Инсулин ИФА (Mercodia Insulin ELISA)

Mercodia Insulin ELISA, Mercodia AB
1
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение №ФСЗ 2010/06182 от 02.02.2010 года.
Инсулин ИФА (Mercodia Insulin ELISA)
Номер по каталогу: 10-1113-01 (набор реагентов на 96 определений)
10-1113-10 (набор реагентов на 10 × 96 определений)
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор Mercodia Insulin ELISA позволяет проводить специфическое количественное определение инсулина
человека в сыворотке и плазме крови.
ВВЕДЕНИЕ
Инсулин — основной гормон, контролирующий метаболизм глюкозы. Он синтезируется в β-клетках
островков Лангерганса в виде предшественника, проинсулина, который проходит процессинг с
образованием С-пептида и инсулина. И тот и другой секретируются в эквимолярных количествах в
портальный кровоток. Зрелая молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей, А-цепи и В-цепи
(21 и 30 аминокислотных остатков, соответственно). Две цепи связаны между собой двумя
межцепочечными дисульфидными мостиками. Внутри А-цепи также имеется один дисульфидный мостик.
Секреция инсулина контролируется в основном концентрацией глюкозы в плазме, гормон оказывает
множество метаболических эффектов. Главная функция инсулина заключается в контроле за поступлением
и утилизацией глюкозы в периферических тканях через переносчик глюкозы. Этой и другим
гипогликемическим активностям инсулина, таким как ингибирование глюконеогенеза и глюкогенолиза в
печени, противодействуют эффекты гипергликемических гормонов, таких как глюкагон, эпинефрин
(адреналин), гормон роста и кортизол.
Концентрация инсулина значительно снижена при инсулинзависимом сахарном диабете (ИЗСД) и при
некоторых других состояниях, таких как гипопитуитаризм. Уровень инсулина возрастает при
инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНСД), ожирении, инсулиноме и некоторых эндокринных
дисфункциях, таких как синдром Кушинга и акромегалия.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Тест Insulin ELISA основан на методе твердофазного одностадийного иммуноферментного анализа
“сэндвич”-типа. Используемые в тесте два вида моноклональных антител направлены по своему действию
на различные антигенные детерминанты молекулы инсулина. Во время инкубации присутствующий в
образце инсулин реагирует с антителами к инсулину, конъюгированными с пероксидазой хрена, и
одновременно - с антителами к инсулину, связанными в лунках микропланшета. Промывка удаляет не
связавшиеся антитела, меченные ферментом. Определение связавшегося конъюгата осуществляют по его
реакции с ферментным субстратом 3,3’,5,5’-тетраметилбензидином. Реакцию останавливают добавлением
кислоты, чтобы получить колориметрическую конечную точку для измерения оптической плотности (ОП) на
спектрофотометре.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
• Набор предназначен только для диагностического использования in vitro.
• Не допускайте возможности контакта жвачных животных или свиней с содержимым данного набора, а
также отходами от его использования.
• Стоп-реагент в данном наборе содержит 0,5 М H2SO4; используя его, соблюдайте правила работы с
опасными химическими веществами.
• Обращайтесь со всеми образцами пациентов как с возможными источниками инфекционного заражения.
НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕ ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ НАБОРА
• Микропипетки со сменными наконечниками, рассчитанные на объемы 25, 50, 100, 200 и 1000 мкл (для
внесения ферментного конъюгата, субстрата ТМБ и стоп-реагента рекомендуется использовать
многоканальные пипетки или мультистепперы)
• Мерная посуда для приготовления растворов реагентов
• Бидистиллированная вода
• Планшетный спектрофотометр, снабженный фильтром на 450 нм
• Шейкер для планшетов
• Устройство для промывки планшетов
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mercodia Insulin ELISA, Mercodia AB
2
_____________________________________________________________________________________________________
РЕАГЕНТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ НАБОРА (на 96 определений)
Каждый набор Mercodia Insulin ELISA (кат. № 10-1113-01) содержит реагенты для 96 лунок в количестве,
достаточном для проведения анализа 42 образцов и построения калибровочной кривой (в дубликатах). Для
большой серии определений можно объединять реагенты из нескольких наборов с одним и тем же номером
лота. Срок годности набора в целом указан на наружной этикетке. Рекомендуемая температура хранения
+2-8 °С.
1 планшет
96 лунок Готов к использованию
Стрипы 8-луночные
покрытые моноклональными мышиными антителами
к инсулину
Неиспользованные стрипы поместить в запечатывающийся пакет. Хранить при температуре 2 – 8 оС
в течение 2 месяцев.
