Рост Cladosporium resinae на минеральной среде с
реклама
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ На правах рукописи СМОЛЯНЮК Евгения Владимировна ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРОМИЦЕТОВ Специальность 03.02.12 – микология Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова доктор биологических наук, профессор Научный руководитель Камзолкина Ольга Владимировна доктор биологических наук Официальные оппоненты Бисько Нина Анатольевна доктор биологических наук Терехова Вера Александровна Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт экологии растений и животных УрО РАН, отдел экологии грибов. Защита диссертации состоится 13 декабря 2013 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет (аудитория 389). Тел./факс: (495) 939-39-70 С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «11» ноября 2013 года Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М. А. Гусаковская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Засоленные почвы – это почвы с повышенным (более 0,25%) содержанием легкорастворимых в воде минеральных солей. Площадь засоленных почв в мире составляет около 950 млн. га, в Европе – 50,8 млн. га, в РФ площадь засоленных почв составляет 52,3 млн. га или 2,4% всех почв Россия (Новикова, 2004). Исследования разнообразия микромицетов засоленных местообитаний и их адаптации к подобным условиям среды активно проводят в последнее десятилетие. Изучение их биологии расширяет наши представления об адаптивном потенциале эукариот к стрессовым условиям среды обитания. В последнее время всесторонне изучают галофильные представители сообществ засоленных почв (Gunde-Cimerman et al., 2009). Анализ разнообразия микромицетов засоленных почв и выявление адаптивных реакций на солевой стресс (поддержание ионного гомеостаза, накопление осмолитов и др.) проводят функциональности мембран, на дрожжеподобных темноокрашенных микромицетах Hortaea werneckii (Horta) Nishim. & Miyaji, Trimmatostroma salinum Zalar, Hoog de, Gunde-Cim. и видах рода Wallemia (Kogej et al., 2004, 2006; Kuncic et al., 2010; Petrovic et al., 2002, 2006; Turk, 2004). Для биотехнологии представляют интерес осмолиты, экзополисахариды и ферменты галофилов и галотолерантов в качестве осмопротекторов и стабилизаторов структуры клетки (Margesin, Schinner, 2001). Микромицеты, изолированные из местообитаний с высокими концентрациями соли, представляют интерес и как доноры генов для сельскохозяйственных растений в связи с необходимостью освоения засоленных почв (Gunde-Cimerman et al., 2009). Исследование реакций галотолерантных мицелиальных микромицетов на присутствие высоких концентраций хлористого натрия в среде культивирования ранее не проводили. Сведения об изменении структуры клеток мицелия микромицетов в подобных условиях роста фрагментарны и не связаны с изучением физиологических и биохимических параметров клетки. Целью нашей работы было изучение галотолерантных микромицетов природных гиперсоленых почв и реакций на солевой стресс на примере солеустойчивых мицелиальных изолятов. Задачи: 1. Охарактеризовать таксономическую структуру комплекса культивируемых галотолерантных грибов засоленных почв побережья Черного и Мертвого морей, а 1 также озера Баскунчак c использованием морфолого-культуральных и молекулярных методов. 2. Исследовать влияние различных концентраций хлористого натрия при добавлении в агаризованную питательную среду на культуральные и морфологические признаки изолятов микромицетов. 3. Провести сравнительное исследование особенностей цитологии представителей галотолерантных микромицетов в условиях различной солености питательной среды. 4. Изучить влияние хлористого натрия в среде культивирования на ультраструктуру клеток галотолерантных микромицетов. 5. Исследовать влияние солености среды на состав мембранных липидов и углеводов цитозоля у галотолерантного вида Fusarium incarnatum. Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование цитологии, физиологии и биохимии культивируемых галотолерантных микромицетов засоленных почв. Получены новые данные об участии клеточных органелл и запасных включений в реакции на солевой стресс методами световой и электронной микроскопии. Впервые в клетках грибов выявлены ацидокальцисомоподобные вакуоли, описаны реакции системы эндомембран и общего цитоплазматического волютина на присутствие хлористого натрия в среде культивирования. Показана осмопротекторная роль арабита в условиях солевого стресса в клетках галотолерантного микромицета Fusarium incarnatum. Практическая значимость. Создана коллекция галотолерантных микроскопических грибов. На базе коллекции возможен поиск продуцентов ферментов, осмопротекторов и др. биомолекул, представляющих интерес для биотехнологии. Коллекция культур включает галотолерантный микромицет Fusarium incarnatum, накапливающий более 20% триацилглицеридов от сухого веса мицелия. Выявленные особенности структуры галотолерантных микромицетов могут быть использованы при чтении курса лекций по цитологии грибов, а обнаруженные изменения состава мембран и углеводов – в курсе биохимии и физиологии грибов. Полученные в ходе проведения данной работы нуклеотидные последовательности двух исследуемых штаммов были размещены в Европейском архиве ДНК (European Nucleotide Archive) под