015262 B1 015262 015262 B1 B1

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
015262
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации
и выдачи патента:
2011.06.30
(21)
Номер заявки:
200702374
(22)
Дата подачи:
2006.04.28
(54)
ВЫДЕЛЕННОЕ АНТИТЕЛО К IL-6 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
(72)
(56)
SHIMAMURA et al. Analysis of interleukin-6 (IL-6)/IL-6 receptor system using
monoclonal anti-IL-6 antibodies, Molecular
Immunology, 1991, vol. 28, No. 11, pages
1155-1161, especially page 1156
Изобретатель:
Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
015262
B1
(57)
Описано антитело к IL-6, а также содержащая его композиция и антиидиотипическое антитело,
связывающееся с ним.
B1
Чэнь Янь, Гарднер Дебра, Найт Дэвид М.,
Ларк Майкл В., Лян Байлинь, Шили Дэвид Дж., Сун Сяо-Юй Р., СтояновичСусулик Ведрана, Свит Реймонд В., Тэм
Сьюзан Х., Ву Шэн-Дзюн, Ян Цзин, Маркис Дэвид Мэттью, Смит Эрик Майкл,
Вассеро Ален Филипп (US)
(74)
015262
(31) 60/676,498; 60/677,319
(32) 2005.04.29; 2005.05.03
(33) US
(43) 2008.10.30
(86) PCT/US2006/016457
(87) WO 2006/119115 2006.11.09
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
СЕНТОКОР, ИНК.; ЭППЛАЙД МОЛЕКЬЮЛАР ЭВОЛЮШН, ИНК. (US)
(51) Int. Cl. C12N 5/10 (2006.01)
C12N 15/12 (2006.01)
C12N 15/13 (2006.01)
C12N 15/63 (2006.01)
A61K 39/395 (2006.01)
G01N 33/53 (2006.01)
G01N 33/567 (2006.01)
015262
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, включая их конкретные части или варианты, специфичные по меньшей мере к одному белку IL-6 или к его фрагменту; а также к антиидиотипическим
антителам; к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные анти-IL-6 антитела; к комплементарным
нуклеиновым кислотам; к векторам; клеткам-хозяевам и к способам их получения и применения, включая способ применения терапевтических композиций и устройства для их введения.
Предшествующий уровень техники
IL-6 представляет собой плейотропный провоспалительный цитокин, продуцируемый и секретируемый многими клетками различных типов, особенно антигенпрезентирующими клетками, а именно
Т- и В-клетками. IL-6 стимулирует различные функции, такие как рост и дифференцировка В-клеток,
активация Т-клеток, гемопоэз, активация остеокластов, рост кератиноцитов, рост нервных клеток и активация гепатоцитов. IL-6 связывается с трансмембранным или растворимым IL-6R и передает сигналы
посредством gp130, который присутствует у некоторых других цитокинов.
IL-6 играет важную роль в патогенезе В-клеток, как это происходит при системной красной волчанке, рассеянном склерозе и лимфопролиферативных расстройствах. Аналогичным образом IL-6 также
участвует в патогенезе аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и
остеоартрит. Недавно на основании косвенных данных было сделано предположение о существовании
взаимосвязи активности IL-6 с хронической обструктивной болезнью легких и инсулинорезистентностью
при диабете типа 2. IL-6 обладает провоспалительным и противовоспалительным действием в иммунной
системе, что указывает на то, что этот цитокин также играет центральную роль в регуляции физиологического ответа организма на развитие заболевания. Поэтому нацеливание терапевтических средств на
IL-6 может оказывать благоприятное действие при различных заболеваниях.
Повышение уровня продуцирования IL-6 наблюдается при ряде заболеваний, включая болезнь
Альцгеймера, аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, воспаление, инфаркт миокарда, болезнь Педжета, остеопороз, солидные опухоли (почечно-клеточная карцинома), рак предстательной железы и мочевого пузыря, рак нервной ткани и В-клеточные злокачественные заболевания (например, болезнь Кастельмана, некоторые лимфомы, хронический лимфоцитарный лейкоз и множественную миелому). Проведенные исследования показали, что IL-6 ассоциируется с патогенезом многих из
этих заболеваний, в частности рака, поэтому блокирование IL-6 должно давать благоприятные клинические эффекты.
Были получены мышиные, химерные и другие нечеловеческие анти-IL-6 антитела, однако они могут обладать ограниченной активностью и эффективностью, что может часто приводить к индуцированию нежелательного иммунного ответа (то есть иммуногенности) и/или к необходимости введения этих
антител в высоких дозах (см. публикацию Trikha et al., Clin. Can. Res., 9, 4653-4665, Oct., 2003, которая
вводится в настоящее описание посредством ссылки). Так, например, антитела, содержащие части нечеловеческого антитела, часто индуцируют иммунный ответ у человека. В соответствии с этим, повторное
введение этого антитела в терапевтических целях является неприемлемым, а опосредуемое иммунным
комплексом выведение антител из кровотока может приводить к снижению активности/эффективности
данного антитела. Сывороточная болезнь и анафилаксия представляют собой два репрезентативных состояния, которые могут вызываться повторным введением антител, имеющих части нечеловеческих антител. Поэтому необходимо получить анти-IL-6 антитело, которое будет обладать меньшей иммуногенностью, то есть будет лучше переноситься человеком и обладать большей активностью, что позволит
вводить его в меньших дозах по сравнению с используемыми ранее анти-IL-6 антителами.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным сконструированным человеческим антителам к
IL-6 (также называемым анти-IL-6 антителами), а также к композициям анти-IL-6 антител, к антиидиотипическим анти-IL-6 антителам и к способам их получения и применения.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, включающей антиIL-6 антитело, для введения терапевтически эффективного количества указанного антитела в целях модуляции или лечения по меньшей мере одного IL-6-ассоциированного состояния в клетки, ткани, органы,
организм животного или человека до, после или во время развития IL-6-ассоциированного состояния,
известного специалистам и/или описанного в настоящей заявке.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции для доставки терапевтически или профилактически эффективного количества по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела
согласно изобретению.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, включающей антиIL-6 антитело, для диагностики по меньшей мере одного IL-6-ассоциированного состояния клеток, ткани,
органа или организма животного или человека до, после или во время развития IL-6-ассоциированного
состояния, известного специалистам и/или описанного в настоящей заявке.
Настоящее изобретение также относится к любому из описанных здесь вариантов.
-1-
015262
Описание чертежей
На фиг. 1 проиллюстрировано связывание сконструированного человеческого и химерного анти-IL6 антитела с комплексом IL-6/IL-6R;
на фиг. 2 проиллюстрирован эпитоп, связывающийся со сконструированным человеческим анти-IL6 антителом согласно изобретению;
на фиг. 3 показано, что сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело ингибирует IL-6стимулированную секрецию МСР-1 клетками U937, как было измерено с помощью ELISA;
на фиг. 4 показано, что сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело ингибирует IL-6- и
IL-1β-стимулированную секрецию SAA клетками HepG2, как было измерено с помощью ELISA;
на фиг. 5А и 5В показано, что сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело блокирует IL-6опосредуемое фосфорилирование STAT3, как было измерено с помощью вестерн-блот-анализа, проводимого посредством гель-электрофореза;
на фиг. 6 проиллюстрировано ингибирование индуцированного человеческим IL-6 продуцирования
SAA у мышей Balb/C под действием сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела;
на фиг. 7 проиллюстрировано ингибирование продуцирования аутоантител против дцДНК под действием анти-IL-6 mAb у мышей NZB/W F1;
на фиг. 8А проиллюстрировано влияние IL-6 на инсулининдуцированное инсулином фосфорилирование Akt в присутствии и в отсутствие сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела;
на фиг. 8В проиллюстрирован вестерн-блот-анализ, проводимый для определения действия IL-6 на
индуцированное инсулином фосфорилирование Akt в присутствии и в отсутствие сконструированного
человеческого анти-IL-6 антитела;
на фиг. 9 представлены результаты ELISA-анализа на связывание, описанного в примере 3;
на фиг. 10 представлены результаты анализа на антипролиферативное действие с использованием
IL-6-зависимой клеточной линии, описанного в примере 3;
на фиг. 11А проиллюстрирована активация киназы PI3 в крысиных гепатоцитах, обработанных инсулином, белком IL-6 и анти-IL-6 антителом;
на фиг. 11В представлен контроль в анализах на активацию киназы PI3 в крысиных гепатоцитах;
на фиг. 12А проиллюстрировано влияние IL-6 на передачу сигнала индуцированного инсулином
фосфорилирования IR в крысиных гепатоцитах;
на фиг. 12А проиллюстрировано влияние IL-6 на передачу сигнала индуцированного инсулином
фосфорилирования Akt в крысиных гепатоцитах;
на фиг. 13А указан уровень глюкозы у мышей DIO после их обработки анти-IL-6 антителом;
на фиг. 13В указан уровень инсулина у мышей DIO после их обработки анти-IL-6 антителом;
на фиг. 13С представлена оценка индекса гомеостаза глюкозы (НОМА) у мышей-моделей DIO после их обработки анти-IL-6 антителом;
на фиг. 14А-F указан уровень липидов до и после обработки анти-IL-6 антителом;
на фиг. 15 проиллюстрирована схема внутрибрюшинного введения анти-IL-6 mAb мышам для проведения теста на их толерантность к глюкозе (ipGTT).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетически сконструированным человеческим анти-IL-6 антителам и к антиидиотипическим антителам против анти-IL-6 антител, а также к композициям и к кодирующим молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей
мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело или антиидиотипическое антитело. Настоящее изобретение также включает, но не ограничивается ими, способы получения и
применения таких нуклеиновых кислот, антител и антиидиотипических антител, включая диагностические и терапевтические композиции, способы и устройства.
Используемые здесь термины "антитело против IL-6", "анти-IL-6 антитело", "часть анти-IL-6 антитела" или "фрагмент анти-IL-6 антитела" и/или "вариант анти-IL-6 антитела" и т.п. означают любую белок- или пептидсодержащую молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, но не ограничивающуюся ими, по меньшей мере одну гипервариабельную область
(комплементарность определяющую область (CDR)) тяжелой или легкой цепи или ее лигандсвязывающую часть, вариабельную область тяжелой или легкой цепи, константную область тяжелой или легкой
цепи, каркасную область или любую их часть или по меньшей мере одну часть IL-6-рецептора или связывающего белка, которые могут быть включены в антитело согласно изобретению. Указанное антитело,
кроме того, но необязательно, взаимодействует со специфическим лигандом таким способом, но не ограничивающимся им, в результате которого указанное антитело модулирует, снижает, увеличивает, подавляет, стимулирует, уменьшает, ослабляет, блокирует, ингибирует, отменяет и/или предотвращает по
меньшей мере одну активность или связывание IL-6 либо активность или связывание рецептора IL-6, in
vitro, in situ и/или in vivo. В качестве неограничивающего примера может служить подходящее анти-IL-6
антитело согласно изобретению или его конкретная часть или вариант согласно изобретению, которые
могут связываться по меньшей мере с одной молекулой IL-6 или с ее конкретными частями, вариантами
или доменами. Подходящее анти-IL-6 антитело, его конкретная часть или вариант могут также, но необя-2-
015262
зательно, влиять по меньшей мере на одну активность или функцию IL-6, такие как, но не ограничивающиеся ими, синтез РНК, ДНК или белка, высвобождение IL-6, передача сигнала рецептором IL-6, расщепление мембранного IL-6, активность IL-6, продуцирование и/или синтез IL-6.
Термин "антитело", кроме того, охватывает антитела, их рестрикционные фрагменты, конкретные
части и варианты, включая антитела-миметики или антитела, содержащие части антител, которые имитируют структуру и/или функцию антитела или его конкретного фрагмента либо конкретной части,
включая одноцепочечные антитела и их фрагменты. Функциональными фрагментами являются антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с IL-6 млекопитающего. Так, например, фрагментами
антител, способными связываться с IL-6 или с его частями, являются, но не ограничиваются ими, следующие фрагменты: Fab (например, образующийся в результате гидролиза папаином), Fab' (например,
образующийся в результате гидролиза пепсином и частичного восстановления) и F(ab')2 (например, образующийся в результате гидролиза пепсином), facb (например, образующийся в результате гидролиза
плазмином), pFc' (например, образующийся в результате гидролиза пепсином или плазмином), Fd (например, образующийся в результате гидролиза пепсином, частичного восстановления и реагрегации), Fv
или scFv (например, полученные методами молекулярной биологии), которые входят в объем настоящего изобретения (см. выше, например, Colligan, Immunology).
Такие фрагменты могут быть продуцированы методом ферментативного расщепления, методом
синтеза или рекомбинантными методами, известными специалистам и/или описанными в настоящей заявке. Антитела могут быть также продуцированы в виде различных усеченных форм с использованием
генов антител, в которых один или несколько стоп-кодонов были введены в область, расположенную
выше (по ходу транскрипции) от природного сайта терминации. Так, например, для встраивания ДНКпоследовательностей, кодирующих CH1-домен и/или шарнирную область тяжелой цепи, может быть
сконструирован комбинированный ген, кодирующий F(ab')2-фрагмент тяжелой цепи. Различные фрагменты антител могут быть присоединены друг к другу стандартными химическими методами, либо они
могут быть получены в виде непрерывной белковой последовательности методами генной инженерии.
Используемый здесь термин "сконструированное человеческое антитело" означает антитело, содержащее, по меньшей мере, полностью человеческие каркасные области и константные области (CL,CHдомены (например, CH1, CH2, CH3) и шарнирную область), и CDR, происходящие от антигенсвязывающих антител. Полностью человеческие каркасные области включают каркасные области, соответствующие человеческим последовательностям зародышевой линии, а также последовательностям с соматическими мутациями. CDR могут происходить от одной или нескольких CDR, которые связываются с IL-6 в
окружении каркасных областей любого антитела. Так, например, CDR сконструированного человеческого антитела согласно изобретению могут происходить от CDR, которые связываются с IL-6 в любом окружении каркасных областей мышиного антитела, а затем их модифицируют так, чтобы они связывались
с IL-6 в окружении полностью человеческих каркасных областей. В большинстве случаев сконструированное человеческое антитело, по существу, является неиммуногенным для человека.
Аналогичным образом, антитела приматов (обезьяны, павианы, шимпанзе и т.п.), грызунов (мышей,
крыс, кроликов, морских свинок, хомячков и т.п.) и других млекопитающих представляют собой антитела, специфичные для животных такого вида, подрода, рода, подсемейства и семейства. Кроме того, химерные антитела могут включать любую из вышеуказанных комбинаций. Такие модификации или варианты антител, по сравнению с немодифицированными антителами, необязательно, но предпочтительно,
сохраняют или снижают иммуногенность у человека или других видов. Так, например, сконструированное человеческое антитело отличается от химерного или гуманизованного антитела.
Было показано, что сконструированное человеческое антитело может продуцироваться организмом
животного, не являющегося человеком, или прокариотическими, или эукариотическими клетками, способными экспрессировать функционально реаранжированные гены человеческого или сконструированного человеческого иммуноглобулина (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи). Кроме того, если
сконструированное человеческое антитело является одноцепочечным, то оно может содержать линкерный пептид, не обнаруживаемый в природных человеческих антителах. Так, например, Fv может содержать линкерный пептид, такой как пептид, имеющий от двух и примерно до восьми глициновых остатков или других аминокислотных остатков, которые соединяют вариабельную область тяжелой цепи и
вариабельную область легкой цепи. Очевидно, что такие линкерные пептиды могут происходить и от
человеческих антител.
Могут быть также использованы биспецифические, гетероспецифические, гетероконъюгированные
или аналогичные им антитела, которые представляют собой моноклональные, а предпочтительно человеческие, сконструированные человеческие или гуманизованные антитела, специфически связывающиеся по меньшей мере с двумя различными антигенами. В данном случае, одной из специфичностей связывания является специфичность по меньшей мере к одному белку IL-6, а другой специфичностью является
специфичность к любому другому антигену. Методы получения биспецифических антител известны
специалистам. Традиционный метод рекомбинантного продуцирования биспецифических антител основан на коэкспрессии двух пар "тяжелая цепь-легкая цепь" иммуноглобулина, где указанные две тяжелые
цепи обладают различными специфичностями (Milstein & Cuello, Nature, 305:537 (1983)). В результате
-3-
015262
случайной реаранжировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют смесь из десяти возможных различных молекул антител, из которых только одна имеет "правильную" биспецифическую структуру. Очистку такой "правильной" молекулы обычно осуществляют
путем проведения постадийной аффинной хроматографии. Аналогичные процедуры описаны, например,
в WO 93/08829, в патентах США №№ 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902,
5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549,
4676980, в WO 91/00360, 92/00373, ЕР 03089, Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991), Suresh et al.,
Methods in Enzymology, 121:210 (1986), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Анти-IL-6 антитела, используемые в способах и композициях согласно изобретению, могут, но необязательно, обладать высокой аффинностью связывания с IL-6 и, необязательно, но предпочтительно,
низкой токсичностью. В частности, в настоящем изобретении используется антитело, его конкретный
фрагмент или вариант, в котором отдельные компоненты, такие как вариабельная область, константная
область и каркасная область, взятые отдельно или в комбинации друг с другом, необязательно, но предпочтительно, имеют низкую иммуногенность. Антитела, которые могут быть использованы в настоящем
изобретении, характеризуются, но необязательно, своей способностью оказывать терапевтическое действие на пациентов в течение продолжительного периода времени со значительным ослаблением симптомов заболевания и низкой и/или приемлемой токсичностью. Низкая или приемлемая иммуногенность
и/или высокая аффинность, а также другие желательные свойства могут вносить свой вклад в достигаемые терапевтические эффекты. Термин "низкая иммуногенность" определяется здесь как вероятность
присутствия титруемых уровней антител против анти-IL-6 антитела у менее чем 25% пациентов, подвергнутых лечению анти-IL-6 антителом, а предпочтительно у менее чем 10% пациентов, которым была
введена рекомендуемая доза такого антитела во время проведения рекомендованного курса лечения.
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть использованы для продуцирования по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела или его конкретного варианта, которые могут быть
использованы для определения частоты возникновения симптомов по меньшей мере одного IL-6ассоциированного состояния, выбранного, но не ограничивающегося ими, из аутоиммунных расстройств
или заболеваний, сердечно-сосудистых расстройств или заболеваний, а также инфекционных, злокачественных и/или нервных расстройств или заболеваний, или другого известного или конкретного IL-6ассоциированного состояния клетки, ткани, органа или организма животного (включая млекопитающих
и человека), или для определения воздействия указанных заболеваний или расстройств на указанные
клетки, ткани, органы или организм животного (включая млекопитающих и человека), а также для диагностики, мониторинга, модуляции, лечения, ослабления, предотвращения возникновения или улучшения
динамики развития симптомов по меньшей мере из одного из IL-6-ассоциированных состояний.
Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, в клетку, в ткань, в орган и в
организм животного или человека, нуждающегося в такой модуляции, лечении, ослаблении или предупреждении симптомов или в снижении уровня, эффектов или механизмов их развития. Такое эффективное количество может составлять примерно 0,001-500 мкг/кг на одно введение (например, введение
ударной дозы), многократное введение или непрерывное введение, или количество, необходимое для
достижения концентрации 0,001-5000 мкг/мл в сыворотке на одно введение, многократное введение или
непрерывное введение, или любое эффективное количество в пределах указанного интервала или величину, входящую в этот интервал, как может быть осуществлено и определено известными методами,
описанными в настоящей заявке или известными специалистам.
Антитела согласно изобретению. Продуцирование и генерация антител
По меньшей мере одно анти-IL-6 антитело согласно изобретению может быть, но необязательно,
продуцировано клеточной линией, смешанной клеточной линией, иммортализованной клеткой или клональной популяцией иммортализованных клеток, хорошо известных специалистам. См., например,
Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001);
Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow & Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current
Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
Сконструированные человеческие антитела, которые являются специфичными к человеческим белкам IL-6 или к их фрагментам, могут вырабатываться против соответствующего иммуногенного антигена, такого как выделенный белок IL-6 и/или его часть (включая синтетические молекулы, такие как синтетические пептиды). Аналогичным образом могут быть продуцированы и другие специфические или
неспецифические антитела других млекопитающих. Получение иммуногенных антигенов и продуцирование моноклонального антитела может быть осуществлено с применением соответствующей технологии.
В одном из способов гибридому продуцируют путем слияния подходящей иммортализованной клеточной линии (например, миеломной клеточной линии, такой как, но не ограничивающейся ими, Sp2/0,
-4-
015262
Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, L243, P3X63Ag8. 653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5,
U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144,
NAMALWA, NEURO 2A или т.п., или гетеромиелом, их гибридных продуктов, или любой происходящей от них клетки, или любой другой подходящей клеточной линии, известной специалистам) (см., например, www.atcc.org, www.lifetech.com и т.п.) с антителопродуцирующими клетками, такими как, но не
ограничивающимися ими, выделенные или клонированные клетки селезенки, периферической крови,
лимфы, миндалин или другие иммунные клетки или В-клетки, либо с любыми другими клетками, экспрессирующими константные, вариабельные, каркасные области или CDR-последовательности тяжелой
или легкой цепи, либо эндогенные, либо гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как рекомбинантные или эндогенные, вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты водорослей, прокариотических организмов, амфибий, насекомых, рептилий, рыб, млекопитающих, грызунов,
лошадей, овец, коз, баранов, приматов и эукариотических организмов; геномные ДНК, кДНК, рДНК,
митохондриальные ДНК или РНК, ДНК или РНК хлоропластов, чРНК, мРНК, тРНК, одноцепочечные,
двухцепочечные, трехцепочечные, гибридизованные ДНК и т.п., или любые их комбинации. См., например, публикации Ausubel, см. выше, и Colligan, Immunology, см. выше, глава 2, которые полностью введены в настоящее описание посредством ссылки.
Антителопродуцирующие клетки могут быть также выделены из периферической крови или предпочтительно из селезенки либо лимфоузлов человека или других подходящих животных, которые были
иммунизированы представляющими интерес антигеном. Для экспрессии гетерологичной или эндогенной
нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело согласно изобретению, его специфический фрагмент или
вариант могут быть также использованы любые другие подходящие клетки-хозяева. Слитые клетки (гибридомы) или рекомбинантные клетки могут быть выделены в селективных условиях культивирования
или другими подходящими известными методами и клонированы путем лимитирующего разведения или
клеточного сортинга, либо другими известными методами. Клетки, продуцирующие антитела с нужной
специфичностью, могут быть выбраны с помощью подходящего анализа (например, ELISA).
Могут быть также использованы методы генного конструирования или гуманизации нечеловеческих или человеческих антител, и эти методы хорошо известны специалистам. Гуманизованное или
сконструированное антитело может иметь один или несколько аминокислотных остатков, происходящих
от источника, не являющегося человеком, например, такого как, но не ограничивающегося ими, мышь,
крыса, кролик, примат, не являющийся человеком, или другое млекопитающее. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки заменяют остатками, которые часто называют "импортными" остатками, и эти остатки обычно происходят от "импортного" вариабельного, константного или другого домена известной
человеческой последовательности.
Известные
последовательности
человеческого
Ig описаны,
например,
на
сайтах:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www. mrccpe.cam.ас.uk/ALIGNMENTS.php;
www.kabatdatabase.com/top.html;
ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat;
www.sciquest.com; www.abcam.com; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html;
www.
whf
reeman.
com/immunology/CH05/kuby05.
htm;
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv. uci.kun.nl/~jraats/linksl.html;
www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu;
www.mrc-cpe.cam.ac.uk;
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;
http://www.bioinf.org.uk/abs;
antibody.bath.ac.uk;
www.unizh.ch;
www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s;
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html;
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de;
Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), каждый из которых
полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
Такие импортные последовательности могут быть использованы для снижения иммуногенности
или для снижения, усиления или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости
диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других подходящих свойств,
известных специалистам. Обычно остатки CDR непосредственно влияют на связывание с антигеном и,
по существу, участвуют в таком связывании. В соответствии с этим все нечеловеческие или человеческие CDR-последовательности или их часть сохраняются, а аминокислоты нечеловеческих последовательностей вариабельной и константной областей могут быть заменены человеческими или другими
аминокислотами.
Антитела могут быть также, но необязательно, гуманизованы или сконструированы, либо они могут
представлять собой сконструированные человеческие антитела, которые сохраняют высокую аффинность связывания с данным антигеном и другие желательные биологические свойства. Для достижения
этой цели гуманизованные (или человеческие) или сконструированные антитела могут быть, но необязательно, получены путем анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизованных и сконструированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных, сконструиро-5-
015262
ванных и гуманизованных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и известны специалистам. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают вероятные трехмерные конформационные структуры отобранных иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Исследование этих отображений позволяет проанализировать
возможную роль данных остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательностикандидата, то есть проанализировать остатки, которые влияют на способность иммуноглобулинакандидата связываться с антигеном. Таким образом, каркасные остатки (FR) могут быть выбраны и объединены с консенсусными и "импортными" последовательностями так, чтобы данное антитело обладало
нужными свойствами, такими как повышенная аффинность по отношению к антигену(ам)-мишени(ям).
Кроме того, человеческое сконструированное анти-IL-6 антитело согласно изобретению может содержать каркасную область легкой цепи человеческой зародышевой линии. В конкретных вариантах
изобретения последовательность легкой цепи зародышевой линии выбрана из человеческих последовательностей VK, включая, но не ограничиваясь ими, A1, A10, A11, A14, А17, А18, А19, А2, А20, А23,
А26, А27, A3, А30, А5, А7, В2, В3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24,
L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, О1, О11, О12, О14, О18, О2, О4 и О8. В некоторых вариантах изобретения
эта каркасная область легкой цепи человеческой зародышевой линии выбрана из V1-11, V1-13, V1-16,
V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15,
V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 и V5-6.
Описание различных последовательностей зародышевой линии можно найти в заявке РСТ
WO 2005/005604.
В других вариантах изобретения сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело согласно изобретению может содержать каркасную область тяжелой цепи человеческой зародышевой линии. В конкретных вариантах изобретения эта каркасная область тяжелой цепи человеческой зародышевой линии
выбрана из VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5,
VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38,
VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28,
VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 и VH7-81. Описание различных последовательностей зародышевой линии можно найти в заявке РСТ WO 2005/005604.
В конкретных вариантах изобретения вариабельная область легкой цепи и/или вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасную область или по меньшей мере часть каркасной области (например, 2 или 3 подобласти, такие как FR2 и FR3). В некоторых вариантах осуществления изобретения по
меньшей мере FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 являются полностью человеческими. В других вариантах
изобретения по меньшей мере FRH1, FRH2, FRH3 или FRH4 являются полностью человеческими. В некоторых вариантах изобретения по меньшей мере FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 представляют собой последовательность зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии) или содержат человеческие консенсусные последовательности для конкретной каркасной области (которые могут быть легко получены из источников известных человеческих последовательностей Ig, описанных выше). В других вариантах изобретения по меньшей мере FRH1, FRH2, FRH3 или FRH4 представляют собой последовательность зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии) или содержат человеческие консенсусные последовательности для конкретной каркасной области. В предпочтительных вариантах изобретения каркасной областью является человеческая каркасная область (например, человеческие
каркасные области, представленные ниже в табл. 11 и 12). В некоторых вариантах изобретения каркасная
область содержит последовательности SEQ ID NO:105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 или их комбинации.
Гуманизация или конструирование антител согласно изобретению могут быть осуществлены любым известным методом, таким как, но не ограничивающимся им, метод, описанный в публикациях Winter (Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science,
239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 (1987),
Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), в патентах США №№: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5766886, 5714352, 6204023,
6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US 98/16280, 96/18978, 91/09630, 91/05939,
94/01234, GB 89/01334, 91/01134, 92/01755; WO 90/14443, 90/14424, 90/14430, EP 229246, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, включая цитируемые в них работы.
В некоторых вариантах изобретения антитело содержит модифицированную (например, мутированную) Fc-область. Так, например, в некоторых вариантах изобретения Fc-область была модифицирована в целях снижения или усиления эффекторых функций антитела. В некоторых вариантах изобретения Fc-область имеет изотип, выбранный из IgM, IgA, IgG, IgE или другого изотипа.
Альтернативно или дополнительно может оказаться желательным объединение аминокислотных
модификаций с одной или несколькими дополнительными аминокислотными модификациями, которые
изменяют уровень связывания с C1q и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC) Fc-области IL6-связывающей молекулы. Исходным полипептидом, представляющим особый интерес, может быть полипептид, который связывается с C1q и обладает комплементзависимой цитотоксичностью. Полипепти-6-
015262
ды, уже обладающие активностью связывания с C1q и, кроме того, но необязательно, обладающие способностью опосредовать CDC, могут быть модифицированы в целях усиления одной или обеих из указанных активностей. Аминокислотные модификации, изменяющие уровень связывания с C1q и/или модифицирующие комплементзависимую цитотоксичность, описаны, например, в заявке WO 0042072, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Как описано выше, может быть создана Fc-область сконструированного человеческого анти-IL-6
антитела согласно изобретению с измененной эффекторной функцией, например, путем изменения уровня связывания с C1q и/или связывания с FcγR и тем самым изменения CDC-активности и/или ADCCактивности. "Эффекторные функции" ответственны за активацию или снижение биологической активности (например, у индивидуума). Примерами эффекторных функций являются, но не ограничиваются ими,
связывание с C1q, комплементзависимая цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецептором; антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; ингибирование рецепторов
клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т.п. Для осуществления таких эффекторных функций может потребоваться объединение Fc-области со связывающим доменом (например,
с вариабельным доменом антитела), и такие эффекторные функции могут быть оценены с помощью различных анализов (например, анализов на Fc-связывание, анализов на ADCC, анализов на CDC и т.п.).
Так, например, может быть получен вариант Fc-области сконструированного человеческого антиIL-6 антитела, обладающий повышенной способностью связываться с C1q и с FcγRIII (например, обладающий повышенной ADCC-активностью и CDC-активностью). Альтернативно, если требуется снижение или элиминация эффекторных функций, то вариант Fc-области может быть сконструирован так, чтобы он обладал пониженной CDC-активностью и/или пониженной ADCC-активностью. В других вариантах изобретения может быть увеличена только одна из этих активностей и при этом, но необязательно,
может быть также снижена другая активность (например, для получения варианта Fc-области с повышенной ADCC-активностью, но с пониженной CDC-активностью, и наоборот).
Fc-мутации могут быть также введены в конструкцию для изменения ее взаимодействия с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) и для улучшения ее фармакокинетических свойств. Набор человеческих
Fc-вариантов с улучшенной способностью связываться с FcRn был описан в литературе (Shields et al.,
(2001), "High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and
design of IgG1 variants with improved binding to the FcγR", J. Biol. Chem., 276:6591-6604).
Аминокислотные замены другого типа могут служить для изменения характера гликозилирования
Fc-области человеческого сконструированного анти-IL-6 антитела. Гликозилирование Fc-области обычно является N-связанным или О-связанным. N-связанное гликозилирование означает присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного из сахаров, таких как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к оксиаминокислоте, обычно к серину или треонину, хотя могут быть также использованы и 5-гидроксипролин или
5-гидроксилизин. Последовательностями распознавания ферментативного присоединения углеводной
группы к пептидным последовательностям боковой цепи аспарагина являются "аспарагин-Х-серин" и
"аспарагин-Х-треонин", где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина. Таким образом, присутствие любой из этих пептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования.
Характер гликозилирования может быть изменен, например, путем делеции одного или нескольких
сайтов гликозилирования, присутствующих в полипептиде, и/или добавления одного или нескольких
сайтов гликозилирования, отсутствующих в данном полипептиде. Присоединение сайтов гликозилирования к Fc-области сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела обычно осуществляют путем
такой модификации аминокислотной последовательности, в результате которой эта аминокислотная последовательность будет содержать одну или несколько вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Репрезентативный вариант гликозилирования имеет
аминокислотную замену в положении остатка Asn 297 тяжелой цепи. Такая модификация может быть
также осуществлена путем добавления одного или нескольких сериновых или треониновых остатков к
последовательности исходного полипептида или их замены в последовательности исходного полипептида (для сайтов О-связанного гликозилирования). Кроме того, замена Asn 297 на Ala может приводить к
удалению одного из сайтов гликозилирования.
В некоторых вариантах изобретения сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело согласно
изобретению экспрессируется в клетках, которые экспрессируют бета-(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnT III), в результате чего GnT III присоединяет GlcNAc к сконструированному
человеческому анти-IL-6 антителу. Методы такого продуцирования антител описаны в WO/9954342,
WO/03011878, в публикации патентной заявки 20030003097А1 и в публикации Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, Feb. 1999.
Человеческое анти-IL-6 антитело может быть, но необязательно, продуцировано путем иммунизации трансгенного животного (например, мыши, крысы, хомячка, примата, не являющегося человеком, и
т.п.), способного продуцировать репертуар человеческих антител, описанных в настоящей заявке и/или
-7-
015262
известных специалистам. Клетки, продуцирующие человеческое анти-IL-6 антитело, могут быть выделены из указанных животных и иммортализованы подходящими методами, такими как описанные здесь
методы.
Трансгенные мыши, которые могут продуцировать репертуар человеческих антител, связывающихся с человеческими антигенами, могут быть получены известными методами (например, описанными, но
не ограничивающимися ими, в патентах США №№: 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825,
5633425, 5661016 и 5789650, выданных Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO
98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710719 A1, Surani et al.
патент США № 5545807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438474 Bl, Lonberg et al.
EP 0814259 A2, Lonberg et al. GB 2272440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int.
Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics
15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20 (23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA 90(8):3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int. Rev. Immunol., 13(1):65-93 (1995) и Fishwald et
al., Nat. Biotechnol., 14(7):845-851 (1996), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Обычно эти мыши имеют по меньшей мере один трансген, содержащий ДНК, происходящую по меньшей мере от одного локуса человеческого иммуноглобулина, который является функционально реаранжированным или который может подвергаться функциональной реаранжировке. Эндогенные локусы иммуноглобулина у таких мышей могут быть разрушены или делетированы в целях элиминации способности такого животного продуцировать антитела, кодируемые эндогенными генами.
Скрининг антител на специфическое связывание с аналогичными белками или фрагментами может
быть легко осуществлен с использованием библиотек пептидного представления. Этот метод включает
скрининг большого набора пептидов для выявления отдельных членов, имеющих нужную функцию или
структуру. Скрининг антител с использованием библиотек пептидного представления хорошо известен
специалистам. Представленные пептидные последовательности могут иметь длину от 3 до 5000 или более аминокислот, а чаще 5-100 аминокислот, а еще чаще примерно 8-25 аминокислот. Помимо прямых
методов химического синтеза, используемых для генерации пептидных библиотек, было описано несколько методов рекомбинантных ДНК. Один из таких методов включает представление пептидной последовательности на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или клетка содержат
нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретную представленную пептидную последовательность. Такие методы описаны в публикациях патентных заявок РСТ №№ 91/17271, 91/18980,
91/19818 и 93/08278.
Другие системы, используемые для создания пептидных библиотек, могут быть получены in vitro
методами химического синтеза и рекомбинантными методами. См. публикации патентных заявок РСТ
№№ 92/05258, 92/14843 и 96/19256. См. также патенты США №№ 5658754 и 5643768. Библиотеки пептидного представления, векторы и наборы для скрининга являются коммерчески доступными и поставляются компаниями Invitrogen (Carlsbad, CA) и Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK).
См., например, патенты США №№ 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621,
5656730, 5763733, 5767260, 5856456, переуступленные Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, переуступленные Dyax; 5427908, 5580717, переуступленные Affymax; 5885793, переуступленный Cambridge
Antibody Technologies; 5750373, переуступленный Genentech; 5618920, 5595898, 5576195, 5698435,
5693493, 5698417, переуступленные Xoma, Colligan, см. выше; Ausubel, см. выше; или Sambrook, см. выше. Антитела согласно изобретению могут быть также получены с использованием по меньшей мере
одной нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-IL-6 антитело, в целях генерирования трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы, кролики и т.п., в молоке которых
продуцируются такие антитела. Указанные животные могут быть получены известными методами. См.,
например, среди прочих, патенты США №№ 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362;
5304489 и т.п., каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством
ссылки.
