А. Аконитатгидратазы

ЛЬВОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ ДАНИЛЫ ГАЛИЦКОГО
КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ
ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ
(для студентов медицинского факультета)
Часть І
ЛЬВОВ 2012
Методические указания подготовили:
доц. Фартушок Н. В., доц. Макаренко Т.Н., в.о.доц. Кобылинская Л.И.,
ас. Хаврона О. П., ас. Фоменко И. С., ас. Федевич Ю. М., ас. Мазур О.Э.
Под редакцией акад. УАН, д - ра мед. наук, проф. Склярова А. Я.
Рецензент:
проф.
кафедры
биоорганической,
бионеорганической
и
фармацевтической химии Львовского национального медицинского
университета имени Данилы Галицького
проф. Музыченко В. О.
Утверджено на заседании методической комиссии по химическим дисциплинам
и физике фармацевтического факультета Львовского национального
медицинского университета им. Данилы Галицкого
от „3” 05 2007 г.
протокол № 2
2
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая химия относится к фундаментальных медицинским
дисциплинам. Знание биохимических процессов, происходящих на разных
уровнях организации – клеточном, органном, тканевом и целого организма –
необходимы студентам-медикам как для понимания метаболических процессов
обмена веществ, энергии, протекания реакций катаболизма и анаболизма,
передачи
наследственной
информации,
процессов,
обеспечивающих
физиологические функции, так и для интерпретации клинических
биохимических показателей с диагностической или прогностической целью.
Согласно программе по биологической и биоорганической химии,
разработанной на основании положений Европейской кредитно-трансферной
системы (ECTS) для студентов высших учебных заведений образования
Украины ІІІ – IV уровней аккредитации, биологическая химия представлена
четырьмя модулями. Соответственно, каждый модуль включает определенное
количество cодержательных модулей и учебных часов: на лекционный курс
выделено 40 час.; на практические занятия – 120 час.; на самостоятельную
работу студентов – 50 час., что соответствует 7 кредитам ECTS.
На каждом практическом занятии студенты должны усваивать
определенный программой учебный материал, проводить определение
различных веществ и интерпретировать их биологическую роль. К каждому
содержательному модулю студентам предложены темы для индивидуальной
самостоятельной работы и тесты.
Существенное внимание при изучении биологической химии уделяется
клиническим аспектам – наследственным и приобретенным нарушениям
обмена веществ, энзимопатиям, вопросам использования энзимов в качестве
фармпрепаратов, а также патохимическим процессам, характерным для
сахарного диабета, атеросклероза, ревматизма, инфаркта миокарда,
заболеваний пищеварительной системы и др.
Для лучшего овладения учебным материалом студентам рекомендуется
использовать современные учебники и пособия, подготовленные ведущими
специалистами Украины и сотрудниками кафедры биохимии Львовского
национального медицинского университета.
Конечные цели при изучении учебной дисциплины „Биологическая и
биоорганическая химия” определяются тем, что студент в своей будущей
профессиональной деятельности должен уметь:
 Анализировать соответствие структуры биоорганических веществ
физиологическим функциям организма человека
 Интерпретировать особенности физиологического состояния организма и
развития патологических процессов на основании лабораторных
исследований.
 Анализировать
реакционную
способность
углеводов,
липидов,
аминокислот, обеспечивающую их функциональные свойства и
метаболические превращения в организме.
3
 Интерпретировать особенности строения и превращений в организме






человека ряда биоорганических соединений как основы их
фармакологического действия в качестве лекарственных средств.
Интерпретировать
биохимические
механизмы
возникновения
патологических процессов в организме человека и принципы их
коррекции.
Объяснять основные механизмы биохимического действия и принципы
направленного использования разных классов фармакологических
средств.
Объяснять биохимические и молекулярные основы физиологических
функций клеток, органов и систем организма человека.
Анализировать функционирование ферментативных процессов, которые
происходят в мембранах и органеллах для понимания интеграции обмена
веществ.
Классифицировать результаты биохимических исследований и изменения
биохимических, ферментативних и неферментативных показателей,
которые используются для диагностики наиболее распространенных
болезней человека.
Интерпретировать значение биохимических процессов обмена веществ и
их регуляции в обеспечении функционирования органов, систем и целого
организма человека.
Методические указания созданы на основе программы учебной
дисциплины „Биологическая и биоорганическая химия” (Киев, 2005) с учетом
особенностей преподавания на кафедре биохимии ЛНМУ имени Данилы
Галицкого.
4
МОДУЛЬ 2. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
Тематический план практических занятий модуля 2
№
п/п
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Темы занятий
Контроль начального уровня знаний. Предмет и задания
биохимии. Цель и методы проведения биохимических
исследований;
их
обоснование
и
клиникодиагностическое значение.
Исследование строения и физико-химических свойств
белков-ферментов. Освоение методов определения
ферментов в биологических обьектах.
Определение активности ферментов, исследование
механизма их действия и кинетики ферментативного
катализа.
Исследование регуляции ферментативных процессов и
анализ
механизмов
возникновения
энзимопатий.
Медицинская энзимология.
Исследование роли кофакторов и коферментных
витаминов в каталитической активности ферментов.
Обмен
веществ
и
энергии.
Исследование
функционирования цикла трикарбоновых кислот.
Исследование процессов биологического окисления,
окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ.
Исследование действия ингибиторов и разобщителей
окислительного фосфорилирования.
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
Итоговый модульный контроль
Вместе
Кол-во
часов
Кол-во
баллов
3
15
3
15
3
15
3
15
3
15
3
15
3
15
3
15
10
3
27
Зачет
80
200
Задания для самостоятельной работы студентов (СРС)
№
п/п
Тема
Кол-во
часов
Подготовить реферат по истории развития биохимии:
становление биохимии как науки, основопологающие открытия
в области структуры и функциональной роли белков и
1
нуклеиновых кислот, направления развития современной
биохимии.
1. Подготовка к практическим занятиям:
1.1 Овладеть практическими навыками в вопросах регуляции метаболизма:
5
Подготовка материала (биологические жидкости, клетки,
субклеточные органеллы) к проведению биохимических
исследований.
Построение графиков зависимости скорости ферментативной
реакции от концентрации субстрата, изменений рН среды и
температуры.
Объяснять
механизм
превращения
субстратов
при
каталитическом действии ферментов.
Представление структурных формул коферментных витаминов
и объяснение механизмов образования их биологически
активных (коферментных) форм.
Объснять механизм протекания ферментативных реакций с
участием коферментов.
Приобрести практические навыки по молекулярным
биоэнергетики:
Воспроизведение последовательных этапов общих путей
катаболизма белков, углеводов и липидов.
Представление последовательности реакций превращения
1.2 интермедиатов в цикле трикарбоновых кислот.
Нарисовать схему и объяснить строение и механизм действия
электронтранспортной цепи в митохондриях.
Объяснять на основании положений хемиоосмотической
теории
механизм
спряженности
окисления
и
фосфорилирования, синтеза АТФ в дыхательной цепи.
Индивидуальная СРС по выбору (индивидуальное задание) – по
2.
темам рефератов, представленным в содержательных модулях.
3. Подготовка к итоговому контролю усвоения модуля 2.
Вместе
0,5
0,5
0,5
1
1
основам
0,5
0,5
0,5
1
1
3
10
При изучении темы по традиционной системе студенту присваиваются
баллы: „5” – 15 балов, „4” – 12 балов, „3” – 9 балов, „2” – 0 балов.
Максимальное количество баллов за поточную учебную деяльность
студента – 120.
Студент допускается к итоговому модульному контролю при условии
выполнения учебной программы и при условии, если за поточную учебную
деяльность он набрал не меньше 72 балов (9 ×·8 = 72).
Итоговый модульный контроль засчитывается студенту, если он
демонстрирует необходимый уровень практических навычек и набрал при
выполнении модульного контроля не меньше 50 баллов.
6
МОДУЛЬ 2. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МЕТАБОЛИЗМА.
Смысловой модуль
компоненты клеток.
№
5.
Введение
в
биохимию.
Биохимические
Тема № 1. Предмет и задачи биохимии. Цель и методы проведения
биохимических исследований; их обоснование и клинико-диагностическое
значение.
Цель занятия: Ознакомить студентов с предметом и задачами
биологической химии и ее практическим использованием, методами
биологических исследований, используемыми в клинической практике.
Овладеть некоторыми физико-химическими методами исследований
биологически важных веществ, а также ознакомиться с аппаратурой,
используемой в биохимии. Получение результатов биохимических
исследований необходимо для объяснения механизмов функционирования
органов, тканей в норме и при патологии, для постановки диагноза,
мониторинга хода заболевания и эффективности лечения. Знать факторы,
которые приводят к ошибкам в биохимических исследованиях.
Актуальность темы: Биохимия – это наука, которая изучает химический
состав живых организмов, строение, свойства, локализацию и роль имеющихся
у них соединений, пути их возникновения и превращения, а также присущие
живой клетке химические процессы, в совокупности обеспечивающие обмен
веществ и превращения энергии.
Биохимия открывает путь к решению основных вопросов природоведения
и медицины, в частности, проблемы синтеза белков, долголетия.
В биохимических исследованиях используются современные физикохимические, физические и математические методы. Биохимические показатели
используются для диагностики, лечения и профилактики заболеваний.
Конкретные задачи:
 Знать
этапы и закономерности становления биохимии как
фундаментальной медико-биологической науки и учебной дисциплины;
 Знать принципы методов биохимических исследований функционального
состояния организма человека в норме и при патологии;
 Использовать результаты биохимического анализа для оценки состояния
определенных звеньев обмена веществ;
 Уметь определить оптическую плотность окрашенных растворов при
разных длинах волн на фотоэлектроколориметре. Правильно
интерпретировать полученные результаты.
Теоретические вопросы
1. Предмет и задачи биохимии. Основные направления и разделы биохимии:
статическая, динамическая, функциональная биохимия, медицинская и
клиническая биохимия.
7
2. Биохимия как фундаментальная медико-биологическая наука. История
развития, научные биохимические школы, значение в системе высшего
медицинского образования.
3. Вклад ученых кафедры биохимии Львовского национального медицинского
университета в развитие биологической химии.
4. Достижения биохимии, молекулярной биологии, биотехнологии и генной
инженерии в установлении молекулярных механизмов патогенеза болезней,
диагностике и лечении основных заболеваний человека: сердечнососудистых, онкологических, инфекционных и т.д.
5. Химический состав живого организма. Характерные черты живой материи:
обмен веществ и энергии, их связь с внешней средой.
6. Структурные элементы про- и эукариотических клеток, их фракционное
разделение методом ультрацентрифугирования. Биомолекулы, их
биохимические функции.
7. Основные методы биохимических исследований:
 осаждение веществ из раствора, высоливание белков;
 оптические
методы
в
биохимии
(фотоэлектроколориметрия,
спектрометрия, спектрофотометрия, флюоресцентный анализ);
 электрофорез (горизонтальный, диск-электрофорез, изоэлектрическая
фокусировка, иммуноэлектрофорез);
 хроматография (афинная, ионообменная, тонкослойная, газовая, гельхроматография);
 полярография;
 манометрический и радиоизотопный методы;
 иммуноферментные методы.
8. Цель проведения биохимических лабораторных исследований.
9. Критерии оценки результатов изучаемых методов лабораторных
исследований.
10. Материал для лабораторных диагностических исследований.
11. Принципы забора и сохранения материала для лабораторных
исследований.
12. Ошибки, имеющие место во время проведения лабораторных
исследований.
Научные направления работы кафедры биохимии ЛНМУ
Более 100 лет прошло со времени создания кафедры биологической химии
Львовского национального медицинского университета имени Данилы
Галицкого. Ее возглавил профессор Станислав Бондзинский, развернувший
большую педагогическую и научную деятельность.
Темой научной работы кафедры были так называемые оксипротеиновые
кислоты – продукты белкового характера, которые в небольшом количестве
выделяются с мочой, а также исследования желчных пигментов и продуктов их
обмена.
8
С 1922 года кафедрой заведовал профессор Яков Парнас. Под его
руководством было изучено ряд актуальных вопросов биохимии, в частности,
исследованы процессы анаэробного обмена углеводов, которые в современной
биохимической литературе носят название теории Эмбдена-МейергофаПарнаса. Под его руководством на кафедре изучались процессы обмена
адениловой кислоты в мышцах и ее роль в образовании аммиака. Я. Парнас
впервые применил радиоактивные изотопы в биохимических исследованиях.
В 1944 году заведующим кафедрой стал профессор Богдан Собчук.
Основные направления научной работы кафедры под его руководством – обмен
углеводов в злокачественных опухолях, действие оксида углерода (II) на
гемсодержащие белки, а также изучение биохимических процессов при разных
патологиях организма человека.
С 1974 года кафедрой руководил профессор Михаил Шлемкевич. Под его
руководством на кафедре биохимии в тесном сотрудничестве с кафедрой
онкологии изучали индивидуальную чувствительность раковых опухолей
желудка человека при применении химиотерапии; исследовали механизмы
развития их резистентности при этом; изучали особенности нуклеинового и
углеводного обменов в злокачественных клетках. В исследованиях были
использованы фармацевтические препараты, меченные радиоактивными
изотопами.
На кафедре проводились также эксперименты с целью изучения изменений
в углеводном и нуклеиновом обменах при отравлении угарным газом, были
предложены новые методы изучения монооксида углерода в воздухе,
карбоксигемоглобина крови.
С 1995 года кафедру возглавил профессор Михаил Тимочко. Основными
направлениями работ, выполняемых под его руководством, были изучение
влияния вредных экологических факторов на функции органов
пищеварительной системы, исследование роли энергетического обмена в
патогенезе хронических заболеваний печени, сердечно-сосудистой системы,
определение степени риска в абдоминальной и эндокринной хирургии,
определение уровня интоксикации у онкологических больных, изучение
процессов липопероксидации и состояния антиоксидантной системы в
эксперименте и клинике.
С 1998 года кафедрой руководит профессор Александр Скляров. На
кафедре проводятся исследования по изучению влияния стресса на
цитопротекторные и ульцерогенные механизмы слизистой оболочки органов
пищеварительной системы, метаболические и ионно-транспортные процессы,
влияние экзоэкологических факторов на эндоэкологическое состояние
внутренней среды живых организмов, разработка новых методов
биохимических исследований и биохимических критериев, используемых при
диагностике разных заболеваний.
9
Практическая работа
Определение оптической плотности окрашенных растворов в зависимости
от их концентрации.
Каждое вещество имеет свой спектр поглощения с максимумом при
определенной длине волны. Поэтому концентрации растворов разных веществ
измеряют при длине волны, отвечающей максимуму поглощения.
Опыт 1. Измерить оптическую плотность (А) раствора, содержащего
разное количество фосфора.
Принцип метода. Фосфаты в растворе сульфатной кислоты образуют с
молибдатами фосфорно-молибденовые комплексы, которые восстанавливаются
до молибденовой сини. Количество фосфатов определяют колориметрически
(по интенсивности окраски) по реакции образования комплексной фосфорномолибденовой кислоты и ее восстановления до молибденовой сини.
Материальное обеспечение: стандартный раствор фосфора 0,32 ммоль
/1мл, молибденовый реактив, пробирки, пипетки, фотоэлектроколориметр
(ФЭК).
Ход работы: В пять пробирок вносят растворы в количествах,
приведенных в таблице ниже:
№
п/п
1
2
3
4
5
Название реактивов
Стандартный раствор фосфора 0,32
ммоль /1мл (в мл)
Дистиллированная вода (в мл)
Молибденовый реактив (в мл)
Концентрация фосфора, ммоль/мл
Оптическая плотность (внести
полученные результаты)
№ пробирки
1
2
3
4
5
-
0,5
1,0
2,0
3,0
5,0
5,0
0
4,5 4,0 3,0 2,0
5,0 5,0 5,0 5,0
0,16 0,32 0,64 0,97
Растворы смешивают и не раньше, чем через 2 мин, но не позже, чем через
5 мин, измеряют оптическую плотность на ФЭКе, используя красный
светофильтр. По результатам измерений строят график зависимости
оптической плотности от концентрации фосфора в ммоль/мл.
Сделать вывод. Объяснить влияние концентраций веществ на значение их
оптической плотности.
Опыт 2. Определение наличия белков в растворе методом осаждения
сульфосалициловой кислотой.
Принцип метода. Белки легко осаждаются из водного раствора
минеральными, органическими кислотами и солями тяжелых металлов.
Денатурация и осаждение белка кислотами обусловливается нейтрализацией
10
поверхностного заряда коллоидных частиц белка, разрушением гидратной
оболочки белковых молекул и образованием комплексных солей белка с
кислотами. Тяжелые металлы образуют стойкие комплексы с SH-группами
белков, что вызывает изменение структуры и потерю растворимости белка.
Особенно чувствительной реакцией на наличие белка в растворе является
осаждение
трихлоруксусной
и
сульфосалициловой
кислотами
(чувствительность последней реакции составляет 1:50000). Кроме того,
сульфосалициловая кислота наряду с высокомолекулярными белками, способна
осаждать низкомолекулярные белки и продукты распада белков – полипептиды
и олигопептиды.
Материальное обеспечение: пробирки, раствор белка, 20 %-ный раствор
сульфосалициловой кислоты.
Ход работы: В пробирку вносят 1,0 мл исследуемого раствора белка и
добавляют 3 – 5 капель 20 %-го раствора сульфосалициловой кислоты.
Наблюдают за образованием осадка белка.
Клинико-диагностическое значение. Реакция с сульфосалициловой и
трихлоруксусной
кислотами
используется
для
качественного
и
количественного определения белка в моче.
Способность белка связывать ионы тяжелых металлов используется в
клинической практике. Белок используют в качестве противоядия при
отравлениях солями ртути, свинца и т.п. В случае отравления солями тяжелых
металлов больному дают большое количество белка (яичного белка или
молока). В желудке образуются нерастворимые комплексы металлов с белками,
в результате чего прекращается всасывание яда в кровь, ослабляется
интоксикация и усиливается их выведение из организма.
Опыт 3. Количественное определение белка в исследуемом растворе
путем измерения оптической плотности колориметрическим методом
(Биуретовая реакция).
Принцип метода. Биуретовая реакция – характерная реакция на
соединения, содержащие в своем составе не меньше двух пептидных связей.
Такие соединения в щелочной среде образуют с меди сульфатом (медным
купоросом) комплекс, окрашенный в розово-фиолетовый цвет. В образовании
этого комплекса принимают участие пептидные связи в енольной форме.
Биуретовая реакция служит доказательством наличия пептидных связей в
белках и пептидах.
Материальное
обеспечение:
сыворотка
крови,
калий-натрий
виннокислый, меди сульфат, 0,9 % раствор NаCl, 10 % раствор NAOH, мерные
пробирки, пипетки на 1, 2 и 10 мл, ФЭК, биуретовый реактив: 0,15 г CuSO4 5
Н2О; 0,6 г калия-натрия виннокислого и 50 мл Н2О. К биуретовому реактиву
добавляют 30 мл 10 % раствора NаОН, 0,1 г калия иодида и доводят водой до
объема 100 мл (хранят в холодильнике в запарафинированной банке).
Ход работы: В первую пробирку вносят 0,1 мл 0,9 % раствора NаCl
(контроль), во вторую – 0,1 мл стандартного раствора белка (50 г/л), в третью,
11
четвертую и пятую пробирки – по 0,1 мл исследуемого раствора белка
(задачи). В каждую пробирку добавляют по 5 мл рабочего биуретового
реактива, перемешивают и через 30 мин. определяют экстинкцию с помощью
фотоэлектроколориметра в кювете толщиной 10 мм при зеленом светофильтре
(500 - 560 нм) против контроля. Появление розово-фиолетовой окраски
(биуретовая реакция) свидетельствует о наличии в растворе белка или
полипептидов. Интенсивность окраски изменяется в зависимости от
концентрации белка в растворе.
Расчет проводят за формулой:
Х = (С  Ао) / Аст, где:
Х – концентрация веществ в опытной пробе, г/л;
С – концентрация веществ в стандартном растворе;
Ао – экстинкция исследуемого раствора (опыт);
Аст – экстинкция стандартного раствора белка (контроль).
Объяснить полученный результат. Сделать вывод. Указать на способность
белков образовывать в щелочной среде с CuSO4 комплекс розово-фиолетовой
окраски.
Количественно белок можно определять в сыворотке или плазме крови с
помощью тестового набора реактивов полуавтоматическим биохимическим
анализатором „ Stat Faх 1904 plus”.
Клинико-диагностическое значение. Для количественного определения
белков
в
биологическом
материале
чаще
всего
применяют
фотоэлектроколориметрические и спектрофотометрические методы, в
некоторых случаях применяют фотонефелометрические методы, а также
определение белка по содержанию общего азота (азотометрия).
В клинико-биохимических лабораториях для установления диагноза
заболевания проводят определение концентрации белков в биологических
жидкостях организма (крови, моче, спинномозговой жидкости, экссудатах). В
норме содержание общего белка в сыворотке крови взрослых - 65-85 г/л (6,5-8,5
г %), в детей до 6 лет - 56-85 г/л (5,6-8,5 г %).
Фотоэлектроколориметрические методы определения количества белка
базируются на „цветных” реакциях, характерных для функциональных групп
белков: биуретовая реакция; микрометод определения количества белка с
помощью реактива Бенедикта; метод Лоури; метод Лоури в модификации
Святкина (метод используют для определения содержания белка в препаратах с
повышенным содержанием липо- и гликопротеинов); метод Флореса.
Ультраспектрофотометричний метод определения количества белка
базируется на способности ароматических радикалов тирозина, триптофана и в
меньшей степени – фенилаланина белков поглощать ультрафиолетовый свет с
максимумом поглощения при 280 нм.
Определение содержания белка сыворотки крови рефрактометрическим
методом основано на неодинаковой способности разных сред преломлять луч
света, проходящий через них. Отношение синуса угла падения света к синусу
угла преломления является постоянной величиной и называется показателем
12
преломления. Величина показателя преломления сыворотки крови зависит,
главным образом, от содержания в ней белка. Для определения показателя
преломления используют специальные приборы – рефрактометры.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Назвать оптические методы исследования, которые используются в
клинической биохимии:
А. Фотоэлектроколориметрические
D. Полярография
В. Афинная хроматография
Е. Иммуноферментный анализ
С. Флюоресцентный анализ
2. Для выявления функциональных групп (-SH -NH2, имидазольных) в белках,
ферментах используют такие методы исследования:
А. Электрофорез
D. Полярографию
В. Люминесцентный анализ
Е. Иммуноферментный анализ
С. Ионообменную хроматографию
3. Указать метод, который наиболее целесообразно использовать для
фракционирования белков:
А. Люминесцентный анализ
D. Полярографию
В. Электрофорез
Е. Иммуноферментный анализ
С. Ионообменную хроматографию
4. Из биологической жидкости путем высоливания выделили белок, который
будет использован для лечения. Каким методом можно очистить его от
низкомолекулярных примесей?
А. Секвенацией
D. Электрофорезом
В. Денатурацией
Е. Диализом
С. Высоливанием
5. В сыворотке крови больного пиелонефритом обнаружены изменения в
соотношении белковых фракций. Укажите, каким методом можно разделить на
фракции белки плазмы крови?
Примеры тестов „Крок-1”
1. Для количественного разделения и определения относительного содержания
каждой аминокислоты в гидролизате белков используют:
А. Электрофорез
D. Ультрацентрифугирование
В. Распределительную хроматографию
Е. Гель-фильтрацию
С. Ионообменную хроматографию
2. Врач назначил пациенту анализ белковых фракций крови. В лаборатории был
использован метод электрофореза. Какое свойство белков дает возможность
применять данный метод?
13
А. Способность к набуханию
В. Оптическая активность
С. Высокое онкотическое давление
D. Наличие электрического заряда
Е. Высокая вязкость
3. В клинику доставлен больной в тяжелом состоянии после отравления солями
свинца. Какое из перечисленных веществ может применяться как акцептор
свинца и таким образом уменьшать интоксикацию организма?
А. Воду
D. Раствор глюкозы
В. Аналгетики
Е. Физиологический раствор
С. Раствор белка
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. История развития биохимии: становление биохимии как науки, направления
развития современной биохимии.
2. Основополагающие открытия в отрасли структуры и функциональной роли
белков и нуклеиновых кислот.
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко – діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ – Тернопіль, Укрмедкнига, 2000. – 508с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль,
Укрмедкнига, 2002.-744с.
4. Практикум із біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. –
297 с.
5. Біологічна хімія. Тести і ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
6. Клінічна біохімія/ За ред. проф. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2006. – 485 с.
Дополнительная:
1. Ангельські С., Якубовські З, Домінічак М. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998.
– 451 с.
2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. –
528 с.
3. Бышевский А.Ш., Терсенов А.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург:
Уральский рабочий, 1994. – 384 с.
4. Владика А. Особливості визначення загального білка сироватки крові //
Клініко-лабораторна діагностика. – 1995. – № 3. – С. 10-12.
5. Клиническая биохимия: Учебное пособие для вузов / Бочков В.Н.,
Добровольский А.Б., Кушлинский Н.Е. и др. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 521
с.
6. Кучеренко Г. Є., Бабенюк Ю. Д., Войціцький В. М. Сучасні методи
біохімічних досліджень. – Київ: Фітосоціоцентр, 2001. – 424 с.
7. Строев Е .А. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1986. – 479 с.
14
Смысловой модуль
метаболизма.
№
6.
Ферменты
и
коферменты.
Регуляция
Тема № 2. Исследование строения и физико-химических свойств белковферментов. Овладение методами выявления ферментов в биологических
объектах.
Цель занятия: Усвоить принципы организации и общие свойства
ферментов. Овладеть методом определения активности амилазы слюны и на ее
примере изучить влияние температуры и рН среды на активность ферментов.
Актуальность темы: Ферменты - это биологические катализаторы
белковой природы, которые обеспечивают ускорение и координацию
многочисленных метаболических процессов в живых организмах. Существуют
тысячи ферментов, которые катализируют отдельные химические превращения
или группы родственных реакций. Ферменты различаются по своему строению,
наличию небелковых компонентов, локализации, разным физико-химическим,
каталитическим свойствам. Активность ферментов может изменяться в
широких границах в зависимости от многочисленных внутренних и внешних
факторов.
Конкретные задания:

Трактовать
биохимические
закономерности
строения
и
функционирования разных классов ферментов.

На основе понимания физико-химических свойств белковферментов объяснять зависимость активности ферментов от рН среды,
температуры и других факторов.

Анализировать активность ферментов плазмы крови в зависимости
от их внутриклеточной и тканевой (органной) локализации.

Анализировать методы выявления активности ферментов с целью
их оптимального применения в клинико-лабораторном анализе.
Теоретические вопросы
1. Ферменты как биологические катализаторы реакций обмена веществ.
2. Физико-химические свойства белков-ферментов: электрохимические
(поверхностный заряд молекулы) свойства, растворимость, термодинамическая
стабильность белковых молекул-ферментов, осаждение, денатурация,
взаимодействие с лигандами и их функциональное значение.
3. Простые и сложные белки-ферменты, небелковые группы сложных белковферментов (кофакторы, коферменты, простетические группы).
4. Строение ферментов: активный, регуляторный (аллостерический) центры.
5. Уровни структурной организации ферментов. Мультиферментные
комплексы, ферментативные ансамбли, полифункциональные ферменты, их
преимущества.
15
6. Номенклатура и классификация ферментов. Типы реакций, которые
катализируют отдельные классы ферментов.
7. Свойства ферментов:
 зависимость активности ферментов от рН среды;
 зависимость активности ферментов от температуры.
8. Специфичность ферментов, ее виды. Привести примеры.
9. Внутриклеточная локализация ферментов.
10. Тканевая (органная) специфичность ферментов.
11. Методы определения ферментов в биологических объектах (кровь, слюна,
моча, отдельные ткани).
Практическая работа
Опыт 1. Выявление амилазы в слюне (реакция с йодом).
Принцип метода. Амилаза относится к классу гидролаз - ферментов,
которые катализируют разрыв химических связей с присоединением молекулы
воды. Амилаза слюны катализирует гидролиз крахмала (разрыв гликозидных
связей) через стадию образования декстринов к дисахариду мальтозе, о чем
свидетельствует положительная реакция крахмала с йодом и реакция Троммера
на мальтозу. Крахмал образует с йодом комплекс синего цвета и не дает
окраски в реакции Троммера, поскольку не содержит свободных альдегидных
групп. Мальтоза содержит свободную альдегидную группу, поэтому ее можно
обнаружить с помощью пробы Троммера.
Материальное обеспечение: 0,5 % раствор крахмала, 0,1 % І2 в КІ, 10 %
раствор NaOH, 5 % раствор CuSO4, дистиллированная вода, газовая горелка,
пробирки, пипетки, штатив.
Ход работы. Для получения разведенной слюны ротовую полость слегка
прополаскивают водой, набирают новую порцию дистиллированной воды и
прополаскивают ею рот на протяжении 1-2 мин. Собранную в пробирку
жидкость используют для анализа.
Чтобы убедиться в том, что крахмал с йодом дает синюю окраску, в
пробирку вносят 10 капель раствора крахмала и добавляют 2 капли раствора I2
в KI. Наблюдают положительную реакцию.
В штатив ставят 10 пробирок и наливают в каждую по 2 мл
дистиллированной воды и по одной капле раствора І2 в KI.
В отдельную пробирку наливают 5 мл 0,5 % раствора крахмала,
добавляют 1 мл разведенной слюны, содержание пробирки перемешивают
(наблюдается опалесценция). Из этой пробирки каждых 60 секунд отбирают по
0,5 мл жидкости и вносят по очереди в пробирки № 1, 2, 3 и т.д., которые были
приготовлены с раствором І2 в KI. Если в первой пробирке наблюдают
фиолетовую или красную окраску, то интервал между забором сокращают до
30 секунд.
Если следующая проба не изменяет желтого цвета раствора йода,
гидролиз крахмала считается законченным. Отмечают время. Наблюдают
16
исчезновение опалесценции раствора в процессе гидролиза. Через 10 мин.
проводят пробу Троммера.
Для проведения пробы Троммера к содержанию пробирки с реактивной
смесью добавляют равный объем 10 % раствора NaOH и 5-7 капель 5 %
раствора CuSO4. Верхнюю часть пробирки осторожно нагревают на открытом
огне до кипения, реакция Троммера является положительной, если исчезает
синий цвеи и появляется желто-красный осадок.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Опыт 2. Исследование термолабильности амилазы слюны.
Принцип метода. Метод базируется на способности крахмала при
взаимодействии с йодом изменять цвет с белого на синий. Продукт
расщепления крахмала - мальтоза - с йодом синей окраски не дает, ее можно
обнаружить при помощи пробы Троммера.
Материальное обеспечение: 0,5 % р-р крахмала, 0,1 % раствор І2 в KІ,
10 % р-р NaOH, 5 % р-р CuSO4, разведенная слюна, газовая горелка, водяная
баня, холодная вода (лед), штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы. В пробирку вносят 2 мл разведенной слюны и кипятят на
открытом огне на протяжении 2 мин. Содержание пробирки охлаждают. В три
других пробирки вносят по 5 мл 0,5 % р-ра крахмала. В пробирку № 1
добавляют прокипяченую слюну, а в пробирки № 2 и № 3 по 2 мл разведенной
некипяченой слюны. Пробирку № 2 ставят на 10 мин на водяную баню при
температуре 37С. Пробирку № 3 помещают на 10 мин в холодную воду. После
инкубации содержание каждой пробирки разделяют поровну. К отобранным
пробам добавляют по 3-5 капель р-ра І2 в KІ и наблюдают за изменением
окраски. С пробами, которые остались проводят реакцию Троммера (см. опыт
№ 1).
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Опыт 3. Изучение специфичности действия амилазы слюны и
сахаразы дрожжей.
Принцип метода. Специфичность действия является одним из наиболее
характерных свойств ферментов и заключается в том, что каждый фермент
действует на определенный субстрат или группу субстратов, которые имеют
похожую структуру. Различают абсолютную, относительную (групповую) и
стереоспецифичность. Высокая специфичность ферментов обусловлена их
белковой природой и структурой активного центра.
Амилаза слюны расщепляет крахмал до дисахарида - мальтозы и не
расщепляет дисахарид - сахарозу, сахараза расщепляет сахарозу на глюкозу и
фруктозу и не гидролизует крахмал. Степень гидролиза субстратов оценивают
по результатам реакции Троммера. Мальтоза содержит свободную альдегидную
группу, поэтому при реакции с реактивом Троммера синий цвет изменяется на
красный, а сахароза не содержит свободной альдегидной группы, потому не
дает положительной реакции.
17
Материальное обеспечение: 1 % р-р крахмала, препарат сахаразы
дрожжей, 1 % раствор сахарозы, 0,1 % раствор І2 в KІ, 10 % р-р NaOH, 5 % р-р
CuSO4, разведенная слюна, газовая горелка, водяная баня, штатив с
пробирками, пипетки.
Ход работы.
1. Специфичность амилазы: в две пробирки (№1, №2) помещают по 1 мл
разведенной в два раза слюны. В пробирку № 1 добавляют 2 мл 1 % раствора
крахмала, в пробирку № 2 - 2 мл 1 % раствора сахарозы. Обе пробирки ставят в
термостат при t=37C на 15 мин. По окончании инкубации в обеих пробирках
проводят реакцию Троммера.
2. Специфичность сахаразы дрожжей: в две пробирки (№3, №4) помещают
по 1 мл препарата сахаразы дрожжей. В пробирку № 3 добавляют 2 мл 1 %
раствора сахарозы, в пробирку № 4 - 2 мл 1 % раствора крахмала. Обе пробирки
ставят в термостат при t = 37C на 15 мин. По окончании инкубации в обеих
пробирках проводят реакцию Троммера.
Результаты проведенного эксперимента заносят в таблицу:
№
пробирки
1
2
3
4
Фермент
Субстрат
Амилаза
Амилаза
Сахараза
Сахараза
Крахмал
Сахароза
Сахароза
Крахмал
Реакция Троммера
По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.
Клинико-диагностическое
значение.
Амилаза
синтезируется
преимущественно в слюнных и поджелудочной железах. Повышение
активности амилазы в крови наблюдается при панкреатите, перитоните,
тромбозе сосудов, в результате введения в организм ряда физиологически
активных соединений, в частности морфина, кодеина, кортикотропина (АКТГ)
и кортизола.
Повышение активности амилазы слюнных желез наблюдается при
стоматите, невралгии лицевого нерва, почечной недостаточности,
паркинсонизме. Снижение активности амилазы крови наблюдается при
психических заболеваниях, анацидных нарушениях. Снижение содержания
амилазы в слюне имеет место при гипосаливации, воспалении слюнных желез,
и т.д.
Опыт 4. Исследование влияния рН среды на активность амилазы
слюны.