следующими номерами: БМ42 Fusarium incarnatum: номер последовательности HF558297; ММ 1 Chaetomium sp.: номер последовательности HF558296. Апробация работы. Результаты работы были доложены на IV Международной конференции молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Адаптация. Эволюция» 2 (Одесса, Украина, 2009); Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010); на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011); на заседании кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова в 2013 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, экспериментальной части, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Экспериментальная часть включает в себя описание материалов, методов и результатов работы (в пяти главах). Работа изложена на 147 страницах, содержит 9 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 165 источников, из них 143 на английском языке. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы В данной главе приведены литературные сведения, характеризующие засоленные местообитания. Представлен анализ сообщества микромицетов засоленных почв. Приведены сведения об адаптациях микромицетов к солевому стрессу на уровне морфологии, физиологии, биохимии и сигнальных системах грибов, реагирующих на высокие концентрации соли. Глава 2. Материалы и методы исследования Материалы. Материалами для исследования были образцы почв отобранные на побережьях Черного и Мертвого морей и озера Баскунчак. В каждой точке отбирали по 6 образцов на расстоянии 10 м друг от друга. Соленость прибрежных почв Черного моря в районе г. Поморие (Болгария) доходит до 5,5%, при этом концентрация NaCl в почве составляет до 0,6%. Соленость почв Мертвого моря (г. Эйн Бокек, Израиль) доходит до 17%, концентрация NaCl составляет более 1% (Dan et al., 1976). Побережье озера Баскунчак (Астраханская область, РФ) сложено соровыми солончаками, соленость которых около 30%, концентрация NaCl более 27%. Значения рН изученных почв нейтральные или слабощелочные. Изоляция микромицетов. Для выделения и культивирования микромицетов почвенные образцы высевали из разведений (1:10, 1:100, 1:1000) в трех повторностях на мальт-агар (МА) с добавлением NaCl: 10%, 15% и 20% (рН 7,0), что позволило выделить специфический комплекс галотолерантных микромицетов, способных к росту в широком диапазоне солености. При выделении грибов из образцов почв во все среды добавляли рифампицин (2 г/л). Чашки Петри инкубировали при температуре t = 29 ± 1°С в течение месяца. Температура культивирования была выбрана на основании данных о средне3 летних температурах в регионах отбора почвенных проб. Учет выросших колоний, изоляцию на пробирки с МА и посев на диагностические среды для идентификации проводили последовательно в течение 2 недель инкубации посевов. Изолированные культуры хранили на скошенном МА при t = 4° С. Идентификация микромицетов. Идентификацию проводили по морфологокультуральным признакам с использованием отечественных и зарубежных определителей (Raper, Fennell, 1965; Raper et al., 1968; Gams, 1971; Ellis, 1971; Кириленко 1978; Kohlmeyer, Kohlmeyer, 1979; Domsch et al., 1980, 2007; Stolk, Samson, 1983; Hoog et al., 2000; Crous et al., 2007; Samson, Varga, 2007; Bensch et al.,2010). Для молекулярной идентификации не образующих споры изолятов M. sterilia (штамм БМ42) и M. sterilia (штамм ММ1) анализировали нуклеотидные последовательности регионов ITS1-5.8S-ITS2 рДНК (Качалкин, 2010). Тест на галотолерантность и ксеротолерантность. При проведении теста на галотолерантность микромицеты высевали на МА и МА с добавлением 5, 10 и 15% NaCl. Изоляты высевали в центр чашки Петри и культивировали в течение 14 дней при t = 29 ± 1°С. Высевы проводили в трех повторностях. Радиус колонии измеряли каждые третьи сутки на протяжении всего периода культивирования и анализировали полученные результаты с помощью диаграмм скорости роста (мм/сут), построенных в программе Microsoft Office Excel 2003. Для оценки устойчивости галотолерантных микромицетов к условиям низкой активности воды был проведен тест на ксеротолерантность. Микромицеты высевали на МА с добавлением глицерина (18,7%, 44,0%, 59,3%) для достижения соответствующих значений активности воды (aw = 0,95; 0,85; 0,75). Культивирование мицелия грибов. Для дальнейшего исследования методами световой и электронной микроскопии, а также анализа углеводов цитозоля и липидов мицелий микромицетов выращивали на чашках Петри с МА и МА с добавлением 10% NaCl в течение 7-и или 14-ти дней при температуре 29 ± 1º С. Изучение реакций клеточных органелл на присутствие 10% NaCl в среде культивирования методами световой микроскопии. Вакуолярная система. Образец с поверхностно растущим мицелием, взятым из зоны роста (5 мм), помещали на предметное стекло и проводили окрашивание витальным красителем нейтральным красным в концентрации 0,1 мг/л, накапливающимся в вакуолях живых клеток в основном в виде гранул (Барыкина и др., 2000). Для просмотра препаратов использовали микроскоп Axioskop 40 FL (увеличение объектива х100). Наблюдение проводили в 10-ти полях зрения. Фотографировали с помощью камеры AxioCam MRc. Цифровые снимки обрабатывали с помощью программы Adobe Photoshop CS. 4 Для определения средних размеров вакуолей, а также отклонения от среднего, достоверной принимали выборку 20-ти вакуолей. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Office Excel 2003. Размеры вакуолей измеряли в программе для морфометрии Image J. Для определения количества вакуолей в клетках просматривали 20 клеток. Суммарный объем вакуолей в клетках рассчитывали по формуле: V = 4/3*π*R3*n, где R – средний диаметр вакуолей, разделенный на 2, а n – среднее количество вакуолей в клетках данного объекта. Волютин. Образец с мицелием помещали на предметное стекло, фиксировали в растворе Карнуа в течение 10 минут, окрашивали в 1% водном растворе метиленового синего 15 минут и наносили 1% раствор H2SO4 на 1 – 2 минуты. Проводили учет волютиновых гранул в общей массе мицелия на 100 мкм длины гифы. Достоверной принимали выборку из 20-ти клеток. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Office Excel 2003. Олеосомы. интерференционного Исследование контраста с проводили использованием методом дифференциально- микроскопа Biolar (Польша). Наблюдали интактные клетки мицелия с липидными включениями (олеосомы). Проводили анализ 14-ти суточного мицелия микромицетов из зоны роста. Учет олеосом проводили в 10-ти полях зрения на 150 мкм длины гифы. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Office Excel 2003. Изучение реакций клеточных органелл на присутствие 10% NaCl в среде культивирования методами электронной микроскопии. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Для исследования методом ТЭМ образцы поверхностно растущего мицелия фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида (“Merck”) на 0,1 М Na-фосфатном буфере (pH 7,2) 1 час (на льду, при температуре 0°С). Образцы отмывали в буфере (3 смены по 5 - 10 мин.) и проводили постфиксацию в 1% растворе OsO4 (1 час при комнатной температуре). Материал промывали в буфере, обезвоживали в восходящей серии этилового спирта (30 %, 50 %, 70 %, 96%; по 10 мин в каждой), а затем в ацетоне (2 смены по 30 мин) и заключали в смолу Epon 812 (“Ferak”). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-8800, окрашивали водным раствором уранил-ацетата (60 мин.) с последующим докрашиванием по методу Рейнольдса (Reynolds, 1963) и исследовали с помощью микроскопа “Jeol” (JEM-100B). На 1 образец проводили анализ 2-3-х сеток со срезами. Анализ элементного состава компартментов клеток Fusarium incarnatum и Aspergillus repens методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДС). Материал готовили, как было описано выше для ТЭМ. Ультратонкие срезы помещали на 5 лавсановые сетки, окрашивание сеток не проводили. Срезы клеток мицелия грибов исследовали с помощью микроскопа JEM-2100. На 1 образец проводили анализ 2-3-х сеток со срезами. Анализ образцов методом ЭДС выполняли в режиме СТЭМ (сканирующая трансмиссионная электронная микроскопия). Полученные ЭДС-спектры анализировали с помощью программного обеспечения для обработки спектров ЭДС. В автоматическом режиме обработки спектров проводили автораспознавание пиков элементов в спектре и их идентификацию. Экстракция липидов из мицелия F. incarnatum и определение состава нейтральных липидов. Мицелий F. incarnatum культивировали стандартным методом на бессолевой (МА) и соленой (МА + 10% NaCl) среде. Биомассу собирали с поверхности агаризованной среды с помощью скальпеля, промывали дистиллированной водой, просушивали фильтровальной бумагой и хранили при t = -70 ºС. Экстракцию липидов из биомассы гриба проводили методом Николса (Nichols, 1963). Для разделения фосфолипидов (ФЛ) и гликолипидов (ГЛ) использовали системы Бенинга (Bening) для двумерной ТСХ. На пластинку наносили 100-200 мкг липидов. В первом направлении была использована система I, содержащая хлороформ, метанол и воду в соотношении 65:25:4, а во втором - система II, содержащая хлороформ, ацетон, метанол, уксусную кислоту и воду в соотношении 50 : 20 : 10 : 10 : 5. Хроматограммы опрыскивали 5% серной кислотой в этаноле с последующим нагреванием при t = 180º С до проявления пятен. Для идентификации ФЛ использовали индивидуальные метчики и качественные реакции с нингидрином (на наличие аминогруппы), реактивом Драгендорфа (на холин содержащие ФЛ) и α-нафтолом (на гликолипиды). Для установления сфинголипидной природы гликолипидов использовали метод омыления. Нейтральные липиды идентифицировали с помощью индивидуальных метчиков: моно-, ди- и триацилглицеринов, свободных жирных кислот, стеринов (эргостерина), углеводородов («Sigma», США). Количественный анализ липидов проводили с использованием компьютерной программы Dens («Ленхром», Россия) в режиме прямой аппроксимации по калибровочным кривым на основе стандартных растворов фосфатидилхолина («Sigma», США), гликоцерамидов («Larodan», Швеция), эргостерина («Sigma», США) и триацилглицеринов («Larodan», Швеция). Анализ жирнокислотного состава основных фосфолипидов мембран мицелия Fusarium incarnatum. Для анализа жирнокислотного состава отдельные фосфолипиды выделяли хроматографически с двух пластинок, элюировали в течение ночи в смеси 6 хлороформ : метанол (1:1). Супернатант декантировали, выпаривали, добавляли 1 мл толуола и 2 мл 2,5% H2SO4 и выдерживали в течение 2 ч при t = 70 °С. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном, сушили и анализировали на газожидкостном хроматографе Кристалл 5000.1 (ЗАО «Хроматек», Россия) на капиллярной колонке Optima-240-0.25 мкм 60м 0,25 мм («Macherey-Nagel GmbH&Co», Германия). Для хроматографирования применяли температурную программу от t = 130 ºС до t = 240 ºС. Идентификацию проводили с использованием смеси метчиков индивидуальных метиловых эфиров жирных кислот Supelco 37 Component FAME Mix (США). Анализ основных растворимых углеводов цитозоля клеток мицелия F. incarnatum. Для определения углеводного состава мицелия экстракцию сахаров проводили кипящей водой в течение 20 мин четырехкратно. Из полученного экстракта удаляли белки (Somogui, 1945). Дальнейшую очистку экстракта углеводов от заряженных соединений проводили, используя комбинированную колонку с ионообменными смолами Dowex-1 (ацетатная форма) и Dowex 50W (H+). Состав углеводов определяли методом газожидкостной хроматографии, получая из лиофильно высушенного экстракта триметилсилильные производные сахаров (Бробст, 1975). В качестве внутреннего стандарта использовали -метил-D-маннозид («Merck», США). Хроматографирование проводили на газожидкостном хроматографе Кристалл 5000.1 (ЗАО «Хроматек», Россия) на капиллярной колонке ZB-5 30 м, 0,32 мм, 0,25 мкм («Phenomenex», США) с применением температурной программы от t = 130 ºС до t = 270 ºС со скоростью 5-6 град/мин. В качестве метчиков использовали глицерин, глюкозу, маннит, арабит, инозит, трегалозу («Sigma» США). Глава 3. Результаты и обсуждение Таксономическое разнообразие культивируемых микромицетов из мест природного засоления. В данном разделе охарактеризован видовой состав микромицетов из гиперсоленых местообитаний, способных к росту на питательных средах, содержащих 10 – 20% хлористого натрия. Наибольшее разнообразие микромицетов, культивируемых на среде, содержащей 10 - 20% NaCl, было отмечено в почвах побережья Черного моря: 15 видов микромицетов, относящихся к 11 родам (Acremonium sp., Aspergillus halophilicus M. Chr., Papav. et C.R. Benj, A. repens (Corda) Sacc, Camarosporium obiones Jaap, Cladosporium halotolerans Zalar, Hoog de, Gunde-Cim, C. salinae Zalar, Hoog de, Gunde-Cim., F. incarnatum Subraman. & Rao, Monodictys levis (Wiltshire) S. Hughes, M. paradoxa (Corda) S. Hughes, Paecilomyces sp., Penicillium cyclopium Westling, P. thomii Maire, Phaeotheca triangularis Hoog de et Beguin, 7 Scolecobasidium salinum (G.K. Sutherl.). M.B. Ellis, Trimmatostroma salinum Zalar, Hoog de et Gunde-Cim.), а также представители группы M. sterilia. Из почв побережья Мертвого моря выделено 7 видов микромицетов, относящихся к 5 родам (Acremonium sp., Arachniotus aurantiacus (Kamyschko) Arx, Aspergillus repens (Corda) Sacc., Chaetomium sp., Penicillium brevicompactum Dierckx, P. chrysogenum Thom, P. citrinum Thom), а также представители группы M. sterilia; из почв побережья озера Баскунчак выделено 14 видов, относящихся к 3 родам (Aspergillus repens (Corda) Sacc., Aspergillus sp. 1, Aspergillus sp. 2, Penicillium chrysogenum Thom, P. citrinum Thom, P. decumbens Thom, P. dierckxii Biourge, P. lanosum Westling, P. miczynskii K.M. Zalessky, P. oxalicum Currie et Thom, P. rugulosum Thom, Penicillium sp., P. variabile Sopp, Ulocladium sp.). а б в Рис. 1. Пространственная частота встречаемости видов микромицетов, выделенных из почвенных образцов с побережья : а) Черного моря, б) Мертвого моря, в) озера Баскунчак. Таким образом, разнообразие родов культивируемых микромицетов, способных к росту в широком диапазоне солености, сокращается при повышении солености почв в местах отбора образцов. Наибольшая пространственная частота встречаемости отмечена 8 для родов Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, а также представителей группы M. sterilia (рис. 1). Aspergillus repens изолирован из почв побережья Черного и Мертвого морей, а также из побережья озера Баскунчак. Представители группы M. sterilia не выделены из почв побережья озера Баскунчак, характеризующихся максимальной соленостью среди изученных почвенных образцов. Исследователи засоленных почв, а также прочих местообитаний с низкой доступностью воды, отмечают сходный родовой состав изолируемых микромицетов (Abdel-Fattah et al., 1977; Abdel-Hafez 1982; Wollenzien et al. 1995; de Hoog et al., 1997; Zalar et al., 1999; Gunde-Cimerman et al. 2000; Petrovic et al,. 2000; Gunde-Cimerman et al. 2004; Butinar et al., 2005; Selbmann et al., 2005; Zalar et al., 2007). Физиология и морфология изолятов из мест природного засоления. Для физиолого-морфологического исследования были отобраны 16 изолятов на основании высоких показателей пространственной частоты встречаемости: 1) из почв Черноморского побережья Болгарии было отобраны восемь видов грибов: Camarosporium obiones, Cladosporium halotolerans, Fusarium incarnatum, Monodictys levis, M. paradoxa, Penicillium cyclopium, P. thomii, Scolecobasidium salinum; 2) из прибрежных почв Мертвого моря было отобрано шесть видов: Aspergillus repens, Arachniotus aurantiacus, Chaetomium sp., Penicillium brevicompactum, P. citrinum, P. chrysogenum; 3) из прибрежных почв озера Баскунчак отобраны два вида: P. dierсkxii и P. rugulosum. Исследовали активность роста на МА с добавлением 5%, 10%, 15% NaCl по сравнению с ростом на МА. Рис. 2. Скорость роста микромицетов при культивировании на МА и МА с NaCl. 9 Степень выраженности галотолерантных свойств у