5
по 1,0 мл Готов к использованию
Калибраторы 1, 2, 3, 4, 5
флаконов
концентрация указана на этикетках флаконов
Нулевой калибратор инсулина 0 мЕд/л
(желтого цвета)
1 флакон
5 мл
Готов к использованию
Концентрированный раствор конъюгата 11Х
(мышиные моноклональные антитела к инсулину,
конъюгированные с пероксидазой)
1 флакон
1,2 мл
Приготовление см. ниже
Буфер для конъюгата
(синего цвета)
1 флакон
12 мл
Готов к использованию
Концентрат промывочного буфера 21Х
Хранение после разбавления: при +2-8°С в течение
4 недель
1 флакон
50 мл
Для приготовления
промывочного буфера
добавьте 1000 мл
бидистиллированной воды
Субстрат пероксидазы (ТМБ)
Бесцветный раствор
Внимание! Чувствителен к свету!
1 флакон
22 мл
Готов к использованию
Стоп-реагент
0,5 М H2SO4
1 флакон
7 мл
Готов к использованию
Приготовление раствора конъюгата
Приготовьте необходимое количество раствора конъюгата смешиванием концентрированного раствора
конъюгата 11Х с буфером для конъюгата в соотношении 1:10, согласно нижеприведенной таблице.
Осторожно перемешайте. Используйте в течение одного дня.
Число стрипов
Концентрированный раствор
конъюгата 11Х
Буфер для конъюгата
4 стрипа
350 мкл
3,5 мл
6 стрипов
500 мкл
5,0 мл
8 стрипов
700 мкл
7,0 мл
12 стрипов
1 флакон
1 флакон
РЕАГЕНТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ НАБОРА (на 96 × 10 определений)
Каждый набор Mercodia Insulin ELISA (кат. № 10-1113-10) содержит реагенты для 10 × 96 лунок в
количестве, достаточном для проведения анализа 10 × 42 образцов и построения одной калибровочной
кривой (в дубликатах) на каждом планшете. Для большой серии определений можно объединять реагенты
из нескольких наборов с одним и тем же номером лота. Срок годности набора в целом указан на наружной
этикетке. Рекомендуемая температура хранения +2-8 °С.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mercodia Insulin ELISA, Mercodia AB
3
_____________________________________________________________________________________________________
10
По 96
Готов к использованию
Стрипы 8-луночные
планшетов
лунок
покрытые моноклональными антителами мыши к
инсулину
Неиспользованные стрипы поместить в запечатывающийся пакет. Хранить при температуре 2 – 8оС
в течение 2 месяцев.
5
по 1,0 мл Готов к использованию
Калибраторы 1, 2, 3, 4, 5
флаконов
концентрация указана на этикетках флаконов
1 флакон
5 мл
Готов к использованию
Нулевой калибратор инсулина 0 мЕд/л
(желтого цвета)
1 флакон
12 мл
Приготовление см. ниже
Концентрированный раствор конъюгата 11Х
(мышиные моноклональные антитела к инсулину,
конъюгированные с пероксидазой)
1 флакон
120 мл
Готов к использованию
Буфер для конъюгата
(синего цвета)
2 флакона
200 мл
Приготовление: см.
Концентрат промывочного буфера 21Х
ниже.
1 флакон
220 мл
Готов к использованию
Субстрат пероксидазы (ТМБ)
Бесцветный раствор
Внимание! Чувствителен к свету!
1 флакон
70 мл
Готов к использованию
Стоп-реагент
0,5 М H2SO4
Приготовление раствора конъюгата
Приготовьте необходимое количество раствора конъюгата смешиванием концентрированного раствора
конъюгата 11Х с буфером для конъюгата в соотношении 1+10 на каждый стрип, согласно количеству
планшетов в нижеприведенной таблице. Используйте в течение одного дня.
Число
стрипов/планшетов
Концентрированный раствор
конъюгата 11Х
Буфер для конъюгата
1 планшет
1,0 мл
10 мл
2 планшета
2,0 мл
20 мл
3 планшета
3,0 мл
30 мл
5 планшетов
5,0 мл
50 мл
10 планшетов
1 флакон
1 флакон
Приготовление промывочного буфера
Приготовьте необходимое количество промывочного буфера путем разведения концентрата промывочного
буфера 21Х в бидистиллированной воде в соотношении 1:20, согласно нижеприведенной таблице.
Тщательно перемешайте. Хранение после разведения: при температуре + 2 – 8 оС в течение 4 недель.