Кроме того, антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием по меньшей
мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-IL-6 антитело, в целях генерирования клеток трансгенных растений и культурных растений (например, таких как, но не ограничивающихся ими, табак и
кукуруза), которые продуцируют такие антитела или их конкретные фрагменты либо варианты в органах
растений или в полученных от них клетках. В качестве неограничивающегося примера могут служить
листья трансгенного табака, которые экспрессируют рекомбинантные белки и которые были успешно
использованы для получения больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием
индуцибельного промотора. См., например, публикацию Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol.,
240:95-118 (1999) и цитируемые в ней работы. Для экспрессии белков млекопитающих на промышленном уровне была также использована трансгенная кукуруза, биологическая активность которой эквивалентна активности, продуцируемой в других рекомбинантных системах или в других системах, выделенных из природных источников. См., например, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol., 464:127-147 (1999) и цитируемые там работы. Антитела, включая фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела
-8-
015262
(scFv), были также продуцированы в больших количествах из семян трансгенных растений, включая семена табака и клубни картофеля. См., например, Conrad et al., Plant Mol. Biol., 38:101-109 (1998) и цитируемые там работы. Таким образом, антитела согласно изобретению могут быть также продуцированы с
использованием трансгенных растений известными методами. См. также, например, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 30:99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol., 13:522-7 (1995); Ma et al.,
Plant Physiol., 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans., 22:940-944 (1994) и цитируемые там
работы.
Антитела согласно изобретению могут связываться с человеческим IL-6 с широким диапазоном
аффинностей (KD). В предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере одно человеческое mAb
согласно изобретению может, но необязательно, связываться с человеческим IL-6 с высокой аффинностью. Так, например, человеческое или сконструированное человеческое mAb может связываться с человеческим IL-6 с величиной KD, равной примерно 10-7 М или менее, например, с величинами KD, такими
как, но не ограничивающимися ими, 0,1-9,9 (или с величинами в любом интервале, входящем в указанный интервал, или с величиной в указанных интервалах)×10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15
или в любом интервале этих порядков величин, как было определено методом поверхностного плазмонного резонанса или методом Кинекса, обычно применяемыми специалистами.
Аффинность или авидность антитела по отношению к антигену может быть определена экспериментально любым подходящим методом (см., например, публикации Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen
Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis
Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992); и описанные там методы). Измеренная
аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьироваться в зависимости от различных условий (например, от концентрации соли и рН). Таким образом, измерение аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, Kon, Koff) предпочтительно проводят с использованием стандартизированных растворов антитела и антигена и стандартизированного буфера, такого как
буфер, описанный в настоящей заявке.
Для того чтобы определить, что белки, антитела и другие антагонисты конкурируют с антителом
согласно изобретению за связывание с IL-6 и/или имеют общую эпитопную область, могут быть проведены анализы на конкурентное связывание с антителом согласно изобретению. Такие анализы, хорошо
известные среднему специалисту в данной области, позволяют выявить конкуренцию между антагонистами или лигандами за связывание с ограниченным числом сайтов связывания на белке. Такой белок
или антитело иммобилизуют или превращают в нерастворимую форму до или после такого анализа на
конкурентное связывание, и образец, связанный с IL-6, отделяют от несвязанного образца, например,
путем декантирования (где белок/антитело предварительно превращают в нерастворимую форму) или
путем центрифугирования (где белок/антитело осаждали после конкурентной реакции). Кроме того, конкурентное связывание может быть определено по изменению функции связывания или по отсутствию
связывания антитела с белком, например, по типу активности молекулы антитела, то есть является ли эта
активность ингибирующей или потенцирующей. При этом могут быть использованы ELISA и другой
функциональный анализ, хорошо известный специалистам.
Предпочтительные анти-IL-6 антитела согласно изобретению имеют последовательности, представленные ниже в табл. 1-5 и 11-13. Так, например, анти-IL-6 антитело согласно изобретению имеет одну из
последовательностей CDR легкой цепи, представленную в табл. 1 (то есть CDRL1, CDRL2 и CDRL3), и
одну из последовательностей CDR тяжелой цепи, представленную в табл. 2 (то есть CDRH1, CDRH2 и
CDRH3). Более конкретно, анти-IL-6 антитело (молекула АМЕ-А9) имеет CDRL1, SEQ ID NO:15;
CDRL2, SEQ ID NO:27; CDRL3, SEQ ID NO:35; CDRH1, SEQ ID NO:47; CDRH2, SEQ ID NO:61; CDRH3,
SEQ ID NO:91.
Молекулы нуклеиновой кислоты
С использованием приведенных здесь данных, например данных о нуклеотидных последовательностях, кодирующих по меньшей мере 70-100% смежных аминокислот по меньшей мере одной из вариабельных областей легкой цепи SEQ ID NO:93, 97 и 101, а также других описанных здесь последовательностей, и по меньшей мере одной из вариабельных областей тяжелой цепи SEQ ID NO:95, 99 и 103, а
также других описанных здесь последовательностей, их фрагментов, вариантов или консенсусных последовательностей, или данных о депонированном векторе, содержащем по меньшей мере одну из указанных последовательностей, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующая по
меньшей мере одно антитело против IL-6, может быть получена методами, описанными в настоящей заявке или известными специалистам.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть получены в форме РНК, такой
как мРНК, чРНК, тРНК или в любой другой форме, либо в форме ДНК, включая, но не ограничиваясь
ими, кДНК и геномную ДНК, полученные методами клонирования или синтеза, или любой их комбинацией. ДНК может представлять собой трехцепочечную, двухцепочечную или одноцепочечную ДНК или
любую их комбинацию. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может представлять
собой кодирующую цепь, также известную как смысловая цепь, либо она может представлять собой некодирующую цепь, называемую также антисмысловой цепью.
-9-
015262
Выделенными молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие открытую рамку считывания (ОРС), необязательно с одним или несколькими интронами, например, такими как, но не ограничивающимися ими, по меньшей мере одна конкретная часть по меньшей мере одной CDR, а именно CDR1, CDR2 и/или CDR3 по меньшей мере одной тяжелой цепи (например, SEQ ID NO:38, 40, 42, 44 и т.п.) или легкой цепи (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8
и т.п.); молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность для анти-IL-6
антитела или его вариабельную область (например, вариабельные области легкой цепи SEQ ID NO:94, 98
и 102, а также другие описанные здесь последовательности и вариабельные области тяжелой цепи SEQ
ID NO:96, 100 и 104); и молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, которая, по существу, отличается от описанных выше последовательностей, но которая, из-за вырожденности генетического кода, еще кодирует по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, описанное в
настоящей заявке и/или известное специалистам. Генетический код хорошо известен специалистам. Таким образом, каждый специалист может генерировать такие вырожденные варианты нуклеиновой кислоты, которые кодируют специфические анти-IL-6 антитела согласно изобретению, см. выше, например,
Ausubel et al., и такие варианты нуклеиновой кислоты входят в объем настоящего изобретения.
Как указано в настоящем описании, молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые включают нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-IL-6 антитело, могут быть, но не ограничиваются ими, молекулы, кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента антитела, саму
аминокислотную последовательность; кодирующую последовательность всего антитела или его части;
кодирующую последовательность антитела, его фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, такие как кодирующая последовательность по меньшей мере одного сигнального лидерного
или гибридного пептида вместе с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями, или без них, такими как по меньшей мере один интрон вместе с другими некодирующими последовательностями, включая, но не ограничиваясь ими, некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие
как транскрибируемые нетранслируемые последовательности, которые играют определенную роль в
транскрипции, в мРНК-процессинге, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например,
связывания с рибосомой и стабильности мРНК), и дополнительную кодирующую последовательность,
которая кодирует другие аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами. Таким образом, последовательность, кодирующая антитело, может быть присоединена к маркерной последовательности, такой как последовательность, кодирующая пептид, облегчающий очистку гибридного антитела, содержащего фрагмент или часть антитела.
Полинуклеотиды, которые селективно гибридизуются с описанным здесь полинуклеотидом
Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются с
описанным здесь полинуклеотидом в условиях селективной гибридизации. Так, например, полинуклеотиды такого варианта изобретения могут быть использованы для выделения, детекции и/или количественной оценки нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Так, например, полинуклеотиды согласно изобретению могут быть использованы для идентификации, выделения или амплификации
неполных или полноразмерных клонов в депонированной библиотеке. В некоторых вариантах изобретения указанные полинуклеотиды представляют собой выделенные геномные последовательности, или
последовательности кДНК, или другие последовательности, комплементарные кДНК, полученные из
библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.
Библиотека кДНК предпочтительно содержит по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полноразмерных последовательностей, а более предпочтительно по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеки кДНК
могут быть нормализованы на увеличение представительности редких последовательностей.
Обычно, но не исключительно, применяются условия гибридизации низкой или умеренной жесткости с использованием последовательностей, имеющих меньшую идентичность по отношению к комплементарным последовательностям. Для последовательностей с большей идентичностью могут быть, но
необязательно, использованы условия гибридизации умеренной и высокой жесткостей. Условия низкой
жесткости позволяют осуществлять селективную гибридизацию последовательностей, имеющих примерно 70%-ную идентичность, и могут быть использованы для идентификации ортологичных или паралогичных последовательностей.
Полинуклеотиды согласно изобретению кодируют, но необязательно, по меньшей мере часть антитела, кодируемого описанными здесь полинуклеотидами. Полинуклеотиды согласно изобретению включают последовательности нуклеиновой кислоты, которые могут быть использованы для селективной
гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим антитело согласно изобретению. См., например, публикации Ausubel, см. выше, и Colligan, см. выше, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Конструирование нуклеиновых кислот
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены (а) рекомбинантными методами, (b) методами синтеза, (с) методами очистки или комбинированными методами, хорошо
известными специалистам.
- 10 -
015262
Обычно нуклеиновые кислоты, помимо полинуклеотида согласно изобретению, могут содержать и
другие последовательности. Так, например, для облегчения выделения данного полинуклеотида в нуклеиновую кислоту может быть встроен сайт множественного клонирования, содержащий один или несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами. Кроме того, для облегчения выделения транслированного
полинуклеотида согласно изобретению в него могут быть встроены транслируемые последовательности.
Так, например, удобным средством для очистки белков согласно изобретению может служить гексагистидиновая маркерная последовательность. Нуклеиновой кислотой согласно изобретению, за исключением кодирующей последовательности, является, но необязательно, вектор, адаптер или линкер для
клонирования и/или экспрессии полинуклеотида согласно изобретению.
В такие клонирующие и/или экспрессирующие последовательности могут быть добавлены и другие
последовательности для оптимизации их функций при клонировании и/или экспрессии, для облегчения
выделения полинуклеотида или для облегчения введения полинуклеотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессирующих векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно специалистам
(например, Ausubel, см. выше, или Sambrook, см. выше).
Рекомбинантные методы конструирования нуклеиновых кислот
Композиции выделенных нуклеиновых кислот согласно изобретению, таких как РНК, кДНК, геномная ДНК или любая их комбинация, могут быть получены из биологических источников методами
клонирования, известными специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения для идентификации нужной последовательности в библиотеке кДНК или геномных ДНК используются олигонуклеотидные зонды, которые селективно гибридизуются с полинуклеотидами согласно изобретению в жестких условиях. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и геномных ДНК хорошо известны
специалистам (например, Ausubel, см. выше, или Sambrook, см. выше).
Методы скрининга и выделения нуклеиновых кислот
Библиотека кДНК или геномных ДНК может быть скринирована с использованием зонда, полученного на основе последовательности полинуклеотида согласно изобретению, например, описанного в настоящей заявке. Зонды могут быть использованы для гибридизации с последовательностями геномных
ДНК или кДНК в целях выделения гомологичных генов из тех же самых или различных организмов. Для
каждого специалиста очевидно, что в данном анализе может быть осуществлена гибридизация с различными условиями жесткости; при этом степень жесткости условий гибридизации может определять либо
среда для гибридизации, либо среда для промывки. По мере увеличения жесткости условий гибридизации должна увеличиваться степень комплементарности между зондом и мишенью для образования дуплекса. Степень жесткости может регулироваться одним или несколькими факторами, такими как температура, ионная сила, рН и присутствие частично денатурирующего раствора, такого как формамид. Так,
например, жесткость гибридизации обычно варьируется в зависимости от изменения полярности реакционного раствора, например при изменении концентрации формамида в пределах от 0 до 50%. Степень
комплементарности (идентичность последовательностей), необходимая для детектируемого связывания,
будет варьироваться в зависимости от жесткости среды для гибридизации и/или среды для промывки.
Оптимальная степень комплементарности равна 100% или составляет в пределах 70-100% или любой
интервал или величину в указанных пределах. Однако следует отметить, что небольшие изменения в последовательностях зондов и праймеров могут компенсироваться за счет снижения жесткости среды для
гибридизации и/или промывки.
Методы амплификации РНК или ДНК хорошо известны специалистам и могут быть использованы
в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования, а лишь исходя из описания и рекомендаций, представленных в настоящей заявке.
Известными методами амплификации ДНК или РНК являются, но не ограничиваются ими, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и аналогичные способы амплификации (см., например, патенты США
4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Mullis, et al.; 4795699 и 4921794, Tabor, et al.; 5142033, Innis;
5122464, Wilson, et al.; 5091310, Innis; 5066584, Gyllensten, et al.; 4889818, Gelfand, et al.; 4994370, Silver,
et al.; 4766067, Biswas; 4656134, Ringold) и РНК-опосредованная амплификация, в которой для последовательности-мишени используется антисмысловая РНК в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной
ДНК (патент США № 5130238, Malek et al., с торговым знаком NASBA, полное содержание которого
вводится в настоящее описание посредством ссылки) (см., например, Ausubel, см. выше, или Sambrook,
см. выше). Так, например, технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) может быть использована
для амплификации полинуклеотидных последовательностей согласно изобретению и родственных генов,
происходящих непосредственно из библиотек геномных ДНК или кДНК. ПЦР и другие методы in vitroамплификации могут быть также применены, например, для клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих экспрессируемый белок, в целях получения нуклеиновых кислот, используемых в качестве зондов для детектирования присутствия нужной мРНК в образцах, для секвенирования
нуклеиновых кислот и для других целей. Примеры методов in vitro-амплификации, которые могут быть
осуществлены любым специалистом, можно найти у Berger, см. выше, Sambrook, см. выше, и Ausubel,
см. выше, а также у Mullis et al., патент США № 4683202 (1987), и Innis et al., PCR Protocols A Guide to
Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Коммерчески доступные набо- 11 -
015262
ры для геномной ПЦР-амплификации известны специалистам. См., например, набор для ПЦР геномных
последовательностей Advantage-GC (Clontech). Кроме того, для увеличения выхода длинноцепочечных
ПЦР-продуктов может быть использован ген 32 белка Т4 (Boehringer Mannheim).
Методы синтеза для конструирования нуклеиновых кислот
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть также получены путем прямого химического синтеза известными методами (например, см. выше, Ausubel et al.). Химический синтез позволяет, в основном, продуцировать одноцепочечный олигонуклеотид, который может быть превращен в двухцепочечную ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или путем полимеризации под действием ДНК-полимеразы с использованием одной цепи в качестве матрицы.
Для каждого специалиста очевидно, что, хотя химический синтез ДНК может быть ограничен последовательностями длиной примерно в 100 или более оснований, однако могут быть получены и более длинные
последовательности путем лигирования коротких последовательностей.
Кластеры для экспрессии рекомбинантных последовательностей
Настоящее изобретение также относится к кластерам для экспрессии рекомбинантных последовательностей, содержащим нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Последовательность нуклеиновой
кислоты согласно изобретению, например кДНК или геномная последовательность, кодирующая антитело согласно изобретению, может быть использована в целях конструирования кластера для экспрессии
рекомбинантных последовательностей, который может быть введен по меньшей мере в одну нужную
клетку-хозяина. Кластер для экспрессии рекомбинантных последовательностей обычно содержит полинуклеотид согласно изобретению, функционально присоединенный к последовательностям регуляции
инициации транскрипции, которые регулируют транскрипцию полинуклеотида в нужной клетке-хозяине.
Для регуляции экспрессии нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть использованы как гетерологичные, так и негетерологичные (то есть эндогенные) промоторы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные нуклеиновые кислоты, которые
служат в качестве промотора, энхансера и других элементов, могут быть введены в соответствующее
положение (выше, ниже или в интрон) негетерологичной формы полинуклеотида согласно изобретению
так, чтобы они стимулировали или ингибировали экспрессию полинуклеотида согласно изобретению.
Так, например, эндогенные промоторы могут быть модифицированы in vivo или in vitro посредством мутации, делеции и/или замены.
Векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к векторам, включающим выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, к клеткам-хозяевам, генетически сконструированным с использованием таких рекомбинантных векторов, и к продуцированию по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела методами рекомбинантных ДНК, хорошо известными специалистам. См., например, публикации
Sambrook et al. и Ausubel et al. (см. выше), каждая из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Указанные полинуклеотиды могут быть, но необязательно, присоединены к вектору, содержащему
селективный маркер для их амплификации в хозяине. В общих чертах плазмидный вектор вводят в преципитат, такой как преципитат фосфата кальция, или в комплекс с заряженным липидом. Если вектором
является вирус, то он может быть упакован in vitro с использованием соответствующей упаковывающей
клеточной линии, а затем он может быть перенесен в клетки-хозяева.
ДНК-вставка должна быть функционально присоединена к соответствующему промотору. Экспрессирующие конструкции, кроме того, содержат сайты инициации и терминации транскрипции, а в транскрибируемой области - сайт связывания с рибосомой для инициации трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых указанными конструкциями, предпочтительно включает в начале
сайт инициации трансляции, а в конце кодон терминации (например, UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный на конце транслируемой мРНК, при этом для экспрессии в клетках
млекопитающих или в эукариотических клетках предпочтительными являются кодоны UAA и UAG.
Экспрессирующие векторы предпочтительно, но необязательно, включают по меньшей мере один
селективный маркер. Такими маркерами являются, но не ограничиваются ими, гены резистентности к
метотрексату (МТХ), ген дегидрофолатредуктазы (DHFR, патенты США №№ 4399216, 4634665,
4656134, 4956288, 5149636, 5179017), гены резистентности к ампициллину, неомицину (G418), микофеноловой кислоте или глутамин-синтетазе (GS) (патенты США №№ 5122464, 5770359, 5827739) для культивирования эукариотических клеток и гены резистентности к тетрациклину или ампициллину для культивирования в E.coli и в других бактериях или в прокариотах (все вышеупомянутые патенты вводятся в
настоящее описание посредством ссылки). Соответствующие культуральные среды и условия культивирования вышеописанных клеток-хозяев известны специалистам. Подходящие векторы могут быть легко
получены специалистом. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина может быть осуществлено
путем трансфекции фосфатом кальция; трансфекции, опосредованной DEAE-декстраном; трансфекции,
опосредованной катионным липидом; электропорации; трансдукции; инфекции или другими известными
методами. Такие методы описаны в литературе, например, у Sambrook, см. выше, главы 1-4 и 16-18, и
Ausubel, см. выше, главы 1, 9, 13, 15, 16.
- 12 -
015262
По меньшей мере одно антитело согласно изобретению может экспрессироваться в модифицированной форме, такой как гибридный белок, и может включать не только сигналы секреции, но также и
другие гетерологичные функциональные области. Так, например, для повышения стабильности и персистентности в клетке-хозяине во время очистки или в процессе последующей обработки и хранения к
N-концу антитела может быть добавлена область из дополнительных аминокислот, а в частности из заряженных аминокислот. Кроме того, для облегчения очистки к антителу согласно изобретению могут
быть добавлены пептидные молекулы. Такие области могут быть удалены перед конечным получением
антитела или по меньшей мере одного его фрагмента. Такие методы описаны во многих известных лабораторных руководствах, таких как Sambrook, см. выше, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; Ausubel, см. выше, главы 16, 17 и 18.
Каждому специалисту известно множество экспрессирующих систем, подходящих для экспрессии
нуклеиновой кислоты, кодирующей белок согласно изобретению. Альтернативно, нуклеиновые кислоты
согласно изобретению могут быть экспрессированы в клетке-хозяине путем модификации (путем манипуляции) в клетке-хозяине, которая содержит эндогенную ДНК, кодирующую антитело согласно изобретению. Эти методы хорошо известны специалистам и описаны, например, в патентах США №№ 5580734,
5641670, 5733746 и 5733671, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Примерами клеточных культур, подходящих для продуцирования антител, их конкретных фрагментов или вариантов, являются клетки млекопитающих. Клеточные системы млекопитающих часто имеют
форму монослоев клеток, хотя могут быть также использованы и суспензии клеток млекопитающих или
биореакторы. Специалистами был разработан ряд подходящих клеточных линий хозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки, и такими клеточными линиями являются COS-1 (например, ATCC CRL 1650), COS-7 (например, ATCC CRL 1651), НЕК293, ВНК21 (например, ATCC
CRL-10), CHO (например, ATCC CRL 1610) и BSK-1 (например, ATCC CRL-26), клетки COS-7, клетки
СНО, клетки hepG2, P3X63Ag8.653, Sp2/0-Ag14, клетки 293, клетки HeLa и т.п., которые могут быть взяты, например, из Американской коллекции типовых культур, Manassas, Va (www.atcc.org). Предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки лимфоидного происхождения, такие как миеломные
клетки и клетки лимфомы. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки
P3X63Ag8.653 (ATCC, per. № CRL 1580) и клетки Sp2/0-Ag14 (ATCC, per. № CRL 1851). В особенно
предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантной клеткой является клетка
P3X63Ag8.653 или клетка Sp2/0-Ag14.
Экспрессирующие векторы для этих клеток могут включать одну или несколько из нижеследующих
последовательностей регуляции экспрессии, таких как, но не ограничивающихся ими, сайт инициации
репликации, промотор (например, поздний или ранний промоторы SV40, промотор CMV (патенты США
№№ 5168062, 5385839), промотор tk HSV, промотор pgk (фосфоглицераткиназы), промотор EF-1-альфа
(патент США № 5266491), по меньшей мере один промотор человеческого иммуноглобулина, энхансер,
и/или сайты инициации процессинга, такие как сайты связывания с рибосомой, сайты сплайсинга РНК,
сайты полиаденилирования (например, сайт присоединения poly А большого Т-антигена Ag SV40) и последовательности терминации транскрипции. См., например, Ausubel, см. выше, или Sambrook, см. выше.
Другие клетки, которые могут быть использованы для продуцирования нуклеиновых кислот или белков
согласно изобретению, известны специалистам и/или могут быть взяты из каталога Американской коллекции типовых культур клеточных линий и гибридом (www.atcc.org) или из других известных или коммерчески доступных источников.
При использовании эукариотических клеток-хозяев в вектор обычно вводят последовательности
полиаденилирования или терминации транскрипции. Примером последовательности терминации является последовательность полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Могут быть также введены последовательности точного сплайсинга транскрипта. Примером последовательности сплайсинга является
интрон VP1 вируса SV40 (Sprague et al., J. Virol., 45:773-781 (1983)). Кроме того, в вектор могут быть
встроены генные последовательности для регуляции репликации в клетке-хозяине, известные специалистам.
Очистка антитела
Анти-IL-6 антитело может быть выделено и очищено из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая, но не ограничиваясь ими, очистку с использованием белка А, преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную
хроматографию, хроматографию на гидроксиапатитах и хроматографию на лектине. Для очистки может
быть также использована высокоэффективная жидкостная хроматография ("ВЭЖХ"). См. например, Colligan, Current Protocol in Immunology, or Current Protocol in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY
(1997-2001), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, 10, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Антителами согласно изобретению являются природные очищенные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из эукариотического хозяина, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хо- 13 -
015262
зяина, используемого в методе рекомбинантного продуцирования, антитело согласно изобретению может быть гликозилированным либо оно может быть негликозилированным, а предпочтительно гликозилированным. Такие методы описаны во многих известных лабораторных руководствах, таких как Sambrook, см. выше, главы 17.37-17.42; Ausubel, см. выше, главы 10, 12, 13, 16, 18 и 20; Colligan, Protein Science, см. выше, главы 12-14, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Анти-IL-6 антитела
Анти-IL-6 антитело согласно изобретению включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как, но не ограничивающуюся ими, по меньшей мере одну лигандсвязывающую часть (LBP), такую как, но не ограничивающуюся ими, гипервариабельная область (CDR) тяжелой цепи или легкой цепи или их лигандсвязывающая часть; вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасную область (например, FR1,
FR2, FR3, FR4 или их фрагмент, или последовательность, представленную в SEQ ID NO:105-112, которая
также, но необязательно, содержит по меньшей мере одну замену, инсерцию или делецию), константную
область тяжелой цепи или легкой цепи (например, содержащую по меньшей мере одну СН1, шарнирную
область 1, шарнирную область 2, шарнирную область 3, шарнирную область 4, СН2 или СН3 или их
фрагмент, также, но необязательно, содержащие по меньшей мере одну замену, инсерцию или делецию)
или любая их часть, которые могут быть включены в антитело согласно изобретению. Антителом согласно изобретению может быть антитело любого млекопитающего, либо оно может происходить от любого млекопитающего, такого как, но не ограничивающегося ими, человек, мыши, кролики, крысы, грызуны, приматы или любые их комбинации и т.п.
Выделенные антитела согласно изобретению содержат аминокислотные последовательности описанного здесь антитела или любого выделенного или продуцированного антитела, кодируемые любым
подходящим полинуклеотидом. Предпочтительно человеческое антитело или его антигенсвязывающий
фрагмент связывается с человеческим IL-6 и тем самым частично или в значительной степени нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность указанного белка. Антитело или его специфическая часть или вариант, которые частично или предпочтительно в значительной степени нейтрализуют
по меньшей мере одну биологическую активность по меньшей мере одного белка IL-6 или его фрагмента, могут связываться с указанным белком или фрагментом и тем самым ингибировать активности, опосредуемые связыванием IL-6 с рецептором IL-6, или другими IL-6-зависимыми или опосредуемыми механизмами. Используемый здесь термин "нейтрализующее антитело" означает антитело, которое может
ингибировать IL-6-зависимую активность примерно на 20-120%, а предпочтительно по меньшей мере
примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более в зависимости от используемого анализа. Способность анти-IL-6 антитела ингибировать IL-6зависимую активность предпочтительно оценивают с помощью анализа по меньшей мере на один подходящий белок IL-6 или его рецептор, как описано в настоящей заявке и/или как известно специалистам.
Человеческое антитело согласно изобретению может быть антителом любого класса (IgG, IgA, IgM, IgE,
IgD и т.д.) или изотипа и может содержать легкую цепь каппа или лямбда. В одном из вариантов изобретения человеческое антитело содержит тяжелую цепь IgG или ее конкретный фрагмент, например по
меньшей мере одного из изотипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (например, γ1, γ2, γ3 или γ4). Антитела этого типа могут быть получены с использованием трансгенной мыши или другого трансгенного животного,
не являющегося человеком, содержащих трансгены по меньшей мере одной человеческой легкой цепи
(например, IgG, IgA и IgM), описанные в настоящей заявке и/или известные специалистам. В другом варианте осуществления изобретения человеческое антитело против человеческого IL-6 содержит тяжелую
цепь IgG1 и легкую цепь IgG1.
По меньшей мере одно антитело согласно изобретению связывается по меньшей мере с одним конкретным эпитопом, специфичным по меньшей мере к одному белку IL-6, к его субъединице, фрагменту,
части или любой их комбинации. Указанный по меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере одну антителосвязывающую область, которая содержит по меньшей мере одну часть указанного белка, где указанный эпитоп предпочтительно состоит по меньшей мере из одной внеклеточной, растворимой, гидрофильной, внешней или цитоплазматической части указанного белка. Указанный по
меньшей мере один конкретный эпитоп может содержать любую комбинацию по меньшей мере из одной
аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 1-3 аминокислоты или всей конкретной части смежных аминокислот последовательности SEQ ID NO:115, например аминокислотных остатков 151-178, а более конкретно остатков 171-182.
В основном человеческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению содержит антигенсвязывающую область, которая включает по меньшей мере одну человеческую гипервариабельную область (CDR1, CDR2 и CDR3) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области
тяжелой цепи и по меньшей мере одну человеческую гипервариабельную область (CDR1, CDR2 и CDR3)
или вариант по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи. Последовательности CDR могут
происходить от последовательностей человеческой зародышевой линии или близкородственных последовательностей зародышевой линии. Так, например, могут быть использованы CDR, происходящие от
синтетической библиотеки, полученной из CDR родительской мыши. Эти CDR могут быть образованы
- 14 -
015262
путем введения в исходную мышиную последовательность консервативных замен. В качестве неограничивающего примера может служить антитело или его антигенсвязывающая часть или вариант, которые
могут содержать по меньшей мере одну CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:79, 81, 83, 85, 87, 89 и 91, и/или CDR3 легкой
цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID
NO:29, 31, 33 и 35. В конкретном варианте изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент
могут иметь антигенсвязывающую область, содержащую по меньшей мере часть по меньшей мере одной
CDR тяжелой цепи (то есть CDR1, CDR2 и/или CDR3), имеющей аминокислотную последовательность
соответствующих CDR1, 2 и/или 3 (например, SEQ ID NO:37, 49 и 79). В другом конкретном варианте
осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть или вариант могут иметь антигенсвязывающую область, содержащую по меньшей мере часть по меньшей мере одной CDR легкой цепи (то есть CDR1, CDR2 и/или CDR3), имеющей аминокислотную последовательность соответствующих
CDR1, CDR2 и/или CDR3 (например, SEQ ID NO:1, 17 и 29).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи указанного антитела или антигенсвязывающего фрагмента имеют аминокислотную последовательность соответствующей CDR по меньшей мере одного из mAb AME-A9, AME-1b, AME-18a,
AME-22a, AME-20b, АМЕ-23а и АМЕ-19а, описанных в настоящей заявке. Такие антитела могут быть
получены путем химического присоединения друг к другу различных частей антитела (например, CDR,
каркасной области) стандартными методами, либо путем продуцирования и экспрессии (то есть одной
или нескольких) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих указанное антитело, с использованием
стандартной методики рекомбинантных ДНК, либо любым другим подходящим методом.
Анти-IL-6 антитело может содержать по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой или
легкой цепи, имеющую определенную аминокислотную последовательность. Так, например, в предпочтительном варианте изобретения анти-IL-6 антитело содержит по меньшей мере одну вариабельную область по меньшей мере одной тяжелой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:95, 99, 103, 118, 122, 126 и 130, и/или по меньшей
мере одну вариабельную область легкой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:93, 97, 101, 116, 120, 124 и 128. Антитела,
которые связываются с человеческим IL-6 и которые содержат определенную вариабельную область тяжелой или легкой цепи, могут быть получены подходящими методами, такими как метод фагового представления (Katsube Y. et al., Int. J. Mol. Med., 1(5):863-868 (1988)), или методами с использованием трансгенных животных, хорошо известными специалистам и/или описанными в настоящей заявке. Так, например, трансгенная мышь, содержащая функционально реаранжированный трансген тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина и трансген, который включает ДНК локуса легкой цепи человеческого
иммуноглобулина и который может подвергаться функциональной реаранжировке, может быть иммунизована человеческим IL-6 или его фрагментом для вырабатывания антител. Если это необходимо, то могут быть выделены антителопродуцирующие клетки и могут быть получены гибридомы или другие иммортализованные антителопродуцирующие клетки, как описано в настоящей заявке и/или как известно
специалистам. Альтернативно, указанное антитело, его конкретная часть или вариант могут быть экспрессированы с использованием кодирующей нуклеиновой кислоты или ее части в подходящей клеткехозяине.
Коды аминокислот
Аминокислоты, которые составляют анти-IL-6 антитела согласно изобретению, часто обозначаются
аббревиатурами. Такие обозначения аминокислот могут быть представлены однобуквенным кодом,
трехбуквенным кодом, их названием или кодоном(ами) из трех нуклеотидов, хорошо известными специалистам (см. Alberts, В. et al., Molecular Biology of The Cell., Third Ed., Garland Publishing, Inc., New
York, 1994).
Анти-IL-6 антитело согласно изобретению может включать одну или несколько замен, делеций или
добавлений аминокислот, образующихся либо в результате природных мутаций, либо вносимых искусственно путем модификаций, как описано в настоящей заявке. Аминокислоты в анти-IL-6 антителе согласно изобретению, которые играют главную роль в его функционировании, могут быть идентифицированы известными методами, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (например, Ausubel, см. выше, главы 8, 15; Cunningham & Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). Проведение последней процедуры позволяет вводить единичные аланиновые мутации в каждом остатке молекулы. Затем полученные мутантные молекулы тестируют на биологическую активность, такую как, но
не ограничивающуюся ею, по меньшей мере одна IL-6-нейтрализующая активность. Сайты, которые играют решающую роль в связывании с антителом, могут быть также идентифицированы с помощью
структурного анализа, такого как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или фотоаффинное мечение (Smith et al., J. Mol. Biol., 224:899-904 (1992) и de Vos et al., Science, 255:306-312 (1992)).
Анти-IL-6 антитела согласно изобретению могут включать, но не ограничиваются ими, по меньшей
мере одну часть, последовательность или комбинацию, включающую от 5 и более или все смежные аминокислоты по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO:91, 93, 95, 97, 99 и т.п.
- 15 -
015262
Неограничивающими вариантами, которые могут усиливать или поддерживать по меньшей мере
одну из перечисленных активностей, являются, но не ограничиваются ими, любой из вышеуказанных
полипептидов, которые также имеют по меньшей мере одну мутацию, соответствующую по меньшей
мере одной замене в остатках, отличающихся во всех описанных вариантах аминокислотных последовательностей.
Кроме того, анти-IL-6 антитело может, но необязательно, содержать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности, состоящей из смежных аминокислот по меньшей мере одной из SEQ ID NO:95, 99 и 103 и т.п. (например, отличающуюся от описанных здесь последовательностей одной или несколькими консервативными заменами). Кроме того, настоящее изобретение включает варианты аминокислотной последовательности вариабельной области
легкой цепи SEQ ID NO:93, 97 или 101 или аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID
NO:79, 81, 83, 85, 87, 89 или 91.
Для каждого специалиста очевидно, что настоящее изобретение включает по меньшей мере одно
биологически активное антитело согласно изобретению. Биологически активные антитела обладают
удельной активностью, составляющей по меньшей мере 20, 30 или 40%, а предпочтительно по меньшей
мере 50, 60 или 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 90 или 95-1000% или более от
активности природного (несинтезированного), эндогенного, родственного и известного антитела. Методы анализа и количественной оценки ферментативной активности и специфичности к субстрату хорошо
известны специалистам.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к человеческим антителам и к их антигенсвязывающим фрагментам, описанным в настоящей заявке, которые были модифицированы посредством ковалентного связывания с органической молекулой. В результате такой модификации могут быть
продуцированы антитела или антигенсвязывающие фрагменты с улучшенными фармакокинетическими
свойствами (например, с повышенным временем полужизни в сыворотке in vivo). Органической молекулой может быть прямая или разветвленная гидрофильная полимерная группа, группа жирной кислоты
или группа сложного эфира жирной кислоты. В конкретных вариантах изобретения гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу примерно от 800 до 120000 Да, и такой группой может
быть полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль (ППГ)), углеводный полимер, аминокислотный полимер или поливинилпирролидон, а группа жирной кислоты или группа сложного эфира жирной кислоты может содержать примерно от восьми до сорока атомов углерода.
Модифицированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению могут содержать одну или несколько органических молекул, которые ковалентно связаны, прямо или опосредованно, с данным антителом. Каждая органическая молекула, связанная с антителом или антигенсвязывающим фрагментом согласно изобретению, может независимо представлять собой гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу сложного эфира жирной кислоты. Используемый
здесь термин "жирная кислота" охватывает монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. Используемый здесь термин "гидрофильная полимерная группа" означает органический полимер, который является более растворимым в воде, чем в октане. Так, например, полилизин является более растворимым в
воде, чем в октане. Таким образом, в объем согласно изобретению входит антитело, модифицированное
путем ковалентного связывания с полилизином. Гидрофильными полимерами, подходящими для модификации антител согласно изобретению, могут быть прямые или разветвленные полимеры, и такими полимерами являются, например, полиалкангликоли (например, ПЭГ, монометокси-полиэтиленгликоль
(мПЭГ), ППГ и т.п.), углеводы (например, декстран, целлюлоза, олигосахариды, полисахариды и т.п.),
полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т.п.), полиалканоксиды (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинилпирролидон. Предпочтительно, чтобы гидрофильный полимер, который модифицирует антитело согласно изобретению,
имел молекулярную массу примерно от 800 до 150000 Да в виде отдельной молекулярной частицы. Так,
например, могут быть использованы ПЭГ5000 и ПЭГ20000, где нижний индекс означает среднюю молекулярную массу полимера в Да. Гидрофильная полимерная группа может быть замещена примерно 1-6
алькильными группами, группами жирной кислоты или группами эфира жирной кислоты. Гидрофильные
полимеры, замещенные группой жирной кислоты или группой сложного эфира жирной кислоты, могут
быть получены подходящими методами. Так, например, полимер, содержащий аминогруппу, может быть
связан с карбоксилатом жирной кислоты или эфиром жирной кислоты, а активированный карбоксилат
(например, активированный N,N-карбонилдиимидазолом) на жирной кислоте или на сложном эфире
жирной кислоты может быть связан с гидроксильной группой на полимере.
Жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот, подходящие для модификации антител согласно изобретению, могут быть либо насыщенными, либо они могут содержать одну или несколько ненасыщенных групп. Жирными кислотами, подходящими для модификации антител согласно изобретению,
являются, например, н-додеканоат (C12, лаурат), н-тетрадеканоат (С14, миристат), н-октадеканоат (C18,
стеарат), н-эйкозаноат (C20, арахидат), н-докозаноат (С22, бегенат), н-триаконтаноат (С30), н-тетраконтаноат (С40), цис-Δ9-октадеканоат (C18, олеат), все цис-Δ5,8,11,14-эйкозатетраеноаты (С20, арахидонат),
октандионовая кислота, тетрадекандионовая кислота, октадекандионовая кислота, докозандионовая ки- 16 -
015262
слота и т.п. Подходящими сложными эфирами жирных кислот являются сложные моноэфиры дикарбоновых кислот, содержащие прямую или разветвленную низшую алкильную группу. Низшая алкильная
группа может содержать примерно от одного до двенадцати, а предпочтительно примерно от одного до
шести атомов углерода.
Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены подходящими методами, например, посредством взаимодействия с одним или несколькими модифицирующими агентами. Используемый здесь термин "модифицирующий агент" означает подходящую
органическую группу (например, гидрофильный полимер, жирную кислоту, сложный эфир жирной кислоты), содержащую активирующую группу. "Активирующая группа" представляет собой химическую
молекулу или функциональную группу, которая, в соответствующих условиях, может реагировать со
второй химической группой, образуя тем самым ковалентную связь между модифицирующим агентом и
второй химической группой. Так, например, реагирующими с амином активирующими группами являются электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), N-гидроксисукцинимидиловые сложные эфиры (NHS) и т.п. Активирующими группами, которые могут реагировать с тиолами, являются, например, малеимид, йодацетил, акрилоил, пиридилдисульфиды, 5-тиол-2нитробензойная кислота-тиол (TNB-тиол) и т.п. Альдегидная функциональная группа может быть присоединена к амино- или гидразидсодержащим молекулам, а азидная группа может реагировать с трехвалентной группой фосфористой кислоты с образованием фосфорамидатных или фосфоримидных связей.
Подходящие методы введения активирующих групп в молекулы известны специалистам (см., например,
Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Активирующая группа
может быть непосредственно связана с органической группой (например, с гидрофильным полимером,
жирной кислотой, сложным эфиром жирной кислоты), или она может быть связана посредством линкерной группы, например двухвалентной C1-C12-группы, где один или несколько атомов углерода могут
быть заменены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. Подходящими линкерными группами
являются, например, тетраэтиленгликоль, -(СН2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- и CH2-O-CH2-CH2-OCH2-CH2-O-CH-NH-.
Модифицирующие агенты, содержащие линкерную группу, могут быть продуцированы, например,
посредством реакции взаимодействия моно-Вос-алкилдиамина (например, моно-Вос-этилендиамина,
моно-Вос-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиаминопропил)карбодиимида (EDC) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом
жирной кислоты. Защитная группа Вос может быть удалена из указанного продукта путем обработки
трифторуксусной кислотой (TFA) с получением первичного амина, который может быть связан с другим
карбоксилатом, как описано в настоящей заявке, либо он может быть подвергнут реакции с малеиновым
ангидридом, после чего полученный продукт подвергают реакции циклизации с получением активированного малеимидо-производного жирной кислоты (см., например, заявку Thompson et al., WO 92/16221,
которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Модифицированные антитела согласно изобретению могут быть продуцированы путем реакции человеческого антитела или антигенсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Так, например,
органические молекулы могут быть связаны с антителом несайтспецифическим способом, а с использованием реагирующего с амином модифицирующего агента, например NHS-эфира ПЭГ. Модифицированные человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть также получены путем
восстановления дисульфидных связей (например, внутрицепьевых дисульфидных связей) антитела или
антигенсвязывающего фрагмента.
Восстановленное антитело или восстановленный антигенсвязывающий фрагмент могут быть затем
подвергнуты реакции с модифицирующим агентом, способным реагировать с тиолом, с продуцированием модифицированного антитела согласно изобретению.
Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие органическую группу, связанную со специфическими сайтами антитела согласно изобретению, могут быть
получены подходящими методами, такими как обратный протеолиз (Fisch et al., Bioconjugate Chem.,
3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):
2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56
(4):456-463 (1997)), и методами, описанными Hermanson, G.Т., Bioconjugate Techniques, Academic Press:
San Diego, CA (1996).
Антиидиотипические антитела против композиций анти-IL-6 антител
Помимо моноклональных анти-IL-6 антител настоящее изобретение также относится к антиидиотипическому (анти-Id) антителу, специфичному к указанным антителам согласно изобретению. Анти-Id
антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающей областью другого антитела. Анти-Id антитело может быть получено
путем иммунизации животного такого же вида и генетического типа (например, мышиной линии), как и
источник анти-Id антитела, данным антителом или его CDR-содержащей областью. Иммунизованное
животное будет распознавать и отвечать на идиодипические детерминанты иммунизирующего антитела,
и продуцировать анти-Id антитело. Анти-Id антитело может быть также использовано в качестве "имму- 17 -
015262
ногена" для индуцирования иммунного ответа у других животных с продуцированием так называемого
анти-анти-Id антитела.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции анти-IL-6 антител,
содержащей по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более анти-IL-6 антител, описанных в настоящей
заявке и/или известных специалистам, которые присутствуют в виде не встречающейся в природе композиции, смеси или формы. Такие композиции включают неприродные композиции, содержащие по меньшей мере один или два полноразмерных, делетированных по С- и/или N-концу вариантов, доменов,
фрагментов или конкретных вариантов аминокислотной последовательности анти-IL-6 антитела, выбранных из группы, состоящей из 70-100% смежных аминокислот последовательностей SEQ ID NO:1114 и 116-138 или их конкретных фрагментов, доменов или вариантов. Предпочтительные композиции
анти-IL-6 антител включают по меньшей мере один или два полноразмерных фрагмента, домена или варианта в виде по меньшей мере одной из CDR или LBR-содержащих частей описанной здесь последовательности анти-IL-6 антитела, составляющих, например, 70-100% от SEQ ID NO:15, 27, 35, 47, 61 и 91,
или их конкретных фрагментов, доменов или вариантов. Более предпочтительные композиции включают, например, 40-99% по меньшей мере одной из последовательностей, которая составляет по меньшей
мере 70-100% от последовательностей SEQ ID NO:93, 95, 97, 99, 101, 103 и т.п. или их конкретных фрагментов, доменов или вариантов. Указанные проценты композиции даны по массе, объему, концентрации,
молярности или моляльности жидких или сухих растворов, смесей, суспензий, эмульсий, частиц, порошков или коллоидов, известных специалистам или описанных в настоящей заявке.
Композиции антител, содержащие дополнительные терапевтически активные ингредиенты
Композиции антител согласно изобретению могут также содержать, но необязательно, эффективное
количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранных из таких соединений, как противоинфекционное лекарственное средство; лекарственное средство, воздействующее на сердечнососудистую (СС) систему; лекарственное средство, воздействующее на центральную нервную систему
(ЦНС); лекарственное средство, воздействующее на вегетативную нервную систему (ВНС); лекарственное средство для лечения заболеваний дыхательных путей; лекарственное средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖК); гормональное лекарственное средство; лекарственное средство для регуляции водно-солевого баланса; гематологическое лекарственное средство; противоопухолевое
лекарственное средство; иммуномодулирующее лекарственное средство; офтальмическое лекарственное
средство; лекарственное средство для лечения заболеваний уха или носа; лекарственное средство для
местного применения; натуральное лекарственное средство или т.п. Такие лекарственные средства, а
также состав, показания, дозы и способы введения каждого из этих лекарственных средств хорошо известны специалистам (см., например, публикации Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, каждая из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Противоинфекционным лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из амебоцидов или антипротозойных средств, противоглистных средств, противогрибковых
средств, противомалярийных средств, противотуберкулезных средств, средств против проказы или аминогликозидов, пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов, сульфонамидов, фторхинолонов, противовирусных средств, макролидных противоинфекционных средств и противоинфекционных средств
смешанного действия. Сердечно-сосудистым (СС) лекарственным средством может быть по меньшей
мере одно средство, выбранное из инотропных средств, средств против аритмии, средств против стенокардии, гипотензивных средств, средств против гиперлипемии и сердечно-сосудистых средств смешанного действия. Лекарственным средством, воздействующим на центральную нервную систему (ЦНС),
может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ненаркотических аналгетиков, или по меньшей мере одно средство, выбранное из антипиретиков, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, наркотических или опиоидных аналгетиков, седативно-гипнотических средств, противосудорожных средств, антидепрессантов, анксиолитических средств, антипсихотических средств, средств,
стимулирующих центральную нервную систему, средств против паркинсонизма и лекарственных
средств, оказывающих смешанное действие на центральную нервную систему. Лекарственным средством, воздействующим на вегетативную нервную систему (ВНС), может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из холинергических средств (парасимпатомиметиков), антихолинергических
средств, адренергических средств (симпатомиметиков), адренергических блокаторов (симпатолитических средств), релаксантов скелетных мышц и нейромиоблокаторов. Лекарственным средством для лечения респираторных заболеваний может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из антигистаминов, бронходилататоров, отхаркивающих средств или средств от кашля и средств для лечения респираторных заболеваний смешанного действия. Лекарственным средством для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из антацидов,
адсорбентов, ветрогонных средств, пищеварительных ферментов, растворителей желчных камней,
средств против диареи, слабительных средств, противорвотных средств и средств против язвы. Гормо- 18 -
015262
нальным лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кортикостероидов, андрогенов, анаболических стероидов, эстрогенов, прогестинов, гонадотропинов, антидиабетических лекарственных средств, и по меньшей мере одно средство, выбранное из глюкагона, тиреотропных гормонов, антагонистов тиреотропных гормонов, гипофизарных гормонов и паратиреоидподобных лекарственных средств. Лекарственным средством для регуляции водно-солевого баланса может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из диуретиков, электролитов, растворовзаменителей, окислителей и подщелачивающих средств. Гематологическим лекарственным средством
может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из лекарственных средств, повышающих уровень гемоглобина в крови, антикоагулянтов, компонентов крови и тромболитических ферментов. Противоопухолевым лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из алкилирующих лекарственных средств, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, противоопухолевых средств, изменяющих гормональный баланс, и противоопухолевых средств смешанного действия. Иммуномодулирующим лекарственным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из иммунодепрессантов, вакцин, токсоидов, антитоксинов, противоядий, иммунных сывороток и
модификаторов биологического ответа. Офтальмическим лекарственным средством и лекарственным
средством для лечения заболеваний уха и носа может быть по меньшей мере одно средство, выбранное
из офтальмических противоинфекционных средств, офтальмических противовоспалительных средств,
миотических средств, мидриатических средств, офтальмических сосудосуживающих средств и офтальмических средств и средств для лечения заболеваний уха и носа смешанного действия. Лекарственным
средством для местного применения может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из противоинфекционных средств для местного применения, противочесоточных средств, средств против педикулеза и кортикостероидов для местного применения. Натуральным лекарственным средством может
быть по меньшей мере одно средство, выбранное из витаминов, микроэлементов или калорийных веществ. См., например, руководство Nursing 2001 Drug Handbook, см. выше.
По меньшей мере одним амебоцидом или антипротозойным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из атоваквона, гидрохлорида хлорохина, фосфата хлорохина, метронидазола, гидрохлорида метронидазола и изетионата пентамидина. По меньшей мере одним противоглистным
средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из мебендазола, памоата пирантела и
тиабендазола. По меньшей мере одним противогрибковым средством может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из амфотерицина В, комплекса "амфотерицин В-холестерилсульфат", комплекса
"амфотерицин В-липид", липосомного афмотерицина В, флуконазола, флуцитозина, гризеофульвина в
микроскопических количествах, гризеофульвина в ультрамикроскопических количествах, итраконазола,
кетоконазола, нистатина и гидрохлорида тербинафина. По меньшей мере одним противомалярийным
средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида хлорохина, фосфата
хлорохина, доксициклина, сульфата гидроксихлорохина, гидрохлорида мефлохина, фосфата примахина,
пириметамина и пириметамина в комбинации с сульфадоксином. По меньшей мере одним противотуберкулезным средством или средством против проказы может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из клофазимина, циклосерина, дапсона, гидрохлорида этамбутола, изониазида, пиразинамида,
рифабутина, рифампина, рифапентина и сульфата стрептомицина. По меньшей мере одним аминогликозидом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата амикацина, сульфата гентамицина, сульфата неомицина, сульфата стрептомицина и сульфата тобрамицина. По меньшей мере одним пенициллиновым составом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из калиевой соли амоксициллина/клавуланата, тригидрата амоксициллина, ампициллина, натриевой соли ампициллина,
тригидрата ампициллина, натриевой соли ампициллина/натриевой соли сульбактама, натриевой соли
клоксациллина, натриевой соли диклоксациллина, натриевой соли мезлоциллина, натриевой соли нафциллина, натриевой соли оксациллина, бензатинсодержащего пенициллина G, калиевой соли пенициллина G, прокаинсодержащего пенициллина G, натриевой соли пенициллина G, калиевой соли пенициллина V, натриевой соли пиперациллина, натриевой соли пиперациллина/натриевой соли тазобактама,
динатриевой соли тикарциллина и динатриевой соли тикарциллина/калиевой соли клавуланата. По
меньшей мере одним цефалоспорином может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из цефаклора, цефадроксила, натриевой соли цефазолина, цефдинира, гидрохлорида цефепима, цефиксима, натриевой соли цефметазола, натриевой соли цефоницида, натриевой соли цефоперазона, динатриевой соли цефотаксима, натриевой соли цефотетана, натриевой соли цефокситина, цефподоксим-проксетила,
цефпрозила, цефтазидима, цефтибутена, натриевой соли цефтизоксима, натриевой соли цефтриаксона,
цефуроксим-аксетила, натриевой соли цефуроксима, гидрохлорида цефалексина, моногидрата цефалексина, цефрадина, лоракарбефа. По меньшей мере одним тетрациклином может быть по меньшей мере
одно средство, выбранное из гидрохлорида демеклоциклина, кальциевой соли доксициклина, гиклата
доксициклина, гидрохлорида доксициклина, моногидрата доксициклина, гидрохлорида миноциклина и
гидрохлорида тетрациклина. По меньшей мере одним сульфонамидом может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из котримоксазола, сульфадиазина, сульфаметоксазола, сульфизоксазола и ацетилсульфизоксазола. По меньшей мере одним фторхинолоном может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из мезилата алатрофлоксацина, ципрофлоксацина, эноксацина, левофлоксацина, гидрохлори- 19 -
015262
да ломефлоксацина, налидиксовой кислоты, норфлоксацина, офлоксацина, спарфлоксацина и мезилата
тровафлоксацина. По меньшей мере одним противовирусным средством может быть по меньшей мере
одно средство, выбранное из сульфата абакавира, натриевой соли ацикловира, гидрохлорида амантадина,
ампренавира, цидофовира, мезилата делавирдина, диданозина, эфавиренца, фамцикловира, натриевой
соли фомивирсена, натриевой соли фоскарнета, ганцикловира, сульфата индинавира, ламивудина, ламивудина/зидовудина, мезилата нелфинавира, невирапина, фосфата озелтамивира, рибавирина, гидрохлорида римантадина, ритонавира, саквинавира, мезилата саквинавира, ставудина, гидрохлорида валацикловира, зальцитабина, занамивира и зидовудина. По меньшей мере одним макролидным противоинфекционным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из азитромицина, кларитромицина, диритромицина, эритромицинового основания, эстолата эритромицина и этилсукцината эритромицина, лактобионата эритромицина, стеарата эритромицина. По меньшей мере одним противоинфекционным средством смешанного действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из астреонама, бацитрацина, натриевой соли сукцината хлорамфеникола, гидрохлорида клиндамицина, гидрохлорида пальмитата клиндамицина, фосфата клиндамицина, натриевой соли имипенема и циластатина,
меропенема, макрокристаллов нитрофурантоина, микрокристаллов нитрофурантоина, хинупристина/далфопристина, гидрохлорида спектиномицина, триметоприма и гидрохлорида ванкомицина (см.,
например, p. 24-214, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним инотропным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из лактата амринона, дигоксина и лактата милринона. По меньшей мере одним средством против аритмии может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из аденозина, гидрохлорида амиодарона, сульфата атропина, тозилата бретилия, гидрохлорида дилтиазема, дизопирамида, фосфата дизопирамида, гидрохлорида эсмолола, ацетата флекаинида, фумарата ибутилида, гидрохлорида лидокаина,
гидрохлорида мексилетина, гидрохлорида морицизина, фенитоина, натриевой соли фенитоина, гидрохлорида прокаинамида, гидрохлорида пропафенона, гидрохлорида пропранолола, бисульфата хинидина,
глюконата хинидина, полигалактуроната хинидина, сульфата хинидина, соталола, гидрохлорида токаинида, гидрохлорида верапамила. По меньшей мере одним средством против стенокардии может быть по
меньшей мере одно средство, выбранное из безилата амлодипидина, амилнитрита, гидрохлорида бепридила, гидрохлорида дилтиазема, динитрата изосорбида, мононитрата изосорбида, надолола, гидрохлорида никардипина, нифедипина, нитроглицерина, гидрохлорида пропранолола, верапамила и гидрохлорида
верапамила. По меньшей мере одним гипотензивным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида ацебутолола, безилата амлодипина, атенолола, гидрохлорида беназеприла, гидрохлорида бетаксолола, фумарата бизопролола, кандесартанцилетексила, каптоприла, гидрохлорида картеолола, карведилола, клонидина, гидрохлорида клонидина, диазоксида, гидрохлорида дилтиазема, мезилата доксазоцина, эналаприлата, малеата эналаприла, мезилата эпросартана, фелодипина,
мезилата фенолдопама, натриевой соли фозиноприла, ацетата гуанабенза, сульфата гуанадрела, гидрохлорида гуанфацина, гидрохлорида гидралазина, ирбесартана, исрадипина, гидрохлорида лабеталола,
лизиноприла, калиевой соли лозартана, метилдопы, гидрохлорида метилдопата, сукцината метопролола,
тартрата метопролола, миноксидила, гидрохлорида моэксипила, надолола, гидрохлорида никардипина,
нифедипина, низолдипина, нитропруссида натрия, сульфата пенбутолола, периндоприлэрбумина, мезилата фентоламина, пиндолола, гидрохлорида празозина, гидрохлорида пропранолола, гидрохлорида хинаприла, рамиприла, телмисартана, гидрохлорида теразозина, малеата тимололпа, трандолаприла, валсартана и гидрохлорида верапамила. По меньшей мере одним средством против гиперлипемии может
быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кальциевой соли аторвастатина, натриевой соли церивастатина, холестирамина, гидрохлорида колестипола, фенофибрата (измельченного в порошок), натриевой соли флувастатина, гемфиброзила, ловастатина, ниацина, натриевой соли правастатина и симвастатина. По меньшей мере одним сердечно-сосудистым (СС) средством смешанного действия может
быть по меньшей мере одно средство, выбранное из абциксимаба, алпростадила, гидрохлорида арбутамина, цилостазола, бисульфата клопидогреля, дипиридамола, эптифибатида, гидрохлорида мидодрина,
пентоксифиллина, гидрохлорида тиклопидина и гидрохлорида тирофибана (см., например, p. 215-336,
Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним ненаркотическим аналгетиком или антипиретиком может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетаминофена, аспирина, магнийсодержащего трисалицилата
холина, дифлунизала и салицилата магния. По меньшей мере одним нестероидным противовоспалительным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из целекоксиба, диклофенаккалия, диклофенак-натрия, этодолака, фенопрофен-кальция, флурбипрофена, ибупрофена, индометацина,
натриевой соли тригидрата индометацина, кетопрофена, кеторолака, трометамина, набуметона, напроксена, напроксен-натрия, оксапрозина, пироксикама, рофекоксиба и сулиндака. По меньшей мере одним
наркотическим или опиоидным аналгетиком может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из
гидрохлорида алфентанила, гидрохлорида бупренорфина, тартрата буторфанола, фосфата кодеина, сульфата кодеина, цитрата фентанила, фентанила для системного чрескожного введения, фентанила для введения через слизистую, гидрохлорида гидроморфона, гидрохлорида мепередина, гидрохлорида метадона,
гидрохлорида морфина, сульфата морфина, тартрата морфина, гидрохлорида налбуфина, гидрохлорида
- 20 -
015262
оксикодона, пектината оксикодона, гидрохлорида оксоморфона, гидрохлорида пентазоцина, гидрохлорида пентазоцина и гидрохлорида налоксона, лактата пентазоцина, гидрохлорида пропоксифена, напсилата
пропоксифена, гидрохлорида ремифентанила, цитрата суфентанила и гидрохлорида трамадола. По
меньшей мере одним седативно-гипнотическим средством может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из хлоралгидрата, эстазолама, гидрохлорида флуразепама, пентобарбитала, пентобарбиталнатрия, фенобарбитал-натрия, секобарбитал-натрия, темазепама, триазолама, залеплона и тартрата золпидема. По меньшей мере одним противосудорожным средством может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из ацетазоламид-натрия, карбамазепина, клоназепама, дикалиевой соли клоразепата, диазепама, дивалпроэкс-натрия, этосуксимида, фосфенитоин-натрия, габапентина, ламотригина,
сульфата магния, фенобарбитала, фенобарбитал-натрия, фенитоина, фенитоин-натрия, фенитоин-натрия
(пролонгированного действия), примидона, гидрохлорида тиагабина, топирамата, валпроата натрия и
валпроевой кислоты. По меньшей мере одним антидепрессантом может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из гидрохлорида амитриптилина, памоата амитриптилина, амоксапина, гидрохлорида бупропиона, гидробромида циталопрама, гидрохлорида кломипрамина, гидрохлорида дезипрамина,
гидрохлорида доксепина, гидрохлорида флуоксетина, гидрохлорида имипрамина, памоата имипрамина,
миртазапина, гидрохлорида нефазодона, гидрохлорида нортриптилина, гидрохлорида пароксетина, сульфата фенелзина, гидрохлорида сертралина, сульфата транилципромина, малеата тримипрамина и гидрохлорида венлафаксина. По меньшей мере одним анксиолитическим средством может быть по меньшей
мере одно средство, выбранное из алпразолама, гидрохлорида буспирона, хлордиазэпоксида, гидрохлорида хлордиазэпоксида, дикалиевой соли клоразепата, диазепама, гидрохлорида доксепина, эмбоната
гидроксизина, гидрохлорида гидроксизина, памоата гидроксизина, лоразепама, мефробамата, гидрохлорида мидазолама и оксазепама. По меньшей мере одним антипсихотическим средством может быть по
меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида хлорпромазина, клозапина, деканоата флуфеназина, энантата флуфеназина, гидрохлорида флуфеназина, галоперидола, деканоата галоперидола, лактата галоперидола, гидрохлорида локсапина, сукцината локсапина, безилата мезоридазина, гидрохлорида
молиндона, оланзапина, перфеназина, пимозида, прохлорперазина, фумарата кветиапина, рисперидона,
гидрохлорида тиоридазина, тиотиксена, гидрохлорида тиотиксена и гидрохлорида трифторперазина. По
меньшей мере одним стимулятором центральной нервной системы может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из сульфата амфетамина, кофеина, сульфата декстроамфетамина, гидрохлорида
доксапрама, гидрохлорида метамфетамина, гидрохлорида метилфенидата, модафинила, пемолина и гидрохлорида фентермина. По меньшей мере одним средством против паркинсонизма может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида амантадина, мезилата бензтропина, гидрохлорида
биперидена, лактата биперидена, мезилата бромкриптина, карбидопы-леводопы, энтакапона, леводопы,
мезилата перголида, дигидрохлорида прамипексола, гидрохлорида ропинирола, гидрохлорида селегилина, толкапона и гидрохлорида тригексифенидила. По меньшей мере одним лекарственным средством,
оказывающим смешанное действие на центральную нервную систему, может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида бупропиона, гидрохлорида донепезила, дроперидола, малеата
флувоксамина, карбоната лития, цитрата лития, гидрохлорида наратриптана, никотинполакрилекса, никотина для системного чрескожного введения, пропофола, бензоата ризатриптана, моногидрата гидрохлорида сибутрамина, сукцината суматриптана, гидрохлорида такрина и золмитриптана (см., например,
p. 337-530, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним холинергическим (например, парасимпатомиметическим) средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из хлорида бетанхола, хлорида эдрофония, бромида неостигмина, метилсульфата неостигмина, салицилата физостигмина и бромида пиридостигмина. По
меньшей мере одним антихолинергическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата атропина, гидрохлорида дицикломина, гликопирролата, гиосциамина, сульфата гиосциамина, бромида пропантелина, скополамина, бутилбромида скополамина и гидробромида скополамина. По меньшей мере одним адренергическим (симпатомиметическим) средством может быть по
меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлоридаа добутамина, гидрохлорида допамина, битартрата метараминола, битартрата норэпинефрина, гидрохлорида фенилэфрина, гидрохлорида псевдоэфедрина и сульфата псевдоэфедрина. По меньшей мере одним блокатором адренергических рецепторов
(симпатолитическим средством) может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из мезилата
дигидроэрготамина, тартрата эрготамина, малеата метизергида и гидрохлорида пропранолола. По меньшей мере одним релаксантом скелетной мышцы может быть по меньшей мере одно средство, выбранное
из баклофена, каризопродола, хлорзоксазона, гидрохлорида циклобензаприна, дантролен-натрия, метокарбамола и гидрохлорида тизанидина. По меньшей мере одним нейромышечным блокатором может
быть по меньшей мере одно средство, выбранное из безилата атракуриума, безилата цис-атракуриума,
хлорида доксакуриума, хлорида мивакуриума, бромида панкурония, бромида пипекурония, бромида рапакурония, бромида рокурония, хлорида сукцинилхолина, хлорида тубокурарина и бромида векурония.
(см., например, p. 531-84, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним антигистаминовым средством может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из малеата бромфенирамина, гидрохлорида цетризина, малеата хлорфенирамина, фумарата
- 21 -
015262
клемастина, гидрохлорида ципрогептадина, гидрохлорида дифенгидрамина, гидрохлорида фексофенадина, лоратадина, гидрохлорида прометазина, теоклата прометазина и гидрохлорида трипролидина. По
меньшей мере одним бронходилататором может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из
альбутерола, сульфата альбутерола, аминофиллина, сульфата атропина, сульфата эфедрина, эпинефрина,
битартрата эпинефрина, гидрохлорида эпинефрина, бромида ипратропия, изопротеренола, гидрохлорида
изопротеренола, сульфата изопротеренола, гидрохлорида левалбутерола, сульфата метапротеренола, окстрифиллина, ацетата пирбутерола, ксинафоата сальметерола, сульфата тербуталина и теофиллина. По
меньшей мере одним отхаркивающим средством или средством против кашля может быть по меньшей
мере одно средство, выбранное из банзонатата, фосфата кодеина, сульфата кодеина, гидробромида декстраметорфана, гидрохлорида дифенилгидрамина, гвайфенезина и гидрохлорида гидроморфона. По
меньшей мере одним лекарственным средством для лечения респираторных заболеваний смешанного
действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетилцистеина, дипропионата беклометазона, берактанта, будезонида, кальфактанта, кромолин-натрия, дорназы-альфа, эпопростенолнатрия, флунизолида, пропионата флутиказона, монтелукаст-натрия, недокромил-натрия, паливизумаба,
ацетонида триамцинолона, зафирлукаста и зилейтона (см., например, p. 585-642, Nursing, 2001, Drug
Handbook).
По меньшей мере одним антацидом, адсорбентом или ветрогонным средством может быть по
меньшей мере одно средство, выбранное из карбоната алюминия, гидроксида алюминия, карбоната кальция, магалдрата, гидроксида магния, оксида магния, симетикона и бикарбоната натрия. По меньшей мере
одним гидролизующим ферментом или растворителем желчных камней может быть по меньшей мере
одно средство, выбранное из панкреатина, панкрелипазы и урсодиола. По меньшей мере одним средством против диареи может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из аттапульгита, субсалицилата висмута, поликарбофил-кальция, гидрохлорида дифеноксилата и сульфата атропина, лоперамида,
ацетата октреотида, опийной настойки и опийной настойки с камфорой. По меньшей мере одним слабительным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из бизокодила, поликарбофил-кальция, cascara sagrada (жостера Пурша), ароматического жидкого экстракта cascara sagrada, жидкого экстракта cascara sagrada, касторового масла, докузат-кальция, докузат-натрия, глицерина, лактулозы, цитрата магния, гидроксида магния, сульфата магния, метилцеллюлозы, минерального масла, полиэтиленгликоля или раствора электролита, псиллиума (подорожника блошиного), сенны и фосфатов натрия. По меньшей мере одним противорвотным средством может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из гидрохлорида хлорпромазина, дименгидрината, мезилата долазетрона, дронабинола, гидрохлорида гранисетрона, гидрохлорида меклизина, гидрохлорида метоклопроамида, гидрохлорида ондансетрона, перфеназина, прохлорперазина, эдисилата прохлорперазина, малеата прохлорперазина, гидрохлорида прометазина, скополамина, малеата тиэтилперазина и гидрохлорида триметобензамида. По
меньшей мере одним средством против язвы является по меньшей мере одно средство, выбранное из циметидина, гидрохлорида циметидина, фамотидина, ланзопразола, мизопростола, низатидина, омепразола,
рабепрозол-натрия, цитрата ранитидина-висмута, гидрохлорида ранитидина и сукралфата (см., например,
p. 643-95, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним кортикостероидом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное
из бетаметазона, ацетата бетаметазона или фосфата бетаметазона-натрия, фосфата бетаметазона-натрия,
ацетата кортизона, дексаметазона, ацетата дексаметазона, фосфата дексаметазона-натрия, ацетата флудрокортизона, гидрокортизона, ацетата гидрокортизона, ципионата гидрокортизона, фосфата гидрокортизона-натрия, сукцината гидрокортизона-натрия, метилпреднизолона, ацетата метилпреднизолона, сукцината метилпреднизолона-натрия, преднизолона, ацетата преднизолона, фосфата преднизолона-натрия,
тебутата преднизолона, преднизона, триамцинолона, ацетонида триамцинолона и диацетата триамцинолона. По меньшей мере одним андрогеном или анаболическим стероидом может быть по меньшей мере
одно средство, выбранное из даназола, флуоксиместерона, метилтестостерона, деканоата нандролона,
фенпропионата нандролона, тестостерона, ципионата тестостерона, энантата тестостерона, пропионата
тестостерона и тестостерона для чрескожного введения. По меньшей мере одним эстрогеном или прогестином может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из этерифицированных эстрогенов, эстрадиола, ципионата эстрадиола, ацетата эстрадиола/норэтиндрона для системного чрескожного введения,
валерата эстрадиола, эстрогенов (конъюгированных), эстропипата, этинилэстрадиола, этинилэстрадиола
и дезогестрела, этинилэстрадиола и этинодиолдиацетата, этинилэстрадиола и дезогестрела, этинилэстрадиола и этинодиолдиацетата, этинилэстрадиола и левоноргестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона,
этинилэстрадиола и ацетата норэтиндрона, этинилэстрадиола и норгестимата, этинилэстрадиола и норгестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона и ацетата и фумарата железа(2), левоноргестрела, ацетата медроксипрогестерона, местранола и норэтиндрона, норэтиндрона, ацетата норэтиндрона, норгестрела и
прогестерона. По меньшей мере одним гонадотропином может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из ацетата ганиреликса, ацетата гонадорелина, ацетата гистрелина и менотропинов. По меньшей мере одним средством против диабета или глюкагоном может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из акарбозы, хлорпропамида, глимепирида, глипизида, глюкагона, глибурида, инсулинов,
гидрохлорида метформина, миглитола, гидрохлорида пиоглитазона, репаглинида, малеата розиглитазона
- 22 -
015262
и троглитазона. По меньшей мере одним тиреоидным гормоном может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из левотироксин-натрия, лиотиронин-натрия, лиотрикса и тиреоидного гормона. По
меньшей мере одним антагонистом тиреоидного гормона может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из метимазола, йодида калия, йодида калия (насыщенного раствора), пропилтиоурацила, радиоактивного йода (йодида натрия, 131I) и концентрированного раствора йода. По меньшей мере одним
гипофизарным гормоном может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из кортикотропина,
козинтропина, ацетата десмопрессина, ацетата лейпролида, кортикотропина пролонгированного действия, соматрема, соматропина и вазопрессина. По меньшей мере одним лекарственным средством, действующим подобно паратиреоидному гормону, может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из
кальцифедиола, кальцитонина (человеческого), кальцитонина (лососевого), кальцитриола, дигидротахистерола и динатриевой соли этидроната (см., например, p. 696-796, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним диуретиком может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из
ацетазоламида, ацетазоламида натрия, гидрохлорида амилорида, буметанида, хлорталидона, этакрината
натрия, этакриновой кислоты, фуросемида, гидрохлортиазида, индапамида, маннита, метолазона, спиронолактона, торсемида, триамтерена и мочевины. По меньшей мере одним электролитом или растворомзаменителем может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из ацетата кальция, карбоната
кальция, хлорида кальция, цитрата кальция, глубионата кальция, глюцептата кальция, глюконата кальция, лактата кальция, фосфата кальция (двухосновного), фосфата кальция (трехосновного), декстрана
(высокомолекулярного), декстрана (низкомолекулярного), гидроксиэтилированного крахмала и хлорида
магния, сульфата магния, ацетата калия, бикарбоната калия, хлорида калия, глюконата калия, раствора
Рингера для инъекций, раствора Рингера для инъекций (содержащего лактат) и хлорида натрия. По
меньшей мере одним окислителем или подщелачивающим средством может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из бикарбоната натрия, лактата натрия и трометамина (см., например, p. 797-833,
Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним лекарственным средством, повышающим уровень гемоглобина в крови,
может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из фумарата железа(2), глюконата железа(2),
сульфата железа(2), сульфата железа(2) (сухого), комплекса "железо-декстран", комплекса "железосорбит", комплекса "полисахарид-железо" и комплекса "глюконат натрия-железо(3)". По меньшей мере
одним антикоагулянтом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из натриевой соли ардепарина, натриевой соли дальтепарина, натриевой соли данапароида, натриевой соли эноксапарина,
кальциевой соли гепарина, натриевой соли гепарина и натриевой соли варфарина. По меньшей мере одним из компонентов крови может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из 5% альбумина,
25% альбумина, антигемофильного фактора, комплекса "антиингибитор-коагулянт", антитромбина III
(человеческого), фактора IX (человеческого), комплекса фактора IX и фракций белков плазмы. По меньшей мере одним тромболитическим ферментом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное
из альтеплазы, анистреплазы, ретеплазы (рекомбинантной), стрептокиназы и урокиназы (см., например,
p. 834-66, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним алкилирующим лекарственным средством может быть по меньшей мере
одно средство, выбранное из бусульфана, карбоплатина, кармустина, хлорамбуцила, цисплатина, циклофосфамида, ифосфамида, ломустина, гидрохлорида мехлорэтамина, мелфалана, гидрохлорида мелфалана, стрептозоцина, темозоломида и тиотепы. По меньшей мере одним антиметаболитом может быть по
меньшей мере одно средство, выбранное из капецитабина, кладрибина, цитарабина, флоксуридина, фосфата флударабина, фторурацила, гидроксимочевины, меркаптопурина, метотрексата, натриевой соли
метотрексата, тиогуанина. По меньшей мере одним противоопухолевым антибиотиком может быть по
меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата блеомицина, дактиномицина, липосомного цитрата
даунорубицина, гидрохлорида даунорубицина, гидрохлорида доксорубицина, липосомного гидрохлорида доксорубицина, гидрохлорида эпирубицина, гидрохлорида идарубицина, митомицина, пентостатина,
пликамицина и валрубицина. По меньшей мере одним противоопухолевым средством, влияющим на
гормональный баланс, может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из анастрозола, бикалутамида, фосфата эстрамустин-натрия, экземестана, флутамида, ацетата гозерелина, летрозола, ацетата
лейпролида, ацетата мегестрола, нилутамида, цитрата тамоксифена, тестолактона и цитрата торемифена.
По меньшей мере одним противоопухолевым средством смешанного действия может быть по меньшей
мере одно средство, выбранное из аспарагиназы, бациллы Кальметта-Герена (БКГ) (живой, интравезикулярной), дакарбазина, доцетаксела, этопозида, фосфата этопозида, гидрохлорида гемцитабина, гидрохлорида иринотекана, митотана, гидрохлорида митоксантрона, паклитаксела, пегаспаргазы, порфимернатрия, гидрохлорида прокарбазина, ритуксимаба, тенипозида, гидрохлорида топотекана, трастузумаба,
третиноина, сульфата винбластина, сульфата винкристина и тартрата винорелбина (см., например,
p. 867-963, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним иммунодепрессантом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из азатиоприна, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба, лимфоцитарного иммуноглобулина, муромонаба-CD3, микофенолатмофетила, гидрохлорида микофенолатмофетила, сиролимуса и такролимуса. По меньшей мере одной вакциной или одним токсоидом может быть по меньшей мере одно
- 23 -
015262
средство, выбранное из вакцины БКГ, холерной вакцины, дифтерийных и столбнячных токсоидов (адсорбированных), адсорбированных дифтерийных и столбнячных токсоидов и бесклеточной коклюшной
вакцины, дифтерийных и столбнячных токсоидов и цельноклеточной коклюшной вакцины, конъюгированных вакцин Haemophilius b, вакцины против гепатита А (инактивированной), вакцины против гепатита В (рекомбинантной), трехвалентной противогриппозной вакцины 1999-2000 типа А и В (содержащей
очищенный поверхностный антиген), трехвалентной противогриппозной вакцины 1999-2000 типа А и В
(содержащей субвирион или очищенный субвирион), трехвалентной противогриппозной вакцины 19992000 типа А и В (содержащей целый вирион), вирусной вакцины против японского энцефалита (инактивированной), вакцины против болезни Лайма (содержащей рекомбинантный OspA), вакцины против кори, паротита и краснухи (живой), вакцины против кори, паротита и краснухи (живой, аттенюированной),
коревой вакцины (живой, аттенюированной), менингококковой полисахаридной вакцины, вакцины против паротита (живой), противочумной вакцины, пневмококковой вакцины (поливалентной), полиовирусной вакцины (инактивированной), полиовирусной вакцины (живой, пероральной, трехвалентной), вакцины против бешенства (адсорбированной), вакцины против бешенства (содержащей человеческие диплоидные клетки), вакцины против краснухи и паротита (живой), вакцины против краснухи (живой, аттенюированной), столбнячного токсоида (адсорбированного), столбнячного токсоида (в жидкой форме),
вакцины против тифа (пероральной), вакцины против тифа (парентеральной), вакцины против тифа на
основе полисахарида вируса тифа, вирусной вакцины против ветряной оспы и вакцины против желтой
лихорадки. По меньшей мере одним антитоксином или противоядием может быть по меньшей мере одно
средство, выбранное из антитоксической сыворотки против яда паука "черная вдова", антитоксической
сыворотки против яда Crotalidae (поливалентной), дифтерийного антитоксина (лошадиного) и антитоксической сыворотки против Micrurus fulvius. По меньшей мере одной иммунной сывороткой может быть
по меньшей мере одна сыворотка, выбранная из сыворотки, содержащей иммуноглобулин против цитомегаловируса (внутривенной), сыворотки, содержащей иммуноглобулин против гепатита В (человеческой), сыворотки для внутримышечного введения, содержащей иммуноглобулин, сыворотки для внутривенного введения, содержащей иммуноглобулин, сыворотки, содержащей иммуноглобулин против вируса бешенства (человеческой), и сыворотки для внутривенного введения, содержащей иммуноглобулин
против респираторно-синцитиального вируса (человеческой), сыворотки, содержащей иммуноглобулин
против вируса Rh0(D), сыворотки для внутривенного введения, содержащей иммуноглобулин против
вируса Rh0(D) (человеческой), сыворотки, содержащей иммуноглобулин против вируса столбняка (человеческого), и сыворотки, содержащей иммуноглобулин против вируса опоясывающего лишая. По меньшей мере одним модификатором биологического ответа может быть по меньшей мере одно средство,
выбранное из альдеслейкина, эпоэтина-альфа, филграстима, ацетата глатирамера для инъекций, интерферона альфакон-1, интерферона альфа-2а (рекомбинантного), интерферона альфа-2b (рекомбинантного), интерферона бета-1a, интерферона бета-1b (рекомбинантного), интерферона гамма-1b, гидрохлорида
левамизола, опрелвекина и сарграмостима (см., например, p. 964-1040, Nursing, 2001, Drug Handbook).
По меньшей мере одним офтальмическим противоинфекционным средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из бацитрацина, хлорамфеникола, гидрохлорида ципрофлоксацина,
эритромицина, сульфата гентамицина, 0,3% офлоксацина, сульфата полимиксина В, 10% сульфацетамида натрия, 15% сульфацетамида натрия, 30% сульфацетамида натрия, тобрамицина и видарабина. По
меньшей мере одним офтальмическим противовоспалительным средством может быть по меньшей мере
одно средство, выбранное из дексаметазона, фосфата дексаметазон-натрия, 0,1% диклофенак-натрия,
фторметолона, флубипрофен-натрия, кеторолак-трометамина, ацетата преднизолона (суспензии) и фосфата преднизолон-натрия (раствора). По меньшей мере одним митотическим средством может быть по
меньшей мере одно средство, выбранное из хлорида ацетилхолина, карбахола (для внутриглазного введения), карбахола (для местного применения), йодида эхотиофата, пилокарпина, гидрохлорида пилокарпина и нитрата пилокарпина. По меньшей мере одним мидриатическим средством может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из сульфата атропина, гидрохлорида циклопентолата, гидрохлорида
эпинефрина, эпинефрилбората, гидробромида гоматропина, гидрохлорида фенилэфрина, гидробромида
скополамина и тропикамида. По меньшей мере одним офтальмическим сосудосуживающим средством
может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида нафазолина, гидрохлорида оксиметазолина и гидрохлорида тетрагидрозолина. По меньшей мере одним офтальмическим средством
смешанного действия может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из гидрохлорида апраклонидина, гидрохлорида бетаксолола, тартрата бримонидина, гидрохлорида картеолола, гидрохлорида дипивефрина, гидрохлорида дорзоламида, дифумарата эмедастина, флуоресцеин-натрия, фумарата кетотифена, латанопроста, гидрохлорида левобунолола, гидрохлорида метипранолола, хлорида натрия (гипотонического средства) и малеата тимолола. По меньшей мере одним средством для лечения заболеваний
уха может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из борной кислоты, пероксида карбамида,
хлорамфеникола и конденсата триэтаноламин-полипептид-олеат. По меньшей мере одним средством для
лечения заболеваний носа может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из дипропионата беклометазона, будезонида, сульфата эфедрина, гидрохлорида эпинефрина, флунизолида, пропионата флутиказона, гидрохлорида нафазолина, гидрохлорида оксиметазолина, гидрохлорида фенилэфрина, гидро- 24 -
015262
хлорида тетрагидрозолина, ацетонида триамцинолона и гидрохлорида ксилометазолина (см., например,
p. 1041-97, Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одним противоинфекционным средством для местного применения может быть
по меньшей мере одно средство, выбранное из ацикловира, амфотерицина В, крема на основе азелаиновой кислоты, бацитрацина, нитрата бутоконазола, фосфата клиндамицина, клотримазола, нитрата эконазола, эритромицина, сульфата гентамицина, кетоконазола, ацетата мафенида, метронидазола (для местного применения), нитрата миконазола, мупироцина, гидрохлорида нафтифина, сульфата неомицина,
нитрофуразона, нистатина, серебряной соли сульфадиазина, гидрохлорида тербинафина, терконазола,
гидрохлорида тетрациклина, тиоконазала и толнафтата. По меньшей мере одним противочесоточным
средством или средством против педикулеза может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из
кротамитона, линдана, перметрина и пиретринов. По меньшей мере одним кортикостероидом для местного применения может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из дипропионата бетаметазона,
валерата бетаметазона, пропионата клобетазола, дезонида, дезоксиметазона, дексаметазона, фосфата дексаметазон-натрия, диацетата дифлоразона, ацетонида флуоцинолола, флуоцинонида, флурандренолида,
пропионата флутиказона, галционида, гидрокортизона, ацетата гидрокортизона, бутирата гидрокортизона, валерата гидрокортизона, фуроата мометазона и ацетонида триамцинолона. (См., например, pp. 10981136, Nursing 2001 Drug Handbook.)
По меньшей мере одним витамином или микроэлементом может быть по меньшей мере одно средство, выбранное из витамина А, комплекса витаминов В, цианокобаламина, фолиевой кислоты, гидроксокобаламина, лейковорин-кальция, ниацина, ниацинамида, гидрохлорида пиридоксина, рибофлавина,
гидрохлорида тиамина, витамина С, витамина D, холекальциферола, эргокальциферола, аналога витамина D, доксекальциферола, парикальцитола, витамина Е, аналога витамина K, фитонадиона, фторида натрия, фторида натрия для местного применения, микроэлементов, хрома, меди, йода, марганца, селена и
цинка. По меньшей мере одним калорийным веществом может быть по меньшей мере одно вещество,
выбранное из растворов аминокислот (кристаллических), растворов аминокислот в декстрозе, растворов
аминокислот с электролитами, растворов аминокислот с электролитами в декстрозе, растворов аминокислот для лечения печеночной недостаточности, растворов аминокислот для предотвращения тяжелых
метаболических расстройств, растворов аминокислот для лечения почечной недостаточности, декстрозы,
жировых эмульсий и триглицеридов со средней длиной цепи (см., например, p. 1137-63, Nursing, 2001,
Drug Handbook).
Композиции анти-IL-6 антител согласно изобретению могут также содержать по меньшей мере любое подходящее и эффективное количество композиции или фармацевтической композиции, содержащей
по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, подвергаемое контакту с клеткой, тканью, органом и организмом животного или человека, или вводимое в указанные клетку, ткань, орган и организм животного
или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии, а также, но необязательно, содержащей по меньшей мере одно средство, выбранное по меньшей мере из таких средств, как антагонист
TNF (например, такой как, но не ограничивающийся ими, антагонист TNF, являющийся химическим соединением или белком, моноклональное или поликлональное антитело или его фрагмент против TNF,
растворимый рецептор TNF (например, р55, р70 или р85) или его фрагмент, гибридные полипептиды или
небольшая молекула-антагонист TNF, например TNF-связывающий белок I или II (TBP-I или TBP-II),
нерелимонмаб, инфликсимаб, этанерцепт, CDP-571, CDP-870, афелимомаб, ленерцепт и т.п.), противоревматическое средство (например, метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, этанерцепт,
тиомалат золота-натрия, сульфат гидроксихлорохина, лефлуномид, сульфазальцин), миорелаксант, наркотическое средство, нестероидное противовоспалительное средство (НСПВС), аналгетик, анестетик,
седативное средство, анестетик для местного применения, нейромышечный блокатор, противомикробное
средство (например, аминогликозид, противогрибковое средство, средство против паразитов, противовирусное средство, карбапенем, цефалоспорин, фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин, другие противомикробные средства), средство для лечения псориаза, кортикостероид, анаболический стероид, средство для лечения диабета, микроэлементы, натуральное средство, средство для лечения щитовидной железы, витамин, кальций-ассоциированный гормон, средство против диареи, средство против кашля, противорвотное средство, средство против язвы, слабительное средство, антикоагулянт, эритропоэтин (например, эпоэтин-альфа), филграстим (например, G-CSF, Neupogen), сарграмостим
(GM-CSF, Leukine), средство для иммунизации, иммуноглобулин, иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон роста, средство для гормон-заместительной терапии, модулятор рецептора эстрогена, мидриатическое средство, средство для лечения циклоплегии, алкилирующий
агент, антиметаболит, ингибитор митоза, радиофармацевтическое средство, антидепрессант, средство
против маниакальной депрессии, антипсихотическое средство, анксиолитическое средство, гипнотическое средство, симпатомиметик, стимулятор, донепезил, такрин, противоастматическое лекарственное
средство, бета-агонист, стероид, вводимый путем ингаляции, ингибитор лейкотриена, метилксантин,
кромолин, эпинефрин или его аналог, дорназа-альфа (Pulmozyme), цитокин или антагонист цитокина.
Неограничивающими примерами таких цитокинов являются, но не ограничиваются ими, любой из
IL-1-IL-23 (например, IL-1, IL-2 и т.п.). Подходящие дозы таких средств хорошо известны специалистам.
- 25 -
015262
См., например, руководства Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange,
Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon
Publishing, Loma Linda, CA (2000), каждое из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Такие противораковые или противоинфекционные средства могут также включать молекулы токсинов, которые могут быть ассоциированы, связаны, совместно приготовлены или совместно введены по
меньшей мере с одним антителом согласно изобретению. Токсин может, но необязательно, селективно
уничтожать патологические клетки или ткани. Такими патологическими клетками могут быть раковые
или другие клетки. Указанными токсинами могут быть, но не ограничиваются ими, очищенный или рекомбинантный токсин или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, выбранного, например, по меньшей мере из одного токсина, такого как рицин,
дифтерийный токсин, токсин яда или бактериальный токсин. Термин "токсин" также включает эндотоксины и экзотоксины, продуцируемые любыми природными, мутантными или рекомбинантными бактериями или вирусами, которые могут вызывать любое патологическое состояние у человека и других
млекопитающих, включая токсический шок, который может приводить к летальному исходу. Такими
токсинами могут быть, но не ограничиваются ими, энтеротоксигенный термолабильный энтеротоксин
E.coli (LT), термостабильный энтеротоксин (ST), цитотоксин Shigella, энтеротоксины Aeromonas, токсин1, вызывающий синдром токсического шока (TSST-1), стафилококковый энтеротоксин A (SEA), В (SEB)
или С (SEC), стрептококковые энтеротоксины и т.п. Такими бактериями являются, но не ограничиваются
ими, штаммы энтеротоксигенных бактерий E.coli (ЕТЕС), энтерогеморрагической E.coli (например,
штаммы серотипа 0157:Н7), Staphylococcus spp. (например, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), Shigella spp. (например, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii и Shigella sonnei), Salmonella spp. (например, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), Clostridium spp.
(например, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacter spp. (например, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), Heliobacter spp. (например, Heliobacter pylori), Aeromonas
spp. (например, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides,
Yersina enterocolitica, Vibrios spp. (например, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), Klebsiella spp.,
Pseudomonas aeruginosa и Streptococci. См., например, публикации Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd
ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp. 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell et al., Principles
and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al., eds., The
Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, NJ., 1992; Wood et al., FEMS Microbiology Immunology,
76:121-134 (1991); Marrack et al., Science, 248:705-711 (1990), которые полностью включены в настоящее
описание посредством ссылки.
Соединения анти-IL-6 антитела, а также их композиции или комбинации согласно изобретению могут также содержать по меньшей мере одно из любых подходящих вспомогательных веществ, таких как,
но не ограничивающихся ими, разбавитель, связующее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант или т.п. Предпочтительными являются фармацевтически
приемлемые вспомогательные вещества. Неограничивающие примеры таких стерильных растворов и
методов их получения хорошо известны специалистам и описаны в руководствах, таких как, но не ограничивающихся ими, руководство Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack
Publishing Co. (Easton, PA), 1990. С применением рутинного метода могут быть выбраны фармацевтически приемлемые носители, подходящие для данного способа введения и обеспечивающие растворимость
и/или стабильность композиций анти-IL-6 антитела, его фрагмента или варианта, как хорошо известно
специалистам или как описано в настоящей заявке.
Фармацевтическими эксципиентами и добавками, которые могут быть использованы в композиции
согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и
углеводы (например, сахара, включая моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; дериватизированные сахара, такие как альдиты, альдоновые кислоты, этерифицированные сахара и т.п., и полисахариды или полимеры сахаров), которые могут присутствовать отдельно или в комбинации друг с другом и
составляют 1-99,99% по массе или объему композиции. Репрезентативными белковыми эксципиентами
являются сывороточный альбумин, такой как альбумин человеческой сыворотки (HSA), рекомбинантный
человеческий альбумин (rHA), желатин, казеин и т.п. Репрезентативными аминокислотами/компонентами, которые могут также обладать забуферивающей способностью, являются аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т.п. Одной из предпочтительных аминокислот является
глицин.
Углеводными эксципиентами, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и
т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит,
мальтит, лактит, ксилит-сорбит (глюцит), миоинозит и т.п. Предпочтительными углеводными эксципи- 26 -
015262
ентами, используемыми в настоящем изобретении, являются маннит, трегалоза и раффиноза.
Композиции, содержащие анти-IL-6 антитело, могут также включать буфер или рН-корректирующий агент, при этом типичным буфером является соль, полученная из органической кислоты или
органического основания. Репрезентативными буферами являются соли органических кислот, такие как
соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; трис, гидрохлорид трометамина или
фосфатные буферы. Предпочтительными буферами, используемыми в композициях согласно изобретению, являются соли органических кислот, такие как цитрат.
Кроме того, композиции, содержащие анти-IL-6 антитело согласно изобретению, могут включать
полимерные эксципиенты/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар),
декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, ароматизаторы, противомикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатики, поверхностно-активные вещества (например, полисорбаты, такие как "твин 20" и "твин 80"), липиды (например,
фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатообразующие агенты (например, EDTA).
Эти и другие известные фармацевтические эксципиенты и/или добавки, подходящие для использования в композициях, содержащих анти-IL-6 антитело согласно изобретению, его часть или вариант, известны специалистам и описаны, например, в руководствах "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995) и "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics,
Montvale, NJ (1998), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительными носителями или эксципиентами являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитрат) или полимерные агенты. Репрезентативной молекулой-носителем является мукополисахарид, гиалуроновая кислота, который может быть использован для внутрисуставного введения.
Составы
Как указано выше, настоящее изобретение относится к стабильным составам, которые могут предпочтительно включать фосфатный буфер, содержащий физиологический раствор или выбранную соль, а
также, но необязательно, растворы-консерванты, и композиции, содержащие консерванты, а также к составам с длительным сроком хранения для многократного приема, пригодным для применения в медицине или ветеринарии и содержащим по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело в фармацевтически приемлемой композиции. Составы с длительным сроком хранения содержат по меньшей мере один известный консервант или, но необязательно, консервант, выбранный из группы, состоящей из фенола,
м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, нитрита фенилртути, феноксиэтанола,
формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния (например, гексагидрата), алкилпарабена (метил-, этил-,
пропил-, бутилпарабена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимерозала, полимеров или их смесей в водном разбавителе. Как очевидно специалистам, может быть использована любая подходящая концентрация или смесь, составляющая примерно 0,001-5% или любой
промежуточный интервал концентраций или любая концентрация в таком интервале или дробная концентрация. Неограничивающими примерами могут служить, но не ограничиваются ими: композиции, в
которых консервант отсутствует, и композиции, содержащие примерно 0,1-2% м-крезола (например, 0,2,
0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), примерно 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5, 0,9, 1,1,, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%),
примерно 0,001-0,5% тимерозала (например, 0,005, 0,01), примерно 0,001-2,0% фенола (например, 0,05,
0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабена(ов) (например, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005,
0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) и т.п.
Как указано выше, настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему
упаковочный материал и по меньшей мере один сосуд, содержащий раствор по меньшей мере одного
анти-IL-6 антитела с описанными ранее буферами и/или консервантами, необязательно, в водном разбавителе, где указанный упаковочный материал имеет этикетку, в которой указано, что данный раствор
может храниться в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 ч или более. Настоящее изобретение также относится к промышленному изделию, включающему упаковочный материал, первый сосуд, содержащий по меньшей мере одно лиофилизованное анти-IL-6 антитело, и второй
сосуд, содержащий водный растворитель описанного ранее буфера или консерванта, где указанный упаковочный материал имеет этикетку, в которой приводится инструкция для пациента по разведению по
меньшей мере одного анти-IL-6 антитела в данном водном разбавителе для получения раствора, который
может храниться в течение двадцати четырех часов или более.
По меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, используемое в соответствии с настоящим изобретением, может быть продуцировано рекомбинантными методами с использованием клеток млекопитающих
или трансгенных составов, либо оно может быть выделено из других биологических источников, описанных в настоящей заявке или известных специалистам.
Интервал количеств по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела в продукте согласно изобретению
включает количества, полученные после их разведения, если они присутствуют в виде жидкой/сухой
смеси, в концентрации примерно от 1,0 мкг/мл до 1000 мг/мл, хотя могут быть использованы более низкие и более высокие концентрации в зависимости от носителя, используемого для доставки; так, напри- 27 -
015262
мер, жидкие составы в виде пластыря для чрескожного введения, составы для внутрилегочного введения,
составы для введения через слизистую или составы для введения с помощью осмотического насоса или
микронасоса будут отличаться по своей концентрации.
Предпочтительно водный разбавитель может дополнительно содержать, но необязательно, фармацевтически приемлемый консервант. Предпочтительными консервантами являются консерванты, выбранные из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового
спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутилпарабена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида
бензэтония, дегидроацетата натрия и тимерозала или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в составе, представляет собой концентрацию, достаточную для достижения противомикробного
эффекта. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и могут быть легко определены средним специалистом в данной области.
В указанный разбавитель, необязательно, но предпочтительно, могут быть добавлены и другие эксципиенты, например вещества, придающие изотоничность, буферы, антиоксиданты и усилители консервантов. Вещество, придающее изотоничность, такое как глицерин, обычно используется в известных
концентрациях. Физиологически приемлемый буфер предпочтительно добавляют для регуляции рН. Эти
составы могут иметь рН в широком диапазоне, например приблизительно рН 4-10, предпочтительно
примерно рН 5-9, а наиболее предпочтительно примерно 6,0-8,0. Предпочтительные составы согласно
изобретению имеют рН примерно 6,8-7,8. Предпочтительными буферами являются фосфатные буферы, а
наиболее предпочтительным - натрийфосфатный буфер, а в частности забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).
Для снижения степени агрегации в указанные составы или композиции могут быть, но необязательно, добавлены и другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизиаторы, например
твин 20 (полиоксиэтилированный (20) сорбитанмонолаурат), твин 40 (полиоксиэтилированный (20) сорбитанмонопальмитат), твин 80 (полиоксиэтилированный (20) сорбитанмонолеат), плюроник Р68 (блоксополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и ПЭГ (полиэтиленгликоль) или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 или полоксамер 184 или 188, полиолы
плюроники®, другие блок-сополимеры и хелатообразующие агенты, такие как EDTA и EGTA. Такие
добавки являются особенно подходящими в том случае, если для введения состава используется насос
или пластиковый контейнер. Присутствие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества снижает степень вероятности агрегации белка.
Составы согласно изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по
меньшей мере одного анти-IL-6 антитела с консервантом, выбранным из группы, состоящей из фенола,
м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-,
пропил-, бутилпарабена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимерозала или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела
с консервантом в водном разбавителе осуществляют в соответствии со стандартными процедурами растворения и смешивания. Так, например, для получения подходящего состава измеренное количество по
меньшей мере одного анти-IL-6 антитела в забуференном растворе объединяют с нужным консервантом
в забуференном растворе в количестве, достаточном для получения нужных концентраций белка и консерванта. Варианты такого способа известны среднему специалисту в данной области. Так, например,
порядок добавления компонентов, независимо от используемых добавок, температура и рН, при которых
приготавливают данный состав, являются факторами, которые могут быть оптимизированы для получения нужной концентрации в соответствии с выбранным способом введения.
Заявленные составы могут поставляться пациентам в виде чистых растворов или в виде составов с
двумя сосудами, где один сосуд включает лиофилизованное по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело,
которое разводят содержимым второго сосуда, включающего воду, консервант и/или наполнители, а
предпочтительно фосфатный буфер и/или физиологический раствор и выбранную соль в водном разбавителе. Состав, содержащий готовый раствор в одном сосуде, или состав, содержащий два сосуда, один
из которых необходим для разведения содержимого другого сосуда, может быть использован несколько
раз и может быть достаточным для проведения одного или нескольких курсов лечения пациента, а поэтому такой состав может оказаться более удобным для проведения курса лечения, чем современные составы.
Заявленные в настоящем изобретении промышленные изделия могут быть использованы для немедленного введения лекарственного средства или для его введения в течение двадцати четырех часов
или более. В соответствии с этим заявленные в настоящем изобретении промышленные изделия имеют
значительные преимущества для пациента. Составы согласно изобретению могут, но необязательно, храниться при температурах примерно от 2 до 40°С и сохраняют биологическую активность белка в течение
продолжительного периода времени, а поэтому на этикетке, приклеенной к упаковке, должно быть указано, что данный раствор может храниться и/или может быть использован в течение 6, 12, 18, 24, 36, 48,
72 или 96 ч или более. Если используется разбавитель с консервантом, то на такой этикетке может быть
указано, что состав годен к применению в течение по меньшей мере 1-12 месяцев, полугода, полутора
лет и/или двух лет.
- 28 -
015262
Растворы по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела согласно изобретению могут быть получены
способом, включающим смешивание по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела в водном разбавителе.
Смешивание осуществляют в соответствии со стандартными процедурами, обычно применяемыми для
растворения и смешивания. Так, например, для получения подходящего разбавителя измеряемое количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере объединяют с количеством, достаточным для
получения нужных концентраций белка и, необязательно, консерванта или буфера. Варианты такого способа известны среднему специалисту в данной области. Так, например, порядок добавления компонентов
независимо от используемых добавок, температура и рН, при которых приготавливают данный состав,
являются факторами, которые могут быть оптимизированы для достижения нужной концентрации в соответствии с выбранным способом введения.
Заявленные продукты могут поставляться пациентам в виде чистых растворов или в виде состава с
двумя сосудами, содержащими один сосуд, включающий лиофилизованное по меньшей мере одно антиIL-6 антитело, которое разводят содержимым второго сосуда, включающего водный разбавитель. Состав,
содержащий готовый раствор в одном сосуде, или состав, содержащий два сосуда, один из которых необходим для разведения содержимого первого сосуда, может быть использован несколько раз и может
быть достаточным для проведения одного или нескольких курсов лечения пациента, а поэтому такой
состав может оказаться более удобным для проведения курса лечения, чем стандартные современные
составы.
Заявленные продукты могут поставляться пациентам через аптеки, клиники или другие организации, такие как институты и фабрики, в виде готовых растворов или составов с двумя сосудами, содержащими один сосуд, включающий лиофилизованное по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, которое
разводят содержимым второго сосуда, включающего водный разбавитель. В данном случае чистый раствор может быть получен в большом резервуаре объемом в один литр или даже в большем объеме, из
которого могут быть взяты один или несколько раз небольшие порции по меньшей мере одного раствора
антитела и расфасованы в более мелкие сосуды, для поставки в аптеки или клиники, а затем заказчикам
и/или пациентам.
Известными устройствами, включающими такие системы в виде одного сосуда, являются инжекторы типа "писчего пера" для введения раствора, такие как BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® и OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, RecoPen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, безыгольный инжектор с J-наконечником (J-tip Needle-Free Injector®), Intraject®, Medi-Ject®, например, изготовленные или разработанные Becton Dickensen (Franklin
Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com); Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK,
www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www, mediject.com), и аналогичные подходящие устройства. Известными устройствами, включающими такие системы с двумя сосудами, являются
системы инжекторов типа "писчего пера", таких как HumatroPen®, предназначенные для разведения
лиофилизованного лекарственного средства в картридже для доставки разведенного раствора. Примерами других подходящих устройств являются готовые к использованию шприцы, автоматические инжекторы, безыгольные инжекторы и наборы безыгольных шприцов для внутривенного вливания.
Продукты, заявленные в настоящем изобретении, включают упаковочный материал. Этот упаковочный материал, помимо информации, требуемой регуляторными органами, включает описание условий, при которых может быть использован данный продукт. В соответствии с настоящим изобретением в
случае состава с двумя сосудами, содержащего продукт в виде раствора/порошка, такой упаковочный
материал включает инструкции для пациента по разведению по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела
в водном разбавителе для получения раствора и его использования в течение 2-24 ч или более. В случае
одного состава с одним сосудом, то есть продукта в виде раствора, на этикетке должно быть указано, что
такой раствор может быть использован в течение 2-24 ч или более. Продукты, заявленные в настоящем
изобретении, являются эффективными фармацевтическими продуктами для введения человеку.
Составы согласно изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по
меньшей мере одного анти-IL-6 антитела и выбранного буфера, а предпочтительно фосфатного буфера,
содержащего физиологический раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела в водном разбавителе осуществляют в соответствии со стандартными процедурами растворения и смешивания. Так, например, для получения подходящего состава измеряемое количество по
меньшей мере одного антитела в воде или буфере объединяют с нужным забуферивающим агентом в
воде в количестве, достаточном для получения нужных концентраций белка и буфера. Варианты такого
способа известны специалисту в данной области. Так, например, порядок добавления компонентов независимо от используемых добавок, температура и рН, при которых приготавливают данный состав, являются факторами, которые могут быть оптимизированы для достижения нужной концентрации в соответствии с выбранным способом введения.
Заявленные стабильные составы или составы с консервантами могут поставляться пациентам в виде
чистых растворов или в виде состава с двумя сосудами, содержащего один сосуд, включающий лиофили- 29 -
015262
зованное по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, которое разводят содержимым второго сосуда,
включающего консервант или буфер и наполнители в водном разбавителе. Состав с одним сосудом, содержащим один раствор, или состав с двумя сосудами, один из которых необходим для разведения содержимого первого сосуда, может быть использован несколько раз и может быть достаточным для проведения одного или нескольких курсов лечения пациента, а поэтому такой состав может оказаться более
удобным для проведения курса лечения, чем стандартные современные составы.
В других композициях или методах стабилизации анти-IL-6 антитела может быть приготовлено в
виде непрозрачного раствора лиофилизованного порошка, содержащего антитело. Такими непрозрачными растворами являются составы, содержащие суспензии частиц, где указанные частицы представляют
собой композицию, содержащую анти-IL-6 антитело в структурах различных размеров, известных под
разными названиями, такими как микросферы, микрочастицы, наночастицы, наносферы или липосомы.
Такие относительно гомогенные составы, состоящие, в основном, из сферических частиц и содержащие
активное вещество, могут быть получены путем контактирования водной фазы, содержащей активное
вещество и полимер, с безводной фазой и последующим выпариванием безводной фазы, в результате
чего происходит слияние частиц водной фазы, как описано в патенте США № 4589330. Пористые микрочастицы могут быть получены с использованием первой фазы, содержащей активное вещество и полимер, диспергированный в непрерывной фазе растворителя, с последующим удалением указанного растворителя из суспензии путем лиофилизации или разведения-экстракции-преципитации, как описано в
патенте США 4818542. Предпочтительными полимерами для получения таких составов являются природные или синтетические сополимеры или полимеры, выбранные из группы, состоящей из желатинового агара, крахмала, арабиногалактана, альбумина, коллагена, полигликолевой кислоты, полимолочной
кислоты, гликолид-L(-)лактида, поли(эпсилон-капролактона), поли(эпсилон-капролактон-СО-молочной
кислоты), поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевой кислоты), поли(β-гидроксимасляной кислоты), полиэтиленоксида, полиэтилена, поли(алкил-2-цианоакрилата), поли(гидроксиэтилметакрилата), полиамидов, полиаминокислот, поли(2-гидроксиэтил-DL-аспартамида), полиэфира мочевины, поли(L-фенилаланина/этиленгликоля/1,6-диизоцианатогексана) и поли(метилметакрилата). Особенно предпочтительными полимерами являются полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, гликолид-L(-)лактид, поли(эпсилонкапролактон), поли(эпсилонкапролактон-СО-молочная кислота) и поли(эпсилонкапролактон-СО-гликолевая кислота).
Растворителями, которые могут быть использованы для растворения полимера и/или активного вещества, являются вода, гексафторизопропанол, метиленхлорид, тетрагидрофуран, гексан, бензол или
сесквигидрат гексафторацетона. Способ диспергирования фазы, содержащей активное вещество, во второй фазе может включать подачу под давлением указанной первой фазы через отверстие сопла для предотвращения образования капель.
Композиции в виде сухого порошка могут быть получены не путем лиофилизации, а другими способами, такими как сушка распылением или экстракция растворителем путем выпаривания или осаждения кристаллической композиции с последующим проведением одной или нескольких стадий удаления
водного или безводного растворителя. Получение состава антитела путем сушки распылением описано в
патенте США 6019968. Антителосодержащие композиции в виде сухого порошка могут быть получены
путем сушки распылением растворов или взвесей антитела и, необязательно, эксципиентов в растворителе в условиях, применяемых для получения сухого порошка для вдыхания. Растворителями могут быть
полярные соединения, такие как вода и этанол, которые могут быть легко осушены. Стабильность антитела может быть повышена путем проведения процедур сушки распылением в отсутствии кислорода,
например в потоке азота или с использованием азота в качестве осушающего газа. Другим относительно
сухим составом является дисперсия, состоящая из множества перфорированных микроструктур, диспергированных в суспензионной среде, которая обычно содержит гидрофторалкановый пропеллент, описанный в WO 9916419. Стабилизированные дисперсии могут быть введены в легкие пациента с помощью
ингалятора с дозирующим клапаном. Оборудование, подходящее для промышленного изготовления лекарственных составов, полученных путем сушки распылением, производится компаниями Buchi Ltd. или
Niro Corp.
По меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, присутствующее в описанных здесь стабильных составах или растворах либо в составах или растворах с длительным сроком хранения, может быть введено
пациенту в соответствии с настоящим изобретением различными методами доставки, включая s.c. или
i.m. инъекцию; а также чрескожное введение, внутрилегочное введение, введение через слизистую, введение с помощью имплантата, осмотического насоса, картриджа и микронасоса или другими методами,
хорошо известными специалистам.
Терапевтические применения
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного IL-6-ассоциировнного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, как
известно специалистам или как описано в настоящей заявке, с использованием по меньшей мере одного
анти-IL-6 антитела согласно изобретению, например, путем введения терапевтически эффективного количества анти-IL-6 антитела в клетку, ткань, орган и организм животного или человека или контактиро- 30 -
015262
вания указанного терапевтического эффективного количества анти-IL-6 антитела с указанными клеткой,
тканью, органом и организмом животного или человека. Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного IL-6-ассоциировнного заболевания клетки, ткани,
органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно
из таких заболеваний как ожирение, иммуноассоциированное заболевание, сердечно-сосудистое заболевание, инфекционное заболевание, злокачественное заболевание или нервное заболевание.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного IL-6-иммуноассоциированного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, внезапно начавшийся системный ювенильный ревматоидный артрит, псориазный артрит, анкилозирующий
спондилит, язву желудка, серонегативные артротопатии, остеоартрит, остеолиз, асептическое отторжение ортопедических имплантатов, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, системную
красную волчанку, кожную красную волчанку, волчаночный нефрит, антифосфолипидный синдром,
иридоциклит/увеит/неврит зрительного нерва, идиопатический фиброз легких, системный васкулит/гранулематоз Вегенера, саркоидоз, орхит/повреждение, связанное с операцией по реверсивной вазоэктомии, аллергические/атопические заболевания, астму, аллергический ринит, экзему, аллергический
контактный дерматит, аллергический конъюнктивит, аллергический пневмонит, трансплантаты, отторжение трансплантированного органа, реакцию "трансплантат против хозяина", синдром системного воспалительного ответа, септический синдром, сепсис, вызванный грамположительными бактериями; сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями, сепсис неинфекционного генеза, грибковый сепсис,
нейтропеническую лихорадку, уросепсис, менингококцемию, травму/геморрагию, ожоги, облучение ионизирующим излучением, острый панкреатит, респираторный дистресс-синдром взрослых, ревматоидный артрит, алкогольный гепатит, хронические воспалительные патологии, саркоидоз, болезнь Крона,
серповидно-клеточную анемию, диабет, нефроз, атопические заболевания, реакцию гиперчувствительности, аллергический ринит, сенную лихорадку, хронический ринит, конъюнктивит, эндометриоз, астму,
крапивницу, системную анафилаксию, дерматиты, пернициозную анемию, гемолитическую болезнь,
тромбоцитопению, отторжение любого трансплантированного органа или ткани, отторжение трансплантированной почки, отторжение трансплантированного сердца, отторжение трансплантированной печени,
отторжение трансплантированной поджелудочной железы, отторжение трансплантированного легкого,
отторжение транспланта костного мозга (ВМТ), отторжение аллотрансплантата кожи, отторжение хрящевого трансплантата, отторжение костного трансплантата, отторжение трансплантата тонкого кишечника, отторжение имплантата тимуса плода, отторжение трансплантата паращитовидной железы, отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани, отторжение аллотрансплантата, антирецепторные
реакции гиперчувствительности, болезнь Грейвса, болезнь Рейно, инсулинрезистентный диабет типа В,
астму, тяжелую миастению, опосредуемую антителом цитотоксичность, реакции гиперчувствительности
типа III, синдром POEMS (полинейропатию, органомегалию, эндокринопатию, гаммапатию, ассоциированную с дефицитом моноклональных антител, и синдром изменения кожи), полинейропатию, органомегалию, эндокринопатию, гаммапатию, ассоциированную с дефицитом моноклональных антител, и синдром изменения кожи, антифосфолипидный синдром, пузырчатку, склеродермию, смешанное заболевание соединительной ткани, идиопатическую болезнь Адиссона, сахарный диабет, хронический активный
гепатит, первичный биллиарный цирроз, витилиго, васкулит, пост-MI-кардиотомный синдром, гиперчувствительность типа IV, контактный дерматит, аллергический пневмонит, отторжение аллотрансплантата,
гранулемы, вызываемые внутриклеточными микроорганизмами, чувствительность к лекарственным
средствам, метаболическую/идиопатическую болезнь, болезнь Вильсона, гемахроматоз, дефицит альфа1-антитрипсина, диабетическую ретинопатию, тиреоидит Хашимото, остеопороз, нарушение системы
гипоталамус-гипофиз-надпочечники, первичный билиарный цирроз, тиреоидит, энцефаломиелит, кахексию, кистозный фиброз, хроническое заболевание легких у новорожденных, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), наследственный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, кожные заболевания, псориаз, алопецию, нефротический синдром, нефрит, гломерулярный нефрит, острую почечную
недостаточность, гемодиализ, уремию, токсикоз, преэкламсию, нарушения, вызываемые okt3-терапией,
анти-cd3-терапией, цитокиновой терапией, химиотерапией и лучевой терапией (например, включая, но
не ограничиваясь ими, астению, анемию, кахексию и т.п.), хроническую интоксикацию салицилатами и
т.п. См., например, руководства Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972,
1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and
Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), каждое из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного сердечно-сосудистого заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере, синдром остановки сердца, инфаркт миокарда, застойную сердечную недостаточность, инсульт, ишемический инсульт, геморрагию, острый коронарный синдром, артериосклероз, атеросклероз, рестеноз, диабетическое атеросклеротическое заболевание, гипертензию, артериальную гипертензию, почечно-сосудистую гипертензию, обморок, шок, сифилис сердеч- 31 -
015262
но-сосудистой системы, сердечную недостаточность, легочное сердце, первичную легочную гипертензию, сердечные аритмии, предсердные эктопические экстрасистолы, трепетание предсердий, фибрилляцию предсердий (устойчивую или пароксизмальную), постперфузионный синдром, воспалительный ответ на кардиопульмональное шунтирование, хаотическую или многоочаговую тахикардию предсердий,
повторяющуюся тахикардию с выраженным сужением QRS-комплекса, характерные аритмии, фибрилляцию желудочков, аритмию пучка Гиса, атриовентрикулярную блокаду, блокаду ножки пучка Гиса,
ишемические нарушения миокарда, ишемическую болезнь сердца, стенокардию, инфаркт миокарда, кардиомиопатию, застойную кардиомиопатию, рестриктивную кардиомиопатию, порок клапана сердца, эндокардит, перикардит, опухоли сердца, аневризму аорты и периферической артерии, расслаивающую
аневризму аорты, воспаление аорты, окклюзию брюшного отдела аорты и ее ветвей, заболевания периферических сосудов, окклюзивные заболевания артерий, атеросклероз периферических сосудов, облитерирующий тромбоангиит, функциональные расстройства периферических артерий, синдром и болезнь
Рейно, акроцианоз, эритромелалгию, заболевания вен, тромбоз вен, варикозные вены, артериовенозные
фистулы, лимфедему, жировой отек, нестабильную стенокардию, реперфузионные повреждения, постгемодиализный синдром, постишемическое реперфузионное повреждение и т.п. Такой способ может, но
необязательно, включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, в клетку, ткань, орган и организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного IL-6-ассоциированного инфекционного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного или
человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как острая
или хроническая бактериальная инфекция, острые и хронические паразитарные инфекции или инфекционные процессы, включая бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, ВИЧ-инфекции/ВИЧневропатию, менингит, гепатит (например, А, В, С или т.п.), септический артрит, перитонит, пневмонию,
эпиглоттит, инфекцию, вызываемую E.coli 0157:h7, гемолитический уремический синдром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, малярию, геморрагическую лихорадку Денге,
лейшманиоз, лепру, синдром токсического шока, стрептококковый миозит, газовую гангрену, заболевание, вызываемое бактерией Mycobacterium tuberculosis, внутриклеточную инфекцию, вызываемую Mycobacterium avium, пневмонию, вызываемую Pneumocyctis carinii, воспаление тазовых органов, орхит/эпидидимит, болезнь, вызываемую бактерией Legionella, болезнь Лайма, грипп А, заболевание, вызываемое вирусом Эпштейна-Барра, вирусный гемафагоцитарный синдром, вирусный энцефалит/асептический менингит и т.п.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного IL-6-ассоциированного злокачественного заболевания клетки, ткани, органа и организма животного
или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как лейкоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз, В-клеточный,
Т-клеточный лейкоз или FAB-ОЛЛ (по франко-американо-британской классификации лейкозов, FAB),
острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), острый миелогенный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз
(ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), ретикулоэндотелиоз, миелодисплазия (МД), лимфома, болезнь Ходжкина, злокачественная лимфома, не-ходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома, саркома Капоши, карцинома ободочной кишки, карцинома поджелудочной железы,
карцинома носоглотки, злокачественный гистиоцитоз, паранеопластический синдром/гиперкальцемия
при злокачественных опухолях, солидные опухоли, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак эндометрия, рак головы и шеи, наследственный неполипоидный рак, ходжкинская
лимфома, рак печени, рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, почечно-клеточная карцинома, рак яичек, аденокарцинома, саркома,
злокачественная меланома, гемангиома, метастазы, рак, ассоциированный с резорбцией кости, рак, ассоциированный с болями в кости и т.п.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного IL-6-ассоциированного нервного заболевания клетки, ткани, органа, организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как нейродегенеративные заболевания; рассеянный склероз; мигрень; деменция, вызываемая СПИД-ассоциированным
комплексом; демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и острый поперечный
миелит; экстрапирамидные и церебеллярные расстройства, такие как поражение корково-спинномозговой системы; расстройства базальных ядер; гиперкинетические расстройства, такие как хорея Гентингтона и сенильная хорея; дискинезии, вызываемые употреблением лекарственных средств, например
дискенизии, индуцируемые лекарственными средствами, блокирующими допаминовые рецепторы ЦНС;
гипокинетические расстройства, такие как болезнь Паркинсона; прогрессирующий надъядерный паралич; структурные поражения мозжечка; дегенерации спинного мозга и мозжечка, такие как атаксия
спинного мозга, атаксия Фридрейха, церебеллярные кортикальные дегенерации; множественные системные дегенерации (болезнь Менцеля, болезнь Дежерина-Томаса, синдром Шая-Дрейджера и болезнь Мачадо-Джозефа); системные расстройства (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телангиэк- 32 -
015262
тазия и митохондриальные общие системные расстройства); демиенилизирующие повреждения коры
головного мозга, такие как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и болезни, связанные с поражением мотонейронов, такие как нейрогенные атрофии мышц (дегенерация ороговевших клеток передней доли гипофиза, такая как боковой амиотрофический склероз, детская атрофия мышц спинного
мозга и ювенильная атрофия мышц спинного мозга), болезнь Альцгеймера, синдром Дауна среднего возраста; болезнь диффузных телец Леви; сенильная деменция, ассоциированная с болезнью диффузных
телец Леви, синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейцфельда-Якоба; подострый склерозирующий панэнцефалит; болезнь Галлервордена-Шпаца; деменция боксеров; нейротравматическое повреждение (например, повреждение спинного мозга, повреждение головного мозга, сотрясение органов и повторное сотрясение органов); боли; воспалительные боли; аутизм; депрессия; инсульт;
нарушение познавательной способности; эпилепсия и т.п. Такой способ может, но необязательно, включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по
меньшей мере одно анти-TNF антитело или его конкретную часть или вариант, в клетку, ткань, орган и
организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии (см., например, Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992)).
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одной
IL-6-ассоциированной раны, травмы или поражения ткани или ассоциированного с ними хронического
состояния клетки, ткани, органа и организма животного или человека, включая, но не ограничиваясь
ими, по меньшей мере одно из телесных повреждений или травм, ассоциированных с хирургической
операцией на органах ротовой полости, включая периодонтальную хирургию, удаление зуба (зубов), лечение пульпита, установку зубных протезов, протезирование и использование зубных протезов; где указанная рана выбрана из группы, состоящей из асептических ран, ран от ушибов, резаных ран, рваных
ран, непроникающих ран, открытых ран, проникающих ран, сквозных ран, колотых ран, септических
ран, ран после инфарктов и подкожных ран; или где указанная рана выбрана из группы, состоящей из
ишемических язв, пролежней, фистул, глубоких укусов, тепловых ожогов и ран на донорских участках
(при аутотрансплантации); или где указанной раной является афтозная рана, травматическая рана или
рана, ассоциированная с герпесом.
Раны и/или язвы обычно возникают на коже или на поверхности слизистой, или в результате инфаркта органа ("инсульта"). Рана может образовываться в результате дефектов или поражения мягких
тканей или ассоциированных с ними состояний. В контексте настоящего описания термин "кожа" означает внешнюю поверхность тела животного, включая человека, и охватывает неповрежденную или почти
неповрежденную поверхность кожи, а также поврежденную поверхность кожи. Термин "слизистая" означает неповрежденную или поврежденную слизистую животного, такого как человек, и такой, слизистой может быть слизистая ротовой полости, щеки, уха, носа, легких, глаз, желудочно-кишечного тракта,
влагалища или прямой кишки.
В контексте настоящего описания термин "рана" означает телесное повреждение с нарушением
нормальной целостности тканевых структур. Этот термин также охватывает термины "рана на коже",
"поражение", "некроз" и "язва". Обычно термин "рана на коже" является самым распространенным термином, который означает почти любое поражение кожи или слизистых оболочек, а термин "язва" означает местное поражение или образование полости на поверхности органа или ткани, которая возникает в
результате отторжения некротизированной ткани. Термин "поражение" обычно означает любой дефект
ткани. Термин "некроз" означает омертвление ткани в результате инфекции, повреждения, воспаления
или инфаркта.
Термин "рана", используемый в контексте настоящего описания, означает любую рану (см. ниже
классификацию ран) и любую конкретную стадию в процессе заживления ран, включая стадию до начала
заживления возникшей раны или даже до возникновения раны, вызванной хирургическим вмешательством (профилактическим лечением). Примерами ран, которые могут быть предупреждены и/или устранены в соответствии с настоящим изобретением, являются асептические раны, раны от ушибов, резаные
раны, рваные раны, непроникающие раны (то есть раны, при которых не происходит повреждения кожи,
но образуются поражения подлежащих структур), открытые раны, проникающие раны, сквозные раны,
колотые раны, септические раны, подкожные раны и т.п. Примерами ран на коже являются пролежни,
афтозный стоматит, дисхромия кожи, пузырьковый лишай, компрессионная атрофия кожи и т.п. Примерами язв являются, например, пептическая язва, язва двенадцатиперстной кишки, язва желудка, подагрическая язва, диабетическая язва, язва, вызванная гипертензивной ишемией, варикозная язва, язва голени
(венозная язва), подъязычная язва, подслизистая язва, симптоматическая язва, трофическая язва, тропическая язва и мягкий шанкр, например, вызываемый гонореей (включая уретрит, эндоцервицит и проктит). Состояниями, ассоциированными с ранами или повреждениями кожи, которые могут быть вылечены способами согласно настоящему изобретению, являются ожоги, сибирская язва, столбняк, газовая
гангрена, скарлатина, ползучая эритема (рожа), сикоз в области бороды, фолликулит, контагиозное импетиго или буллезное импетиго и т.п. Термины "рана" и "язва", а также "рана" и "поражение кожи" часто
используются как синонимы, и, кроме того, эти термины часто используются произвольно. Поэтому, как
упоминалось выше, в контексте настоящего описания, термин "рана" также охватывает термины "язва",
- 33 -
015262
"повреждение", "поражение кожи" и "инфаркт", и эти термины являются взаимозаменяемыми, если это
не оговорено особо.
Ранами, подвергаемыми лечению способами согласно настоящему изобретению, являются также
раны таких типов, как (i) раны общего характера, например, такие как хирургические, травматические,
инфекционные, ишемические, тепловые, химические и буллезные раны; (ii) раны, характерные для полости рта, например, такие как раны, образующиеся после удаления зубов, раны пульпы и, в частности,
раны, возникающие при удалении кист и абсцессов, язвы и поражения бактериального, вирусного или
аутоиммунного происхождения, механические раны, химические раны, тепловые раны, инфекционные
раны и лихеноидные раны; при этом конкретными примерами являются герпетические язвы, афтозный
стоматит, острый некрозирующий язвенный гингивит и ожоги ротовой полости; и (iii) раны на коже, такие как, например, опухоли, ожоги (например, химические и тепловые), поражения, вызываемые заболеваниями (бактериальными, вирусными, аутоиммунными), укусы и хирургические раны. Другая классификация ран включает (i) незначительные потери ткани, вызываемые хирургическими операциями, небольшими ссадинами и неглубокими укусами, или (ii) значительные потери ткани. Последняя группа
включает ишемические язвы, пролежни, фистулы, рваные раны, глубокие укусы, тепловые ожоги, раны
на донорских участках при аутотрансплантации (в мягких и твердых тканях) и инфаркты.
Другими ранами, которые имеют важное значение с точки зрения настоящего изобретения, являются ишемические язвы, пролежни, фистулы, глубокие укусы, тепловые ожоги и раны на донорских участках. Ишемическими язвами и пролежнями являются раны, которые в нормальных условиях заживают
обычно очень медленно, и, разумеется, большое значение для пациента имеет, в частности, более эффективное и быстрое заживление раны. Кроме того, при эффективном и более быстром заживлении ран
стоимость лечения пациентов, имеющих такие раны, заметно снижается.
Ранами на донорских участках являются раны, которые образуются, например, после удаления
твердой ткани из части тела и ее переноса в другую часть тела, например при трансплантации. Раны,
возникающие после таких операций, являются очень болезненными, а поэтому их ускоренное заживление является весьма желательным. Термин "кожа" употребляется здесь в очень широком смысле и охватывает эпидермальный слой кожи, а в тех случаях, когда поверхность кожи является более или менее
поврежденной, то он относится также и к дермальному слою кожи. В отличие от рогового слоя эпидермальный слой кожи представляет собой внешний (эпителиальный) слой, а более глубокий слой соединительной ткани называется дермой.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения остеоартрита, системной красной волчанки, кожной красной волчанки, волчаночного нефрита, сахарного диабета типа 2 и
хронической обструктивной болезни легких, а также других заболеваний, перечисленных выше как IL-6ассоциированные заболевания, поражающие клетку, ткань, орган и организм животного или человека,
включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одно из таких заболеваний, как иммуннное заболевание, сердечно-сосудистое заболевание, инфекционное, злокачественное и/или нервное заболевание.
Такой способ может включать, но необязательно, введение эффективного количества по меньшей мере
одной композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-IL-6
антитело, в клетку, ткань, орган или организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или терапии.
Любой способ согласно изобретению может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, в клетку, ткань, орган или организм животного или человека, нуждающихся в такой модуляции, лечении или
терапии. Такой способ может также, но необязательно, включать совместное введение или комбинированную терапию для лечения указанных заболеваний или расстройств, где введение указанного по
меньшей мере одного анти-IL-6 антитела или его конкретной части или варианта также предусматривает
одновременное введение или введение до и/или после введения по меньшей мере одного средства, выбранного по меньшей мере из таких средств, как антагонист TNF (например, такой как, но не ограничивающийся ими, антагонист TNF, являющийся химическим соединением или белком, моноклональное
или поликлональное антитело или его фрагмент против TNF, растворимый рецептор TNF (например,
р55, р70 или р85) или его фрагмент, гибридные полипептиды или небольшая молекула-антагонист TNF,
например TNF-связывающий белок I или II (TBP-I или TBP-II), нерелимонмаб, инфликсимаб, этанерцепт, (Enbrel™), адалимумаб (Humira™), CDP-571, CDP-870, афелимомаб, ленерцепт и т.п.), противоревматическое средство (например, метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, тиомалат золотанатрия, сульфат гидроксихлорохина, лефлуномид, сульфазальцин), миорелаксант, наркотическое средство, нестероидное противовоспалительное средство (НСПВС), аналгетик, анестетик, седативное средство,
анестетик для местного применения, нейромышечный блокатор, противомикробное средство (например,
аминогликозид, противогрибковое средство, средство против паразитов, противовирусное средство, карбапенем, цефалоспорин, фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин и другие противомикробные средства), средство для лечения псориаза, кортикостероид, анаболический стероид,
средство для лечения диабета, микроэлементы, натуральное средство, средство для лечения щитовидной
железы, витамин, кальций-ассоциированный гормон, средство против диареи, средство против кашля,
- 34 -
015262
противорвотное средство, средство против язвы, слабительное средство, антикоагулянт, эритропоэтин
(например, эпоэтин-альфа), филграстим (например, G-CSF, Neupogen), сарграмостим (GM-CSF, лейкин),
средство для иммунизации, иммуноглобулин, иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон роста, средство для гормонзаместительной терапии, модулятор эстрогеновых
рецепторов, мидриатическое средство, средство для лечения циклоплегии, алкилирующий агент, антиметаболит, ингибитор митоза, радиофармацевтическое средство, антидепрессант, средство против маниакальной депрессии, антипсихотическое средство, анксиолитическое средство, гипнотическое средство,
симпатомиметик, стимулятор, донепезил, такрин, противоастматическое лекарственное средство, бетаагонист, стероид, вводимый путем ингаляции, ингибитор лейкотриена, метилксантин, кромолин, эпинефрин или его аналог, дорназа-альфа (Pulmozyme), цитокин или антагонист цитокина. Подходящие дозы таких средств хорошо известны специалистам. См., например, руководства Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon
Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001
Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide
2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ., каждое из которых полностью
включено в настоящее описание посредством ссылки.
Антагонистами TNF, подходящими для получения композиций, комбинированной терапии, совместного введения и для использования в устройствах или способах согласно настоящему изобретению
(также включая по меньшей мере одно антитело, его определенную часть и вариант настоящего изобретения), являются, но не ограничиваются ими, анти-TNF антитела (например, по меньшей мере один антагонист TNF, определенный выше), его антигенсвязывающие фрагменты и рецепторные молекулы, которые специфически связываются с TNF; соединения, которые предотвращают и/или ингибируют синтез
TNF, секрецию TNF или их действие на клетки-мишени, например, такие соединения, как талидомид,
тенидап, ингибиторы фосфодиэстеразы (например, пентоксифиллин и ролипам), агонисты аденозинового
рецептора А2b и стимуляторы аденозинового рецептора А2b; соединения, которые предотвращают и/или
ингибируют передачу сигнала рецептора TNF, такие как активированные митогеном ингибиторы протеинкиназы (MAP); соединения, которые блокируют и/или ингибируют расщепление мембранного TNF,
такие как ингибиторы металлопротеиназы; соединения, которые блокируют и/или ингибируют активность TNF, такие как ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента (АСЕ) (например, каптоприл); и соединения, которые блокируют и/или ингибируют продуцирование и/или синтез TNF, такие
как ингибиторы МАР-киназы.
Используемые здесь термины "антитело против фактора некроза опухоли", "антитело против TNF",
"антитело против TNFα" или его фрагмент и т.п. означают антитело, которое снижает, блокирует, ингибирует, отменяет или предотвращает активность TNFα in vitro, in situ и/или предпочтительно in vivo. Так,
например, подходящее человеческое анти-TNF антитело настоящего изобретения может связываться с
TNFα, и таким антителом являются анти-TNF антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и их конкретные мутанты или домены, которые специфически связываются с TNFα. Подходящее анти-TNF антитело или его фрагмент могут также снижать, блокировать, отменять, предотвращать, предупреждать
и/или ингибировать синтез РНК, ДНК или белка TNF, высвобождение TNF, передачу сигнала рецептора
TNF, расщепление мембранного TNF, активность TNF, продуцирование TNF и/или синтез TNF.
Примером анти-TNF антитела или антагониста TNF является химерное антитело сА2. Другие примеры моноклональных анти-TNF антител, которые могут быть использованы в настоящем изобретении,
описаны в литературе (см., например, патент США № 5231024; Möller, A. et al., Cytokine 2(3): 162-169
(1990); заявка на патент США № 07/943852 (поданная 11 сентября 1992); Rathjen et al., публикация международной заявки № WO 91/02078 (опубликованной 21 февраля, 1991); Rubin et al., GLP-1, публикация
патента № 0218868 (22 апреля, 1987); Yone et al., GLP-1 P публикация патента № 0288088 (26 октября
1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Coram., 757:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma, 6:305-311
(1987); Fendly et al., Hybridoma, 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma, 6:489-507 (1987); and Hirai,
et al., J. Immunol. Meth., 96:51-62 (1987), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Молекулы TNF-рецептора
Предпочтительными молекулами TNF-рецептора, используемыми в настоящем изобретении, являются молекулы, которые связываются с TNFα с высокой аффинностью (см., например, Feldmann et al.,
международную заявку № WO 92/07076 (опубликованную 30 апреля, 1992); Schall et al., Cell., 61:361-310
(1990) и публикацию Loetscher et al., Cell., 67:351-359 (1990), которые полностью включены в настоящее
описание посредством ссылки) и обладают, но необязательно, низкой иммуногенностью. В настоящем
изобретении могут быть использованы TNF-рецепторы клеточной поверхности, а в частности 55 кДа
(р55 TNF-R) и 75 кДа (р75 TNF-R). В настоящем изобретении могут быть также использованы и усеченные формы TNF-рецепторов, содержащие внеклеточные домены (ECD) рецепторов или их функциональных частей (см., например, Corcoran et al., Eur. J. Biochem., 223:831-840 (1994)). Усеченные формы
TNF-рецепторов, содержащие ECD, были обнаружены в моче и сыворотке в виде 30 кДа- и 40 кДа- 35 -
015262
белков, ингибирующих связывание с TNFα (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem., 265:1531-1536 (1990)).
Мультимерные молекулы TNF-рецептора и гибридные молекулы TNF-иммунорецептора и их производные, фрагменты или части являются дополнительными примерами молекул TNF-рецептора, которые могут быть использованы в способах и композициях согласно изобретению.
Мультимерные молекулы TNF-рецептора, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, содержат весь внеклеточный домен (ECD) или функциональную часть ECD двух или более
TNF-рецепторов, присоединенных посредством одного или нескольких полипептидных линкеров или
других непептидных линкеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Примером такой гибридной молекулы "TNF-иммунорецептор" является гибридный белок TNF-рецептор/IgG. Гибридные молекулы
"TNF-иммунорецептор" и методы их получения описаны в литературе (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol.,
2i:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991); Peppel et al., J.
Exp. Med., 774:1483-1489 (1991); Rolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219 (1994); Butler et al.,
Cytokine, 6(6):616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol., 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., патент
США № 5447851 и заявка на патент США 08/442133 (поданная 16 мая, 1995), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Методы продуцирования иммунорецепторных гибридных молекул можно также найти в патенте США № 5116964, в патенте США № 5225538, Capon et al.
и в публикации Capon et al., Nature 337:525-531 (1989), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Цитокинами являются любые известные цитокины. См., например, CopewithCytokines.com. Антагонистами цитокинов являются, но не ограничиваются ими, любое антитело, его фрагмент или миметик,
любой растворимый рецептор, его фрагмент или миметик, любая небольшая молекула-антагонист или
любые их комбинации.
Терапевтическое лечение
Любой способ согласно изобретению может включать лечение IL-6-опосредуемого расстройства,
где указанное лечение заключается во введении эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, в клетку, ткань, орган или
организм животного или человека, нуждающиеся в такой модуляции, лечении или терапии. Указанный
способ может также, но необязательно, включать совместное введение или комбинированную терапию
для лечения указанных заболеваний или расстройств, где указанное введение по меньшей мере одного
анти-IL-6 антитела или его конкретной части или варианта также предусматривает введение до, во время
и/или после введения по меньшей мере одного средства, выбранного по меньшей мере из таких средств,
как противоинфекционное лекарственное средство; лекарственное средство, воздействующее на сердечно-сосудистую (СС) систему; лекарственное средство, воздействующее на центральную нервную систему (ЦНС); лекарственное средство, воздействующее на вегетативную нервную систему (ВНС); лекарственное средство для лечения заболеваний дыхательных путей; лекарственное средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖК); гормональное лекарственное средство; лекарственное средство для регуляции водно-солевого баланса; гематологическое лекарственное средство; противоопухолевое лекарственное средство; иммуномодулирующее лекарственное средство; офтальмическое лекарственное средство; лекарственное средство для лечения заболеваний уха или носа; лекарственное средство
для местного применения; натуральное лекарственное средство или т.п.; по меньшей мере одно средство,
такое как антагонист TNF (например, такой как, но не ограничивающийся ими, анти-TNF антитело или
его фрагмент, растворимый рецептор TNF или его фрагмент, гибридные белки или низкомолекулярное
соединение-антагонист TNF); противоревматическое средство (например, такие как метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, этанерцепт, тиомалат золота-натрия, сульфат гидроксихлорохина,
лефлуномид, сульфазальцин); миорелаксант; наркотическое средство; нестероидное противовоспалительное средство (НСПВС); аналгетик; анестетик; седативное средство; анестетик для местного применения; нейромышечный блокатор; противомикробное средство (например, аминогликозид, противогрибковое средство, средство против паразитов, противовирусное средство, карбапенем, цефалоспорин,
фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин, другие противомикробные средства);
средство для лечения псориаза; кортикостероид; анаболический стероид; средство для лечения диабета;
микроэлементы; натуральное средство; средство для лечения щитовидной железы; витамин; кальцийассоциированный гормон; средство против диареи; средство против кашля; противорвотное средство;
средство против язвы; слабительное средство; антикоагулянт; эритропоэтин (например, эпоэтин-альфа);
филграстим (например, G-CSF, Neupogen); сарграмостим (GM-CSF, лейкин); средство для иммунизации;
иммуноглобулин; иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб); гормон роста; средство для гормонозаместительной терапии; модулятор рецептора эстрогена; мидриатическое средство; средство для лечения циклоплегии; алкилирующий агент; антиметаболит; ингибитор митоза; радиофармацевтическое средство; антидепрессант; средство против маниакальной депрессии; антипсихотическое средство; анксиолитическое средство; гипнотическое средство; симпатомиметик; стимулятор;
донепезил; такрин; противоастматическое лекарственное средство; бета-агонист; стероид, вводимый путем ингаляции; ингибитор лейкотриена; метилксантин; кромолин; эпинефрин или его аналог; дорназаальфа (Pulmozyme); цитокин или антагонист цитокина. Такие лекарственные средства, а также состав,
- 36 -
015262
показания, дозы и способы введения каждого из этих лекарственных средств хорошо известны специалистам (см., например, публикации Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, каждая из
которых полностью включена в настоящее описание посредством ссылки).
Обычно лечение патологических состояний осуществляют путем введения эффективного количества или дозы композиции по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела, которая в целом или в среднем
составляет в пределах по меньшей мере примерно от 0,01 до 500 мг по меньшей мере одного анти-IL-6
антитела на килограмм массы пациента на одну дозу, а предпочтительно по меньшей мере примерно от
0,01 до 100 мг антитела/килограмм массы пациента на разовую дозу или дробные дозы, в зависимости от
удельной активности антитела, содержащегося в данной композиции. Альтернативно, эффективная сывороточная концентрация может составлять 0,1-5000 мгк/мл на вводимую разовую дозы или вводимые
дробные дозы. Подходящие дозы могут быть установлены лечащим врачом и, как известно, зависят от
конкретного патологического состояния, удельной активности вводимой композиции и от конкретного
пациента, подвергаемого лечению. В некоторых случаях для достижения нужного терапевтического эффекта может оказаться необходимым повторное введение, то есть повторное введение индивидууму конкретно регулируемого или конкретно дозируемого количества, где такое введение индивидууму повторяют до тех пор, пока не будет установлена нужная суточная доза или не будет достигнут нужный эффект.
Предпочтительные дозы могут, но необязательно, составлять примерно 0,1-99 и/или 100-500 мг/кг
на одно введение, или любой интервал, или целую величину или дробную величину в указанном интервале, либо, для достижения нужной концентрации в сыворотке, эти дозы могут составлять 0,1-5000 мг/мл
сыворотки на одно разовое или многократное введение, или любой интервал, целую величину или дробную величину в указанном интервале. Предпочтительная доза анти-IL-6 антитела согласно изобретению
составляет примерно от 1 мг/кг до 3-6 или 12 мг/кг массы тела пациента.
Альтернативно, вводимая доза может варьировать в зависимости от известных факторов, таких как
фармакодинамические свойства конкретного агента, способ и путь его введения, возраст, состояние здоровья и масса реципиента; природа и тяжесть симптомов, вид сопутствующего лечения, режим лечения и
желаемый эффект. Обычно доза активного ингредиента может составлять примерно 0,1-100 мг/кг массы
тела. В основном для достижения нужных результатов эффективной является доза, составляющая 0,1-50,
а предпочтительно 0,1-10 мг/кг на одно введение разовой лекарственной формы или введение лекарственной формы пролонгированного высвобождения.
Неограничивающим примером является лечение человека или животных, которое может быть осуществлено путем введения однократной дозы или периодического введения дозы по меньшей мере одного антитела согласно изобретению, составляющей 0,1-100 мг/кг или любой интервал, или целую величину или дробную величину в указанном интервале, в день и вводимой по меньшей мере в течение
1-40 дней, либо альтернативно или дополнительно по меньшей мере в течение 1-52 недель, либо альтернативно или дополнительно по меньшей мере в течение 1-20 лет или в любой их комбинации при введении разовой дозы, при вливании или введении многократных доз.
Лекарственные формы (композиции), подходящие для внутреннего введения, обычно содержат
примерно от 0,001 до 500 мг активного ингредиента в одной разовой форме или в контейнере. В этих
фармацевтических композициях активный ингредиент обычно присутствует в количестве примерно
0,5-99,999 мас.% всей композиции.
Для парентерального введения указанное антитело может быть приготовлено в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка, взятого отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем для парентерального введения. Примерами таких носителей являются вода,
физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и примерно 1-10% альбумина человеческой сыворотки. Могут быть также использованы липосомы и безводные носители, такие как жирные
масла. Указанный носитель или лиофилизованный порошок могут содержать добавки, поддерживающие
изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и
консерванты). Указанную композицию стерилизуют известными или подходящими методами.
Подходящие фармацевтические носители описаны в последнем новом издании руководства Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, то есть стандартного руководства, используемого специалистами в данной области.
Альтернативное введение
Для введения фармацевтически эффективных количеств по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела согласно изобретению могут быть использованы многие известные и разработанные способы введения. Хотя ниже описано внутрилегочное введение, однако в соответствии с настоящим изобретением
аналогичные результаты могут быть достигнуты и другими способами введения. Анти-IL-6 антитела согласно изобретению могут быть доставлены в носителе в виде раствора, эмульсии, коллоида или суспензии, либо в виде сухого порошка с применением любых устройств и способов, подходящих для введения
путем ингаляции, или других способов, описанных в настоящей заявке или известных специалистам.
- 37 -
015262
Парентеральные составы и их введение
Составы для парентерального введения могут содержать стандартные наполнители, такие как стерильная вода или физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, растительные масла, гидрогенизированные нафталины и т.п. Водные или масляные суспензии для инъекций
могут быть получены с использованием соответствующего эмульгатора или увлажнителя и суспендирующего агента известными методами. Агентами для инъекций могут быть нетоксичные и не предназначенные для перорального введения разбавители, такие как водный раствор, стерильный раствор для инъекций или суспензия в растворителе. В качестве приемлемого носителя или растворителя могут быть
использованы вода, раствор Рингера, изотонический физиологический раствор и т.п.; а в качестве стандартного или суспендирующего растворителя может быть использовано стерильное нелетучее масло.
Для этих целей могут быть использованы нелетучее масло и жирная кислота любого вида, включая природные, синтетические или полусинтетические жирные масла или жирные кислоты, а также природные,
синтетические или полусинтетические моно-, ди- или триглицериды. Способы парентерального введения
известны специалистам, и такими способами являются, но не ограничиваются ими, стандартные способы
инъекций, способы с использованием безыгольных устройств, работающих путем подачи сжатого газа,
описанных в патенте США № 5851198, и лазерных перфораторов, как описано в патенте США
№ 5839446, где указанные патенты полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Альтернативная доставка
Настоящее изобретение также относится к доставке по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела
путем парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, интраабдоминального, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутрибрюшного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового,
интраперикардиального, внутрибрюшинного, интраплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, внутрисетчаточного, внутрипозвоночного, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного и интравезикулярного введения, введения в пораженный участок,
введения в виде болюса, а также вагинального, ректального, трансбуккального, подъязычного, интраназального или чрескожного введения. Для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) или любого другого введения композиция, содержащая по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, может быть, в частности, получена в форме жидких растворов или суспензий; для вагинального или
ректального введения эта композиция может быть, в частности, получена в полутвердых формах, таких
как, но не ограничивающихся ими, кремы и суппозитории; для трансбуккального или подъязычного введения она может быть получена в таких формах, но не ограничивающихся ими, как таблетки и капсулы;
для интраназального введения она может быть получена в таких формах, но не ограничивающихся ими,
как порошки, капли в нос, аэрозоли или некоторые другие составы; для чрескожного введения она может
быть получена в таких формах, но не ограничивающихся ими, как гель, мазь, лосьон, суспензия или система для доставки типа пластыря с химическими стимуляторами, такими как диметилсульфоксид, используемыми для модификации структуры кожи или для увеличения концентрации лекарственного средства в указанном чрескожном пластыре (см. работы Junginger et al., In "Drug Permeation Enhancement";
Hsieh D.S. Eds., p. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, которые полностью включены в настоящее
описание посредством ссылки), либо с окислителями, используемыми для облегчения нанесения составов, содержащих белки и пептиды, на кожу (WO 98/53847), или наложения электрических полей для создания путей кратковременного транспорта, например, при электропорации, либо для увеличения подвижности заряженных лекарственных средств, проходящих через кожу, например, при ионтофорезе, либо для обработки ультразвуком, например, при сонофорезе (патенты США №№ 4309989 и 4767402) (все
вышеуказанные публикации и патенты полностью включены в настоящее описание посредством ссылки).
Внутрилегочное/интраназальное введение
Для внутрилегочного введения предпочтительно по меньшей мере одна композиция анти-IL-6 антитела доставляется в виде частиц, имеющих размер, эффективный для их доставки в нижние дыхательные пути легких или в синусы. В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одно антиIL-6 антитело может быть доставлено с помощью любых ингаляторов или устройств для интраназального введения, известных специалистам и используемых для введения терапевтического средства путем
ингаляции. Такими устройствами, способными накапливать распыляемые композиции в синусовых пазухах или альвеолах пациента, являются ингаляторы с дозирующими клапанами для доставки, распылители, аэрозольные генераторы для сухих порошков, пульверизаторы и т.п. Специалистам также известны и
другие устройства, подходящие для регуляции внутрилегочного или интраназального введения антител.
Во всех указанных устройствах могут быть использованы композиции, подходящие для дозируемой доставки антитела, присутствующего в аэрозоле. Такие аэрозоли могут состоять либо из растворов (как водных, так и безводных), либо из твердых частиц.
В ингаляторах с дозируемой доставкой, таких как ингалятор с дозирующим клапаном Ventolin®,
обычно используется газ-пропеллент, и эти ингаляторы приводятся в действие во время вдыхания (см.,
- 38 -
015262
например, WO 94/16970, 98/35888). Ингаляторы для сухих порошков, такие как Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), ингалятор Spiros™ (Dura), устройства, имеющиеся в продаже под торговым знаком Inhale Therapeutics, и инсуффлятор Spinhaler® (Fisons) приводятся в действие при вдыхании смешанного порошка (патент США № 4668218 Astra, ЕР 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo,
WO 94/08552 Dura, патент США № 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, которые полностью включены в
настоящее описание посредством ссылки). Распылители, такие как AERx™ Aradigm, распылитель Ultravent® (Mallinckrodt) и распылитель Acorn II® (Marquest Medical Products) (патент США 5404871
Aradigm, WO 97/22376, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки) образуют аэрозоли из растворов, а ингаляторы с дозирующим клапаном, ингаляторы для сухих порошков и
т.п. генерируют мелкодисперсные аэрозоли. Эти конкретные примеры коммерчески доступных ингаляторов приводятся лишь для иллюстрации конкретных устройств, подходящих для осуществления настоящего изобретения, и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Предпочтительно композиция, содержащая по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, доставляется
с помощью ингалятора для сухих порошков или распылителя. Для введения по меньшей мере одного
антитела согласно изобретению устройство для ингаляции имеет несколько преимуществ. Так, например,
доставка с использованием устройства для ингаляции является достаточно надежной, воспроизводимой и
точной. С использованием устройства для ингаляции можно, но необязательно, осуществлять доставку
небольших сухих частиц, например, размером примерно менее чем 10 мкм, а предпочтительно примерно
1-5 мкм, которые легко вдыхаются.
Введение композиции анти-IL-6 антитела в виде спрея
Спрей, включающий композицию анти-IL-6 антитела, может быть получен путем подачи суспензии
или раствора по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела через сопло под давлением. Для достижения
нужного выхода и размера частиц необходимо выбрать соответствующие размеры и конфигурацию сопла, давление и скорость подачи жидкости. Электроспрей может быть продуцирован, например, путем
наложения электрического поля при подачи жидкости через капилляр или сопло. Предпочтительно, чтобы частицы белка композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело и доставляемой с
помощью распылителя, имели размер примерно менее чем 10 мкм, предпочтительно в пределах примерно 1-5 мкм, а наиболее предпочтительно примерно 2-3 мкм.
Составы композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, подходящие для доставки с помощью распылителя, обычно включают композицию антитела в водном растворе в концентрации, составляющей примерно 0,1-100 мг по меньшей мере одной композиции анти-IL-6 антитела на 1 мл
раствора или 1 мг/г, или любой интервал величин, целую величину или дробную величину в указанном
интервале. Данный состав может включать такие агенты, как эксципиент, буфер, вещество, придающее
изотоничность, консервант, поверхностно-активное вещество, а предпочтительно цинк. Указанный состав может также включать эксципиент или средство для стабилизации композиции антитела, такое как
буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. Белками-наполнителями, используемыми для
получения составов, содержащих композиции антител, являются альбумин, протамин или т.п. Типичными углеводами, используемыми для получения составов, содержащих композиции антител, являются
сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза или т.п. Состав, содержащий композицию антител, может
также включать поверхностно-активное вещество, которое может снижать или предотвращать поверхностно-индуцированную агрегацию композиции антител, вызываемую распылением раствора при образовании аэрозоля. При этом могут быть использованы различные стандартные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты, а также полиоксиэтилированные эфиры сорбита и жирных кислот. Их количества обычно составляют в пределах от 0,001 до
14 мас.% состава. Для целей настоящего изобретения особенно предпочтительными поверхностноактивными веществами являются полоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 или
т.п. Для получения составов белка, такого как анти-IL-6 антитело или его конкретные части или варианты, в данный состав могут быть также включены и другие агенты, известные специалистам.
Введение композиций анти-IL-6 антител с помощью аэрозольного ингалятора
Композиции антитела согласно изобретению могут быть введены с помощью аэрозольного ингалятора, такого как струйный ингалятор или ультразвуковой ингалятор. Обычно в струйном ингаляторе для
создания высокоскоростной струи воздуха, поступающей через отверстие, используется источник сжатого воздуха. Поскольку газ распространяется за пределы сопла, то создается область низкого давления,
которая направляет раствор композиции антитела через капиллярную трубку, присоединенную к резервуару с жидкостью. Поток жидкости из капиллярной трубки разделяется на нестабильные струйки и капельки на выходе из трубки, в результате чего образуется аэрозоль. Для получения нужных технологических характеристик данного струйного ингалятора могут быть использованы различные конфигурации,
скорости потока и типы перегородок. В ультразвуковом ингаляторе для создания вибрационной механической энергии используется электроэнергия высокой частоты, обычно с применением пьезоэлектрического преобразователя. Эта энергия передается составу, содержащему композицию антител, либо непосредственно, либо через связующую жидкость, в результате чего образуется аэрозоль, содержащая ком- 39 -
015262
позицию антитела. При этом предпочтительно, чтобы частицы композиции антитела, доставляемой с
помощью распылителя, имели размер примерно менее чем 10 мкм, предпочтительно в пределах примерно 1-5 мкм, а наиболее предпочтительно примерно 2-3 мкм.
Составы, содержащие по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело и подходящие для использования в
струйном или ультразвуковом аэрозольном ингаляторе, обычно включают по меньшей мере один белок
анти-IL-6 антитела, в концентрации примерно 0,1-100 мг на 1 мл раствора. Данный состав может включать такие компоненты, как эксципиент, буфер, средство, придающее изотоничность, консервант, поверхностно-активное вещество, а предпочтительно цинк. Указанный состав может также включать эксципиент или средство для стабилизации по меньшей мере одной композиции анти-IL-6 антител, такие
как буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. Белками-наполнителями, используемыми
для получения составов, содержащих по меньшей мере одну из композиций анти-IL-6 антитела, являются альбумин, протамин или т.п. Типичными углеводами, используемыми для получения по меньшей мере
одного анти-IL-6 антитела, являются сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза или т.п. Состав, содержащий по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело, может также включать поверхностно-активное
вещество, которое может снижать или предотвращать поверхностно-индуцированную агрегацию по
меньшей мере одного анти-IL-6 антитела, вызываемую распылением раствора при образовании аэрозоля.
При этом могут быть использованы различные стандартные поверхностно-активные вещества, такие как
полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты, и полиоксиэтилированные эфиры сорбита и
жирных кислот. Их количества обычно составляют в пределах от 0,001 до 4 мас.% состава. Для целей
настоящего изобретения особенно предпочтительными поверхностно-активными веществами являются
полоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 или т.п. Для получения составов, содержащих белок, такой как белок антитела, в данный состав белка могут быть также включены и другие
агенты, известные специалистам.
Введение композиций анти-IL-6 антител с помощью ингалятора с дозирующим клапаном
В ингаляторе с дозирирующим клапаном (MDI) пропеллент, по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело и любые наполнители или другие добавки содержатся в контейнере в виде смеси, включающей
сжиженный газ под давлением. Приведение в действие дозирующего клапана приводит к высвобождению смеси в виде аэрозоля, содержащего частицы размером предпочтительно менее чем примерно
10 мкм, более предпочтительно примерно 1-5 мкм, а наиболее предпочтительно примерно 2-3 мкм. Аэрозольные частицы нужного размера могут быть получены с использованием состава композиции антител,
приготовленного различными известными методами, включая размол на струйной мельнице, сушку распылением, конденсацию в критической точке и т.п. Предпочтительными ингаляторами с дозирующим
клапаном являются ингаляторы, производимые 3М или Glaxo, в которых используется гидрофторуглеродный пропеллент. Составы, содержащие по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело и вводимые с помощью ингалятора с дозирующим клапаном, обычно представляют собой тонкодисперсный порошок,
содержащий по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело в виде суспензии в безводной среде, например,
суспендированной в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Таким пропеллентом
может быть любой стандартный материал, используемый для этих целей, такой как хлорфторуглерод,
хлорфторуглеводород, фторуглеводород или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, HFA-134a (гидрофторалкан-134а), HFA-227 (гидрофторалкан-227) или т.п. Предпочтительным углеводородом является фторуглеводород. Поверхностноактивное вещество может быть выбрано так, чтобы оно стабилизировало по меньшей мере одно
анти-IL-6 антитело, суспендированное в пропелленте, для защиты активного агента от химической деградации и т.п. Подходящими поверхностно-активными веществами являются сорбитантриолеат, лецитин сои, олеиновая кислота или т.п. В некоторых случаях аэрозоли растворов предпочтительно приготавливают с использованием растворителей, таких как этанол. Для получения состава белка в данный
состав белка могут быть также включены и другие агенты, известные специалистам. Для каждого специалиста очевидно, что способы согласно изобретению могут быть осуществлены путем внутрилегочного введения композиций, содержащих по меньшей мере одну композицию анти-IL-6 антитела, с использованием других устройств, не описанных в настоящей заявке.
Пероральные составы и их введение
Составы для перорального введения основаны на совместном введении адъювантов (например, резорцинов и неионогенных поверхностно-активных веществ, таких как олеиловый эфир полиооксиэтилена и эфир н-гексадецилполиэтилена), используемых для искусственного усиления проницаемости стенок
кишечника, а также на совместном введении ингибиторов ферментов (например, ингибиторов трипсина
поджелудочной железы, диизопропилфторфосфата (DFF) и тразилола) в целях ингибирования ферментативного расщепления. Составы для доставки гидрофильных агентов, включая белки, антитела и комбинацию по меньшей мере двух поверхностно-активных веществ для перорального введения, трансбуккального введения, введения через слизистую, интраназального введения, внутрилегочного введения,
интравагинального или ректального введения, описаны в патенте США 6309663. Активное соединение,
являющееся компонентом твердой лекарственной формы для перорального введения, может быть смешано по меньшей мере с одной добавкой, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу,
- 40 -
015262
раффинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакантовую
камедь, аравийскую камедь, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Эти лекарственные формы могут также содержать добавки другого типа (типов), например неактивный разбавитель; замасливатель, такой как стеарат магния, парабен; консервант,
такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол; антиоксидант, такой как цистеин; дезинтегратор; связующий агент; загуститель; забуферивающий агент; подсластитель; отдушку; ароматизатор и т.п.
Таблетки и драже могут быть также изготовлены в виде препаратов с энтеросолюбильным покрытием. Жидкими препаратами для перорального введения являются эмульсии, сиропы, эликсиры, суспензии и растворы, пригодные для использования в медицине. Такие препараты могут содержать неактивные разбавители, обычно используемые специалистами в данной области, например вода. В качестве
систем для доставки таких лекарственных средств, как инсулин и гепарин, также используются липосомы (патент США № 4239734). Совсем недавно для доставки фармацевтических средств были использованы микросферы из искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеиноидов) (патент США
№ 4925673). Кроме того, для пероральной доставки биологически активных агентов используются соединения-носители, описанные в патентах США №№ 5879681 и 5871753 и известные специалистам.
Составы для введения через слизистую и их применение
Состав для перорального введения биоактивного вещества, инкапсулированного в одном или нескольких биосовместимых полимерных или сополимерных эксципиентах, а предпочтительно в биологически разлагаемом полимере или сополимере, представляет собой микрокапсулы, которые благодаря
своему размеру позволяют указанному веществу достигать групповых лимфатических фолликул животного, иначе называемых "пейеровыми бляшками" или "GALT", без снижения его эффективности благодаря прохождению такого агента через желудочно-кишечный тракт. Аналогичные групповые лимфатические фолликуллы могут присутствовать в бронхиолах (BALT) и в толстом кишечнике. Вышеуказанные
ткани обычно называются лимфоретикулярными тканями слизистых оболочек (MALT). Для абсорбции
через поверхности слизистой в композициях и методах введения по меньшей мере одного анти-IL-6 антитела используется эмульсия, которая содержит множество субмикронных частиц, мукоадгезивную
макромолекулу, биологически активный пептид и водную непрерывную фазу и которая стимулирует
абсорбцию через поверхности слизистой оболочки посредством адгезии эмульсионных частиц на поверхности слизистой оболочки (патент США № 5514670). Способами, подходящими для нанесения
эмульсий согласно изобретению на поверхность слизистых оболочек, являются роговичное, конъюнктивальное, трансбуккальное, подъязычное, интраназальное, вагинальное, внутрилегочное, внутрижелудочное, интестинальное и ректальное введение. Составы для вагинального или ректального введения, например суппозитории, могут содержать эксципиенты, например полиалкиленгликоли, вазелин, маслокакао и т.п. Составы для интраназального введения могут быть твердыми и могут содержать в качестве
эксципиента, например, лактозу либо они могут представлять собой водные или масляные растворы капель в нос. Для трансбуккального введения эксципиентами являются сахара, стеарат кальция, стеарат
магния, предварительно желатинизированный крахмал и т.п. (патент США № 5849695).
Чрескожные композиции и их введение
Для чрескожного введения по меньшей мере одно анти-IL-6 антитело инкапсулируют в системы для
доставки, такие как липосома или полимерные наночастицы, микрочастицы, микрокапсулы или микросферы (имеющие общее название "микрочастицы", если это не оговорено особо). Известно несколько
подходящих систем, включая микрочастицы, изготовленные из синтетических полимеров, таких как полиоксикислоты, например полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры, полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены, и природных полимеров, таких как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды и их комбинации (патент США
№ 5814599).
Пролонгированное введение и композиции
Иногда индивидууму желательно вводить соединения согласно изобретению в течение продолжительного периода времени, например в течение периода времени от одной недели до одного года в виде
разовой дозы. Для этого могут быть использованы различные лекарственные формы для пролонгированного высвобождения, депо-формы или имплантаты. Так, например, лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединений, обладающую низкой степенью растворимости в физиологических жидкостях, например (а) кислотно-аддитивную соль с полиосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинмоно- или нафталиндисульфоновые кислоты, полигалактуроновая кислота и т.п.; (b) соль, образованную катионом поливалентного металла, такого как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель,
кадмий и т.п., или органическим катионом, образованным, например, N,N'-дибензилэтилендиамином или
этилендиамином; или (с) комбинацию (а) и (b), например цинковую соль дубильной кислоты. Кроме того, соединения согласно изобретению или предпочтительно его относительно нерастворимая соль, такая
как вышеуказанные соли, могут быть приготовлены в виде геля, например геля, содержащего моностеа- 41 -
015262
рат алюминия с добавлением, например, кунжутного масла для инъекции. Особенно предпочтительными
солями являются соли цинка, цинковые соли дубильной кислоты, соли памовой кислоты и т.п. Другие
типы депо-состава замедленного высвобождения, предназначенные для инъекций, могут содержать соединение или соль, диспергированную для инкапсуляции в медленно разлагающемся нетоксичном и неантигенном полимере, таком как полимер полимолочной кислоты/полигликолевой кислоты, например,
описанный в патенте США № 3773919. Соединения или предпочтительно их относительно нерастворимые соли, например соли, описанные выше, могут быть также получены в виде силастических гранул с
холестериновым матриксом, которые могут быть, в частности, использованы для введения животным.
Другие составы для замедленного высвобождения, депо-формы или имплантаты, например газовые или
жидкие липосомы, описаны в литературе (патент США № 5770222 и "Sustained and Controlled Release
Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).
Хотя выше представлено общее описание настоящего изобретения, однако для лучшего понимания
настоящего изобретения ниже приводятся конкретные примеры, которые служат лишь для иллюстрации
изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение.
Показания
Ревматоидный артрит (РА).
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое системное воспалительное заболевание
с аутоиммунными признаками. Некоторые признаки РА могут быть объяснены нерегулируемым действием IL-6.
Действием IL-6, играющим важную роль в развитии РА, является индуцирование поликлональной
гипергаммаглобулинемии и продуцирование аутоантител (ревматоидного фактора), где IL-6 действует
как фактор дифференцировки В-клеток; стимуляция развития цитотоксических Т-клеток, где IL-6 действует в сочетании с IL-2; продуцирование белков острой фазы (CRP, SAA, фибриногена) посредством гепатоцит-стимулирующей активности; активация остеокластов, приводящая к околосуставному остеопорозу и деструкции кости; индуцирование тромбоцитоза, где IL-6 действует как фактор дифференцировки
мегакариоцитов; и регуляция VEGF, которая может приводить к ангиогенезу, где IL-6 действует в сочетании с IL-1β и TNFα.
IL-6 продуцируется фибробластами в синовиальной жидкости индивидуумов с РА, стимулируемыми TNFα или IL-1, и присутствует в высокой концентрации в синовиальной жидкости (СЖ) и в сыворотке индивидуумов с РА. Существует корреляция между уровнями IL-6 в сыворотке и клиническими/лабораторными показателями активности заболевания.
Анти-IL-6/IL-6R mAbs были исследованы в нескольких клинических испытаниях, проводимых с
участием пациентов с активным РА. Полученные результаты вкратце приводятся ниже.
Испытания фазы I/II.
В первом из этих испытаний мышиное анти-IL-6 mAb (BE-8) вводили ежедневно в течение 10 дней
5 пациентам с РА и такое введение давало временное улучшение по клиническим и лабораторным показателям (9) (Wendling, D., et al., 1993, J. Rheumatol., 20:259). Гуманизованное анти-IL-6R (80 кДа) mAb
(MRA; Chugai) анализировали у пациентов с РА в нескольких испытаниях фазы I/II. В первом из этих
испытаний MRA вводили путем i.v. вливания в дозах 1-50 мг один или два раза в неделю с применением
поддерживающей терапии в дозе 50 мг в неделю в течение 6 месяцев. Это приводило к быстрому снижению признаков острой фазы заболевания, уровней С-реактивного белка (CRP) и фибриногена, а также к
снижению субфебрильной температуры, устранению усталости и к улучшению клинических показателей, таких как утренняя скованность, опухание и болезненность суставов. Также наблюдалась положительная динамика в развитии анемии, тромбоцитоза и гипергаммаглобулинемии. В следующем испытании 45 пациентов подвергали лечению путем одного i.v. вливания MRA в дозе 0,1-10 мг/кг, что приводило к улучшению клинических показателей при более высоких уровнях доз и к снижению продуктов, являющихся признаками острой фазы заболевания.
Испытания фазы II.
В первом из этих испытаний 15 пациентов подвергали лечению путем введения MRA (в дозах 2, 4
или 8 мг/кг, вводимых два раза в неделю в течение 24 недель), и через 24 недели были обнаружены
ACR20-ответы у 13 из 15 пациентов, где полученные данные были нормализованы по CRP/сывороточному амилоиду А (SAA). Хотя основная проблема опасности, связанная с острой фазой заболевания,
была устранена, однако у двух третей пациентов наблюдалось заметное увеличение уровней холестерина
ЛПНП. Во втором испытании фазы II 164 пациентам с РА, резистентным к DMARD, вводили плацебо
или MRA путем i.v. вливания (в дозах 4 или 8 мг/кг, вводимых через 4 недели в течение 3 месяцев), и
через 12 недель были обнаружены ACR20-ответы у 11, 57 и 78% пациентов, которым вводили плацебо,
4 и 8 мг/кг MRA соответственно. И, наконец, 359 пациентам с активным РА вводили только МТХ
(10-25 мг/неделю), только MRA (в дозах 2, 4 или 8 мг/кг, вводимых ежемесячно путем i.v. вливания) или
MTX+MRA. MRA и MRA+MTX были более эффективными, чем один МТХ, как было определено по
ACR20-ответу.
Системная красная волчанка (СКВ).
- 42 -
015262
СКВ представляет собой хроническое, потенциально смертельное аутоиммунное заболевание с широким многообразием манифестаций. Этиология этого заболевания не ясна. Одним из признаков этого
заболевания является гиперпролиферация и активация В-клеток, а также продуцирование аутоантител
против различных аутоантигенов.
IL-6 индуцирует дифференцировку В-клеток с образованием антителопродуцирующих клеток. При
СКВ наблюдается повышенный уровень продуцирования аутоантител (ANA, анти-дцДНК антител) такими антителопродуцирующими клетками и отложение иммунных комплексов. IL-6 стимулирует развитие цитотоксических Т-клеток, увеличение уровней гепатоцитарных реагентов-индикаторов острой фазы, пролиферацию мезангиальных клеток, рост кератиноцитов, дифференцировку мегакератиноцитов и
тромбоз.
У пациентов с СКВ и у мышей с моделью СКВ уровни IL-6 увеличены. Было показано, что IL-6рецептор, связывающийся с В-клетками, индуцирует конечную стадию дифференцировки В-клеток с
образованием клеток, продуцирующих аутоантитела. Linker-Israeli и сотрудниками (Linker-Israeli M. et
al., 1991, J. Immunol. 147:117-123) было обнаружено снижение уровня спонтанного продуцирования поликлональных антител в присутствии нейтрализующих антител против IL-6. Эти данные были подтверждены Kitani и сотрудниками (Kitani A., et al., 1992 Clin. Exp. Immunol., 88:75-83), которые показали, что
уровень in vitro продуцирования IL-6 Т-клетками удваивается в СКВ-культурах, и что В-клетки при СКВ
продуцируют уровни IL-6, в 5 раз превышающие уровни IL-6, продуцируемые контрольными
В-клетками. Однако патологическое продуцирование аутоантител при СКВ не ограничивается только
действием IL-6. Была также исследована роль IL-6-рецептора. Nagafuchi и сотрудниками была обнаружена позитивная регуляция IL-6-рецептора в большинстве В-клеток у пациентов с СКВ по сравнению с
нормальными В-клетками. Антитело против IL-6-рецептора ингибирует конечную стадию дифференцировки этих В-клеток с образованием антителопродуцирующих клеток. Роль растворимого IL-6-рецептора
при СКВ пока еще не установлена.
Сахарный диабет типа II (T2DM).
Считается, что основными причинами, вызывающими развитие сахарного диабета типа 2 (T2DM),
являются инсулинорезистентность (нарушение действия инсулина) и нарушение функции β-клеток
(функциональное нарушение секреции инсулина панкреатическими β-клетками). Инсулинорезистентность характеризуется неспособностью периферических тканей адекватно реагировать на поступление
инсулина, что приводит к увеличению уровней глюкозы в крови. Увеличение инсулинорезистентности и
уровней глюкозы в крови сопровождается компенсирующей гиперсекрецией инсулина панкреатическими β-клетками на ранних стадиях заболевания. По мере прогрессирования T2DM способность β-клеток
секретировать инсулин снижается.
Механизмы, ответственные за развитие инсулинорезистентности, точно не установлены. Одним из
состояний, наиболее часто ассоциированных с развитием T2DM, является ожирение, причем даже небольшое снижение веса приводит к значительному снижению уровней глюкозы у пациентов с T2DM.
Как ожирение, так и инсулинорезистентность/гиперинсулинемия в комбинации с дислипидемией,
нарушенной толерантностью к глюкозе и гипертензией характеризуются состоянием, называемым метаболическим синдромом. Естественное прогрессирование метаболического синдрома с развитием предрасположенности у индивидуумов с T2DM приводит к микро- и макрососудистым изменениям, которые
могут индуцировать развитие сердечно-сосудистых (СС) заболеваний и, в конечном счете, приводить к
летальному исходу. Было высказано предположение, что ожирение, инсулинорезистентность и гиперинсулинемия, по всей вероятности, являются промежуточным звеном между T2DM и сердечно-сосудистым
заболеванием (ССЗ).
Жировая ткань была идентифицирована как один из множества органов, которые регулируют метаболизм, и представляет собой депо для накопления энергии и эндокринный орган, который секретирует
различные молекулы, участвующие в регуляции чувствительности к инсулину. Помимо лептина, резистина, адипонектина и TNFα жировая ткань секретирует IL-6, продуцирование которого, как предполагается, является промежуточным звеном между развитием ожирения, воспаления, T2DM и сердечнососудистого заболевания (ССЗ).
Была также описана положительная корреляция между ожирением и уровнями IL-6. Возможно, что
увеличение образования жировой ткани при ожирении может способствовать стойкому увеличению
уровней циркулирующего IL-6, которое может приводить к снижению чувствительности к инсулину посредством стимуляции воспаления чувствительных к инсулину тканей или приводить к инсулинорезистентности в результате негативного влияния на активность и экспрессию белков, участвующих в каскаде реакций передачи инсулинового сигнала. Имеются in vitro и in vivo данные, которые подтверждают
или опровергают возможную роль IL-6 в развитии инсулинорезистентности.
In vitro данные, полученные с использованием хорошо изученных клеточных систем, включая клетки печени (HepG2)(44), жировые клетки (3T3L1) или выделенные у крыс клетки панкреатических островков, показали, что IL-6 оказывает прямое негативное воздействие на передачу инсулинового сигнала,
поглощение глюкозы и секрецию инсулина соответственно. С другой стороны, данные, полученные из
- 43 -
015262
экспериментов, проведенных на биоптатах скелетных мышц, позволяют предположить, что IL-6 может
повышать уровень поглощения глюкозы в работающей мышце.
Данные, полученные в экспериментах in vivo по взаимосвязи между уровнями IL-6 и чувствительностью к инсулину, являются противоречивыми. Данные, полученные на моделях сверхэкспрессии IL-6
или его полной элиминации, позволяют предположить, что полное ингибирование активности IL-6 может не давать благоприятный эффект. Так, например, у трансгенных мышей с моделью диабета без ожирения (NOD), сверхэкспрессия человеческого IL-6 приводит к замедлению развития диабета и к увеличению продолжительности жизни. Кроме того, данные, полученные от IL-6-дефицитных мышей, позволяют предположить, что IL-6 может играть определенную роль в регуляции энергетического баланса, поскольку у таких животных наблюдается позднее развитие ожирения и более высокие уровни глюкозы.
У людей природная мутация в области промотора IL-6 приводила к увеличению уровней секреции
IL-6. Такая мутация ассоциировалась как с увеличением, так и со снижением чувствительности к инсулину.
В другой серии экспериментов оценивали действие экзогенного IL-6. У нормальных индивидуумов
введение IL-6 приводило к увеличению уровней глюкозы без какого-либо влияния на концентрацию инсулина в плазме, тогда как у пациентов с раком добавление IL-6 приводило к усилению поглощения глюкозы. Кроме того, была оценена корреляция между уровнями IL-6 и инсулинорезистентностью. Данные,
полученные из этих экспериментов, позволяют предположить, что у мужчин и женщин более высокие
уровни IL-6 в кровотоке коррелируют с более высокой инсулинорезистентностью, хотя их причинноследственная связь не была установлена.
Было показано, что IL-6 играет важную роль в развитии инсулинорезистентности, ассоциированной
с ожирением. Однако эксперименты in vitro и in vivo дают противоречивые данные, которые подтверждают или опровергают возможную роль IL-6 в развитии инсулинорезистентности.
Остеоартрит (ОА).
ОА представляет собой хроническое, дегенеративное заболевание суставов, характеризующееся потерей ткани суставного хряща и аналогичными изменениями в подхрящевой кости. Хотя при артроскопии или в биоптатах синовиальной жидкости наблюдаются воспаления различной степени, однако это
заболевание по своей первичной природе не является воспалительным. Более того, считается, что причиной этого заболевания являются изменения метаболизма хондроцитов и/или остеобластов. TNF, IL-1 и
IL-6 представляют собой цитокины, которые обнаруживают наиболее явную взаимосвязь с указанными
изменениями.
IL-6 был детектирован в синовиальной жидкости пациентов с ОА, хотя и на уровнях, значительно
более низких, чем уровни, наблюдаемые при воспалительных артропатий (Bertazzolo, N. et al., 1994,
Agents and Actions, 41:90-92). Известно, что IL-6 является главным стимулятором синтеза белков гепатоцитов острой фазы, а уровни CRP ассоциируются с остеоартритом (ОА) коленей, даже если принять во
внимание известную взаимосвязь между CRP и ожирением (Mohtai, M. et al., 1996, J. Orthopedic Research,
14:67-73).
IL-6 экспрессируется в хондроцитах хряща при ОА, но не в нормальном хряще (Sowers, M. et al.,
2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10:595-601). В экспериментах, проводимых для анализа влияния механической нагрузки на экспрессию цитокинов в хондроцитах in vitro, индуцированное жидкостью напряжение при сдвиге приводило к заметной стимуляции продуцирования мРНК и белка IL-6. Это дает основание предположить, что экспрессия IL-6 в хряще у пациентов с ОА может быть результатом механической нагрузки. IL-6 может также продуцироваться в ответ на действие IL-1 в хондроцитах (Dozin, В. et
al., 2002, Matrix Biology, 21:449-459).
В других экспериментах IL-6 в комбинации с sIL-6R, приводит к ингибированию синтеза протеогликана человеческими хондроцитами суставов, культивированными ex vivo, хотя такой эффект был гораздо более скромным по сравнению с эффектом IL-1 (Guerne, P. et al., 1999, Matrix Biology, 18: 253-260).
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ).
ХОБЛ представляет собой патологическое состояние, характеризующееся ограничением проходимости дыхательных путей, которое не является полностью обратимым. Такое ограничение проходимости
дыхательных путей обычно прогрессирует и ассоциируется с патологическим воспалительным ответом в
легких на вредные частицы и газы (Pauwels R.A. et al., 2001, Am. J. Respir Crit Care Med., 163:1256-1276).
ХОБЛ характеризуется ускорением естественного снижения функции легких, наблюдаемого в старости.
Медленно прогрессирующее ограничение проходимости дыхательных путей приводит к инвалидности и
к преждевременной смерти. ХОБЛ является лидирующей причиной смертности и инвалидности, однако
исследования клеточных и молекулярных механизмов, вызывающих это заболевание, стали интенсивно
проводиться лишь недавно (Barnes P.J. et al., 2003, Eur. Respir. J., 22:672-688). При ХОБЛ наблюдается
хроническое воспаление, которое приводит к фиксированному сужению нижних дыхательных путей и
альвеолярной деструкции (эмфиземе). Воспалительный ответ характеризуется увеличением альвеолярных макрофагов, нейтрофилов и цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождением множества медиаторов воспаления (хемокинов, цитокинов, факторов роста и липидов). Такое воспаление может усиливаться сильным окислительным стрессом. При этом также повышается эластолиз и имеются данные, ука- 44 -
015262
зывающие на участие в этих процессах некоторых эластолитических ферментов. Воспаление и протеолиз
при ХОБЛ характеризуются усилением нормального воспалительного ответа на сигаретный дым. В отличие от астмы такое воспаление, очевидно, является резистентным к кортикостероидам (Barnes P.J. et
al., 2003).
У животных-моделей бактериальный эндотоксин или липополисахариды (ЛПС) и сигаретный дым
индуцируют нейтрофилию и повышают уровень продуцирования IL-6 в жидкости бронхоальвеолярного
лаважа (BAL) (Underwood D.C. et al., 2000, AJPLCMP 279:L895-902). Сверхэкспрессия IL-6 в легких мышей индуцирует эмфизему (Kuhn III Ch. et al., 2000 AJRCMB 22:289-2 95). У людей объем форсированного выдоха за одну секунду (FEV1) обратно пропорционален уровням IL-6 и IL-8 и числу полиморфонуклеарных клеток в BAL (Soler N. et al., 1999, Eur. Respir. J., 14:1015-1022). У индивидуумов с ХОБЛ
средней тяжести и с тяжелой формой ХОБЛ наблюдаются повышенные уровни TNFα, IL-6 и CRP (Yasuda N. et al., 1998, Respir. Med., 92:993-999).
Обострение ХОБЛ определяют как стойкое ухудшение состояния пациента, находящегося в стабильной стадии заболевания, которое отличается от обычных суточных вариаций и которое имеет острое
начало и требует регулярного введения лекарственных составов (Burge S. et al., 2003, Eur. Respir. J., 21:
Suppl. 41, 46s-53s). Хотя усиление симптомов и ухудшение функции легких является наиболее распространенной причиной госпитализации (в США приблизительно 500000 человек в год), однако клеточные
и молекулярные механизмы, лежащие в их основе, пока еще хорошо не изучены и не совсем ясны
(Wedzicha, J.A., 2002, Chest. 121:136S-141S). Такое обострение может быть достаточно продолжительным и серьезно влиять на качество жизни пациента, а также ускорять прогрессирование ХОБЛ (Soto F.J.
et al., 2003, Pulm. Med., 9:117-124). Наиболее распространенными причинами, вызывающими обострение
ХОБЛ, являются респираторные инфекции. Большинство этих инфекций вызываются бактериями, но
многие из них вызываются вирусными патогенами, а в частности риновирусами (Soto F.J. et al., 2003).
Определенную роль могут также играть факторы окружающей среды, загрязнение воздуха и температура
окружающей среды.
В процессе обострения наблюдается увеличение числа нейтрофилов и концентрации IL-6, IL-8,
TNFα и LTB4 в мокроте пациентов с ХОБЛ. У некоторых пациентов с ХОБЛ средней тяжести и с тяжелой ХОБЛ наблюдаются частые обострения (три или более обострений в год). У этой группы пациентов
("с частыми обострениями") и даже у пациентов с ХОБЛ в стабильной фазе обнаруживаются более высокие уровни IL-6 и более низкие уровни секреторных лейкоцитарных ингибиторов протеазы (Bhowmik A.
et al., 2000, Thorax, 55:114-120; Gompertz S. et al., 2001, Thorax 56: 36-41; Gompertz S. et al., 2001, Eur. Respir. J., 17:1112-1119).
В физиологии обострения ХОБЛ также участвуют и другие механизмы, такие как окислительный
стресс и бактериальная колонизация.
Пример 1. Клонирование и экспрессия анти-IL-6 антитела в клетках млекопитающих.
Типичный вектор для экспрессии в клетках млекопитающих содержит по меньшей мере один промоторный элемент, который опосредует инициацию транскрипции мРНК, антителокодирующую последовательность и сигналы, необходимые для терминации транскрипции и полиаденилирования транскрипта. Дополнительными элементами являются энхансеры, последовательности Козака и интронные
последовательности, фланкированные донорными и акцепторными сайтами для РНК-сплайсинга. Высокоэффективная транскрипция может быть достигнута с использованием раннего и позднего промоторов
SV40, длинных концевых повторов (LTRS), происходящих от ретровирусов, например RSV, HTLV-I,
ВИЧ-1 и раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Однако могут быть также использованы и клеточные элементы (например, промотор человеческого актина). Подходящими экспрессионными векторами, используемыми для осуществления настоящего изобретения, являются, например, такие векторы,
как pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN или pLNCX (Clontech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-),
pcDNA/Zeo (+/-) или pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL и PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden),
pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) и pBC12MI (ATCC 67109). Подходящими клетками млекопитающих и другими клетками-хозяевами являются человеческие клетки Hela, 293, H9 и клетки Jurkat,
мышиные клетки NIH3T3 и С127, клетки Cos I, Cos 7 и CV1, клетки QC1-3 перепелов, мышиные
L-клетки и клетки яичника китайского хомячка (СНО). Альтернативно, ген может экспрессироваться в
стабильных клеточных линиях, которые содержат ген, интегрированный в хромосому. Котрансфекция
селективным маркером, таким как ген dhfr, ген gpt, ген неомицина или гигромицина, позволяет идентифицировать и выделять трансфицированные клетки.
Трансфицированный ген может быть также амплифицирован для экспрессии больших количеств
кодируемого антитела. Маркер DHFR (дигидрофолатредуктаза) может быть использован для выявления
клеточных линий, несущих несколько сотен или даже несколько тысяч копий представляющего интерес
гена. Другим подходящим селективным маркером является фермент глутаминсинтаза (GS) (Murphy et al.,
Biochem. J., 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175 (1992)). С использованием
этих маркеров клетки млекопитающих культивируют в селективной среде и отбирают на наибольшую
резистентность. Эти клеточные линии содержат амплифицированный(е) ген(ы), интегрированный(е) в
- 45 -
015262
хромосому. Для продуцирования антител часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО)
и клетки NSO.
Экспрессионные векторы рС1 и рС4 содержат сильный промотор (LTR) вируса саркомы Рауса (Cullen et al., Molec. Cell. Biol., 5:438-447 (1985)) плюс фрагмент CMV-энхансера (Boshart et al., Cell., 41:521530 (1985)). Сайты множественного клонирования, например сайты расщепления рестриктирующими
ферментами BamHI, XbaI и Asp718, облегчают клонирование представляющего интерес гена. Эти векторы, помимо 3'-интрона, содержат сигнал полиаденилирования и стоп-сигнал гена крысиного препроинсулина.
Клонирование и экспрессия в клетках СНО.
Для экспрессии анти-IL-6 антитела может быть использован вектор рС4. Плазмида рС4 представляет собой производное плазмиды pSV2-dhfr (ATCC рег. № 37146). Эта плазмида содержит мышиный ген
DHFR, находящийся под контролем раннего промотора SV40. Клетки яичника китайского хомячка или
другие клетки, в которых отсутствует дигидрофолатная активность и которые были трансфицированы
указанными плазмидами, могут быть отобраны путем культивирования этих клеток на селективной среде
(например, на среде альфа--МЕМ, Life Technologies, Gaithersburg, MD) с добавленным химиотерапевтическим средством, метотрексатом. Амплификация генов DHFR в клетках, резистентных к метотрексату
(МТХ), была подробно описана в литературе (см., например, F.W. Alt, et al., J. Biol. Chem., 253:1357-1370
(1978); J.L. Hamlin & C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990) и M.J. Page & M.A. Sydenham,
Biotechnology, 9:64-68 (1991)). В процессе роста клеток при возрастающих концентрациях МТХ у них
развивается резистентность к лекарственному средству посредством сверхпродуцирования нужного
фермента, DHFR, что является результатом амплификации гена DHFR. Если второй ген сцеплен с геном
DHFR, то он обычно коамплифицируется и сверхэкспрессируется. Известно, что такой подход может
быть использован для выявления клеточных линий, несущих более чем 1000 копий амплифицированного(ых) гена(ов). Затем после удаления метотрексата получают клеточные линии, которые содержат амплифицированный ген, интегрированный в одну или несколько хромосом клетки-хозяина.
Кроме сильного промотора длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса, для экспрессии могут быть также использованы и другие высокоэффективные промоторы, например промотор человеческого β-актина, ранний или поздний промоторы SV40 или длинные концевые повторы, происходящие от других ретровирусов, например ВИЧ и HTLVI. Для экспрессии анти-IL-6 антитела под контролем
регуляторных последовательностей в клетках млекопитающих могут быть использованы системы экспрессии генов Tet-Off и Tet-On Clontech и аналогичные системы (M. Gossen & H. Bujard, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)). Для полиаденилирования мРНК могут быть также использованы и другие
сигналы, например сигналы, происходящие от генов человеческого гормона роста или глобина. Стабильные клеточные линии, несущие представляющий интерес ген, интегрированный в хромосомы, могут
быть также отобраны в результате котрансфекции с селективным маркером, таким как gpt, G418 или гигромицин. При этом сначала предпочтительно использовать более чем один селективный маркер, например G418 плюс метотрексат. Плазмиду рС4 гидролизовали рестриктирующими ферментами, а затем дефосфорилирировали с использованием телячьей кишечной фосфатазы в соответствии с процедурами,
известными специалистам. Затем вектор выделяли из 1% агарозного геля.
В соответствии со стадиями известного метода использовали ДНК-последовательность, кодирующую полноразмерное анти-IL-6 антитело, например, представленную в SEQ ID NO:98 и 96 и соответствующую вариабельным областям НС и LC анти-IL-6 антитела согласно изобретению соответственно. В
этой конструкции также использовали выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую подходящую
человеческую константную область (то есть области НС и LC).
Затем выделенную ДНК, кодирующую вариабельную и константную области, и дефосфорилированный вектор лигировали вместе с помощью ДНК-лигазы Т4. После этого клетки E.coli HB101 или
XL-1 Blue трансформировали и идентифицировали бактерии, которые содержат фрагмент, встроенный в
плазмиду рС4, с помощью, например, рестрикционного анализа.
Для трансфекции использовали клетки яичника китайского хомячка (СНО), в которых отсутствовал
ген активной DHFR. 5 мкг экспрессионной плазмиды рС4 котрансфицировали 0,5 мкг плазмиды pSV2neo с использованием липофектина. Плазмида pSV2-neo содержит доминантный селективный маркер, а
именно ген neo от Tn5, кодирующий фермент, который сообщает резистентность к группе антибиотиков,
включая G418. Эти клетки высевали в среду альфа--МЕМ, в которую был добавлен 1 мкг/мл G418. Через
два дня клетки трипсинизировали и высевали в планшеты для клонирования гибридом (Greiner,
Germany) в среду альфа--МЕМ, в которую было добавлено 10, 25 или 50 нг/мл метотрексата плюс
1 мкг/мл G418. Примерно через 10-14 дней одиночные клоны трипсинизировали, а затем высевали в
6-луночные чашки Петри или в 10-мл колбы с различными концентрациями метотрексата (50, 100, 200,
400, 800 нМ). Затем клоны, выращенные при наибольших концентрациях метотрексата, переносили в
новые 6-луночные чашки, содержащие еще большие концентрации метотрексата (1, 2, 5, 10, 20 мМ). Ту
же самую процедуру повторяли до тех пор, пока не были получены клоны, которые росли при концентрации 100-200 мМ. Экспрессию нужного генного продукта анализировали, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга или с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.
- 46 -
015262
Пример 2. Конструирование и скрининг анти-IL-6 антител.
Варианты анти-IL-6 антитела (клон АМЕ-А9) конструировали и скринировали на их активность. В
этом примере и в других разделах CDR определяли по Кэбату, за исключением области CDRH1, которую
определяли по Кэбату и Чотия. Длина области CDRH2 должна быть такой, чтобы можно было сконструировать две отдельных библиотеки, покрывающие всю область. Представляющие интерес клоны секвенировали и охарактеризовывали с помощью ELISA и клеточного анализа, после чего определяли кинетические константы.
Пример ELISA, проведенного с использованием очищенных IgG, представлен на фиг. 9. В ELISA
обычно используют микротитрационные планшеты Costar 3366, сенсибилизированные козьим антителом
против человеческой цепи каппа. Разведения Fab (или IgG) инкубировали в сенсибилизированных лунках в течение 1 ч при 22°С. Затем лунки промывали PBS, 0,1% твина 20 и в течение 1 ч добавляли биотинилированный IL-6 при 200 нг/мл. После промывки добавляли конъюгат щелочной фосфатазы и авидина
NeutrAvidin и инкубировали в течение 1 ч при 22°С. После интенсивной промывки добавляли колориметрический субстрат и определяли уровень связанного IL-6. Вариант такого ELISA включает более
длительную стадию промывки в лабораторном стакане с PBS, 0,01% BSA, при 37°С, после инкубирования биотинилированного IL-6, например, эта стадия промывки продолжается 18 ч.
Некоторые из сконструированных человеческих реагирующих с IL-6 моноклональных антител IgG
согласно изобретению имеют константы аффинности от 1×109 до 9×1012. Высокие аффинности таких
сконструированных человеческих моноклональных антител позволяют использовать их в терапевтических целях для лечения IL-6-зависимых заболеваний, патологий или ассоциированных с ними состояний.
Множество различных сконструированных вариантов человеческих анти-IL-6 антител было получено путем модификации одной или нескольких CDR-областей антитела. В приведенной ниже табл. 3 в
систематизированном виде даны предпочтительные мутации, которые были обнаружены в библиотеках
CDR индивидуумов (аминокислотные замены соответствуют варианту АМЕ-А9). Кроме того, в приведенной ниже табл. 13 представлены аминокислотные последовательности для CDR легкой и тяжелой
цепей с возможными положениями замен (обозначенными "X").
"Комбинаторная" библиотека была сконструирована на основе наилучших клонов (то есть вариантов), имеющихся в CDR-библиотеках индивидуумов. В табл. 4 указаны мутации, которые были включены в такую "комбинаторную" библиотеку. "Комбинаторную" библиотеку скринировали и охарактеризовывали, как описано выше. Мутации, обнаруженные в шести из лучших клонов, представлены ниже в
табл. 5А, а номера ID последовательностей для CDR в этих клонах представлены в табл. 5В.
Оценка анти-IL-6 антител IgG в клеточном анализе.
Химерное анти-IL-6 антитело и сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело (клон
АМЕ-19а) тестировали на их способность предупреждать рост IL-6-зависимой клеточной линии. Клетки
7TD1 высевали в 96-луночный планшет Costar 3610 при плотности 200 клеток на лунку. В эти лунки добавляли антитела, разведенные в среде IMDM, а затем добавляли человеческий IL-6 до конечной концентрации 500 пг/мл, и планшеты инкубировали в инкубаторе для культивирования тканей в течение
64-72 ч. На этой стадии во все лунки добавляли 50 мкл буфера для лизиса клеток, поставляемого с набором ATPlite (Packard Bioscience), и планшеты встряхивали в течение 3 мин. Затем добавляли 50 мкл субстрата ATPlite и сенсибилизированные планшеты встряхивали в течение 1 мин. Хемилюминесценцию
определяли на люминометре.
Результаты клеточного анализа представлены на фиг. 10, а вычисленные величины ЕС50 представлены ниже в табл. 6. Величина ЕС50 для химерного анти-IL-6 антитела составляла 2,7×10-11М
(4,09 нг/мл), а величина для сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела (клона АМЕ-19а) составляла 2,7×10-12М (0,41 нг/мл). Величина ЕС50 для сконструированного человеческого антитела была
примерно в 10 раз выше, хотя может быть достигнуто примерно 10-60-кратное увеличение величины
ЕС50, включая промежуточные величины.
Пример 3. Кинетика связывания сконструированных человеческих антител против человеческого
IL-6.
ELISA-анализ подтвердил, что антитело, выделенное из этих клеток-хозяев, связывается с IL-6 в зависимости от концентрации. В данном случае была измерена аффинность антитела по отношению к его
когнатному антигену (эпитопу). Количественные величины констант связывания получали с помощью
анализа BIAcore и с использованием оборудования KinExA 3000. Полученные результаты показали, что
несколько сконструированных человеческих моноклональных антител имеют очень высокую аффинность при KD в пределах от 1×10-9 до 3×10-14.
Для детектирования связывания IL-6 с растворимым IL-6-рецептором, sIL-6R, проводили иммуноферментный анализ (EIA), в котором в качестве позитивного контроля использовали моноклональные
антитела против человеческого IL-6 (AME-A9, АМЕ-А16, АМЕ-18а, АМЕ-20b, АМЕ-22а и АМЕ-23а) и
CNTO 328. Растворимый человеческий IL-6-рецептор, sIL-6R, и рекомбинантный человеческий IL-6 получали от R&D Systems (Minneapolis, MN) (Catalog #227-SR-025 и 206-IL-010 соответственно). Конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело против человеческого IgG (цепь H+L) получали от Jackson
- 47 -
015262
Immunoresearch (West Grove, PA) (Catalog # 109-035-003). Таблетки пероксида водорода и OPD получали
от Sigma (St. Louis, MO) (Catalog # H-1009 и Р-8287 соответственно).
Твердофазный иммуноферментный анализ на образование комплекса sgp80/IL-6/анти-IL-6 mAb.
Планшеты Costar EIA (Corning/Costar, Acton, MA) (Catalog # 9018) покрывали sIL-6R (10 мкг/мл в
PBS, 100 мкл/лунку) в течение ночи при 4°С. Эти планшеты промывали 0,15 М физиологическим раствором, содержащим 0,02% (об./об.) твина 20, и лунки блокировали 1% (мас./об.) BSA в PBS, 200 мкл/лунку,
в течение одного часа при комнатной температуре. После этого лунки снова промывали, а затем инкубировали с 200 нг/мл человеческого IL-6 (100 мкл/лунку) в PBS в течение одного часа при комнатной температуре. После этого во все лунки добавляли 10-кратные серийные разведения антитела, начиная с концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл/лунку в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки лунки инкубировали с ПХ-конъюгированным козьим антителом против человеческого IgG (H+L)
(10 мкг/мл в PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого лунки промывали и добавляли 100 мкл/лунку раствора цитратфосфатных субстратов (0,1М лимонная кислота и 0,2М фосфат натрия, 0,01% Н2О2 и 1 мг/мл OPD) в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию прекращали
добавлением 25 мкл/лунку 4 N серной кислоты и OD490 считывали на автоматическом ридере для ELISAпланшетов (Molecular Devices Spectromax Plus, Sunnyvale, CA).
Для оценки эффекта предварительного инкубирования IL-6 с моноклональными анти-hIL-6 антителами или CNTO 328, 200 нг/мл IL-6 (100 мкл) инкубировали с 10-кратными серийными разведениями
антитела (100 мкл), начиная с 10 мкг/мл, в течение одного часа при комнатной температуре. Затем эту
предварительно инкубированную смесь инкубировали с sIL-6R в течение одного часа при комнатной
температуре, а детектирование комплекса sIL-6R/IL-6/антитело против человеческого IL-6 осуществляли
с использованием ПХ-конъюгированного козьего антитела против человеческого IgG (H+L), (10 мкг/мл в
PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре. Остальные условия анализа были аналогичны условиям, описанным в предыдущем параграфе.
Проведенные ранее исследования показали, что CNTO 328 позволяет детектировать IL-6 при его
захвате рецептором sIL-6R, который был нанесен на EIA-планшет, как описано в техническом отчете.
Кроме того, антитела АМЕ-А9, АМЕ-А16, АМЕ-18а, АМЕ-20b, АМЕ-22а и АМЕ-23а позволяют детектировать дозозависимое связывание IL-6 с sgp80 (sIL-6R), проводимое с помощью EIA. Каждое сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело оценивали по сравнению с эталонным антителом CNTO 328.
Однако предварительное инкубирование IL-6 и любого из этих моноклональных антител против hIL-6
подавляло способность sIL-6R связываться с IL-6.
Измерение кинетических констант для анти-IL-6 IgG.
Для измерения кинетики связывания использовали оборудование KinExA 3000, изготовленное
Sapidyne. Вкратце, человеческий IL-6 был ковалентно связан с алзактоновыми сферами, и с помощью
вышеуказанного оборудования было детектировано связывание свободного IgG с указанными сферами.
Для измерения KD содержимое отдельных пробирок, включающих постоянную концентрацию 0,5, 1 или
5 пМ IgG со снижающимся серийным разведением человеческого IL-6, инкубировали в течение 3-4 дней
при 20°С в 0,1% BSA, PBS. Для определения каждой величины KD было использовано всего 13 пробирок.
Так, например, химерное анти-IL-6 антитело использовали при постоянной концентрации 5 пМ и отдельные пробирки инкубировали с 0-200 пМ IL-6. Инкубирование с другими IgG проводили аналогичным образом. После инкубирования уровень свободного IgG в каждом уравновешенном образце определяли на оборудовании KinExA 3000 в соответствии с инструкциями производителя. Величины KD определяли с помощью компьютерной программы KinExA 3000 с использованием оборудования KinExA
3000, как более подробно описано ниже.
Для измерения kon отдельные IgG при 200 пМ смешивали со 100-200 пМ человеческого IL-6, а несвязанный IgG детектировали по связыванию с человеческим IL-6, ковалентно присоединенным к алзактоновым сферам на оборудовании KinExA 3000. Была проведена серия измерений. Полученные данные
использовали для вычисления kon с помощью компьютерной программы KinExA 3000. koff вычисляли по
формуле KD=koff/kon. Кинетические константы для анти-IL-6 IgG систематизированы в табл. 7.
Пример 4. In vitro характеризация анти-IL-6 антитела.
In vitro исследования проводили для характеризации последовательности, специфичности к эпитопу, аффинности и биологической активности анти-IL-6 антитела.
Сконструированное человеческое mAb.
Анализ последовательности подтвердил, что анти-IL-6 антитело согласно изобретению (включая
различные его варианты/клоны) содержит полностью человеческие каркасные области. В табл. 5а показано всего 10 аминокислотных остатков, замененных в CDR1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепей анти-IL-6
антитела согласно изобретению (в различных вариантах антитела) по сравнению с остатками химерного
анти-IL-6 антитела (описанного в РСТ WO 04/039826).
Специфичность к эпитопу.
Анти-IL-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-IL-6 антитело распознают аналогичные
эпитопы на человеческом IL-6. Эти антитела не конкурируют с коммерчески доступными мышиными
mAb против человеческого IL-6, поставляемыми компанией R&D Systems #MAB-206, что позволяет
- 48 -
015262
предположить, что такие антитела распознают эпитоп, который совершенно отличается от эпитопа, распознаваемого анти-IL-6 mAb R&D. Анти-IL-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-IL-6 антитело не конкурируют с крысиным mAb против человеческого IL-6 R&D.
Человеческий IL-6 (200 нг/мл) захватывался связанным с планшетом анти-IL-6 mAb (мышиным
mAb против человеческого IL-6, МАВ-206, которое было использовано, только как связанное с планшетом mAb для захвата человеческого IL-6) (10 мкг/мл), а затем в планшет добавляли серийные разведения
анти-IL-6 антитела согласно изобретению и химерного анти-IL-6 антитела, как показано на оси X. Связывание с IL-6 оценивали по увеличению величин OD490, отложенных по оси Y. Анти-IL-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-IL-6 антитело связывались с IL-6 в зависимости от дозы.
И наоборот, анти-IL-6 антитело согласно изобретению и химерное анти-IL-6 антитело конкурентно
связывались с человеческим IL-6, что позволяло предположить, что эти две молекулы имеют один и тот
же эпитоп связывания на IL-6. Человеческий IL-6 (200 нг/мл) захватывался связанным с планшетом антителом МАВ-206 (10 мкг/мл). Затем в планшет добавляли серийные разведения анти-IL-6 антитела согласно изобретению, указанные на оси X, и 50 нг/мл биотинилированного химерного анти-IL-6 антитела.
Связывание биотинилированного химерного анти-IL-6 антитела с IL-6 детектировали с помощью стрептавидина-ПХ и измеряли как величины OD490, отложенные по оси Y.
Кроме того, сконструированные человеческие и химерные антитела обладают аналогичными способностями связываться с комплексом sIL-6/sIL-6R (фиг. 1). Анти-IL-6 антитело согласно изобретению
связывается с комплексом sIL-6/sIL-6R. Растворимый IL-6-рецептор (sIL-6R) наносили на планшет при
концентрации 10 мкг/мл. В этот планшет добавляли человеческий IL-6 при концентрации 200 нг/мл. Затем в планшет добавляли серийные разведения анти-IL-6 антитела согласно изобретению или химерного
анти-IL-6 антитела, указанные по оси X, после чего детектировали связывание с комплексом sIL-6/sIL-6R
с использованием ПХ-конъюгированного антитела против человеческих IgG и выражали как величины
OD490, отложенные по оси Y.
Для дополнительного подтверждения полученных выше результатов проводили тест на перекрестную межвидовую реактивность с использованием IL-6-содержащего кондиционированного супернатанта, полученного от ЛПС- или IFNγ-стимулированных МКПК различных видов, в анализе на пролиферацию клеток 7TD1 (IL-6-зависимой мышиной гибридомной клеточной линии). Было обнаружено, что
сконструированное человеческое антитело согласно изобретению нейтрализует активность кондиционированных супернатантов, направленную на стимуляцию пролиферации клеток 7TD1 у приматов различных видов, включая человека, игрунок, собакоподобных обезьян, шимпанзе, макак-резусов, павианов,
свинохвостых макак и эдиповых тамаринов Жоффруа (с ватной макушкой), и обнаруживает перекрестную аналогичную межвидовую реактивность, сравнимую с химерным антителом (табл. 8).
И наконец, было обнаружено, что при картировании эпитопов методом гидролиза трипсином, сконструированное человеческое антитело и химерное антитело связывались с одним и тем же эпитопом на
человеческом IL-6, и этот эпитоп был локализован в положениях аминокислотных остатков 168-184 спирали D (фиг. 3). Недавно проведенный анализ на мутации подтвердил, что остатки 179 и 182 играют
важную роль в связывании антитела согласно изобретению с IL-6. Этот эпитоп (аминокислотные остатки
168-184) идентифицировали как поверхностный участок IL-6, который удерживает дейтерий в присутствии сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела.
Биологическая активность.
Способность сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела нейтрализовать IL-6 была определена в биоанализе с использованием клеток 7TD1. В анализе на пролиферацию клеток 7TD1 сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело обнаруживало нейтрализующую способность, которая в
10 раз превышала нейтрализующую способность химерного анти-IL-6 антитела. Клетки 7TD1 стимулировали 500 пг/мл hIL-6 в присутствии серийных разведений сконструированного человеческого
анти-IL-6 антитела или химерного анти-IL-6 антитела либо mAb контрольного изотипа в течение 72 ч.
Пролиферацию клеток измеряли как число клеток в секунду, отложенное по оси Y. Величина ошибки
означает среднее отклонение (SD) для образцов в дубликатах. Заштрихованными кружками показаны
клетки без IL-6; незаштрихованными кружками показаны клетки, стимулированные 500 пг/мл hIL-6.
Сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело также ингибирует IL-6-индуцированное продуцирование моноцитарного белка-хемоатрактанта-1 (MCP-1) клетками U937 (фиг. 3) и IL-6/IL-1βиндуцированное продуцирование сывороточного амилоида A (SAA) клетками человеческой гепатомы
HepG2 (фиг. 4). На фиг. 3 показано, что сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело ингибирует
IL-6-стимулируемую секрецию МСР-1 клетками U937. 5×105 клеток/лунку обрабатывали 1 нг/мл hIL-6 и
серийных разведений сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела в течение 72 ч. Супернатанты клеточной культуры анализировали с тремя повторами с помощью ELISA на присутствие МСР-1.
На фиг. 4 показано, что сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело ингибирует IL-6- и
IL-1β-стимулируемую секрецию SAA клетками HepG2. 2,25×105 клеток стимулировали 100 нг/мл hIL-6,
200 нг/мл sIL-6R и 1 нг/мл IL-1β в присутствии серийных разведений сконструированного человеческого
анти-IL-6 антитела в течение 24 ч. Затем супернатанты клеточной культуры анализировали в дубликатах
- 49 -
015262
с помощью ELISA на присутствие SAA.
IL-6-зависимое фосфорилирование STAT3.
Для оценки способности сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела блокировать каскад
реакций передачи сигнала связывания IL-6 с IL-6R и gp130 был проведен анализ методом иммунопреципитации для определения влияния на IL-6-зависимое фосфориливание STAT3 в клетках ТНР-1, на поверхности которых экспрессируется gp130.
mAbs были стерильно отфильтрованы и стерилизованы на фильтре, после чего их хранили в PBS
при 4°С. Были использованы рекомбинантный человеческий IL-6 (206-IL-010) и sIL-6R (227-SR-025) от
R&D Systems (Minneapolis, MN). Среду RPMI (11875-085), термоинактивированную фетальную бычью
сыворотку (16000-069), L-глутамин (25030-081), несущественные аминокислоты (11140-050) и пируват
натрия (11360-070) получали от Invitrogen (Carlsbad, СА). Был также использован TBS (10 мМ трис,
рН 7,5, 100 мМ NaCl).
Человеческая клеточная линия острого моноцитарного лейкоза, ТНР-1, полученная из банков клеток Научно-исследовательских институтов, была протестирована на отсутствие микоплазмы и бактерий.
Эти клетки культивировали в среде RPMI, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, 2 мМ глутамина и 1 мМ пирувата натрия. Клетки субкультивировали или собирали, когда они достигали примерно
85%-ной конфлюэнтности. Затем через каждые три дня клетки разводили 1:5 рутинным способом.
Для фосфорилирования тирозина клетки культивировали до 80-90% конфлюэнтности в колбах
Т-225. Затем среду удаляли и заменяли свежей бессывороточной средой, после чего клетки инкубировали в течение ночи. После выращивания клеток в бессывороточной среде их собирали из каждой колбы,
осаждали и клетки в конечной концентрации 20×106 для каждого условия культивирования ресуспендировали в 0,5 мл бессывороточной среды.
RhIL-6 (0,1 мкг/мл) предварительно инкубировали при 37°С в течение 15 мин со следующими реагентами: 0,5 мл одной среды, анти-IL-6 Ab (10 мкг/мл) и sIL-6R (0,2 мкг/мл). Затем к клеткам, предварительно инкубированным с анти-IL-6 Ab и sIL-6R, соответственно, добавляли sIL-6R (0,2 мкг/мл) и антиIL-6 Ab (10 мкг/мл), после чего инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Затем клетки объединяли со
средой, используемой в качестве негативного контроля, и с комплексом IL-6/Ab/sIL-6R, после чего инкубировали при 37°С в течение 6 мин. Клетки два раза промывали в охлажденном льдом TBS и клеточный
осадок либо обрабатывали, как описано в разделе 5.4, либо хранили при -70°С.
Для иммунопреципитации клеточный осадок лизировали в 1 мл буфера для лизиса (50 мМ трис,
рН 7,5, 300 мМ NaCl, 0,5% Triton-X-100) (T-9284, Sigma, St. Louis, МО), содержащего таблетку со смесью
полного набора ингибиторов протеазы (1697498, Roche, Basel, Switzerland). Клетки интенсивно встряхивали в течение 30 с и инкубировали при -70°С в течение 20-60 мин. Клеточный дебрис удаляли путем
центрифугирования при 13000 об/мин в течение 20 мин. Для снижения уровня неспецифического фонового окрашивания образцы предварительно очищали путем инкубирования с 2 мкг кроличьего IgG
(15006, Sigma, St. Louis, МО) и 50 мкл белка А - агарозы (SC-2001, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
CA) в течение 1 ч при 4°С на орбитальном шейкере. Агарозные сферы удаляли путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 5 мин. Осветленные лизаты переносили в микроцентрифужные пробирки
и инкубировали с анти-STAT3 антителом (2 мкг/мл) (SC-7179, Santa Cruz Biotechnology) в течение ночи
при 4°С на орбитальном шейкере, а затем добавляли 50 мкл агарозных сфер с белком А и инкубировали
в течение 2 ч при 4°С на орбитальном шейкере. Агарозные сферы собирали путем центрифугирования
при 2500 об/мин в течение 5 мин и 5 раз промывали в охлажденном льдом TBS при 4°С. Затем агарозные
сферы ресуспендировали в 40 мкл буфера Лэммли для образцов плюс DTT (NP0007-465030, Invitrogen,
Carlsbad, CA) и нагревали при 95°С в течение 5 мин.
Образцы разделяли на 3-8% бис-трис-геле NuPage (EA0375BOX, Invitrogen, Carlsbad, CA) с использованием рабочего буфера (NP0002-465026, Invitrogen, Carlsbad, CA) при 100 В в течение 1 ч. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (LC2001, Invitrogen, Carlsbad, CA) с использованием буфера
для переноса (NP0006-465029, Invitrogen, Carlsbad, CA) при 30 В в течение 1 ч. Эти мембраны блокировали в 10% обезжиренном сухом молоке (Nestle, Glendale, California) в TBS-T в течение ночи при 4°С.
После нескольких промывок в TBS-T при комнатной температуре эти мембраны инкубировали с мышиным моноклональным Ab против р-STAT3 (SC-8059, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), разведенным 1:1000 в TBS-T, в течение 4 ч при 4°С на орбитальном шейкере. После нескольких промывок
мембраны инкубировали с ПХ-конъюгированным ослиным антителом против мышиных IgG (1:1000)
(SC-2318, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) при комнатной температуре в течение 2 ч на орбитальном миксере. После нескольких промывок образцы детектировали с использованием реагентов для
детекции в вестерн-блот-анализе ECLplus и набора для анализа (RPN2108, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) в соответствии с инструкциями производителя, а затем визуализировали путем экспонирования с ЭХЛ-пленкой. Затем из мембран удаляли Ab путем погружения в 100 мМ DTT, 2% ДСН,
62,5% мМ трис-HCl, рН 6,7, при 100°С в течение 30 мин при перемешивании. После этого мембраны
промывали в TBS-T и блокировали в течение ночи 10% обезжиренным сухим молоком. Мембраны промывали и инкубировали с анти-STAT3 антителом (1:1000) (SC-7179, Santa Cruz Biotechnology) в TBS-T в
течение 2 ч при 4°С, а затем 5 раз промывали и инкубировали в течение 1 ч с ПХ-конъюгированным
- 50 -
015262
козьим антителом против кроличьих IgG (1:1000) (SC2030, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),
после чего проводили детектирующий анализ с использованием ECLplus. Все мембраны очищали рутинным способом и снова зондировали белком STAT3 для подтверждения присутствия белка STAT3.
Полученные результаты показали, что сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело блокировало IL-6-опосредованное фосфорилирование STAT3, то есть ключевого компонента в пути передачи
сигнала IL-6 (фиг. 5А и 5В). Сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело (АМЕ-19А) ингибировало IL-6/sIL-6R-индуцированное фосфорилирование STAT3. Фосфорилирование STAT3, индуцированное рекомбинантным человеческим IL-6/sIL-6R, детектировали в клетках ТНР-1 (фиг. 5В). Добавление
10 мкг/мл сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела (АМЕ-19А) или химерного анти-IL-6
антитела приводило к полному ингибированию фосфорилирования STAT3 (фиг. 5В). На фиг. 5А продемонстрировано присутствие аналогичного количества нефосфорилированного белка STAT3 во всех образцах, соответствующих различным клонам сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела. Используемое здесь обозначение CNTO328 (или 328) означает химерное антитело "человек-мышь" (также
называемое антителом дикого типа (WT)); 150 означает клон АМЕ-22а; 143 означает клон АМЕ-23а; 140
означает клон АМЕ-20b; 136 означает клон АМЕ-19а; 130 означает клон АМЕ-18а; 106 означает клон
АМЕ-А16; а 104 означает клон АМЕ-А9.
In vivo эффективность сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела.
Эффективность сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела оценивали на двух различных моделях in vivo. Сначала были протестированы эффекты сконструированного человеческого и химерного анти-IL-6 антител, после чего проводили их сравнительную оценку в анализе на ангиогенез, индуцированный человеческим IL-6, где указанный анализ осуществляли в матриксном блоке Matrigel,
вводимом мышам. В матриксный блок Matrigel вводили 200 нг/мл человеческого IL-6. Каждой "голой"
мыши инъецировали два матриксных блока Matrigel. Группам из шести мышей i.v. инъецировали 1, 3
или 6 мг/кг сконструированного человеческого или химерного анти-IL-6 антитела. Контрольным группам также вводили PBS или mAb контрольного изотипа. На 7 день блоки удаляли и измеряли уровень
ангиогенеза по содержанию гемоглобина, длине микрососудов и числу микрососудов в этих блоках. Полученные результаты показали, что человеческий IL-6 (PBS-группа) стимулировал ангиогенез в модели с
матриксным блоком Matrigel, как было измерено по всем трем параметрам.
Сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело (АМЕ-19А) ингибировало образование микрососудов на среднем уровне в блоках Matrigel. Кроме того, сконструированное человеческое анти-IL-6
антитело (АМЕ-19А) снижало среднюю длину микрососудов в блоках Matrigel. Сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело (АМЕ-19А) также снижало уровень гемоглобина в блоках Matrigel.
Кроме того, сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело (АМЕ-19А) и химерное анти-IL-6
антитело ингибировало IL-6-опосредуемый ангиогенез у "голых" мышей в зависимости от дозы. И наконец, сконструированное человеческое и химерное анти-IL-6 антитела обладали сравнимой активностью,
направленной на ингибирование IL-6-индуцированного ангиогенеза при 6 мг/кг, то есть при наивысшей
тестируемой дозе. Хотя химерное анти-IL-6 антитело в значительной степени ингибировало индуцированный человеческим IL-6 ангиогенез при 3 мг/кг, как было измерено по длине и по числу сосудов, однако, какого-либо статистически значимого различия между сконструированным человеческим и химерным анти-IL-6 антителами при этих дозах не наблюдалось.
Для дополнительной оценки влияния сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела на индуцированное человеческим IL-6 продуцирование продукта острой фазы заболевания, а именно сывороточного амилоидного белка A (SAA), у мышей Balb/C, была дополнительно разработана модель in vivo.
Мышам i.p. вводили 0,01, 0,5 или 5 мг/кг сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела за 4 ч до
i.v. введения 5 мкг/кг человеческого IL-6 (фиг. 6). В качестве контроля использовали PBS и mAb контрольного изотипа. Через 16 ч после инъекции IL-6 определяли уровни SAA в сыворотке. Сконструированное человеческое и химерное анти-IL-6 антитела значительно ингибировали индуцированное человеческим. IL-6 продуцирование SAA у мышей Balb/C при 0,5 и 5 мг/кг, причем сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело значительно ингибировало продуцирование SAA при наименьшей тестируемой дозе. Однако какого-либо статистически значимого различия между сконструированным человеческим и химерным анти-IL-6 антителами при всех трех тестируемых дозах не наблюдалось (фиг. 6).
На фиг. 6 показано, что сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело ингибирует индуцированное человеческим IL-6 продуцирование SAA. Каждая точка означает среднюю величину SAA для
каждого животного, а линия представляет собой среднее для всех частных значений в каждой группе.
Затем для исключения общей ошибки I рода проводили попарное сравнение с использованием критерия
Тьюки в целях определения 95% совместных доверительных интервалов (**р<0,001, *р<0,05).
Пример 5. Механизм терапевтического действия анти-IL-6 mAb. Ревматоидный артрит. Воздействие анти-IL-6 mAb на индуцированный коллагеном артрит (CIA) у животного с моделью ревматоидного
артрита. Модели in vivo преклинической стадии заболевания.
В ряде in vivo моделей в качестве мишени служил IL-6. В стандартных мышиных моделях использовали крысиное антитело против мышиных IL-6, либо, в случае моделей-приматов и моделей человек/мышь SCID, использовали гуманизованное анти-IL-6R mAb (80 кДа) (MRA; Chugai). У мышей с мо- 51 -
015262
делью индуцированного коллагеном артрита (CIA) анти-IL-6 антитело было эффективным для предупреждения заболевания в том случае, когда оно использовалось на ранней стадии (на день 0 или 3 после
введения коллагена), но не на более поздних стадиях. В модели трансплантата человек/мышь SCID, где
иммунодефицитным мышам трансплантировали человеческую синовиальную ткань, MRA-обработка
приводила к сжатию тканевых имплантатов и к снижению числа воспалительных клеток и остеокластов.
У собакоподобных обезьян с индуцированным коллагеном артритом (CIA) MRA ингибировало развитие
артрита и снижало уровень продуцирования продуктов острой фазы заболевания.
Влияние суррогатного mAb против мышиного IL-6 на развитие заболевания оценивали на
CIA-модели. Полученные результаты показали, что i.p. введение антитела против мышиного IL-6 при
1 мг/мышь в неделю до индуцирования заболевания приводило к значительному подавлению развития
индуцированного коллагеном артрита, на что указывало заметное снижение тяжести заболевания. Артрит был индуцирован у 8-недельных мышей DBA/1 LacJ 100 мкг бычьего коллагена типа II в полном
адъюванте Фрейнда (ПАФ), вводимого чрескожно в основание хвоста. Мышей подвергали ежедневному
клиническому мониторингу на начало развития заболевания. Анти-IL-6 mAb или mAb контрольного изотипа вводили i.p. за 2 дня до индуцирования CIA, а затем еженедельно в дозе 1 мг/мышь. Тяжесть течения артрита оценивали по опуханию, эритеме и выраженным порокам суставов.
Результаты гистопатологического анализа подтвердили клинические наблюдения, а именно показали, что еженедельная i.p. инъекция mAb против мышиного IL-6 приводила к значительному улучшению
параметров течения индуцированного коллагеном артрита. Все оцениваемые параметры артрита, включая воспалительный ответ (синовит и образование паннуса) и эрозивные изменения (эрозии и изменения
всей структуры сустава), значительно улучшались у мышей, обработанных антителом против мышиного
IL-6, по сравнению с животными, обработанными контрольным mAb. Анти-IL-6 mAb ингибировало развитие артрита на гистопатологическом уровне. Оценку синовита проводили, исходя из толщины синовиальной оболочки; образование паннуса оценивали по степени развития паннуса на поверхности сустава,
а эрозию оценивали по степени поражения хряща и подхрящевой кости.
У мышей, обработанных mAb против мышиного IL-6, наблюдалось значительное снижение потери
белков хрящевого матрикса. Репрезентативные срезы суставов, полученные по окончании исследований
(день 53) от контрольных животных и животных, обработанных анти-IL-6 mAb, оценивали на состояние
хрящевого матрикса по окрашиванию толуидиновым синим.
Микро-КТ-анализ подтвердил клинические наблюдения и показал, что терапия с применением антитела против мышиного IL-6 оказывает благоприятное воздействие на снижение уровня прогрессирования заболевания в отдельном суставе. Визуальная оценка типичных трехмерных (3D) изображений, сделанных с помощью компьютерной томографии (КТ), указывала на заметную степень эрозивных изменений, которые происходят у группы животных, обработанных mAb контрольного изотипа, по сравнению с
преимущественно слабыми воспалительными изменениями мягкой ткани суставов у животных, обработанных антителом против мышиного IL-6. Эти эксперименты проводили на репрезентативных животных, обработанных контрольным mAb, и животных, обработанных mAb против мышиного IL-6.
Волчанка. Действие анти-IL-6 антитела у мышей NZB/W F1. Модели in vivo преклинической стадии
заболевания.
Существуют мышиные модели с СКВ, и эти модели заболевания имеют близкое сходство с человеческим заболеванием. Исследования мышей MRL/lpr и NZB/W F1 продемонстрировали гиперпролиферацию В-клеток, продуцирование аутоантител и отложение иммунного комплекса, которые имеют очень
близкое сходство с симптомами человеческого заболевания. Было показано, что анти-IL-6 mAb эффективно ингибирует продуцирование аутоантитела, снижает уровень протеинурии и повышает выживаемость мышей NZB/W F1.
Влияние суррогатного mAb против мышиного IL-6 на развитие волчанки оценивали на мышах
NZB/W F1. Результаты предварительных исследований показали, что i.p. введение mAb против мышиного IL-6 при 1 мг/мышь/неделю в течение 22 недель приводило к подавлению продуцирования антидцДНК аутоантитела, главного патогенного аутоантитела в этой модели заболевания (фиг. 7). Уровни
аутоантител против дцДНК у животных, обработанных анти-IL-6 mAb, были стабильно ниже уровней у
животных, обработанных физиологическим раствором и контрольным Ab, во время всего исследования.
Как обсуждалось выше, на фиг. 7 показано ингибирование продуцирования аутоантител против
дцДНК под действием анти-IL-6 mAb у мышей NZB/W F1. Величины O.D. для каждого отдельного образца нормализовали на величины, полученные для сыворотки позитивного контроля, и выражали в % от
позитивного контроля. Каждое значение представляет собой % от позитивного контроля для каждого
образца, а линия представляет собой среднее для всех частных значений в каждой группе. Значимое различие представлено как *р<0,01.
Кроме того, оценка небольшой субпопуляции животных показала, что анти-IL-6 mAb ингибировало
пролиферацию В-клеток и снижало степень повреждения почек. По окончании исследования не наблюдалось какого-либо значимого различия в пролиферации Т-клеток у различных групп обработки, тогда
как у мышей, обработанных анти-IL-6 mAb, по сравнению с мышами, обработанными физиологическим
раствором, пролиферация В-клеток, индуцируемая анти-IgM антителом и анти-CD40 антителом, снижа- 52 -
015262
лась с течением времени, а именно через 34 недели. Этот результат совпадал с полученным выше результатом, который указывал на снижение уровня продуцирования аутоантитела против дцДНК, что позволяет предположить, что аутореактивные В-клетки могут служить непосредственной и преимущественной
мишенью для терапии с использованием анти-IL-6 mAb.
Гистопатологический анализ показал, что животные в этом исследовании могут быть подразделены
на 3 группы по тяжести заболевания почек (слабое, умеренное и тяжелое) (табл. 9). Почечная патология
у мышей NZB/W F1 характеризовалась смешанной лимфоидной гиперплазией и отложением иммунных
комплексов в гломерулярной базальной мембране.
У животных, обработанных анти-IL-6 mAb, развивалось менее тяжелое почечное заболевание. У
животных, обработанных анти-IL-6 mAb, отсутствовали периваскулярная смешанная лимфоидная гиперплазия и отложение белка, а у животных, обработанных физиологическим раствором и контрольным Ab,
наблюдались умеренная и тяжелая форма периваскулярной смешанной лимфоидной гиперплазии и отложение белка. Кроме того, у животных, обработанных анти-IL-6 mAb, по сравнению с животными двух
других групп обработки, наблюдалось незначительное отложение иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране. Для того чтобы определить, играют ли эти клетки решающую роль в патогенезе
СКВ, был также проведен другой анализ механизма действия анти-IL-6 mAb на функции В-клеток,
Т-клеток и макрофагов.
Сахарный диабет типа II.
Было показано, что IL-6 играет важную роль в развитии инсулинорезистентности, ассоциированной
с ожирением. Однако результаты in vitro и in vivo анализов как подтверждают, так и опровергают его
возможную роль в развитии инсулинорезистентности.
In vitro эксперименты.
Для лучшего понимания действия, которое может оказывать IL-6 на передачу инсулинового сигнала и на биологические эффекты и функцию инсулина, такие как поглощение глюкозы, регуляция генов и
связанные с ними механизмы, были проведены эксперименты с использованием in vitro моделей восприимчивых к инсулину тканей (клеток 3Т3 L1 жировой ткани, клеток HepG2 печени, клеток C2C12 скелетной мышцы) и in vivo моделей инсулинорезистентности и сахарного диабета типа II (T2DM), таких как
мыши db/db.
Данные in vitro анализа дают основание предположить, что основное действие IL-6 направлено на
передачу инсулинового сигнала в печени. IL-6-обработка клеток HepG2 приводила к ингибированию
индуцированного инсулином фосфорилирования Akt. Такое ингибирующее действие IL-6 на передачу
инсулинового сигнала блокируется анти-IL-6 антителом. Изменение метаболизма глюкозы и действия
инсулина в печени позволяет предположить, что они являются главной причиной развития инсулинорезистентности и T2D. Влияние IL-6 на передачу инсулинового сигнала в клетках 3Т3 L1 (клеточной линии
адипоцитов) и C2C12 (клеточной линии скелетной мышцы) оценивали для определения механизмов действия IL-6 при T2D.
3Т3 L1. Эксперименты проводили с использованием клеточной линии мышиных адипоцитов 3Т3
L1. В 90% дифференцированных клеток 3Т3 L1 было оценено влияние IL-6 на индуцированное инсулином поглощение глюкозы. В этих экспериментах обработка 10 нг/мл TNFα в течение 24 ч приводила к
стабильному ингибированию индуцированного инсулином поглощения глюкозы, тогда как обработка 20
нг/мл IL-6 не давала какого-либо эффекта. Эти данные позволяют предположить, что активность IL-6 в
жировой ткани не является главным механизмом IL-6-опосредуемой инсулинорезистентности, и скорее
сама жировая ткань может служить главным источником IL-6, который затем оказывает негативное воздействие на чувствительность к инсулину в печени и в мышцах. Аналогичные данные были получены с
использованием дифференцированных первичных человеческих адипоцитов, высвобождаемых из подкожно введенного депо. Влияние IL-6 на поглощение глюкозы оценивали с использованием человеческих первичных адипоцитов, высвобождаемых из жирового депо внутренних органов, поскольку такое
депо должно быть более подходящим для оценки инсулинорезистентности, ассоциированной с ожирением.
HepG2. Клетки HepG2 были выбраны в качестве репрезентативной ткани печени in vitro. Клетки
HepG2 представляют собой клеточную линию человеческой гепатомы, в которой ранее наблюдалось
влияние IL-6 на передачу инсулинового сигнала. В этих экспериментах 20 нг/мл IL-6 блокировали индуцированное инсулином фосфорилирование киназы Akt, которая играет решающую роль в пути передачи
инсулинового сигнала, причем максимальный эффект наблюдался после 60-минутного инкубирования, и
полученный результат совпадал с результатами, сообщаемыми в научной литературе.
Фосфорилирование Akt на субконфлюэнтных клетках HepG2 в 10-см чашках измеряли после инкубирования rhIL-6 (20 нг/мл) в течение 30, 60, 90 и 120 мин. В течение последних 5 мин инкубирования
добавляли 0,5, 1 и 5 нМ инсулина для индуцирования фосфорилирования Akt. Клетки подвергали лизису
с использованием модифицированного буфера для лизиса RIPA и уровень фосфорилирования Akt измеряли с помощью ELISA-анализа Ser-фосфо-Akt. Результаты получали с использованием наборов для
ELISA pAkt и Akt (BioSource). После 60-минутной IL-6-обработки в присутствии физиологической концентрации инсулина (0,5-1 нМ) фосфорилирование Akt ингибировалось на ~50% по сравнению с кон- 53 -
015262
трольной группой. Концентрации белка количественно оценивали с помощью набора для анализа белка
Pierce BCA.
Действие анти-IL-6 антитела.
Определяли способность сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела ингибировать воздействие IL-6 на индуцированное инсулином фосфорилирование Akt.
Сконструированное человеческое анти-IL-6 антитело в количестве 20 мкг/мл было способно ингибировать действие IL-6 в клетках HepG2. На фиг. 8А и 8В проиллюстрировано воздействие IL-6 на индуцированное инсулином фосфорилирование Akt в присутствии и в отсутствии сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела.
Данные, указанные в верхней части снимка (фиг. 8А), представляют среднее ± ср. кв.от. (* - значимая величина по сравнению с (+) инсулином, IL-6, Р=0,029; ** - значимая величина по сравнению с (+)
инсулином, +IL-6, Р=0,02). Субконфлюэнтные клетки HepG2 обрабатывали 20 нг/мл IL-6 в течение
60 мин. В последние 5 мин обработки добавляли 1 нМ инсулина и клетки подвергали лизису с использованием модифицированного буфера RIPA. Образцы анализировали с помощью ELISA, в котором было
детектировано фосфорилирование Akt в положении Ser 473. Все данные нормализовали по общему Akt,
измеренному в ELISA. АМЕ-19а-обработка приводила к восстановлению нормального Akt-сигнала.
В нижней части снимка (фиг. 8В) представлен репрезентативный вестерн-блот. Верхние полосы соответствуют образцам, обработанным IL-6 (20 нг/мл, 60 мин, 5 мин с 1 нМ инсулина), АМЕ-19а
(20 мкг/мл, в присутствии или в отсутствии IL-6 при 20 нг/мл в течение 60 мин, 5 мин с 1 нМ инсулина)
или буфером. Блоты зондировали антифосфо-Ser/Akt антителом (верхняя панель) (pS473, Biosource).
Нижние полосы (тот же самый блот был очищен и снова зондирован анти-Akt антителом, полученным от
BioSource) указывают на то, что на каждую дорожку был загружен эквивалентный белок.
Метод.
Клетки HEPG2 культивировали в 100-мм чашках для культивирования тканей до достижения конфлюэнтности. Клетки выдерживали в минимальной среде DMEM-1%BSA в течение ночи. АМЕ-19а
(20 мкг/мл) инкубировали на клетках в течение ~30 мин перед добавлением IL-6. IL-6 (20 нг/мл) в присутствии и в отсутствии АМЕ-19а (20 мкг/мл) инкубировали в течение ~30 мин, а затем добавляли к
клеткам. Образцы инкубировали на клетках в течение 60 мин при 37°С; а затем к клеткам в течение
5 мин при комнатной температуре добавляли 1 нМ инсулин (в конечной концентрации). Клетки сразу 3
раза промывали охлажденным на льду PBS. Планшеты замораживали до проведения лизиса. Уровень
фосфо-Akt и общего Akt определяли с помощью наборов для ELISA (BioSource and Sigma). Ссылки:
J.J. Senn, P.J. Kover, I.A. Nowak and R.A. Mooney. Interleukin 6 induces cellular insulin resistance in hepatocytes, Diabetes., 51:3391-3399, 2002.
Первичные крысиные гепатоциты.
Первичные гепатоциты представляют собой наиболее релевантную in vitro систему, подходящую
для анализа влияния IL-6 и анти-IL-6 антител (или других антагонистов IL-6) на передачу инсулинового
сигнала и влияния инсулина на продуцирование глюкозы в печени. Для определения активации киназы
PI3 (PI3K) в крысиных гепатоцитах, обработанных инсулином, IL-6 и/или анти-IL-6 mAb, выделенные
клетки обрабатывали инсулином в присутствии и в отсутствии 5 нг/мл IL-6, и уровень фосфорилирования инсулинового рецептора IRS-1 (фиг. 12А) и Akt (фиг. 12В) определяли с помощью ELISA-анализов и
вестерн-блот-анализа. Кроме того, оценивали влияние IL-6 на стимулированное инсулином связывание
IRS1 с р85 (фиг. 11А и В). Эти эксперименты проводили следующим образом.
Первичные гепатоциты крыс (в возрасте ~2 месяца) в 6-луночных покрытых коллагеном планшетах
уравновешивали в течение ночи в среде с гепатоэнзимом. На следующий день клетки на 6 ч помещали в
минимальную поддерживающую среду DMEM, содержащую 1% BSA-пенициллин-стрептамицин; а затем инкубировали с hIL-6 (5 нг/мл), с анти-IL-6 антителом (АМЕ-19а) (20 нг/мл) или с анти-IL-6 антителом (АМЕ-19а) + hIL-6 в течение 90 мин при 37°С. Клетки предварительно обрабатывали в течение 1 ч
анти-IL-6 антителом (АМЕ-19а), а затем добавляли комбинацию антител. Перед добавлением к клеткам
эту комбинацию также предварительно инкубировали. К клеткам в течение 5 мин добавляли 5 нМ инсулин (BioSource), а затем клетки отсасывали и сразу подвергали лизису буфером для экстракции BioSource вместе с ингибиторами протеазы. Лизаты центрифугировали и супернатанты разводили 1:10 и
тестировали в ELISA (Biosource).
Связывание IRS1 с р85.
Равные количества белка (45 мкг) инкубировали в течение ночи с 2 мкг поликлонального
анти-IRS-1 антитела (Upstate, Item #06-248). Затем образцы подвергали иммунопреципитации сферами
белка А в течение 1 ч и элюировали 3× буфером для образцов в целях проведения электрофореза в
ДСН-ПААГ. Затем IP образцы подвергали электрофорезу в 4-12% ПААГ с ДСН, после чего переносили
на мембраны для вестерн-блот-анализа. Эти мембраны зондировали: (1) разведенным 1:100 анти-р85
mAb (Upstate, Item #05-217) на IRS-1, связанный с р85, то есть с активной PI3K (как показано на
фиг. 11А); и (2) разведенным 1:600 анти-IRS-l mAb (BD Biosciences, Item #611395) на общий IRS-1, используемый в качестве контрольной загрузки (как показано на фиг. 11В).
- 54 -
015262
Эти данные показали, что IL-6-обработка приводит к снижению индуцированного инсулином фосфорилирования IR, IRS-1 и Akt. Если клетки были предварительно обработаны анти-IL-6 антителом
(клоном АМЕ-19а), то это действие IL-6 прекращалось. Кроме того, IL-6 ингибировал индуцированное
инсулином связывание р85 (субъединицы PI3K) с IRS-1. И в этом случае предварительная обработка анти-IL-6 антителом приводила к ингибированию действия IL-6.
In vivo эксперименты.
Влияние IL-6 на чувствительность к инсулину не было хорошо исследовано на животных. Для того
чтобы определить, приводит ли терапия анти-IL-6 антителом к повышению чувствительности к инсулину
и к ослаблению симптомов T2DM, мышей db/db и самцов С57/В16, которым давали корм с высоким содержанием жира, обрабатывали коммерчески доступным антителом против мышиного IL-6 (полученным
от R&D Systems).
Мыши db/db.
Эффекты обработки анти-IL-6 антителом тестировали на мышах db/db различного возраста. У этих
мышей в возрасте 8-10 недель наблюдалась гиперинсулинемия и инсулинорезистентность, которые являются характерными симптомами на более ранних стадиях заболевания, а у мышей в возрасте 12-14
недель помимо гиперинсулинемии наблюдались повышенные уровни глюкозы в крови, которые являются характерными признаками на более поздних стадиях T2DM. Обе эти возрастные группы мышей тестировали на возможность применения терапии анти-IL-6 антителом в целях улучшения чувствительности к инсулину и регуляции уровня сахара в крови в тесте на толерантность к внутрибрюшинно вводимой глюкозе (ipGTT).
У мышей db/db наблюдалась передача сигнала нефункционального лептина, что было обусловлено
мутацией лептинового рецептора. У таких мышей с возрастом развивались ожирение, гиперинсулинемия
и инсулинорезистентность, при этом первые симптомы наблюдались тогда, когда возраст мышей составлял 6-8 недель. Две группы мышей различных возрастов - 8 и 12 недель - были обработаны 5 мг/кг антиIL-6 mAb, и через один день и 7 дней после обработки проводили тест на толерантность к внутрибрюшинно вводимой глюкозе (ipGTT). Схема обработки представлена на фиг. 15.
У 8-недельных животных обработка анти-IL-6 mAb не оказывала какого-либо влияния на выведение глюкозы во время проведения теста на толерантность к глюкозе (GTT). Обработка анти-IL-6 mAb
приводила к повышению толерантности к глюкозе (GT) у 12-недельных животных, хотя этот эффект не
был статистически значимым (р=0,063). Такое увеличение толерантности к глюкозе в тесте GTT наблюдалось через 7 дней после обработки. Кроме того, пробы сыворотки, взятые до и после окончания исследований, были проанализированы на профили адипокинов и адипонектинов. Уровни IL-6, TNFα и
МСР-1 были ниже детектируемых уровней. Эти данные, взятые вместе с результатами теста, ipGTT, дают основание предположить, что животные db/db не являются хорошими моделями для исследования
влияния анти-IL-6 антитела на инсулинорезистентность, и что уровни IL-6 в тканях являются более подходящими параметрами для изучения роли, которую может играть IL-6 в развитии инсулинорезистентности и T2DM.
Ожирение, вызываемое кормом (DIO). Животное с моделью ожирения и инсулинорезистентности.
Самцам мышей С57/В1 давали корм, содержащий 60% жира, в течение 20-35 недель. В результате у
этих мышей развивалось ожирение (средняя масса тела составляла 50,5 г) и возрастали уровни глюкозы в
крови натощак (FBG>145 мг/дл). Кроме того, у этих мышей была нарушена толерантность к глюкозе
(GT). Животных с DIO обрабатывали 10 мг/кг мышиного анти-IL-6 Ab (R&D Systems). В целом, им вводили 50 мг/кг анти-IL-6 mAb в течение 3 недель. После введения первых 2 доз (день 5), после введения
4 дозы (дни 12 и 16) и после введения 5 дозы (день 23) проводили тест ipGTT. В то же самое время брали
кровь для определения наличия адипоцитокинов и адипонектина.
Обработка анти-IL-6 антителом не приводила к повышению толерантности к глюкозе на дни 5 и 12;
однако, после введения дозы в дни 16 и 23, наблюдалось увеличение клиренса глюкозы, а также усиление метаболизма глюкозы. Через 39, 60 и 90 мин после начала проведения теста на толерантность к глюкозе (GTT) такое улучшение достигало статистической значимости.
В другой серии экспериментов животным с DIO еженедельно (2 дозы в течение первой недели и 1
дозу каждую неделю в течение последующих четырех недель) i.p. вводили 10 и 20 мг/кг анти-IL-6 Ab и
20 мг/кг IgG контрольного изотипа. Затем проводили анализ HOMA-IR (через 2, 4 и 6 недель после введения доз), ipGTT, ipITT и оценивали профиль адипокинов (через 6 недель после введения).
Анализ HOMA-IR, проводимых на животных с DIP, обработанных анти-IL-6 Ab.
В этих исследованиях у животных с DIO, которым вводили 10 и 20 мг/кг мышиного анти-IL-6 Ab и
антитела контрольного изотипа, наблюдалось снижение уровней глюкозы и уровней инсулина в крови
натощак. У этих животных брали кровь и определяли уровни глюкозы и инсулина натощак с помощью
анализа на глюкозу с использованием индикатора глюкозы Trace/DMA (ox) (thermo Electron Corp) и анализа ELISA на сверхчувствительность к крысиному инсулину (Crystal Chem) соответственно. Эти величины были использованы для определения HOMA-IR. Индекс HOMA-IR определяет статус чувствительности к инсулину и хорошо коррелирует с данными исследований на агглютинацию. HOMA-IR вычис- 55 -
015262
ляли по формуле: уровень глюкозы натощак (мМ) × уровень инсулина натощак (мМЕ/л)/22,5 (фиг. 13А,
В и С).
Улучшение индексов HOMA-IR наблюдалось после обработки в течение 2, 4 и 6 недель (на
фиг. 13А-С представлены данные, полученные после 6-недельной обработки). По окончании исследования проводили тесты ipGTT и ipITT. В этих тестах введение анти-IL-6 антитела (20 мг/мл) приводило к
значительному улучшению метаболизма и клиренса глюкозы по сравнению с данными, полученными
для животных, которым вводили антитело контрольного изотипа.
Анализ на профили адипокинов и цитокинов в пробах сыворотки, взятых у контрольных животных
и у животных, которым вводили анти-IL-6 антитело, показал, что нейтрализация IL-6 приводит к снижению уровней циркулирующих IL-6 и TNFα наряду со снижением общих уровней МСР-1 и резистина.
Другая серия полученных данных указывала на повышение уровней адипонектина при введении анти-IL6 антитела.
Был проведен гистологический анализ образцов печени, взятых у животных группы обработки и у
животных контрольной группы. Для определения содержания липидов в паренхиме печени образцы окрашивали масляным красным О. Содержание липидов в печени у животных с DIO снижалось в ответ на
введение мышиного анти-IL-6 антитела.
Такое окрашивание выявило содержание липидов в 34% от всех образцов печени, взятых у необработанных животных, то есть у животных, которым вводили носитель, и лишь в 8% образцов, взятых у
животных, обработанных 20 мг/кг анти-IL-6 антитела (фиг. 14A-F). На фиг. 14А и 14D представлена контрольная группа; на фиг. 14B и 14Е представлены необработанные животные с DIO; а на фиг. 14С и 14F
представлены животные, обработанные анти-IL-6 антителом. Повышенное содержание липидов в печени
ассоциировалось с развитием инсулинорезистентности и сахарного диабета типа 2. Таким образом, считается, что нейтрализация IL-6 приводит к повышению чувствительности к инсулину и к ослаблению
симптомов T2DM благодаря воздействию на метаболизм липидов в печени. В целом, эти данные дают
все основания предположить, что IL-6 играет определенную роль в патогенезе диабета типа 2, и что нейтрализация IL-6 должна повышать чувствительность к инсулину.
Дополнительные исследования.
Был проведен мониторинг влияния IL-6 на стимулированное инсулином фосфорилирование IRS1,
связывание с р85/PI3K, фосфорилирование инсулинового рецептора (IR), синтез гликогена и передачу
SOCS3- и STAT-сигналов в клетках HepG2 в присутствии или в отсутствии сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела. В дополнительных экспериментах оценивали влияние IL-6 на индуцированную глюкозой секрецию инсулина из панкреатических островков. Опубликованные в настоящее время
данные указывают на то, что IL-6 как ингибирует, так и стимулирует секрецию инсулина из крысиных
панкреатических островков. Свежевыделенные крысиные панкреатические островки (LiefscaNO) обрабатывали IL-6 и сконструированным человеческим анти-IL-6 антителом (АМЕ-19а) в присутствии или в
отсутствии глюкозы. Затем измеряли уровни инсулина, секретируемого такими островками в различных
условиях обработки.
С2C12. Для исследования влияния инсулина на скелетную мышцу были использованы клетки
С2С12. Были проведены эксперименты по оценке экспрессии IRS1 и Glut4, индуцированного инсулином
фосфорилирования IRS1 и влияния IL-6 на действие адипонектина.
Преимущества.
Ингибирование активности IL-6 анти-IL-6 антителом согласно изобретению должно давать значительное терапевтическое преимущество, поскольку такое ингибирование может приводить к повышению
чувствительности к инсулину и регуляции метаболизма без каких-либо побочных эффектов, вызываемых
существующими средствами. Кроме того, современные методы терапии лишь в небольшой степени подавляют системное воспаление, которое, как предполагается, является основной причиной развития ассоциированных с T2DM диабетических осложнений диабета. Предполагается, что терапия с использованием анти-IL-6 антитела согласно изобретению должна помимо повышения чувствительности к инсулину ингибировать системное воспаление и предупреждать развитие осложнений диабета.
Число пациентов, страдающих T2DM, постоянно растет, и по оценкам специалистов к 2025 году это
число достигнет 300 млн человек. Анти IL-6 антитело может быть использовано в качестве монотерапии
или в комбинации с другими уже известными OAD, такими как сульфонилмочевины, бигуаниды (например, метформин), тиазолидиндионы, меглитинид (например, репаглинид), ингибиторы альфаглюкозидазы (например, акарбоза). Кроме того, это антитело может быть использовано в комбинации с
инсулином или с другими терапевтическими средствами, такими как средства, повышающие чувствительность к инсулину и регулирующие уровень сахара в крови, что позволяет избежать развития гипогликемии, ассоциированной с введением инсулина. Также предполагается, что терапия с использованием
анти-IL-6 антитела, помимо повышения чувствительности к инсулину и регуляции уровней глюкозы у
пациентов с T2D и метаболическим синдромом, должна оказывать благоприятное действие на изменения
в сердечно-сосудистой (СС) системе, часто наблюдаемые у этих пациентов. См. Saltiel, A.R., and Kahn,
CR, 2001, Nature, 414:799-806; Hansen, В.С., 1995. Diabetes Care, 18:A2-A9; Diabetes Prevention Program
- 56 -
015262
research group, 2002, New Engl. J Med., 346:393-403; Hansen, В.С., 2000, ANO New York Academy of Science, 892:1-24; Hsueh, W.A., and Quinones, M.J., 2003, Am. J. Cardiology, 93:10J-17J; Resnick, H.E. and
Howard, B.V., 2002, ANO. Rev. Med., 53:245-267; Korner, J. and Aronne, L., 2003, J. Clin. Invest.,
111(5):565-570; Skoog, Т., et al., 2001. Diabetologia, 44:654:655; Fernandez-Real, J.M., and Ricart W., 2003,
Endocrine Reviews, 24(3):278-301; Fernandez-Real, J.M., et al., 2001, J. Clin. Endocrinol Metab., 86:11541159; 10a. Fried, S., et al., 1998, J. Clin. Endocrinol Metab., 83:847-850; Senn, J.J., et al., 2002, Diabetes,
51:3391-3399; Rotter, V., et al., 2003, JBC in press, Manus.#301977200; 12a. Stouthard, J.M., et al., 1996,
BBRC, 220:241-245; Southern, C., et al., 1990, Biochem J., 272:243-245; Sandier, S., et al., 1990, Endocrinology, 126:1288-1294; Pedersen, B.K., et al., 2001, J. Physiol., 536:329-337; DiCosmo, B.F., et al., 1994, Int.
Immunol., 6:1829-1837; Wallenius, V., et al., 2002, Nature Medicine, 8:75-79; Vozarova, В., et al., 2003, Human Genetic, 112:409-413; Kubaszek, A., et al., 2003, Diabetes, 52:558-461; Tsigos, C., et al., 1997, J. Clin.
Endocrinol Metab., 82:4167-4170; Stoutharad, J.M., et al., 1995, Am J. Physiol., 268:E813-E819; Kern, P.A., et
al., 2001, Am J. Physiol. Endocrinol Metab., 280:E745-E751; Bastard, J.P., et al., 2000, J. Clin. Endocrinol Metab., 85:3338-3342; and Bastard, J.P., et al., 2002, J. Clin. Endocrinol. Metab., 87:2084-2089.
Совершенно очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено и другими способами,
которые не были описаны в настоящем описании и в примерах. Несмотря на проиллюстрированные выше конкретные варианты осуществления изобретения, подразумевается, что в настоящее изобретение
могут быть внесены различные модификация и изменения, не выходящие за рамки объема прилагаемой
формулы изобретения.
Таблица 1
CDR легкой цепи
- 57 -
015262
*CDR определены по Кэбату, за исключением области CDRH1, которая была определена
по Кэбату и Чотия.
Таблица 2
CDR тяжелой цепи
- 58 -
015262
- 59 -
015262
*CDR определены по Кэбату, за исключением области CDRH1, которая была определена
по Кэбату и Чотия.
Таблица 3
Мутации в библиотеках отдельных CDR
- 60 -
015262
Таблица 4
Мутации, включенные в комбинаторную библиотеку
- 61 -
015262
Таблица 5А
Позитивные клоны библиотеки
Таблица 5В
Клоны сконструированного человеческого анти-IL-6 антитела и соответствующие CDR
Таблица 6
Величины ЕС50
Таблица 7
Кинетические константы для анти-IL-6 IgG
- 62 -
015262
Таблица 8
Межвидовая перекрестная реактивность сконструированного человеческого
антитела и химерного антитела
Межвидовая перекрестная реактивность сконструированного человеческого и химерного антитела.
Сконструированное человеческое антитело и химерное антитело обладали способностью нейтрализовать пролиферацию клеток 7TD1, которые были стимулированы кондиционированными супернатантами от культуры МКПК человека, игрунки, собакоподобной обезьяны, шимпанзе, макака резуса, павиана, свинохвостой обезьяны и эдипова тапарина. "+" положительный в анализе на нейтрализацию; "-" отрицательный в анализе на нейтрализацию; N/D - не определяли.
Таблица 9
Влияние анти-IL-6 mAb-обработки на почечную патологию у мышей NZB/W F1
*Тяжелая форма заболевания - периваскулярная смешанная лимфоидная гиперплазия,
повышенное содержание мезангиальных паренхиматозных клеток, отложение белка, отложение
иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране.
Заболевание средней тяжести - умеренная периваскулярная смешанная лимфоидная гиперплазия,
умеренное содержание мезангиальных паренхиматозных клеток, отложение иммунных комплексов
в гломерулярной базальной мембране, отложение белка отсутствует.
Легкая форма заболевания - небольшое количество мезангиальных паренхиматозных клеток,
небольшое отложение иммунных комплексов в гломерулярной базальной мембране, отсутствие
периваскулярной смешанной лимфоидной гиперплазии, отсутствие отложения белка.
- 63 -
015262
Таблица 10
Последовательности вариабельных областей клонов
- 64 -
015262
- 65 -
015262
- 66 -
015262
Таблица 11
Аминокислотная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи L6
со встроенными мечеными последовательностями CDR
Таблица 12
Аминокислотная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи VH3-7
со встроенными мечеными последовательностями CDR
Таблица 13
Последовательности CDR
*Х означает любую подходящую аминокислоту с репрезентативными неограничивающими
заменами, указанными в последовательностях SEQ ID NO:1-92 в табл. 1 и 2 и в табл. 3, 4, 5А и 8.
Кроме того, X может иметь следующие значения:
- 67 -
015262
- 68 -
015262
Список последовательностей
- 69 -
015262
- 70 -
015262
- 71 -
015262
- 72 -
015262
- 73 -
015262
- 74 -
015262
- 75 -
015262
- 76 -
015262
- 77 -
015262
- 78 -
015262
- 79 -
015262
- 80 -
015262
- 81 -
015262
- 82 -
015262
- 83 -
015262
- 84 -
015262
- 85 -
015262
- 86 -
015262
- 87 -
015262
- 88 -
015262
- 89 -
015262
- 90 -
015262
- 91 -
015262
- 92 -
015262
- 93 -
015262
- 94 -
015262
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное антитело к IL-6, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:97 и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:99.
2. Выделенное антитело к IL-6, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:97 и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой
цепи SEQ ID NO:99.
3. Выделенное антитело к IL-6, содержащее аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 легкой цепи (CDRL1) SEQ ID NO:3, аминокислотную последовательность CDRL2
SEQ ID NO:21, аминокислотную последовательность CDRL3 SEQ ID NO:29, аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 тяжелой цепи (CDRH1) SEQ ID NO:39, аминокислотную по- 95 -
015262
следовательность CDRH2 SEQ ID NO:59, аминокислотную последовательность CDRH3 SEQ ID NO:89.
4. Выделенное антитело к IL-6, включающее по меньшей мере одну вариабельную область легкой
цепи и одну вариабельную область тяжелой цепи, причем указанная вариабельная область легкой цепи
содержит:
аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 легкой цепи (CDRL1)
SEQ ID NO:132, содержащую последовательность S-X1-X2-X3-X4-V-X5-Y-M-Y, где X1 представляет собой А или G, Х2 представляет собой S или R, Х3 представляет собой Н, I, S или Y, Х4 представляет собой
S или Y и Х5 представляет собой S или F;
аминокислотную последовательность CDRL2 SEQ ID NO:133, содержащую последовательность
D-X6-S-X7-L-X8-S, где Х6 представляет собой F, L, M или Т, Х7 представляет собой N или Е и Х8 представляет собой А или Т;
аминокислотную последовательность CDRL2 SEQ ID NO:134, содержащую последовательность
Х9-Х10-W-S-G-Y-P-Y-T, где Х9 представляет собой M, С, S или Q и Х10 представляет собой Q или С;
аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 тяжелой цепи (CDRH1)
SEQ ID NO:135, содержащую последовательность G-F-X11-X12-S-X13-F-A-X14-S, где Х11 представляет собой Т или Q, X12 представляет собой F, S или Т, Х13 представляет собой S или Р и X14 представляет собой
L или М;
аминокислотную последовательность CDRH2 SEQ ID NO:136, содержащую последовательность
K-X15-S-X16-G-G-S-X17-X18-Y-X19-X20-D-T-X21-X22-X23, где Х15 представляет собой А или I, X16 представляет собой S или Р, Х17 представляет собой Y или W, X18 представляет собой Т, Е или Y, X19 представляет собой Y или F, Х20 представляет собой Р, S, D или Y, X21 представляет собой V или D, X22 представляет собой Т или А и Х23 представляет собой G или Р;
аминокислотную последовательность CDRH3 SEQ ID NO:137, содержащую последовательность
Q-L-W-G-X24-Y-A-L-D-X25, где X24 представляет собой S, Y, Т или N и Х25 представляет собой Y, Т, F
или I.
5. Выделенное антитело к IL-6 по п.4, которое дополнительно включает встроенные между гипервариабельными областями каркасную область 1 легкой цепи антитела человека (FRL1) SEQ ID NO:105,
FRL2 SEQ ID NO:106, FRL3 SEQ ID NO:107, FRL4 SEQ ID NO:108, каркасную область 1 тяжелой цепи
антитела человека (FRH1) SEQ ID NO:109, FRH2 SEQ ID NO:110, FRH3 SEQ ID NO:111 и FRH4
SEQ ID NO:112.
6. Антитело к IL-6 по любому из пп.2-4, где указанное антитело связывается с IL-6 по меньшей мере с одной из аффинностей, выбранных из группы, состоящей из 10-9М, 10-10М, 10-11М, 10-12М, 10-13М,
10-14М и 10-15М, определяемых методом поверхностного плазмонного резонанса или методом Kinexa.
7. Антитело к IL-6 по любому из пп.1-4, где указанное антитело ингибирует активность полипептида IL-6, состоящего из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:115, где указанная
активность выбрана из группы, состоящей из связывания IL-6 с растворимым gp80 (sIL-6R),
IL-6-индуцированного продуцирования моноцитарного белка-хемоатрактанта-1 (МСР-1), IL-6 и
IL-1β-индуцированного продуцирования сывороточного амилоида A (SAA), IL-6-зависимого фосфорилирования сигнального трансдуктора и активатора транскрипции 3 (STAT3) и снижения фосфорилирования протеинкиназы В (Akt), рецептора инсулина (IR) на субконфлюэнтных клетках HepG2.
8. Антитело к IL-6 по п.7, где IR представляет собой IR-1.
9. Композиция, содержащая по меньшей мере одно выделенное антитело к IL-6 по любому из пп.1-4
и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
10. Композиция по п.9, которая дополнительно содержит по меньшей мере одно соединение или
полипептид, выбранные из детектируемой метки или репортера, антагониста TNF, противоинфекционного лекарственного средства; лекарственного средства, воздействующего на сердечно-сосудистую (СС)
систему; лекарственного средства, воздействующего на центральную нервную систему (ЦНС); лекарственного средства, воздействующего на вегетативную нервную систему (ВНС); лекарственного средства
для лечения заболеваний дыхательных путей; лекарственного средства для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖК); гормонального лекарственного средства; лекарственного средства для
регуляции водно-солевого баланса; гематологического лекарственного средства; противоопухолевого
лекарственного средства; иммуномодулирующего лекарственного средства; офтальмического лекарственного средства; лекарственного средства для лечения заболеваний уха или носа; натурального лекарственного средства, цитокина и антагониста цитокина.
11. Антиидиотипическое антитело или его фрагмент, которые специфически связываются по меньшей мере с одним антителом к IL-6 по любому из пп.1-4.
12. Антитело к IL-6, продуцируемое способом, включающим получение выделенной рекомбинантной не являющейся человеческой клетки-хозяина, способной экспрессировать в поддающихся выделению количествах указанное антитело, трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело к IL-6 по любому из пп.1-4, и выделение указанного антитела.
13. Антитело к IL-6 по любому из пп.2-4, где указанное антитело имеет величину ЕС50, составляю- 96 -
015262
щую примерно 2,7×10-11M или менее.
14. Антитело по п.13, где указанная величина ЕС50 составляет примерно 2,7×10-12 или менее.
15. Антитело к IL-6 по любому из пп.1-4, где указанное антитело имеет константную область человека.
16. Выделенное антитело к IL-6, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной
области легкой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:98, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:100.
17. Выделенное антитело к IL-6, содержащее аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 легкой цепи (CDRL1), кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:4,
аминокислотную последовательность CDRL2, кодируемую нуклеотидной последовательностью
SEQ ID NO:22, аминокислотную последовательность CDRL3, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:30, аминокислотную последовательность гипервариабельной области 1 тяжелой цепи
(CDRH1), кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:40, аминокислотную последовательность CDRH2, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:60, аминокислотную
последовательность CDRH3, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:90.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 97 -
015262
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
- 98 -
015262
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
- 99 -
015262
Фиг. 9
Фиг. 10
Фиг. 11
- 100 -
015262
Фиг. 12А
Фиг. 12В
- 101 -
015262
Фиг. 13А
Фиг. 13В
Фиг. 13С
- 102 -
015262
Фиг. 14А
Фиг. 14В
Фиг. 14С
Фиг. 14D
- 103 -
015262
Фиг. 14Е
Фиг. 14F
Фиг. 15
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 104 -