Ершов Никита Игоревич - Институт цитологии и генетики СО РАН
реклама
На правах рукописи Ершов Никита Игоревич РАННИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТРАНСКРИПТОМА ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕННЫХ АМИНОАЗОСОЕДИНЕНИЙ 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2011 Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.И. Меркулова, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Н.В. Тикунова, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск кандидат биологических наук, О.Е. Редина, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН, г. Новосибирск Защита диссертации состоится « » ________ 2011 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. Тел/факс: (383) 3331278, e-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан « Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук » _________2011 г. Т.М. Хлебодарова ВВЕДЕНИЕ Актуальность Выяснение причин злокачественного перерождения клеток млекопитающих является одной из важных задач молекулярной генетики. Данные последних лет указывают на существенную роль в развитии злокачественных новообразований эпигенетических механизмов, в частности, нарушений в регуляторном аппарате клеток, приводящих к дисбалансу процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза в клеточных сообществах различных органов и тканей. Известно, что большое значение для поддержания баланса этих процессов имеют регуляторные белки – факторы транскрипции, контролирующие экспрессию множества генов, в том числе ответственных за пролиферацию и дифференцировку различных типов клеток. Одним из ключевых звеньев в регуляции процессов дифференцировки клеток печени являются факторы транскрипции подсемейства FoxA. В предыдущих исследованиях нашей лаборатории были получены данные, свидетельствующие об опухолесупрессорных свойствах этих белков в ходе химически индуцированного гепатоканцерогенеза [Kropachev et al., 2001; Merkulova et al., 2005]. В частности, было установлено, что введение мышам и крысам 3’-метил-4-диметиламиноазобензола (3’-МеДАБ) приводит к снижению FoxA ДНК-связывающей активности в печени крыс, чувствительных к его опухолеиндуцирующему действию, но не мышей, у которых данное соединение не вызывает развития опухолей. Наоборот, введение животным орто-аминоазотолуола (ОАТ), гепатоканцерогенного только для мышей, сопровождается снижением FoxA ДНК-связывающей активности только в печени мышей. В ходе поиска связанных с контролем пролиферации и апоптоза генов-мишеней FoxA, уровень экспрессии которых существенно менялся в ответ на введение животным гепатоканцерогенов, в регуляторных районах таких генов был обнаружен новый тип сайтов связывания FoxA белков, представляющий собой тандемный повтор тетрануклеотида TTTG [Брызгалов и др., 2008]. Известно, что микросателлитные повторы часто являются сайтами связывания нескольких близкородственных белков. Поскольку ДНКсвязывающие домены Fox белков характеризуются высокой степенью гомологии, можно ожидать, что с обнаруженным микросателлитом (TTTG)n могут связываться не только члены подсемейства FoxA, но и другие белки семейства Fox. Изучение этого вопроса представляет значительный интерес, поскольку для многих представителей этого семейства показана их роль как в супрессии, так и в стимуляции развития опухолей. 1 В настоящее время одним из основных подходов к изучению моделей химически индуцированного канцерогенеза в современной токсикогеномике является анализ изменения профиля экспрессии генов в ответ на то или иное канцерогенное соединение. Широкомасштабное профилирование экспрессии позволяет эффективно обнаруживать характерные маркеры злокачественного перерождения клеток, а также в ряде случаев выявлять основные биохимические процессы и регуляторные каскады, задействованные в процессах химического канцерогенеза. Поскольку ранее получены данные о видоспецифическом влиянии гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на активность ряда факторов транскрипции в клетках печени, становится очевидным, что наблюдаемые изменения в ансамбле регуляторных белков клетки должны отразиться, в первую очередь, на уровне экспрессии контролируемых ими генов-мишеней. Сопоставление изменений профиля экспрессии таких генов в печени крыс под действием гепатоканцерогенного 3’-МеДАБ и близкого ему по структуре, но слабоканцерогенного ОАТ служит отправной точкой в идентификации генов и контролирующих их экспрессию факторов, задействованных в реализации гепатоканцерогенных свойств аминоазосоединений. Цель и задачи исследования Целью исследования было выявление ранних изменений в транскриптоме печени под действием гепатоканцерогенных аминоазосоединений 3’-МеДАБ и ОАТ и роли факторов транскрипции семейства Fox в этих процессах. Для этого были поставлены следующие задачи: 1. Выявление факторов транскрипции в клетках печени крыс и мышей, связывающихся с микросателлитными ДНК-сайтами (TTTG)n. 2. Исследование влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и 3’МеДАБ на FoxO ДНК-связывающую активность в печени мышей линии ICR и крыс Wistar, соответственно. 