Число
стрипов/планшетов
Концентрат промывочного
буфера 21Х
Бидистиллированная
вода
1 планшет
35 мл
700 мл
2 планшета
70 мл
1400 мл
3 планшета
110 мл
2200 мл
5 планшет
180 мл
3600 мл
10 планшет
2 флакона
8000 мл
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mercodia Insulin ELISA, Mercodia AB
4
_____________________________________________________________________________________________________
ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ
Сыворотка
Соберите кровь методом венепункции, дайте ей свернуться, отделите сыворотку центрифугированием.
Образцы сыворотки можно хранить при 2-8 °С до 24 часов. Более длительное хранение осуществляйте при
минус 20 °С. Избегайте повторного замораживания и оттаивания образцов.
Плазма
Соберите кровь методом венепункции в пробирки, содержащие антикоагулянт гепарин или ЭДТА, и
отделите фракцию плазмы. Образцы плазмы можно хранить при 2-8 °С до 24 часов. Более длительное
хранение осуществляйте при -20 °С. Избегайте повторного замораживания и оттаивания образцов.
Подготовка образцов
Разводить образцы обычно не требуется, однако при содержании инсулина > 200 мЕд/л их следует
разбавить 1:9 (по объему) нулевым калибратором (0 мЕд/л).
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Каждое определение стандартов и исследуемых образцов выполняйте в дубликатах. Готовьте
калибровочную кривую при каждом проведении анализа. Перед использованием все реагенты и образцы
должны быть нагреты до комнатной температуры.
1. Подготовьте рабочий раствор конъюгата и промывочного буфера.
2. Извлеките из пакета стрипы с лунками, в количестве, достаточном для проведения анализа с
калибраторами и исследуемыми образцами в дубликатах.
3. Внесите в соответствующие лунки по 25 мкл калибраторов и образцов.
4. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгата.
5. Инкубируйте на шейкере для планшетов в течение 1 часа при комнатной температуре (18-25 °С).
6. Промойте планшет 6 раз, используя автоматическое устройство для промывки планшетов, или
промойте планшет вручную, удалив из лунок все содержимое и добавив в лунки по 350 мкл
промывочного буфера; затем полностью удалите жидкость из лунок и повторите описанную процедуру
промывки еще 5 раз. Закончив последнюю промывку, удалите из лунок остатки жидкости, энергично
постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.
7. Внесите в каждую лунку по 200 мкл субстрата ТМБ.
8. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре (18-25 °С).
9. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента. Поместите планшет на 5 секунд на шейкер для
хорошего перемешивания жидкости в лунках.
10.Измерьте оптическую плотность при 450 нм и оцените результаты. Измерение проводите не позднее
30 минут после остановки реакции.
Замечание: используйте разные пипетки для субстрата и конъюгата для избежания контаминации.
ВНУТРЕННИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для проведения внутреннего контроля качества следует ежедневно в постановку анализа в качестве
неизвестного образца включать какой-либо коммерческий контрольный материал, например,
диабетический контроль фирмы Mercodia - Mercodia Diabetes antigen control (кат № 10-1134-01 / 10-1164-01),
или используемые внутри лаборатории пулы сывороток с низкой, промежуточной и высокой концентрацией
инсулина; результаты должны ежедневно наноситься на диаграмму. Правила надлежащей лабораторной
практики рекомендуют для каждого проведенного анализа записывать следующие данные: номер лота
набора; сведения о разведении компонентов набора; значение ОП бланка; концентрации калибраторов и
контролей.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Способ обработки данных
При компьютерной обработке данных используйте кубическую регрессию для расчета калибровочной
кривой.
Расчет вручную
1. Постройте на логарифмической бумаге (log-log) график зависимости логарифма полученных для
калибраторов инсулина (3-200 мЕд/л) величин оптической плотности (ось Y) от логарифма
концентрации калибраторов (ось X).
2. Используя полученную калибровочную кривую, и измеренную величину ОП для каждого образца,
определите по кривой концентрацию инсулина в образце.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mercodia Insulin ELISA, Mercodia AB
5
_____________________________________________________________________________________________________
Пример рабочего протокола
Лунки
Содержимое лунок
1A-B
1C-D
1E-F
1G-H
2A-B
2C-D
2E-F
2G-H
3A-B
Нулевой калибратор, 0 мЕд/л
Калибратор 3 мЕд/л
Калибратор 10 мЕд/л
Калибратор 30 мЕд/л
Калибратор 100 мЕд/л
Калибратор 200 мЕд/л
Неизвестный образец 1
Неизвестный образец 2
Неизвестный образец 3
ОП450
0,070/0,071
0,105/0,106
0,202/0,204
0,434/0,470
1,348/1,351
2,451/2,476
0,222/0,214
0,546/0,538
1,941/1,978
Среднее значение
концентрации
инсулина, мЕд/л
11,1
35,6
153
Пример калибровочной кривой
Здесь показана типичная калибровочная кривая. Не используйте эту кривую для определения результатов
реального исследования.
