартовой точки, чтобы диаметр мокрого пятна был не более 5 мм. После каждого нанесения
пятно подсушивают над электроплиткой или в термостате.
2. В центре хроматограмм делают иглой отверстие, в которое пропускают фитилек
из сложенной вчетверо нити. Хроматограмму помещают в эксикатор, на дно которого
предварительно наливают верхний слой растворителя. Проверяют положение фитилька и
хроматограммы: конец фитилька должен быть погружен в растворитель, а края
хроматограммы должны находиться на выступах эксикатора. Закрывают эксикатор крышкой.
3. Растворитель поднимается вверх по фитильку, а затем радиально
распространяется по бумаге от центра. Когда растворитель достигнет края бумаги, ее
вынимают из эксикатора, высушивают под тягой, обрабатывают 0,5% раствором нингидрина
28
и помещают в сушильный шкаф при 60-70оС на 10-15 минут. На хроматограмме появляются
сине-фиолетовые пятна, каждое из которых соответствует отдельной аминокислоте.
Вычисляют коэффициенты подвижности аминокислот ( Rf ).
4. Тонкослойная хроматография на пластинах «Силуфол»
Метод характеризуется более высокой чувствительностью по сравнению с
хроматографией на бумаге.
Ход работы
1. На пластинку «Силуфол», на расстоянии 2,5 см от нижнего края проводят
стартовую линию, на которой наносят исследуемую смесь из аминокислот (рис. 6 б). Затем
на эту же пластинку микропипеткой наносят стандартные растворы аминокислот. Диаметр
пятен, образовавшихся на бумаге, не должен превышать 5 мм.
2. Проводят восходящую хроматографию.
3.
Проявление.
Для
обнаружения
пятен
аминокислот
высохшую
хроматографическую полоску равномерно опрыскивают из пульвизатора раствором
нингидрина и, высушив на воздухе (под тягой), прогревают 2-3 мин в сушильном шкафу при
70-90º С, следя за тем, чтобы полоска не прикасалась к стенкам шкафа. В процессе
прогревания на полоске выступают пятна, соответствующие местам локализации
аминокислот (рис. 6 в). Измеряют расстояние от места нанесения аминокислот до
отмеченной карандашом границы, до которой поднялся по бумаге растворитель. Вычисляют
коэффициенты подвижности аминокислот ( Rf ).
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
АМИНОКИСЛОТ
В
ПЯТНАХ
ХРОМАТОГРАММ.
Кроме качественной реакции на аминокислоты, можно определить аминокислоты
количественно. Для этого, пятно с аминокислотой, «проявленной» раствором нингидрина,
обводят простым карандашом, вырезают (с хроматографической бумаги) или соскабливают
(в случае тонкослойной хроматографии) в индивидуальную пробирку, экстрагируют
раствором ацетона (3, 0 мл) в течение 30 мин. при 37 °С.
Затем аминокислоты определяют колориметрически на спектрофотометре или
фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (против контроля, содержащего 3,0 мл
раствора ацетона).
ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ:
1.
Какие свойства аминокислот лежат в основе хроматографического метода?
2.
Перечислите основные виды хроматографии?
3.
Принцип адсорбционной хроматографии.
4.
Какие свойства аминокислот лежат в основе распределительной
хроматографии?
5.
Какие свойства аминокислот лежат в основе ионообменной хроматографии?
6.
Какие свойства аминокислот лежат в основе диффузной хроматографии?
7.
Какие свойства аминокислот лежат в основе хроматографии по сродству?
8.
Перечислите виды распределительной хроматографии.
9.
Какие растворители применяются для приготовления разделительной смеси
аминокислот?
10. Какие носители используются в распределительной хроматографии?
11. Что является подвижной фазой в распределительной хроматографии?
12. Что является неподвижной фазой в распределительной хроматографии?
13. Какая качественная реакция используется для обнаружения аминокислот на
хроматограмме?
14. Что собой представляет коэффициент распределения?
29
15. Какие факторы определяют константность величины Rf каждой
аминокислоты?
16. Объясните, почему различные аминокислоты имеют разные Rf?
17. Количественное
определение
аминокислот
при
распределительной
хроматографии.
КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ, ПРИОБРЕТЕННЫХ НА ЛАБОРАТОРНЫХ
ЗАНЯТИЯХ ПО РАЗДЕЛУ «ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ» (4 часа)
I. Ответить на контрольные вопросы:
1. Какие аминокислоты входят в состав белков?
2. Какие аминокислоты относятся к незаменимым?
3. Какие аминокислоты относятся к:
- правовращающимся,
- левовращающимся ?
4. Какие аминокислоты имеют:
- 1 хиральный атом С,
- 2 хиральных атома С?
5. Как называются соединения аминокислот с ионами металлов?
6. Какие виды распределительной хроматографии Вы знаете?
7. Какая качественная реакция используется в бумажной хроматографии для
выявления свободных α-аминокислот?
8. Что собой представляет Rf ?
9. Укажите принцип классификации аминокислот.
10. Какие α-аминокислоты относятся к:
- неполярным,
- полярным незаряженным,
- полярным отрицательнозаряженным,
- полярным положительнозаряженным?
11. Какие аминокислоты относятся к циклическим?
12. Какие аминокислоты относятся к гидроксилсодержащим?
13. Какие аминокислоты относятся к ароматическим?
14. Какие аминокислоты относятся к:
- диаминомонокарбоновым,
- моноаминодикарбоновым?
15. Какие аминокислоты относятся к S-содержащим?
16. Какие α-аминокислоты относятся к модифицированным?
17. Какие аминокислоты относятся к циклическим аминокислотам?
18. Укажите специфическую реакцию на циклические аминокислоты.
19. С помощью уксуснокислого свинца в щелочной среде, какие аминокислоты
можно обнаружить?