3. Проведение широкомасштабного микрочипового анализа изменения экспрессии генов в печени крысы в ответ на высококанцерогенный для крыс 3'-МеДАБ и слабоканцерогенный ОАТ. 4. Выявление функционально связанных кластеров дифференциально экспрессирующихся генов на основе данных из баз Gene Ontology, KEGG и литературы. 5. Поиск потенциальных сайтов связывания белков FoxA в промоторных районах дифференциально экспрессирующихся генов и их выборочная экспериментальная проверка. Оценка обогащения групп дифференциально экспрессирующихся генов потенциальными генами-мишенями FoxA. 2 6. Выборочная проверка методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени данных микрочипового анализа по изменению экспрессии генов, связанных с регуляцией пролиферации, в ответ на 3'-МеДАБ и/или ОАТ. Научная новизна Впервые получены данные по масштабному изменению экспрессии генов в печени крыс под действием двух аминоазосоединений с различным гепатоканцерогенным потенциалом – слабоканцерогенного ОАТ и высококанцерогенного 3’-МеДАБ. Установлено, что эти близкие по структуре соединения вызывают изменения экспрессии различных функциональных групп генов. 3’-МеДАБ, в отличие от ОАТ, приводит к значительно более выраженному изменению экспрессии генов, связанных с регуляцией апоптоза и клеточного цикла. Напротив, в ответ на ОАТ, но не 3’-МеДАБ, наблюдалась индукция большого числа генов, продукты которых участвуют в метаболизме ксенобиотиков и ответе на окислительный стресс. Впервые показано, что введение мышам гепатоканцерогенного для них ОАТ и крысам гепатоканцерогенного для них 3’-МеДАБ приводит к снижению ДНКсвязывающей активности опухолевого супрессора FoxO3 в клетках печени этих животных. Обнаружено, что тандемные повторы (TTTG)n с числом звеньев более трех являются общими сайтами связывания для факторов транскрипции FoxA и FoxO. Выявлено значительное увеличение экспрессии четырех потенциальных генов-мишеней FoxA/FoxO, содержащих этот тип сайта, Ccng1, Tnfrsf12a, Klf6 и Pcna, в ответ на введение крысам 3’-МеДАБ, но не ОАТ. Теоретическая и практическая значимость Разработанная совместно с сотрудниками лаборатории теоретической генетики СО РАН система поиска сайтов связывания транскрипционных факторов FoxA может быть использована как аналитический инструмент для выявления и анализа представленности генов-мишеней FoxA. Материалы данной диссертации используются при чтении лекций по спецкурсу «Новейшие молекулярногенетические технологии» на кафедре информационной биологии ФЕН НГУ. Положения, выносимые на защиту Близкие по структуре аминоазосоединения 3’-МеДАБ и ОАТ обладают значительными различиями в спектре индуцируемых изменений профиля экспрессии генов в клетках печени крыс. Гепатоканцерогенный для крыс 3’МеДАБ инициирует выраженные изменения экспрессии ряда генов, связанных с регуляцией апоптоза и клеточного цикла. Слабоканцерогенный для крыс ОАТ 3 вызывает значительное увеличение экспрессии генов, продукты которых участвуют в метаболизме ксенобиотиков и ответе на окислительный стресс. Прямые тандемные повторы тетрануклеотида TTTG с числом звеньев более трех являются сайтами связывания транскрипционных факторов подсемейства FoxO. 3’-МеДАБ, в отличие от ОАТ, вызывает значительное увеличение экспрессии потенциальных генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA/FoxO, содержащих микросателлитные сайты (TTTG)n: Ccng1, Tnfrsf12a, Klf6 и Pcna. Апробация работы и публикации Результаты работы были представлены на II Съезде общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007) и 34th FEBS Congress (Чехия, Прага, 3-9 июля 2009) . По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых отечественных журналах. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 120 страницах (в том числе 3 страницы в приложении), содержит 13 рисунков и 8 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена на самцах крыс линии Wistar весом 200-250 г и 12дневных самцах мышей линии ICR разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН. 3'-МеДАБ, ОАТ или растворитель вводили животным внутрибрюшинно за 18 ч до изъятия материала печени в дозе 25,0 мг (3'-МеДАБ) и 22,5 мг (ОАТ) на 100г массы тела. Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с общепринятыми биоэтическими нормами проведения экспериментальных исследований на животных. Экстракты ядер клеток печени получали согласно методу [Shapiro et al., 1988]. Связывание белков экстракта ядер и рекомбинантного GST-слитого белка FoxA2, синтезированного в клетках E.coli, с олигонуклеотидными пробами изучали методом задержки ДНК-зонда в геле. Широкомасштабное профилирование экспрессии генов в печени крысы проводили с помощью гибридизации на микроматрицах RatRef-12 BeadChip (Illumina, США). Для выборочной проверки уровня экспрессии генов использовали метод ПЦР с детекцией в режиме реального времени. В качестве эндогенного контроля использовали ген домашнего хозяйства Gapdh. 4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Микросателлитные повторы TTTG как сайты связывания FoxA и FoxO белков Ранее в лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦиГ СО РАН были получены данные, указывающие на связь между видоспецифической гепатоканцерогенностью аминоазокрасителей и их способностью подавлять связывание транскрипционных факторов подсемейства FoxA со специфическими сайтами на ДНК [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003]. В регуляторных районах потенциальных генов-мишеней FoxA, уровень экспрессии которых существенно возрастал в ответ на введение мышам ОАТ, был обнаружен новый тип сайтов связывания FoxA, представляющий собой тандемный повтор тетрануклеотида TTTG. Поскольку в предыдущей работе по изучению повторов (TTTG)n в роли сайтов связывания FoxA использовались изолированные рекомбинантные FoxA белки [Брызгалов и др., 2008], вопрос о взаимодействии с ними других транскрипционных факторов оставался неосвещенным. В связи с этим, мы провели исследование взаимодействия белков экстракта ядер клеток печени крысы с олигонуклеотидами, содержащими тандемные повторы (TTTG)n с числом звеньев (n) от 1 до 6, методом задержки олигонуклеотидного зонда в геле. Из рисунка 1 видно, что олигонуклеотид TTR, соответствующий известному сайту TTTG TTR 1x 2x 3x 4x 5x 6x связывания факторов подсемейства FoxA, формирует с белками ядерного экстракта две полосы задержки (I и II), которые, как было установлено ранее, являются комплексами III II I 1 2 3 4 5 6 7 Рисунок 1. Взаимодействие ядерных белков клеток печени мыши с олигонуклеотидами, содержащими 1-6 -звенные повторы TTTG. 1 – меченый ДНКзонд (TTR), соответствующий известному FoxA сайту; 2-7 – зонды, содержащие от 1 до 6 звеньев TTTG. Стрелками отмечены полосы задержки. зонда с факторами подсемейства FoxA [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003]. В то же время, ДНК-зонды, содержащие 4–6 звеньев повтора TTTG, помимо комплексов I и II формировали также дополнительный ДНК-белковый комплекс меньшей подвижности (III). Исходя из анализа нуклеотидного состава известных сайтов связывания белков семейства Forkhead, мы предположили, что данный комплекс может быть образован факторами транскрипции семейства FoxO [Martinez-Gac et al., 2004]. 5 Чтобы выяснить, содержит ли комплекс III белки подсемейств FoxA либо FoxO, был проведен эксперимент по перекрестной конкуренции олигонуклеотида, соответствующего микросателлитному FoxA сайту (TTTG)5, с олигонуклеотидами, соответствующими известным сайтам связывания белков FoxA (зонд TTR) и FoxO (зонд DAF16). Как видно из рисунка 2, добавление 10- и 100-кратного избытков немеченого FoxA-специфичного олигонуклеотида TTR к микросателлитному зонду (TTTG)5 (дорожки 2-3) приводит к значительному ослаблению полос задержки I и II, однако не сказывается на интенсивности полосы задержки III. Таким образом, отсутствие конкуренции между зондами TTR и (TTTG)5 за формирование комплекса III указывает на отсутствие в его составе белков FoxA. В то же время, интенсивность III полосы задержки ДНК-зонда (TTTG)5 значительно снижалась в присутствии 10- и 100-кратного избытков немеченого FoxO-специфичного зонда DAF16 (дорожки 6-7). Следовательно, ДНК-белковый комплекс, соответствующий полосе задержки III олигонуклеотидов (TTTG)5 и DAF16, идентичны и, наиболее вероятно, образованы белками группы FoxO. Для подтверждения взаимодействия FoxO белков с сайтом, содержащим тандемный повтор (TTTG)5, был проведен эксперимент по задержке в геле комплексов олигонуклеотида с белками ядерного экстракта клеток печени крысы с помощью антител к FoxO3 (рисунок 3). Микросателлитный зонд (TTTG)5 в TTR (TTTG)5 ат-AhR ат-FoxO3 III II I 1 + - 2 + - 3 + + - 4 + + - 5 + + 6 + + IV III II I 1 2 3 4 5 6 7 Рисунок 2. Перекрестная конкуренция олигонуклеотидов, соответствующих микросателлитному FoxA сайту (TTTG)5 и известным сайтам FoxA (TTR) и FoxO (DAF16) за связывание с белками экстрактов ядер клеток печени крысы. Сверху указаны избытки соответствующих немеченых конкурентов. Стрелками отмечены полосы задержки I, II и III. Рисунок 3. Взаимодействие in vitro белка FoxO3 с микросателлитным сайтом (TTTG)5. Стрелками отмечены характерные полосы задержки I, II, III и «супершифт» IV. ат-AhR – антитела к арилгидрокарбоновому рецептору (контроль) ат-FoxO3 – антитела к белку FoxO3. 6 присутствии антител к FoxO3 (дорожка 6), но не контрольных антител к AhR (дорожка 4), формировал дополнительную полосу задержки IV наибольшей молекулярной массы, соответствующую специфической ассоциации антител с ДНК-белковым комплексом III. В случае с зондом TTR (дорожки 1, 3, 5) какоголибо изменения в числе и интенсивности формируемых полос задержки не наблюдалось. В соответствии с результатами конкурентного анализа можно заключить, что в формировании полосы задержки III зонда (TTTG)5 принимает участие транскрипционный фактор FoxO3. Таким образом, микросателлитные повторы (TTTG)n с числом звеньев более 4 являются высокоаффинными сайтами связывания транскрипционных факторов двух подсемейств Forkhead – FoxA и FoxO. 2. Снижение ДНК-связывающей активности FoxО3 под действием гепатоканцерогенов Поскольку ранее были получены данные о снижении ДНК-связывающей активности белков FoxA под действием гепатоканцерогенных азосоединений [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003], представляло интерес выяснить, влияют ли эти азосоединения на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов подсемейства FoxO. Для этого был проведен эксперимент по задержке ДНК-зондов DAF-16, TTR и (TTTG)5 в геле белками ядерных экстрактов клеток печени контрольных и обработанных соответствующим канцерогеном животных (рисунок 4). В соответствии с полученными ранее данными, обработка мышей гепатоканцерогенным для них ОАТ и крыс гепатоканцерогенным для них 3’DAF16 к о TTR 5xTTTG к о к о DAF16 к м А TTR 5xTTTG ETS к м к м к м Б Рисунок 4. Влияние ОАТ и 3’-МеДАБ на ДНК-связывающую активность FoxA и FoxO3 в печени мышей (А) и крыс (Б). Экстракты ядер получали из клеток печени: к – контрольных животных, о – мышей, обработанных ОАТ, м – крыс, обработанных 3’-МеДАБ. Стрелками отмечены характерные полосы задержки, формируемые белками FoxA (I, II) и FoxO3 (III). ETS – контрольный ДНК-зонд, соответствующий известному сайту связывания Ets белков. 7 МеДАБ приводила к значительному снижению интенсивности полос задержки I и II, соответствующих комплексам зонда с белками FoxA, в случае каждого из трех олигонуклеотидных зондов. Помимо этого, в результате обработки мышей ОАТ и крыс 3’-МеДАБ наблюдалось выраженное снижение интенсивности полосы задержки III, содержащей комплексы олигонуклеотидов DAF-16 и (TTTG)5 с белком FoxO3 (рис. 4). Таким образом, обработка крыс и мышей гепатоканцерогенными для них азосоединениями приводит к снижению ДНКсвязывающей активности не только белков FoxA, но и FoxO3. Данный результат имеет большое значение с точки зрения канцерогенного действия аминоазокрасителей, поскольку белки подсемейства FoxO являются известными опухолевыми супрессорами. FoxO3 участвует в индукции апоптоза посредством активации генов Bim и FasL [Gilley et al., 2003; Brunet et al., 1999] и в аресте клеточного цикла посредством активации p27KIP1 и репрессии Ccnd1 [Dijkers et al., 2000; Schmidt et al., 2002]. Нуль-мутация FoxO1−/− FoxO3−/− FoxO4−/− приводит к развитию тимических лимфом и гемангиом у мышей [Paik et al., 2007]. Можно предполагать, что снижение ДНК-связывающей активности FoxO3 в клетках печени под действием гепатоканцерогенных азосоединений приводит к изменению экспрессии его генов-мишеней, связанных с регуляцией апоптоза и клеточного цикла, обусловливая тем самым некоторые из событий в химически индуцированном злокачественном перерождении гепатоцитов. 3. Изменения транскриптома печени крысы под действием ’ гепатоканцерогенного для этих животных 3 -МеДАБ и слабоканцерогенного ОАТ Снижение ДНК-связывающей активности белков подсемейств FoxA и FoxO при введении животным аминоазосоединения, гепатоканцерогенного для данного вида, является далеко не единственным изменением в регуляторном аппарате клетки. В предыдущих работах по изучению влияния 3'-МеДАБ и ОАТ на рецепторы ксенобиотиков в печени животных была обнаружена видоспецифическая активация конститутивного рецептора андростанов (CAR) и арилгидрокарбонового рецептора (AhR) [Пахарукова и др., 2007а; Пахарукова и др, 2007б] этими соединениями. Очевидно, что гепатоканцерогенные аминоазосоединения влияют и на некоторые другие, пока неизвестные нам регуляторные белки. Результатом таких множественных преобразований в регуляторном аппарате клетки, индуцированных этими соединениями, является, в первую очередь, изменение транскрипционного профиля гепатоцитов. В этой связи нами был проведен широкомасштабный микрочиповый анализ ранних изменений в транскрипционном профиле клеток печени крыс в результате 8 воздействия гепатоканцерогенного для этих животных 3’-МеДАБ и неканцерогенного для них ОАТ. При этом предполагалось, что оценка изменения экспрессии генов под действием неканцерогенного для крыс ОАТ позволит отличить потенциально проканцерогенные события, возникающие только при воздействии высококанцерогенного 3’-МеДАБ, от общих эффектов аминоазокрасителей на транскриптом клеток печени. Для проведения микрочипового анализа были использованы микроматрицы RatRef-12 BeadChip (Illumina), позволяющие единовременно провести профилирование экспрессии более 20000 уникальных транскриптов крысы. В результате было выявлено 4612 и 2965 транскриптов, уровень экспрессии которых изменился после обработки животных 3’-МеДАБ и ОАТ, соответственно, при пороге значимости изменений P-value ≤ 0,0001. Для дальнейшего функционального анализа были сформированы группы генов, уровень экспрессии которых в соответствующей опытной группе животных изменялся не менее чем в 2 раза по сравнению с контрольной группой (таблица 1). Таблица 1. Группы дифференциально экспрессирующихся генов. группа критерий отбора по уровню экспрессии число генов изменение более чем в 2 раза в ответ на введение 3’1059 (↑465, ↓594) МеДАБ II изменение более чем в 2 раза в ответ на введение ОАТ 445 (↑185, ↓260) изменение в ответ на введение 3’-МеДАБ в 2 и более III 412 (↑227, ↓185) раз сильнее, чем на ОАТ изменение в ответ на введение ОАТ в 2 и более раз IV 74 (↑57, ↓17) сильнее, чем на 3’-МеДАБ изменение более чем в 2 раза в ответ на оба азокрасителя при различии между ответом на 3’V 231 (↑60, ↓171) МеДАБ и ОАТ менее чем в 2 раза Примечание. Стрелки обозначают индукцию (↑) или репрессию (↓) генов. I 3.1. Функциональный анализ дифференциально экспрессирующихся генов Для функциональной интерпретации выделенных групп генов был проведен статистический анализ обогащения этих групп терминами Gene Ontology (GO) Biological Process и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Pathways. Результирующие диаграммы для групп III и IV, демонстрирующих избирательную реакцию на введение 3’-МеДАБ либо ОАТ, и группы V, отражающей общие эффекты этих аминоазосоединений, приведены на рисунке 5. Группа III: Пролиферация и апоптоз. Большой интерес с точки зрения различий в гепатоканцерогенных свойствах 3’-МеДАБ и ОАТ представляет тот 9 А Б группа III (3'МеДАБ, но не ОАТ) группа III (3'МеДАБ, но не ОАТ) steroid biosynthetic process sterol metabolic process cellular amine metabolic process positive regulation of apoptosis positive regulation of cell death positive reg. of programmed cell death steroid metabolic process carboxylic acid metabolic process regulation of programmed cell death regulation of apoptosis Primary bile acid biosynthesis Terpenoid backbone biosynthesis Complement and coagulation Steroid hormone biosynthesis Butanoate metabolism Steroid biosynthesis Val, Leu and Ile degradation p53 signaling pathway Cell cycle PPAR signaling pathway 0 5 10 15 20 25 30 35 0 группа IV (OAT, но не 3'МеДАБ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 группа IV (OAT, но не 3'МеДАБ) Caffeine metabolism Drug metabolism Tryptophan metabolism Arachidonic acid metabolism Linoleic acid metabolism Steroid hormone biosynthesis Glutathione metabolism Retinol metabolism Drug metabolism Metabolism of xenobiotics by CYP450 dibenzo-p-dioxin metabolic process porphyrin metabolic process benzene and derivative metabolic pr. xenobiotic catabolic process response to corticosteroid stimulus response to nutrient carboxylic acid metabolic process 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 группа V (3'МеДАБ и ОАТ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 группа V (3'МеДАБ и ОАТ) Drug metabolism Steroid biosynthesis Retinol metabolism Arginine and proline metabolism Glutathione metabolism Linoleic acid metabolism Drug metabolism Complement and coagulation cascades Metabolism of xenobiotics by CYP450 Arachidonic acid metabolism negative regulation of protein phospholipid metabolic process glucose metabolic process carboxylic acid transport hexose metabolic process steroid metabolic process acute inflammatory response fatty acid metabolic process proteolysis carboxylic acid metabolic process 0 5 10 15 20 25 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рисунок 5. Обогащение трех групп генов, различающихся по реакции на ОАТ и 3'МеДАБ, терминами GO Biological Process (А) и KEGG Pathways (Б). На диаграммах приведено число реагирующих генов с указанием долей активируемых (штриховка сеткой) и репрессируемых (диагональная штриховка) генов для каждого из 10 наиболее представленных терминов в соответствующей группе. факт, что группа III генов, реагирующих избирательно на высококанцерогенный для крыс 3’-МеДАБ, показала наибольшее обогащение по генам, ассоциированным с термином GO «регуляция апоптоза» и его синонимами. В то же время, среди генов, реагирующих на слабоканцерогенный ОАТ (IV и V), обогащения по этим терминам не обнаружено (рис. 5, А). Более того, анализ в категориях KEGG показал, что группа III, в отличие от двух других групп, наиболее обогащена генами, связанными с терминами «P53 сигнальный путь» и «клеточный цикл», причем экспрессия практически всех таких генов повышалась в ответ на высококанцерогенный 3’-МеДАБ (рис. 5, Б). Более подробный анализ генов, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации клеток и реагирующих на введение 3’-МеДАБ и/или ОАТ, показал, 10 что уровень экспрессии большинства из них при введении животным 3’-МеДАБ заметно выше, чем в случае ОАТ. В частности, введение крысам 3’-МеДАБ, в отличие от ОАТ, приводит к увеличению экспрессии генов Ccnd1, Ccng1, Mcm7, Pcna, Mybl2, Brd2, Jun, Nupr1, Pdgfa, Tnfrsf12a, Gdf15, Mapk8ip3, Mapk7 и Map3k6, являющихся известными маркерами и индукторами пролиферативных процессов, а также к репрессии генов антипролиферативных белков Rbl2, Rarb и Igfbp1. Наблюдаемые изменения экспрессии этих генов могут указывать на активацию пролиферативных процессов в клетках печени под действием 3’-МеДАБ, но не ОАТ. В то же время, 3’-МеДАБ вызывает репрессию генов индукторов апоптоза G0s2, Faf1, Ctnnbl1, Pcsk9, Stk3, Lcn2 и Prkra, а также активацию экспрессии генов Mdm2 и Mdm4, напрямую репрессирующих p53; Mcl1 и Bcl2l1, блокирующих митохондриальный путь активации апоптоза; Traf4, Klf6 и регуляторов клеточного цикла Ccng1, Cdkn1a, Btg2 и Nupr1, продукты которых также обладают выраженными антиапоптогенными свойствами. Группа IV: Метаболизм ксенобиотиков и ответ на окислительный стресс. Несмотря на то, что группа IV объединяла всего 74 гена, реагирующих избирательно на ОАТ, она все же проявила значимое обогащение терминами GO и KEGG, связанными, в первую очередь, с метаболизмом ксенобиотиков; при этом экспрессия большинства соответствующих генов возрастала в ответ на ОАТ (рис. 5). В то же время, в группе III обогащения аналогичными терминами выявлено не было. Детальный анализ этой функциональной категории генов показал, что представленность мРНК ферментов I и II фазы метаболизма ксенобиотиков значительно выше в клетках печени животных, обработанных ОАТ, по сравнению с животными, обработанными 3’-МеДАБ. В частности, ОАТ приводит к гораздо более выраженной индукции генов цитохромов P450, и в первую очередь, ключевых ферментов метаболизма проканцерогенов Cyp1b1 и Cyp1a1, а так же ряда УДФ-гликозил-трансфераз, глутатион-S-трансфераз, оксидоредуктазы Nqo1 и эпоксидгидролазы 1. В совокупности, результаты функционального анализа указывают на то, что высококанцерогенный для крыс 3’-МеДАБ, в отличие от слабоканцерогенного для них ОАТ, приводит к количественным изменениям мРНК целого ряда генов, задействованных в процессах апоптоза и клеточного цикла, то есть наиболее вероятных ключевых игроков в злокачественном перерождении клеток печени. Кроме того, 3’-МеДАБ, по сравнению с ОАТ, в значительно меньшей степени индуцирует экспрессию генов метаболизма ксенобиотиков, потенциально способных участвовать в его собственной метаболической деактивации. 11 3.2. Анализ обогащения промоторных районов генов, реагирующих на введение аминоазосоединений, потенциальными сайтами связывания FoxA Представляло большой интерес выяснить, является ли снижение ДНКсвязывающей активности FoxA одной из доминант, обусловливающих наблюдаемые ранние изменения экспрессии генов в печени крыс под действием высококанцерогенного для этих животных 3'-МеДАБ. В этой связи, нами совместно с сотрудниками лаборатории теоретической генетики ИЦиГ СО РАН был проведен анализ представленности потенциальных генов-мишеней белков FoxA в группах генов, уровень экспрессии которых в клетках печени крыс изменялся в ответ на введение 3'-МеДАБ либо ОАТ. Для выявления потенциальных генов-мишеней FoxA, содержащих в промоторных районах сайты связывания соответствующих транскрипционных факторов, был модифицирован и использован вычислительный метод SITECON. Выборочную экспериментальную проверку FoxA сайтов, предсказанных методом SITECON, проводили с помощью задержки олигонуклеотидных зондов в геле белками ядерного экстракта клеток печени крыс (рис. 6, А) и рекомбинантным белком, содержащим ДНК-связывающий домен белка FoxA2 крысы (рис. 6, Б). Как видно из рисунка 6, подавляющее большинство предсказанных модифицированным методом SITECON FoxA сайтов подтвердилось in vitro. Дальнейший анализ показал, что обогащение потенциальными генамимишенями FoxA (в 1,17 раз; P ≤ 0.01) наблюдалось лишь в группе генов, демонстрирующих увеличение экспрессии в ответ на ОАТ. В группе генов, А Б 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Рисунок 6. Экспериментальная проверка предсказанных сайтов связывания FoxA методом задержки в геле с использованием белков ядерного экстракта клеток печени крыс (А) и рекомбинантного GST-DBD-FoxA2 (Б). 1-12 – зонды, соответствующие предсказанным сайтам связывания FoxA: Faf1_508 (1); Cdc27_1043 (2); Abtb2_320 (3);Serping1_68 (4);Mybl2_475 (5); Mdm4_1622 (6); Btg2_986 (7); Prc1_864 (8); Mcm7_558 (9); Tnfrsf12a_1687 (10); Adra1b_479 (11); Cinp_706 (12); 13 - ДНК-зонд, соответствующий FoxA сайту из гена транстиретина (TTR). 12 демонстрирующих снижение уровня экспрессии в ответ на 3’-МеДАБ, напротив, наблюдалось значимое обеднение генами-мишенями FoxA (в 0,82 раз; P ≤ 0.01). Таким образом, полученные данные указывают на то, что наблюдаемые различия в действии 3’-МеДАБ и ОАТ на транскриптом клеток печени крыс не объясняются различиями в действии этих азосоединений на ДНК-связывающую активность FoxA. Однако это не исключает участия одного или нескольких геновмишеней FoxA в процессах злокачественного перерождения клеток печени под действием 3’-МеДАБ. 3.3. Верификация данных микроэррей-анализа по изменению экспрессии генов под действием 3'-МеДАБ и ОАТ методом ПЦР в реальном времени Из генов, показавших в микроэррей-анализе различия в изменении уровня экспрессии в ответ на 3'-МеДАБ и ОАТ, было выбрано 11 (Cyp1A1, Cyp3A1, Cdkn1a, Ccng1, Pcna, Btg2, Btg3, Mdm4, Tnfrsf12a, Klf6, Irf7), продукты которых играют ключевую роль в метаболизме ксенобиотков, регуляции пролиферации и 18.9 ответе на клеточный стресс, для оценки изменения их экспрессии методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Из результатов, приведенных на рисунке 7, видно, к онтроль 3'-М еД А Б ОАТ 15.0 ко нтро ль 3.6 1.4 ОАТ 1.0 0.7 dm 4 1.6 0.8 M f7 Ir a sf 12 lf 6 Tn fr 3.8 1.4 4.3 0.8 2.3 K g1 1.8 C cn 2 B tg 3 3'-М е Д А Б 7.5 7.5 4.3 4.4 tg B P cn a n1 C dk 13.5 20.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 a 64.8 6.5 18.9 63.5 Tn fr M sf Ir dm f7 4 1.0 a 0.6 12 lf 6 K 2.8 1.1 4.9 9.8 g1 cn 2 C C 1 3A yp C 3.3 1.6 8.3 B tg 3 B P tg a cn n1 dk 1.2 2.1 1.0 6.9 a 1 3A yp C 1.0 N/D 2E-04 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 C y p 1 A1 .. . 2.0 0.7 1.9 5.9 1 1A yp C 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 9.8 14.6 20.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 Рисунок 7. Сопоставление данных по изменению уровня экспрессии 11 генов в клетках печени крысы под действием 3’-МеДАБ и ОАТ, полученных методами микроэррей-анализа (А) и ПЦР в реальном времени (Б). На диаграмме указаны средние значения коэффициента изменения экспрессии ± стандартная ошибка среднего (n=3). N/D – продукт не детектирован. 13 что тенденции в изменении экспрессии анализируемых генов в трех экспериментальных группах, выявленные методом микроэррей-анализа, в значительной мере воспроизводятся при использовании метода ПЦР-РВ. Так, по результатам обоих экспериментов, экспрессия Cdkn1a, Ccng1, Pcna, Btg2, Btg3, Tnfrsf12a и Klf6 в печени животных, обработанных 3'-МеДАБ, более чем в два раза превышает таковую в контрольной группе и в группе ОАТ. В обоих экспериментах в результате введения ОАТ экспрессия генов Btg2, Klf6, Tnfrsf12a, а также Irf7 и Mdm4, существенно не менялась, тогда как экспрессия Cdkn1a и Ccng1 возрастала в 2 и более раз. Оба метода также выявили значительную индукцию гена Cyp1A1 в ответ на введение ОАТ и гораздо менее выраженную индукцию экспрессии этого гена под действием 3'-МеДАБ. Интересно, что различия между 3'-МеДАБ и ОАТ в активации генов цитохромов 1A1 и 3A1, равно как и генов клеточного цикла Cdkn1a и Pcna, оказались значительно более выраженными в эксперименте ПЦРРВ. Ввиду того, что гены Tnfrsf12a, Klf6 и Irf7 содержат в регуляторной области микросателлитный сайт (TTTG)3, а гены Ccng1 и Pcna – (TTTG)6, можно предполагать, что белки FoxA и/или FoxO3, способные связываться с данным типом сайтов, участвуют в регуляции экспрессии этих генов. Так как введение крысам 3'-МеДАБ приводит к снижению ДНК-связывающей активности FoxA и FoxO3, можно было ожидать, что уровень экспрессии вышеуказанных генов будет в той или иной мере изменяться в ответ на этот канцероген. Проведенные эксперименты по изучению изменения экспрессии генов под действием азосоединений методами микроэррей-анализа и ПЦР-РВ действительно показали значительно более выраженное увеличение экспрессии Ccng1, Tnfrsf12a, Klf6 и Pcna в клетках печени крыс под действием гепатоканцерогенного для них 3'МеДАБ в сравнении со слабоканцерогенным ОАТ. Таким образом, гепатоканцерогенный для крыс 3’-МеДАБ в отличие от слабоканцерогенного ОАТ вызывает изменение экспрессии целого ансамбля генов в клетках печени этих животных, для ряда которых уже известна связь между соответствующим изменением их экспрессии и гепатоканцерогенезом. Так, высокий уровень экспрессии гена Tnfrsf12a, кодирующего рецептор цитокина TWEAK, наблюдается в клетках гепатокарцином человека и мыши, но не в нативной ткани [Feng et al., 2000]. Экспрессия гена Klf6 в клеточных линиях гепатокарциномы важна для их пролиферации и резистентности к апоптозу [Sirach et al., 2007]. Также известно, что у мышей, нокаутных по Ccng1, значительно снижены частота возникновения, число и размер индуцированных диэтилнитрозамином опухолей [Jensen et al., 2003]. 14 Под действием 3’-МеДАБ наблюдается изменение экспрессии различных функциональных групп генов, и в частности, ферментов клеточного метаболизма и компонент системы контроля пролиферации и апоптоза. Очевидно, что в реализации наблюдаемых разносторонних эффектов этого гепатоканцерогена оказывается задействованным множество элементов регуляторного аппарата клеток печени. Ранее в нашей лаборатории было показано, что обработка животных аминоазосоединением, гепатоканцерогенным для данного вида, приводит к снижению ДНК-связывающей активности белков подсемейства FoxA [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003], а также активации конститутивного рецептора андростанов (CAR) и арилгидрокарбонового рецептора (AhR) [Пахарукова и др., 2007а; Пахарукова и др., 2007б]. В данной работе впервые обнаружено снижение ДНК-связывающей активности фактора транскрипции FoxO3 в печени животных при введении гепатоканцерогенного для них азосоединения. В отличие от белков FoxA, CAR и AhR, роль которых в процессах канцерогенеза не до конца ясна, FoxO3 обладает выраженным опухолесупрессорным действием, в том числе посредством регуляции ряда генов, продукты которых играют ключевую роль в процессах апоптоза и клеточного цикла [Paik et al., 2007; Dijkers et al., 2000; Schmidt et al., 2002; Gilley et al., 2003; Brunet et al., 1999]. Таким образом, можно предполагать, что снижение ДНКсвязывающей активности данного белка является важным звеном в некоторых из событий злокачественного перерождения клеток печени под действием 3’-МеДАБ. ВЫВОДЫ: 1. Впервые показано, что тандемные тетрануклеотидные повторы (TTTG)n с числом звеньев более трех являются сайтами связывания не только факторов транскрипции FoxA, но и FoxO3. 2. Установлено, что введение мышам гепатоканцерогенного для них ОАТ и крысам гепатоканцерогенного для них 3’-МеДАБ приводит к снижению ДНК-связывающей активности опухолевого супрессора FoxO3 в клетках печени этих животных. 3. Показано, что близкие по структуре азосоединения, гепатоканцерогенный для крыс 3’-МеДАБ и слабоканцерогенный ОАТ, приводят к изменению экспрессии различных функциональных групп генов: а) обработка животных 3’-МеДАБ, в отличие от ОАТ, приводит к изменению экспрессии значительного числа генов, связанных с регуляцией апоптоза и клеточного цикла; 15 б) введение животным ОАТ, в сравнении с 3’-МеДАБ, приводит к значительно более выраженной индукции генов, продукты которых участвуют в метаболизме ксенобиотиков и ответе на окислительный стресс. 4. Обнаружено значительное увеличение экспрессии потенциальных геновмишеней транскрипционных факторов FoxA/FoxO3: Ccng1, Tnfrsf12a, Klf6 и Pcna – участвующих в регуляции пролиферации, в клетках печени крыс в ответ на введение высококанцерогенного 3’-МеДАБ, но не слабоканцерогенного ОАТ. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Л.О. Брызгалов, Н.И. Ершов, С.И. Ильницкая. Транскрипционные факторы определяют FoxA амплитуду тирозинаминотрансферазы у глюкокортикоидной мышей // Бюллетень индукции Экспериментальной Биологии и Медицины. – 2007. – Т. 144. – № 11. – С. 565–567. 2. Л.О. Брызгалов, Н.И. Ершов, Д.Ю. Ощепков, В.И. Каледин, Т.И. Меркулова. Выявление генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA, связанных с регуляцией пролиферации // Биохимия. – 2008. – Т. 73. – № 1. – С. 70–75. 3. Н.И. Ершов, В.Г. Левицкий, Д.Ю. Ощепков, О.В. Вишневский, Л.О. Брызгалов, Е.В. Антонцева, Т.И. Меркулова. Изменения транскриптома печени крысы под действием гепатоканцерогенного для этих животных 3’-МеДАБ и неканцерогенного ОАТ // Вестник ВОГиС. – 2009. – Т. 13. – № 4. – С. 703–722. 4. В.Г. Левицкий, Д.Ю. Ощепков, Н.И. Ершов, Л.О. Брызгалов, Е.В. Антонцева, Г.В. Васильев, Т.И. Меркулова, Н.А. Колчанов. Разработка методов распознавания сайтов связывания транскрипционных факторов FoxA, их экспериментальная верификация и использование для анализа данных массовой иммунопреципитации хроматина // ДАН. – 2011. – Т. 436. – № 3. – С. 413–421. 5. Т.И. Меркулова, Л.О. Брызгалов, Н.И. Ершов, Д.Ю. Ощепков, М.Ю. Пахарукова, К.Ю. Кропачев, В.И. Каледин. Транскрипционные факторы FOXA как потенциальные опухолевые супрессоры в печени // Сборник материалов 16 всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология», Новосибирск, Россия, 2008, С. 134–135. 6. N. Ershov, T. Merkulova, L. Bryzgalov, M. Pakharukova, D. Oschepkov and V. Kaledin. Revealing of potential FoxA target genes, involved in proliferation control. // The FEBS journal. Abstracts of 34th FEBS Congress. Prague, Czech Republic. – 2009. – V. 276 – supp. 1. – P. 112. Подписано к печати 14.02.2011 г. Формат бумаги 60 x 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7. Тираж 110 экз. Заказ 12. _______________________________________________ Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10. 17