представителей выделенного сообщества микромицетов засоленных почв оценивали по скорости роста на МА + 5% и 15% NaCl по сравнению с МА. Было показано, что 70% всех исследованных изолятов способны к росту на среде с 15% NaCl (кроме Arachniotus aurantiacus, Chaetomium sp., Monodictys levis и Scolecobasidium salinum) (рис. 2). Две трети из всех исследованных изолятов (исключая Arachniotus aurantiacus, Monodictys levis, Penicillium thomii, P. dierckxii и Scolecobasidium salinum) демонстрируют более активный рост на среде с добавлением 5% NaCl по сравнению с МА (рис. 2). Анализ активности роста микромицетов на питательной среде с разными концентрациями хлористого натрия показал, что комплекс галотолерантных микромицетов, изолированных из засоленных почв, неоднороден. На основании результатов теста на галотолерантность исследуемые микромицеты были разделены на две группы: 1. Слабые галотолеранты, характеризующиеся следующими культуральными особенностями: а) рост на МА + 15% NaCI отсутствует или слабее, чем на МА; б) рост на МА + 5% NaCl такой же или активнее, чем на МА. 2. Группа сильных галотолерантов характеризуется тем, что скорость роста на МА + 15% NaCl больше скорости роста на МА. К группе сильных галотолерантов был отнесен один вид – A. repens. Проверка ксеротолерантных свойств изолятов на МА с добавлением разных концентраций глицерина, создающих условия низкой активности воды (aw = 0,95; 0,85; 0,75), показала отсутствие активного роста для всех изученных микромицетов. Таким образом, выделенный комплекс микромицетов обладает галотолерантными свойствами и может быть использован для изучения адаптивных реакций к солевому стрессу. В дальнейшие исследования морфологии и цитологии мицелия галотолерантных микромицетов были включены представители из группы слабых галотолерантов: Chaetomium sp., C. obiones, F. incarnatum., M. paradoxa, P. dierckxii и сильный галотолерант A. repens. Изменение интенсивности пигментации (ослабление или усиление) колоний микромицетов в зависимости от присутствия разных концентраций хлористого натрия в среде культивирования является видоспецифичным и не зависит от степени галотолерантности микромицета (рис. 3). Уменьшение степени развития надсубстратного мицелия вплоть до полной редукции при культивировании на соленых питательных средах по сравнению с МА было характерно для группы слабых галотолерантов (рис. 3). 10 Морфология колоний представителей рода Penicillium при культивировании на соленых средах практически не изменяется (за исключением P. thomii, для которого отмечено прекращение образования склероциев на соленых питательных средах). а б г в д е Рис. 3. Морфология колоний грибов при росте на средах различной солености (14-е сутки роста): а) P. dierckxii, б) Chaetomium sp., в) F. incarnatum, г) C. obiones, д) M. paradoxa, е) A. repens. Цитология галотолерантных микромицетов при культивировании в присутствии хлористого натрия и без него. В данном разделе представлены результаты сравнительного исследования изменения/постоянства структуры различных компартментов клеток при культивировании с добавлением NaCl и без него. На МА у микромицетов хорошо выражена однослойная клеточная стенка, имеющая зернистую или гомогенную структуру средней электронной плотности, толщиной 120 ± 25 нм для A. repens, 110 ± 30 нм для Chaetomium sp. и 165 ± 35 нм для P. dierckxii (рис. 4 а – г). Солевой стресс вызывает недостоверное утолщение клеточных покровов у клеток слабых галотолерантов Chaetomium sp., P. dierckxii и сильного галотолеранта A. repens (рис. 4 а – г). Для A. repens толщина клеточной стенки составляет 160 ± 30 нм, для Chaetomium sp. - 135 ± 30 нм, для P. dierckxii толщина клеточной стенки составляет 190 ± 40 нм. 11 0,2 мкм КС КС Вак ВВ а 0,2 мкм б Инв КС Экз КС в г Рис. 4. Клеточные покровы микромицетов, при культивировании на бессолевой и соленой питательной среде: а – A. repens (МА), б – A. repens (МА + 10% NaCl), в – P. dierckxii (МА), г – P. dierckxii (МА + 10% NaCl). Обозначения: ВАК – вакуоль, ВВ – вакуолярный волютин, Инв - инвагинация, КС – клеточная стенка, Экз – экзосома. Увеличение толщины клеточной стенки по нашим наблюдениям связано с разными процессами. У клеток сильного галотолеранта A. repens при культивировании на соленой питательной среде наблюдали образование многослойных клеточных стенок, что может быть связано с активным синтезом дополнительного материала. У слабых галотолерантов P. dierckxii и F. incarnatum при культивировании в присутствии хлористого натрия происходит расслоение и разрыхление клеточной стенки, вероятно, свидетельствующее о нарушении синтеза и/или сборки внутреннего слоя клеточной стенки. В некоторых клетках мицелия наблюдали плазмолиз. При культивировании микромицетов на соленых питательных средах в клетках мицелия происходит увеличение количества мелких митохондрий. Митохондрии в апикальных и субапикальных клетках мицелия, растущего на МА, в основном палочковидные (длинные и короткие), хотя встречаются и шаровидные (рис. 5). При росте на соленой среде наблюдается множество шаровидных митохондрий, либо диффузное окрашивание. Сходная реакция хондриома на солевой стресс была описана у галоалкалофильного микромицета Sodiomyces alkalinum (Козлова, 2006). При инкубации клеток в растворе питательной среды с добавлением хлористого натрия Козлова М.