20. Какие качественные реакции Вы знаете для обнаружения триптофана?
21. Какая аминокислота дает красное окрашивание в кислой среде с альдегидом?
22. Для фенилаланина ксантопротеиновая реакция является специфичной?
23. Какую аминокислоту можно обнаружить с помощью реакции с нитропруссидом
натрия?
24. Укажите специфическую реакцию на тирозин.
30
II. Определить аминокислотный состав двух смесей с помощью качественных
реакций на отдельные аминокислоты
Название качественных реакций
Определяемые аминокислоты
смесь I
смесь II
смесь I
смесь II
смесь I
смесь II
смесь I
смесь II
Тирозин
Триптофан
Фенилаланин
Цистеин
Вывод
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ (8 часа)
Белки высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы
которых построены из остатков аминокислот. Аминокислотные остатки в полипептидной
цепи расположены в определенном генетически запрограммированном порядке и соединены
пептидной связью, что определяет первичную структуру белка.
Первичная структура белка несет информацию о пространственной организации,
имеющей несколько уровней.
Спиральная конфигурация полипептидных цепей носит название
вторичной
структуры белка. В образующихся спиралях водород NH-группы пептидной связи вступает
во взаимодействие с кислородом С=О группы пептидной связи соседнего витка.
Образовавшаяся новая связь носит название водородной связи. Водородные связи укрепляют
вторичную структуру белка. Однако полипептидные цепи не могут образовать спирали на
всем их протяжении – этому мешает дисульфидные связи между молекулами цистеина,
расположенными в разных частях полипептидной цепочки, а также молекулы пролина и
оксипролина, не укладывающиеся в спирали. В результате возникает специфическое для
данного белка расположение полипептидных цепей в пространстве или “упаковка”
спиралей, называемая третичной структурой белка. Белковые молекулы могут объединятся
между собой, образуя более тяжелые полимеры. В этом случае речь идет о четвертичной
структуре белка.
Существование первичной структуры белка легко можно обнаружить, пользуясь
химическими реакциями, в то время как для исследования вторичной структуры белка и
последующих уровней его организации большое значение приобретает физико-химические
методы анализа.
31
Лабораторная работа № 18
ОБНАРУЖЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ)
Принцип метода. Белки (пептиды) в щелочном растворе в присутствии солей меди
(II) образуют комплексные ее соединения, окрашенные в сине-фиолетовый или краснофиолетовый цвет, в зависимости от концентрации белка.
Реактивы: Сернокислая медь, 1%-ный
Едкий натр, 10%-ный
Яичный белок, 10%-ный, 50 %-ный растворы
Ход работы
К 3 каплям раствора белка добавляют 1 каплю раствора сульфата меди и 3 капли
едкого натра. Появляется фиолетовое окрашивание.
Полученные результаты занести в таблицу:
Варианты опыта
CuSO4
Белок, 10%-ный
Белок, 50%-ный
NaOH
Окраска
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 19
НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
(на аминогруппу, находящуюся в -положении)
Принцип метода. Белки, полипептиды и свободные -аминокислоты при
нагревании реагируют с нингидрином (трикетогидринденгид-ратом) с образованием
продукта конденсации, окрашенного в фиолетовый цвет.
Реактивы: Яичный белок, 1%-ый раствор
Нингидрин, 0,5%-ый раствор
Глицин, 1%-ый раствор
Ход работы
К 1 мл 1% раствора белка прибавляют 0,5 мл 0,5% раствора нингидрина и нагревают
до кипения. Появляется фиолетово-синее окрашивание.
Проделывают эту реакцию с раствором аминокислоты, взяв вместо раствора белка
1% раствор глицина.
Полученные результаты занести в таблицу:
Используемые реагенты (мл)
№
пробирки
Белок
Глицин
Нингидрин
1
1
0,5
2
1
0,5
Сделать выводы:
32
Окраска
Лабораторная работа № 20
РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ
Принцип метода. Растворимость белков в воде обусловлена наличием на
поверхности белковой молекулы свободных гидрофильных групп и зависит от структуры
белка, реакции среды, присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются белки,
обладающие кислыми свойствами, а в щелочной - белки, обладающие основными
свойствами.
Альбумины хорошо растворяются в дистиллированной воде, а глобулины
растворимы в воде только в присутствии электролитов.
Не растворяются в воде белки опорных тканей (коллаген, кератин, эластин и др.).
Реактивы: Яичный белок
КС1, 5%-ый раствор
Кератин
Ход работы
1. К 2 каплям неразведенного яичного белка прибавляют 1 мл дистиллированной
воды и перемешивают. При этом яичный альбумин растворяется, а яичный глобулин
выпадает в виде небольшого осадка.
2. К 2 каплям яичного белка прибавляют 1 мл 5% раствора хлорида калия. В слабом
солевом растворе растворяются как альбумины, так и глобулины.
3. Проверяют растворимость в воде и 5% растворе хлористого калия белка кератина,
содержащегося в шерсти и волосах.
Результаты работы оформить в виде таблицы:
Название белка
Растворимость
в Н2О
в 5% КС1
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 21
ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ
Реакции осаждения белков в зависимости от применяемого осадителя бывают
необратимыми и обратимыми.
Необратимое осаждение белков (денатурация)
Необратимые реакции осаждения приводят к денатурации белков, при этом
разрушается пространственная структура молекулы, и белки утрачивают свои естественные
биологические и физико-химические свойства. Денатурацию белков можно вызвать
физическими воздействиями (кипячение, замораживание, высокое давление, вибрация,
радиоактивное излучение и др.) и химическими осадителями.
33
1. Осаждение белков неорганическими осадителями.
а) Осаждение белков минеральными кислотами.
Реактивы: Яичный белок 1% раствор
Азотная кислота, конц.
Ход работы
В пробирку осторожно наливают около 1 мл концентрированной азотной кислоты.
Затем, наклонив пробирку, медленно по стенке добавляют 1 мл 1% раствора белка. На
границе двух жидкостей появляется осадок в виде белого кольца.
Такую же реакцию проделывают с концентрированной соляной и серной кислотами.
б) Осаждение белков солями тяжелых металлов.
Реактивы: Яичный белок, 1% раствор
Сульфат меди, 7% раствор
Ацетат свинца, 5% раствор
Ход работы
В две пробирки наливают по 1 мл 1% раствора белка и добавляют по 3-4 капли: в
первую пробирку - 7% раствора сульфата меди, во вторую - 5% раствора ацетата свинца. Во
всех пробирках образуется осадок.
2.
Осаждение белков органическими осадителями.
а) осаждение белков органическими кислотами.
Реактивы: Яичный белок, 1% раствор
Сульфосалициловая кислоты, 10% раствор
Трихлоруксусная кислота,10% раствор
Ход работы
В 2 пробирки наливают по 2 мл 1% раствора белка и добавляют в одну пробирку 4-5
капель 10% раствора сульфосалициловой кислоты, в другую - 5-10 капель 10%
трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.
б) Осаждение белков органическими растворителями.
Реактивы: Яичный белок, 1% раствор
Этанол, 96%
Хлороформ
Ацетона или эфира
Ход работы
К 1 мл 1% раствора белка добавляют 2 мл органического растворителя (96% этанола,
хлороформа, ацетона или эфира) и перемешивают. Образование осадка можно усилить
добавлением нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия.
в) Осаждение белков реактивами на алкалоиды.
Реактивы: Яичный белок, 1% раствор
Уксусная кислота, 1% раствор
Пикриновая кислота, 1% раствор
Танин
Железисто-синеродистый калий, 5% раствор
34
Ход работы
В три пробирки наливают по 1 мл 1% раствора белка, по 4-5 капель 1% раствора
уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую пробирку - 10% раствора пикриновой кислоты,
во вторую - насыщенного раствора танина, в третью - 5% раствора железисто-синеродистого
калия. Наблюдают выпадение осадка.
3.
Осаждение белков при нагревании.
Реактивы: Яичный белок, 1% раствор
Уксусная кислота, 1%, 10% растворы
Хлорид натрия
Гидроксид натрия, 10% раствор
Ход работы
В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1% раствора яичного белка.
Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения
раствора).
К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1% раствора
уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем
выпадение белого хлопьевидного осадка белка. Это объясняется тем, что белок теряет заряд
и находится в изоэлектрическом состоянии.
К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной
кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка
перезаряжаются и приобретают положительный заряд.
К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной
кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок
вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и
нейтрализации заряда на частицах белка.
К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10% раствора гидроксида
натрия и нагревают. Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на
частицах белка усиливается.
Обратимое осаждение белков (высаливание)
При добавлении к водным растворам белков сульфатов или хлоридов щелочных и
щелочно-земельных металлов (Na2SO4, NaCl, MgSO4 и др.) происходит дегидратация и
нейтрализация белковых частиц, при этом белки выпадают в осадок без изменения нативной
структуры. Такой тип осаждения белков называется высаливанием. Высаливание обратимый процесс, и после удаления соли (разбавлением водой, диализом) белок вновь
приобретает природные свойства. Поскольку разные белки высаливаются при различных
концентрациях солей, этот метод используется для фракционирования белков. Для
разделения белков методом высаливания широко применяется сульфат аммония.
Фракционное осаждение белков плазмы крови
сульфатом аммония.
Фибриноген выпадает в осадок при 33% насыщении плазмы сернокислым
аммонием, глобулины - при полунасыщении а альбумины - при полном насыщении.
Реактивы: Сульфат аммония
Гидроксид натрия, 10% раствор
Сульфат меди, 1% раствор
Ход работы
1. К 2 мл плазмы крови добавляют 5 мл дистиллированной воды, 3,5 мл
насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадает фибриноген
35
(можно наблюдать лишь незначительное помутнение), который отделяют фильтрованием.
Наличие белка на фильтре проверяют биуретовой реакцией: для этого воронку с фильтром
переносят в чистую пробирку и на фильтр наливают 1 мл 10% раствора гидроксида натрия и
1 каплю 1% раствора сульфата меди. Фильтрат (№1) используют для дальнейшей работы.
2. К 4 мл фильтрата №1 добавляют 4 мл насыщенного раствора сульфата аммония и
перемешивают. В осадок выпадают глобулины, которые отделяют фильтрованием.
Получают осадок, с которым проделывают биуретовую реакцию, и фильтрат №2.
3. К фильтрату №2 добавляют при постоянном перемешивании стеклянной
палочкой кристаллический сульфат аммония до насыщения (пока соль не перестанет
растворяться). Выпадают в осадок альбумины, наличие которых проверяют биуретовой
реакцией: 1 мл смеси переносят в чистую пробирку, добавляют 1 мл 10% раствора
гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди.
1. Записать результаты реакций необратимого осаждения белка при действии
неорганических и органических осадителей в виде таблицы:
Название групп
Употребляемые
Характер и цвет
Чем обусловлена реакция
осадителей
реактивы
осадка
2. Результаты опытов по осаждению белков при нагревании оформить в виде
таблицы:
Номер
Среда
Наблюдаемые
Выводы
пробирки
изменения
1
Нейтральная
2
Слабокислая (1% СН3СООН)
3
Кислая (10% СН3СООН)
4
Кислая (10% СН3СООН +
электролит NaCl)
5
Щелочная (10% NaOH)
3. Выписать результаты фракционного разделения белков плазмы в таблицу:
Название
Степень
Характер осадка
Результаты биуретовой
белка
насыщения
реакции
(NH4)2SO4
Лабораторная работа № 22
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ
ТОЧКИ БЕЛКА
Принцип метода. Изоэлектрической точкой белка называется величина pH среды,
при которой суммарный электрический заряд белка равен нулю. Растворы белков в
изоэлектрической точке наименее устойчивы, нейтральные молекулы белка легко выпадают
в осадок. Вследствие этого определение изоэлектрической точки может быть сведено к
определению pH раствора, при котором наблюдается наиболее полное и быстрое выпадение
белка в осадок. Для получения растворов с различной величиной водородного показателя
пользуются буферными растворами.
Реактивы: Казеин0,4% раствор
Желатин1% раствор
СН3СООН 0,1 М, 0,2 М, 1М р-ры
СН3СООNa 0,1М раствор
36
Ход работы
1. Для определения изоэлектрической точки казеина в 7 сухих пробирок наливают
последовательно реактивы в количествах (в мл), указанных в таблице:
№
пробирки
1
2
3
4
5
6
7
СН3СООН
0,2 М
Н2О
1,6
0,8
0,4
0,2
0,1
0,06
0,03
0,4% р-р казеина в
в 0,2 М р-ре
СН3СООNa
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,4
1,2
1,6
1,8
1,9
1,94
1,97
рН
смеси
3,8
4,1
4,4
4,7
5,0
5,3
5,6
Растворы тщательно перемешивают. Через 5-10 минут наблюдается помутнение
растворов. Наибольшее количество осадка наблюдается в той пробирке, где рН
соответствует изоэлектрической точке казеина.
Для определения изоэлектрической точки желатина в 6 сухих пробирок
последовательно наливают реактивы в количествах (в мл), указанных в таблице:
№
пробир
-ки
1
2
3
4
5
6
Н2О
3,8
3,5
3,0
2,0
3,2
0,1 М
1М
раствор
раствор
СН3СООН СН3СООН
0,8
0,5
1,0
2,0
4,0
-
0,1М
раствор
СН3СООNa
1%
раствор
желатина
рН
среды
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
5,6
5,3
5,0
4,7
4,4
0,8
4,1
Содержимое каждой пробирки перемешивают и затем во все пробирки медленно по
стенке добавляют по 2 мл 96% этанола (или ацетона). Через 30 минут определяют
изоэлектрическую точку желатина. Она будет соответствовать рН пробирки с максимальной
степенью помутнения.
Отметить степень помутнения в пробирках и записать изоэлектрические точки
казеина и желатина.
Лабораторная работа № 23
ДИАЛИЗ БЕЛКОВ
Диализом называется процесс разделения высоко- и низко- молекулярных веществ с
помощью полупроницаемых мембран (целлофан, коллодий, пергамент и др.). Молекулы
белка, обладающие большими размерами и молекулярной массой, не способны проникать
через такие мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества легко проходят через
них. Диализ является очень удобным методом очистки белковых растворов от
37
низкомолекулярных примесей, например, от избытка солей. Простейшим диализатором
может служить целлофановый или коллоидный мешочек, опущенный в стакан с водой.
Реактивы: Яичный белок 3% раствор
Сульфат аммония
Хлорид бария 5% раствор
Ход работы
1. В пробирку наливают 2 мл 3% раствора яичного альбумина и добавляют 1 каплю
насыщенного раствора сульфата аммония. Из листа целлофана, предварительно намоченного
дистиллированной водой, делают мешочек и выливают в него содержимое пробирки. Края
мешочка прикрепляют к середине стеклянной палочки (или зажимают между двумя
стеклянными палочками, соединенными друг с другом резиновыми колечками). Мешочек
помещают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы стеклянная палочка легла на края
стакана. Уровень жидкости в мешочке должен быть ниже уровня жидкости в стакане.
2. Через 1 час после начала диализа жидкость, находящуюся в стакане, проверяют на
присутствие белка и сульфат-анионов:
а) Проба на белок.
С 1 мл жидкости из стакана проделывают биуретовую реакцию.
б) Проба на сульфат-анионы.
К 1 мл жидкости из стакана добавляют 3-4 капли 5% раствора хлорида бария и
наблюдают образование осадка сульфата бария в виде белой мути.
3. Целлофановый мешочек вынимают из стакана. Жидкость из мешочка переливают
в пробирку и проделывают биуретовую реакцию.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ:
1.
Что такое белки? Перечислите функции белков.
2.
Назовите типы связей аминокислот в молекуле белка.
3.
Что понимают под первичной, вторичной, третичной, четвертичной
структурами белка? Какие связи их формируют?
4.
Виды спиралей в молекуле белка.
5.
Дисульфидная, водородная, солевая связи, их участие в образовании структур
белка.
6.
Гидрофобные связи в молекуле белка.
7.
Как установить N-концевую и С-концевую аминокислоты в полипептидной
цепочке?
8.
Приведите доказательства наличия пептидной связи в молекуле белка.
9.
Характеристика глобулярных и фибриллярных белков.
10. Методы выделения и очистки белков.
11. Амфотерные свойства белков.
12. Растворимость белков.
13. Факторы устойчивости белковой молекулы в растворе.
14. Механизм возникновения заряда белковой молекулы.
15. Изоэлектрическая точка и изоэлектрическая зона белков.
16. Гидратная оболочка, механизм ее возникновения.
17. Понятие о денатурации и высаливании белков.
18. Обратимое и необратимое осаждение белков.
19. Молекулярная масса белков. Методы ее определения.
20. Классификация белков.
21. Чем отличаются сложные белки от простых?
38
КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ, ПРИОБРЕТЕННЫХ НА ЛАБОРАТОРНЫХ
ЗАНЯТИЯХ ПО РАЗДЕЛУ «ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ»
(4 часа)
I. Ответить на контрольные вопросы:
1.