Принцип метода. Метод основан на способности крахмала при
взаимодействии с йодом образовывать синюю окраску в условиях оптимальной
18
для амилазы рН среды. Продукт расщепления крахмала - мальтоза - с йодом
синий цвет не дает и ее можно обнаружить с помощью пробы Троммера.
Материальное обеспечение: 0,5 % р-р крахмала, 0,1 % раствор I2 в KI,
10% р-р NaOH, 5 % р-р CuSO4, разведенная слюна, газовая горелка, водяная
баня, штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы. В три пробирки вносят по 2 мл 0,5 % р-ра крахмала. В
первую добавляют 2 мл фосфатного буфера с рН 5,0, во вторую - с рН 7, а в
третью - с рН 9. В каждую из пробирок вносят по 1 мл разведенной слюны и
помещают их в водяную баню при температуре 37С.
После инкубации содержание каждой пробирки делят поровну. К первым
фракциям добавляют по 3-5 капель р-ра І2 в KI и наблюдают за изменением
окраски. С фракциями, которые остались проводят пробу Троммера (см. опыт
№ 1).
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Что происходит с ферментами в условиях высокой температуры?
А. Гидролиз
В. Денатурация
С. Образование фермент-субстратного комплекса
D. Блокировка активного центра
Е. Нарушение первичной структуры
2. Установить соотношение: Ферменты - Специфичность действия:
А. Химотрипсин
1 - стереоспецифичность
В. Уреаза
2 - групповая специфичность
С. Фумараза
3 - абсолютная специфичность
D. Пепсин
Е. Сахараза
3. Угнетение скорости ферментативной реакции при избыточной концентрации
субстрату связано:
А. Блокированием аллостерического центра
В. Денатурацией фермента
С. Насищением аллостерических центров
D. Насыщением активного центра
Е. Повышением температуры среды
4. Роль активного центра заключается в:
А. Регуляции активности ферментов
В. Прикреплении ферментов к мембранам
С. Связывании и превращении субстратов
D. Взаимодействии ферментов между собой
Е. Связывании аллостерических эффекторов
19
5. Фермент осуществляет перенос структурного фрагмента от одного субстрата
к другому с образованием двух продуктов. Назовите класс этого фермента.
А. Трансферазы
Д. Лигазы
В. Ізомеразы
Е. Гидролазы
С. Оксидоредуктазы
6. В чем заключается опасность избыточного повышения температуры тела?
7. Для сохранения трансплантантов их замораживают. Объясните смысл таких
действий.
8. Объясните термолабильность ферментов на примере определения амилазы
слюны, которая была предварительно нагрета или охлаждена, и амилазы
слюны, которая не была предварительно обработана.
9. У больного развился метаболический ацидоз. Как это повлияет на активность
внутриклеточных ферментов?
10. У некоторых людей отсутствуют гены, которые кодируют фермент лактазу.
Объясните, почему при употреблении такими людьми свежего молока
наблюдаются расстройства желудочно-кишечного тракта.
11. Докажите белковую природу ферментов биуретовой реакцией, реакцией
Фоля, методом формол-титрования за Серенсеном. Объясните принципы этих
методов.
12. Нарисуйте график зависимости скорости ферментативных реакций от
изменения рН среды по результатам определения активности амилазы слюны.
Примеры тестов „Крок-1”
1. У больного с болями в животе обнаружили высокую амилазную активность в
крови и моче. Какой патологический процесс сопровождают эти изменения?
А. Гепатит
D. Острый гастрит
В. Панкреатит
Е. Желчекаменная болезнь
С. Перфоративная язва желудка
2. После добавления вытяжки из поджелудочной железы в пробирку с
раствором крахмала, отмечено исчезновение синей окраски в пробе с раствором
йода, что свидетельствует о гидролизе крахмала. Под воздействием какого
фермента поджелудочной железы это состоялось?
D. Альдолазы
А. -амилазы
Е. Трипсина
В. Химотрипсина
С. Липазы
20
3. В слюне содержится фермент, способный разрушать -l,4-гликозидные
связи в молекуле крахмала. Назовите этот фермент.
A. -Амилаза
D. -Галактозидаза
B. Фосфатаза
Е. Лизоцим
C. Фруктофуранозидаза
4. Важным ферментом слюны является щелочная фосфатаза. К какому классу
ферментов она принадлежит?
А. Оксидоредуктаз
D. Лиаз
В. Трансфераз
Е. Лигаз
С. Гидролаз
5. Снижение активности какого фермента слюны служит показателем
гипофункции околоушной железы?
А. Фосфоглюкомутазы
D. Амилазы
В. Мальтазы
Е. Глюкокиназы
С. Лизоцима
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Мультиферментные комплексы, особенности строения и катализа.
2. Использование ферментов в биохимических исследованиях.
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко – діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508
с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. –
Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. –
С. 3 – 46.
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998.
– 451 с.
2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. –
528 с.
3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
4. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва:
Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.
21
Тема № 3. Определение активности ферментов, исследование механизма
их действия и кинетики ферментативного катализа.
Цель занятия: На примере пептидаз панкреатина и амилазы слюны
показать каталитическую роль ферментов в химических превращениях.
Освоить методику определения активности пептидаз и амилазы слюны и
оценить их клинико-диагностическое значение.
Актуальность темы: Знание механизма действия ферментов и кинетики
ферментативного катализа лежит в основе понимания метаболических
процессов в клетках, тканях и органах организма, что важно для понимания
хода химических превращений и применения ферментных препаратов, их
ингибиторов в практической медицине.
Конкретные задания:
 Объяснять механизм действия ферментов на основе сродства фермента
к субстрату и процессов, которые происходят в фермент-субстратном
комплексе.
 Трактовать изменения количественного определения активности
ферментов как диагностического показателя развития определенной патологии.
 Объяснять применение ингибиторов и активаторов ферментов при
нарушениях обмена веществ и определенных патологиях.
 Анализировать механизм действия ферментов на примере химотрипсина
и ацетилхолинэстеразы.
1.



2.
3.






4.



Теоретические вопросы
Принципы количественного определения активности ферментов:
по количеству продукта, который образуется под действием фермента;
по количеству субстрата, который используется;
по изменению количества кофермента (окислительно-восстановительные
превращения для НАД и ФАД);
Единицы ферментативной активности.
Основные положения кинетики ферментативного катализа:
зависимость скорости реакции от концентрации субстрата;
зависимость скорости реакции от концентрации фермента;
образование фермент-субстратного комплекса и процесс превращения
субстрата;
уравнение Михаелиса-Ментен;
смысловое значение величины Кm (сродство фермента к субстрату).
выражение ферментативной реакции в двойных обратных величинах;
уравнение Лайнуивера-Берка.
Механизмы действия ферментов (превращение субстрата):
эффекты сближения и ориентации;
эффекты кислотно-основного катализа;
эффекты нуклеофильного и электрофильного катализа.
22
5.
Механизмы
каталитического
ацетилхолинэстеразы.
действия
химотрипсина
и
Практическая работа
Опыт 1. Количественное определение активности амилазы мочи по
методу Вольгемута.
Принцип метода. Метод Вольгемута основывается на способности
амилазы расщеплять (гидролизовать) крахмал. В ходе работы обнаруживают
минимальное количество фермента, способного полностью расщеплять 1 мл 0,1
% раствора крахмала. Это количество фермента принимают за единицу
амилазной активности.
Амилазная активность выражается в количестве мл 0,1 % раствора
крахмала, которое может гидролизовать 1 мл неразведенной мочи при
температуре 4С на протяжении 15 мин.
Материальное обеспечение: моча, 0,1 % р-р крахмала, 0,1 % раствор I2 в
0,2 % растворе KI, 0,85 % р-р NaCl, газовая горелка, водяная баня, штатив с
пробирками, пипетки.
Ход работы. В девять пронумерованных пробирок вносят из бюретки по
1 мл 0,85 % р-р NaCl. В первую пробирку добавляют 1 мл мочи. Содержание
хорошо перемешивают и 1 мл полученного раствора переносят с первой
пробирки во вторую, из нее - в третью, таким образом в каждой следующей
пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Из
последней пробирки 1 мл смеси выливают для уравнивания объема. Потом во
все пробирки добавляют еще по 1 мл 0,85% р-ра NaCl и по 2 мл 0,1% раствора
крахмала, перемешивают и ставят пробирки в водяную баню (термостат) при
45С на 15 мин.
После инкубации пробирки вынимают и охлаждают для остановки
действия фермента. В каждую пробирку добавляют по 2 капли раствора йода и
наблюдают за изменением окраски. Жидкость в пробирках может окрашиваться
в желтый, красный и синий цвет. Желтый цвет свидетельствует о полном
расщеплении крахмала. Результаты наблюдений вносят в таблицу, помечая
синюю, красную и желтую расцветку буквами “С”, “К”, “Ж”. Отмечают
последнюю пробирку с раствором желтого цвета и проводят расчет амилазной
активности в моче:
Показатель
Розведение мочи
Количество 0,1 %
раствора крахмал, мл
Окрашивание после
добавления йода
(цвет раствора)
1
1:2
2
2
1:4
2
3
1:8
2
№ пробирки
4
5
6
7
8
9
1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512
2
2
2
2
2
2
23
Последняя пробирка с
раствором желтого цвета
Для расчета активности амилазы необходимо знать разведение мочи в
последней пробирке, где состоялся полный гидролиз крахмала.
Например, последняя пробирка с раствором желтого цвета оказывается
четвертой, в которой моча разведена в 16 раз. Составляют пропорцию и
рассчитывают активность амилазы:
1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1 % раствора крахмала;
1мл мочи гидролизует - Х мл 0,1 % раствора крахмала,
отсюда X = 1 × 2_ = 2 × 16 = 32 мл
1/16
1
а следовательно: А (амилазная активность) = 32 единицы.
Сделать выводы из проведенных исследований.
Клинико-диагностическое значение. Метод Вольгемута широко
используется в клинической практике для определения амилазной активности в
крови и моче. В норме активность амилазы мочи колеблется в пределах 16-64
единицы. При острых панкреатитах активность амилазы мочи и сыворотки
крови растет в 10-30 раз, особенно в начале заболевания, потом постепенно
возвращается к норме.
Опыт 2. Количественное определение активности пептидаз
панкреатина.
Принцип метода. Метод основан на способности пептидаз
гидролизовать пептидные связи, что приводит к увеличению количества
свободных амино- и карбоксильных групп. После блокировки аминогрупп
формалином, карбоксильные группы повышают кислотность среды, прирост
которой определяется титрованием щелочью по методу Зернсена в присутствии
индикатора фенолфталеина.
Материальное обеспечение: 6 % раствор казеина, фосфатный буфер рН
7,6, панкреатин, фенолфталеин, 0,2 н раствор NaОН, 0,02 н раствор NaОН,
формольная смесь рН 8,3, штатив с пробирками, пипетки, колбочки для
титрования, бюретка, водяная баня, термометр, газовая горелка.
Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл 6 % раствора казеина и
по 2 мл фосфатного буфера рН 7,6. В одну из пробирок добавляют 0,5 г
панкреатина, старательно перемешивают и ставят на водяную баню при
температуре 37С вместе с контрольной пробиркой.
Через 30 мин пробирки снимают с бани, охлаждают, их содержание
переливают в колбочки для титрования, добавляют в каждую по 2-3 капли
фенолфталеина и подщелачивают 0,2 н раствором NaОН до появления светлорозовой окраски (рН-8,3).
При таком рН количество аминогрупп в растворе равняется количеству
карбоксильных групп. Далее в обе колбочки добавляют по 5 мл формольной
24
смеси (рН-8,3). Формалин связывает аминогруппы, а карбоксильные группы
сдвигают рН раствора в кислую сторону.
OH-CH2 \
NH3 - CH - COO- + 2НСНО
N - CH - COO- + H+
OH-CH2 /
R
R
Раствор обесцвечивается. Обе пробы титруют из бюретки 0,02 н раствором
NaOH до появления слабо-розовой окраски (рН 8,3) и добавляют еще несколько
капель 0,02 н раствора NаОН до появления ярко красного цвета (рН 9,1).
Вычисляют разницу между данными титрования исследуемого и
контрольного растворов. Активность пептидаз выражают в условных единицах.
Одна условная единица отвечает 1 мл 0,02 н раствора NаОН, который
затрачивается дополнительно на титрование опытной пробы.
Пример расчета:
Количество 0,02 н NаОН, которое использовалось на титрование гидролизата
казеина ......... мл.
Количество 0,02 н NаОН, которое использовалось на титрование контрольного
раствора ..... мл.
Разница в количестве 0,02 н NaOH между опытным и контрольным
растворами ........ мл.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. В норме активность пептидаз
сыворотки крови составляет 0,2-1,7 мкмоль/мл час. Увеличение содержания
пептидаз в сыворотке крови и роста их активности наблюдается при остром
панкреатите, язвенной болезни, обширных ожогах, остром гепатите. Снижение
активности пептидаз может наблюдаться при эмфиземе легких, циррозе печени.
+
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Катал - единица активности фермента, которая выражает:
А. Количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля
субстрата за 1 минуту
В. Количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля
субстрата за 1 секунду
С. Число единиц ферментативной активности на 1 мг белка
D. Количество молекул субстрата, которое превращается одной молекулой
фермента за минуту
Е. Количество фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата
за 1 секунду.
2. Какое явление лежит в основе механизма действия ферментов?
А. Образование фермент-субстратного комплекса
В. Сближение групп, которые входят в активный центр ферментов
С. Изменение пространственной конфигурации
25
D. Снижение электрического заряда фермента
Е. Гидролиз фермента
3. Пептидазы катализируют расщепление:
А. Липидов
В. Нуклеиновых кислот
С. Полисахаридов
D. Полипептидов
Е. Олигосахаридов
4. К пептидазам не относится следующий фермент:
А. Уреаза
D. Амилаза
В. АТФаза
Е. Трипсин
С. РНК-полимераза
5. В сыворотке крови больного обнаружено резкое повышение активности
трипсина, -амилазы, липазы. Для какого заболевании характерны такие
изменения?
A. Холестаз
B. Хронический гепатит
C. Злокачественные новообразования
D. Острый панкреатит
E. Отравление инсектицидами
6. В поджелудочной железе находятся ферменты: амилаза, пептидазы и липазы.
Какие из этих ферментов при определенных условиях могут вызывать автолиз
органа и почему?
7. У больного острый панкреатит. Какие препараты должен назначить врач для
избежание автолиза поджелудочной железы?
8. Попадание в организм метилового спирта в количестве около 30мл является
очень токсичным и может привести к смерти. Ядовитым для организма
является не сам метанол, а его продукт - формальдегид, который образуется
при участии алкогольдегидрогеназы. Одним из методов лечения при этом
является введение избыточного количества этилового спирта. Объясните, на
чем основано такое лечебное действие.
9. Объясните основные принципы определения активности ферментов на
примере амилазы слюны (йод-крахмальная реакция и реакция Троммера).
10. Объясните механизм превращения субстрата при действии фермента.
26
Примеры тестов “Крок-1”
1. Во время операции у больного после введения препарата, который вызывает
расслабление мышц наблюдается длительная остановка дыхания (более 5мин).
Недостаточность какого из приведенных ферментов наблюдалась?
А. Каталазы
D. Ацетилтрансферазы
В. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Е. Ацетилхолинэстеразы
С. Моноаминооксидазы
2. Фармпрепараты, которые содержат ртуть, мышьяк и другие тяжелые металлы
ингибируют ферменты, которые имеют сульфгидрильные группы. Какую
аминокислоту используют для реактивации этих ферментов?
А. Гистидин
D. Аспарагиновую кислоту
В. Изолейцин
Е. Глицин
С. Цистеин
3.Протеолитические ферменты ЖКТ катализируют гидролиз белков. Укажите,
какую химическую связь они расщепляют:
А. Пептидную
D. Эфирную
B. Гликозидную
E. Фосфодиэфирную
C. Водородную
4. Амилолитические ферменты катализируют гидролиз полисахаридов и
олигосахаридов. На какую химическую связь они действуют?
А. Гликозидную
D. Амидную
В. Сложноэфирную
E. Фосфодиэфирную
C. Пептидную
5. Липолитические ферменты ЖКТ катализируют гидролиз липидов. Укажите
химическую связь, которую они расщепляют:
А. Сложноэфирную
D. Водородную
B. Пептидную
E. Амидную
C. Гликозидную
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко – діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508
с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. –
Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. –
С. 3 – 46.
27
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998.
– 451 с.
2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. –
528 с.
3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
4. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва:
Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.
Тема № 4. Исследование регуляции ферментативных процессов и анализ
механизмов возникновения энзимопатий. Медицинская энзимология.
Цель занятия: Освоить основные принципы регуляции метаболических
путей, нарушения функционирования ферментов в клетке и использования
ферментов в медицине.
Актуальность темы: Ферменты являются биокатализаторами с
изменчивой
активностью,
которая
изменяется
при
определенных
регулирующих влияниях. В клинической практике ферменты применяют как
фармпрепараты, а определение их активности в крови и моче необходимо для
диагностики патологических состояний.
Конкретные задания:
 Анализировать пути и механизмы регуляции ферментативных процессов,
как основы обмена веществ в организме в норме и при патологиях;
 Объяснять применение ингибиторов и активаторов ферментов как
фармпрепаратов при нарушениях обмена веществ и определенных патологиях;
 Объяснять изменения хода ферментативных процессов и накопления
промежуточных продуктов метаболизма при врожденных (наследственных) и
приобретенных нарушениях метаболизма - энзимопатиях;
 Анализировать изменения активности индикаторных ферментов плазмы
крови при патологиях определенных органов и тканей.
1.
2.







Теоретические вопросы
Активация и ингибирование ферментов
активаторы ферментов;
ингибирование ферментов (обратимое, необратимое, конкурентное,
неконкурентное).
Регуляция путем изменения каталитической активности ферментов:
аллостерические ферменты;
ковалентная модификация ферментов;
протеолитическая активация ферментов (ограниченный протеолиз);
действие регуляторных белков;
циклические нуклеотиды в регуляции ферментативных процессов.
28
3.
Регуляция путем изменения количества ферментов: конститутивные и
адаптивные ферменты.
4.
Изоферменты, множественные молекулярные формы ферментов.
Объяснить на примере лактатдегидрогеназы.
5.
Энзимодиагностика, энзмопатии и энзимотерапия.
6.
Изменения активности ферментов плазмы и сыворотки крови как
диагностические (маркерные) показатели развития патологических процессов:
 инфаркт миокарда;
 заболевание печени;
 заболевание мышечной ткани.
7.
Изоферменты в энзимодиагностике.
8.
Врожденные (наследственные) и приобретенные нарушения метаболизма,
их клинико-лабораторная диагностика.
9.
Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных
средств:
 ацетилсалициловая кислота;
 аллопуринол;
 сульфаниламидные препараты.
10. Энзимотерапия - использование ферментов в качестве лекарственных
средств
 при заболеваниях пищеварительной системы;
 при гнойно-некротических процессах;
 как фибринолитические препараты;
 препараты ферментов.
Практическая работа
Опыт 1. Исследовать влияние активаторов и ингибиторов на
активность амилазы слюны.
Принцип метода. Соединениями, которые повышают активность
ферментов - активаторами - являются ионы многих металлов, в частности: Na+,
Mg2+, Mn2+, Co2+, а также органические соединения - промежуточные продукты
обмена веществ в организме.
Активатором амилазы является натрия хлорид (NaCl), ингибитором – меди
сульфат (CuSO4). Показателем влияния этих соединений на активность амилазы
является степень гидролиза крахмала под действием фермента в присутствии
NaCl и CuSO4.
Материальное обеспечение: 1 % р-р крахмала, 0,1 % раствор йода в
0,2% растворе калия йодида, 5 % р-р CuSO4, 1 % раствор NaCl, разведенная
слюна, газовая горелка, водяная баня, штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы. Слюну разводят в 2 раза. Берут 3 пробирки. В пробирку №
1 наливают 1 мл воды, в пробирку № 2 - 0,8 мл воды и 0,2 мл 1% раствора
NaCl, в пробирку № 3 - 0,8 мл воды и 0,2 мл 1 % раствора CuSO4. Во все три
пробирки добавляют по 1 мл слюны. Содержание перемешивают и добавляют
29
по 2 мл 1 % раствора крахмала, опять перемешивают и ставят в термостат или
на водяную баню при t = 37C на 15 мин.
Далее во всех пробирках проводят реакцию с йодом (0,1 % раствор йода в
0,2 % растворе калия йодида). Наблюдают изменение окраски.
Результаты работы заносят в таблицу:
№ пробирки
Содержание пробирок
Вода, мл
NaCl, 1 % раствор, мл
CuSO4, 5 % раствор, мл
Слюна (розведение 1:2), мл
Крахмал, 1 % раствор, мл
Окраска после добавления
йода
1
2
3
1
----1
2
0,8
0,2
--1
2
0,8
--0,2
1
2
По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.
Клинико-диагностическое значение. Ингибиторы ферментов широко
используются в медицине в качестве лекарственных средств, в частности
ацетилсалициловая кислота (аспирин) - ингибитор циклооксигеназы
(простагландинсинтазы) используется в качестве противовоспалительного
препарата, трасилол - ингибитор трипсина и контрикал - ингибитор протеиназ
(в частности каликреинов) используются при панкреатите, аллопуринол ингибитор ксантиноксидазы применяется при подагре, и т.д.
Опыт 2. Исследовать влияние фосфакола и ионов кальция на
активность холинэстеразы.
Принцип метода. Фосфорорганические соединения (ФОС, фосфакол)
являются необратимыми ингибиторами холинэстеразы и ацетилхолинэстеразы,
поскольку ковалентно связываются с активным центром фермента и тормозят
его активность. Препараты ФОС являются высокотоксичными ядами для
насекомых (пестициды) и теплокровных животных. Механизм ингибирующего
действия заключается в связывании с ОН-группой серина в активном центре
фермента.
При проведении нервного импульса происходит рост концентрации
ионов Са2+ в нервном окончании, что является сигналом для активации выхода
ацетилхолина
в
синаптическую
щель,
взаимодействию
его
с
холинорецепторами
постсинаптической
мембраны
и
расщеплением
ацетилхолинэстеразой. Кроме этого, ионы кальция являются мощным
активатором холинэстеразы.
Метод количественного определения холинэстеразы основан на
титровании щелочью ацетатной кислоты, которая образовалась в процессе
гидролиза ацетилхолина.
30
Количество щелочи, которое использовалось на титрование является
мерой активности фермента.
Материальное обеспечение: 0,5 % раствор CaCl2, 0,05 % раствор
фосфакола, 5 % раствор CuSO4, 2 % раствор ацетилхолина, NaOH 0,1 М,
раствор фенолфталеина, сыворотка крови, штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы. Три пробирки заполняют реактивами согласно даных
таблицы.
Содержание пробирок
№ пробирки
1
2
Сыворотка крови, мл
0,5
0,5
0,5 % раствор CaCl2, капель
--5
0,5 % раствор фосфакола, кап.
----Инкубация при комнатной температуре, 5 минут
2 % раствор ацетилхоліна
1,5
1,5
Инкубация 10 минут
Фенолфталеин, капель
2
2
Количество 0,1 М NaOH,
которое использовалось на
титрование, мл
Сделать вывод.
3
0,5
--5
1,5
2
Клинико-диагностическое значение. Холинэстераза катализирует
реакцию гидролиза нейромедиатора – ацетилхолина с образованием холина и
ацетатной кислоты. В крови человека существует два вида холинэстеразы. В
сыроватке есть неспецифическая ацилхолинэстераза (КФ 3.1.1.8), которая
расщепляет не только ацетилхолин, но и другие эфиры холина. В эритроцитах
есть специфическая, истинная ацетилхолинэстераза, которая расщепляет только
ацетилхолин (КФ 3.1.1.7).
В норме активность холинэстеразы в сыроватке крови 44,4 – 94,4 мккат/л
(колориметрическим методом по гидролизу ацетилхолинхлорида).
Физиологически активные соединения, которые являются ингибиторами
ацетилхолинэстеразы, имеют важное фармакологическое и токсикологическое
значение, поскольку приводят к значительному повышению концентрации
нейромедиатора как в структурах центральной нервной системы, так и в
организме в целом.
Обратимые ингибиторы ацетилхолинэстеразы используются в медицине с
целью увеличения активности холинэргической импульсации, которая
нарушается при определенных неврологических заболеваниях, таких как
атония кишечника, мочевого пузиря. С этой целью используются препараты:
Прозерин, Физостигмин, Галантамин.
Необратимые ингибиторы ацетилхолинэстеразы являются мощными
нервными ядами, которые приводят к резкому возбуждению нервной системы с
судоргами, нарушением функции сердечно-сосудистой, гастро-интестинальной
31
и других физиологических систем организма. Наиболее распространенными
необратимыми ингибиторами являются фосфорорганические соединения –
ФОС. В сельском хозяйстве для борьбы с вредными насекомыми используют:
хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос и др. Нервно-паралитическими ядами,
которые используются как боевые ядовитые вещества являются табун, зарин,
зоман и др.
Высокая
чувствительность
холинэстеразы
к
действию
фосфорорганических соединений делает ее специфическим биохимическим
маркером для выявления влияния этих ядов на организм человека.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Укажите, какой тип ингибирования наблюдается при использовании
ингибитора ацетилхолинэстеразы – прозерина:
А. Конкурентное
D. Бесконкурентное
В. Обратимое
Е. Аллостерическое
С. Неконкурентное
2. Ацетилхолинэстераза – фермент, который осуществляет расщепление
ацетилхолина. Инсектициды, пестициды и яды с нервно-паралитическим
действием
на
основе
фторфосфатов,
необратимо
ингибируют
ацетилхолинэстеразу. Укажите механизм ингибирования:
А. Ингибиторы являются структурными аналогами субстрата
В. Ингибиторы связываются с остатком гистидина в аллостерическом центре
С. Ингибиторы связываются с остатком серина в активном центре фермента
D. Ингибиторы образуют комплекс с ацетилхолином
Е. Ингибиторы вызывают денатурацию фермента
3. Константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость
реакции равна:
А. Максимальной
D. Половине минимальной
В. Минимальной
Е. Трети максимальной
С. Половине максимальной
4. Конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы является:
А. Сукцинат
D. Фумарат
В. Аланин
Е. -Кетоглутарат
С. Малонат
5. Больного доставила в стационар скорая помощь с возможным диагнозом –
острый панкреатит. Активность какого фермента в крови и моче необходимо
определить для подтверждения этого диагноза?
А. АлАТ
D. γ-Амилазы
В. АсАТ
E. Лактадегидрогеназы
С. α-Амилазы
32
6. У больного в сыворотке крови выявлено повышение активности ЛДГ 4 і ЛДГ5,
аланинаминотрансферазы, карбамоилорнитинтрансферазы. В каком органе
происходит развитие патологического процесса?
7. В инкубационную среду, где была сукцинатдегидрогеназа и янтарная
кислота, добавили малоновую кислоту. Как изменится активность фермента?
Этот процесс обратимый?
8. В больного гнойная рана. Возможно ли для ее лечения использовать
ферменты? Какие именно? На чем основано их лечебное действие?
9. Объясните влияние модуляторов на активность ферментов на примере
определения активности холинэстеразы в присутствии кальция хлорида и
фосфакола, на примере активности амилазы слюны в присутствии натрия
хлорида.
Примеры тестов “Крок-1”
1. При обследовании больного выявлено повышение в крови активности ЛДГ.
Это характерно для болезней сердца, печени, почек. Какое дополнительное
биохимическое обследование нужно сделать для дифференциальной
диагностики?
А. Определение сахара крови
В. Уровень ацетоновых тел
С. Определение изоферментов ЛДГ
D. Определение уровня холестерина
Е. Активность амилазы крови
2. Больному в курсе лечения туберкулеза назначили изониазид – структурный
аналог никотинамида и пиридоксина. К какому типу ингибирования за
механизмом действия принадлежит изониазид?
А. Аллостерическое
D. Конкурентное
В. Необратимое
Е. Неконкурентное
С. Бесконкурентное
3. Для лечения определенных инфекционных заболеваний используют
сульфаниламидные препараты, которые останавливают рост бактерий. Какой
механизм их действия?
А. Аллостерично ингибируют ферменты бактерий
В. Являются структурными аналогами парааминобензойной кислоты,
необходимой для синтеза фолиевой кислоты
С. Принимают участие в окислительно-восстановительных процессах
D. Ингибируют всасывание фолиевой кислоты
33
Е. Необратимо ингибируют синтез фолиевой кислоты, необходимой для
нормального функционирования бактерий
4. Какой фермент используется как фармпрепарат для лечения гнойных ран?
А. Каталаза
D. Кислая фосфатаза
В. Щелочная фосфатаза
Е. Аргиназа
С. Трипсин
5. У больного с жалобами на боль в области сердца по определению активности
ферментов сыворотки крови диагностирован инфаркт миокарда. Укажите,
активность каких ферментов определяли?
А. Амилазы, липазы, фосфатазы
В. ЛДГ, креатинкиназы, трансаминазы
С. Пептидазы, аргиназы, глюкокиназы
D. Трипсина, лизоцима, цитратсинтазы
Е. Альдолазы, сукцинатдегидрогеназы, гексокиназы
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Регуляторы активности ферментов и их использование в клинической
практике.
2. Энзимодиагностика. Использование изоферментов в энзимодиагностике.
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. –
Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 71-74, 98-102.
3. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.
106-114.
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002.
– С. 167-179.
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. –
Львів: Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот,
1998. – 451 с.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – Москва: Медицина,
1990. – С. 126-129, 145-157, 165-168.
3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
4. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. –
Москва: Мир, 2004. – С. 71-75, 98-110.
5. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. – М.: Мир, 1980. –
364 с.
34
6. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные
комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с.
Тема № 5. Исследование роли кофакторов и коферментных витаминов в
проявлении каталитической активности ферментов
Цель занятия: Освоить строение, общие принципы классификации и
функционирования коферментных форм витаминов. Овладеть методами
качественного и количественного определения витаминов.
Актуальность темы: Водорастворимые витамины принимают участие в
обмене веществ как коферменты и активаторы многих ферментативних
процессов.
Ограничение поступления витаминов в организм или патология их обмена,
связанная с нарушением всасывания, превращение витаминов в коферментные
формы, резко снижает интенсивность энергетического и пластичного обменов,
что сопровождается нарушением функций головного мозга, сердца, печени и
других органов, снижением иммунитета к вирусным и инфекционным
заболеваниям, потерей организмом способности адаптироваться к разным
неблагоприятным факторам.
Недостаточное обеспечение организма витаминами приводит к развитию
гиповитаминозов с характерными клиническими проявлениями.
Конкретные задания:
 Уметь трактовать роль витаминов и их биологически активных производных
в механизмах катализа при участии основных классов ферментов;
 Объяснять применение антивитаминов как ингибиторов ферментов при
инфекционных заболеваниях и при нарушениях системы гомеостаза;
 Объяснять роль металлов в механизме ферментативного катализа;
 Классифицировать отдельные группы коферментов за химической природой
и типом реакции, которую они катализируют.
Теоретические вопросы
1. Кофакторы, коферменты и простетические группы.
2. Роль ионов металлов в функционировании ферментов.
3. Классификация коферментов по химической природе и по типу реакции,
которую они катализируют.
4. Коферменты – переносчики атомов водорода и электронов (рассмотреть
конкретные реакции):
• НАД+, НАДФ+ - коферменты – производные витамина РР;
• ФАД, ФМН – коферменты – производные витамина В2 – рибофлавина;
• роль витамина С в окислительно-восстановительных реакциях;
• металлопорфирины.
5. Коферменты – переносчики химических групп (рассмотреть конкретные
реакции):
35
• пиридоксалевые коферменты;
• НS-КоА – коэнзим ацилирования;
• липоевая кислота;
• ТГФК – производные фолиевой кислоты.
6. Коферменты изомеризации, синтеза и расщепления С – С связей
(рассмотреть конкретные реакции):
• тиаминдифосфат – производные витамина В1;
• карбоксибиотин – биологически активная форма витамина Н – биотина;
• метилкобаламин и дезоксиаденозилкобаламин – производные витамина В12.
Практическая работа
Опыт 1. Проба с медью на никотиновую кислоту.
Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с раствором
купрума ацетатнокислого образуется синий осадок медной соли никотиновой
кислоты.
Материальное обеспечение: 10 % раствор СН3СООН, раствор
никотиновой кислоты, 5 % раствор купрума ацетатнокислого, газовая горелка,
пробирки.
Ход работы. 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в
10-20 каплях 10 %-го раствора СН3СООН. К нагретому до кипения раствору
добавляют равный объем 5 %-го раствора уксуснокислой меди. Жидкость
окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает осадок синего цвета.
Объяснить полученные результаты и сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. В норме содержание данного
витамина в крови человека составляют 29,2 мкмоль/л. Регуляция
биохимических процессов этим витамином осуществляется благодаря его
коферментным формам НАД+ и НАДФ+.
Функции, которые выполняют данные коферменты следующие: транспорт
водорода в окислительно – восстановительных реакциях на всех этапах
оксиления углеводов, жирных кислот и аминокислот; НАД является субстратом
при ДНК – лигазной реакции, которая является обязательной для репликации и
репарации ДНК; НАД принимает участие в высвобождении гистамина и
активации системы кининов, способствует микроциркуляции крови. При
недостатке даного витамина развивается симптомокомплекс, который известен
под названием пеллагра. Он сопровождается следующими признаками:
дерматит, нарушение функции пищеварительного тракта, деменция.
Опыт 2. Феррихлоридная проба на пиридоксин.
Принцип метода. При добавлении к раствору пиридоксина раствора
хлорного железа образуется комплексное соединение типа фенолята железа,
которое имеет характерный красный цвет.
36
Материальное обеспечение: водный раствор пиридоксина, 5 % раствор
FeCl3, пробирки.
Ход работы. К 5 каплям водного раствора пиридоксина добавляют 1
каплю 5 %-го раствора FeCl3 и взбалтывают. Жидкость окрашивается в красный
цвет.
Объяснить полученный результат и сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. В норме содержание данного
витамина в крови человека составляет 0,6 мкмоль/л, в сыворотке – 0,4
мкмоль/л. Основной метаболически активной формой витамина В6 является
фосфорный эфир пиридоксаля – пиридоксаль-5-фосфат (ПАЛФ). Ограниченное
биологическое действие обнаруживает пиридоксамин-5-фосфат (ПАМФ),
который принимает участие только в реакцих переаминирования. Данные
коферменты входят в состав ферментов, которые катализируют следующие
реакции: транспорт аминокислот через клеточные мембраны; реакциях
переаминирования, декарбоксилирования, десульфуривания, обезвреживании
биогенных аминов, синтезе гемопротеинов и сфинголипидов. При недостатке
данного витамина развивается неврастенический синдром, эритема тыльной
части кистей рук, шеи, грудной клетки, гиперкератоз, сухость и бледность губ,
возможная боль в мышцах по ходу нервов.