В. наблюдала последовательные стадии фрагментации образованием шаровидных митохондрий (Козлова, 2006). 12 нитевидных митохондрий с 10 мкм 10 мкм а б в г Рис. 5. Митохондрии в клетках Chaetomium sp.: прижизненное окрашивание родамином 6Ж при культивировании на МА (а) и МА + 10% NaCl (б); схемы расположения митохондрий в клетках, выращенных на МА (в) и МА + 10% NaCl (г). Изучение реакции вакуолярной системы клеток галотолерантных микромицетов на солевой стресс показало увеличение общего объема вакуолей в клетках микромицетов в присутствии NaCl в среде культивирования в обеих фазах роста (рис. 6). Подобная реакция отмечена ранее в клетках морского гриба Dendryphiella salina (Clipson et al., 1989) и галофильных видов рода Wallemia (Kuncic et al., 2010). Однако, в клетках всех исследованных нами галотолерантных микромицетов при культивировании в условиях повышенной солености среды увеличение общего объема вакуолей происходит за счет увеличения размеров вакуолей, а не за счет увеличения их количества, как это показано для галофильных микромицетов (Kuncic et al., 2010). Рис. 6. Суммарный объем вакуолей (мкм3) в клетках микромицетов при культивировании на МА и МА с добавлением 10% NaCl на 7-е и 14-е сутки роста (учет на 100 мкм длины гифы). 13 Кроме того, в клетках микромицетов обеих физиологических групп отмечено сокращение количества вакуолей с включениями волютина при культивировании на соленой питательной среде (рис. 7, 8). Эти данные подтверждаются как методами световой, как и трансмиссионной электронной микроскопии. Отмеченные в вакуолях микромицетов электронно-плотные включения содержат, предположительно, полифосфаты (рис. 7). При культивировании на соленой среде количество электронноплотных включений в вакуолях значительно сокращается. (рис. 7, 8). КС ВВ Мтх ВВ Мтх КС Вак Вак ВВ Ол МВТ Вак Мтх Вак Вак ВВ ВВ Вак Ол Ол а 0,2 мкм Вак б Рис. 7. Вакуоли в клетках мицелия A. repens при культивировании на МА (а) и МА + 10% NaCl (б). Рис. 8. Количество гранул вакуолярного волютина в клетках микромицетов при культивировании на МА и МА с добавлением 10% NaCl на 7-е и 14-е сутки роста (учет на 100 мкм длины гифы). Методом ЭДС впервые было показано присутствие фосфора и кальция в вакуолях микромицетов (рис. 9). Специфические вакуоли, содержащие в себе комплексы фосфатов и кальция, называют ацидокальцисомами. Ацидокальцисомы описаны у многих паразитических простейших (рода Leishmania, Toxoplasma, Trypanososma), водорослей, 14 миксомицетов (Moreno, Docampo, 2003; Miranda, 2004, Docampo et al., 2005, Docampo et al., 2011, Rohloff, 2011). Для клеток бактерий показано, что гранулы цитоплазматического волютина могут выполнять функции ацидокальцисом (Moreno, Docampo, 2003). У грибов эти органеллы ранее не были описаны. а б Рис. 9. ЭДС-спектр вакуолей в клетках F. incarnatum, выращенного на МА (а) и участок клетки, анализируемый энергодисперсионным методом (б). Роль ацидокальцисом в реакции на осмотический шок показана на клетках простейших. Эти органеллы участвуют в процессах осморегуляции, позволяя клеткам организма выжить в гиперсоленых условиях. Гидролиз ацидокальцисомальных полифосфатов приводит к накачиванию воды в вакуоли и нормализации осмотического давления (Furgey le et al., 2001; Ruiz et al, 2001; Docampo et al., 2010). При исследовании клеток галотолерантов методом ТЭМ наблюдали увеличение количества везикул эндо-/экзосомального компартмента и мультивезикулярных тел при культивировании на соленой питательной среде по сравнению с контролем (рис. 10). Данные изменения свидетельствует об интенсификации процессов эндо-/экзоцитоза в клетках микромицетов в условиях стресса. 0,2 мкм Вез КС КС ЭР Вез Вак Вак а б Рис. 10. Везикулы эндо-/экзоцитозного компартмента в клетках мицелия микромицетов при культивировании на бессолевой и соленой питательной среде: а – F. incarnatum (МА), б – F. incarnatum (МА + 10% NaCl). Обозначения: Вак – вакуоль, Вез– везикулы эндо-/экзоцитозного компартмента, эндоплазматический ретикулум. 15 КС – клеточная стенка, ЭР – Исследование влияния хлористого натрия в среде культивирования на накопление/расходование цитоплазматического волютина в клетках галотолерантных микромицетов выявило различие между физиологическими группами. Для сильного галотолеранта A. repens показано уменьшение количества волютиновых гранул (рис. 11), что может быть связано с их мобилизацией в качестве дополнительного источника энергии в стрессовых условиях. В клетках слабых галотолерантов общий волютин накапливается в присутствии хлористого натрия в среде культивирования по сравнению с МА (рис. 11). Рис. 11. Количество гранул волютина в клетках мицелия микромицетов (на 7-е и 14-е сутки роста) при культивировании на МА и МА с добавлением 10% NaCl (учет на 100 мкм длины гифы). Рис. 12. Количество олеосом на 150 мкм длины гифы микромицетов при культивировании на бессолевой и соленой питательной среде (14-е сутки роста). 