Что такое белки?
2.
Что понимают под первичной структурой белка?
3.
Что понимают под вторичной структурой белка?
4.
Что понимают под третичной структурой белка?
5.
Что понимают под четвертичной структурой белка?
6.
Какие методы используют для изучения аминокислотного состава
гидролизатов белков?
7.
Белки способны осаждаться под влиянием высоких концентраций солей (NaCl,
(NH4)2SO4 и других), т.е. высаливаться. Чем обусловлен данный эффект?
8.
Какие химические элементы входят в состав протеинов?
9.
Сколько полипептидных цепей содержится в молекуле протеинов?
10. Что позволяют установить качественные реакции на белки?
11. Какие органические соединения реагируют с нингидрином?
12. На каких физико-химических свойствах белков основан метод диализа?
13. Какими методами можно фракционировать белки, основываясь на
молекулярной массе?
14. Какими процессами сопровождается денатурация протеинов?
15. Какие реакции осаждения белка относятся к необратимым?
16. Какие группы участвуют в образовании пептидной связи между
аминокислотами в белке?
17. Какие реагенты используют для обратимого осаждения белка?
18. Что такое изоэлектрическая точка и изоэлектрическая зона белков?
II. Проведите сравнительную характеристику физико-химических свойств двух
растворов белков
Реакции
Раствор №1
Результат исслед-я
І. Высаливание
1) полунасыщенный
раствор (NH4)2SO4
2) насыщенный раствор
(NH4)2SO4
3) качественная реакция
на белок
Вывод:
39
Раствор №2
Результат исслед-я
Определите изоэлектрическую точку исследуемых растворов
Реакции
Раствор №3
Результат исслед-я
Раствор №4
Результат исслед-я
ІІ. Определение ИЭТ
рН
4,0-5,0
9,0-11,0
Вывод:
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
ТЕМА 1. СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (8 часов)
Нуклеиновые кислоты – биополимеры, которые состоят из нуклеотидов. Они имеют
первостепенное значение в сохранении, распространении и передаче генетической
информации, которая реализуется путем синтеза специфических белков.
Нуклеиновые кислоты являються высокомолекулярными соединениями, которые
состоят из мононуклеотидов. В свою очередь, мононуклеотиды состоят из пуринового или
пиримидинового основания, углеводного компонента (рибозы и дезоксирибозы) и
фосфорной кислоты.
Пуриновые основания можно рассматривать как производные пурина. В состав
нуклеиновых кислот входят два пуриновых основания — аденин и гуанин:
Аденин
Гуанин (2-амино6 гидроксипурин)
-(6 –аминопурин)
Пиримидиновые основания — цитозин, урацил, тимин — можно рассматривать как
производные пиримидина:
40
Пиримидин
Цитозин
Урацил
Тимин
Кроме того, открыт еще ряд минорных оснований: 5-метилцитозин, 5гидроксиметилцитозин в составе ДНК диметилгуанин, метиладенин в составе РНК и др.
В качестве углеводного компонента в нуклеиновые кислоты входят рибоза и
дезоксирибоза:
Примером мононуклеотида является адениловая кислота:
Адениловая кислота
Мононуклеотиды носят разные названия в зависимости от входящего в их состав
пуринового или пиримидинового основания, например, адениловая кислота (аденин),
гуаниловая кислота (гуанин), цитидиловая кислота (цитозин) и др. Отдельные
мононуклеотиды в молекуле нуклеиновой кислоты соединяются между собой посредством
кислородных мостиков, образующихся за счет гидроксильной группы третьего углеродного
атома пентозы одного мононуклеотида и гидроксила фосфорной кислоты соседнего
нуклеотида.
В
живых
организмах
обнаружены
два
типа
нуклеиновых
кислот:
дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). Разница в
химическом составе между ДНК и РНК состоит в том, что углеводным компонентом в ДНК
является дезоксирибоза, а в РНК — рибоза; кроме того, в ДНК наряду с другими азотистыми
основаниями входит тимин, а в РНК вместо тимина — урацил.
41
Лабораторная работа № 24
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПУТЕМ
ГИДРОЛИЗА НУКЛЕОПРОТЕИДОВ
Принцип метода. Нуклеопротеиды хорошо растворяются в разбавленных щелочах и
легко осаждаются при подкислении. Для выделения нуклеопротеидов из дрожжей их
экстрагируют слабым раствором гидроксида натрия, а затем осаждают при подкислении
разбавленным раствором уксусной кислоты.
Для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз этих белков и
в гидролизате обнаруживают их компоненты. При неполном гидролизе нуклеопротеиды
распадаются на белки и нуклеиновые кислоты. Белок обнаруживают биуретовой реакцией.
При полном гидролизе нуклеопротеидов образуются α-аминокислоты, пуриновые и
пиримидиновые основания, фосфорная кислота и пентозы (рибоза и дезоксирибоза).
Аминокислоты обнаруживают нингидриновой реакцией, фосфорную кислоту – реакцией с
молибдатом аммония, пентозы – реакцией Фелинга, азотистые основания – с помощью
нитрата серебра, с которым они образуют труднорастворимые соединения.
Реактивы: Дрожжи
Эфир
Гидроксид натрия, 0,4%-й и 10%-й, 30%-й растворы
Уксусная кислота, 5%-й раствор
Серная кислота, 5%-й раствор
Сульфат меди, 1%-й, 7%-й растворы
Аммиак, конц.
Аммиачный раствор нитрата серебра
Реактив Фелинга
Молибденовый реактив (молибдат аммония в азотной кислоте)
ПРОВЕДЕНИЕ ГИДРОЛИЗА.
Ход работы
Тщательно растирают в фарфоровой ступке 5-10 г дрожжей, смоченных 10-15
каплями эфира и таким же количеством воды, с 2-3 г песка. Постепенно прибавляют в ступку
30-40 мл 0,4 %-ого раствора гидроксида натрия и продолжают растирать в течение 10-15
мин. Содержимое ступки переносят в центрифужные пробирки, уравновешивают их и
центрифугируют. К центрифугату при перемешивании прибавляют по каплям раствор
уксусной кислоты до прекращения выделения осадка нуклеопротеидов. Полученный осадок
отфильтровывают и используют для гидролиза. 0,5 г нуклеопротеидов помешают в
пробирку, прибавляют 5 мл 5 %-ого раствора серной кислоты, закрывают пробирку пробкой,
в которую вставлена стеклянная трубка длиной 25-30 см (обратный холодильник), и ставят
на кипящую водяную баню. Через 1-2 ч после начала гидролиза раствор охлаждают,
фильтруют и исследуют.
КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА БЕЛОК
Ход работы
Для проведения биуретовой реакции к 5 каплям гидролизата прибавляют 10 капель
10 %-ого раствора гидроксида натрия, одну каплю 1 %-ого раствора сульфата меди и
наблюдают за изменением окраски.
ПРОБА НА ПУРИНОВЫЕ ОСНОВАНИЯ.
Ход определения
К 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного раствора аммиака
для нейтрализации и 5 капель 1% раствора AgNO3. При стоянии выпадает рыхлый осадок
бурого цвета, обусловленный образованием серебряных соединений пуриновых оснований.
42
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА УГЛЕВОД (РИБОЗУ И ДЕЗОКСИРИБОЗУ).
Эти реакции основаны на способности рибозы и дезоксирибозы, имеющих
свободный гликозидный гидроксил, восстанавливать металлы (медь, висмут, железо) в
щелочной среде. При этом металлы восстанавливаются из окисной формы в закисную или в
случае закиси до свободного состояния; сахара же дают различные продукты окисления.
а) Проба Троммера заключается в восстановлении окисной меди в закисную под
влиянием рибозы и дезоксирибозы, присутствующих в гидролизате дрожжей; реакция
протекает в щелочной среде.
Химизм реакции:
CuSO4 + 2NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4
Сульфат меди
Гидрат окиси меди
(голубой осадок)
2CuOH →Cu2O + H2O
Закись меди
(кирпично-красный цвет)
Избыток CuSО4 мешает реакции, так как ведет к образованию большого количества
Сu(ОН)2, который при нагревании распадается с образованием черного осадка окиси меди.
Химизм реакции:
Cu(OH)2 → CuO + H2O
Окись меди
(черного цвета)
Ход определения
К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30% раствора едкого натра и несколько
капель 7% раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидроокиси меди
Сu(ОН)2. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидрата закиси меди СuОН
или красный осадок закиси меди Сu2О
б) Реакция Фелинга.
Ход определения
К 1 мл гидролизата прибавляют раствор гидроксида натрия до щелочной реакции на
лакмус, затем 5-10 капель реактива Фелинга, нагревают и наблюдают за изменением
окраски.
43
РЕАКЦИЯ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ
Молибденовая проба на фосфорную кислоту.
К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель молибденового реактива,
представляющего собой раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте, и кипятят.
При охлаждении пробирки под струей холодной водопроводной воды выпадает
кристаллический осадок лимонно-желтого цвета, обусловленный образованием
фосфорномолибденовокислого аммония.
Химизм реакции:
12(NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21HNO3 →
→ 21NH4NO3 + (NH4)3PO4 · 12MoO3·6H2O + 6H2O
фосфорномолибденовокислый
аммоний (лимонно-желтого цвета)
Результаты занести в таблицу:
Результаты реакций
Исследуемый
объект
Биуретовой
Феллинга
Троммера
AgNO3
С
молибденовы
м реактивом
Сделать выводы:
ТЕМА 2. ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (8 часов)
В современной биологии широкое применение находят спектральные методы
исследования биологических объектов. Важную информацию о структурных особенностях
биополимеров получают при использовании флуоресценции, ультрафиолетовой (УФ) и
инфракрасной (ИФ) спектрофотометрии, дисперсии оптического вращения, электронного
парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Основным законом абсорбционной спектрофотометрии есть закон Ламберта - Бэра.
Если на шар вещества толщиной L падает монохроматический пучок света интенсивностью
І0 , то благодаря процессам поглощения света в веществе, свет, который вышел, будет иметь
интенсивность
І = І0 е -ECL
где
С- концентрация вещества;
Е - молярный коэффициент экстинкции (М-1 · CM-1).
Логарифм соотношения Іо / І называется оптической плотностью вещества:
D = Ln I0/I = ECL
Пропускание света раствором (Т) выражается соотношением :
T = I0/I · 100 %
Свет разных длин волн λ поглощается веществом поразномому. Зависимость
оптической плотности D или молярного коэффициента экстинции Е от λ называется
спектром поглощения вещества: D = f (λ) или Е= f (λ). Спектр поглощения определяется
свойствами вещества и является постоянной характеристикой вещества. Приборы, на
44
которых измеряются D или Т и определяются спектры поглощения, называются
спектофотометрами. D изменяется от 0 до∞, а Т – от 1 до 100 %.
Вещества могут поглощать свет в разных участках спектра. Условно весь
спектральный диапазон разделяют на ультрафиолетовую, видимую и инфракрасную области.
УФ-спектр лежит в интервале λ от 100 до 400 нм и разделяется на вакуумную (100-200 нм),
среднюю (200-300 нм) и близкую (300-400 нм) УФ-области (1 нм = 10-9 м). Видимая часть
спектра занимает интервал от 400 до 750 нм. ИФ-спектр делится на близкую (0,75-2,5 мкм),
среднюю (2,5-15 мкм) и далекую (15-300 мкм) ИФ-области.
Спектры поглощения белков и нуклеиновых кислот расположены в средний части
УФ-спектра. Чисто эмпирически найдены корреляции между химической структурой
молекул и их спектрами. Наличие циклических структур с делокализованными π электронами обуславливает поглощение УФ-света. Для белков и нуклеиновых кислот
характерны два максимума поглощения: один - на границе вакуумной УФ-области (200-210
нм) и второй - в средней УФ-области (длинноволновый максимум поглощения).
Длинноволновый максимум белков определяется поглощением трех ароматических
аминокислот - триптофана, тирозина и фенилаланина. Поглощение обусловлено π - π
электронными переходами в плоскости ароматического кольца. Для нуклеиновых кислот
максимум
260
нм
связан
с
поглощением
пуриновых
и пиримидиновых
оснований. Основная частица поглощения связана с π - π * переходами, но небольшое
поглощение определяется и гетероатомами, что дают n - π * переходы.
В лабораторной практике на спектрофотометре определяют отношение D280 / D260.
По этому отношению оценивают чистоту белковых препаратов и отсутствие нуклеиновых
кислот. Если D280 / D260 > 1,6-1,7 - это свидетельствует о высокой чистоте белковых
препаратов.
УФ - ПОГЛОЩЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ. Поглощения нуклеиновых
кислот обусловлены пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Значение Еmax при 260
нм для аденина, урацила, тимина, гуанина и цитозина равняется соответственно 13,4 ·103; 8,2
·103; 7,4 ·103; 7,2 ·103 и 5,55 ·103 Г-1см-1.
Денатурация ДНК сопровождается резким ростом оптической плотности при 260
нм. Это явление называется гиперхромным эффектом.
Зависимость оптической плотности D260 от температуры называется кривой
плавления ДНК. С помощью кривой плавления определяются важные характеристики ДНК.
Определяется гиперхромный эффект (Г.Э.) в процентах:
Г. Э. = ((Dд-DH) /DH)·100%
где Dд и DH - оптические плотности денатурированной и нативной ДНК.
Гиперхромный эффект увеличивается при увеличении длины цепи. В зависимости от
препаратов ДНК гиперхромный эффект дает увеличение оптической плотности от 20 до 60
%. С помощью кривой плавления определяется интервал плавления (ΔT) и температура
плавления ДНК (Тn). Денатурация ДНК наблюдается в узком интервале температур, который
свидетельствует о высокой кооперативности процесса. Величина ΔТ отображает
гетерогенность ДНК за составом и уменьшается при наличии денатурированных участков.
Препараты ДНК из разных типов клеток характеризуются разной температурой
плавления. Экспериментально было показано, что Тn линейно зависит от количества Г - Ц
пар в ДНК. Мармур и Доти пор предложили формулу, которая связывает содержимое Г - Ц
пар в ДНК (δ) из Тn (Тn как правило, не зависит от молекулярной массы. ДНК):
δ = 2,44 Тп - 834 (%)
45
При охлаждении нагретых образцов ДНК оптическая плотность уменьшается. Это гипохромный эффект. Восстановление комплементарной спиральной структуры ДНК
называется ренатурацией. Для того, чтобы проверить, состоялась ли ренатурация ДНК,
раствор, который содержит ДНК, нагревают повторно. Если гиперхромный эффект есть
таким же резким, с тем же интервалом плавления, тогда считают, что ренатурация была
полной. Если переход размыт в большом интервале температур, то произошло
неспецифическое спаривание оснований.
Таким образом, УФ-спектрофотометрия во многих случаях является простым
методом для изучения структурной организации белков и нуклеиновых кислот.
Лабораторная работа № 25
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ НУКЛЕОТИДОВ
ПО ВАСИЛЕНКО, КАМЗОЛОВОЙ И КНОРРЕ
Метод определения основывается на прямом спектрофотометричному определении
нуклеотидов в растворе при девяти разных длинах волн со следующим расчетом отдельных
нуклеотидов по специальными коэффициентами (табл. 1). Метод применяют для
сравнительно чистых препаратов РНК.
Реактивы: РНК
Гидроксид калия, 0,5 н
Соляная кислота, 0,1 н
Ход определения
Навеску РНК гидролизуют в 0,5 н растворе КОН при 37°С на протяжении 18 ч,
подкисляют 0,1 н раствором НСІ, и полученный гидролизат используют для
спектрофотометрического анализа.
Хотя для этого метода характерно быстрота выполнения и небольшое количество
стадий определения нуклеиновых кислот, тем не менее, его использование ограничивается в
связи с тем, что он нуждается в чистых препаратах нуклеиновых кислот и в определенных
концентрациях. Значительные колебания концентраций приводят к потере воспроизведения
результатов.
Таблица 1
Коэффициенты перерасчета концентраций нуклеотидов
Длина волны, нм
Нуклеотиды
А
Т
Г
Ц
255,0
-0,102722
+0,137335
-0,076828
+0,064128
257,5
+0,086134
+0,024500
-0,011923
-0,117505
260,0
-0,388802
+0,190198
-0,121019
+0,437638
265,0
+0,648962
-0,355113
+0,204348
-0,629913
270,0
+0,413094
-0,285994
+0,163068
-0,356251
275,0
-0,899523
+0,311530
-0,198800
+0,341192
280,0
-0,374961
+0,177533
-0,081681
+0,380892
285,0
+0,521705
-0,156474
+0,138982
+0,659304
290,0
+0,234601
-0,026770
+0,054940
-0,345770
46
Пример рассчета. Для адениловой кислоты найдены такие значения оптических
плотностей при указанных длинах волн: 0,740; 0,780; 0,799; 0,798; 0,756; 0,691; 0,600; 0,486;
0,360. Итак, концентрация адениловой кислоты в растворе будет равна:— (0, 102722·0, 740) +
(0, 0861340, 780)-0,388802·0,799) + (0,648962·0,798) + +(0,413094·0,756) — (0,899523·0,691)
—(0,37496 1·0,600)+ (0,521705·0,486) + +(0,234601·0,360) = 2,14·103 мкмоль/мл.
Лабораторная работа № 26
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИПЕРХРОМНОГО И ГИПОХРОМНОГО ЭФФЕКТА
НУКЛЕИНОВІХ КИСЛОТ РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Реактивы: Раствор ДНК
Ход определения
В 6 пробирок добавляют: в первую, другую и третью - по 4 мл 0,002 % раствора ДНК
селезенки быка в 0,2 М растворе NaCl, в четвертую, пятую и шестую -по 4 мл 0,002 %
раствора ДНК из гороха посевного в 0,2 М растворе NaCI. Измеряют экстинкцию всех проб
на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 260 нм. Затем другую и пятую пробирки
ставят на водяную баню при 50°С на 10 минут, а 3 и 6 - кипятят на протяжении 10 минут. Все
пробы спектрофотометруют. Затем все пробирки охлаждают под струей воды до
комнатной температуры и через 10 минут снова спектрофотометруют.
Данные оптической плотности занести в таблицу:
Вариант
Животная ДНК
50 °С
100 °С
Растительная ДНК
50 °С
100 °С
Нативная ДНК
Нагревание
Охлаждение
Гиперхромный и гипохромный эффекты рассчитывают по формулам:
Гипер. Е. = (Еднк нагр. - Еднк натив.) · 100 % Еднк натив.
Гипо. Е. = (Еднк нагр. - Еднк охложд.) · 100 % Еднк охложд.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ:
1.
Расскажите о локализация нуклеиновых кислот в клетке.
2.
Какова структура пуриновых оснований. Представители.
3.
Какова структура пиримидиновых оснований. Представители.
4.
Перечислите минорные основания пуринового ряда.
5.
Перечислите минорные основания пиримидинового ряда.
6.
Какие таутомерные формы ОН-содержащих азотистых оснований.
7.
Назовите качественную реакция на азотистые основания.
8.
Охарактеризуйте углеводный компонент нуклеиновых кислот. Качественные
реакции на этот компонент.
9.
N,β –гликозидная связь нуклеозидов. Примеры.
10. Мононуклеотиды. Образование фосфодиэфирной связи. Качественная реакция
на фосфатный компонент.
11. Циклические нуклеотиды.
47
12.
13.
14.
Первичная структура нуклеиновых кислот.
Вторичная структура нуклеиновых кислот.
Правила Чаргаффа.
КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ, ПРИОБРЕТЕННЫХ НА ЛАБОРАТОРНЫХ
ЗАНЯТИЯХ ПО РАЗДЕЛУ «ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ» (4 часа)
Ответить на контрольные вопросы:
Охарактеризуйте функции нуклеиновых кислот.
Опишите механизм гипер- и гипохромного эффектов.
Охарактеризуйте особенности первичной структуры ДНК и РНК.
Охарактеризуйте принцип комплементарности и его реализацию в структуре
ДНК.
5. Каковы параметры двойной спирали ДНК для модели Уотсона и Крика, А и В
форм?
6. Опишите особенности структуры и функций тРНК.
7. Охарактеризуйте таутомерию азотистых оснований.
8. Как определить нуклеотидную последовательность ДНК?
9. Опишите вторичную структуру РНК.
10. Охарактеризуйте физико-химические свойства нуклеиновых кислот.
11. Опишите азотистые основания пуринового ряда: структуру и свойства.
12. Опишите азотистые основания пиримидинового ряда: структуру и свойства.
13. Охарактеризуйте третичную структуру ДНК.
14. Что собой представляет процесс денатурации ДНК?
15. Опишите минорные основания нуклеиновых кислот.
16. Какие качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот Вы знаете?
17. Опишите виды нуклеиновых кислот и их локализацию в клетке.
18. Охарактеризуйте третичную структуру РНК.
19. Что собой представляет макромолекулярная структура нуклеиновых кислот?
20. Охарактеризуйте структуру и биологические функции циклических нуклеотидов.
I.
1.
2.
3.
4.
II. Определите компоненты предложенных растворов
Определяемые
компоненты
Углеводный
компонент
Реакции
Раствор №1
Результат исслед-я
Основание
Неорганический
фосфор
Вывод
48
Раствор №2
Результат исслед-я
ЛИТЕРАТУРА
1. Биологическая химия: Практикум / Под общ. Ред. Ю.В. Хмелевского. – К.:Вища
школа., Головное изд-во, 1985. – 208 с.
2. Біологічна хімія: Лабораторний практикум / За заг. ред. проф. Я.І. Гонського. –
Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – 288 с.
3. Біохімія: Підручник / М.Є. Кучеренко та ін.. – К.: Либідь, 1995. – 464 с.
4. Горячковский А.И. Справочное пособие по клинической биохимии.-Одесса:
ОКФА, 2005.- 616 с.
5. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. – Ростов – на – Дону: Феникс, 1999. –
544 с.
6. Кучеренко Н. Е., Бабенюк Ю. Д., Васильев А. Н. Биохимия (практикум). - Киев.:
Вища школа, 1988. - 128 с.
49
Составители:
Доц. Запорожченко А.В.,
Проф. Петров С.А.,
Доц. Чернадчук С.С.,
Доц. Захариева З.Е.,
Доц. Федорко Н.Л,
Доц. Вовчук И.Л.,
Доц. Сорокин А.В.,
Доц. Будняк А.К.
50