Опыт 3. Восстановление K3Fe (CN)6 аскорбиновой кислотой.
Принцип метода. Аскорбиновая кислота восстанавливает K3Fe(CN)6 в
K4Fe(CN)6. Последняя, реагируя с FeCl3, образует берлинскую лазурь –
соединение синего цвета.
Материальное обеспечение: 5 % раствор K3Fe(CN)6, 1 % раствор FeCl3, 1
% вытяжка из шиповника, дистиллированная вода, пробирки.
Ход работы. В две пробирки добавляют по одной капле 5 %-го раствора
K3Fe(CN)6 и 1 %-го раствора FeCl3. В одну из пробирок к зелено-бурой
жидкости, которая образовалась, добавляют 5 – 10 капель 1 % вытяжки из
шиповника, во вторую – 5 – 10 капель дистиллированной воды. Жидкость в
первой пробирке окрашивается в зелено-синий цвет и выпадает синий осадок
берлинской лазури. При осторожном наслоении дистиллированной воды,
осадок на дне пробирки становится более выразительным. Во второй пробирке
зелено-бурая жидкость расцветки не изменяет.
Объяснить полученные результаты и сделать вывод.
Опыт 4. Определить содержание аскорбиновой кислоты в моче как
показатель обеспеченности организма витамином С.
Принцип метода. Аскорбиновая кислота в определенных условиях легко
отдает пару электронов и протонов, а следовательно является хорошим
восстановителем. Другие вещества – окислительно-восстановительные
индикаторы при переходе из окисленой формы в восстановленную способны
изменять свою расцветку. Так, 2,6-дихлорфенолиндофенол при взаимодействии
37
с аскорбиновой кислотой восстанавливается и изменяет цвет с синего на
розовый.
Материальное обеспечение: исследуемая моча, конц. СН3СООН, 2,6дихлорфенолиндофенол, дист. вода, колбочки, пипетки, бюретка.
Ход работы. В две колбочки отмеряют по 5 мл свежей мочи, добавляют 5
капель конц. СН3СООН и одну из них титруют 2,6-дихлорфенолиндофенолом
до образования стойкого розового цвета. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола
приготовлен так, что 1 мл его реагирует из 0,1 мг аскорбиновой кислоты.
Средний суточный диурез составляет 1500 мл. Определив количество реактива,
которое
используется
на
титрование
2,6-дихлорфенолиндофенола,
рассчитывают количество витамина С, которое выделяется с мочой за сутки.
Расчет количества витамина С проводят по формуле:
1500 × а
Х=
5
где: 1500 – суточный диурез в мл;
а – количество витамина С, которое соответствует потраченному на титрование
2,6-дихлорфенолиндофенола;
5 – количество мочи в мл, которую исследуют.
Сделать выводы из проведенного исследования и полученных результатов.
Клинико-диагностическое значение. При многих заболеваниях органов
пищеварительной системы нарушается всасывание витаминов через стенку
кишечника в кровь и усиливается процесс распада витаминов в
пищеварительном тракте. Это наблюдается при язвенной болезни, гастрите,
энтерите, холецистите и др.
Для оценки С – витаминной обеспеченности организма в клинической
практике определяют содержание аскорбиновой кислоты в крови и моче, а
также в продуктах питания в пищевой промышленности.
В норме в крови взрослого человека содержание аскорбиновой кислоты
составляет 39,7 – 113,6 мкмоль/л.
Аскорбиновая кислота и продукты ее распада выводятся из организма с
мочой. У здорового человека за сутки с мочой выводится 20 – 30 мг или 113,55
– 170,33 мкмоль витамина С. Повышенный распад аскорбиновой кислоты
встречается при гипоацидном гастрите, язвенной болезни, энтерите. Выделение
витамина С ниже нормы свидетельствует о С – гиповитаминозе. Авитаминоз С
приводит к возникновению заболевания – цинги, сопровождается
синюшностью губ, ногтей, кровоточивостью десен, бледностью и сухостью
кожи, точечным подкожным кровоизлиянием, расшатыванием и выпадением
зубов, болями в суставах, медленным заживлением ран.
38
Контроль выполнения лабораторной работы
1. У больного наблюдается кровоточивость десен, боли в мышцах и суставах,
подкожные точечные кровоизлияния (петехии). Недостаток какого витамина
наблюдается и каким методом это можно обнаружить в моче?
A. Феррихлоридная проба
B. Проба с медью
C. Реакция из натрия 2,6 - дихлорфенолиндофенолом
D. Реакция с тиомочевиной
E. Бромхлороформная проба
2. Отсутствие какого витамина приводит к нарушению гидроксилирования
аминокислот лизина и пролина?
A. Витамин С
B. Витамин Е
C. Витамин К
D. Витамин А
E. Витамин D
3. В состав каких коферментов входит витамин В1?
A. ТПФ, ТДФ
B. ПАЛФ, ПАМФ
C. ФМН, ФАД
D. НАД, НАДФ
E. КоАSH, НАДФ
4. При длительном лечении изониазидом больных туберкулезом возникают
нарушения связанные с недостаточностью витамина В6. Какая причина такого
состояния ?
5. За сутки у человека выделяется 10 мг витамина С. Обеспеченный ли
организм этим витамином ?
6. У больного с мочой выделяется повышенное количество пировиноградной
кислоты. О недостаточности каких витаминов в организме это свидетельствует
?
Примеры тестов “Крок-1”
1. Биохимические функции водорастворимых витаминов реализуются за счет
превращения их в коферментные формы. В какую из приведенных
коферментных форм превращается витамин РР?
A. ФМН (флавинмононуклеотид)
B. ФАД (флавинадениндинуклеотид)
39
C. ПАЛФ (пиридоксальфосфат)
D. НАД (никотинамидадениндинуклеотид)
Е. ТПФ (тиаминпирофосфат)
2. У больного наблюдается боль по ходу больших нервных стволов и
повышенное содержание пирувата в крови. Превращение какого витамина в
активную коферментную форму является нарушенным?
A. С
B. В1
C. В6
D. К
E. РР
3. В организме человека большинство витаминов испытывают определенных
превращений. Какой витамин принимает участие в образовании кофермента
ацетилирования (КоАSH)?
A. Тиамин
B. Рибофлавин
C. Пантотеновая кислота
D. Никотинамид
E. Фолиевая кислота
4. Укажите, какой из перечисленных витаминов входит в состав коферментов
дегидрогеназ цикла трикарбонових кислот:
А. Биотин
В. Рутин
С. Пантотеновая кислота
D. Аскорбиновая кислота
Е. Никотинамид
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Влияние изменений концентраций витамина В6 на процессы
трансаминирования в печени.
2. Процессы кроветворения и их регуляция коферментними формами витамина
В12 и фолиевой кислоты.
Литература
Основная:
1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Київ-Тернопіль:
Укрмедкнига, 2001. – С. 124 –149.
2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини.
Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
40
3. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508
с.
4. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
5. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. –
297 с.
6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998.
– 451 с.
2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. –
С. 147-163.
3. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург:
Уральский рабочий, 1994. – 384 с.
Смысловой модуль № 7. Главные закономерности обмена веществ. Цикл
трикарбоновых кислот.
Тема № 6. Обмен веществ и энергии. Исследование функционирования
цикла трикарбоновых кислот.
Цель занятия: Усвоить последовательность реакций и биологическое
значение цикла трикарбоновых кислот, как универсального конечного пути
окислительного катаболизма клетки. Овладеть методами исследования
функционирования ЦТК митохондрий и влияния малоновой кислоты на ход его
реакций.
Актуальность теми: Изучение особенностей функционирования цикла
трикарбоновых кислот важно для понимания его роли в энергообеспечении
клетки и понимания его амфиболической природы. Умение анализировать роль
ЦТК необходимо для понимания обмена веществ и энергии в клетке.
Конкретные задания:
 Трактовать биохимические закономерности хода обмена веществ:
катаболические, анаболические, амфиболические пути метаболизма;
 Объяснять биохимические механизмы регуляции процессов анаболизма и
катаболизма;
 Трактовать биохимические закономерности функционирования цикла
трикарбоновых кислот, его анаплеротические реакции и амфиболическую
суть;
 Объяснять биохимические механизмы регуляции цикла трикарбоновых
кислот и его ключевую роль в обмене веществ и энергии.
Теоретические вопросы:
1. Понятие обмена веществ и энергии. Характеристика катаболических,
анаболических и амфиболических путей метаболизма, их значение.
41
2. Экзэргонические и эндергонические биохические реакции; роль АТФ и
других макроэргических фосфатов в их сопряжении.
3. Внутриклеточная локализация метаболических путей, компартментализация
метаболических процессов в клетке. Методы изучения обмена веществ.
4. Катаболические пути обмена биомолекул: белков, углеводов, липидов, их
характеристика.
5. Наиболее важные метаболиты амфиболических путей обмена белков,
углеводов, липидов; их роль в интеграции метаболизма клетки.
6. Цикл трикарбоновых кислот.
 внутриклеточная локализация ферментов ЦТК;
 последовательность реакций ЦТК;
 характеристика ферментов и коферментов ЦТК;
 реакции субстратного фосфорилирования в ЦТК;
 влияние алостерических модуляторов на регуляцию ЦТК;
 энергетический баланс цикла трикарбоновых кислот.
7. Анаплеротические и амфиболические реакции ЦТК.
Практическая работа
Опыт 1. Выделение митохондрий из мышц путем дифференциального
центрифугирования (демонстрация).
Принцип метода. Клетки мышечной ткани содержат большое количество
специализированных субклеточных органелл – митохондрий. Именно в
митохондриях происходят реакции цикла трикарбоновых кислот (ЦТК),
тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования. Ферменты ЦТК
локализируются в матриксе митохондрий, а компоненты дыхательной цепи
локализируются на внутренней мембране митохондрий.
Для выделения митохондрий мышечную ткань гомогенизируют в
механическом гомогенизаторе с тефлоновым наконечником, добавляя раствор
сахарозы. Выделение митохондрий из гомогената производят с помощью
рефрижераторной центрифуги. Скорость осаждения клеточных компонентов
под влиянием центробежной силы зависит от их массы, размера, а также
времени центрифугирования.
Материальное обеспечение: свежие мышцы кролика; раствор № 1 – среда
для выделения митохондрий (0,25 М раствор сахарозы и 0,01 М раствор
этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЕДТА – для связывания кальция) с рН =
7,6); розчин № 2 – среда для получения суспензии митохондрий (0,25 М
раствор сахарозы в 0,02 М растворе трис-буфера с рН = 7,5). Все растворы
охлаждают до + 2оС.
Ход работы. Мышечную ткань очищают от жира, измельчают,
взвешивают и гомогенизируют в десятикратном объеме охлажденного раствора
№ 1 на протяжении 40 мин. при скорости оборотов – 600 об/мин. Все
последующие процедуры проводят при температуре + 1-2оС. Гомогенат
освобождают от ядер и обломков клеточных мембран путем
42
центрифугирования на протяжении 6 мин. при 700 об/мин. Полученную
надосадочную жидкость (супернатант) переносят в другие центрифужные
пробирки и повторно центрифугируют на протяжении 10 мин. при 7000 об/мин.
После удаления надосадочной жидкости получают осадок митохондрий.
Для очистки митохондрий, добавляют исходное количество раствора № 1,
осадок ресуспендируют, а потом проводят повторное осаждение митохондрий
на протяжении 10 мин. при 7000 об/мин. Полученный осадок митохондрий
ресуспендируют в небольшом объеме раствора № 2, определяют содержание
белка и используют для изучения функционирования ЦТК, тканевого дыхания
и окислительного фосфорилирования.
Опыт 2. Исследование функционирования ЦТК митохондрий по
скорости образования СО2 и влияние малоновой кислоты на этот процесс.
Принцип метода. Превращение ацетил-S-КоА в присутствии
митохондрий, которые содержат ферменты ЦТК, сопровождается выделением
СО2. В качестве ресурса ацетил-S-КоА, вступающего в ЦТК, используют
пировиноградную кислоту (ПВК). ПВК под действием мультиферментного
пируват-дегидрогеназного комплекса митохондрий поддается окислительному
декарбоксилированию с образованием ацетил-S-КоА.
Если блокировать ЦТК малонатом (малоновой кислотой), то СО2 не
образуется, пузырьки газа не выделяются. Малонат - классический
конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы – фермента ЦТК, потому что
связывается с её активным центром и препятствует связыванию субстрата –
сукцината (янтарной кислоты).
Для связывания образованного СО2 в инкубационную среду добавляют
Са(ОН)2. После окончания инкубации, связанный СО2 определяют по
выделению пузырьков газа, который образуется после добавления в
инкубационную среду сульфатной кислоты.
Материальное обеспечение: фосфатный буфер рН 7,4, раствор пирувата
натрия, малоновая кислота, физиологический раствор, раствор Са(ОН) 2,
суспензия митохондрий, 0,1 М раствор H2SO4, термостат, штатив с пробирками,
пипетки
Ход роботы. Три пробирки – контрольную, исследуемую № 1 и
исследуемую № 2 наполняют реактивами за таблицей:
Содержание пробирок
Фосфатный буфер, рН = 7,4, мл
Раствор пирувата натрия, мл
Малоновая кислота, мл
Физиологический раствор, мл
Раствор Са(ОН)2, мл
Суспензия митохондрий, мл
Суспензия митохондрий после
Контроль
2,0
0,5
–
0,5
0,5
–
0,5 мл
Пробирки
Опыт №1
2,0
0,5
–
0,5
0,5
0,5
–
Опыт №2
2,0
0,5
0,5
–
0,5
0,5
–
43
кипячения
Инкубация в термостате: 15 мин. при температуре 37оС
0,1 М раствор H2SO4, мл
1,0
1,0
Результаты: выделения пузырьков СО2
выд.
1,0
мало
Все пробирки помещают в термостат на 15 мин. при 37 оС. После
инкубации в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл 0,1 м раствора H 2SO4 и
наблюдают за выделением пузырьков СО2
За результатами проведенного эксперимента сделать выводы.
Опыт 3. Исследование функционирования ЦТК митохондрий по
скорости образования атомов водорода и влияния малоновой кислоты на
этот процесс.
Принцип метода. При окислении ацетил-S-КоА в ЦТК выделяется
водород, который восстанавливает метиленовую синьку и превращает её в
безцветное лейкосоединение. Время, на протяжении которого происходит
обесцвечивание раствора служит показателем интенсивности протекания ЦТК в
митохондриях.
При блокировании ЦТК малонатом (малоновой кислотой), выделение
водорода не происходит и метиленовая синька не обесцвечивается.
Материальное обеспечение: фосфатный буфер рН 7,4, раствор пируват
натрия, малоновая кислота, физиологический раствор, раствор метиленовой
синьки, суспензия митохондрий, термостат, штатив с пробирками, пипетки
Ход роботы. Три пробирки – контрольную, исследуемую № 1 та
исследуемую № 2 наполняют реактивами за таблицей:
Пробирки
Контроль Опыт №1 Опыт №2
2,0
2,0
2,0
0,5
0,5
0,5
–
–
0,5
0,5
0,5
–
–
0,5
0,5
0,5 мл
–
–
Содержание пробирок
Фосфатный буфер, рН = 7,4, мл
Раствор пирувата натрия, мл
Малоновая кислота, мл
Физиологический раствор, мл
Суспензия митохондрий, мл
Суспензия митохондрий после
кипячения
Раствор метиленовой синьки, мл
0,5
0,5
Инкубация в термостате при температуре 37оС
Результаты: время, на протяжении
которого происходит обесцвечивание
10 мин
раствора
0,5
-
По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.
44
Опыт 4. Определение активности ФАД-зависимой сукцинатдегидрогеназы – компонента дыхательной цепи митохондрий.
Принцип
метода.
Сукцинатдегидрогеназа
катализирует
дегидрогенизацию сукцината (янтарной кислоти), в результате чего образуется
фумарат (фумаровая кислота). Кофактором фермента является ФАД, который
восстанавливается в процессе реакции до ФАДН2. Образованый в реакции
ФАДН2 восстанавливает метиленовую синьку и превращает её в безцветное
лейкосоединение.
Материальное обеспечение: фосфатный буфер рН 7,4, раствор янтарной
кислоты, раствор метиленовой сини, суспензия митохондрий, 0,1 М раствор
H2SO4, термостат, штатив с пробирками, пипетки.
Ход роботы. Две пробирки – контрольную и исследуемую наполняют
реактивами за таблицей:
Содержание пробирок
Пробирка
Контрольная Исследуемая
Фосфатный буфер, рН = 7,4, мл
1,0
1,0
Раствор янтарной кислоты, мл
1,0
1,0
Суспензия митохондрий, мл
–
0,5
Суспензия митохондрий после кипячения, мл
0,5
–
Метиленовая синь, мл
0,5
0,5
о
Инкубация в термостате при 37 С
Результаты: время, на протяжении которого
15
происходит обесцвечивание раствора
По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.
Клинико-диагностическое значение. Много веществ, в том числе и
лекарственные препараты, могуть изменять энергетику клеток, интенсивность
окислистельного фосфорилирования – образования АТФ. Их можна поделить
на активаторы и ингибиторы энергетического обмена. К активаторам относят
кислоты цикла Кребса (лимонная, яблочная, янтарная) и ряд других соединений
(глюкоза, аминокислоты и др.), поэтому их используют в медицинской
практике.
Лимонную кислоту в виде солей (цитрат натрия) используют в качестве
средства, которое препятствует свертыванию крови и может входить в состав
некоторых лекарств.
Контроль выполнения лабораторной роботы
1. Митохондрии – субклеточные органеллы, которые локализируются в
цитоплазме всех клеток за исключением зрелых эритроцитов, бактерий, синезеленых водорослей. Какой главный метод используют для их виделения?
А. Дифференционное центрифугирование
В. Хроматографию
45
С. Электрофорез
D. Спектрофотометрию
Е. Гель-фильтрацию
2. Принцип определения активности сукцинатдегидрогеназы базируется на
восстановлении метиленовой синьки восстановленной формой кофермента.
Какой кофермент входит в состав сукцинатдегидрогеназы:
А. ТПФ
D. ФАД
В. НАД
Е. ПАЛФ
С. ФМН
3. Какое из указанних соеденений используется в качестве ингибитора для
изучения функционирования цикла трикарбоновых кислот?
А. АТФ
D. Изоцитрат
+
В. НАД
Е. Малонат
С. Аконитат
4. Пациент поступил в стационар с диагнозом сахарный диабет І типа. Среди
метаболических изменений имеет место снижение скорости синтеза
оксалоацетата. Какой метаболический процесс нарушатся в результате этого?
Какие энергетические утраты будут наблюдаться при нарушении этого
метаболического процесса. Укажите, какие метаболические пути могут
активироваться для компенсации утраты энергии.
5. Какими методами можна доказать функционирование ЦТК? Принцип
определения активности ферментов ЦТК. Доказать функционирование ЦТК по
использованию ацетил-КоА, по образованию СО2, по выделению
промежуточных продуктов атомов водорода.
6. К какому классу и подклассу ферментов принадлежат ферменты ЦТК?
Примеры тестов “Крок-1”
1. Ферменты цикла трикарбоновых кислот осуществляют окисление ацетилКоА, которое сопровождается восстановлением 3 молекул НАД + и одной
молекулы ФАД. Где они локализируются?
А. На плазматической мембране
D. В матриксе митохондрий
В. В цитоплазме
Е. На внутренней мембране
С. На внешней мембране митохондрий
митохондрий
2. В больницу попал больной з признаками отравления арсеном. Нарушение
какого процесса имеет место, если известно, что мишьяк блокирует липоевую
кислоту?
А. Биосинтеза жирных кислот
В. Окислительного декарбоксилирования -кетоглутаровой кислоты
46
С. Обезвреживание супероксидных анионов
D. Спряженность окисления и фосфорилирования
Е. Микросомального окисления
3. Субстратное фосфорилирование – это процесс непосредственной передачи
молекулы активного фосфата с субстратов, которые содержат макроэргическую
связь, на АДФ с образованием АТФ.Укажите какой фермент цикла лимонной
кислоты принимает участие в реакции субстратного фосфорилирования?
А. Цитратсинтаза
D. Сукцинилтиокиназа
В. Сукцинатдегидрогеназа
E.α-Кетоглутаратдегидрогеназный
С. Фумараза
комплекс
4. Какое вещество служит главным ресурсом энергии для функционирования
цикла трикарбоновых кислот?
А. Ацетил-КоА
D. Жирные кислоты
В. Глюкоза
Е. Сукцинил-КоА
С. Аминокислоты
Индивидуальная самостоятельная робота студентов.
1. Анаплеротическое и амфиболическое значение цикла трикарбоновых кислот.
2. Роль наиважнейших метаболитов амфиболических путей (пирувата, αкетоглутарата, ацетил-КоА, сукцинил-КоА и др.) в интеграции метаболизма.
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508
с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. –
Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. –
298 с.
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина,
1998. – 701 с
2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. – М.:
Мир, 2004. – 381 с.
4. Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Особливості обміну речовин у дітей / Чернівці:
БДМА, 2003. – С. 4-18.
47
Смысловой модуль № 8. Молекулярные основы биоэнергетики.
Тема № 7. Исследование процессов биологического окисления,
окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ.
Цель занятия: Освоить главные принципы организации дыхательной цепи
митохондрий. Знать роль окислительно-восстановительных ферментов в
тканевом дыхании. Овладеть методами исследования действия оксидоредуктаз:
фенолоксидазы, альдегиддегидрогеназы, пероксидазы, цитохрома с.
Актуальность
темы:
окислительно-восстановительные
ферменты
катализируют реакции, связанные с переносом электронов и протонов, и лежат
в основе формирования макроэргических соединений. Исследование их
функционирования важно для глубокого понимания механизмов тканевого
дыхания и його роли при разных функциональных состояниях организма.
Конкретные задания:
 Объяснять процессы биологического окисления субстратов в клетках и
запасания энергии в виде макроэргических связей АТФ;
 Анализировать реакции биологического окисления и их роль в обеспечении
фундаментальных биохимических процессов;
 Малатаспартатная и глицеролфосфатная челночные системы транспорта
восстанавливаемых эквивалентов гликолитического НАДН в митохондриях
и их значения.
 Объяснять структурную организацию цепи транспорта электронов и его
молекулярных комплексов;
 Трактовать роль биологического окисления, тканевого дыхания и
окислительного фосфорилирования в генерации АТФ при аэробных
условиях.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Теоретические вопросы
Биологическое окисление субстратов в клетках.
Реакции биологического окисления и их функциональное значение:
 дегидрогеназные;
 оксидазные;
 оксигеназные (моно- и диоксигеназные).
Пиридинзависимые дегидрогеназы. Строение НАД+ и НАДФ+ (окисленная и
восстановленная формы). Их значение в реакция окисления и
восстановления.
Флавинзависимые дегидрогеназы. Строение ФАД и ФМН (окисленная и
восстановленнная формы). Их роль в реакциях окисления и восстановления.
Убихинон. Его окисленная и восстановленная формы.
Цитохромы и их роль в тканевом дыхании. Строение их простетической
группы.
Молекулярная организация цепи транспорта электронов (дыхательной цепи)
митохондрий:
48
 компоненты дыхательной цепи митохондрий;
 последовательность переносчиков электронов в дыхательной цепи;
 роль редокс-потенциалов в транспорте электронов и протонов.
Понятие полной и укороченной дыхательной цепи.
8. Надмолекулярные комплексы дыхательной цепи внутренних мембран
митохондрий.
9. Пути включения восстановительных эквивалентов (электронов и протонов) в
дыхательную цепь митохондрий.
10.Пути образования АТФ в клетках – субстратное и окислительное
фосфорилирование.
Практическая работа
Опыт 1. Исследование действия фенолоксидазы.
Принцип метода. Метод базируется на явлении окрашивания
пирокатехина в случае, окисления его молекулярным кислородом при
присутствии фенолоксидазы.
Материальное обеспечение: раствор пирокатехина, 2 г свежего
картофеля, дистиллированная вода, раствор натрия сульфида, ступка, штатив с
пробирками, пипетки, водяная баня, термометр, газовая горелка.
Ход работы. Получение свежего сока из картофеля: 1 – 2 г свежего
картофеля растирают в ступке, добавляют 25 мл воды, перемешивают и
сливают раствор в пробирку (ножом измельчать картофель нельзя, потому что
ионы железа вызывают потемнение).
В 4 пронумерованные пробирки наливают по 0,5 мл свежего
картофельного сока. В первую пробирку добавляют 0,5 мл пирокатехина, в
другую – 1 – 2 капли ингибитора натрия сульфида и 0,5 мл пирокатехина.
Содержание третьей пробирки кипятят, а затем добавляют 0,5 мл
пирокатехину. В четвертую пробирку доливают 0,5 мл дистиллированной воды.
Все пробирки ставят на водяную баню на 30 мин. при температуре 37° С.
Содержимое пробирок перемешивают для лучшего доступа кислорода. Раствор
первой пробирки окрашивается в результате окисления пирокатехина
кислородом при присутствии фенолоксидазы. Цвет растворов во второй,
третьей, четвертой пробирках не изменяется.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Опыт 2. Исследование действия альдегиддегидрогеназы.
Принцип метода. Метод базируется на обесцвечении метиленового
синего при его восстановлении альдегидом в присутствии фермента
альдегиддегидрогеназы. Дегидрогеназа, которая содержится в молоке, легко
окисляет формальдегид в муравьиную кислоту. При этом происходит перенос
водорода на метиленовый синий, который вследствие этого обесцвечивается:
49
Н
С
О
Н
+ Н2О
формальдегід
НС
гідратаза
ОН
НС ОН
ОН
гідратована форма формальдегіду
ОН
альдегідоксидаза
ОН + Мс
Н
ОН метиленовий
синій
С
О
ОН
форміатна кислота
Материальное обеспечение: нейтрализованный альдегид, раствор
метиленового синего, молоко, штатив с пробирками, пипетки, водяная баня,
термометр, газовая горелка.
Ход работы. Готовят 3 пронумерованных пробирки. В первую наливают
1мл молока, 1 – 2 кап. нейтрализованного альдегида и 2 капли раствора
метиленового синего. Во вторую пробирку – 1 мл молока и 2 капли
метиленового синего. В третью пробирку – 1 мл прокипяченного молока, 1 – 2
капли нейтрализованного альдегида и 2 капли раствора метиленового синего.
Содержииое всех трех пробирок перемешивают и ставят на водяную баню на
30 мин. при температуре 37°С.
В первой пробирке раствор метиленового синего обесцвечивается. Во второй
и третьей изменении цвета не наблюдают.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Опыт 3. Исследование действия пероксидазы.
Принцип метода. Метод базируется на способности пероксидазы при
присутствии перекиси водорода катализировать окисление бензидина, которое
сопровождается появлением синего цвета.
Материальное обеспечение: вытяжка из хрена, 3 %-ний раствор перекиси
водорода, раствор бензидина в уксусной кислоте, ингибитор пероксидазы,
штатив с пробирками, пипетки, газовая горелка.
Ход работы. Готовят 3 пронумерованных пробирки. В первую вливают 34 капли раствора бензидина в уксусной кислоте, 3-4 капли 3 %-го раствора
перекиси водорода и 3-4 капли вытяжки из хрена. Во вторую пробирку вносят
3-4 капли раствора бензидина в уксусной кислоте, 3-4 капли 3 %-го раствора
перекиси водорода и 3-4 капли прокипяченной вытяжки из хрена. В третью
пробирку к 3-4 каплям раствора бензидина добавляют ингибитор пероксидазы,
вытяжку из хрена, после перемешивания добавляют 3-4 капли перекиси
водорода.
В первой пробирке наблюдают появление синего цвета. Во второй и
третьей пробирках расцветка отсутствует.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Опыт 4. Исследование восстановления цитохрома с.
Принцип метода: Метод основывается на реакции восстановления
цитохрома с с помощью водорода, который выделяется в реакции между
50
металлическим цинком и хлоридной кислотой. После восстановления красный
цвет цитохрома с бледнеет.
Материальное обеспечение: раствор цитохрома с – 100мг/мл, 0,5 М
раствор (9 %) аскорбиновой кислоты, концентрированная хлоридная кислота,
металлический цинк, пробирки с газоотводной трубкой.
Ход работы: В первую пробирку вносят 8-10 капель цитохрома с, во
вторую пробирку с газоотводной трубкой – столько же концентрированной
хлоридной кислоты и металлический цинк. Закрывают пробирку пробкой и
внешний конец трубки опускают в пробирку с раствором цитохрома с так,
чтобы через раствор проходили пузырьки водорода. При стоянии на воздухе
раствор цитохрома с постепенно восстанавливает предыдущую расцветку.
В пробирку наливают 1 мл раствору цитохрома с, добавляют 0,5 М раствор
аскорбиновой кислоты (2 – 3 мл) и закрывают пробирку пробкой. Наблюдают
за изменением цвета.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. Цитохромы – окислительновосстановительные ферменты, которые принимают участие в транспортировке
электронов в процессах тканевого дыхания. Они принадлежат к
железопорфириновим ферментам, простетическая группа которых содержит
разные производные гема. Атом железа в геме может изменять валентность,
присоединяя или отдавая электроны. Препарат цитохрома с используют для
улучшения тканевого дыхания асфиксии новорожденных, при астматических
состояниях,
хронической
пневмонии,
сердечной
недостаточности,
ишемической болезни сердца, инфекционном гепатите при интоксикациях и
других состояниях, которые сопровождаются нарушениям окислительных
процессов в организме.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Исследование действия какого из перечисленных ферментов базируется на
обесцвечении бензидина при его окислении?
А. Пероксидазы
D. Фенолоксидазы
В. Цитохрома С
Е. Лактатдегидрогеназы
С. Альдегиддегидрогеназы
2. Какой ингибитор используют для исследования действию фенолоксидазы?
А. Малонат
В. FeCl3
С. Йодацетамид
D. Na2S
Е. CuSO4
51
3. При каких условиях происходит окрашивание пирокатехина при окислении
его молекулярным кислородом в присутствии фенолоксидазы:
А. При наличии Na2S
В. После кипячения картофельного сока
С. В отсутствии пирокатехина
D. В присутствии картофельного сока и пирокатехина
Е. В отсутствии пирокатехина
4. Массовая доля железа в цитохроме с составляет 0,426 %. Рассчитайте
молекулярную массу цитохрома и опишите значение этого фермента.
5. У новорожденных, в отличие от взрослых, содержится некоторое количество
бурого жира. Объясните такую особенность строения организмов разного
возраста, если известно, что бурый жир содержит большое количество
митохондрий, а выход АТФ в нем в пересчете на атом поглощенного кислорода
составляет меньше единицы.
Примеры тестов “Крок-1”
1. Ферменты дыхательной цепи осуществляют окисление биологических
субстратов и транспорт восстановительных эквивалентов на кислород с
образованием молекулы воды. Где они локализуются?
А. На плазматической мембране
В. В цитоплазме
С. На внешней мембране митохондрий
D. В матриксе митохондрий
Е. На внутренней мембране митохондрий
2. Цитохромы – компоненты дыхательной цепи митохондрий, которые
осуществляют перенос электронов от убихинона на молекулярный кислород.
Какая часть молекулы цитохрома принимает участие в окислительновосстановительных реакциях?
А. Винильный радикал
В. Пирольное кольцо
С. Белковая часть
D. Атом железа
Е. Метиновый мостик
3. НАДН+Н+-дегидрогеназа – фермент, который находится на внутренней
мембране митохондрий, который в качестве коферменту содержит:
А. НАД+
В. ФАД
С. ФМН
D. НАДН+Н+
Е. НАДФ
52
4. Назвать последний компонент мультиферментного комплекса дыхательной
цепи митохондрий, который способен транспортировать как электроны, так и
протоны:
А. Убихинон
В. НАД
С. Железо-серный белок
D. Цитохром в
Е. Цитохром а3
Индивидуальная самостоятельная работа студентов.
1. Развитие учения о биологическом окислении. Значение трудов А.Баха, В.
Палладина и О. Варбурга.
2. Современные представления об организации дыхательной цепи как
целостного полиферментативного комплекса.
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508
с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. –
Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. –
298 с.
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина,
1998. – 701 с.
2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. – М.:
Мир, 2004. – 381 с.
4. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологическая химия:
Практикум. – К.: Вища школа, 1985. – 212 с.
Тема № 8. Исследование действия
окислительного фосфорилирования.
ингибиторов
и
разобщителей
Цель занятия: Освоить главные принципы хемиосмотической теории
Митчела. Овладеть методом определения активности каталазы в крови,
научиться использовать этот показатель в клинико-диагностических целях.
53
Актуальность темы: Хемиосмотическая теория окислительного
фосфорилирования объясняет молекулярные механизмы генерации АТФ в ходе
биологического окисления. При некоторых патологических процессах,
сопровождающихся гипоксией, может происходить неполное восстановление
молекулы кислорода в дыхательной цепи и накопление перекиси водорода,
расщепление которой катализирует фермент каталаза. Потому определение
активности каталазы является важным критерием для оценки антиоксидантного
состояния организма.
Конкретные задания:
 Объяснять механизмы спряженности биологического окисления и
окислительного фосфорилирования – синтеза АТФ;
 Анализировать
структурно-функциональные
особенности
функционирования дыхательной цепи, обеспечивающие эффективный
синтез АТФ; Полная и укороченная дыхательная цепь.
 Объяснять
основные
принципы
хемиосмотической
теории
окислительного фосфорилирования;
 Анализировать действие ингибиторов и разъеденителей окислительного
фосфорилирования природного и синтетического происхождения, их
физиологичное значение.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Теоретические вопросы
Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования –
молекулярный механизм генерации АТФ в процессе биологического
окисления (Теория Митчелла).
Электрохимический градиент протонов (Н+), образующийся во время
функционирования электронтранспортной цепи, его роль в спряженности
транспорта электронов в митохондриях с синтезом АТФ.
Схема хемиосмотического механизма спряженности транспорта
электронов в дыхательной цепи с синтезом АТФ. Молекулярное строение и
принцип действия АТФ-синтетазы. Коэффициент фосфорилирования
полной и укороченной дыхательной цепи. Дыхательный контроль.
Ингибиторы транспорта электронов в дыхательной цепи митохондрий.
Разобщители транспорта электронов и окислительного фосфорилирования
в дыхательной цепи митохондрий.
Нарушение синтеза АТФ в условиях действия на организм человека
патогенных факторов химического, биологического и физического
происхождения.
Активные формы кислорода и механизмы их образования и инактивации.
Практическая работа
Опыт 1. Изучение окислительного фосфорилирования в митохондриях
и действии разобщителя – 2,4-динитрофенола на этот процесс.
Принцип метода. Определение неорганического фосфата основывается на
способности аммония молибдата в кислой среде присоединять остаток
фосфорной кислоты с образованием аммония фосфата. Аммония фосфат под
54
действием восстановителя – аскорбиновой кислоты образует продукты синего
цвета. В процессе окислительного фосфорилирования Фн изымается из
инкубационной среды, а потому интенсивность синего цвета раствора
уменьшается.
Материальное обеспечение: свежевыделенные митохондрии; смесь № 1 –
0,08 моль КН2РО4, 0,255 моль KCl, 0,05 моль MgCl2 растворяют в
дистиллированной воде, добавляют 0,1 М раствор КОН до рН = 7,4 и доводят
объем в мерной колбе до 1 л; смесь № 2 – водный раствор глюкозы из АТФ, что
содержит 90 мг глюкозы и 30 мг АТФ в 1 мл; гексокиназа в 1 %-м растворе
глюкозы (0,8 мг гексокиназы в 1 мл); 5 %-й раствор сукцината калия; 5 %-й
раствор уксусной кислоты; 10 %-й раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); 1
%-й раствор динитрофенол; 2,5 %-й раствор молибдата аммония в 10 М
растворе H2SO4 (2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл 20 М раствора
H2SO4 и доводят объем водой до 100 мл); 5 %-й раствор аскорбиновой кислоты.
Ход работы. Три пробирки – контрольную, опытную № 1 и опытную № 2
заполняют реактивами по таблице:
Пробирки
Контроль Опыт №1 Опыт №2
1,0
1,0
1,0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
----2
--0,5
0,5
0,5
-----
Содержание пробирок
Смесь № 1, мл
Смесь № 2, мл
Гексокиназа, мл
Сукцинат калия, мл
2,4-динитнофенол, (капли)
Суспензия митохондрий, мл
Суспензия митохондрий после
кипячения, мл
Раствор уксусной кислоты, (капли)
2
--Инкубация в термостате 15 мин. при температуре 37оС
Раствор ТХУ, мл
1,0
1,0
Молибдат аммония, мл
0,5
0,5
Аскорбиновая кислота, мл
0,5
0,5
Результаты: наблюдают за появлением
синего цвета
--1,0
0,5
0,5
Уксусная кислота добавляется для полноты денатурации белка в
контрольной пробирке. После инкубации в термостате на протяжении 15 мин.
при 37оС в каждую пробирку добавляют по 1 мл 10 %-го раствора ТХУ; по 0,5
мл 2,5 %-го раствора молибдата аммония и по 0,5 мл 5 %-го раствора
аскорбиновой кислоты. На протяжении 20 минут наблюдают за появлением
синей расцветки.
Сделать выводы.
Клинико-диагностическое значение. Определение коэффициента
окислительного фосфорилирования используется с целью характеристики
55
эффективности процессов энергопродукции в тканях в норме и при патологии.
Нарушение синтеза АТФ наблюдают в условиях действия на организм человека
и животных многих патогенных факторов химического (в частности,
естественные и синтетические токсины, лекарственные средства, и тому
подобное), биологического (гормоны, антибиотики, промежуточные продукты
метаболизма) и физического (ионизирующая радиация) происхождения. Все
они вызывают разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования за
счет нарушения способности создавать и поддерживать электрохимический
протонный потенциал на внутренней мембране митохондрий.
Опыт 2. Количественное определение активности каталазы в крови.
Принцип метода: Каталаза – фермент класса оксидоредуктаз,
катализирующий расщепление перекиси водорода на воду и кислород:
каталаза
2 Н2О2
2Н2О + О2
Метод базируется на определении количества перекиси водорода,
преобразованного ферментом за определенный промежуток времени. Перекись
водорода раскладывается каталазой, а её избыток титруют в присутствии
сульфатной кислоты:
5H2O2 + 2 KMnO4 + 3 H2SO4 → K2SO4 + 2 MnSO4 + 8 Н2О + 5О2
Материальное
обеспечение:
Разведенная
кровь
(1:1000),
дистиллированная вода, 1%-ный раствор Н2О2, 10 % раствор сульфатной
кислоты, 0,1 н раствор КМnO4, колбочки, пипетки, бюретка.
Ход работы: Разведенную кровь (1:1000) наливают по 1 мл в две
колбочки, добавляют по 7 мл дистиллированной волы, в опытную пробу
добавляют 2 мл 1 % Н2О2, а в контрольную – 5 мл 10 % раствору сульфатной
кислоты. Действие каталазы в кислой среде прекращается (в контрольной
пробе), поскольку ее рН оптимум – 7,4. Колбочки оставляют на 30 мин. при
комнатной температуре. Потом к опытной пробе добавляют 5 мл 10 % раствора
Н2SO4, а к контрольной – 2 мл 1 % р-ну Н2О2. Содержание колб титруют 0,1н рном КМnO4 до появления стойкого розового цвета.
Каталазное число (Кч) рассчитывают по формуле:
Кч= (А-В) x 1,7
А – количество мл 0,1 н р-на КМnO4, которое пошло на титрование
контрольной пробы;
В – количество в мл 0,1 н р-на КМnO4, которое пошло на титрование
опытной пробы.
В норме каталазное число составляет 10-15 единиц.
Каталазное число – это количество перекиси водорода (мг), которое
раскладывается 1 мкл исследуемой крови.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. Биологическая роль каталазы
заключается в защите организма от вредного влияния перекиси водорода.
При норме каталазное число составляет в крови 10-15 единиц. Однако
определение каталазного числа без одновременного определения количества
56
эритроцитов является нецелесообразным, поскольку количество фермента
является зависимым от количества эритроцитов. Потому в клинике используют
не каталазные числа, а показатель каталазы, в котором числителем является
каталазное число, а знаменателем – количество эритроцитов в 1 мл крови. Этот
показатель составляет в норме 2-310-6.
Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной анемии и
других макроцитарных анемиях, при введении в организм кофеина, ацетоновых
тел, алкоголя. Понижение активности фермента наблюдается при
злокачественных опухолях, инфекционных заболеваниях, таких как брюшной
тиф, скарлатина, малярия, туберкулез легких.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. В организме человека обнаружен дефицит железа. Это вызывает снижение
активности фермента:
А. Глутатионпероксидазы
В. Карбоангидразы
С. Карбоксипептидазы
D. Церулоплазмина
Е. Каталазы
2. Спряженность тканевого дыхания с окислительным фосфорилированием
происходит при наличии электрохимического градиента ионов Н+ между
матриксом и межмембранным пространством. Какое вещество из
перечисленных может разобщать процессы дыхания и фосфорилирования?
А. Соматотропин
В. Цианиды
С. Динитрофенол
D. Глюкоза
Е. Ротенон
3. В условиях нормы каталазное число составляет:
А. 1-6 единиц
В. 25-50 единиц
С. 10-15 единиц
D. 100-200 единиц
Е. 250-1000 единиц
4. Метод определения какого из перечисленных ферментов базируется на
определении количества перекиси водорода, преобразованного им за
определенный промежуток времени:
А. Аконитаза
B. Цитохромоксидаза
C. Лактатдегидрогеназа
D. Амилаза
E. Каталаза
57
5. Амитал – фармпрепарат, который применяют в фармакологии в качестве
снотворного средства. Какой механизм его действия на процессы тканевого
дыхания?
6. У больного гиперфункция щитовидной железы. Почему нарушается
биологическое окисление в клетках?
Примеры тестов “Крок-1”
1. При тиреотоксикозе повышается продукция тиреоидных гормонов Т3 и Т4,
наблюдаются похудение, тахикардия, психическая возбудимость и др. Как
именно влияют тиреоидные гормоны на энергетический обмен в митохондриях
клеток?
A. Блокируют дыхательную цепь
B. Активируют субстратное фосфорилирование
C. Блокируют субстратное фосфорилирование
D. Разобщают процессы окисления и фосфорилирования
Е. Активируют окислительное фосфорилирование
2. Судебно-медицинский эксперт во время вскрытия тела 20-летней девушки
установил, что смерть наступила в результате отравления цианидами.
Нарушение какого процесса наиболее вероятно стало причиной смерти
девушки?
A. Тканевого дыхания
B. Синтеза гемоглобина
C. Транспорта кислорода гемоглобином
D. Синтеза мочевины
E. Транспорта водорода с помощью малатаспартатного механизма
3. Повышенную стойкость “моржей” к холодной воде объясняют тем, что у них
синтезируются в больших количествах гормоны, которые усиливают процессы
окисления и образования тепла в митохондриях путем разобщения
биологического окисления и фосфорилирования. Какие это гормоны (гормон)?
A. Глюкагон
B. Адреналин и норадреналин
C. Йодсодержащие гормоны щитообразной железы (йодтиронины)
D. Инсулин
E. Кортикостероиды
Индивидуальная самостоятельная работа студентов.
1. Разобщители окислительного фосфорилирования и регуляция термогенеза.
2. Универсальность хемиоосмотической теории для живых систем.
58
Литература
Основная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина,
1998. – 701 с.
2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. –
М.: Мир, 2004. – 381 с.
Дополнительная:
1. Березов т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина,
1998. – 701 с.
2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
3. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т. – М.: Мир, 1985. – 1056 с.
4. Марри Г., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. –
М.: Мир, 2004. – 381 с.
5. Николс Д.Дж. Биоэнергетика. Введение в хемио-осмотичскую теорию. –
М.: Мир, 1985. – 190 с.
6. Скулачев в.П. Энергетика биологических мембран. – М.: Наука, 1989. –
564 с.
Тема № 9. Итоговый контроль. Модуль 2.
Теоретические вопросы
1. Предмет и задачи биохимии. Основные направления и разделы биохимии.
2. Биохимия как фундаментальная медико-биологическая наука: история
развития; научные биохимические школы, значение в системе высшего
медицинского образования.
3. Достижения биохимии, молекулярной биологии, биотехнологии и генной
инженерии в установлении молекулярных механизмов патогенеза заболеваний,
диагностике и лечении основных заболеваний человека: сердечно-сосудистых,
онкологических, инфекционных и др.
4. Химический состав живого организма. Характерные черты живой материи:
обмен веществ и энергии и их связь с внешней средой.
5. Структурные элементы клеток, их фракционное разделение методом
ультрацентрифугирования.
6. Основные методы биохимических исследований (осаждение веществ из
растворов, высаливание белков, оптические методы в биохимии, электрофорез,
хроматография, полярографический метод исследования, использование
манометрического и радиоизотопного методов в биологических исследованиях,
иммуноферментные методы анализа.
7. Ферменты:
определение; свойства ферментов как биологических
катализаторов.
59
8. Классификация и номенклатура ферментов, характеристика отдельных
классов ферментов.
9. Строение и механизмы действия ферментов. Активный и аллостерический
(регуляторный) центры.
10. Кофакторы, коферменты и простетические группы.
11. Роль ионов металлов в функционировании ферментов.
12. Классификация коферментов согоасно химической природе и по типу
реакции, которую они катализируют.
13. Коферменты – переносчики атомов водорода и электронов (НАД+, НАДФ+ коферменты – проихводные витамина РР; ФАД, ФМН – коферменты –
произврдные витамина В2 – рибофлавина; роль витамина С в окислительновосстановительных реакциях). Их строение, особенности окисленной и
влсстановленной форм.
14. Коферменты – переносчики химических групп (пиридоксалевые
коферменты; НS-КоА – коэнзим ацилирования; липоевая кислота; фолиевая
кислота).
15. Коферменты изомеризации, синтеза и расщепления С–С связей
(тиаминдифосфат; карбоксибиотин – биологически активная форма витамина Н
– биотина; метилкобаламин и дезоксиаденозилкобаламин – производные
витамина В12).
16. Внутриклеточная локализация ферментов.
17. Тканевая (органная) специфичность ферментов.
18. Изоферменты, особенности строения и функционирования, значение в
диагностике заболеваний. Объяснить на примере лактатдегидрогеназы,
креатинфосфокиназы.
19. Механизмы действия и кинетика ферментативных реакций: зависимость
скорости реакции от концентрации субстрата, рН и температуры.
20. Механизмы
каталитического
действия
химотрипсина
и
ацетилхолинэстеразы.
21. Активаторы и ингибиторы ферментов: примеры и механизмы действия.
22. Типы
ингибирования
ферментов:
обратимое
(конкурентное,
неконкурентное) и необратимое ингибирование.
23. Регуляция ферментативных процессов. Пути и механизмы регуляции:
аллостерические ферменты; ковалентная модификация ферментов.
24. Циклические нуклеотиды (цАМФ, цГМФ) как регуляторы ферментативных
реакций и биологических функций клеток.
25. Энзимопатии – врожденные (наследственные) нарушения метаболизма
углеводов, аминокислот, порфиринов, пуринов.
26. Энзимодиагностика патологических процессов и заболеваний.
27. Энзимотерапия – использование ферментов, их активаторов и ингибиторов
в медицине.
28. Принципы и методы определения ферментов в биообъектах. Единицы
измерения активности и количества ферментов.
29. Методы определения ферментов в биологических объектах (кровь, слюна,
моча, отдельные ткани).
60
30. Обмен веществ (метаболизм) – общие закономерности протекания
катаболических и анаболиче6ских процессов.
31. Общие стадии внутриклеточного катаболизма биомолекул: белков,
углеводов, липидов.
32. Цикл
трикарбоновых
кислот.
Локализация,
последовательность
ферментативных реакций, характеристика ферментрв и коферментов, значение
в обмене веществ.
33. Энергетический баланс цикла трикарбоновых кислот. Физиологическое
значение реакций ЦТК.
34. Реакции биологического окисления; типы реакций (дегидрогеназные,
оксидазные, оксигеназные) и их биологическое значение. Клеточное дихание.
35. Ферменты биологического окисления в митохондриях: пиридин-,
флавинзависимые дегидрогеназы, убихинон, цитохромы.
36. Последовательность компонентов дыхательной цепи митохондрий.
Молекулярные комплексы внутренней мембраны митохондрий. Полная и
укороченная элентронтранспортная цепь.
37. Окислительное фосфорилирование: пункты спряженности транспорта
электронов
и
фосфорилирования,
коэффициент
окислительного
фосфорилирования. Коеффициент фосфорилирования. Дыхательный контроль.
38. Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования, АТФсинтетаза митохондрий.
39. Ингибиторы транспорта электронов и разобщители окислительного
фосфорилирования.
40. Активные формы кислорода и механизмы их инактивации.
41. Объяснить основные принципы определения активности ферментов на
примере амилазы слюны (йод-крахмальная реакция и реакции Троммера и
Феллинга).
42. Подтвердить белковую природу ферментов биуретовой реакцией, реакцией
Фоля. Объяснить принципы методов.
43. Объяснить термолабильность ферментов на примере определения
активности амилазы слюны при разных температурных режимах.
44. Представить график зависимости активности пепсина и амилазы слюны от
рН среды. Объяснить его.
45. Доказать абсолютную специфичность сахаразы (в реакциях с сахарозой и
крахмалем). Какие еще виды специфичности ферментов существуют?
46. Объяснить влияние модуляторов на активность ферментов на примере
определения активности холинэстеразы в присутствии хлорида кальция и
фосфакола, на примере активности амилазы слюны в присутствии хлорида
натрия.
47. Как можно доказать функционирование ЦТК? Принцип определения
активности ферментов ЦТК. Доказать функционирование ЦТК по
использованию ацетил-КоА, по образованию СО2, по выделению из
промежуточных продуктов атомов водорода.
48. Ингибирование ферментов ЦТК малоновой кислотой. Назовите тип
ингибирования. Каким образом можно избежать негативного влияния
61
малоновой кислоты? Нарисовать график зависимости активности ферментов
ЦТК от концентрации субстрата без малоновой кислоты и в ее присутствии. К
какому классу и подклассу ферментов принадлежат ферменты ЦТК?
49. Изучение активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий. К какому
классу и подклассу ферментов принадлежит этот фермент? Объясните принцип
метода. Назовите ингибиторы ферментов дыхательной цепи, ингибиторы
окислительного фосфорилирования.
50. Исследовать процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях,
объяснить на чем он базируется. Какие фармакологические и физиологические
соединения являются разобщителями дыхания и фосфорилирования?
Объяснить молекулярный механизм их действия.
Примеры тестового контроля знаний.
1. Для разделения и количественного определения относительного содержания
каждой аминокислоты в гидролизате белков используют:
А. Электрофорез
С. Ионообменную хроматографию
В.
Распределительную
D. Ультрацентрифугирование
хроматографию
Е. Гель-фильтрацию
2. Врач назначил пациенту анализ белковых фракций крови. В лаборатории был
использован метод электрофореза. Какое свойство белков дает возможность
использовать даный метод?
А. Способность к набуханию
D. Наличие электрического заряда
В. Оптическая активность
Е. Высокая вязкость
С. Високое онкотическое давление
3. Укажите какой тип ингибирования наблюдается при использовании
ингибитора ацетилхолинэстеразы – прозерина:
А. Конкурентное
D. Бесконкурентное
В. Обратимое
Е. Аллостерическое
С. Неконкурентное
4. Ацетилхолинэстераза – фермент, который осуществляет расщепление
ацетилхолина. Инсектициды, пестициды и яды с нервно-паралитическим
действием
на
основе
фторфосфатов,
необратимо
ингибируют
ацетилхолинэстеразу. Укажите механизм ингибирования:
А.
Ингибиторы
являются
С. Ингибиторы связываются с
структурными аналогами субстрата
остатком серина в активном
В.
Ингибиторы
связываются
с
центре фермента
остатком гистидина в аллостерическом
D.
Ингибиторы
образуют
центре
комплекс з ацетилхолином
Е. Ингибиторы вызывают
денатурацию фермента
62
5. У больного наблюдается болезненность по ходу больших нервних стволов и
повышенное содержание пирувата в крови. Нехватка какого витамина может
вызывать такие изменения?
A. С
D. К
B. В1
E. РР
C. В6
6. Биохимические функции водорастворимых витаминов реализуются за счет
превращения их в коферментные формы. В какую из приведенных
коферментных форм превращается витамин РР?
A. ФМН (флавинмононуклеотид)
D. НАД
B. ФАД (флавинадениндинуклеотид)
(никотинамидадениндинуклеотид)
C. ПАЛФ (пиридоксальфосфат)
Е. ТПФ (тиаминпирофосфат)
7. Реакция конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом происходит с участием:
А. Аконитатгидратазы
В. Дигидролипоилдегидрогеназы
Е. Цитратсинтетазы
С. Пируватдегидрогеназы
D. Дигидролипоилацетилтрансферазы
8. Цианиды – клеточые яды, ингибиторы транспорта электронов на
терминальном участке дыхальной цепи митохондрий. Какой механизм их
токсического действия?
А.
Блокирование
электронного
D. Образование комплексов с Fe3+транспорта на уровне НАДН-коэнзимформой гема цитохромоксидазы
Q-редуктазы
Е. Разобщители дыхания и
В. Блокирование переноса электронов
окислительного
фосфорилирования
в
на участке цитохрома вс1
митохондриях
С. Ингибирование функций АТФсинтетазы
Примеры тестов и ситуационных задач для овладения практическими
навычками
1. Назвать оптические методы исследования, которые используются в
клинической биохимии:
А. Фотоэлектроколориметрические
D. Полярография
В. Афинная хроматография
Е. Иммуноферментный анализ
С. Флюоресцентный анализ
2. Для определения функциональных групп (-SH, NH2, имидазольных) в белках,
ферментах используют такие методы тсследования:
А. Электрофорез
D. Полярографию
В. Люминесцентний анализ
Е. Иммуноферментный анализ
С. Ионообменнную хроматографию
63
3. Что происходит с ферментами при высокой температуре?
А. Гидролиз
D. Блокирование активного
В. Денатурация
центра
С. Образование фермент-субстратного
Е. Нарушение первичной
комплекса
структуры
4. После добавления вытяжки из поджелудочной железы в пробирку с
раствором крахмала, исчезла синяя окраска в пробе с раствором йода, что
свидетельствует о гидролизе крахмала. Под влиянием какого фермента
поджелудочной железы это произошло:
А. α-Амилазы
D. Альдолазы
В. Химотрипсина
Е. Трипсина
С. Липазы
5. Метод определения какого из названных ферментов базируется на
определении количества гидрогена пероксида, который распадся за
определенный промежуток времени:
А.
Аконитаза
D.
Амилаза
B.
Цитохромоксидаза
E.
Каталаза
C.
Лактатдегидрогеназа
6. Из биологической жидкости путем висоливания выделили белок, который
будет использован для лечения. Каким методом можно освободить его от
низкомолекулярных примесей?
А. Секвенациею
D. Электрофорезом
В. Денатурацией
Е. Диализом
С. Высоливанием
7. В сыворотке крови больного пиэлонефритом выявлено изменения
соотношения белковых фракций. Укажите, каким методом можно разделить на
фракции белки плазмы крови?
8. В поджелудочной железе находятся ферменты: амилаза, пептидазы и липазы.
Какие из этих ферментов при определенных условиях могут вызывать автолиз
органа и почему?
9. У больного в сыворотке крови выявлено высокую активность ЛДГ4 и ЛДГ5,
аланинаминотрансферазы, карбамоилорнитинтрансферазы. В каком органе
можно предполагать развитие патологического процесса?
10. В инкубационную среду, где находились сукцинатдегидрогеназа и янтарная
кислота добавили малоновую кислоту. Как изменится активность фермента?
Является ли этот процесс обратимым? Как это сделать?
64
11. За сутки у человека выделяется с мочой 10 мг витамина С. Обеспечен ли
организм этим витамином?
12. Почему больным с сердечно-сосудистой недостаточностью и признаками
ацидоза назначают препарат кокарбоксилазу (тиаминпирофосфат)?
13. Во время обследования больного установлено, что активность каталазы
крови у него составляет 6 единиц. Как оценить такой результат? Опасно ли
такое состояние для организма?
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення.
Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. –
508 с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. –
Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я,
2002. – 298 с.
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. –
Львів: Світ, 2006. – 271 с.
65
МОДУЛЬ 3. МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ, ЛИПИДОВ,
АМИНОКИСЛОТ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ
№
п/п
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Тематический план практических занятий модуля 3
Кол-во
Тема занятий
часов
Исследование гликолиза – анаэробного окисления
3
углеводов.
Исследование
аэробного
окисления
глюкозы
и
3
альтернативных путей обмена моносахаридов.
Исследование катаболизма и биосинтеза гликогена.
Регуляция обмена гликогена, биосинтеза глюкозы –
3
глюконеогенез.
Исследование механизмов метаболической и гормональной
3
регуляции обмена углеводов. Сахарный диабет.
Исследование
катаболизма
и
биосинтеза
триацилглицеролов и фосфолипидов. Внутриклеточный
3
липолиз и молекулярные механизмы его регуляции.
-Окисление и биосинтез жирных кислот. Исследование
3
обмена жирных кислот и кетоновых тел.
Биосинтез и биотрансформация холестерола. Патологии
липидного обмена: стеаторея, атеросклероз, ожирение.
3
Транспортные формы липидов – липопротеины плазмы
крови.
Исследование
превращений
аминокислот
(трансаминирование,
дезаминирование,
3
декарбоксилирование), биосинтез глутатиона и креатина.
Исследование процессов детоксикации аммиака и
3
биосинтеза мочевины.
Исследование промежуточных продуктов биосинтеза
3
порфринов и их накопление при порфириях.
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
15
Итоговый модульный контроль
3
33
Всего (часов, баллов)
Кол-во
баллов
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Зарах
80
200
Задания для самостоятельной работы студентов (СРС)
№
Тема
п/п
1. Подготовка к практическим занятиям:
Приобрести практические навыки по биохимии метаболизма
углеводов:
1.1
Представить ферментативные реакции превращения
интермедиатов в гликолизе, пентозофосфатном пути,
Кол-во
часов
2
66
метаболизме гликогена.
Построение схем метаболических путей обмена углеводов.
Объяснить молекулярные механизмы регуляции метаболизма
углеводов.
Оценить по биохимическим показателям состояние
углеводного обмена при патологиях.
Приобрести практические навыки по биохимии метаболизма
липидов:
Представить схемы и биохимические реакции превращений
липидов в метаболических путях.
1.2
Объяснить молекулярные механизмы регуляции обмена
липидов и их отдельных метаболических путей.
Оценивать по биохимическим показателям нарушения
липидного обмена при патологических состояниях.
Приобрести практические навыки по биохимии метаболизма
аминокислот:
Построить схемы и написать биохимические
(ферментативные) реакции превращений аминокислот в
метаболических процесах.
1.3. Анализировать и трактовать молекулярные механизмы
регуляции обмена аминокислот и отдельных метаболических
путей.
Оценивать по биохимическим показателям нарушения обмена
аминокислот при врожденных и приобретенных нарушениях
метаболизма.
Индивидуальная СРС по выбору (индивидуальное завание) – по
2.
темам рефератов, представленных в содержательных модулях.
3. Подготовка к итоговому контролю усвоения модуля 3.
Вместе
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
15
Примечание: при оценивании темы по традиционной системе студенту
присваиваются баллы: „5” – 12 баллов, „4” – 10 баллов, „3” – 7 балла, „2” – 0
баллов.
Максимальное количество баллов за текущую деяльность студента – 120.
Студент допускается к итоговому модульному контролю при выполнении
условий учебной программы и при условии, если за текущую учебную
деяльность он набрал не меньше 70 баллов (7 ×·10 = 70).
Итоговый модульный контроль засчитывается студенту, если он
демонструет овладение практическими навыками и набирает при выполнении
модульного контроля не меньше 50 баллов.
67
Смысловой модуль 9. Метаболизм углеводов и его регуляция
Тема 1. Исследование гликолиза – анаэробного окисления углеводов.
Цель занятия: Усвоить основные принципы внутриклеточного
анаэробного и аэробного окисления глюкозы и биохимические пути их
регуляции. Знать роль коферментов и ферментов необходимых для протекания
реакций гликолиза. Овладеть особенностями протекания реакций субстратного
фосфорилирования и синтеза АТФ.
Актуальность темы: Превращение углеводов в процессах обмена
веществ играет важную роль в энергообеспечении организма. В процессе
гликолиза и спиртного брожения в результате фосфоролитического распада
углеводов образуются сначала промежуточные соединения фосфорных эфиров
триоз и гексоз, а также образуется АТФ. При фосфорилировании этих
соединений концентрация неорганического фосфора уменьшается. По
интенсивности уменьшения последнего можно судить о ходе процессов
фосфорилирования. Содержание молочной кислоты увеличивается в крови при
интенсивной работе мышц и ряде заболеваний.
Конкретные цели:
 Объяснять биохимические пути внутриклеточного анаеробного окисления
глюкозы
 Анализировать особенности реакций гликолиза, протекающих с
использованием энергии АТФ.
 Анализировать особенности реакций субстратного фосфорилирования и
синтеза АТФ.
 Объяснять роль коферментов и ферментов в протекании реакций гликолиза.
 Анализировать механизмы регуляции анаэробного окисления углеводов.
Теоретические вопросы.
1.
Глюкоза, как важный метаболит углеводного обмена: общая схема
источников и путей превращения глюкозы в организме. Специфический и
общий пути катаболизма глюкозы.
2.
Анаэробное окисление глюкозы и гликогена:
 особенности процессов гликолиза и гликогенолиза (последовательность
реакций);
 ферментативные реакции аеробного и анаэробного гликолиза;
 характеристика ферментативних реакций гликолиза, которые проходят с
использованием энергии;
 характеристика
ферментативных
реакций
субстратного
фосфорилирования гликолиза;
 механизм гликолитической оксидоредукции и реакции, которые
обеспечивают этот процесс.
68
3. Вклад работ Эмбдена, Мейергофа, Парнаса в определение
последовательности ферментативных реакций гликолиза.
4.
Лактатдегидрогеназная (ЛДГ) реакция в гликолизе, ее механизм и
особенности протекания. Изоферменты ЛДГ и клинико-диагностическое
значение их определения.
5.
Механизмы регуляции скорости реакций анаэробного окисления
глюкозы.
6.
Энергетическая ценность анаэробного окисления глюкозы.
7.
Спиртное брожение, ферментативные реакции. Реакции общие и
отличные для гликолиза и брожения.
8. Эффект Пастера – переключение с анаэробного на аэробное окисление
глюкозы, особенности регуляции.
Практическая работа
Опыт 1. Использование неорганического фосфора дрожжевыми клетками
в процессе их брожения.
В процессе спиртного брожения, так как и при гликолизе, проходит
фосфоролитический распад углеводов, что приводит к образованию как
промежуточных соединений, фосфорных эфиров триоз и гексоз, а также и к
образованию АТФ. При фосфорилювании этих соединений связывается
неорганический фосфат, концентрация которого в растворе уменьшается. По
интенсивности уменьшения количества неорганического фосфора можно
судить об интенсивности процессов фосфорилирования.
Принцип метода. Фосфаты в растворе сульфатной кислоты образуют с
молибдатами фосфорно-молибденовые комплексы, которые редуцируются
аскорбиновой кислотой в молибденовую синь. Количество фосфатов
определяют колориметрически на ФЭKе.
Материальное обеспечение. Сухие дрожжи, порошок глюкозы, или
сахарозы, стандартный раствор фосфата (10 мг фосфора/ мл), фосфатный
буфер (6 г Na2HPO4 • 2H2O и 2 г KH2PO4 на 1 л H2O – рН 7,2), 0,1 н раствор
СН3СООН, молибденовый реактив (смесь (NH4)2МоО4 и Fe(HSO4)2), 0,5 %
раствор аскорбиновой кислоты, дистиллированная вода, штатив с пробирками,
лейки, фильтры, ступка с пестиком, водяная баня (37оС), термометр, ФЭК.
Ход работы. 1.Приготовление бродильной смеси. В ступке растирают 1 г
сухих дрожжей с 5-ю мл дистиллированной воды, получая дрожджевую
суспензию. В чистую пробирку вносят 2 г глюкозы, или сахарозы, добавляют 5
мл фосфатного буферу (рН 7,2) и ставят в водяную баню при температуре 37380С. После растворения глюкозы или сахарозы в фосфатном буфере к
раствору добавляют 4 мл дрожжевой суспензии и хорошо перемешивают.
2. Исследование во времени скорости связывания неорганического фосфора в
пробах, взятых из бродильной смеси. Пипеткой набирают 1 мл бродильной
смеси и вносят в чистую пробирку. Бродильную смесь, которая осталась, ставят
в водяную баню при 37-38оС на 90 мин., отбирая в чистые пробирки по 1 мл
бродильной смеси каждые 30 мин.
69
а) Осаждение дрожжевих клеток. До 1 мл бродильной смеси добавляют 3 мл
0,1 н
раствора СН3СООН. В слабо кислой среде (рН близкое к
изоэлектрической точке) дрожжевые клетки выпадают в осадок. Последние
удаляют фильтрованием через сухой фильтр.
б) Разведение фосфатов. До 1 мл фильтрата добавляют 19 мл
дистиллированной воды (1:20 ). Из разведенного в 20 раз фильтрата отбирают
пипеткой 1 мл и вносят в чистую пробирку, и добавляют 4 мл дист. воды,
получая конечное разведение в 100 раз. Процедуру а) и б), которые описаны
выше, повторяют еще 3 раза, отбирая каждые 30 мин по 1 мл бродильной смеси
из пробирки, которая инкубируется в водяной бане при 37-38оС.
в) Колориметрирование растворов. После отбора и обработки всех четырех
проб в каждую пробирку добавляют по 4,5 мл молибденового реактива и по
0,5 мл 0,5% р-на аскорбиновой кислоты. Растворы в пробирках перемешивают
и не раньше, чем через 2 мин., но не позже чем через 5 мин, измеряют
оптическую плотность на ФЭКе, при длине волны 750 нм. Полученные
величины оптической плотности 4 проб записывают.
Построение калибровочного графика.
В 4 пробирки вносят растворы в мл, как указано ниже в таблице. В 5-й
линейке приведенные концентрации фосфора в ммоль/л, а в 6-й записывают
полученные на ФЭКе величины оптических плотностей.
№
п/п
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Название реактивов
Стандартний раствор, мл
Дистилированная вода, мл
Молибденовый реактив, мл
Раствор аскорбиновой кислоты
Концентрация фосфора в ммоль/л
Величин полученных плотностей
1
5
4,5
0,5
0
0,01
№ пробирок
2
3
0,5
1,0
4,5
4,0
4,5
4,5
0,5
0,5
16,25
32,5
0,06
0,11
4
2,0
3,0
4,5
0,5
65
0,21
По результатам измерений оптических плотностей строят калибровочный
график, откладывая на оси ординат полученные оптические плотности, а на оси
абсцисс концентрацию фосфора в ммоль/л .
Пользуясь калибровочным графиком, по величинам оптических
плотностей исследуемых проб находят концентрацию фосфора.
70
Калибровочный график
Е,Оптическая
плотность
График зависимости концентрации
неорганического фосфора от времени
моль/л
концентрация
ммоль/л
хв.
На основании полученных данных строят график зависимости
концентрации неорганического фосфора от времени инкубации (концентрацию
неорганического фосфора откладывают на оси ординат, время инкубации в
мин на оси абсцисс). Сделать вывод.
Опыт 2. Количественное определение молочной кислоты в сыворотке
крови за методом Бюхнера.
Молочная кислота в организме является конечным продуктом гликолиза и
гликогенолиза – анаэробных процессов окисления глюкозы и гликогена.
Значительное количество молочной кислоты образуется в мышцах, поступает в
кровь, переносится к сердечной мышце и в печень, где окисляется.
Принцип метода. Молочная кислота при нагревании с концентрированной
сульфатной кислотой превращается в уксусный альдегид, который при
взаимодействии с гидрохиноном образует соединение красно-коричневого
цвета. Количество молочной кислоты определяют колориметрически на ФЕКу
синий светофильтр (длина волны 380 нм).
Материальное обеспечение. Сыворотка крови,
5% раствор
метафосфорной кислоты, 10% раствор меди сульфата, кальция гидроксид в
порошке, концентрированная сульфатная кислота, 20% раствор гидрохинона,
стандартный раствор молочной кислоты, дистиллированная вода, пробирки с
притертыми пробками на 15 мл, стеклянные лейки, стеклянные палочки,
фильтры, водяная баня, газовая горелка, ФЭК.
Ход работы. В две сухие пробирки наливают по 6 мл дистиллированной
воды. Потом в первую добавляют 1 мл стандартного раствора молочной
кислоты, в другую - 1 мл сыворотки крови. Для осаждения белков вносят в
каждую пробирку по 1 мл метафосфорной кислоты, стряхивают и оставляют на
несколько минут, после чего фильтруют. К фильтратам добавляют по 1 мл 10%
раствора меди сульфата и по 0,5 г кальция гидроксида. Пробы перемешивают
стеклянными палочками, через 5 мин. фильтруют. Отмеряют по 1 мл фильтрата
71
в пробирки с притертыми пробками, добавляют по 0,1 мл 10% раствора меди
сульфата и по 4 мл концентрированной сульфатной кислоты. Пробирки ставят в
кипящую водяную баню на 1,5 мин. После охлаждения добавляют по 0,1 мл
20% спиртного раствора гидрохинона, хорошо перемешивают и кипятят 15
мин. Пробирки охлаждают и колориметрируют при синем светофильтре (длина
волны 380 нм).
Расчеты: Концентрацию молочной кислоты рассчитывают за формулой:
С СТАНДАРТА . Е ОПЫТА
С = -----------------------------------------Е СТАНДАРТА
где С – конц. молочной кислоты в сыворотке крови, ммоль/л.
С СТАНДАРТА - концентрация молочной кислоты в стандартном растворе.
Е СТАНДАРТА - оптическая плотность стандартного раствора молочной
кислоты.
Е ОПЫТА - оптическая плотность опытной пробы.
Оценить полученный результат. Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. В крови здорового человека содержится
1-2 ммоль/л молочной кислоты. Увеличение содержания молочной кислоты
может быть связано с выполнением человеком интенсивного физического
труда за короткий промежуток времени без достаточного поступления
кислорода. При этом не проходит в достаточной мере окислительное
декарбоксилирование пирувату в ацетил-КоА, а только образование лактата.
Последний может использоваться в восстановительном периоде при
достаточном поступлении кислорода. Наблюдается увеличение молочной
кислоты при остром гнойном воспалительном пораженные тканей, тяжелой
анемии, эпилепсии, тетании, столбняке, гипоксии, связанной с сердечной и
легочной недостаточностью, злокачественных новообразованиях, заболеваниях
печени (острых гепатитах, циррозе печени), сахарном диабете, почечной
недостаточности, остром септическом эндокардите, полиомиелите, лейкозах,
интенсивных и длительных физических нагрузках и др.
Для большинства указанных состояний (лактатацидоз) увеличивается
соотношение лактат / ПВК, как правило, оно равняется 10:1.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. При каких патологических состояниях количество молочной кислоты
увеличивается в крови?
А. Сахарном диабете;
В. Анемии;
С. Инфаркте миокарда;
D. Гепатитах;
Е. Эпилепсии.
2. С целью определения концентрации молочной кислоты в крови пользуются
методом, принцип которого заключается в:
72
А. восстановлении солей тяжелых металлов в щелочной среде;
В. определении интенсивности цвета соединения, образованного при
взаимодействия глюкозы с ортотолуидином;
С. действии фермента глюкозооксидазы, который окисляет глюкозу в
глюконовую кислоту кислородом воздуха;
D. восстановлении двувалентных ионов меди в одновалентные;
Е. фотометрировании окрашенного комплекса, что образовался в процессе
взаимодействия с концентрированной сульфатной кислотой и гидрохиноном
3. Больной находится в состоянии шока. Содержание молочной кислоты в
крови 10 ммоль/л. Оцените этот показатель. К каким последствиям это может
привести?
4. У больного обнаружено повышение активности ЛДГ1, ЛДГ2 и
креатинкиназы. В каком органе возможное развитие патологического процесса?
5. У спортсмена после соревнований повысилось содержание молочной
кислоты в крови. Можно ли считать это патологией? Ответ обьясните.
Тесты “Крок -1”
1. Гликолиз – это анаэробный путь распада глюкозы, что протекает с помощью
ряда последовательных реакций. Укажите какую реакцию гликолиза
катализирует энзим фосфофруктокиназа?
А. Образование глюкозо-6-фосфата
В. Образование фруктозо-1-фосфату
С. Образованиея фруктозо-1,6-дифосфата
D. Образование диоксиацетонфосфата
Е. Образование 1,3-дифосфоглицерата
2.Укажите реакции гликолиза, которые протекают с затратой энергии в виде
АТФ:
A. Альдолазная, фосфофруктокиназная
B. Пируваткиназная, гексокиназная
C. Гексокиназная, фосфофруктокинаная
D. Фосфоглицераткиназная, гексокиназная
E. Пируваткиназная, фосфоглицеромутазная
3. Эритроцит для своей жизнедеятельности нуждается в энергии в виде АТФ.
Какой процесс обеспечивает эту клетку необходимым количеством АТФ?
A. Анаэробный гликолиз
B. Аеробное окисление глюкозы
C. Пентозофосфатний цикл
D.В -окисление жирных кислот
E. Цикл трикарбонових кислот
73
4. При употреблении печенья, конфет в смешанной слюне временно
повышается уровень лактата. Активация какого биохимического приводит к
этому?
А. Анаэробного гликолиза
В. Тканевого дыхания
С. Аэробного гликолиза
D. Глюконеогенеза
Е. Микросомального окисления
5. В дрожжевых организмах происходит процесс близкий к гликолизу –
спиртное брожение, в результате которого через ряд последовательных стадий
из пирувата образуется:
A. Лактат
B. Этанол
C. Ацетальдегид
D. Глицеральдегид
E. Пируват
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1.
Нарушение углеводородного обмена и его коррекция фармпрепаратами.
2.
Принципы регуляции обмена глюкозы. Характеристика регуляторных
ферментов гликолиза и глюконеогенеза.
Литература
Основная:
1. Губський Ю.І. Біологічна хімія.- Київ-Тернопіль: Укрмедкнига.-200.-508с.
2 Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.Тернопіль: Укрмедкнига.-2002.-744с.
3. Скляров О.Я., Сергієнко О.О., Фартушок Н.В. та ін Обмін вуглеводів.
Біохімічні та клінічні аспекти.- Львів: Світ.- 2004.-111с.
Дополнительная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. –
704 с.
2. Парнас Я.О. Гликогенолиз // Успехи современной биологии. – 1940. - № 12. –
С. 393-446.
Тема 2. Исследование аэробного окисления глюкозы и альтернативных
путей обмена моносахаридов
Цель занятия: Знать роль мультиферментного пируватдегидрогеназного
комплекса для аэробного превращения глюкозы. Овладеть особенностями
метаболических путей превращения фруктозы и галактозы в организме
человека. Усвоить последовательность ферментативных реакций и значение
пентозофосфатного пути окисления глюкозы.
74
Актуальность темы: Обмен углеводов представляет собой одно из
важнейших звеньев всего обмена веществ как единого целого. Это понятие
охватывает весь сложный процесс превращения углеводов от поступления их в
организм, пищеварение и всасывание, до образования конечных продуктов СО2 и Н2О.
В аэробних условиях продукт гликолиза - пируват - в реакции
окислительного декарбоксилирования теряет СО2, а двухуглеродный фрагмент
в виде ацетиловой группы включается в КoА с образованием ацетил - КoА.
Дальше эта ацетиловая группа окисляется до СО2 и Н2О в цикле трикарбонових
кислот (цикл Кребса).
Скорость функционирования цикла Кребса зависит от потребностей клетки
в АТФ. Важной регуляторной реакцией цикла является синтез цитрата из
оксалоацетата и ацетил - КoА. АТФ является аллостерическим ингибитором
цитратсинтазы. Вторая регуляторная реакция - это реакция, что катализуеться
изоцитратдегидрогеназой, которая аллостерично стимулируется АДФ. Третьей
регуляторной реакцией цикл трикарбонових кислот является реакция, которая
катализуется
-кетоглутаратдегидрогеназой.
Последняя
ингибируется
сукцинил - КoА и НАДН2.
Таким образом, цикл трикарбонових кислот это конечный общий путь
окисления топливных молекул, что обеспечивает регенерацию АТФ. Кроме
этого, он служит источником строительных блоков для процессов биосинтеза.
Цикл трикарбонових кислот может функционировать только в аэробних
условиях.
Пентозофосфатный путь – апотомический путь расщепления глюкозы можно разделить на две фазы: 1) окислительную, 2) неокислительную.
Окислительная фаза приводит к образованию восстановленных эквивалентов
НАДФН + Н+, пентоз и углекислого газа, который во время гликолиза не
образуется. Окиление глюкозо-6-фосфата по пентозофосфатному пути
катализуеться глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой НАДФ+-зависимой, а не НАД+зависимой.
Биологическое значение пентозофосфатного пути заключается прежде всего
в том, что он является единственным источником восстановленых эквивалентов
НАДФН + Н+ в организме, которые используются в реакциях синтеза жирных
кислот, холестерина, стероидных гормонов, желчных кислот, витамина Д и т.д.
В эритроцитах молекулы НАДФН + Н+ поддерживают высокий уровень
восстановленного глутатиона, который защищает ненасыщенные жирные
кислоты мембран от пероксидного окисления липидов. Недостаточность в
эритроцитах глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы приводит к нарушению
образования НАДФН + Н+, в результате – к гемолизу эритроцитов.
Значение
пентозного пути также заключается в том, что он поставляет пентозы для
синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот.
Конкретные задания:
 Объяснять механизмы превращения моносахаридов до конечных продуктов
с освобождением энергии в аэробних условиях.
75
 Анализировать
структурно-функциональные
особенности
мультиферментного пируватдегидрогеназного комплекса.
 Объяснять последовательность ферментативних реакций и значение
пентозофосфатного пути окисления глюкозы.
 Анализировать метаболические пути превращения фруктозы и галактозы в
организме человека.
Теоретические вопросы.
1.
Этапы и схема аэробного окиления глюкозы
2.
Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты:
 строение мультиферментного пируватдегидрогеназного комплекса;
 особенности функционирования пируватдегидрогеназного комплекса;
 механизм реакции окислительного декарбоксилирования пирувата;
 роль витаминов и коферментов в превращении пирувата в ацетил-КоА;
3.
Энергетическая ценность аэробного окисления глюкозы.
4.
Пентозофосфатний путь (ПФП) окисления глюкозы:
.  схема реакций окислительной и неокислительной стадий ПФП;
 роль ферментов и коферментов в течении реакций ПФП;
 биологическое значение ПФП.
5.
Ферментативные реации превращения фруктозы в организме человека.
Наследственные энзимопатии обмена фруктозы.
6.
Ферментативные реакции превращения галактозы в организме человека.
Наследственные энзимопатии обмена галактозы
Практическое занятие
Опыт 1. Количественное определение пировиноградной кислоты
(ПВК) в моче колориметрическим методом.
Пировиноградная кислота – один из центральных метаболитов углеводного
обмена. Определение ее количества в плазме крови и мочи широко
используется с диагностической целью в клинической практике.
Принцип метода. Пировиноградная кислота (ПВК) с 2,4динитрофенилгидразином (2,4 ДНФГ) в щелочной среде образует 2,4динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты коричнево-красного цвета,
интенсивность которого пропорциональна концентрации ПВК и определяется
колориметрически.
NH-NH
CH
2
NO
N O2
2
+
CH 3
3
C
COOH
O
C
N
NH
+
H2O
N O2
COOH
N O2
2 , 4 ДНФГ
ПВК
с полу к а к оричневочервоног о к оль ору
76
Материальное обеспечение. Моча, стандартный раствор пирувата (ПВК)
- 625мг в100мл воды, 0,1% раствор 2,4- динитрофенилгидразина в 2 н растворе
соляной кислоты, 12% раствор гидроксида натрия, дистиллированная вода,
штатив с пробирками, пипетки, ФЕК.
Ход работы. Берут 2 пробирки, в одну наливают 0,1 мл мочи, в другую 0,1 мл ПВК, а затем в обе пробирки добавляют по 0,9 мл дистиллированной
воды. После этого вносят по 0,5мл 0,1% р-ра 2,4- динитрофенилгидразина,
смешивают и на 20 мин. ставят в темное место. Позже добавляют по 1 мл 12%
раствора гидроксида натрия и через 10 мин. колориметрируют на ФЭКе против
контроля (воды) при синем светофильтре (длина волны 380 нм).
РАСЧЕТ: Концентрацию ПВК высчитывают за формулой.
С СТАНД. • Е ОПЫТ. •V
С ДОСЛ.= --------------------------------,
Е СТАНД. • а
где:
С СТАНД - концентрация стандартного раствора ПВК.
С ОПЫТ – концентрация ПВК в моче (мг/сутки).
Е ОПЫТ - оптическая плотность исследуемой пробы.
Е СТАНД – оптическая плотность стандарта
V - суточное количество мочи
а - 0,1 мл мочи, взятой для анализа.
Сравнить полученный результат с нормативными величинами. Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. В крови здорового человека
содержится 45-115 мкмоль/л ПВК, с мочой за сутки выделяется 15-25 мг ПВК.
Содержание ПВК в крови (вместе с молочной кислотой) повышается при
усиленном физическом
труде, а также при некоторых патологических
состояниях, что сопровождается судорогами (тетания, эпилепсия, столбняк).
Увеличивается выделение ПВК с мочой при В1- витаминной недостаточности,
сердечной
недостаточности,
токсикозах,
заболеваниях
печени,
инсулинзависимом
сахарном
диабете,
диабетическом
кетоацидозе,
дыхательном алкалозе, уремии, гепатоцеребральной дистрофии, гиперфункции
гипофизарно-адреналовой и симпатико-адреналовой систем, а также после
введения камфары, стрихнина, адреналина. К увеличению ПВК приводят
токсичное действие ацетилсалициловой кислоты, отравление ртутью,
мышьяком, сурьмой.
Содержание ПВК резко повышается в спинномозговой жидкости при
травматических заболеваниях ЦНС, воспалительных процессах: менингите,
абсцессе мозга. Под воздействием наркоза уровень ПВК в крови несколько
снижается. Все факторы, которые предопределяют увеличение концентрации
ПВК, как правило, приводят к росту уровня молочной кислоты.
Таким образом, основной причиной накопления в крови пировиноградной и
молочной кислот является нарушение их последующего ферментативного
превращения в обычные продукты распада в результате разных причин.
77
Контроль выполнения лабораторной работы
1. При каких патологических состояниях увеличивается количество пирувата в
моче?
А. Сахарном диабете;
В. Остром панкреатите;
С. Инфаркте миокарда;
D. Гепатитах;
Е. Эпилепсии.
2. С целью установления концентрации пировиноградной кислоты в моче
используют метод, принцип которого заключается в:
А. восстановлении солей тяжелых металлов в щелочной среде;
В. определении интенсивности цвета соединения, что образовалось при
взаимодействия глюкозы с ортотолуидином;
С. действия фермента глюкозооксидазы, который окисляет глюкозу в
глюконовую кислоту кислородом воздуха;
D. восстановлении двухвалентных ионов меди в одновалентные;
Е. фотометрировании окрашенного комплекса, что образовался в процессе
взаимодействия пировиноградной кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4
ДНФГ) в щелочной среде
3. У больного обнаружено в крови 5,15 ммоль/л молочной кислоты и 0,35
ммоль/л пировиноградной кислоты. При каких состояниях повышаются в крови
эти показатели?
4. Содержание ПВК в моче составляет 45 мг/сутки. Дать оценку результату.
Какие возможные причины и последствия такого состояния?
5. У больных со сниженной активностью глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в
эритроцитах наблюдается повышенная чувствительность к окислителям, а
также нарушается восстановление метгемолобина. Какая причина такого
состояния?
6. Почему больным с сердечно-сосудистой недостаточностью и признаками
ацидоза назначают кокарбоксилазу?
Тесты “Крок-1”
1. У мальчика 3 лет наблюдается увеличение в размерах печени и селезенки,
катаракта. В крови – повышенная концетрация глюкозы, однако тест
толерантности к глюкозе – в норме. Наследственное нарушение обмена какого
вещества является причиной этого состояния?:
A. Глюкозы
B. Галактози
C. Фруктозы
78
D. Сахарозы
E. Манозы
2. При окислении в пентозофосфатном цикле 6 молекул глюкозы образуется:
А. 3 мол. НАДФН2
В. 6 мол. НАДФН2
С. 9 мол. НАДФН2
D. 12 мол. НАДФН2
Е. 15 мол. НАДФН2
3. Окисленная форма липоамида превращается в дигидролипоамид при
участии:
А. Дигидролипоилдегидрогеназы
В. Дигидролипоилацетилтрансферазы
С. НАД
D. ФАД
Е. ТПФ
4. Эссенциальная фруктозурия – наследственное заболевание, связанное с
нарушением обмена фруктозы. При этой патологии наблюдаются симптомы
поражения печени и почек. Причиной является отсутствие фермента, который
катализирует превращение фруктозы в:
A. Фруктозо-1-фосфат
B. Фруктозо-6-фосфат
C. Фруктозо-1,6-дифосфат
D. Глюкозо-1-фосфат
E. Глицеральдегидфосфат
5. Одним из важных субстратов окисления глюкозы является пируват, который
образуется как промежуточный продукт распада углеводов, белков
аминокислот. Окислительное декарбоксилирование пирувата осуществляется с
помощью пируватдегидрогеназного комплекса в состав которого входит:
A. Пируваткиназа
B. Лактатдегидрогеназа
C. Сукцинатдегидрогеназа
D. Малатдегидрогеназа
E. Дигидролипоилдегидрогеназа
6. При сердечных заболеваниях для улучшения обеспечения энергией сердца,
мозга, интенсификации окислительных процессов применяют кокарбоксилазу
(тиаминпирофосфат) в виде инъекций. Какие метаболические процессы
активируются при этом?
А. Декарбоксилирование гистидина
В. Дезаминирование глутамата
С. Окислительное декарбоксилирование пирувата
79
D. Трансаминирование аспартата
Е. Субстратное фосфорилирование
7. НАДФН2, образованный в результате пентозофосфатного пути используется
организмом для:
A. Синтеза жирных кислот
B. Синтеза аминокислот
C. Синтеза гликогена
D. Синтеза мочевины
E. Синтеза нуклеотидов
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1.
Патохимия нарушений пентозофосфатного пути.
2.
Патохимия энзимопатий, связанных с генетическими дефектами синтеза
ферментов метаболизма фруктозы и галактозы.
Литература
Основная:
1.Губський Ю.І. Біологічна хімія.- Київ-Тернопіль: Укрмедкнига.-200.-508с.
2.Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.Тернопіль: Укрмедкнига.-2002.-744с.
3.Скляров О.Я., Сергієнко О.О., Фартушок Н.В. та ін Обмін вуглеводів.
Біохімічні та клінічні аспекти.- Львів: Світ.- 2004.-111с.
Дополнительная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. –
704 с.
Тема 3. Исследование катаболизма и биосинтеза гликогена. Регуляция
обмена гликогена, биосинтез глюкозы – глюконеогенез
Цель занятия: Знать механизмы гормональной регуляции обмена
гликогена в мышцах и печени и усвоить особенности реакций синтеза и распада
гликогена. Овладеть основными принципами регуляции и особенностями
протекания рекций глюконеогенеза.
Актуальность темы: Гликоген является основной молекулярной формой
запасания углеводов в организме человека и животных, которая
аккумулируется в виде внутриклеточных гранул, преимущественно в печени и
мышцах. Концентрация гликогена в гепатоцитах значительно превышает его
концентрацию в клетках мышц, но, учитывая общую массу скелетных мышц, в
них акумулируется большая часть гликогена организма.
В организме человека существуют регуляторные механизмы, которые
контролируют координированные изменения процессов синтеза и распада
гликогена в условиях изменений режимов питания, перехода организма от
состояния покоя к активной деятельности.
80
Основную роль в регуляции реакций гликогенолиза и гликогенеза играют
ключевые ферменты расщепления и синтеза гликогена: гликогенфосфорилаза и
гликогенсинтетаза. Контроль за их активностью осуществляется путем
ковалентной модификации (фосфорилирования – дефосфорилирования) и
частично – путем алостеричной регуляции.
Конкретные задания:
 Объяснять особенности реакций распада и биосинтеза гликогена.
 Анализировать механизмы гормональной регуляции обмена гликогена в
мышцах и печени.
 Объяснять генетические нарушения метаболизма гликогена.
 Анализировать особенности хода реакций и субстраты глюконеогенеза.
 Объяснять и уметь анализировать механизмы регуляции глюконеогенеза.
Теоретические вопросы.
1. Особенности протекания и механизм ферментативных реакций гликогенеза.
2. Гликогенолиз, реакции общие и отличные с гликолизом.
3. Каскадные
механизмы
АТФ-зависимой
регуляции
активностей
гликогенфосфорилази и гликогенсинтетази.
4. Особенности гормональной регуляции обмена гликогена в мышцах и
печени.
5. Наследственные нарушения ферментов синтеза и распада гликогена.
Гликогенозы, агликогенозы, их характеристика, причины возникновения.
6. Особенности метаболизма углеводных компонентов гликокон’югатов и
генетические нарушения их обмена.
7. Генетические нарушения метаболизма гликонъюгатов (гликозидозы),
мукополисахаридозы, ревматизм.
8. Метаболические пути и субстраты глюконеогенеза, механизмы регуляции
процесса.
9. Взаимосвязь гликолиза и глюконеогенеза (цикл Кори). Необратимые реакции
гликолиза и их обходные пути. Глюкозо-лактатный, глюкозо-аланиновый
циклы.
10. Пути регуляции глюконеогенеза в организме человека.
Практическая работа
Опыт 1. Реакция на полисахариды.
Принцип метода. При взаимодействии крахмала с иодом образуются
комплексные адсорбционные соединения, которые окрашиваются в синий
цвет.
Материальное обеспечение: 1% раствор крахмала, раствор Люголя
(раствор иода в йодиде калия), штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы. В пробирку вносят 0,5 мл раствора крахмала и добавляют 1-2
капли раствора Люголю. Наблюдают появление синей окраски которое
объясняется адсорбцией иода крахмалом и образованием комплексных
соединений крахмала с иодом. Это можно выразить схемой:
81
(C6H10O5)n  I2
На холоде
--------- (C6H10O5)n I2
-------при нагреваниии
Сделать вывод.
Опыт 2. Выявление гликогена в печени.
Принцип метода. Гликоген, как и крахмал, с иодом образует
окрашенные соединения (крахмал темно-синего цвета, гликоген – краснобурого).
Материальное обеспечение: печень свежая или свежезамороженная,
раствор Люголя (раствор иода в йодиде калия), раствор уксусной кислоты,
фарфоровая ступка, водяная баня, бумажные фильтры, штатив с пробирками,
пипетки.
Ход работы. 0,5 г свежезамороженной печени помещают в стакан,
измельчают ножницами, заливают 4 мл кипяченной дистиллированной воды,
переносят в пробирку и кипятят на протяжении 2-3 минут (для инактивации
ферментов). Позже содержание пробирки переливают в фарфоровую ступку и
растирают до получения однородной массы. Этот гомогенат разводят 1 мл
дистиллированной воды, переносят в пробирку и кипятят на водяной бане 20
минут, добавляя воду по каплям по мере выкипания жидкости.
Для более полного осаждения белков кипящую жидкость подкисляют 5-10
каплями 1% раствора уксусной кислоты.
Осадок белка отделяют фильтрованием через смоченный водой бумажный
фильтр. К фильтрату добавляют 2-3 капли раствора Люголя. При наличии в
исследуемом материале гликогена раствор приобретает характерную краснобурую расцветку.
Клинико-диагностическое значение. Гликоген – полисахарид, который
является основным резервом углеводов в организме. Главное депо для
гликогена – печень и мышцы. Норма в крови – 16,2 – 38,7 мг/л.
Повышение концентрации гликогена в крови наблюдают при
инфекционных заболеваниях, болезнях крови, которые сопровождаются
лейкоцитозом, диабете, новообразованиях.
Снижение концентрации характерное для детей с острыми гепатитами.
Важное клиническое значение имеет цитохимичне определение уровня
гликогена в клетках крови, костного мозга и печенке.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. При добавлении к гомогенату, который содержит гликоген раствор иода
образуется окрашенное соединение:
А. Синего цвета;
В. Красно-бурого цвета;
82
С. Зеленого;
D. Бесцветное соединение;
Е. Фиолетового цвета
2.
У больного судорога в мышцах при напряженной работе, а в остальном
чувствует себя здоровым. При биопсии мышечной ткани обнаружен большой
избыток гликогена. Концентрация глюкозы в крови ниже нормы. О
недостаточности какого фермента следует думать?
3.
Известно, что гликоген, который составляет энергетический запас
организма, откладывается впрок в печени и мышцах, но не создает резерва в
такой
важной ткани как мозг, которая в большом количестве использует
глюкозу. Объясните, почему гликоген не запасается в мозге?
Тесты “Крок-1”
1. Гликоген – полисахарид, что имеет способность накапливаться в печени и
мышцах. Процессы синтеза и распада гликогена в клетках регулируются
благодаря включению механизмов фосфорилювання ключевых ферментов
обмена гликогена:
А. Гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы
В. Гликогенфосфорилазы и липазы
С. Гликогенсинтаы и протеинкиназы
D. Фосфопротеинфосфатазы и протеинкиназы
Е. Аденилатциклазы и липазы
2. Ребенок – хилый, апатичный. Печень увеличена и при ее биопсии обнаружен
значительный избыток гликогена. Концентрация глюкозы в крови ниже нормы.
В чем причина указанных нарушений?:
A. Сниженная активность гликогенфосфорилазы в печенке
B. Сниженная активность гликогенсинтазы
C. Сниженная активность глюкозо-6-фосфатизомеразы
D. Сниженная активность глюкокиназы
E.
Дефицит
гена,
который
отвечает
за
синтез
глюкозо-1фосфатуридилтрансферазы
3. При исследовании крови у больного обнаружена выраженная
гипоглюкоземия натощак. При исследовании биоптату печени оказалось, что в
клетках печени не происходит синтез гликогена. Недостаточность какого
фермента является причиной заболевания?
А. Гликогенсинтазы
В. Фосфорилазы
С. Альдолазы
D. Фруктозодифосфатазы
Е. Пируваткарбоксилазы
83
4. Фосфоролитический распад углеводов играет ключевую роль в мобилизации
полисахаридов. В результате действия энзима фосфорилазы гликоген
распадается с образованием:
A. Глюкозо-1-фосфата
B. Глюкозо-1,6-дифосфата
C. Глюкозо-6-фосфата
D. Глюкозы
E. Фруктозо-6-фосфата
5. У ребенка с точечной мутацией генов обнаружено отсутствие глюкозо-6фосфатазы, гипогликемия и гепатомегалия. Укажите вид патологии, для
которой характерные эти признаки:
А. Болезнь Адисона
В. Болезнь Гирке
С. Болезнь Паркинсона
D. Болезнь Коре
Е. Болезнь Мак-Ардля
6. У больного сниженная выносливость к физическим нагрузкам, в то время как
в скелетных мышцах содержание гликогена повышено. Снижением активности
какого фермента это объясняется?
A. Фосфофруктокиназы
B. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
C. Гликогенфосфорилазы
D. Гликогенсинтазы
E. Глюкозо-6-фосфатазы
7. Синтез гликогена осуществляется под воздействием ряда ферментов.
Укажите, какой из энзимов катализирует образование ?-1,6-гликозидных связей
в молекуле гликогена:
А. Гликогенсинтаза
В. Гексокиназа
С. Глюкокиназа
D. Гликозил-4,6-трансфераза
Е. Глюкозо-1-фосфатуридилтрансфераза
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Принципы регуляции биосинтеза и расспада гликогена.
2. Наследственные
нарушения
синтеза,
распада
гликогена
гликоконьюгатов.
и
Литература
Основная:
1.Губський Ю.І. Біологічна хімія.- Київ-Тернопіль: Укрмедкнига.-200.-508с.
84
2.Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.Тернопіль: Укрмедкнига.-2002.-744с.
3.Скляров О.Я., Сергієнко О.О., Фартушок Н.В. та ін Обмін вуглеводів.
Біохімічні та клінічні аспекти.- Львів: Світ.- 2004.
Дополнительная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. –
704 с.
Тема 4. Исследование механизмов метаболической и гормональной
регуляции обмена глюкозы крови. Сахарный диабет.
Цель занятия: Знать роль гормонов в регуляции и поддержании
постоянного уровня глюкозы в крови. Усвоить особенности нарушения обмена
углеводов, жиров, белков при сахарном диабете.
Актуальность темы: Концентрация глюкозы в крови зависит от
равновесия между поступлением ее в кровь и потреблением тканями.
Поскольку выведение глюкозы из организма в норме достаточно
незначительно, то поддержка постоянства ее концентрации в относительно
узких границах при значительных колебаниях поступления с едой
обеспечивается
процессами обмена в тканях. Система регуляторных
механизмов
включает
гормоны
инсулин,
глюкагон,
адреналин,
глюкокортикоиды, а также взаимодействия между тканями: печенью,
мышцами, мозгом и др.
Конкретные задания:
 Анализировать основные источники и пути использования глюкозы крови.
 Объяснять роль гормонов в поддержке постоянного уровня глюкозы в крови.
 Объяснять нарушение метаболизма углеводов при сахарном диабете.
Теоретические вопросы.
1.
Основные углеводы пищи. Механизм пищеварения углеводов в
желудочнокишечном тракте. Механизм всасывания углеводов.
2.
Биохимические процесы, обеспечивающие постоянный уровень глюкозы
в крови. Роль разных путей обмена углеводов в регуляции уровня глюкозы в
крови.
3. Роль печени в обмене углеводов.
4.
Эндокринная регуляция обмена углеводов:
o инсулин, строение, механизм действия, роль в обмене углеводов;
o адреналин и глюкагон, механизмы их регулирующего действия на обмен
углеводов;
o глюкокортикоиды, их влияние на обмен углеводов;
5.
Характеристика гипер-, гипогликемии и глюкозурии.
6.
Инсулинзависимая и инсулиннезависимая формы сахарного диабета.
7.
Характеристика биохимических нарушений при сахарном диабете.
8.
Биохимические тесты для оценки сахарного диабета. Нарушение
толерантности к глюкозе. Биохимические критерии сахарного диабета.
85
СН3
N
O
CH3
N H2
орт от олу ї дин
H
+
C
H
C
OH
HO C
H
H
C
H
C OH
CH2OH
OH
г люк оз а
C
H
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C OH
CH2OH
+
H O
2
г люк оз а мі н
с полу к а с инь о- з еленог о
к оль ору
Практическая работа.
Опыт 1. Количественное определение сахара в крови орто –
толуидиновим методом (за Гульманом).
Принцип метода. Глюкоза при нагревании с орто-толуидином в растворе
уксусной кислоты образует соединение синьо-зеленого цвета, интенсивность
которого прямо пропорциональная концентрации глюкозы.
Материальное обеспечение. Кровь, 3% раствор трихлоруксусной
кислоты (ТХУ), орто-толуидиновый реактив, стандартный раствор глюкозы (4
ммоль/л, 720 мг глюкозы растворить в 1 л дист.води),дистилированная вода,
штатив с пробирками, пипетки, микропипетка на 0,1 мл, центрифуга,
центрифужные пробирки, ФЭК, водяная баня (100 0С).
Ход работы. В две центрифужные пробирки наливают по 0,9 мл 3%
раствора ТХУ кислоты. В одну из них вносят 0,1 мл крови, а в другую – 0,1 мл
стандартного раствора глюкозы. Содержание пробирок перемешивают и
центрифугируют при 3000 об/мин на протяжении 10 мин. Из каждой пробирки
отбирают по 0,5 мл надосадочной жидкости и добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива. Помещают пробирки в водяную баню на 8 мин. Потом
их вынимают из водяной бани и охлаждают до комнатной температуры. После
этого на ФЭКе определяют оптическую плотность проб в кюветах на 10 мл
против воды при длине волны 630 нм, используя красный светофильтр.
Расчет. Содержание глюкозы определяют за формулой:
С СТАНДАРТА • Е ОПЫТ.
С =----------------------------------------Е СТАНДАРТА
Где: С – конц. глюкозы в крови, ммоль/л.
С СТ.- конц. стандартного р-на глюкозы.
Е ОПЫТ.- оптическая плотность исследуемой пробы.
Е СТ.- оптическая плотность стандартного р-ра глюкозы.
Сравнить с нормой полученный результат. Сделать вывод.
86
Опыт
2.
Определение
концентрации
глюкозы
в
крови
глюкозооксидазным методом.
Принцип метода. Окисление глюкозы кислородом воздуха под
действием глюкозооксидазы с образованием гидрогена пероксида, который в
присутствии фенола с 4 – амино – феназоном (4- аминоантипирином) образует
окрашенное соединение.
Материальное обеспечение: глюкозооксидаза (активность 60 000 – 120
000 од/г), пероксидаза из конского хрона (активность 11 000 од/мг), фенол, 4 –
амино – феназон , Д- Глюкоза, фосфатный буфер 0,1 М рН 7,0 рабочий реактив
(150 мг/л глюкозооксидазы, 1,1 мг/л пероксидазы, 1,034 г фенола, 0,148 г 4 –
амино – феназона, довести фосфатным буфером до 1 л, стабильный на
протяжении 1 мес. в посуде из темного стекла при температуре 4 ОС), 0,2 %
раствор бензойной кислоты (2 г бензойной кислоты растворяют в 800 мл
дистиллированной воды во время нагревания, после охлаждения объем
раствора доводят в мерной колбе на 1000 мл к отметке дистиллированной
водой, фильтруют), основной калибровочный раствор глюкозы 27,75 ммоль/л
(500мг высушенной к постоянной массе Д – Глюкозы растворяют в мерной
колбе на 100 мл в небольшом количестве 0,2 % раствора бензойной кислоты),
калибровочный раствор глюкозы 5,55 ммоль/л (100 мг/100мл), стандарт
(основной калибровочный раствор глюкозы разводят в 5 раз 0,2 % раствором
бензойной кислоты), раствор хлоридной кислоты 0,33 ммоль/л.
Ход работы. Последовательность опыта представлена в таблице
Таблица 1. Последовательность определения концентрации глюкозы в крови
глюкозооксидазним методом
Инградиент
Сыроватка,
плазма
Стандарт
Робочие
реактивы
Опытная проба, Стандартная
мл
проба, мл
0,02
2
0,02
2
Контрольная
проба, мл
2
Содержание пробирок перемешивают, инкубируют при комнатной температуре
30 – 60 хв. Колориметрируют при длине волны 490 – 540 нм против
контрольной пробы. Результаты вычисляют по формуле :
Сопыт. = Сст. Еопыт
--------------Ест.
где Сопыт. – концентрация глюкозы в опытной пробе, ммоль/л; Сст. концентрация глюкозы в стандартной пробе, ммоль/л; Еопыт. – экстинкция
опытной пробы; Ест. - екстинкция стандартной пробы.
Сравнить с нормой полученный результат. Сделать вывод.
87
Определение можно проводить с помощью наборов реактивов фирмы
“Cormay”, “La chema”, “Merck” и полуавтоматического анализатора “Stat Fax”.
Клинико-диагностическое значение. Качественное и количественное
определение сахара в крови и моче имеет важное клинико-диагностическое
значение. Физиологичные гипергликемии наблюдаются при эмоциональных
стрессах, потреблении большого количества углеводов с едой. Патологические
гипергликемии чаще всего связаны с заболеваниями эндокринной системы.
Они наблюдаются при сахарном диабете, опухолях коры надпочечников и
гипофиза, тяжелых расстройствах функции печени, гиперфункции щитовидной
железы, органических поражениях нервной системы.
Гипогликемия наблюдается при аденоме
островкового аппарата
поджелудочной железы в результате повышенной продукции инсулина В клетками, недостаточной функции щитовидной железы, надпочечников,
гипофиза. Кроме того, гипогликемия может быть вызвана голоданием, тяжелым
физическим трудом, передозированием инсулина при лечении, нарушением
всасывания углеводов, заболеванием почек, которые сопровождаются
снижением почечного порога для глюкозы.
Исследование влияния сахарной нагрузки на уровень сахара в крови
имеет особенное значение для диагностики скрытых форм диабета,
дифференциации панкреатической и ренальной глюкозурии, выявления
нарушения гликогенсинтезирующей функции печени и влияния инсулина на
обмен углеводов. Для ориентации студентов ниже приводим два типа сахарных
кривых: № 1 - у здорового человека и № 2 - у больной сахарным диабетом.
Существенное клинико-диагностическое значение имеет диагностический
тест на кетоновые тела в крови и моче. Например, кетонурия при ІЗСД И типа
указывает на угрозу кетоацидоза. Отсутствие кетонемии или кетонурии во
время коматозных состояний позволяет исключить кетоацедотическую кому,
как причину нарушения. Необходимо иметь в виду, что и другие
метаболические состояния: голодание, алкогольный кетоацидоз, употребление
еды богатой на жиры и лихорадка могут привести к образованию кетоновых
соединений и появления кетонурии (кетонемии).
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Определение уровня глюкозы в крови является одним из важнейших
биохимических исследований для диагностики сахарного диабета. С целью
установления концентрации сахара в крови пользуются глюкозооксидазним
методом, принцип которого заключается в:
А. восстановлении солей тяжелых металлов в щелочной среде;
В. определении интенсивности цвета соединения, что образовалось при
взаимодействии глюкозы с ортотолуидином;
С. действия фермента глюкозооксидазы, который окисляет глюкозу до
глюконовой кислоты кислородом воздуха;
D. восстановлении двувалентных ионов меди в одновалентные;
88
Е. фотометрировании окрашенного комплекса, что образовался в процессе
взаимодействия антрона с углеводами
2. Концентрация глюкозы в крови здорового человека варьирует в таких
границах:
А. 2-4 ммоль/л
В. 10-25 ммоль/л
С. 3,5-5,5 ммоль/л
D. 6-9,5 ммоль/л
Е. 1-2 ммоль/л
3. Для определения уровня сахара в крови с целью диагностики сахарного
диабета и других заболеваний самым специфичным и технологически простым
в выполнении считается метод:
А. Ортотолуидиновый;
В. Редуктометричный;
С. Глюкозооксидазный;
D. Антроновый;
Е. Анилиновый
4. Больную привезено каретой скорой помощи. Состояние тяжелое, сознание
омрачено, адинамия, тахикардия, запах ацетона из рта. О наличии какой
патологии это свидетельствует? Какие дополнительные обследования
целесообразно назначить?
5. У некоторых людей после сахарной нагрузки содержание глюкозы в крови
может уменьшаться ниже исходного уровня. Объясните чему?
Тесты “Крок-1”
1. Увеличение концентрации глюкозы в крови при действии глюкагону связано
с активированием:
А – гексокиназы
B – глюкокиназы
C – альдолазы
D – гликогенфосфорилазы
E – гликогенсинтетазы
2. Во время обследования больного обнаружено, что концентрация глюкозы в
крови составляет 4,5 ммоль/л. Такой результат свидетельствует о том, что
пациент:
А. практически здоровый;
В. больной сахарным диабетом;
С. имеет повышенную толерантность к глюкозе;
D. больной несахарным диабетом
Е. больной стероидным диабетом
89
3. Больной доставлен в медицинское заведение в коматозном состоянии. Со
слов сопровождающих удалось выяснить, что больной потерял сознание во
время тренировки на завершающем этапе марафонской дистанции. Какую кому
диагностировано?
А. Гипергликемическую
В. Гипогликемическую
С. Ацидотичную
D. Гипотиреоидную
Е. Печеночную
4. Больная 46 лет, жалуется на сухость в роте, жажду, частое мочеиспускание.
При биохимическом исследовании крови – гипергликемия. В моче – глюкоза,
кетоновые тела. У больной вероятно наблюдается:
А. Алиментарна гипергликемия
В. Сахарный диабет
С. Острий панкреатит
D. Несахарный диабет
Е. Ишемическая болезнь сердца
5. К врачу обратился больной с жалобами на постоянную жажду. Обнаруженна
гипергликемия, полиурия и повышенное содержание 17-кетостероидов в моче.
Какое заболевание является наиболее вероятным?
А. Стероидный диабет
В. Инсулинзависимый диабет
С. Аддисонова болезнь
D. Гликогеноз И типа
Е. Микседема
6. В крови пациента содержание глюкозы натощак было 5,65 ммоль/л. Через 1
год после сахарной нагрузки составляло 8,55 ммоль/л, а через 2 часа – 4,95
ммоль/л. Такие показатели характерны для:
А. Больного со скрытым сахарным диабетом
В. Здорового человека
С. Больного с инсулинзависимым сахарным диабетом
D. Больного с инсулиннезависимым сахарным диабетом
Е. Больного с тиреотоксикозом.
7. У больного 57 лет, который болеет сахарным диабетом, развился кетоацидоз.
Биохимической основой этого состояния является снижение степени
утилизации ацетил –КоА в результате дефицита:
А. 2-оксоглутарата
В. Глутамата
С. Оксалоацетата
D. Аспартата
90
Е. Сукцината
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Нарушение обмена углеводов. Изменение биохимических показателей
биологических жидкостей при сахарном диабете.
2. Роль гормонов в регуляции углеводного обмена и их механизмы. Нарушение
углеводного, белкового и жирового обмена при сахарном диабете.
3. Методы диагностики и принципы биохимической коррекции сахарного
диабета.
Литература
Основная:
1.Губський Ю.І. Біологічна хімія.- Київ-Тернопіль: Укрмедкнига.-200.-508с.
2.Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І., Біохімія людини.Тернопіль: Укрмедкнига.-2002.-744с.
3.Скляров О.Я., Сергієнко О.О., Фартушок Н.В. та ін. Обмін вуглеводів.
Біохімічні та клінічні аспекти.- Львів: Світ.- 2004.-111с.
Дополнительная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. –
704 с.
Смысловой модуль 10. Метаболизм липидов и его регуляция
Тема № 5. Исследование катаболизма и биосинтеза триацилглицеролов и
фосфолипидов. Внутриклеточный липолиз и молекулярные механизмы
его регуляции.
Цель занятия: Изучить процессы биосинтеза фосфолипидов и
триацилглицеролов и основные пути внутриклеточного метаболизма липидов.
Уметь определять содержание фосфолипидов, активность липазы и оценивать
полученные показатели.
Актуальность темы: Знание основных путей внутриклеточного
метаболизма липидов в условиях нормального функционирования
человеческого организма и в условиях влияния патологических факторов
необходимо студентам медицинских вузов для последующего изучения
патофизиологии, фармакологии и других предметов, а также для будущей
профессиональной деятельности.
Конкретные задания:
 Трактовать биохимические функции простых и сложных липидов в
организме: участие в построении и функционировании биологических
мембран клеток, запасная, энергетическая функции, использование в
качестве предшественников в биосинтезе биологически активных
соединений липидной природы.
 Объяснять основные пути внутриклеточного метаболизма липидов.
91
 Объяснять ферментативные реакции катаболизма и биосинтеза
триацилглицеролов.
 Трактовать
ферментативные
реакции
синтеза
фосфолипидов
и
сфинголипидов.
 Анализировать основные пути метаболизма липидов в условиях
нормального функционирования человеческого организма и при патологии.
 Объяснять гормональную регуляцию обмена липидов.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Теоретические вопросы
Биологические функции простых и сложных липидов в организме человека
(запасная, энергетическая, участие в терморегуляции, биосинтетическая).
Участие липидов в построении и функционировании биологических
мембран клеток. Жидкостно-мозаичная модель биомембран. Липосомы.
Использование липосом в медицине.
Адипоциты жировой ткани и их роль в обмене липидов и
биоэнергетических процессах в организме.
Катаболизм триацилглицеролов: характеристика внутриклеточного
липолиза, его биологическое значение; ферментативные реакции;
механизмы
регуляции
активности
триацилглицероллипазы;
нейрогуморальная регуляция липолиза при участии адреналина,
норадреналина,
глюкагона,
инсулина;
энергетика
окисления
триацилглицеролов.
Биосинтез триацилглицеролов и фосфолипидов, значение фосфатидной
кислоты.
Метаболизм
сфинголипидов.
Генетические
аномалии
обмена
сфинголипидов – сфинголипидозы. Лизосомальные болезни.
Практическая работа
Опыт 1. Количественное определение фосфолипидов в сыворотке
крови.
Принцип метода. Фосфолипиды осаждаются трихлорацетатной кислотой
(ТХАК) вместе с белками крови. В осадке после минерализации определяют
содержание фосфора.
Материальное обеспечение: сыворотка крови, 10 % раствор ТХАК, 56 %
раствор хлорной кислоты, раствор аммония молибденовокислого, 1% раствор
аскорбиновой кислоты, стандартный раствор КН2РО4 (0,05 мг в 1 мл),
центрифужные пробирки, центрифуга, водяная баня, ФЭК, пипетки, пробирки,
микропипетки.
Ход работы. В центрифужную пробирку наливают 0,2 мл сыворотки
крови, 2 мл дистиллированной воды. Добавляют 3 мл 10 % раствора ТХАК и
через 1-2 минуты центрифугируют на протяжении 5 мин при 2000-3000 об/мин.
Надосадочную жидкость сливают, не стряхивая пробирку. К осадку, который
содержит липопротеины, добавляют 1 мл 56 % раствора HСlO4 и нагревают на
кипящей водяной бане на протяжении 20-30 мин (до обесцвечивания раствора).
92
После окончания минерализации в пробирку наливают 5 мл воды, 1 мл
молибденовокислого аммония и 1 мл 1 % раствора аскорбиновой кислоты и
перемешивают. Одновременно реакцию проводят со стандартным раствором
фосфора. К 1 мл стандартного раствора (0,05 мг/мл) добавляют 5 мл воды, 1 мл
аммония молибденовокислого и 1 мл 1 % раствора аскорбиновой кислоты и
перемешивают. Через 15-20 мин растворы колориметрируют на ФЭКе,
используя красный светофильтр и кюветы на 10 мм против воды.
Расчет проводят по формуле:
Ао · 0,05
Общие липиды сыворотки = -------------- г 25 мг/мл или г/л
Аст · 0,2
Ао – оптическая плотность опытной пробы; Аст – оптическая плотность
стандартного раствора; 0,05 – содержание фосфора в стандартном растворе
(мг/мл ); 0,2 – объем взятой для опыта сыворотки; 25 – пересчет на общие
липиды.
Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. Содержание общих фосфолипидов
в сыворотке крови 1,5-3,6 г/л, а лецитина – 0,75-1,2 г/л. Общую концентрацию
фосфолипидов определяют по содержанию липидного фосфора, на долю
которого приходится 4 % относительной молярной массы фосфолипидов (0,10,15 г/л). Важным показателем является индекс фосфолипиды/холестерол,
который при физиологичных условиях составляет 1–1,5. Этот индекс снижается
при атеросклерозе, гипертонической болезни, болезнях печени.
Определение содержания липидов в крови имеет важное диагностическое
значение. Повышение уровня фосфолипидов в сыворотке крови
(гиперфосфолипидемия) наблюдается при тяжелой форме сахарного диабета (в
2-2,5 раз), нефрозах, застойной желтухе и др. Снижение уровня фосфолипидов
(гипофосфолипидемия) наблюдается при атеросклерозе, малокровии,
лихорадочных состояниях, алиментарной дистрофии, заболеваниях печени.
Недостаточное поступление с едой липотропных факторов (холина,
этаноламина, метионина, инозита) или недостаточное их эндогенное
образование приводит к торможению синтеза фосфолипидов и к жировой
инфильтрации печени.
Опыт 2. Влияние желчи на активность липазы.
Принцип метода. Активность липазы оценивают по образованию в
результате гидролиза жира жирных кислот, количество которых определяют
титрованием щелочью в присутствии фенолфталеина. Гидролиз жиров удобнее
всего наблюдать на примере вытяжки из поджелудочной железы (источник
липазы) и молока как субстрата, жир которого находится в эмульгированном
состоянии и быстро расщепляется на глицерин и жирные кислоты. Если в
пробу добавить желчь, то липаза активируется и гидролиз жира протекает
быстрее.
93
Материальное обеспечение: панкреатин, молоко кипяченое и
предварительно разведенное 1:1, желчь, 0,5 % спиртной раствор
фенолфталеина, 0,05 н NаOH, водяная баня или термостат, микробюретки,
пипетки.
Ход работы. В две пробирки или колбочки наливают по 10 мл молока и по
0,5 мл панкреатина. В одну пробирку доливают 1 мл воды, а в другую – 1 мл
желчи. Содержание пробирок хорошо перемешивают. Из каждой пробирки
отбирают по 1 мл смеси в другие пробирки, добавляют 1-2 капли 0,5 %
раствора фенолфталеина и сразу же титруют 0,05 н раствором натрия
гидроксида до появления слаборозового цвета, который не исчезает на
протяжении 30 секунд. Пробирки с остатком смеси помещают в водяную баню
или термостат при 37˚ С. Через каждые 10-15 минут из них отбирают по 1 мл
смеси и проводят титрование, как и в предыдущий раз. Делают 4-5 таких
определений. Результаты выражают в мл раствора щелочи, которую потратили
на титрование.
Полученые данные вносят в таблицу и строят кривую, откладывая по оси
абсцисс время в мин, а по оси ординат – количество NаОН в мл, которое пошло
на титрование.
0 мин
15 мин
30 мин
45 мин
60 мин
Условия опыта
Количество NаОН, мл
Липаза, активированная
желчью
Липаза без желчи
Клинико-диагностическое
значение.
Переваривание
липидов
происходит в основном в кишечнике под действием активной панкреатической
липазы, потому что в желудочном соке липаза малоактивна и действует только
на эмульгированный жир, например молока, для лучшего переваривания.
Липиды должны быть эмульгированными. Главным эмульгатором липидов
является желчь. Поскольку желчь эмульгирует жиры, при добавлении желчи
липаза активируется и гидролиз жиров происходит с большей скоростью. Так
как липаза является основным энзимом для переваривания липидов, изменения
ее активности могут свидетельствовать о нарушении определенных звеньев
липидного
обмена.
Дефицит
панкреатической
липазы
вызывает
панкреатогенную стеаторею, которую наблюдают при хроническом
панкреатите, наследственной гипоплазии pancreas, наследственном или
приобретенном дефиците панкреатической липазы, а также при муковисцидозе.
Содержание желчных пигментов в кале при таких состояниях сопровождается
снижением содержания свободных жирных кислот и значительным приростом
нерасщепленных жиров. Нарушение эмульгирования, пищеварения и
всасывания липидов и жирорастворимых витаминов могут вызываться также
94
заболеваниями печени, желчного пузыря или желчных путей (желчекаменная
болезнь).
Контроль выполнения лабораторной работы
1. В чем заключается принцип метода определения фосфолипидов в сыворотке
крови?
A.
В осаждении фосфолипидов трихлорацетатной кислотой и определении
содержания фосфора
B.
В образовании комплексного соединения при присутствии ацетатного
ангидрида и смеси ацетатной и сульфатной кислот
C.
В образовании синего цвета с 2,6-дихлорфенолиндофенолом и
восстановлении аскорбиновой кислотой
D.
В образовании с 2-тиобарбитуровой кислотой цветного триметинового
комплекса
E.
В образовании цветных продуктов с оксиметилфурфуролом
2. Указать содержание общих фосфолипидов в норме:
А. 0,25 – 1,25 г/л
В. 1,52 – 3,62 г/л
С. 3,75 – 5,40 г/л
Д. 10,15 – 12,30 г/л
Е. 9,80 – 15,72 г/л
3. Каким образом можно оценить активность липазы?
А. По способности энзима гидролизовать пептидные связи
В. По количеству образованной пировиноградной кислоты
С. По образованию в результате гидролиза жирных кислот, количество которых
определяют титрованием в присутствии фенолфталеина
Д. По способности ингибировать восстановление нитротетразолия синего в
присутствии НАДН2
Е. По способности обесцвечивать метиленовую синьку при ее восстановлении
альдегидом
4. Человек длительное время ограничивает употребление продуктов, которые
содержат фосфолипиды. К каким метаболическим нарушениям это может
привести?
5. Анализ сыворотки крови человека - 5 ммоль/л общего холестерина, 3,2
ммоль/л фосфолипидов, 1,5 ммоль/л триглицеридов. Отвечают ли эти
показатели норме? Как называется такое состояние и когда оно бывает?
6. Концентрация фосфолипидов в крови составляет 0,7 г/л. Как называется
такое состояние и о каких метаболических нарушениях свидетельствует?
95
Примеры тестов „Крок-1”
1. Потерпевший от укуса змеи едва не умер из-за интенсивного гемолиза.
Анализ крови показал необычно высокое содержание лизолецитина. Токсичный
эффект был обусловлен наличием в змеином яде:
А. Фосфолипазы А1
В. Фосфолипазы А2
С. Фосфолипазы С
Д. Фосфолипазы Д
Е. Нейраминидазы
2. У больных сахарным диабетом наблюдается повышение содержания
свободных жирных кислот (НЭЖК). Причиной этого может быть:
А. Накопление в цитозоле пальмитоил-КоА
В. Активация утилизации кетоновых тел
С. Активация синтеза аполипопротеинов А1, А2, А4
Д. Снижение активности фосфатидилхолинхолестеринацилтрансферазы плазмы
крови
Е. Повышение активности триглицеридлипазы
3. При лабораторном обследовании крови больного, взятой натощак,
обнаружено, что сыворотка имеет белый цвет, содержание общих липидов – 20
г/л, холестерина – 9 мМ/л. После центрифугирования сыворотки на
поверхности образуется белая пленка, что позволяет допустить увеличение в
крови хиломикронов. Снижение активности какого фермента может повлечь
такое явление?
А. Липазы поджелудочной железы
В. Панкреатических фосфолипаз
С. Лецитинхолестеринацилтрансферазы
Д. Липазы жировой ткани
Е. Липопротеинлипазы крови
4. В результате длительного употребления жирной еды у больного развилась
алиментарная гиперлипемия, которая главным образом может быть следствием
повышения содержания:
А. Фосфолипидов
В. Холестерина
С. Гликолипидов
Д. Хиломикронов
Е. Триглицеридов
5. После приема жирной еды у больного появляются тошнота и изжога, имеет
место стеаторея. Причиной такого состояния может быть:
А. Недостаточность амилазы
В. Повышение выделения липазы
С. Нарушение синтеза фосфолипазы
96
Д. Нарушение синтеза трипсина
Е. Недостаточность желчных кислот
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Метаболизм сфинголипидов в норме и при патологии; клиническое значение,
нарушение обмена сфинголипидов.
Литература
Основная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. –
743 с.
2. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення / За
ред. проф. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2004. – 191 с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига,
2002. – 744 с.
4. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508
с.
5. Клінічна біохімія. Курс лекцій для студентів вищих навчальних медичних
закладів / За ред. проф. Склярова О.Я. – Львів, 2004. – 295 с.
6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Асинова М.И., Белая И.И. Липидный обмен и социальная адаптация
человека при старении // Клин. геронтология. – 2001. – № 7. – С. 18 – 22.
2. Красильников О.А. Роль ионов Са в реализации быстрых эффектов Lтироксина на обмен фосфоинозитидов в клетках печени крыс / Биохимия. –
2003. – Т. 68, № 7. – С. 946 – 953.
Тема № 6. β-окисление и биосинтез жирных кислот. Исследование обмена
жирных кислот и кетоновых тел.
Цель занятия: Изучить процессы биосинтеза и окисления жирных кислот.
Знать метаболизм кетоновых тел в норме и при патологии и уметь определять
их содержание в моче.
Актуальность темы: Окисление липидов и метаболизм кетоновых тел
является важной составляющей метаболизма, который обеспечивает организм
человека резервами метаболического топлива в виде энергии АТФ.
Определение содержания кетоновых тел в крови и моче имеет важное значение
для диагностики ряда патологических процессов.
Конкретные задания:
 Трактовать β-окисление высших жирных кислот.
 Трактовать биосинтез высших жирных кислот и регуляцию процесса
биосинтеза на уровне ацетил-КоА-карбоксилазы и на уровне синтетазы
жирных кислот.
 Анализировать метаболизм кетоновых тел.
97
 Объяснять механизмы избыточного возрастания содержания кетоновых
тел при сахарном диабете и голодании.
Теоретические вопросы
1. β-окисление высших жирных кислот:
· локализация процесса β-окисления жирных кислот;
· активация жирных кислот. Роль карнитина в транспорте жирных
кислот в митохондрии;
· последовательность ферментативных реакций β-окисления жирных
кислот;
· энергетика β-окисления жирных кислот.
2. Механизм окисления глицерола, энергетика этого процесса.
3. Биосинтез высших жирных кислот:
· локализация биосинтеза высших жирных кислот;
· метаболические источники синтеза жирных кислот;
· стадии синтеза насыщенных жирных кислот;
· характеристика синтетазы ВЖК, значение ацилтранспортирующего
белка, биотина;
· источники НАДФН, необходимого для биосинтеза жирных кислот;
· последовательность ферментативных реакций биосинтеза высших
жирных кислот;
· регуляция процесса биосинтеза на уровне ацетил-КоА-карбоксилазы и
на уровне синтетазы жирных кислот;
· елонгация насыщенных жирных кислот;
· образование ненасыщенных жирных кислот.
4. Метаболизм кетоновых тел:
· ферментативные реакции биосинтеза кетоновых тел;
· реакции утилизации кетоновых тел, энергетическое значение;
· метаболизм кетоновых тел в условиях патологии. Механизмы
избыточного роста содержания кетоновых тел при сахарном диабете и
голодании;
· понятия – кетоацидоз, кетонемия, кетонурия.
Практическая работа
Опыт 1. Качественная реакция на ацетон и ацетоацетатную кислоту
(проба Ланге).
Принцип метода. Ацетон и ацетоацетатная кислота с натрия
нитропруссидом в щелочной среде образуют продукты реакции красного цвета:
CH3 – CO – CH3 + Na2 [Fe (CN)5 NO] + 2 NAOH →
→ Na4 [Fe (CN)5 NO = CHCOCH3] + 2 H2O.
Под действием концентрированной ацетатной кислоты образуется продукт
вишнево-красного цвета:
98
Na4 [Fe (CN) 5 NO =CHCOCH3] +CH3COOH →
→ Na3 [Fe (CN) 5 NOCH3COCH3] + CH3COONa.
Ацетоацетатная кислота (в энольной форме) способна также образовывать
с ферум (III) хлоридом комплексное соединение вишнево-красного цвета.
Материальное обеспечение: моча больного сахарным диабетом и моча
здорового
человека,
10
%
раствор
натрия
нитропруссида
(свежеприготовленный), ледяная ацетатная кислота, 10 % раствор NаOH, 50 %
раствор аммония сульфата, концентрированный раствор аммиака, 10 % раствор
ферум (ІІІ) хлорида, пипетки, пробирки, воронка, фильтровальная бумага.
Ход работы. 1. Реакция с натрия нитропруссидом (проба Ланге). В
пробирку наливают 0,5 мл исследуемой мочи, добавляют 0,5 мл раствора
натрия гидроксида и 5-7 капель натрия нитропруссида. Наблюдают за
появлением красного цвета, который переходит в вишневый после добавления
нескольких капель концентрированной ацетатной кислоты.
2. Реакция с ферум (III) хлоридом (проба Герхарда).
В пробирку наливают 2,0 мл исследуемой мочи и добавляют по каплям 10
% раствор ферум (III) хлорида до прекращения образования осадка фосфатов.
Осадок фильтруют, к фильтрату добавляют еще несколько капель FeCl 3 и
наблюдают за появлением вишневого цвета.
Сделать вывод.
Опыт 2. Количественное определение кетоновых тел в моче.
Принцип метода. См. предыдущий опыт.
Материальное обеспечение: см. предыдущий опыт.
Ход работы. Берут 8 пробирок. Во все, кроме первой, наливают по 1мл
дистиллированной воды. В первую и вторую пробирки добавляют по 1 мл мочи
больного сахарным диабетом. Таким образом, в первой пробирке моча не
разведенная, а во второй разведенная дважды. После перемешивания из второй
пробирки отбирают 1 мл смеси и переносят в третью пробирку, из третьей в
четвертую и т.д. Из последней пробирки 1 мл выливают для уравнивания
объема с другими пробирками. Таким образом, моча в пробирках будет
разведенной в 2, 4, 8 (и т. д.) раз.
Потом в каждую пробирку добавляют по 8 капель 50 % раствора аммония
сульфата для увеличения плотности растворов, по 8 капель ацетатной кислоты
(концентрированной) и натрия нитропруссида. Содержание пробирок
перемешивают и в каждую из них осторожно по стенкам, начиная с последней
пробирки, наслаивают по 1 мл концентрированного аммиака (реактив отбирать
осторожно только с помощью резиновой груши, работая с ним в вытяжном
шкафу). Наблюдая за пробирками, отмечают ту из них, в которой при
максимальном разведении мочи на протяжении 3-4 мин еще заметно
фиолетовое кольцо на грани раздела жидкостей. Обратить внимание, что для
успешного проведения опыта аммиак необходимо наслаивать осторожно, по
стенкам. Акцентировать внимание на время образования фиолетового кольца.
Расчет проводят по формуле:
Х = 0,85 ∙ А ∙ 15
99
где Х – концентрация ацетона в моче, мг/сутки; 0,85 – эмпирическое
число; А – разведение мочи; 15 – пересчет на суточную мочу 1500 мл.
После проведения расчетов сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. У здорового человека в крови
содержание кетоновых тел – 1,3-185 мкмоль/л (1,5-20 мг/л), с мочой выделяется
20-40 мг на сутки. Это преимущественно ацетоацетатная и β-оксимасляная
кислоты. Резкий рост концентрации кетоновых тел сопровождается
нарушением кислотно-основного состояния и развитием метаболического
кетоацидоза, который является опасным, в первую очередь, для нормального
функционирования клеток головного мозга.
Увеличение количества кетоновых тел в крови (кетонемия) и появление их
в моче (кетонурия) наблюдают при сахарном диабете, тиреотоксикозе,
поражении печени, тяжелых интоксикациях, голодании. Снижение количества
кетоновых тел не имеет клинического значения.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. В чем заключается принцип метода определения кетоновых тел (проба Ланге
)?
A.
В способности ацетона образовывать фиолетовое кольцо с натрия
нитропруссидом при наслоении аммиака
B.
В
образовании
цветных
продуктов
конденсации
из
оксиметилфурфуролом
C.
В способности образовывать мелкодисперсную эмульсию
D.
В образовании цветного триметинового комплекса при реакции с
тиобарбитуровой кислотой
E.
В способности в присутствии ацетатного ангидрида и смеси ацетатной и
сульфатной кислот образовывать соединение зеленого цвета
2. Какое содержание кетоновых тел в крови в норме:
А. 2,5 – 8 мкмоль/л
В. 0 – 2,5 мкмоль/л
С. 180 – 250 мкмоль/л
Д. 13 – 185 мкмоль/л
Е. 205 – 317 мкмоль/л
3. Какая проба используется для выявления в моче ацетоацетата?
А. Проба Герхардта
В. Проба Барфуда
С. Проба Богомолова
Д. Проба Петенкофера
Е. Проба Гмелина
4. На чем основывается выявление кетоновых тел пробой Герхардта?
A. На способности образовывать красный цвет с оксиметилфурфуролом
100
B. На способности образовывать с ферум (Ш) хлоридом соединение красного
цвета
C. На окислении бензидина кислородом
D. На образовании ферум лактата желто-зеленого цвета
E. На способности образовывать красный цвет с диазореактивом
5. В рационе человека отсутствуют растительные масла. К каким последствиям
это может привести?
6. В крови человека обнаружена высокая концентрация свободных жирных
кислот. Какие причины этого явления?
7. В суточной моче обнаружено 120 мг кетоновых тел. Какие причины и
следствия такого состояния для организма?
Примеры тестов „Крок-1”
1.Жиры являются необходимым энергетическим материалом для организма.
Какой основной путь превращения жирных кислот в митохондриях клетки?
А. Восстановление
В. Декарбоксилирование
С. β-окисление
Д. α-окисление
Е. γ-окисление
2. При сахарном диабете и голодании в крови увеличивается содержание
ацетоновых тел, которые используются в качестве энергетического материала.
Назовите вещество, из которого они синтезируются?
А. Цитрат
В. Ацетил-КоА
С. Сукцинил-КоА
Д. α-Кетоглутарат
Е. Малат
3. После длительного голодания в крови человека наблюдается повышение
содержания кетоновых тел. Это обусловлено:
А. Снижением уровня свободных жирных кислот в сыворотке крови
В. Мобилизацией липопротеинов высокой плотности
С. Образованием ацетил-КоА
Д. Повышением окисления жирных кислот в печени
Е. Снижением мобилизации триацилглицеролов в жировой ткани
4. У больного сахарным диабетом в крови обнаружен ацетон. Каким образом он
образуется в организме?
А. В процессе α-окисления жирных кислот
101
В. В процессе β-окисления жирных кислот
С. При конденсации двух молекул ацетил-КоА
Д. В процессе γ-окисления жирных кислот
Е. В цикле Кребса
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Патологии, связанные с нарушением липидного обмена.
Литература
Основная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998.
– 743 с.
2. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення /
За ред. проф. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2004. – 191 с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль:
Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
4. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. –
508 с.
5. Клінічна біохімія. Курс лекцій для студентів вищих навчальних медичних
закладів / За ред. проф. Склярова О.Я. – Львів, 2004. – 295 с.
6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. –
Львів: Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Скляров О.Я., Сергієнко О.О., Фартушок Н.В. та ін. Обмін вуглеводів.
Біохімічні та клінічні аспекти. – Львів: Світ, 2004. – 111с.
2. Колосова Н.Г. Возрастные изменения окислительности белков и липидов
в печени преждевременно стареющих крыс // Биомед. химия. – 2004. – Т.
50, № 1. – С. 73 – 78.
3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – 469 с.
Тема № 7. Биосинтез и биотрансформация холестерола. Патологии
липидного обмена: стеаторея, атеросклероз, ожирение. Транспортные
формы липидов – липопротеины плазмы крови.
Цель занятия: Изучить пути биотрансформации холестерина и основные
нарушения липидного обмена. Понять природу свободнорадикальных реакций,
механизмы реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) и значение их в
биологических процессах в норме и при патологии.
Актуальность темы: Нарушение процессов биотрансформации
холестерина предопределяет ряд заболеваний, среди которых атеросклероз,
ожирение и другие. Потому исследование показателей липидного обмена
является необходимым для диагностики и лечения разных заболеваний.
Образование свободных радикалов и продуктов ПОЛ является
необходимым звеном в нормальном метаболизме. В норме интенсивность
процессов ПОЛ регулируется системой антиоксидантной защиты. Нарушение
102
соотношения между активностью про- и антиоксидантных систем проявляется
в виде разных патологических процессов, что и объясняет необходимость их
изучения.
Конкретные задания:
 Трактовать этапы биосинтеза холестерина.
 Объяснять регуляцию синтеза холестерина в организме человека.
 Анализировать пути биотрансформации холестерина: этерификацию,
образование желчных кислот, стероидных гормонов, витамина D3;
экскрецию холестерина из организма.
 Объяснять патологию липидного обмена: атеросклероз, сахарный
диабет, ожирение, стеаторею.
 Объяснять процессы липидной пероксидации в условиях нормы и
патологии.
 Трактовать регуляцию свободнорадикальных реакций в организме
человека.
Теоретические вопросы
1. Биосинтез холестерина в организме человека:
· локализация этого процесса, значение;
· этапы синтеза холестерина;
· ферментативные реакции синтеза мевалоновой кислоты;
· регуляция синтеза холестерина.
2. Пути биотрансформации холестерина (этерификация, образование желчных
кислот и стероидных гормонов, синтез витамина D3, экскреция из организма).
3. Патологии липидного обмена:
 атеросклероз: механизмы развития, роль генетических факторов,
гиперхолестеринемии;
 нарушение липидного обмена при сахарном диабете;
 патологические процессы обмена липидов, которые ведут к развитию
ожирения;
 жировой гепатоз, липотропные факторы.
6. Процессы перекисного окисления липидов и механизмы действия энзимов
антиоксидантной защиты:
 процессы липидной пероксидации в норме и в условиях патологии;
 регуляция свободнорадикальных реакций в организме человека;
 характеристика антиоксидантов и прооксидантов, их значение для
прохождения реакций пероксидации липидов.
7. Строение липопротеинов крови.
8. Особенности метаболизма липопротеинов крови.
Практическая работа
Опыт 1. Качественная реакция на желчные кислоты (реакция
Петенкофера)
103
Принцип метода. Реакция базируется на образовании окрашенных
продуктов конденсации при взаимодействия желчных кислот с
оксиметилфурфуролом. Последний образуется из фруктозы, которая является
продуктом гидролиза в результате добавления к сахарозе концентрированной
сульфатной кислоты.
Материальное обеспечение: желчь, 20 % раствор сахарозы,
концентрированная Н2SO4, пробирки.
Ход работы. В пробирку наливают 10-15 капель желчи, добавляют 1
краплю свежего раствора сахарозы и слегка стряхивают. В другую пробирку
помещают 10-15 капель сульфатной кислоты. Раствор, который содержит
желчь, наслаивают на сульфатную кислоту. На грани деления жидкостей
образуется осадок желчных кислот и появляется красно-фиолетовое кольцо. В
случае осторожного встряхивания жидкость приобретает вишнево-красную
окраску.
Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. Главным эмульгатором липидов
является желчь, содержащая желчные кислоты, которые образуются в печени
(10-15 г за сутки). К ним принадлежат: холевая, дезоксихолевая,
хенодезоксихолевая, литохолевая и другие кислоты, которые выделяются с
желчью в свободном состоянии и в виде парных желчных кислот и связаны с
глицином или таурином. Желчные кислоты эмульгируют липиды, активируют
панкреатическую липазу, активно участвуют в процессе всасывания жирных
кислот, образуют холеиновие комплексы, стабилизируют холестерол. Дефицит
желчи в кишечнике может быть связан с заболеваниями печени (механическая
желтуха, гепатиты, цирроз), желчного пузыря или желчных путей
(желчекаменная
болезнь,
опухоли
желчевыводящих
путей).
При
копрологических исследованиях наблюдают уменьшение или отсутствие в кале
желчных пигментов (ахолический кал) и высокое содержание мыл, особенно
кальциевых.
Опыт 2. Определение процессов липидной пероксидации в тканях.
Определение содержания малонового диальдегида.
Принцип метода. Метод основывается на том, что при высокой
температуре в кислой среде малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием окрашенного триметинового
комплекса с максимумом поглощения при 532 нм.
Материальное обеспечение: сыворотка крови, фосфатный буфер рН 7,4; 1
мМ KMnO4, 1 мМ FeSO4, 20 % раствор трихлорацетатной кислоты (ТХАК), 1 н
хлоридная кислота, 0,7 % тиобарбитуровая кислота, бутанол, центрифуга,
водяная баня, спектрофотометр, пробирки.
Ход работы. К 3 мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2 мл
сыворотки; 0,5 мл 1мМ KMnO4, перемешивают, а через 10 мин добавляют 0,5
мл 1 мM FeSO4. После этого добавляют 1 мл 20 % ТХАК и центрифугируют
10 мин при 3000 об/мин. Далее к 2 мл супернатанта добавляют 0,5 мл 1 н НСl и
1 мл 0,7 % тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20 мин на кипящей
104
водяной бане (95-100°С). После резкого охлаждения в пробирку вносят 3 мл
бутанола, тщательным образом перемешивают раствор и центрифугируют 10
мин при 3000 об/мин.
Оптическую плотность раствора определяют спектрофотометрически при
532 нм. Содержание МДА выражают в мкМ/мл сыворотки.
Расчет проводят по формуле:
С = А · 52,88 / 0,2
где А – оптическая плотность раствора;
52,88 – коэффициент пересчета;
0,2 – количество мл сыворотки крови в пробе.
Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. Образование свободных радикалов
и продуктов ПОЛ является необходимым звеном нормального метаболизма,
который
коррелирует
с
активностью
мембраносвязанных
электронтранспортных и энерготрансформирующих систем, способствует
обновлению клеточных мембран, принимает участие в регуляции активности
мембраносвязанных ферментов, биосинтезе простагландинов, лейкотриенов,
пиноцитозе.
Содержание МДА (ТБК-активных продуктов) в крови здоровых людей
составляет 6,2-8,3 мкмоль/л. Избыточная интенсификация ПОЛ приводит к
нарушению хода химических процессов, клеток и нарастанию системной
полиорганной патологии. Увеличение содержания МДА наблюдается при
атеросклерозе (вдвое), ишемической болезни сердца и печени, гипертонической
болезни, под воздействием ионизирующего облучения, а также во время
старения, которое может быть связано с возрастным развитием атеросклероза.
Снижение содержания МДА наблюдается при хронической сердечной
недостаточности, онкологических заболеваниях и др.
Опыт
3.
Изучение
системы
антиоксидантной
защиты.
Количественное определение активности каталазы в крови.
Принцип метода. Антиоксидантные реакции в механизме защитных
процессов являются ведущими и наиболее мощными, поскольку они не только
предотвращают развитие свободнорадикальных реакций, но и обеспечивают
эффективность элиминации конечных метаболитов пероксидного окисления с
вовлечением их в энергетический обмен, тем самым поддерживая высокую
активность
синтетических
процессов,
в
том
числе
энзимов
супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КТ) и глутатионпероксидазы (ГПО),
которые соответственно формируют вторую и третью степени защиты. Кроме
предотвращения накопления перекисей, такая антиоксидантная защита
стабильно
поддерживает
высокую
активность
окислительновосстановительных процессов в результате образования кислорода при
превращении супероксида в пероксид при участии СОД и гидролиза его
каталазой и глутатионпероксидазой.
105
Метод определения активности каталазы базируется на определении
количества пероксида водорода, преобразованного энзимом за определенный
промежуток времени.
Материальное
обеспечение:
разведенная
кровь
(1:1000),
дистиллированная вода, 1% раствор Н2О2, 10 % раствор серной кислоты, 0,1 н
раствор КМпО4, колбы, пипетки, бюретка.
Ход работы. Разведенную кровь (1:1000) наливают по 1 мл в две
колбочки, добавляют по 7 мл дистиллированной воды, в опытную пробу
добавляют 2 мл 1 % Н2О2, а в контрольную – 5 мл 10 % раствора серной
кислоты. Действие каталазы в кислой среде прекращается (в контрольной
пробе), так как она действует при рн 7,4. Колбочки оставляют на 30 мин при
комнатной температуре. Потом к опытной пробе добавляют 5 мл 10 % раствора
серной кислоты. А к контрольной – 2 мл 1% раствора Н2О2. Содержание
колбочек титруют 0,1 н раствором КМnО4 до розовой окраски.
Каталазное число (Кч) рассчитывают по формуле:
Кч = ( А – В ) ∙ 1,7
где: А – количество мл 0,1н р-на КМnО4, которое потратили на титрование
контрольной пробы;
В – количество мл 0,1н р-на КМnО4, которое потратили на титрование
опытной пробы.
В норме каталазное число составляет 10-15 единиц.
Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. В норме интенсивность процессов
ПОЛ регулируется системой антиоксидантной защиты. Важнейшими
компонентами антирадикальной и антиперекисной защиты являются энзимы,
которые катализируют реакции между активированными формами кислорода,
осуществляют распад гидропероксидов. Среди этих энзимов важное место
занимает каталаза, которая усиливает реакцию расщепления пероксида
водорода и некоторых его однозамещенных производных.
В норме активность каталазы в крови человека 25,5-52,2 мкат/л.
Повышение активности каталазы наблюдается при хронической сердечной
недостаточности, перциозний анемии и макроцитарних анемиях, при введенные
в организм кофеина, алкоголя, ацетоновых тел. Снижение активности этого
энзима наблюдается при злокачественных опухолях, при ряде инфекционных
заболеваний (брюшной тиф, скарлатина, малярия, туберкулез легких).
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Какой качественной реакцией можно обнаружить желчные кислоты в
биологических жидкостях?
А. Проба Ланге
В. Биуретовая реакция
С. Реакция Петенкофера
Д. Бензидиновая проба
Е. Реакция Фоля
106
2. Какое значение имеют желчные кислоты в пищеварении и усвоении
липидов?
А. Проводят гидролиз липидов
В. Предотвращают расщепление белков
С. Эмульгируют жиры, усиливают их пищеварение и всасывание
Д. Транспортируют моносахариды
Е. Способствуют выведению жиров из организма
3. По активности каких энзимов оценивают надежность антиоксидантной
защиты?
А. Пепсина, трипсина, химотрипсина
В. Аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы
С. Липазы, фосфолипазы, холестеролестеразы
Д. Супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, каталазы
Е. Щелочной и кислой фосфатазы
4. О чем может свидетельствовать повышенная концентрация малонового
диальдегида?
А. Повышении количества витамина Е
В. Активации ПОЛ и разрушении клеточных мембран
С. Повышении активности энзимов антиоксидантной защиты
Д. Снижении содержания диеновых коньюгат
Е. Повышении содержания витамина С
5. Содержание холестерина в крови составляет 12 ммоль/л. Дать клиническую
интерпретацию результата, указать возможные причины и следствия для
организма.
6. Витамин Е играет важную роль в системе антиоксидантов, проявляет
стабилизирующее влияние на состояние билипидного слоя мембран. На чем
основывается его действие?
Примеры тестов „Крок-1”
1. При обследовании больного обнаружено повышенное содержание
липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови. Какое заболевание можно
предполагать у этого больного?
А. Воспаление легких
В. Атеросклероз
С. Гастрит
Д. Острый панкреатит
Е. Поражение почек
2. Жалобы и объективные данные позволяют допустить наличие у больного
воспалительного процесса в желчном пузыре, нарушение коллоидных свойств
107
желчи, вероятность образования желчных камней. Что главным образом может
повлечь их образование?
А. Ураты
В. Оксалаты
С. Хлориды
Д. Фосфаты
Е. Холестерин
3. Усиление перекисного окисления липидов и биополимеров является одним
из основных механизмов повреждения структуры и функции клеточных
мембран и гибели клетки. Причиной этого является:
А. Гиповитаминоз В1
В. Гипервитаминоз В1
С. Гиповитаминоз В12
Д. Гипервитаминоз В12
Е. Гиповитаминоз Е
4. В процессе лечения пародонтоза применяют антиоксиданты естественного и
искусственного происхождения. Укажите, какое из приведенных естественных
соединений используется в качестве антиоксидантного средства?
А. Тиамин
В. Глюконат
С. Пиридоксин
Д. Холин
Е. Токоферол
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Перекисное окисление липидов.
2. Реализация биохимической роли оксида азота.
3. Антиоксидантная система, ее значение.
Литература
Основная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998.
– 743 с.
2. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення /
За ред. проф. Склярова О.Я., Київ: Здоров’я, 2004. – 191 с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль:
Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
4. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. –
508 с.
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. –
Львів: Світ, 2006. – 271 с.
Додаткова:
1. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – 469 с.
108
2. Малюкова Н. Г. Возрастные особенности состояния перекисного
окисления липидов и активности антиоксидантной системы при
хронической сердечной недостаточности // Проблемы старения и
долголетия. – Т. 14, № 2. – 2005. – С. 143 – 150.
3. Янькова В.И. Возрастные изменения липидного спектра уровня
пероксидации липидов и антиоксидантной защиты крови и печени крыс //
Рос. физиол. журнал. – Т. 89, № 7. – 2003. – С. 828 – 836.
Смысловой модуль 11.
аминокислотного обмена.
Метаболизм
аминокислот.
Энзимопатии
Тема № 8. Исследование превращений аминокислот (трансаминирование,
дезаминирование, декарбоксилирование), биосинтеза
глутатиона и креатина.
Цель занятия: Изучить общие пути превращения аминокислот, овладеть
методами идентификации их метаболитов. Уметь интерпретировать
полученные показатели.
Актуальность темы: Обмен белков является центральным звеном всех
биохимических процессов, знание и понимание общих путей превращений
аминокислот, их метаболитов и определение активности ферментов, которые
принимают участие в этих превращение является критериями для оценки
обмена белков.
Конкретные задания:
 - Определять активность аминотрансфераз в сыворотке крови
динитрофенилгидразиновым методом;
 - Овладеть методом количественного определения креатинина в сыворотке
крови;
 - Дать оценку проведенным исследованием и сделать выводы о возможности
их использования в клинической практике.
Теоретические вопросы
1. Пути образования и поддержки пула свободных аминокислот в организме
человека. Общие пути превращения свободных аминокислот.
2. Трансаминирование
аминокислот,
субстраты
для
реакций
трансаминирования. Механизм реакции трансаминирования. Трансаминазы.
Локализация трансаминаз в органах и тканях. Клинико-диагностическое
значение определения активности трансаминаз.
3. Типы реакций дезаминирования аминокислот и их конечные продукты.
Механизм окислительного дезаминирования аминокислот. Оксидазы L- и Dаминокислот. Их ферментативная активность, специфичность действия.
4. Декарбоксилирование
аминокислот.
Декарбоксилазы.
Образование
биогенных аминов (-аминомасляная кислота, гистамин, серотонин, дофамин).
Декарбоксилирование аминокислот в процессе гниения белков в кишечнике.
Окисление биогенных аминов.
109
5. Глутатион, строение и роль в обмене органических пероксидов.
6. Образование креатина и креатинина, клинико-биохимическое значение
нарушений их обмена.
Практическая работа
Опыт 1. Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ)
унифицированным динитрофенилгидразиновым методом РайтманаФренкеля
Принцип метода. В результате реакции трансаминирования под
действием АлАТ образуются пируват и глутамат. При добавлении 2,4динитрофенилгидразина
в
щелочной
среде
образуется
гидразон
пировиноградной
кислоты,
интенсивность
цвета
которого
прямопропорциональна количеству образуемой пировиноградной кислоты и
является показателем активности АлАТ.
Материальное обеспечение: 0,1 М раствор Na2HPO4; 0,1 М раствор
КН2РО4; 0,1 М фосфатный буфер рН 7,4 (смешивают 840 мл 0,1 М Na 2HPO4 и
160 мл 0,1 М КН2РО4); 0,4 М раствор NаОН; 0,04 % раствор бромтимолового
синего (100 мг индикатора растирают в ступке с 3,2 мл 0,05 М NаОН, смывают
водой в мерную колбу на 250 мл и доводят до метки водой); субстратный
раствор: 29,2 мг -кетоглутаровой кислоты и 1,78 мг D,L-аланина растворяют в
1 М NаОН для получения рН 7,4, раствор переливают в мерную колбу на 100
мл и доводят 0,1 М фосфатным буфером до метки); 1 М раствор соляной
кислоты; 1 мМ раствор 2,4-динитрофенилгидразину (19,8 мг 2,4динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 М НСl при
нагревании на водяной бане, после охлаждения доводят до 100 мл, на
следующий день реактив фильтруют); натрия пируват. Определения проводятся
с помощью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра. Необходимы
термостат или водяная баня, холодильник.
Приготовление калибровочного раствора: 11 мг натрия пирувата растворяют
в небольшом количестве воды, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят
водой до метки – 1 мл калибровочного раствора содержит 110 мкг натрия
пирувата, что соответствует 88 мкг или 1 мкмоль пировиноградной кислоты.
Ход работы: 1) Опытная проба: В пробирку вносят 0,5 мл субстратного
раствора и 0,1 мл исследуемой сыворотки. Пробирку ставят в термостат при
37°С на 30 мин. Добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и
выдерживают 20 мин. при комнатной температуре. Потом добавляют 5 мл 0,4
М NaOН, перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре
для
развития
цвета.
Интенсивность
окраски
определяют
на
фотоэлектроколориметре при λ= 546 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм
против контрольной пробы.
2) Контрольная проба: В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора, 0,1 мл
сыворотки и 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Контрольную пробу
оставляют на 10 мин при комнатной температуре.
110
Расчет активности АлАТ в сыворотке крови проводят по калибровочныму
графику, который показывает зависимость оптической плотности от
содержания пировиноградной кислоты.
Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора готовят
ряд разведений (см. табл.). Калибровочные пробы проводят так же как и
опытные, но вместо сыворотки добавляют разведенные калибровочные
растворы. Измеряют против холостой пробы, в которую вместо калибровочных
растворов добавляют воду. Определив оптические плотности строят
калибровочный график, откладывая на оси абсцисс активность фермента, а на
оси ординат – значение оптической густоты. Калибровальная кривая линейная
до величины оптической плотности - 0,3.
Получение калибровочных растворов
№
про
бы
1
2
3
4
5
Калибровочный
раствор натрия
пирувата, мл
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Дист.
вода, мл
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
Пировиноградная
кислота
мкг
мкмоль
4,4
0,05
8,8
0,10
13,2
0,15
17,6
0,20
22,0
0,25
Активность
АлАТ,
нмоль/(с.л)
278
556
834
1112
1390
Активность АлАТ расчитывают по формуле:
С × 1000
Активность =
30 × 0,1 [мкмоль/(мин. л) или МО/л]
где: С – содержание пировиноградной кислоты,
калибровочному графику (в мкмолях);
1000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки
0,1
30 – коэффициент пересчета на 1 хв.;
Коэффициент пересчета в нмоль/(с•л) равняется 16,67.
Сделать вывод.
определённой
по
Клинико-диагностическое значение. Активность АсАТ в крови
увеличивается через 4-6 ч. после инфаркта миокарда и обычно возвращается к
норме на 3-7 день. При стенокардии АсАТ остается в норме. Снижение
нормальных показателей аминотрансфераз в плазме может наблюдаться при
недостаточности витамина В6, а также при почечной недостаточности.
Наивысшая активность АлАТ характерна для заболеваний печени – особенно в
инкубационном периоде инфекционного гепатита.
111
Рост активности ферментов в сыворотке крови указывает на некроз печени
или ее повреждение любой этиологии, включая холестатическое или
обструктивную желтуху, хронические гепатиты, алкогольный гепатит (АсАТ
обычно больше АлАТ); вирусные и хронические гепатиты (АлАТ > АсАТ),
метастазы в печень и гепатомы; инфекционный мононуклеоз; некроз, травма,
воспалительные заболевания сердечной или скелетной мышц; после острого
инфаркта миокарда АсАТ > АлАТ; тяжелая физическая нагрузка, сердечная
недостаточность, тяжелые ожоги, тепловой удар, гипотиреоидизм,
молочнокислый ацидоз и др.
Нормальные значения или незначительное повышение наблюдается при
циррозе печени, неврологических заболеваниях, церебральном инфаркте,
остром панкреатите, гемофилии, нарушении процессов всасывания в
кишечнике, ожирении и др.
Диагностически важным является одновременное определение активности
АлАТ и АсАТ и расчет коэффициента де Ритиса – АсАТ/АлАТ, который в
норме равняется приблизительно 1,3. При инфекционном гепатите он ниже
нормы, при инфаркте миокарда – выше нормы.
Нормативные величины: для АлАТ – 28-190 нмоль/(с•л)
[0,1-0,68 мкмоль/(ч.мл)] при 37оС или 11,4 МО/л.
Опыт 2. Унифицированный метод определения креатинина по цветной
реакции Яффе (метод Поппера и соавторов)
Принцип метода. В результате реакции креатинина и пикриновой кислоты
в щелочной среде образуется цветное соединение, интенсивность цвета
которого прямопропорциональна концентрации креатинина.
Материальное обеспечение: Насыщенный раствор пикриновой кислоты
(2 г пикриновой кислоты растворяют у 100 мл горячей (70-80оС)
дистиллированной воды) оставляют на сутки при комнатной температуре,
фильтруют, хранят в темной посуде; основной стандартный раствор креатинина
(8,8 мМ 100 мг креатинина растворяют в 100 мл 0,1 н раствора хлоридной
кислоты) хранят в холодильнике с притертой пробкой; раствор едкого натрия –
10 г/100 мл; 0,1 н раствор хлоридной кислоты; центрифуга, водяная баня,
фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.
Ход работы: 2 мл сыворотки смешивают в пробирке с 6 мл прозрачного
насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помещают
на 15-20 с в кипящую водяную баню, потом содержание пробирки
центрифугируют (или фильтруют). К 4 мл супернатанта добавляют 0,2 мл
раствора NаОН, перемешивают и доводят водой до 10 мл. Через 10 мин пробы
колориметрируют при зеленом светофильтре (длина волны 530 нм) в кювете с
толщиной слоя 20 мм против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят
следующим образом: к 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты
добавляют 0,2 мл раствора NаОН и доводят водой до 10 мл. Стандартную
пробу готовят аналогично опытной, но с той разницей, что вместо сыворотки
берут 2 мл рабочего стандартного раствора и содержание пробирки не
центрифугируют.
112
Рассчитывают концентрацию креатинину (Х) по формуле:
АОП
X=
× 0,088 (ммоль/л)
АСТ.
или
АОП
X=
× 88 (мкмоль/л)
АСТ.
где: АОП – экстинкция опытной пробы;
АСТ – экстинкция стандартной пробы;
0,088 ммоль/л (88 мкмоль/л) – концентрация креатинина в стандартной пробе.
Сделать выводы.
Клинико-диагностическое значение. Креатинин – конечный продукт обмена
креатина. Концентрация креатинина в крови является достаточно постоянной
величиной, что отображает мышечную массу и не зависит от питания и других
факторов. Креатинин не реабсорбируется в почечных канальцах, поэтому с
диагностической целью используется его определение в крови и моче для
оценки скорости клубочковой фильтрации почек. В норме содержание
креатинина у женщин – 0,044-0.097 ммоль/л или 44-97 мкмоль/л; у мужчин –
0,044-0,115 ммоль/л или 44-115 мкмоль/л. Повышенные показатели могут быть
на фоне принятия нефротоксических препаратов, при лейкемии, гемолизе,
кетоацидозе, заниженные – при желтухе. Повышенная концентрация
креатинина в крови наблюдается при острых и хронических заболеваниях
почек, активной акромегалии, гигантизме, гипертиреозе. Снижение даного
показателя может наблюдаться на протяжении I и ІІ триместров беременности,
а также при уменьшении мышечной массы (обусловленной возрастом или
мышечной дистрофией).
Контроль выполнения лабораторной работы
1.
При
определении
активности
АлАТ
унифицированным
динитрофенилгидразиновим
методом
Райтмана-Френкеля
используют
субстратную смесь:
А. - Кетоглутарат и аланин
В. - Кетоглутарат и глицин
С. - Кетоглутарат и аспартат
D. Оксалоацетат и аланин
Е. Оксалоацетат и глутамат
2.
Гидразон пировиноградной кислоты в щелочной среде образует краснобурую расцветку, интенсивность которой прямопропорциональна количеству:
А. Пирувата
В. Оксалоацетата
113
С. - Кетоглутарата
D. Аланина
Е. Аспартата
3.
В результате реакции креатинина и пикриновой кислоты в щелочной
среде образуется цветное соединение, интенсивность цвета которого
прямопропорциональна концентрации:
А. Креатинина
В. Креатина
С. - Кетоглутарата
D. Аланина
Е. Аспартата
4.Нормативные величины креатинина для женщин составляют:
А. 0,044-0,097 ммоль/л
В. 0,440-0,970 ммоль/л
С. 4,400-9,700 ммоль/л
D. 44,000-97,000 ммоль/л
Е. 440,000-970,000 ммоль/л
5.
Больной 55 лет госпитализирован с жалобами на боли в левой половине
грудной клетки, одышку в состоянии покоя с диагнозом – инфаркт миокарда.
Результаты лабораторных анализов: креатинкиназа - 12 мкмоль/мин.л) (норма
0-6); АсАТ - 60 мкмоль/(мин.л) (норма 2-20); ЛДГ - 15 мкмоль/(ч.мл) (норма
8,8-4,0). Подтверждается ли диагноз на основе проведенного лабораторного
исследования?
Примеры тестов „Крок-1”
1. У больного 60 лет присутствуют клинические признаки инфаркта миокарда.
Определение активности каких ферментов сыворотки крови подтвердят
диагноз?
А. Трансаминаза, креатинкиназа, лактатдегидрогеназа
В. Трансаминаза, креатинкиназа, глутаматдегидрогеназа
С. Креатинкиназа, липаза, глутатиопероксидаза
D. Лактатдегидрогеназа, трансаминаза, амилаза
Е. Гликозидаза, амилаза, супероксиддисмутаза
2. Больной 30 лет, спортсмен, после очередной тренировки потерял сознание.
До этого возникали боли в области сердца. Больному предварительно
поставлен диагноз инфаркт миокарда. Определение активности какого
фермента необходимо провести для уточнения диагноза?
А. Альдолазы
В. АсАТ
С. Лужной фосфатазы
D. Холинэстеразы
Е. Кислой фосфатазы
114
3. Больной 45 лет жалуется на общую слабость, быструю утомляемость. При
анализе крови установлено снижение активности аминотрансфераз и
декарбоксилаз аминокислот. Больному нужно назначить:
А. Тиамин
В. Рибофлавин
С. Пиридоксальфосфат
D. Фолиевую кислот
Е. Никотинамид
4. К врачу обратился больной, у которого выраженные аллергические
симптомы: сыпь на теле, отеки лица, зуд. Это связано с увеличением
образования:
А. Холина
В. ГАМК
С. Дофамина
D. Гистамина
Е. Серотонина
5. К врачу обратилась больная с термическим ожогом. В сыворотке крови
больной наблюдается:
А. Увеличение концентрации ГАМК
В. Снижение концентрации ГАМК
С. Увеличение концентрации дофамина
D. Повышение концентрации гистамина
Е. Снижение концентрации гистамина
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Клинико-диагностическое значение определения трансаминаз.
2. Синтез и распад биогенных аминов.
Литература
Основная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998.
– 704 с.
2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. –
508 с.
3. Гонський Я.І. Біохімія людини. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – 735 с.
4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі / За ред. О.Я. Склярова. –
Львів: Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Справочник по лабораторным методам исследования. Под ред. проф. Л.А.
Даниловой. – М. – С.-Пб. – Нижний Новгород – Воронеж – Ростов-наДону – Екатеринбург – Самара – Киев – Харьков – Минск: Питер. – 2003.
– 733 с.
115
Тема № 9. Исследование процессов детоксикации аммиака и биосинтеза
мочевины.
Цель занятия: Знать пути образования, транспорта и обезвреживания
аммиака в организме человека. Освоить методы определения мочевины,
фенилпировиноградной кислоты в биологических жидкостях, уметь
интерпретировать полученные данные.
Актуальность темы: В процессе обмена аминокислот образуются
метаболиты, опреление которых в крови и моче может быть использовано для
диагностики и контроля за лечением.
Конкретные задачи:
 Количественно определять мочевину в биологических жидкостях. Давать
оценку проведенным исследованиям и делать выводы;
 Трактовать
метаболические
закономерности
образования
и
обезвреживания аммиака, циркуляторного транспорта аммиака, биосинтеза
мочевины;
 Анализировать изменения в системах транспорта и обезвреживания
аммиака при генетических аномалиях ферментов метаболизма аммиака;
 Объяснять особенности функционирования общих путей метаболизма
безазотистых скелетов аминокислот и специализированных превращений
циклических аминокислот;
 Объяснять биохимические основы возникновения и проявлений
генетических аномалий обмена циклических аминокислот и анализировать
причины накопления промежуточных продуктов их обмена при
фенилкетонурии, алкаптонурии, альбинизме.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Теоретические вопросы
Общие пути метаболизма безазотистого скелета аминокислот в организме
человека. Глюкогенные и кетогенные аминокислоты.
Пути образования аммиака. Токсичность аммиака и механизмы его
обезвреживания. Циркуляторный транспорт аммиака (глутамин, аланин).
Биосинтез мочевины: ферментные реакции; генетические дефекты
ферментов (энзимопатии) синтеза мочевины.
Специализированные пути обмена ациклических аминокислот. Обмен
глицина и серина; роль тетрагидрофолата (H4-фолата) в переносе
одноуглеродных фрагментов, ингибиторы дигидрофолатредуктазы как
противоопухолевые средства.
Обмен серусодержащих аминокислот; реакции метилирования.
Особенности обмена аминокислот с разветвленными углеродными
радикалами; участие коферментных форм витамина В12 в метаболизме
аминокислот.
Обмен аргинина; биологическая роль оксида азота, NO-синтаза.
Специфические пути метаболизма циклических аминокислот фенилаланина
и тирозина, последовательность ферментативных реакций. Наследственные
116
энзимопатии обмена циклических аминокислот фенилаланина и тирозина –
фенилкетонурия, алкаптонурия, альбинизм.
9. Обмен триптофана: кинурениновый и серотониновый пути.
Практическая работа
Опыт 1. Определение содержания мочевины в моче.
Принцип метода. Метод базируется на спосрбности мочевины,
содержащей аминогруппы, образовывать с парадиметиламинобензальдегидом в
кислой среде комплексное соединение, окрашенное в желтый цвет.
Интенсивность окраски прямопропорциональна концентрации мочевины в
исследуемой моче и определяется фотоколориметрически (450-480 нм).
Материальное обеспечение: моча; 2 %-ный раствор парадиметиламинобензальдегида (ПДМАБА); стандартный раствор мочевины (2,5 %); ФЭК,
пипетки, микропипетки, сухие пробирки.
Ход работы. В пробирку наливают 0,2 мл мочи, добавляют 1,2 мл
раствора ПДМАБА и тщательно перемешивают. Через 15 мин пробу
фотометрируют в сухих кюветах шириной 3 мм (синий светофильтр, λ = 450480 нм) против воды. Показатель А для контроля – 0,08. Для определения
содержания мочевины в моче пользуются калибровочным графиком (0,5; 1,0;
1,5; 2,0; 2,5 г мочевины в 100 мл) и рассчитывают количество мочевины в
г/сутки. При построении калибровочного графика используют стандартные
растворы мочевины (вместо мочи берут по 0,2 мл стандартных растворов,
проводят реакцию, аналогично опытной пробе, фотометрируют). Коэффициент
пересчета в одиницы СИ (ммоль/сутки) составляет 16,65.
Объяснить полученные результаты. Сделать вывод.
Опыт 2. Определение содержания мочевины в сыворотке крови и моче
по реакции с диацетилмонооксимом.
Принцип метода. Мочевина в кислой среде при наличии
тиосемикарбазида и солей ферума (железа) образует с диацетилмонооксимом
комплексное соединение красного цвета, оптическая плотность которого при
использовании зеленого светофильтра (500-560 нм) пропорциональна
концентрации мочевины.
диацетилмонооксим
диацетил
диацетил
мочевина
гидроксиламин
диазиновое производное
117
Материальное обеспечение: раствор трихлорацетатной кислоты (ТХАК)
(100 г/л), диацетилмонооксим (25 г/л, водный стабильный раствор),
тиосемикарбазид (2,5 г/л водный раствор стабильный при хранении в темной
посуде при комнатной температуре), кислота сульфатная конц.(96 %), кислота
ортофосфорная (85 %), раствор ферума хлорида (основной раствор – 5 г ферума
хлорида доводят до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл сульфатной
кислоты конц.; из основного раствора готовят рабочий: 1 мл основного
раствора ферума хлорида доводят до 100 мл водою, добавляют 8 мл конц.
сульфатной кислоты и 1 мл 85 % ортофосфатной кислоты; сохраняют 2 недели
в темной посуде), раствор бензойной кислоты (2 г/л), раствор мочевины (7
ммоль/л – 42г/100 мл), цветной реактив (к 30 мл рабочего раствора ферума
хлорида добавляют 20 мл воды, 1 мл раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл
раствора тиосемикарбазида; цветной реактив готовят каждый раз перед
использованием), спектрофотометр, водяная баня с температурой 100С,
сыворотка
крови,
суточная
моча
профильтрованная,
розведенная
изотоническим раствором натрия хлорида или дистилированной водой 1:50 или
1:100.
Ход работы. Определение с депротеинированием. Пробы: сыворотка
(плазма) крови липемическая или гемолизованная; цельная кровь (плазма).
Ход определения проводят по следующей схеме:
Контрольная
Стандартная
Опытная
проба,
проба,
проба,
мл
мл
мл
Н2О
1,0
0,8
0,8
Раствор ТХАК
1,0
1,0
1,0
Исследуемая
0,2
проба
Стандартный
0,2
раствор
мочевины
Перемешать и центрифугировать 10 мин при 3000 об/мин.
Надосадочная
0,5
0,5
0,5
жидкость
Цветной
5,0
5,0
5,0
реактив
Содержание пробирок тщательно перемешивают, отверстие закрывают
алюминиевой фольгой и пробирки ставят в кипящую водяную баню точно на 20
мин. Потом пробирки быстро охлаждают водой и измеряют оптическую
плотность стандартной (Астанд.) и опытной (Адосл.) проб при зеленом
светофильтре (500-560 нм) против контрольной пробы в кювете толщиной 1,0
см. Окраска остается стойкой в течение 15 мин. Обратить внимание на
следующее: если содержание мочевины в пробе превышает 17 ммоль/л, пробу
118
необходимо развести дистилированной водой и анализ провести повторно.
Результат необходимо умножить на разведение.
Рссчет содержания мочевины проводят по формуле:
АОП.
С=
 7 где:
АСТАНД.
С – содержание мочевины в опытной пробе, ммоль/л;
АОП. – оптическая плотность опытной пробы;
АСТАНД. – оптическая плотность стандартной пробы;
7 – содержание мочевины в стандартном растворе, ммоль/л.
Объяснить полученный результат. Сделать вывод.
Клинико-диагностическое значение. Синтез мочевины происходит в
печени (цитозоль и митохондрии) главным образом из аммиака, который
образуется при дезаминировании аминокислот, распаде пуриновых и
пиримидиновых нуклеотидов. За сутки с мочой здорового человека выделяется
20-35 г или 333-583 ммоль мочевины. В норме содержание мочевины в
сиворотке крови составляет 3,3 - 8,3 ммоль/л.
Отклонения от нормального содержания зависят от интенсивности
процессов синтеза мочевины и ее выведения.
Увеличение содержания мочевины в сыворотке крови является одним из
главных признаков нарушения выделительной функции почек. Кроме того,
возрастание уровня мочевины в сыворотке крови может быть внепочечного
происхождения – при потере организмом жидкости (рвота, понос,
обезвоживание), при усиленном разпаде белков (острая жировая дистрофия
печени).
Снижение содержания мочевины может наблюдаться при заболеваниях
печени (паренхиматозная желтуха, цирроз печени) вследствие нарушения
синтеза мочевины в печени.
Повышенное содержание мочевины в моче наблюдается при дефиците
белка в пище, при злокачественной анемии, высокой температуре, интенсивном
разпаде белков в организме, после приема салицилатов, при отравлении
фосфором.
Пониженное содержание – наблюдается при циррозе печени,
паренхиматозной желтухе, нефрите, ацидозе, уремии.
Опыт
3.
Проба
Феллинга.
Качественная
реакция
на
фенилпировиноградную кислоту.
Принцип метода. Фенилпировиноградная кислота образует с ионами
трехвалентного ферума комплексное соединение сине-зеленого цвета.
Материальное обеспечение: моча больного фенилкетонурией, 10 %-ный
раствор ферума хлорида, капельницы, фильтры, пипетки.
Ход работы. К 2 мл свежеотфильтрованной мочи наливают 8-10 капель
10% раствора FeCl3. Если в моче имеется фенилпировиноградная кислота, через
30-60 сек раствор приобретает сине-зеленую окраску, которая постепенно в
119
течение 5-30 мин (в зависимости от концентрации фенилпировиноградной
кислоты в моче) исчезает.
Клинико-диагностическое
значение.
Врожденное
отсутствие
(пониженная активность) у детей в печени фермента фенилаланин-4монооксигеназы вызывает нарушение окисления фенилаланина в тирозин и,
соответственно, всех дальнейших метаболических превращений тирозина.
Накопление в крови и тканях фенилаланина и продуктов его распада, в том
числе фенилпировиноградной кислоты, вызывает интоксикацию организма.
Следствием этого является нарушение нормального развития мозга и тяжелые
нервные расстройства. Диагностическим критерием этого наследственного
заболевания является повышенное содержание фенилаланина в крови, наличие
фенилпировиноградной кислоты в моче. В норме концентрация фенилаланина в
крови детей в среднем составляет: до 1 месяца – 0,133 ммоль/л, от 1 месяца до 1
года – 0,095 ммоль/л, от 1 года до 14 лет – 0,115 ммоль/л.
Пробу Феллинга можно проводить на фильтровальной бумаге. Полоску
фильтровальной бумаги смачивают мочой, высушивают на воздухе и наносят
каплю 10% раствора FeCl3. Положительная проба дает сине-зеленый цвет.
Аналогичную пробу можно проводить на сухой или мокрой детской пеленке.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. Какое содержание мочевины в крови и моче здорового человека? Каким
методом ее определяют?
2. С помощью какой реакции можно диагностировать фенилкетонурию?
3. В больницу привезли двухлетнего ребенка. После приема пищи у него часто
возникает рвота. Ребенок отстает в весе, физическом и умственном развитии.
Волосы темные, но есть седая прядь. Проба мочи посли добавления FeCl3
приобрела зеленый цвет. Результаты количественного анализа мочи:
содержание фенилаланина – 7 ммоль/л при норме 0,01; содержание
фенилпирувата – 4,8 ммоль/л при норме 0; содержание фениллактата – 10,3
ммоль/л при норме 0. О каком нарушении метаболизма свидетельствуют
полученные данные? Что можно порекомендовать для нормализации
метаболизма относительно лечебного питания в этом случае?
4. У маленьких детей больных квашиоркором в первые дни после перевода на
полноценную диету наблюдается потеря веса. Объясните причину этого
феномена.
Примеры тестов „Крок-1”
1. У больного моча имеет специфический запах кленового сиропа. Какой
биохимический дефект является причиной этого заболевания?
А. Нарушение окислительного декарбоксилирования кетокислот с
разветвленной углеводной цепью
В. Нарушение окислительного декарбоксилирования α-кетокислот
120
C. Нарушение декарбоксилирования глутаминовой кислоты
D. Снижение активности 5-окситриптофандекарбоксилазы
E. Снижениея активности НАД-дегидрогеназы цитрата и декарбоксилазы
щавелевоянтарной кислоты
2. У ребенка наблюдаются нарушения функций центральной нервовой системы.
Клинико-биохимическими методами выявлено гипераммониемию и уремию.
Предварительный диагноз – наследственная гипераммониемия, обусловленная
нарушением синтеза мочевины. Какая энзимопатия может быть причиной этого
заболевания?
А. Глутатионтрансферазы
D. Глюкуронилтрансферазы
В. Сульфотрансферазы
Е.
С. Глицинтрансферазы
Орнитинкарбомоилтрансферазы
3. В крови пациента 50 лет наблюдается высокий уровень серотонина, в моче –
резкое возрастание концентрации 5-оксииндолилацетатной кислоты.
Нарушение метаболизма какой аминокислоты может вызывать такие
изменения?
А. Метионина
D. Фенилаланина
В. Триптофана
E. Гистидина
С. Глутамата
4. Оксид азота образуется под действием NО-синтазы, сложной Са2+-зависимой
ферментной системы, из аминокислоты:
А. Аргинина
D. Лизина
В. Аланина
E. Лейцина
С. Аспартата
Индивидуальная самостоятельная работа студентов
1. Особенности функционирования орнитинового цикла в норме и при
патологии.
2. Пути метаболизма фенилаланина; наследственные энзимопатии обмена
фенилаланина.
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення.
Довідник // За ред. Склярова О.Я. Київ: Здоров’я, 2002. – С.50-57.
2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига,
2001. – С. 413-434.
3. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.
242-263.
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2002.
– С.153-167.
121
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів:
Світ, 2006. – 271 с.
Дополнительная:
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. –
С. 446-468.
2. Гуревич К.Г., Шимановський Н.Л. Оксид азота: биосинтез, механизмы
действия, функции // Вопросы биол. медиц. и фармацевт. химии, 2000. – №4.
– С.16-56.
3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – С. 182-187.
4. Кононов И.Н., Журбина А.И., Филимонов А.Ю. Аргинин в медицинской
практике (Обзор лит.) // Журн. АМН України, 2004. – Т. 10, № 2. – С. 339351.
5. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – М.: Мир,
1993. – Т. 1. – С. 311-355.
6. Меркулова Ю.В., Чайка Л.А., Гомон О.Н., Белостоцкая Л.И.
Фармакологические основы фармакотерапии гипераммониемии //
Фармакологічний вісник, 1998. – № 6. – С. 13-18.
7. Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Особливості обміну речовин у дітей. – Чернівці:
БДМА, 2003. – С. 4-18.
8. Надинская М.Ю. Печеночная энцефалопатия (Обзор литературы) // Рос.
журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол, 1998. – № 8 (2). – С. 25-32.
9. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1989. – С. 315339, 343-345,411-426.
10. Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Постовітенко К.П. та ін. Гіпергомоцистеїнемія //
Досягнення біол. та медицини, 2004. – №1. – С. 35-38
Тема № 10. Исследование промежуточных
порфирина и их накопление при порфириях.
продуктов
биосинтеза
Цель занятия: Проанализировать методы определения гемоглобина,
выполнить бензидиновую пробу и обнаружить геминовую группу гемоглобина,
как пробу на минимальное количество крови в биологическом материале.
Актуальность темы: Порфирины – органические соединения,
принимающие участие в главных процессах жизнедеятельности: тканевом
дыхании и фотосинтезе. В свободном состоянии порфирины почти не
встречаются,
специфические
соединения
порфирина
представлены
комплексами, состоящими из белков и металлов.
Гемпротеины – комплексы железа с порфирином и белком – являются
представителями разных соединений, функция которых связана с обменом
кислорода. Одна из групп гемпротеинов является дыхательными ферментами. К
ним относятся каталаза, пероксидазы, цитохромы. Вторая группа гемпротеинов,
которые переносят и депонируют кислород, представлена гемоглобином,
миоглобином. Накопление их в организме выше нормы вызывает повышенную
светочувствительность кожных покровов.
122
Конкретные задачи:
 Трактовать использование аминокислот как предшественников в
биосинтезе гема, глутатиона.
 Знать
биохимические функции гемпорфиринов: гемоглобина,
миоглобина, цитохромов.
 Обусловить основные этапы синтеза порфирина на примере гема.
 Объяснить процессы развития порфирий.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Теоретические вопросы
Порфирины. Строение порфирина.
Синтез порфирина, схема ферментативных реакций синтеза гема.
Регуляция синтеза порфирина.
Наследственные нарушения обмена порфирина (энзимопатии).
Клинические
проявления
порфирий:
светочувствительность,
неврологические нарушения.
Классификация порфирий – эритропоэтическая (болезнь Гюнтера),
печеночные порфирии, фотодерматиты.
Практическая работа
Опыт 1. Обнаружить гемоглобин крови с помощью бензидиновой
пробы.
Принцип метода. Для выявления кровяного пигмента используют
бензидиновую пробу, которая основана на каталитическом свойстве
производных гемоглобина окислять бензидин за счет кислорода пероксида
водорода. Продукт окисления бензидина окрашен в синий цвет, при стоянии
переходит в красный.
Материальное обеспечение: 1 % раствор крови, 1 % раствор бензидина в
ледяной уксусной кислоте, 3 % раствор пероксида водорода, пипетки.
Ход работы. В пробирку наливают 5 капель 1 % раствора крови, 5 капель
раствора бензидина, 2-3 капли пероксида водорода и наблюдают за появлением
синей окраски.
Химизм данной реакции:
Сделать вывод. Обратить внимание на то, что данная реакция указывает на
присутствие гемоглобина.
Клинико-диагностическое значение. Повышение уровня гемоглобина
наблюдается при: высотной гипоксии, хронической легочной недостаточности,
врожденных пороках сердца с уменьшенным легочным кровообращением,
большой потере жидкости, тяжелой пищевой интоксикации и отравлении
угарным газом.
123
Гипохромная анемия может возникать в результате расстройства
всасывания железа, острого и хронического кровотечения.
Гиперхромная анемия наблюдается при недостаточном всасывании
цианкобаламина и фолиевой кислоты в пищеварительном тракте, глистной
инвазии, ахиличном гастрите, полипозе желудка, состоянии после резекции
желудка.
Опыт 2. Полуколичественный метод определения копропорфиринов
(КП) в моче.
Принцип метода. Копропофирины имеют свойство в кислой среде в
присутствии эфира давать флюоресценцию в потоке УФ-света.
Материальное обеспечение: пробирки, эфир, уксусная кислота,
хроматоскоп.
Ход работы. К 5 мл мочи в пробирке с притертой пробкой добавляют
несколько капель ледяной уксусной кислоты (до кислой реакции по лакмусовой
бумажке), потом приливают 5 мл эфира и смесь энергично стряхивают на
протяжении 3 – 5 мин. После отстаивания и разделения слоев наблюдают
флюоресценцию в верхнем слое, помещая пробирку в поток УФ-света.
Копропорфирины определяют в баллах по такой шкале:
1 балл – голубая флюоресценция – нормальное содержание КП;
2 балла – едва заметная розовая – слабое увеличение концентрации КП;
3 балла – четкая розовая – среднее увеличение концентрации КП;
4 балла – слабая красная – сильное увеличение концентрации КП;
5 баллов – четкая красная флюоресценция – очень сильное увеличение
концентрации КП.
Клинико-диагностическое значение. Наследственная копропорфирия
связана с дефицитом копропорфириногеноксидазы – митохондриального
фермента, катализирующего превращение копропорфириногена ІІІ в
протопорфирин ІХ. В крови накапливается копропорфириноген ІІІ, который в
больших количествах выделяется с калом и мочой и окисляется в пигмент
красного цвета – копропорфирин. У таких больных повышена
светочувствительность кожи. Введение гематина уменьшает симптомы.
Контроль выполнения лабораторной работы
1. У больного, который страдает эритропоетической порфирией, моча
приобрела розовую окраску. Появлением какого вещества в моче можно
объяснить изменение ее окраски?
А. Гемоглобина
D. Копропорфирина ІІ
В. Уропорфирина И
Е. Протопорфирина
С. Уропорфирина ІІІ
2. У ребенка 8 лет наблюдается эритема кожи, повышена чувствительность к
солнечному облучению, температура тела повышена, увеличена селезенка.
Моча окрашена в красно-оранжевый цвет за счет наличия уропорфирина І. У
больного отмечается повышенная чувствительность кожи к солнечным лучам.
124
При стоянии моча приобретает темно-красный цвет. Какая наиболее вероятная
причина такого состояния?
A. Алкаптонурия
D. Пелагра
B. Гемолитическая желтуха
E. Порфирия
C. Альбинизм
3. Женщина 43 лет, работница лако-красочного предприятия, жалуется на
общую слабость, снижение массы тела, апатию, сонливость. Хроническая
свинцовая интоксикация подтверждена лабораторно – обнаружена гипохромная
анемия. В крови повышен уровень протопорфирина и снижен уровень δаминолевулиновой кислоты, которая свидетельствует о нарушении синтеза:
A. ДНК
D. Белка
B. Гема
E. Мевалоновой кислоты
C. РНК
4. У больной 45 лет, страдающей эритропоетичной порфирией, наблюдается
светочувствительность кожи. Накопление какого соединения в клетках кожи
определяет ее светочувствительность?
5. Больной 33 лет болеет на протяжении 11 лет. Периодически обращался к
врачу с жалобами на острые боли в животе. Оперирован трижды. Диагноз язва,
панкреатит, холецистит. Через 11 лет от начала заболевания после очередного
приступа болей в животе обнаружил красную мочу. Какая возможна причина?
6. Какую реакцию используют для выявления геминовой группы гемоглобина?
7. На каком принципе основывается определение копропорфиринов?
Примеры тестов „Крок-1”
1. У ребенка 5 лет под действием солнечных лучей на коже появляются
эритемы, везикулярная сыпь, ребенок жалуется на зуд. Исследование крови
обнаружило уменьшение содержания железа в сыворотке крови, увеличение
выделения с мочой уропорфириногена І. Наиболее вероятной наследственной
патологией у ребенка является:
A. Копропорфирия
D. Эритропоетическая порфирия
B. Метгемоглобинемия
E. Интермитирующая порфирия
C. Печеночная порфирия
2. У пациента визуально обнаружено пузыри и усиленную пигментацию кожи
после влияния УФ - лучей. Моча после стояния приобретает красный цвет.
Обнаружение в моче какого из перечисленных показателей дает возможность
верифицировать болезнь Гюнтера?
A. Ацетона
D. Креатинина
B. Гемоглобина
E. Уропорфириногена ІІ
C. Билирубина
125
3. Беременной женщине назначено обезболивающие лекарственные препараты,
что спровоцировало появление у ребенка наследственного заболевания –
острой изменчивой порфирии, при которой имеет место недостаточность
уропорфириногенсинтазы. Какой промежуточный продукт синтеза гема
экскретируется с мочой у таких больных?
А. Уропорфириноген ІІІ
В. Порфобилиноген
С. Копропорфириноген ІІІ
D. Протопорфирин ІІІ
Е. Протопорфириноген ІІІ
Самостоятельная индивидуальная работа студентов
1. Метаболизм порфирина.
Литература
Основная:
1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990.528с.
1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ – Тернопіль, Укрмедкнига, 2000.
– 508с.
2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. –
Тернопіль, Укрмедкнига, 2002.-744с.
3. Біологічна хімія. Тести і ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. –
Львів: Світ, 2006. – 271 с.
1. Клінічна біохімія/ За ред. проф. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2006. – 485
с.
2. Практикум із біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002.
– 297 с.
Дополнительная:
1. Ангельські С., Якубовські З., Домінічак М. Клінічна біохімія. Сопот.
1998. - 451 с.
2. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача Екатеринбург.
Уральский рабочий. 1994. - 384 с.
3. Камышников В.С. Клинические лабораторные тесты от А до Я и их
диагностические профили/ МЕДпресс –информ – Москва, 2005. – 320с.
4. Клиническая биохимия: Учебное пособие для вузов /Бочков В.Н.,
Добровольский А.Б., Кушлинский Н.Е. и др. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 521с.
5. Клиническая биохимия: Учебник для студентов мед. вузов /А.Я.
Цыганенко, В.И. Жуков, В.В. Леонов и др. – Харьков: Факт, 2005.— 456с.
6. Мещишен І.Ф., Пішак В.П., Григор’єва Н.П. Основи обміну речовин та
енергії. Чернівці, 2005, – 192с.
126
Тема № 11. Итоговый контроль. Модуль 3.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Теоретические вопросы
Анаэробное окисление глюкозы – гликолиз: ферментативные реакции
гликолиза, энергетика, регуляция. Гликолитическая оксидоредукция,
субстратное фосфорилирование в гликолизе.
Значение работ Ембдена, Мейергофа, Парнаса в определении
последовательности ферментативных реакций гликолиза (молочнокислого
брожения).
Спиртовое и другие виды брожения.
Биосинтез глюкозы – глюконеогенез: физиологическое значение,
ферментативные реакции, регуляторные ферменты. Метаболический путь
глюконеогенеза:
субстраты
глюконеогенеза,
компартментализация
превращения пирувата в фосфоенолпируват. Лактат и аланин как
субстраты глюконеогенеза.
Глюкозо-лактатный (цикл Кори) и глюкозоаланиновий циклы.
Этапы аэробного окисления глюкозы.
Окислительное декарбоксилирование пирувата, мультиферментный
пируватдегидрогеназный комплекс – особенности функционирования при
участии трех ферментов и пяти коферментов.
Сравнительная характеристика биоэнергетики аэробного и анаэробного
окисления глюкозы.
Челночные механизмы окисления гликолитического НАДН. Малатаспартатний
шунт
транспорта
восстановительных
эквивалентов
гликолитического НАДН в митохондриях в аэробных условиях.
Пентозофосфатний путь (ПФШ) окисления глюкозы: схема, биологическое
значение,
особенности
функционирования
в
разных
тканях.
Последовательность ферментативных реакций ПФШ, окислительная
стадия и стадия изомерных превращений пентозо-, гексозо- и
гептозофосфатов.
Значение
ПФШ
как
донора
НАДФН
в
восстановительном синтезе жирных кислот и стероидов, как поставщика
рибозо-5-фосфата для образования нуклеотидов в синтезе нуклеиновых
кислот.
Нарушения пентозофосфатного пути в эритроцитах: ензимопатии глюкозо6-фосфат-дегидрогеназы.
Метаболический путь и ферментативные реакции превращения фруктозы в
организме человека.
Наследственные ензимопатии связанные с генетическими дефектами
синтеза ферментов метаболизма фруктозы – невосприимчивость фруктозы,
фруктоземия.
Метаболический путь и ферментативные реакции превращения галактозы в
организме человека. Наследственные ензимопатии связанные с
генетическими дефектами синтеза ферментов метаболизма галактозы –
галактоземия.
127
15. Расщепление и биосинтез гликогена: ферментативные реакции гликогенеза
и гликогенолиза.
16. Каскадные механизмы цАМФ-зависимой регуляции активностей
гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы.
17. Гормональная регуляция обмена гликогена в мышцах и печени.
18. Генетические нарушения ферментов метаболизма гликогена: гликогенозы
– аномально высокое накопление гликогена в органах и тканях,
агликогенозы – недостаточное запасание гликогена в тканях.
19. Метаболизм углеводных компонентов гликоконъюгатов. Биосинтез O- и Nсвязанных
гликопротеинов;
значение
гликозилтрансфераз
и
долихолфосфата. Биосинтез гликолипидов на примере образования
олигосахаридних фрагментов антигенных детерминант групп крови
человека системы АВО. Ферменты катаболизма гликоконьюгат.
20. Генетические нарушения метаболизма гликоконъюгатов (гликозидозы):
мукополисахаридозы – патологии соединительной ткани внутренних
органов, костей и суставов. Ревматизм.
21. Гормоны – регуляторы обмена глюкозы (глюкагон, адреналин,
глюкокортикоиды, соматотропин, инсулин – эффекты и механизмы
влияния на уровень глюкоземии).
22. Глюкоземия: нормальное состояние и его нарушение (гипер-,
гипоглюкоземия та глюкозурия).
23. Сахарный диабет: инсулинозависимая и инсулинонезависимая формы.
24. Клинико-биохимическая характеристика и диагностические критерии
сахарного диабета – глюкозотолерантный тест, двойная сахарная нагрузка.
25. Адипоциты жировой ткани и их роль в обмене липидов и
биоэнергетических процессах в организме.
26. Катаболизм триацилглицеролов: реакции; механизмы регуляции
активности триглицеридлипазы. Нейрогуморальна регуляция липолиза при
участии адреналина, норадреналина, глюкагона, инсулина.
27. Биосинтез
триацилглицеролов.
Биосинтез
фосфоглицеридов.
Ферментативные реакции, значения фосфатидной кислоты. Липотропные
соединения.
28. Метаболизм
сфинголипидов.
Генетические
аномалии
обмена
сфинголипидов – сфинголипидозы. “Лизосомальные болезни”: болезнь
Нимана-Пика, болезнь Тея-Сакса (ганглиозидоз GM2) ганглиозидоз GM1,
болезнь Гоше (глюкоцереброзидний липидоз).
29. Окисление жирных кислот (β-окисление): активация жирных кислот, роль
карнитина
в
транспорте
жирных
кислот
в
митохондрии,
последовательность ферментативных реакций. Энергетика β-окисления
жирных кислот.
30. Механизм окисления глицерола, энергетика этого процесса.
31. Биосинтез насыщенных жирных кислот (пальмитата), метаболические
источники,
ферментативные
реакции
–
синтез
малонил-КоА,
ацилтранспортирующий белок, источники НАДФН, необходимого для
биосинтеза жирных кислот, Регуляция процесса биосинтеза на уровне
128
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
ацетил-КоА-карбоксилазы и синтетазы жирных кислот. Елонгация
насыщенных жирных кислот. Образование ненасыщенных жирных кислот.
Кетоновые тела. Реакции биосинтеза и утилизации кетоновых тел, их
физиологичное значение. Метаболизм кетоновых тел в условиях
патологии. Механизмы избыточного роста содержания кетоновых тел при
сахарном диабете и голодании.
Биосинтез холестерина: метаболические предшественники; схема
последовательности реакций. Регуляция синтеза холестерина.
Пути биотрансформации холестерина: этерификация; образование
желчных кислот, стероидных гормонов, витамина D3; экскреция
холестерина из организма. Роль цитохрома Р-450 в биотрансформации
физиологически активных стероидов.
Патологии липидного обмена. Атеросклероз: механизмы развития, роль
генетических факторов. Атеросклероз как иммуновоспалительный процесс.
Инсулинонезависимый сахарный диабет – заболевание, которое
сопровождается гипертриглицеридемией (гиперлипопротеинемии І типа),
стимуляцией липолиза в жировой ткани, активацией синтеза кетоновых
тел, снижением активности процесса обратного транспорта холестерина.
Процессы липидной пероксидации в норме и в условиях патологии.
Регуляция свободнорадикальных реакций в организме человека.
Характеристика антиоксидантов и прооксидантов, их значение для
протекания реакций пероксидации липидов.
Пути образования и поддержки пула свободных аминокислот в организме
человека. Общие пути превращения свободных аминокислот.
Трансаминирование аминокислот: реакции; биохимическое значение;
механизмы действия аминотрансфераз.
Дезаминирование аминокислот. Механизм непрямого дезаминирования Lаминокислот.
Декарбоксилирование аминокислот: ферменты, физиологическое значение.
Образования физиологически активных соединений – биогенных аминов
(γ-аминомасляная кислота, гистамин, серотонин, дофамин, норадреналин,
адреналин) в тканях и аминов – эндогенных токсинов (путресцин,
кадаверин) в процессе гниения белков в кишечнике. Окисление биогенных
аминов.
Образование креатина и креатинина, клинико-биохимическое значение
нарушений обмена креатина и креатинина. Глутатион, его роль в обмене
органических пероксидов.
Общие пути метаболизма безазотистого скелета аминокислот в организме
человека. Глюкогенные и кетогенные аминокислоты.
Пути образования аммиака. Токсичность аммиака и механизмы его
обезвреживания. Циркуляторный транспорт аммиака (глутамин, аланин).
Биосинтез мочевины: ферментативные реакции; генетические дефекты
ферментов (ензимопатии) синтеза мочевины.
Специализированы пути обмена ациклических аминокислот. Обмен
глицина и серина; роль тетрагидрофолата (H4-фолата) в перенесении
129
одноуглеродных фрагментов, ингибиторы дигидрофолатредуктазы как
противоопухолевые средства.
48. Обмен серосодержащих аминокислот; реакции метилирования.
49. Особенности обмена аминокислот с разветвленными цепями; участие
коферментных форм витамина В12 в метаболизме аминокислот.
50. Обмен аргинина; биологическая роль оксида азота, NO-синтаза.
51. Специфические
пути
метаболизма
циклических
аминокислот
фенилаланина и тирозина, последовательность ферментативных реакций.
Наследственные ензимопатии обмена циклических, ациклических
аминокислот фенилаланина и тирозина – фенилкетонурия, алкаптонурия,
альбинизм.
52. Обмен триптофана: кинурениновий и серотониновий пути.
53. Порфирин. Структура порфирина.
54. Синтез порфирина, схема ферментативных реакций синтеза гема.
55. Регуляция синтеза порфирина.
56. Наследственные нарушения обмена порфирина (ензимопатии).
57. Клинические
проявления
порфирий:
светочувствительность,
неврологические нарушения.
58. Классификация порфирий – еритропоетическая (болезнь Гюнтера),
печеночные порфирии, фотодерматиты.
59. Выявление глюкозы в растворе реакциями Фелинга, Троммера. Написать
уравнение реакций.
60. Определение глюкозы крови глюкозооксидазним методом. Написать
уравнение реакций, которые лежат в основе этого метода. Какое содержание
глюкозы в крови человека в норме?
61. Определение глюкозы в крови ортотолуидиновым методом. Объяснить
принцип.
62. Выявление гликогена в печени. Как может быть использован гликоген
печени? Где еще накапливается в организме человека гликоген?
63. Определения конечного продукта анаэробного гликолиза – молочной
кислоты методом Бюхнера. Принцип метода.
64. Выявление ацетона (кетоновых тел) в моче (реакциями с нитропруссидом
натрия и хлоридом железа). Выявление кетоновых тел в моче экспрессметодом. Принципы методов. Значение выявления кетоновых тел в крови и
моче для медицины.
65. Определение содержания пировиноградной кислоты в биологической
жидкости колориметрическим методом. Объяснить принцип.
66. Изучение активности липазы поджелудочной железы. Какие соединения в
организме активируют липазу? Проиллюстрируйте ответ результатами
практической работы.
67. Объяснить процесс переаминирования с использованием глутаминовой и
пировиноградной кислот. Написать уравнение соответствующих реакций.
68. Объяснить
принцип
метода
определения
активности
аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы. Значение определения
этих ферментов для медицины.
130
69. Определение
мочевины
в
моче
цветной
реакцией
с
диацетилмонооксимом. Написать реакции образования мочевины в организме.
70. Определение креатинина в моче цветной реакцией Яффе. При каких
условиях наблюдается увеличение или уменьшение количества кратинина в
моче?
71. Качественная реакция на фенилпировиноградную кислоту (проба
Фелинга). Принцип метода. При каком заболевании фенилпировиноградная
кислота появляется в моче?
Примеры тестового контроля знаний „Крок 1”
1. Гликолиз – это анаэробный путь распада глюкозы, который происходит с
помощью ряда последовательных реакций. Назовите какую реакцию гликолиза
катализирует энзим фосфофруктокиназа?
А. Образование глюкозо-6-фосфата
В. Образование фруктозо-1-фосфата
С. Образование фруктозо-1,6-дифосфата
Д Образование диоксиацетонфосфата
Е. Образование 1,3-дифосфоглицерата
2. Укажите реакции гликолиза, которые протекают с затратой энергии в виде
АТФ:
A. Альдолазная, фосфофруктокиназная
B. Пируваткиназная, гексокиназная
C. Гексокиназная, фосфофруктокиназная
Д Фосфоглицераткиназная, гексокиназная
E. Пируваткиназная, фосфоглицеро-мутазная
3. Жиры являются необходимым энергетическим материалом для организма.
Какой основной путь превращения жирных кислот в митохондриях клетки?
А. Восстановление
В. Декарбоксилирование
С. β-окисление
Д. α-окисление
Е. γ-окисление
4. Жалобы и объективные данные позволяют допустить наличие у больного
воспалительного процесса в желчном пузыре, нарушение коллоидных свойств
желчи, вероятность образования желчных камней. Что может главным образом
повлечь их образование?
А. Ураты
В. Оксалаты
С. Хлориды
Д. Фосфаты
Е. Холестерин
131
5. У больного моча имеет специфический запах кленового сиропа. Какой
биохимический дефект является причиной этого заболевания?
А. Нарушение окислительного декарбоксилирования кетокислот с
разветвленной углеводородной цепью
В. Нарушение окислительного декарбоксилирования α-кетокислот
C. Нарушение декарбоксилирования глутаминовой кислоты
D. Снижение активности 5-окситриптофандекарбоксилазы
E. Снижение активности НАД-дегидрогеназы цитрата и декарбоксилазы
щавелевоянтарной кислоты
6. К какой из перечисленных порфирий можно отнести такие показатели:
детский возраст; увеличена селезенка; клиника гемолитической анемии, язвы,
рубцы, эритема кожных покровов, повышенная чувствительность к солнечному
облучению, лейкоцитоз; температура. Моча окрашена в красно-оранжевый цвет
за счет наличия уропорфирина І:
А. Уропорфирия (болезнь Гюнтера)
В. Печеночная порфирия
С. Еритропоетическая порфирия
D. Копропротопорфирия
Е. Гемоглобинурия
Примеры тестов и ситуационных задач
для усвоения практических навыков
1. С целью установления концентрации молочной кислоты в крови пользуются
методом, принцип которого заключается в:
А. Восстановлении солей тяжелых металлов в щелочной среде
В. Определении интенсивности окрашивания соединения, которое образовалось
при взаимодействии глюкозы из ортотолуидином
С. Действии фермента глюкозооксидазы, которая окисляет глюкозу до
глюконовой кислоты кислородом воздуха
D. Восстановлении двувалентных ионов меди до одновалентных
Е. Фотометрировании окрашенного комплекса, который образовался в процессе
взаимодействия с концентрированной сульфатной кислотой и гидрохиноном
2. При каких патологических состояниях количество молочной кислоты
увеличивается в крови?
А. Сахарном диабете
В. Анемии
С. Инфаркте миокарда
D. Гепатитах
Е. Епилепсии
3. Какая проба используется на выявление в моче ацетоацетата?
А. Проба Герхардта
132
В. Проба Барфуда
С. Проба Богомолова
Д. Проба Петтенкофера
Е. Проба Гмелина
4. Каким образом можно оценить активность липазы?
А. За способностью энзима гидролизовать пептидные связи
В. За количеством образованной пировиноградной кислоты
С. За образованием в результате гидролиза жирных кислот, количество которых
определяют титрованием в присутствии фенолфталеина
Д. За способностью ингибировать восстановление нитротетразолия синего в
присутствии НАДН
Е. За способностью обесцвечивать метиленовую синь при ее восстановлении
альдегидом
5. В больницу привезли двухлетнего ребенка. После употребления пищи у него
часто возникает блевота. Ребенок отстает в массе тела, физическом и
умственном развитии. Волосы темные, но есть седая прядь. Проба мочи после
добавления FeCl3 приобрела зеленый цвет. Результаты количественного
анализа мочи таковы: содержание фенилаланина – 7 ммоль/л при норме 0,01
ммоль/л; содержание фенилпирувата – 4,8 ммоль/л при норме 0 ммоль/л;
содержание фениллактата – 10,3 ммоль/л при норме 0 ммоль/л. О каком
нарушении метаболизма свидетельствуют полученные данные? Что можно
порекомендовать для нормализации метаболизма относительно лечебного
питания в этом случае?
6. У больного, который страдает еритропоетической порфирией, моча
приобрела розовую окраску. Появлением какого вещества в моче можно
объяснить изменение ее цвета?
А. Гемоглобина
В. Уропорфирина ІІ
С. Уропорфирина ІІІ
D. Копропорфирина ІІ
Е. Протопорфирина
Литература
Основная:
1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення // За
ред. проф. Склярова О.Я., Київ: Здоров’я, 2004. – 191 с.
2. Губський Ю.І.. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508
с.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига,
2001. – 744 с.
4. Практикум з біологічної хімії // За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2002.
– 298 с.
133
5. Ситуаційні задачі та тести з біологічної хімії (для студентів медичних вузів)
Під ред. акад. УАННП, д.м.н. О.Я.Склярова. – Львів, 1999. – 102 с.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
МОДУЛЬ 2. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ МОДУЛЯ 2
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ (СРС)
СМЫСЛОВОЙ МОДУЛЬ № 5. ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ.
БИОХИМИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОК.
ТЕМА № 1. ПРЕДМЕТ И ЗАДАНИЯ БИОХИМИИ. ЦЕЛЬ И МЕТОДЫ
ПРОВЕДЕНИЯ
БИОХИМИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ;
ИХ
ОБОСНОВАНИЕ И КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
СМЫСЛОВОЙ МОДУЛЬ № 6. ФЕРМЕНТЫ И КОФЕРМЕНТЫ.
РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА.
3
5
5
5
7
7
15
134
ТЕМА № 2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ
БЕЛКОВ-ФЕРМЕНТОВ.
ОВЛАДЕНИЕ
МЕТОДАМИ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.
ТЕМА № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ,
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ИХ ДЕЙСТВИЯ И КИНЕТИКИ
ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛІЗА.
ТЕМА № 4. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ
ПРОЦЕССОВ И АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ВОЗНИКНОВЕНИЯ
ЭНЗИМОПАТИЙ. МЕДИЦИНСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ.
ТЕМА № 5. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ КОФАКТОРОВ И
КОФЕРМЕНТНЫХ
ВИТАМИНОВ
В
КАТАЛИТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ.
СМЫСЛОВОЙ МОДУЛЬ № 7. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ
ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ. ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ.
ТЕМА № 6. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. ИССЛЕДОВАНИЯ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЦИКЛА ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ.
СМЫСЛОВОЙ МОДУЛЬ № 8. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ
БИОЭНЕРГЕТИКИ.
ТЕМА № 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО
ОКИСЛЕНИЯ, ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ И
СИНТЕЗА АТФ.
ТЕМА № 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ И
РАЗОБЩИТЕЛЕЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ.
ТЕМА № 9. ИТОГОВЫЙ КОНТРОЛЬ. МОДУЛЬ 2.
МОДУЛЬ
3.
МЕТАБОЛИЗМ
УГЛЕВОДОВ,
ЛИПИДОВ,
АМИНОКИСЛОТ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ
ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ МОДУЛЯ 3
ЗАВАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ (СРС)
СМЫСЛОВОЙ МОДУЛЬ 9. МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ И ЕГО
РЕГУЛЯЦИЯ
ТЕМА № 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛИКОЛИЗА – АНАЭРОБНОГО
ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ.
ТЕМА № 2. ИССЛЕДОВАНИЕ АЭРОБНОГО ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
И АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ПУТЕЙ ОБМЕНА МОНОСАХАРИДОВ.
ТЕМА № 3. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАБОЛИЗМА И БИОСИНТЕЗА
ГЛІКОГЕНА. РЕГУЛЯЦИЯ ОБМЕНА ГЛИКОГЕНА, БИОСИНТЕЗ
ГЛЮКОЗЫ – ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ.
ТЕМА № 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ И
ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ОБМЕНА УГЛЕВОДОВ. САХАРНЫЙ
ДИАБЕТ.
СМЫСЛОВОЙ МОДУЛЬ 10. МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ И ЕГО
РЕГУЛЯЦИЯ
ТЕМА № 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАБОЛИЗМА И БИОСИНТЕЗА
ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛОВ И ФОСФОЛИПИДОВ. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ
15
22
28
35
41
41
48
48
53
59
66
66
66
68
68
74
80
85
91
91
135
ЛИПОЛИЗ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЕГО РЕГУЛЯЦИИ.
ТЕМА № 6. -ОКИСЛЕНИЕ И БИОСИНТЕЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ.
ИССЛЕДОВАНИЕ ОБМЕНА ЖИРНЫХ КИСЛОТ И КЕТОНОВЫХ ТЕЛ.
ТЕМА № 7. БИОСИНТЕЗ И БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ХОЛЕСТЕРОЛА.
ПАТОЛОГИИ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА: СТЕАТОРЕЯ, АТЕРОСКЛЕРОЗ,
ОЖИРЕНИЕ.
ТРАНСПОРТНЫЕ
ФОРМЫ
ЛИПИДОВ
ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ.
СМЫСЛОВОЙ МОДУЛЬ 11. МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ.
ЭНЗИМОПАТИИ АМИНОКИСЛОТНОГО ОБМЕНА.
ТЕМА № 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕВРАЩЕНИЙ АМИНОКИСЛОТ
(ТРАНСАМИНИРОВАНИЕ,
ДЕЗАМИНИРОВАНИЕ,
ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ),
БИОСИНТЕЗА
ГЛУТАТИОНА
И
КРЕАТИНА.
ТЕМА № 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ДЕТОКСИКАЦИИ
АММИАКА И БИОСИНТЕЗА МОЧЕВИНЫ.
ТЕМА № 10. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
БИОСИНТЕЗА
ПОРФИРИНОВ
И
ИХ
НАКОПЛЕНИЕ
ПРИ
ПОРФИРИЯХ.
ТЕМА № 11. ИТОГОВЫЙ КОНТРОЛЬ. МОДУЛЬ 3.
СОДЕРЖАНИЕ
97
102
109
109
116
122
127
135
136