16 Накопление олеосом в клетках галотолерантных микромицетов при культивировании на питательной среде с хлористым натрием было характерно для большинства изученных нами штаммов, за исключением Aspergillus repens и Fusarium incarnatum (рис. 12). В клетках мицелия F. incarnatum накапливается значительное количество липидных включений при культивировании на МА. В присутствии соли происходит снижение числа олеосом почти в два раза. Математический анализ культуральных и цитологических данных. На основании 4-х культуральных признаков: скорость роста на МА и МА с добавлением 5% и 15% NaCl, изменения пигментации и степени развития надсубстратного мицелия при культивировании микромицетов на среде с различным содержанием соли; а также 10-ти цитологических признаков, описывающих реакции общего волютина, вакуолей (количества и размеров), вакуолярного волютина в обеих фазах роста, хондриома и олеосом на культивирование в присутствии NaCl, был проведен кластерный анализ (рис. 13). На кладограмме можно видеть обособление двух кластеров, что подтверждает правомерность выделения двух физиологических групп галотолерантных микромицетов. Рис. 13. Кладограмма, отражающая распределение галотолерантных микромицетов по устойчивости к присутствию NaCl в среде культивирования, построенная на основании сравнения морфолого-цитологических и культуральных признаков. Биохимический анализ мицелия Fusarium incarnatum. Для штамма F. incarnatum был проведен анализ основных растворимых углеводов цитозоля. Было установлено, что в отличие от дрожжей, в клетках которых основным запасным углеводом 17 является глицерин (Magan, 2007), у мицелиальных грибов осмопротекторную роль выполняет арабит. Доля углеводов в сухой биомассе Fusarium incarnatum значительно возрастает при культивировании на соленой питательной среде (рис. 14). При этом доля арабита возрастает в гиперсоленых условиях с 6% до 50%. Рис. 14. Влияние NaCl в среде культивирования на соотношение основных углеводов цитозоля (в % от Σ сухой биомассы). Кроме того, для F. incarnatum были исследованы механизмы поддержания функциональности мембран. Показано, что при культивировании на соленой питательной среде происходит уменьшение доли стеринов в мембранах клеток Fusarium incarnatum как в стационарной, так и в логарифмической фазе роста, а также возрастает доля фосфатидных кислот, являющихся вторичными мессенджерами стресса (Алехина и др., 2005) и играющих роль в процессах экзо- и эндоцитоза. Кроме того, для исследования степени ненасыщенности жирных кислот были препаративно выделены основные фосфолипиды и исследован их жирнокислотный состав. Показано, что в стационарной фазе увеличивается степень ненасыщенности жирных кислот во всех изученных фосфолипидах. 18 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Впервые проведенное комплексное исследование галотолерантных микромицетов продемонстрировало сравнительно невысокое видовое разнообразие культивируемых мицелиальных микроскопических грибов в засоленных почвах побережий Черного и Мертвого морей и озера Баскунчак. Разнообразие родов галотолерантных микромицетов значительно сокращается с повышением солености почв. Состав выделенного комплекса микромицетов оказался сходным по составу с сообществами местообитаний, характеризующихся ионным и осмотическим стрессом, связанным с низкой доступностью воды (засоленные, аридные и мерзлотные почвы, скалы, ледники). Галотолерантные микромицеты по степени устойчивости к хлористому натрию были разделены на две физиологические группы. Выделение двух физиологических групп было подтверждено исследованиями цитологии клеток микромицетов. Выявлены реакции на солевой стресс, специфические для каждой физиологической группы микромицетов, а также отмечены общие реакции для всех изученных изолятов. К общим реакциям на солевой стресс можно отнести фрагментацию митохондрий и уплотнение их матрикса, увеличение количества везикул эндо-/экзоцитозного пути, увеличение толщины клеточной стенки, увеличение общего вакуолярного объема и уменьшение количества вакуолярного волютина в клетках, выращенных на соленой питательной среде по сравнению с контролем. Специфическом для каждой физиологической группы реакцией на солевой стресс было изменение количества общего волютина в клетках. В мицелии слабых галотолерантов при культивировании в условиях повышенной солености происходит накопление гранул общего волютина. В мицелии более устойчивого к хлористому натрию галотолеранта A. repens отмечено снижение числа гранул общего волютина. Основным компонентом волютина являются полифосфаты, которые выполняют множество функций в клетке, среди которых: снабжение внутриклеточных процессов энергией и связывание излишка ионов натрия в клетках (гомеостатирование цитоплазмы). В условиях повышенной солености среды происходят адаптивные перестройки мембран, обеспечивающие их стабильность. Под действием солевого стресса увеличивается соотношение фосфолипиды/стерины, возрастает степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов (показано на примере F. incarnatum). Также отмечено увеличение содержания фосфатидных кислот, являющихся вторичными мессенджерами, передающими сигналы стресса и играющими роль в процессах эндо-/экзоцитоза. Увеличение количества везикул эндо-/экзоцитозного пути галотолерантных микромицетов под действием солевого стресса. 19 отмечено в клетках Анализ основных культивировании на растворимых соленой углеводов питательной цитозоля среде в показал, клетках что при мицелиального галотолерантного гриба F. incarnatum происходит накопление запасных углеводов, а также смена основного запасного углевода с маннита на арабит в отличие от накопления глицерина у дрожжеподобных темноокрашенных галофильных грибов. Проведенное исследование реакций галотолерантных мицелиальных грибов на солевой стресс позволило дополнить общую картину механизмов защиты эукариот от воздействия солевого стресса на клеточном уровне. Выявлен новый и неизвестный ранее для грибов фактор защиты клеток мицелиальных грибов от солевого стресса цитоплазматический волютин. Протекторная роль волютина в реакции на солевой стресс прежде была показана для бактерий. С простейшими животными в ответной реакции на солевой стресс галотолерантные грибы сближает возможность инактивации избытков ионов натрия и хлора при солевом стрессе с участием вакуолей-ацидокальцисом. Участие ацидокальцисомоподобных вакуолей клеток грибов в реакциях на солевой стресс показано впервые. Выводы 1. Охарактеризован видовой состав галотолерантных микромицетов в засоленных почвах побережий Черного и Мертвого морей и оз. Баскунчак, изолированных на среды с концентрациями хлористого натрия 10 – 20%. Выявлено 29 анаморфных, 8 телеоморфных культивируемых видов аскомицетов и 11 морфотипов. 2. На основании культуральных и цитологических признаков выделены две группы галотолерантных микромицетов. Скорость линейного роста более устойчивых к соли галотолерантов на среде с содержанием 15% хлористого натрия выше скорости роста на среде без соли, а менее устойчивых – на среде с содержанием 5% хлористого натрия выше или такая же, как в контроле. 3. Отмечено изменение морфолого-культуральных признаков колоний грибов при культивировании на среде с разными концентрациями хлористого натрия: изменение пигментации колоний и степени развития воздушного мицелия. 4. С помощью методов световой и электронной микроскопии показаны изменения в структуре клеток галотолерантных мицелиальных грибов, происходящие под действием хлористого натрия: увеличение толщины клеточной стенки, увеличение общего объема вакуолей и уменьшение количества гранул вакуолярного волютина, фрагментация митохондрий и уплотнение их матрикса, изменения в системе внутренних мембран. Впервые в клетках выявлены вакуоли-ацидокальцисомы. 20 галотолерантных микромицетов 5. Установлено накопление растворимых углеводов при культивировании галотолерантного штамма Fusarium incarnatum в присутствии 10% NaCl в питательной среде. Основную осмопротекторную роль выполняет арабит. 6. Увеличение соотношения фосфолипиды/стерины и степени ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов при культивировании в присутствии NaCl способствует поддержанию функционирования мембран Fusarium incarnatum, что свидетельствует о сходстве реакций на солевой и температурный стресс. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК. 1. Cмолянюк Е.В., Биланенко Е.Н. Сообщества галотолерантных микромицетов из мест природного засоления // Микология и фитопатология. Том 45, вып. 5, 2011. – с. 50-58. Smolyanyuk E.V., Bilanenko E.N. Communities of halotolerant micromycetes from the areas of natural salinity // Microbiology, vol. 80, n. 6, 2011 – p. 877-883. DOI 10.1134/S002626171106021X. 2. Cмолянюк Е.В., Биланенко Е.Н., Терешина В.М., Качалкин А.В., Камзолкина О.В. Влияние концентрации хлористого натрия в среде на состав мембранных липидов и углеводов цитозоля гриба Fusarium sp. // Микробиология. Том 82, № 5, 2013. – с. 595– 604. Smolyanyuk E. V., Bilanenko E. N., Tereshina V. M., Kachalkin A. V., Kamzolkina O. V. Effect of sodium chloride concentration in the medium on the composition of the membrane lipids and carbohydrates in the cytosol of the fungus Fusarium sp. // Microbiology, vol. 82, n. 5, 2013 – p. 600-608. DOI 10.1134/S0026261713050111. Материалы и тезисы конференций. 1. Smolyanyuk E.V., Bilananko E.N. Halotolerant micromycetes from hypersaline environments (Pomorie solar salterns, Bulgaria) // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution. Materials of IV International Young Scientists conference. – Odessa: Pechatniy dom, 2009. – p. 208. 2. Смолянюк Е.В. Сообщества галотолерантных микромицетов из мест природного засоления // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов2011». М.: МАКС Пресс, 2012. – С. 155 – 156. 3. Смолянюк Е.В., Камзолкина О.В. Особенности мицелия галотолерантных микромицетов при росте на питательных средах различной солености // Современная микология в России. Том 3. Материалы 3-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2012. С. 206. 21 Благодарности. Я благодарю моего научного руководителя Камзолкину Ольгу Владимировну за помощь и поддержку при выполнении работы. Также хочется выразить признательность за помощь в идентификации микромицетов, ценные советы и рекомендации Елене Николаевне Биланенко. Хочу поблагодарить Терешину Веру Михайловну, Дерябину Юлию Ивановну, Алексея Владимировича Качалкина, Шебанову Анастасию Сергеевну, а также сотрудников лаборатории регуляции биохимических процессов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (заведующая лабораторией Кулаковская Татьяна Валентиновна) за предоставление оборудования и помощь в проведении экспериментов. Я искренне признательна всему коллективу кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ. Отдельная благодарность моим близким за помощь и неоценимую поддержку в работе. 22