ОП 450 нм
10.0
1.0
0.1
0.0
1
10
100
1000
Инсулин (мЕд/л)
ФАКТОР ПЕРЕСЧЁТА
1мкг/л=29 мЕд/л; 1 мЕд/л=6,0 пмоль/л
ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ПРОЦЕДУРЕ АНАЛИЗА
Как для всех диагностических тестов, окончательный клинический диагноз не может быть поставлен по
результатам единичного теста, но должен делаться врачом после оценки всех имеющихся результатов
клинических исследований.
Применение теста к исследованию пациентов, находящихся на лечении, осложнено тем фактом, что такая
терапия обычно приводит к образованию анти-инсулиновых антител, которые могут помешать анализу.
Проведению анализа не мешали образцы с признаками гемолиза, липемические и иктерические образцы.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
В соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (GLP), каждой лаборатории
рекомендуется самостоятельно определять диапазон ожидаемых значений. Приводим ориентировочные
результаты, которыми лаборатория может руководствоваться до накопления достаточного количества
данных для выработки собственных норм.
У 137 здоровых индивидов в образцах, взятых натощак, среднее арифметическое значение концентрации
инсулина равнялось 9,2 мЕд/л, медиана – 6,9 мЕд/л, диапазон значений для центральных 95% выборки
обследованных: 2 – 25 мЕд/л.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Предел определения
Предел определения 1 мЕд/л рассчитан как концентрация нулевого калибратора + 2 S.D.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mercodia Insulin ELISA, Mercodia AB
6
_____________________________________________________________________________________________________
Открытие
При добавлении известного количества инсулина в пробу измеряемое увеличение концентрации
составляет 94-113 % от ожидаемого (в среднем 104 %).
Прозонный эффект (hook-эффект)
Образцы с концентрацией инсулина вплоть до 30 000 мЕд/л могут быть измерены без занижения
результата.
Воспроизводимость
Каждый образец анализировали в 6 повторах в шести разных постановках.
Образец
1
2
3
4
Среднее,
мЕд/л
11
36
80
154
в пределах
постановки, %
3,4
4,0
2,8
3,2
Коэффициент вариации
между
постановками, %
3,6
2,6
2,8
2,9
в целом, %
5,0
4,7
4,0
4,4
Специфичность
Были найдены следующие перекрестные реакции:
С-пептид
<0,01 %
Проинсулин
<0,01 %
Проинсулин des (31-32)
<0,5 %
Проинсулин split (32-33)
<0,5 %
Проинсулин des (64-65)
98 %
Проинсулин split (65-66)
56 %
Инсулин lispro (Humalog®, Eli Lilly)
<0,006 %
Инсулин aspart
<0,006 %
Инсулиноподобный фактор роста IGF-I
<0,02 %
Инсулиноподобный фактор роста IGF-II
<0,02 %
Инсулин крысиный
0,07 %
Инсулин мышиный
0,03 %
Инсулин свиной
37,4 %
Инсулин овечий
48 %
Инсулин бычий
31 %
Калибровка
Набор фирмы Mercodia Insulin ELISA откалиброван относительно 1-го Международного референтного
препарата 66/304.
ГАРАНТИИ
Приведенные аналитические характеристики набора были получены при использовании указанной
процедуры анализа. Любые изменения или модификации процедуры, не рекомендованные фирмой
Mercodia АВ, могут повлиять на результаты; в этом случае фирма Mercodia АВ слагает с себя всякую
установленную законом предполагаемую ответственность, включая предполагаемую гарантию на
пригодность набора к продаже и к использованию.
При этом фирма Mercodia АВ и ее авторизованные дистрибьюторы не будут нести материальную
ответственность за непрямые убытки или убытки, произошедшие вследствие неправильного использования
набора.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
10-1113-01_Mercodia Insulin ELISA.doc
02/07/2010 13.26.00
Оригинал – Insulin 31-3107 Revised 2009-05-05
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mercodia Insulin ELISA, Mercodia AB
7
_____________________________________________________________________________________________________
СХЕМА ПОСТАНОВКИ АНАЛИЗА
Mercodia Insulin ELISA
Внесите калибраторы и образцы
25 мкл
Добавьте раствор конъюгата
100 мкл
Инкубируйте
Промойте
Внесите субстрат
Инкубируйте
Добавьте стоп-реагент
1 час при 18-25 ° на шейкере
6 раз
200 мкл
15 минут при 18-25 °С
50 мкл
Встряхивайте 5 секунд для
перемешивания
Измерьте при ОП450
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru