018450 B1 018450 B1 (11) 018450

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
018450
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2013.08.30
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. C07K 14/705 (2006.01)
A61K 38/17 (2006.01)
A61P 19/00 (2006.01)
201100158
(22)
Дата подачи заявки
2006.11.22
(54)
АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ACTRIIA И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ
СТИМУЛИРОВАНИЯ РОСТА КОСТИ
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
В некоторых аспектах изобретение обеспечивает композиции и способы для стимулирования роста
кости и увеличения плотности кости.
Нопф Джон, Сихра Джасбир (US)
Медведев В.Н. (RU)
B1
018450
(56) WO-A2-2005094871
WO-A1-2003006057
WO-A2-2005028517
RU-C2-2238948
TSUCHIDA K., Activins, myostatin and
related TGF-beta family members as novel therapeutic
targets for endocrine, metabolic and immune disordes.,
Curr Drug Immune Endocr Metabol Disord, 2004 Jun.,
4(2) 157-66, реферат, [найдено 2011-04-27]. Medline
[он-лайн], найдено в Интернет <URL:http://www
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15180456
018450
(31) 60/739,462; 60/783,322; 60/844,855
(32) 2005.11.23; 2006.03.17; 2006.09.15
(33) US
(43) 2011.08.30
(62) 200801406; 2006.11.22
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
АКСЕЛЕРОН ФАРМА ИНК. (US)
018450
Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет следующих предварительных патентных заявок
США №№ 60/739462, поданной 23 ноября 2005 года, 60/783322, поданной 17 марта 2006 года и
60/844855, поданной 15 сентября 2006 года, причем указанные заявки включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей их полноте.
Уровень техники изобретения
Костные нарушения от остеопороза до переломов представляют собой ряд патологических состояний, для которых существует немного эффективных фармацевтических средств. Вместо медикаментозной терапии лечение нацелено на физические воздействия и влияние на поведение, включая иммобилизацию, физические упражнения и перемену диеты. Наличие терапевтических средств, которые стимулируют рост кости и увеличение плотности кости, было бы полезным для лечения множества костных нарушений.
Рост кости и минерализация зависят от активности двух типов клеток, остеокластов и остеобластов,
но вместе с тем важнейшие аспекты этих процессов также охватывают активность хондроцитов и клеток
сосудистой сети. Относительно развития процесс остеогенеза происходит посредством двух механизмов,
представляющих собой эндохондральное окостенение и оссификацию в соединительнотканной мембране, при этом первое отвечает за формирование кости в длину, а второе отвечает за формирование топологически плоских костей, таких как кости черепа. Для эндохондрального окостенения необходимо последовательное образование и разрушение хрящевых структур в ростовых пластинках, которые служат
основой для образования остеобластов, остеокластов, сосудистой сети и последующей минерализации. В
процессе оссификации в соединительнотканной мембране образование кости происходит непосредственно в соединительных тканях. Для обоих процессов необходима инфильтрация остеобластов и последующее отложение матрикса.
Излечение переломов и других структурных разрушений кости происходит в ходе процесса, который, по меньшей мере, на первый взгляд напоминает последовательность событий, развивающихся при
остеогенезе, включая образование хрящевой ткани и последующую минерализацию. Процесс заживления перелома может происходить двумя способами. Прямое или первичное заживление кости происходит без образования костной мозоли. При косвенном или вторичном заживлении кости наблюдается
предшествующая стадия костной мозоли. Первичное заживление переломов охватывает воссоздание механической непрерывности через область перелома. Клетки, резорбирующие кость, которые окружают
область перелома, при подходящих условиях проявляют туннелирующую резорбтивную реакцию и создают проводящие пути для проникновения кровеносных сосудов и последующего заживления. Вторичное заживление кости следует за процессом воспаления, образованием мягкой мозоли, минерализацией
мозоли и реконструкцией мозоли. Причиной образования гематомы и геморрагии на стадии воспаления
является разрушение периостальных и эндостальных кровеносных сосудов в области повреждения. В эту
область проникают воспалительные клетки. На стадии образования мягкой мозоли эти клетки производят новые сосуды, фибробласты, внутриклеточный материал и поддерживающие клетки, образуя грануляционную ткань в пространстве между фрагментами перелома. Клиническое сращение в области перелома создается волокнистой или хрящевой тканью (мягкая мозоль). Происходит образование остеобластов, опосредующих минерализацию мягкой мозоли, которая затем замещается пластинчатой костью и
претерпевает нормальные процессы ремоделирования.
В дополнение к переломам и другим физическим разрушениям структуры кости потерю содержания минеральных веществ в костях и костной массы может вызывать широкий спектр состояний, и это
может приводить к серьезным медицинским проблемам. На протяжении жизни человека изменение костной массы происходит относительно прогнозируемым образом. До возраста около 30 лет и у мужчин, и
у женщин нарастание костной массы до максимальных показателей происходит посредством линейного
роста эндохондральных ростовых пластинок и радиального роста. И у мужчин, и у женщин в возрасте
старше примерно 30 лет (в трабекулярных костях, например плоских костях, таких как кости позвоночника и таза) и в возрасте старше примерно 40 лет (в корковых костях, например длинных костях конечностей) наблюдается медленная потеря костной массы. У женщин конечная фаза значительной потери
костной массы происходит, по-видимому, также в силу дефицита эстрогенов в постклимактерическом
периоде. Во время этой фазы женщины могут потерять дополнительно 10% костной массы в корковых
костях и 25% в трабекулярном пространстве. Возникновение патологического состояния в результате
прогрессирующей потери костной массы, такого как остеопороз, в значительной степени зависит от исходной костной массы человека и от наличия отягощающих условий.
Потеря костной массы иногда носит характер дисбаланса в нормальном процессе ремоделирования
кости. Здоровая кость постоянно подвергается ремоделированию. Ремоделирование начинается с резорбции кости остеокластами. Затем резорбированная кость замещается новой костной тканью, которая
характеризуется образованием коллагена остеобластами и последующей кальцификацией. У здоровых
людей скорости резорбции и остеогенеза сбалансированы. Остеопороз представляет собой хроническое,
прогрессирующее состояние, при котором отмечается сдвиг в сторону резорбции, что приводит к общему уменьшению костной массы и минерализации кости. Остеопорозу у людей предшествует клиническая
-1-
018450
остеопения (значение минеральной плотности костей выше одного стандартного отклонения, но ниже 2,5
стандартных отклонений, и ниже среднего значения минеральной плотности костей у молодого взрослого человека). Во всем мире риску развития остеопороза подвержены около 75 млн человек.
Таким образом, способы регуляции баланса между активностью остеокластов и остеобластов могут
быть полезными для ускорения заживления переломов и других повреждений костей, а также для лечения нарушений, связанных с потерей костной массы и минерализации костей, таких как остеопороз.
Что касается остеопороза, то эстроген, кальцитонин, остеокальцин с витамином K или диеты с
большими дозами кальция - все используются в качестве средств для терапевтического воздействия.
Другие терапевтические подходы к остеопорозу включают бифосфонаты, паратиреоидный гормон, кальцимиметики, статины, анаболические стероиды, соли лантана и стронция и фторид натрия. Вместе с тем,
такое лечение часто связано с нежелательными побочными эффектами.
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении композиций и способов для
стимулирования роста и минерализации костей.
Сущность изобретения
Частично в настоящем описании изобретения показано, что молекулы, обладающие активностью
антагонистов активина или ActRIIa ("антагонисты активина" и "антагонисты ActRIIa"), можно использовать для увеличения плотности кости, стимулирования роста кости и/или увеличения прочности кости. В
частности, в настоящем описании показано, что растворимая форма ActRIIa действует как ингибитор
сигнального пути активин-ActRIIa и способствует in vivo увеличению плотности кости, роста кости и
прочности кости. Тогда как большинство фармацевтических средств, стимулирующих рост кости или
ингибирующих потерю костной массы, действуют либо как антикатаболические средства (также обычно
называемые "катаболическими средствами") (например, бифосфонаты), либо как анаболические средства
(например, паратиреоидный гормон (РТН) в подходящей дозе), растворимый белок ActRIIa проявляет
двойное действие, обладая как катаболическими, так и анаболическими эффектами. Таким образом, настоящим изобретением установлено, что антагонисты сигнального пути активин-ActRIIa можно использовать для увеличения плотности кости и стимулирования роста кости. Хотя растворимый ActRIIa может
действовать на кость посредством механизма, отличного от антагонизма к активину, тем не менее, в настоящем описании показано, что могут быть выбраны желаемые терапевтические средства на основе
антагонистической активности активин-ActRIIa. В этой связи, в некоторых вариантах осуществления
настоящее изобретение обеспечивает способы использования антагонистов активин-ActRIIa, включающих, например, активинсвязывающие полипептиды ActRIIa, антитела к активину, антитела к ActRIIa,
нацеленные на активин или ActRIIa малые молекулы и аптамеры, и нуклеиновые кислоты, которые
уменьшают экспрессию активина и ActRIIa, для лечения нарушений, ассоциированных с низкой плотностью кости или низкой прочностью кости, таких как остеопороз, или для стимулирования роста кости у
нуждающихся в этом пациентов, таких как пациенты, имеющие перелом кости. Дополнительно, растворимый полипептид ActRIIa стимулирует рост кости, не вызывая при этом соизмеримого увеличения мышечной массы.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает полипептиды, содержащие растворимый активинсвязывающий полипептид ActRIIa, который связывается с активином. Полипептиды ActRIIa
можно приготовить в виде фармацевтического препарата, содержащего активинсвязывающий полипептид ActRIIa и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно активинсвязывающий полипептид ActRIIa связывается с активином с константой диссоциации KD менее 1 мкмоль или менее чем 100,
10 или 1 нмоль. Необязательно, активинсвязывающий полипептид ActRIIa селективно связывается с активином в сравнении с ростовыми дифференцировочными факторами GDF11 и/или GDF8 и предпочтительно имеет KD, которая по меньшей мере в 10, в 20 или в 50 раз ниже в отношении активина, чем в отношении GDF11 и/или GDF8. Без связи с конкретным механизмом действия предполагается, что указанная степень селективности для ингибирования активина по сравнению с ингибированием GDF11/GDF8
является причиной селективного действия на кость без соответствующего заметного действия на мышцы. Во многих вариантах осуществления будут выбирать полипептид ActRIIa, достигающий желаемого
действия на кость в дозах, которые вызывают увеличение мышц менее чем на 15%, менее чем на 10%
или менее чем на 5%. Предпочтительно композиция имеет по меньшей мере 95% чистоту относительно
других полипептидных компонентов по оценкам с помощью эксклюзионной хроматографии и более
предпочтительно композиция имеет по меньшей мере 98% чистоту. Активинсвязывающий полипептид
ActRIIa для использования в таком препарате может быть любым из раскрытых в настоящем изобретении полипептидов, таким как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную
из SEQ ID NO: 2, 3, 7 или 12, или имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей
мере на 80, 85, 90, 95, 97 или на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ
ID NO: 2, 3, 7, 12 или 13. Активинсвязывающий полипептид ActRIIa может включать функциональный
фрагмент природного полипептида ActRIIa, такой как фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 20
или 30 аминокислот из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-3, или из последовательности
SEQ ID NO: 2, в которой отсутствуют 10-15 С-концевых аминокислот ("хвост").
Растворимый активинсвязывающий полипептид ActRIIa может включать одно или несколько изме-2-
018450
нений аминокислотной последовательности (например, лигандсвязывающего домена) по сравнению с
природным полипептидом ActRIIa. Примеры измененных полипептидов ActRIIa представлены в WO
2006/012627, p. 59-60, включенном в качестве ссылки в настоящее описание. Изменение в аминокислотной последовательности может, например, менять гликозилирование полипептида, если оно происходит
в клетке млекопитающего, насекомого или в другой эукариотической клетке, или менять протеолитическое расщепление полипептида, по сравнению с природным полипептидом ActRIIa.
Активинсвязывающий полипептид ActRIIa может быть слитым белком, который в качестве одного
домена имеет полипептид ActRIIa (например, лигандсвязывающий участок ActRIIa) и один или несколько дополнительных доменов, которые обеспечивают желаемые свойства, такие как улучшенная фармакокинетика, более легкая очистка, направленность на конкретные ткани и т.д. Например, домен слитого
белка может увеличивать одно или несколько из следующего: устойчивость in vivo, период полувыведения in vivo, поглощение/введение, локализацию или распределение в тканях, образование белковых комплексов, мультимеризацию слитого белка и/или очистку. Активинсвязывающий слитый белок ActRIIa
может включать домен иммуноглобулина Fc (дикого типа или мутанта) или сывороточного альбумина,
или другой полипептидный участок, который обеспечивает желаемые свойства, такие как улучшенная
фармакокинетика, улучшенная растворимость или улучшенная устойчивость. В предпочтительном варианте осуществления слитый ActRIIa-Fc содержит относительно неструктурированный линкер, расположенный между доменом Fc и внеклеточным доменом ActRIIa. Такой неструктурированный линкер может соответствовать примерно 15 аминокислотам неструктурированной области на С-терминальном
конце внеклеточного домена ActRIIa ("хвост"), или он может представлять собой искусственную последовательность из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или иметь длину в диапазоне от 5 до 15, 20, 30, 50 или более аминокислот, которые относительно лишены вторичной структуры, или представлять собой смесь и
того, и другого. Линкер может быть обогащен остатками глицина и пролина и может, например, содержать единственную последовательность треонина/серина и глицинов или повторяющиеся последовательности треонина/серина и глицинов (например, синглеты или повторы TG4 или SG4). Слитый белок
может включать подпоследовательность очистки, такую как метка эпитопа, FLAG метка, последовательность полигистидина и слияние GST (глутатион-S-трансфераза). Необязательно, растворимый полипептид ActRIIa включает один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из
гликозилированной аминокислоты, пегилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты,
ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с
липидной группой, и аминокислоты, конъюгированной с агентом органического происхождения. Фармацевтический препарат может также включать одно или несколько дополнительных соединений, таких
как соединение, применяемое для лечения костных нарушений. Предпочтительно фармацевтический
препарат является, по существу, апирогенным. Как правило, предпочтительно, чтобы белок ActRIIa экспрессировался в клеточной линии млекопитающих, что опосредует соответствующее естественное гликозилирование белка ActRIIa для уменьшения вероятности неблагоприятного иммунного ответа у пациента. Успешно использовались клеточные линии человека и яичника китайского хомячка СНО, и предполагается, что другие общепринятые системы экспрессии млекопитающих также будут полезными.
Как описано в настоящем изобретении, белки ActRIIa, обозначаемые ActRIIa-Fc (форма с минимальным линкером между участком ActRIIa и участком Fc), имеют желаемые свойства у животных моделей, включая селективное связывание с активином по сравнению с GDF8 и/или GDF11, высоко аффинное лигандное связывание и период полувыведения из сыворотки более двух недель. В некоторых
вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает полипептиды ActRIIa-Fc и фармацевтические препараты, содержащие такие полипептиды и фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие
растворимый активинсвязывающий полипептид ActRIIa. Выделенный полинуклеотид может содержать
кодирующую последовательность для растворимого активинсвязывающего полипептида ActRIIa, такую
как описанная выше последовательность. Например, выделенная нуклеиновая кислота может включать
последовательность, кодирующую внеклеточный домен (например, лигандсвязывающий домен) ActRIIa,
и последовательность, которая будет кодировать часть или весь трансмембранный домен и/или цитоплазматический домен ActRIIa, кроме стоп-кодона, расположенного в трансмембранном домене или в
цитоплазматическом домене, или расположенного между внеклеточным доменом и трансмембранным
доменом или цитоплазматическим доменом. Например, выделенный полинуклеотид может содержать
полноразмерную полинуклеотидную последовательность ActRIIa, такую как SEQ ID NO: 4 или 5, или
частично усеченный вариант, причем указанный выделенный полинуклеотид дополнительно содержит
кодон терминации транскрипции по меньшей мере из шестисот нуклеотидов перед 3'-концом или указанный кодон расположен иным образом, так что трансляция полинуклеотида необязательно обусловливает слияние внеклеточного домена с усеченным участком полноразмерного ActRIIa. Предпочтительной
последовательностью нуклеиновой кислоты является SEQ ID NO: 14. Нуклеиновые кислоты, раскрытые
в настоящем изобретении, могут быть функционально связаны с промотором экспрессии, и настоящее
изобретение обеспечивает клетки, трансформированные такими рекомбинантными полинуклеотидами.
Предпочтительно клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка СНО.
-3-
018450
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы получения растворимого активинсвязывающего полипептида ActRIIa. Такой способ может включать экспрессию любой из нуклеиновых кислот (например, SEQ ID NO: 4, 5 или 14), раскрытых в настоящем изобретении, в подходящей
клетке, такой как клетка яичника китайского хомячка (СНО). Такой способ может включать а) культивирование клетки в условиях, подходящих для экспрессии растворимого полипептида ActRIIa, где указанная клетка трансформирована конструкцией для экспрессии растворимого ActRIIa; и b) выделение растворимого полипептида ActRIIa, экспрессируемого таким образом. Растворимые полипептиды ActRIIa
можно выделять в виде неочищенных, частично очищенных или высокоочищенных фракций. Очистку
можно осуществлять сериями последовательных стадий очистки, включающими, например, одну, две
или три либо больше из следующих стадий в любом порядке: хроматография с белком А, анионообменная хроматография (например, с использованием Q-сефарозы), хроматография гидрофобного взаимодействия (например, с использованием фенилсефарозы), эксклюзионная хроматография и катионообменная
хроматография.
В некоторых аспектах антагонист активина-ActRIIa, раскрытый в настоящем изобретении, такой
как растворимый активинсвязывающий полипептид ActRIIa, может быть использован в способе стимулирования роста кости или увеличения плотности кости у субъекта. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы лечения нарушения, ассоциированного с низкой плотностью кости, или способы стимулирования роста кости у нуждающихся в этом пациентов. Способ может включать введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества антагониста активинаActRIIa. В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает применение антагониста активинаActRIIa для получения лекарственного средства для лечения нарушения или состояния, описанного в
настоящем изобретении.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации вещества, которое стимулирует рост или повышенную минерализацию кости. Способ включает а) идентификацию тестового вещества, которое связывается с активином или лигандсвязывающим доменом полипептида ActRIIa; и b) оценку эффекта вещества на рост или минерализацию кости.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает очистку ActRIIa-hFc, экспрессируемого в клетках СНО. Белок очищается в виде
единственного, четко определяемого пика.
Фиг. 2 показывает связывание ActRIIa-hFc с активином и GDF-11, как измерено с помощью анализа
BiaCore™.
Фиг. 3 показывает схему анализа гена-репортера А-204. На чертеже показан вектор репортера:
pGL3(CAGA)12 (описанный Dennler et al., 1998, EMBO, 17: 3091-3100). Мотив CAGA12 присутствует в
реактивных генах TGF-бета (ген PAI-1), таким образом, этот вектор имеет общее применение для факторов, передающих сигналы через Smad 2 и 3.
Фиг. 4 показывает эффекты ActRIIa-hFc (ромбики) и ActRIIa-mFc (квадратики) на передачу сигналов GDF-8 в анализе гена-репортера А-204. Оба белка показывают значительное ингибирование GDF-8опосредованной передачи сигнала в пикомолярных концентрациях.
Фиг. 5 показывает эффекты трех различных препаратов ActRIIa-hFc на передачу сигналов GDF-11 в
анализе гена-репортера А-204.
Фиг. 6 показывает примеры изображений DEXA (двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии) у мышей BALB/c контрольной группы и леченных ActRIIa-mFc, перед (верхние изображения) и
после (нижние изображения) 12-недельного периода лечения. Более бледная тень указывает на повышенную плотность кости.
Фиг. 7 показывает количественное определение эффектов ActRIIa-mFc на минеральную плотность
кости у мышей BALB/c на протяжении 12-недельного периода. Проводимое лечение было контролем
(ромбики), дозой 2 мг/кг ActRIIa-mFc (квадратики), дозой 6 мг/кг ActRIIa-mFc (треугольники) и дозой 10
мг/кг ActRIIa-mFc (кружки).
Фиг. 8 показывает количественное определение эффектов ActRIIa-mFc на содержание минералов в
кости у мышей BALB/c на протяжении 12-недельного периода. Проводимое лечение было контролем
(ромбики), дозой 2 мг/кг ActRIIa-mFc (квадратики), дозой 6 мг/кг ActRIIa-mFc (треугольники) и дозой 10
мг/кг ActRIIa-mFc (кружки).
Фиг. 9 показывает количественное определение эффектов ActRIIa-mFc на минеральную плотность
трабекулярной кости у овариэктомированных (OVX) или ложнооперированных (SHAM) мышей C57BL6
после 6-недельного периода. Проводимое лечение было контролем (PBS) или дозой 10 мг/кг ActRIIa-mFc
(ActRIIa).
Фиг. 10 показывает количественное определение эффектов ActRIIa-mFc на трабекулярную кость у
овариэктомированных (OVX) мышей C57BL6 на протяжении 12-недельного периода. Лечение представляло собой контроль (PBS; светлые столбики) или дозу 10 мг/кг ActRIIa-mFc (ActRIIa; светлые столбики).
Фиг. 11 показывает количественное определение эффектов ActRIIa-mFc на трабекулярную кость у
ложнооперированных мышей C57BL6 после лечения на протяжении 6 или 12 недель. Лечение представ-4-
018450
ляло собой контроль (PBS; светлые столбики) или дозу 10 мг/кг ActRIIa-mFc (ActRIIa; темные столбики).
Фиг. 12 показывает результаты плотности кости по анализу pQCT (периферической количественной
компьютерной томографии) у овариэктомированных мышей на протяжении 12 недель лечения. Лечение
представляло собой контроль (PBS; светлые столбики) или ActRIIa-mFc (темные столбики), ось y: мг/см3.
Фиг. 13 показывает результаты pQCT анализа плотности кости у ложнооперированных мышей на
протяжении 12 недель лечения. Лечение представляло собой контроль (PBS; светлые столбики) или ActRIIa-mFc (темные пластинки), ось y: мг/см3.
Фиг. 14А и 14В показывают анализ DEXA всего тела после 12 недель лечения А) и анализ бедренных костей ex vivo В). Светлые столбики отображают зоны высокой плотности кости.
Фиг. 15 показывает pQCT анализ средней части диафиза бедра ex vivo после двенадцати недель лечения. Лечение представляло собой контроль носителя (PBS, темные столбики) и ActRIIa-mFc (светлые
столбики). Четыре столбика слева показывают общую плотность кости, тогда как четыре столбика справа показывают плотность кортикальной кости. Первая пара столбиков в каждой группе из четырех столбиков представляет данные от овариэктомированных мышей, и вторая пара столбиков представляет данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 16 показывает ex vivo анализ pQCT и диафизарную костную массу средней части диафиза бедренной кости после двенадцати недель лечения. Лечение представляло собой контроль носителя (PBS,
темные столбики) или ActRIIa-mFc (светлые столбики). Четыре столбика слева показывают общую костную массу, тогда как справа четыре столбика показывают костную массу кортикального слоя. Первая
пара столбиков в каждой группе из четырех столбиков представляет данные от овариэктомированных
мышей, и вторая пара столбиков представляет данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 17 показывает ex vivo pQCT анализ средней части диафиза бедренной кости и толщину кортикального слоя бедренной кости. Лечение было контролем (PBS, темные столбики) и ActRIIa-mFc (светлые столбики). Четыре столбика слева показывают эндостальную длину окружности, и четыре столбика
справа показывают периостальную длину окружности. Первая пара столбиков в каждой группе из четырех столбиков представляет данные от овариэктомированных мышей, и вторая пара столбиков представляет данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 18 показывает результаты механического тестирования бедренных костей после двенадцати
недель лечения. Лечение представляло собой контроль (PBS, темные столбики) и ActRIIa-mFc (светлые
столбики). Два столбика слева представляют данные от овариэктомированных мышей, и последние два
столбика представляют данные от ложнооперированных мышей.
Фиг. 19 показывает действие ActRII-mFc на объем трабекулярной кости.
Фиг. 20 показывает действие ActRII-mFc на трабекулярную архитектуру в дистальной части бедренной кости.
Фиг. 21 показывает действие ActRII-mFc на кортикальную кость.
Фиг. 22 показывает действие ActRII-mFc на механическую прочность кости.
Фиг. 23 показывает эффекты различных доз ActRIIa-mFc на параметры кости в трех разных дозах.
Фиг. 24 показывает гистоморфометрию кости, указывающую на наличие у ActRIIa-mFc двойного
анаболического и антирезорбтивного действия.
Подробное описание изобретения
1. Краткий обзор.
Суперсемейство трансформирующего бета-фактора роста (TGF-бета) содержит множество факторов роста, которые имеют общие элементы последовательностей и структурные мотивы. Известно, что
эти белки проявляют биологические эффекты на множестве типов клеток как у позвоночных, так и у
беспозвоночных. В ходе эмбрионального развития члены суперсемейства выполняют важные функции в
формировании структуры и тканевой дифференцировке и могут влиять на ряд процессов дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кардиогенез, гематопоэз, нейрогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. Семейство разделяют на две общих ветви: ветвь BMP/GDF и ветвь TGFбета/активин/ВМР10, члены которых имеют разнообразные, часто комплементарные эффекты. Часто
можно вызвать значительные физиологические изменения в организме путем влияния на активность
члена семейства TGF-бета. Например, породы рогатого скота Piedmontese и Бельгийская голубая несут
мутацию с потерей функции в гене GDF8 (также называемом миостатином), который вызывает заметное
увеличение мышечной массы; Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1): 71-4. Кроме того, у людей неактивные
аллели GDF8 ассоциированы с увеличенной мышечной массой и, по сообщениям, с исключительной силой; Schuelke et al., N Engl J. Med., 2004, 350: 2682-8.
Активины представляют собой димерные полипептидные факторы роста, которые принадлежат к
суперсемейству TGF-бета. Существуют три принципиальных формы активина (А, В и АВ), которые являются гомо/гетеродимерами двух близкородственных β-субъединиц (βAβA, βBβB и βAβB). В человеческом геноме также кодированы активин С и активин Е, которые экспрессируются в основном в печени. В
суперсемействе TGF-бета активины представляют собой уникальные и многофункциональные факторы,
которые могут стимулировать продукцию гормонов в клетках яичников и плаценты, поддерживать жизнеспособность нейронов, положительно или отрицательно влиять на развитие клеточного цикла в зави-5-
018450
симости от типа клетки и индуцировать мезодермальную дифференцировку, по меньшей мере, у эмбрионов земноводных (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ер Biol. Med., 198: 500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol.,
7: 81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol., 55: 953-963). Кроме того, было выявлено, что фактор эритроидной дифференцировки (EDF), выделенный из стимулированных человеческих моноцитарных лейкозных клеток, идентичен активину (Murata et al., 1988, PNAS, 85: 2434). Предполагается, что активин А
действует как естественный, положительный регулятор эритропоэза в костном мозге. В некоторых тканях антагонистом передачи сигналов активина является родственный ему гетеродимер ингибин. Например, в процессе высвобождения из гипофиза фолликулостимулирующего гормона (FSH) активин способствует секреции и синтезу FSH, тогда как ингибин предотвращает секрецию и синтез FSH. Другие белки,
которые могут регулировать биоактивность активина и/или связываться с активином, включают фоллистатин (FS), родственный фоллистатину белок (FSRP), α2-макроглобулин, белок Cerberus и эндоглин.
Передача TGF-бета сигналов опосредована гетеромерными комплексами рецепторов серин/треонинкиназы I типа и II типа, которые фосфорилируют и активируют каскад белков Smad после
лигандной стимуляции (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 1: 169-178). Эти рецепторы I типа и II
типа представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лигандсвязывающего внеклеточного
домена с участком, обогащенным цистеином, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с
прогнозируемой серин/треониновой специфичностью. Рецепторы I типа являются необходимыми для
передачи сигнала; и рецепторы II типа необходимы для связывающих лигандов и для экспрессии рецепторов I типа. После лигандного связывания рецепторы активина I и II типа образуют устойчивый комплекс, приводя к фосфорилированию рецепторов I типа рецепторами II типа.
Два родственных рецептора II типа, ActRIIa и ActRIIb, были идентифицированы как рецепторы II
типа для активинов (Mathews and Vale, 1991, Cell, 65: 973-982; Attisano et al., 1992, Cell, 68: 97-108). Помимо активинов, ActRIIa и ActRIIb могут биохимически взаимодействовать с некоторыми другими белками семейства TGF-бета, включающими ВМР7, нодал, GDF8 и GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell
Biol., 130: 217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci., 98: 9306-9311; Yeo and Whitman, 2001,
Mol. Cell, 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev., 16: 2749-54). Рецептором I типа для активинов в первую
очередь является ALK4, в частности для активина А, и ALK7 также может служить рецептором для активинов, особенно для активина В.
Как показано в настоящем изобретении, растворимый полипептид ActRIIa (sActRIIa), который проявляет значительную предпочтительность в связывании с активином в отличие от других членов семейства TGF-бета, таких как GDF8 или GDF11, эффективно ускоряет рост кости и увеличивает плотность
кости in vivo. Без намерения связывать это с каким-либо конкретным механизмом, предполагается, что
действие sActRIIa, прежде всего, обусловлено эффектом антагониста активина, учитывая очень мощное
связывание с активином (пикомолярная константа диссоциации), которое проявляет конкретная конструкция sActRIIa, используемая в настоящем исследовании. Независимо от механизма, по данным, представленным в настоящем изобретении, очевидно, что антагонисты ActRIIa-активина действительно увеличивают плотность кости у здоровых мышей и на моделях мышей с остеопорозом. Необходимо отметить, что кость является динамической тканью, способной к росту или сжатию и к увеличению или
уменьшению плотности в зависимости от баланса факторов, которые продуцируют кость и стимулируют
минерализацию (прежде всего, остеобласты), и факторов, которые вызывают разрушение и деминерализацию кости (прежде всего, остеокласты). Можно усилить рост и минерализацию кости путем увеличения продуцирующих факторов, уменьшения деструктивных факторов или двумя этими путями. Понятия
"стимулирование роста кости" и "увеличение минерализации кости" относятся к заметным физическим
изменениям в кости, и предполагается, что они имеют нейтральное значение по отношению к механизму,
посредством которого происходят костные изменения.
Считается, что мышиные модели, используемые в исследованиях остеопороза и роста/плотности
кости, которые описаны в настоящем изобретении, имеют высокое прогностическое значение для оценки
эффективности у людей, и, в этой связи, настоящее изобретение обеспечивает способы использования
полипептидов ActRIIa и других антагонистов активина-ActRIIa для стимулирования роста кости и повышения плотности кости у людей. Антагонисты активина-ActRIIa включают, например, активинсвязывающие растворимые полипептиды ActRIIa, антитела, которые связываются с активином (особенно с
субъединицами активина А или В, также называемыми βА или βВ) и нарушают связывание ActRIIa, антитела, которые связываются с ActRIIa и нарушают связывание активина, небелковые антитела, выбранные для связывания активина или ActRIIa (см., например, WO/2002/088171, WO/2006/055689,
WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939 и US 2005/0238646 для примеров таких белков и
способов их конструирования и выбора), рандомизированные пептиды, выбранные для связывания активина или ActRIIa, часто прикрепляющиеся к Fc домену. Соответственно для создания бифункциональной
связывающей молекулы могут быть связаны два различных белка (или другие функциональные группы)
с активностью связывания активина или ActRIIa, особенно активинсвязывающие вещества, которые блокируют сайты связывания I типа (например, растворимого рецептора активина I типа) и II типа (например, растворимого рецептора активина II типа). Аптамеры нуклеиновых кислот, малые молекулы и дру-6-
018450
гие агенты, которые ингибируют ось передачи сигнала активин-ActRIIa. Активностью антагонистов активина-ActRIIa обладает ряд белков, включая ингибин (то есть альфа-субъединицу ингибина), хотя ингибин не является универсальным антагонистом активина во всех тканях, фоллистатин (например, фоллистатин-288 и фоллистатин-315), белки Cerberus, FSRP, эндоглин, активин С, альфа(2)-макроглобулин и
мутант активина А М108А (с замещением метионина на аланин в положении 108). В общем, альтернативные формы активина, особенно формы с заменами в связывающем домене рецептора I типа, могут
связываться с рецепторами II типа и не обладать способностью к образованию активного третичного
комплекса, таким образом действуя в качестве антагонистов. Дополнительно, в качестве антагонистов
активина-ActRIIa можно использовать нуклеиновые кислоты, такие как антисмысловые молекулы, малые
интерферирующие РНК (siPHK) или рибозимы, которые ингибируют активин А, В, С или Е, или особенно экспрессию ActRIIa. Предпочтительно используемый антагонист активина-ActRIIa будет проявлять
селективность в ингибировании активинопосредованной передачи сигналов по сравнению с другими
членами семейства TGF-бета, особенно по сравнению с GDF8 и GDF11. Растворимые белки ActRIIb связываются с активином, однако белок дикого типа не проявляет значительной селективности в связывании с активином против GDF8/11, и по предварительным экспериментам предполагается, что указанный
белок не обеспечивает желательного действия на кость, также одновременно вызывая существенный
рост мышц. Вместе с тем были идентифицированы измененные формы ActRIIb с разными связывающими свойствами (см., например, WO 2006/012627, p. 55-59, включенный путем ссылки в настоящее изобретение), и эти белки могут достигать желаемого действия на кость. Нативный или измененный ActRIIb
может обладать дополнительной специфичностью к активину путем связывания со вторым активинселективным связывающим агентом.
Термины, используемые в настоящем описании, обычно имеют свои общепринятые в данной области значения, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, где используется какойлибо термин. Конкретные термины рассмотрены ниже или в другом разделе настоящего описания для
обеспечения дополнительных разъяснений практическим специалистам в описании композиций, способов настоящего изобретения и методик их получения и применения. Объем или значение какого-либо
используемого термина будут очевидны из конкретного контекста, в котором используется термин.
Термины "примерно" и "приблизительно" обычно будут означать, что приемлемая степень ошибки
для измеряемого количества обусловлены характером или точностью измерений. Обычно примерные
степени ошибки находятся в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в
пределах 5% данного значения или диапазона значений.
Альтернативно, и особенно в биологических системах, термины "примерно" и "приблизительно"
могут означать показатели, которые находятся в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратного и более предпочтительно в пределах 2-кратного значения от данной величины. Числовые
количества, приведенные в настоящем изобретении, являются примерными, если не указано иное, означая, что можно подразумевать термины "примерно" или "приблизительно", если в прямой форме не указано иное.
Способы настоящего изобретения могут включать стадии сравнения последовательностей друг с
другом, включая сравнение последовательности дикого типа с одним или несколькими мутантами (вариантами последовательностей). Такие сравнения обычно содержат выравнивания полимерных последовательностей, например, с использованием программы выравнивания последовательностей и/или алгоритмов, которые известны в данной области (например, BLAST, FASTA и MEGALIGN и некоторые другие).
В таких выравниваниях специалист в данной области с легкостью может оценить, что если мутация содержит вставку или делецию остатка, при выравнивании последовательности в полимерной последовательности, не содержащей вставленный или делетированный остаток, будет вставляться "промежуток"
(обычно представленный прочерком, или "А").
Термин "гомологичный" во всех его грамматических формах и вариантах орфографии относится к
отношениям между двумя белками, которые обладают "общим эволюционным происхождением", и
включает белки из суперсемейств организмов одного вида, а также гомологичные белки от организмов
разных видов. Такие белки (и кодирующие их нуклеиновые кислоты) обладают гомологией последовательностей, как отражено по их подобию последовательностей, выраженному процентом идентичности,
или по наличию конкретных остатков или мотивов и консервативных положений.
Термин "подобие последовательностей" во всех его грамматических формах относится к степени
идентичности или соответствию между последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот,
которые могут иметь или могут не иметь общее эволюционное происхождение.
Однако в общепринятом использовании и в настоящей заявке термин "гомологичный" при варианте
его употребления с наречием, например "высоко гомологичный", может иметь в виду подобие последовательностей и может относиться или может не относиться к общему эволюционному происхождению.
2. Полипептиды ActRIIa.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам ActRIIa. Используемый в
настоящем изобретении термин "ActRIIa" относится к семейству белков-рецепторов активина типа IIa
(ActRIIa) от любых видов и вариантов, полученных из таких белков ActRIIa мутагенезом или другой мо-7-
018450
дификацией. Предполагается, что ссылка на ActRIIa в настоящем изобретении является ссылкой на любую из идентифицированных на настоящий момент форм. Члены семейства ActRIIa в общем представляют собой трансмембранные белки, составленные из лигандсвязывающего внеклеточного домена с участком, обогащенным цистеином, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с прогнозируемой активностью серин/треонинкиназы.
Термин "полипептид ActRIIa" включает полипептиды, содержащие любой природный полипептид
членов семейства ActRIIa, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты, слияния и пептидомиметические формы), которые сохраняют полезную активность. Например, полипептиды ActRIIa
включают полипептиды, полученные из последовательности любого известного ActRIIa, имеющего последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80% идентична последовательности полипептида ActRIIa и предпочтительно идентична указанной последовательности по меньшей мере на 85, 90,
95, 97, 99% или более. Например, полипептид ActRIIa настоящего изобретения может связываться с белком ActRIIa и/или активином и ингибировать их действие. Предпочтительно полипептид ActRIIa стимулирует рост кости и минерализацию кости. Примеры полипептидов ActRIIa включают предшественник
человеческого полипептида ActRIIa (SEQ ID NO: 1) и растворимые человеческие полипептиды ActRIIa
(например, SEQ ID NO: 2, 3, 7 и 12).
Последовательность предшественника человеческого белка ActRIIa представляет собой
Сигнальный пептид подчеркнут одной линией, внеклеточный домен выделен жирным шрифтом и
потенциальные N-связанные участки гликозилирования подчеркнуты двойной линией.
Последовательность человеческого (внеклеточного) растворимого процессированного полипептида
ActRIIa представляет собой
С-концевой "хвост" внеклеточного домена подчеркнут. Последовательность с удаленным "хвостом"
(последовательность ∆15) представляет собой
-8-
018450
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок-предшественник человеческого ActRIIa, представлена следующим образом (нуклеотиды 164-1705 из доступа NM_01616 Genbank):
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий растворимый (внеклеточный) полипептид ActRIIa, представляет собой
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к растворимым полипептидам ActRIIa. Используемый в данном описании термин "растворимый полипептид ActRIIa" обычно
относится к полипептидам, содержащим внеклеточный домен белка ActRIIa. Термин "растворимый полипептид ActRIIa", используемый в настоящем описании, включает любой природный внеклеточный
домен белка ActRIIa, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты и пептидомиметические формы). Активинсвязывающий полипептид ActRIIa представляет собой полипептид, который сохраняет способность связываться с активином, особенно с активином АА, АВ или ВВ. Предпочтительно
активинсвязывающий полипептид ActRIIa связывается с активином АА с константой диссоциации 1 нМ
или меньше. Аминокислотные последовательности белка-предшественника человеческого ActRIIa представлены ниже. Внеклеточный домен белка ActRIIa связывается с активином и, как правило, является
растворимым, таким образом, его можно называть растворимым активинсвязывающим полипептидом
ActRIIa. Примеры растворимых активинсвязывающих полипептидов ActRIIa включают растворимый
полипептид, показанный в SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12 и 13. Последовательность SEQ ID NO: 7 обозначена как
ActRIIa-hFc и дополнительно описана в примерах. Другие примеры растворимых активинсвязывающих
полипептидов ActRIIa в дополнение к внеклеточному домену белка ActRIIa содержат сигнальную последовательность, например лидерную последовательность меллитина пчелиного меда (SEQ ID NO: 8), лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) (SEQ ID NO: 9) или лидерную
последовательность нативного ActRIIa (SEQ ID NO: 10). В полипептиде ActRIIa-hFc, показанном в SEQ
ID NO: 13, использована лидерная последовательность ТРА.
-9-
018450
Функционально активные фрагменты полипептидов ActRIIa могут быть получены путем скрининга
полипептидов, полученных по рекомбинантной технологии из соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ActRIIa. Кроме того, фрагменты можно синтезировать химически,
используя способы, известные в данной области, такие как общепринятый твердофазный синтез Merrifield f-Moc или t-Boc. Фрагменты могут быть получены (рекомбинантным путем или химическим синтезом) и протестированы для идентификации таких пептидильных фрагментов, которые могут действовать
как антагонисты (ингибиторы) белка ActRIIa или для передачи сигналов, опосредуемых активином.
Функционально активные варианты полипептидов ActRIIa могут быть получены путем скрининга
библиотек модифицированных полипептидов, полученных по рекомбинантной технологии из соответствующих мутировавших нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид ActRIIa. Можно получать и тестировать варианты для идентификации тех из них, которые способны действовать как антагонисты (ингибиторы) белка ActRIIa или передавать сигналы, опосредуемые активином. В некоторых вариантах
осуществления функциональный вариант полипептидов ActRIIa содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности, выбранной
из SEQ ID NO: 2 или 3. В некоторых случаях функциональный вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной
последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2 или 3.
Функциональные варианты можно получать путем модификации структуры полипептида ActRIIa
для таких целей, как усиление терапевтической эффективности, или для повышения стабильности (например, срока годности ex vivo и устойчивости к протеолитическому разрушению in vivo). Такие модифицированные полипептиды ActRIIa, выбранные для поддержания связывания активина, считаются
функциональными эквивалентами природных полипептидов ActRIIa. Модифицированные полипептиды
ActRIIa также можно получать, например, путем аминокислотного замещения, делеции или добавления.
Например, обоснованно предполагать, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или подобная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту (например, консервативные мутации) не будут обладать большим эффектом на биологическую активность полученной молекулы. Консервативными заменами являются замены, происходящие в
пределах семейства аминокислот, которые родственны по боковым цепям. Можно легко определить получение функционального гомолога путем замены аминокислотной последовательности полипептида
ActRIIa, оценивая способность вариантного полипептида ActRIIa вызывать клеточный ответ таким же
образом, как и полипептид ActRIIa дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение рассматривает конкретные мутации
полипептидов ActRIIa с целью изменения гликозилирования полипептида. Могут быть выбраны такие
мутации, чтобы вставить или удалить один или несколько сайтов гликозилирования, таких как Освязанный или N-связанный сайты гликозилирования. Аспарагинсвязанные сайты узнавания гликозилирования обычно содержат трипептидную последовательность, аспарагин-Х-треонин (или аспарагин-Хсерин) (где "X" представляет собой любую аминокислоту), которая специфично распознается подходящими клеточными ферментами гликозилирования. Изменение также можно осуществлять путем добавления или замены одного или нескольких сериновых или треониновых остатков последовательности полипептида ActRIIa дикого типа (для О-связанных сайтов гликозилирования). Ряд аминокислотных замен
или делеций в одной аминокислоте или в обеих аминокислотах из первого или третьего положения сайта
узнавания гликозилирования (и/или делеция аминокислоты во втором положении) приводит к отсутствию гликозилирования в модифицированной трипептидной последовательности. Другим способом увеличения числа углеводных групп в полипептиде ActRIIa является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду ActRIIa. В зависимости от используемого способа присоединения
можно присоединять сахар (сахара) к (а) аргинину и гистидину; (b) к свободным карбоксильным группам; (с) к свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина; (d) к свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина; (е) к ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана; или (f) к амидным группам глутамина. Эти способы описаны в WO 87/05330, опубликованном 11 сентября 1987 года, и в публикации Aplin
and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., p. 259-306, включенных путем ссылки в настоящее описание.
Удаление одной или нескольких углеводных групп, присутствующих в полипептиде ActRIIa, можно
осуществлять химическим и/или ферментативным способом. Химическое дегликозилирование может
включать, например, воздействие на полипептид ActRIIa трифторметансульфоновой кислотой или эквивалентным соединением. Такая обработка приводит к расщеплению большей части сахара или всех сахаров, кроме связывающего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), при этом не воздействуя на аминокислотную последовательность. Химическое дегликозилирование дополнительно описано Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 и Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: 131.
Ферментативное расщепление углеводных групп в полипептидах ActRIIa может быть осуществлено с
использованием ряда эндо- и экзогликозидаз, как описано Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350.
При необходимости можно подбирать последовательность полипептида ActRIIa в зависимости от типа
используемой системы экспрессии, поскольку, например, в клетках млекопитающих, дрожжей, насеко- 10 -
018450
мых и в растительных клетках могут находиться отличающиеся структуры гликозилирования, на которые может воздействовать аминокислотная последовательность пептида. Как правило, белки ActRIIa для
использования у людей будут экспрессироваться в клеточной линии млекопитающих, которая обеспечивает надлежащее гликозилирование, например в клеточной линии НЕК293 или СНО, но вместе с тем
предполагается, что также будут полезны другие клеточные линии экспрессии млекопитающих, клеточные линии дрожжей с рекомбинантными ферментами гликозилирования и клетки насекомых.
Настоящее изобретение дополнительно рассматривает способ получения мутантов, особенно наборы комбинаторных мутантов полипептида ActRIIa, а также "усеченных" мутантов; пулы комбинаторных
мутантов являются особенно полезными для идентификации функциональных вариантов последовательностей. Целью скрининга таких комбинаторных библиотек может быть получение, например, вариантов
полипептида ActRIIa, которые могут действовать или как агонисты, или как антагонисты, или альтернативно, что придает новые свойства им всем. Ниже рассматривается ряд скрининговых анализов, и такие
анализы можно использовать для оценки вариантов. Например, можно проводить скрининг варианта полипептида ActRIIa на его способность связываться с лигандом ActRIIa, на способность предотвращать
связывание лиганда ActRIIa с полипептидом ActRIIa или нарушать передачу сигналов, вызываемых лигандом ActRIIa.
Активность полипептида ActRIIa или его вариантов также можно тестировать в анализе на клетке
или in vivo. Например, можно оценивать действие варианта полипептида ActRIIa на экспрессию генов,
вовлеченных в продукцию кости или деструкцию кости. При необходимости, это можно осуществлять в
присутствии одного или нескольких рекомбинантных лигандных белков ActRIIa (например, активина), и
можно трансфицировать клетки для получения полипептида ActRIIa и/или его вариантов и, необязательно, лиганда ActRIIa. Аналогично, полипептид ActRIIa можно вводить мыши или другому животному,
можно проводить оценку одного или нескольких свойств кости, таких как плотность или объем кости.
Также можно оценивать скорость излечения переломов кости. Общеизвестной неинвазивной количественной методикой оценки плотности кости у животного является двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (DEXA). У людей для оценки плотности кости в позвоночном столбе и в костях таза могут быть использованы системы центральной DEXA. Они представляют собой наилучшие прогностические показатели общей плотности кости. Системы периферической DEXA можно использовать для
оценки плотности кости в периферических костях, включая, например, кости кисти, запястья, лодыжки и
стопы. Традиционные рентгеновские системы отображения, включая компьютерную аксиальную томографию CAT, можно применять для оценки роста кости и излечения перелома. Также можно оценивать
механическую прочность кости.
Могут быть получены варианты комбинаторного происхождения, которые обладают селективной
или в целом увеличенной эффективностью по сравнению с природным полипептидом ActRIIa. Аналогично, мутагенез может способствовать появлению вариантов, имеющих периоды полувыведения из клеток, резко отличающиеся от соответствующих периодов полипептида ActRIIa дикого типа. Например,
измененный белок может стать или более устойчивым, или менее устойчивым к протеолитическому
расщеплению или другим клеточным процессам, которые приводят к разрушению, или к инактивации
другим путем природного полипептида ActRIIa. Можно использовать такие варианты и гены, которые
кодируют их, для изменения уровней полипептида ActRIIa путем модулирования периода полувыведения полипептидов ActRIIa. Например, короткий период полувыведения может способствовать появлению большого числа транзиторных биологических эффектов и может позволить более жесткий контроль
уровня рекомбинантного полипептида ActRIIa в организме пациента. Для изменения периода полувыведения белка можно осуществлять мутации в белке слияния Fc в линкере (при его наличии) и/или в участке Fc.
Комбинаторную библиотеку можно получить посредством вырожденной библиотеки генов, кодирующих библиотеку полипептидов, каждый из которых включает по меньшей мере часть возможных
последовательностей полипептида ActRIIa. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов можно
лигировать ферментным путем в генные последовательности таким образом, что вырожденный набор
возможных нуклеотидных последовательностей полипептида ActRIIa является экспрессируемым в виде
отдельных полипептидов или, альтернативно, в виде набора белков слияния большего размера (например, для фагового дисплея).
Существует много путей создания библиотеки потенциальных гомологов из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной генной последовательности можно
осуществлять в автоматическом синтезаторе ДНК, а затем лигировать синтетические гены в подходящий
вектор для экспрессии. Синтез вырожденных олигонуклеотидов известен в данной области (см., например, публикации Narang, S.A. (1983) Tetrahedron, 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd
Cleveland Sympos. Macroraolecules, ed. A.G. Walton, Amsterdam: Elsevier, p. 273-289; Itakura et al., (1984)
Annu. Rev. Biochem., 53: 323; Itakura et al., (1984) Science, 198: 1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res., 11:
477). Такие технологии использовались в направленной эволюции других белков (см., например, публикации Scott et al., (1990) Science, 249: 386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA, 89: 2429-2433; Devlin et
al., (1990) Science, 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA, 87: 6378-6382; а также в патентах США
- 11 -
018450
№№ 5223409, 5198346 и 5096815).
Альтернативно, для создания комбинаторной библиотеки можно использовать другие формы мутагенеза. Например, можно получить и выделить варианты полипептида ActRIIa из библиотеки путем
скрининга с использованием, например, мутагенеза аланинового сканирования и тому подобное (Ruf et
al., (1994) Biochemistry, 33: 1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem., 269: 3095-3099; Balint et al.,
(1993) Gene, 137: 109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem., 218: 597-601; Nagashima et al., (1993) J.
Biol. Chem., 268: 2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry, 30: 10832-10838 and Cunningham et al.,
(1989) Science, 244: 1081-1085), мутагенеза с использованием сканирования линкером (Gustin et al.,
(1993) Virology, 193: 653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol., 12: 2644-2652; McKnight et al. (1982)
Science, 232: 316); путем насыщающего мутагенеза (Meyers et al., (1986) Science, 232: 613); путем ПЦРмутагенеза (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol., 1: 11-19) или путем случайного мутагенеза, включая химический мутагенез и тому подобное (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL
Press, Cold Spring Harbor, NY and Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol., 7: 32-34). Мутагенез с использованием сканирования линкером, особенно в комбинаторной установке, является привлекательным
способом идентификации усеченных (биоактивных) форм полипептидов ActRIIa.
В данной области известен широкий диапазон технологий для скрининга генных продуктов из комбинаторных библиотек, полученных точечными мутациями и усечениями, и, в сущности, для скрининга
библиотек кДНК для генных продуктов, имеющих определенное свойство. Такие технологии будут, в
общем, адаптированы для быстрого скрининга генных библиотек, созданных комбинаторным мутагенезом полипептидов ActRIIa. Наиболее широко используемые технологии скрининга больших генных библиотек обычно включают клонирование генной библиотеки в реплицируемые векторы экспрессии,
трансформацию подходящих клеток получаемой библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных
генов в условиях, при которых обнаружение желаемой активности облегчает относительно простое выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был обнаружен. Предпочтительные анализы включают анализы связывания активина и анализы передачи активин-опосредуемого клеточного сигнала.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIa настоящего изобретения могут дополнительно содержать посттрансляционные модификации в дополнение к какой-либо модификации, которые естественным образом присутствуют в полипептидах ActRIIa. Такие модификации включают, но не
ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. В результате модифицированные полипептиды ActRIIa могут содержать неаминокислотные элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахариды и фосфаты.
Действие таких неаминокислотных элементов на функциональные возможности полипептида ActRIIa
можно тестировать, как описано в настоящем изобретении, на других вариантах полипептида ActRIIa.
Если полипептид ActRIIa продуцируется в клетках за счет расщепления растущей формы полипептида
ActRIIa, посттрансляционная обработка также может быть важной для правильной укладки и/или функционирования белка. Разные клетки (такие как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 или НЕК293)
имеют конкретные клеточные структуры и характерные механизмы для таких посттрансляционных действий, и их можно выбирать для гарантии правильной модификации и обработки полипептидов ActRIIa.
В некоторых аспектах функциональные варианты или модифицированные формы полипептидов
ActRIIa включают слитые белки, имеющие, по меньшей мере, участки полипептидов ActRIIa и один или
несколько доменов слияния. Общеизвестные примеры таких доменов слияния включают, но не ограничиваются ими, полигистидин, Glu-Glu, глутатион-S-трансферазу (GST), тиоредоксин, белок А, белок G,
константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Fc), мальтоза-связывающий белок (МВР) или человеческий сывороточный альбумин. Домен слияния может быть выбран таким образом, чтобы возникало желаемое свойство. Например, некоторые домены слияния особенно полезны для выделения слитых
белков методом аффинной хроматографии. С целью аффинной очистки для аффинной хроматографии
используют подходящие матрицы, такие как глутатион-, амилаза- и никель- или кобальтконъюгированные смолы. Многие из таких матриц доступны в форме "комплекта", такого как система
очистки Pharmacia GST и система QIAexpress (Qiagen), полезные при использовании с парами слияния
(HIS6). В качестве другого примера домен слияния может быть выбран таким образом, чтобы облегчить
обнаружение полипептидов ActRIIa. Примеры таких доменов обнаружения включают различные флуоресцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок GFP), а также "метки эпитопа", которые
обычно представляют собой короткие пептидные последовательности, для которых существует специфичное антитело. Общеизвестные метки эпитопа, для которых легкодоступны специфичные моноклональные антитела, включают FLAG, гемагглютинин вируса гриппа (НА) и метки c-myc. В некоторых
случаях домены слияния имеют сайт расщепления протеазы, такой как для фактора Ха или тромбина,
которые позволяют соответствующей протеазе частично расщеплять слитые белки и, таким образом, высвобождать из них рекомбинантные белки. Затем высвобожденные белки могут быть выделены из домена слияния последующим хроматографическим разделением. В некоторых предпочтительных вариантах
осуществления полипептид ActRIIa сливают с доменом, который стабилизирует полипептид ActRIIa in
vivo (домен-"стабилизатор"). Под "стабилизацией" понимают все, что увеличивает период полувыведения из сыворотки, независимо от того, происходит ли это в силу уменьшения разрушения, уменьшенного
- 12 -
018450
почечного клиренса или в силу другого фармакокинетического эффекта. Известно, что слияния с участком Fc иммуноглобулина придают желаемые фармакокинетические свойства широкому диапазону белков. Аналогично, желаемые свойства могут придавать слияния с человеческим сывороточным альбумином. Другие типы доменов слияния, которые могут быть выбраны, включают домены мультимеризации
(например, димеризации, тетрамеризации) и функциональные домены (которые придают дополнительную биологическую функцию, такую как дополнительная стимуляция роста кости или роста мышцы,
если это желательно).
В качестве конкретного примера настоящее изобретение обеспечивает слитый белок, содержащий
растворимый внеклеточный домен ActRIIa, слитый с доменом Fc (например, SEQ ID NO: 6).
Необязательно, домен Fc имеет одну или несколько мутаций в таких остатках, как Asp-265, лизин
322 и Asn-434. В некоторых случаях мутантный домен Fc, имеющий одну или несколько таких мутаций
(например, мутацию Asp-265), обладает пониженной способностью связываться с Fcγ-рецептором по
сравнению с Fc-доменом дикого типа. В других случаях мутантный домен Fc, имеющий одну или несколько указанных мутаций (например, мутацию Asn-434), обладает повышенной способностью связываться с Fc-рецептором комплекса гистосовместимости (МНС) класса I (FcRN) по сравнению с Fcдоменом дикого типа.
Подразумевается, что разные элементы слитых белков могут быть организованы любым образом,
который согласуется с желаемыми функциональными возможностями. Например, полипептид ActRIIa
может быть расположен С-терминально по отношению к гетерологичному домену или, альтернативно,
гетерологичный домен может быть расположен С-терминально по отношению к полипептиду ActRIIa.
Домен полипептида ActRIIa и гетерологичный домен не должны быть смежными в слитом белке, и дополнительные домены или аминокислотные последовательности могут быть вставлены на С-конце или
на N-конце по отношению к любому домену или между доменами.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIa настоящего изобретения содержат одну или несколько модификаций, которые способны к стабилизации полипептидов ActRIIa. Например,
такие модификации in vitro увеличивают период полувыведения полипептидов ActRIIa, увеличивают
период полувыведения из циркулирующей крови полипептидов ActRIIa или уменьшают протеолитическое разрушение полипептидов ActRIIa. Такие стабилизирущие модификации включают, но не ограничиваются ими, слитые белки (включая, например, слитые белки, содержащие полипептид ActRIIa и стабилизирующий домен), модификации участка гликозилирования (включая, например, добавление участка гликозилирования к полипептиду ActRIIa) и модификации углеводных функциональных групп (включая, например, удаление углеводных групп из полипептида ActRIIa). В случае слитых белков полипептид
ActRIIa слит со стабилизирующим доменом, например, как молекула IgG (например, домен Fc). Используемый в настоящем описании термин "стабилизирующий домен" относится не только к домену слияния
(например, Fc) как в случае слитых белков, но также включает небелковоподобные модификации, такие
как углеводные группы, или небелковоподобные полимеры, такие как полиэтиленгликоль.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение дает возможность получения выделенных и/или очищенных форм полипептидов ActRIIa, которые являются выделенными, или иным образом, по существу, не содержат других белков. Полипептиды ActRIIa обычно получают путем экспрессии
из рекомбинантных нуклеиновых кислот.
3. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ActRIIa.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает выделенные и/или рекомбинантные
нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из полипептидов ActRIIa (например, растворимые полипептиды ActRIIa), включая фрагменты, функциональные варианты и слитые белки, раскрытые в настоящем
изобретении. Например, SEQ ID NO: 4 кодирует природный предшественник человеческого полипептида
ActRIIa, тогда как SEQ ID NO: 5 кодирует процессированный внеклеточный домен ActRIIa. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или иметь двойную цепь. Такие нуклеиновые кислоты могут быть молекулами ДНК или РНК. Эти нуклеиновые кислоты можно использовать,
например, в способах получения полипептидов ActRIIa или в качестве прямых терапевтических средств
(например, в методиках генной терапии).
В некоторых аспектах дополнительно предполагается, что рассматриваемые нуклеиновые кислоты,
кодирующие полипептиды ActRIIa, включают нуклеиновые кислоты, которые являются вариантами последовательностей SEQ ID NO: 4 или 5. Вариантные нуклеотидные последовательности включают последовательности, которые отличаются одной или несколькими нуклеотидными заменами, добавлениями
или делециями, такими как аллельные варианты.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенные или рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97,
- 13 -
018450
98, 99 или на 100% идентичны SEQ ID NO: 4 или 5. Рядовому специалисту в данной области будет понятно, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, комплементарные SEQ ID NO: 4 или 5, и
варианты SEQ ID NO: 4 или 5 также входят в объем настоящего изобретения. В дополнительных вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть выделенными, рекомбинантными и/или слитыми с гетерологичной нуклеотидной последовательностью, или в
библиотеке ДНК.
В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты настоящего изобретения также включают
нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются при очень строгих условиях с нуклеотидной
последовательностью, обозначенной SEQ ID NO: 4 или 5, комплементарной последовательностью SEQ
ID NO: 4 или 5 или с их фрагментами. Как рассмотрено выше, рядовому специалисту в данной области
будет очевидно, что подходящие условия строгости, которые вызывают гибридизацию ДНК, могут быть
различными. Рядовому специалисту в данной области будет очевидно, что могут быть различными подходящие условия строгости, которые вызывают гибридизацию ДНК. Например, можно осуществлять
гибридизацию в растворе 6,0× хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при температуре около 45°С с последующим промыванием раствором 2,0×SSC при 50°С. Например, можно выбрать концентрацию солей на
стадии промывки из условий низкой строгости около 2,0×SSC при 50°С до концентрации в условиях высокой строгости примерно 0,2×SSC при 50°С. Дополнительно, на стадии промывки можно повышать
температуру от условий низкой строгости при комнатной температуре примерно 22°С до условий высокой строгости при температуре примерно 65°С. И температура, и концентрация солей могут варьировать,
или как температуру, так и концентрацию солей можно поддерживать постоянными, в то время как другой показатель варьирует. В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях низкой строгости 6×SSC при комнатной температуре с последующим промыванием в 2×SSC при комнатной температуре.
Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, обозначенных как
SEQ ID NO: 4 или 5, по причине дегенерации генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Например, многие аминокислоты обозначены более чем одним триплетом. Кодоны, которые
определяют одну и ту же аминокислоту, или синонимы (например, CAU и САС являются синонимами
для гистидина) могут приводить к "молчащим" мутациям, которые не повреждают аминокислотную последовательность белка. Однако предполагается, что в клетках млекопитающих будут существовать полиморфизмы последовательностей ДНК, которые действительно приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях рассматриваемых белков. Специалист в данной области будет понимать, что у
представителей одного вида могут существовать указанные вариации в одном или нескольких нуклеотидах (примерно до 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, в силу природного аллельного разнообразия. Любые и все такие нуклеотидные вариации и полученные полиморфизмы аминокислот входят в объем настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть функционально связаны с одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями в конструкции экспрессии. Регуляторные нуклеотидные последовательности обычно будут подходить для клетки-хозяина, используемой для экспрессии. Многочисленные типы подходящих векторов экспрессии и подходящих регуляторных последовательностей известны в данной области
для ряда клеток-хозяев. Обычно одна или несколько указанных регуляторных нуклеотидных последовательностей могут включать, без ограничения, промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала и завершения транскрипции, последовательности начала и завершения трансляции и активирующие или усиливающие (энхансерные) последовательности. В настоящем изобретении рассмотрены конститутивные или индуцибельные промоторы, известные в данной области. Промоторы могут представлять собой либо природные
промоторы, либо гибридные промоторы, в которых сочетаются элементы более чем одного промотора.
Конструкция экспрессии может присутствовать в клетке на эписоме, такой как плазмида, или конструкция экспрессии может быть вставлена в хромосому. В предпочтительном варианте осуществления вектор
экспрессии содержит селектируемый маркерный ген, позволяющий выбирать трансформированные
клетки-хозяева. Селектируемые маркерные гены известны в данной области и будут варьировать в зависимости от используемой клетки-хозяина.
В некоторых аспектах настоящего изобретения рассматриваемая нуклеиновая кислота представлена
в векторе экспрессии, содержащем нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ActRIIa
и функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Регуляторные последовательности известны в данной области и выбираются для направленной экспрессии полипептида ActRIIa. Соответственно термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии. Примеры регуляторных последовательностей описаны
в публикации Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego,
CA (1990). Например, в таких векторах можно использовать любую из широкого разнообразия последовательностей контроля экспрессии, которые регулируют экспрессию последовательности ДНК при
- 14 -
018450
функциональном связывании с ней, для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид
ActRIIa. Такие полезные последовательности контроля экспрессии включают, например, ранние и поздние промоторы SV40, tet-промотор, аденовирусный или цитомегаловирусный предранний промотор,
промоторы RSV, lac систему, trp систему, систему ТАС или TRC, промотор Т7, экспрессия которого направляется Т7 РНК полимеразой, главные операторные и промоторные области лямбда фага, контрольные области для fd-покрытого белка, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических
ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например Pho5, промоторы α-фактора скрещивания дрожжей,
многогранный промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, известные регуляцией
экспрессии генов прокариотических или эукариотических клеток, или их вирусов, и их различные комбинации. Предполагается, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как
выбор клетки-хозяина, которая будет трансформирована, и/или типа белка, желаемого для экспрессии.
Кроме того, также необходимо учитывать число векторных копий, способность регулировать это число
копий и экспрессию любого другого белка, кодируемого вектором, таким как антибиотические маркеры.
Рекомбинантная нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть получена путем лигирования клонированного гена или его участка в вектор, подходящий для экспрессии как в прокариотические клетки, эукариотические клетки (клетки дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих), так и в
оба типа клеток. Носители экспрессии для получения рекомбинантного полипептида ActRIIa включают
плазмиды и другие векторы. Например, для экспрессии в прокариотических клетках, таких как E.coli,
подходящие векторы включают плазмиды следующих типов: pBR322-производные плазмиды, pEMBLпроизводные плазмиды, рЕХ-производные плазмиды, рВТас-производные плазмиды и pUC-производные
плазмиды.
Некоторые векторы экспрессии млекопитающих содержат как прокариотические последовательности для облегчения размножения вектора в бактериях, так и одну или несколько эукариотических единиц
транскрипции, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Векторы, происходящие из
pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pkoneo и pHyg, являются примерами векторов экспрессии млекопитающих, подходящих для трансфекции в
эукариотическую клетку. Некоторые из этих векторов модифицированы последовательностями из бактериальных плазмид, таких как pBR322, для облегчения репликации и отбора на лекарственную устойчивость как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. Альтернативно, для транзиторной экспрессии белков в эукариотических клетках могут быть использованы производные вирусов, такие как
вирус папилломы быка (BPV-I) или вирус Эпштейна-Барра (рНЕВо, полученный из pREP и р205). Примеры других систем экспрессии вирусов (включая ретровирусы) можно найти ниже в описании систем
доставки при генной терапии. Различные способы, используемые в получении плазмид и в трансформации организмов-хозяев, известны в данной области. Примеры других подходящих систем экспрессии как
для прокариотических, так и для эукариотических клеток, а также примеры обычных рекомбинантных
методик см. в руководствах Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and
Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). В некоторых случаях может быть желательно экспрессировать рекомбинантные полипептиды, используя бакуловирусную систему экспрессии. Примеры
таких бакуловирусных систем экспрессии включают векторы, происходящие из pVL (такие как pVL1392,
pVL1393 и pVL941), векторы, происходящие из pAcUW (такие как pAcUW1), и векторы, происходящие
из pBlueBac (такие как β-gal, содержащий pBlueBac III).
В предпочтительном варианте осуществления вектор будет сконструирован для получения рассматриваемых полипептидов ActRIIa в клетках СНО, например вектор Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla,
Calif.), векторы pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) и векторы pCI-neo (Promega, Madison, Wise). Очевидно, что для очистки можно использовать рассматриваемые генные конструкции, чтобы вызвать экспрессию рассматриваемых полипептидов ActRIIa в клетках, размножающихся в культуре, например, для
получения белков, включая слитые белки или вариантные белки.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансфицированной рекомбинантным
геном, включающим кодирующую последовательность (например, SEQ ID NO: 4 или 5) для одного или
нескольких рассматриваемых полипептидов ActRIIa. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, полипептид ActRIIa настоящего изобретения может быть
экспрессирован в бактериальных клетках, таких как E.coli, в клетках насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), дрожжей или в клетках млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области.
Соответственно настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения рассматриваемых полипептидов ActRIIa. Например, клетка-хозяин, трансфицированная вектором экспрессии,
кодирующим полипептид ActRIIa, может быть культивирована в подходящих условиях, позволяющих
происходить экспрессии полипептида ActRIIa. Полипептид ActRIIa можно секретировать и выделять из
смеси клеток и питательной среды, содержащей полипептид ActRIIa. Альтернативно, полипептид ActRIIa может сохраняться в цитоплазме или в мембранной фракции и собранных клетках, в виде лизированного и выделенного белка. Клеточная культура включает клетки-хозяева, питательные среды и другие
- 15 -
018450
побочные продукты. Подходящие питательные среды для клеточной культуры известны в данной области. Рассматриваемые полипептиды ActRIIa можно выделить из среды для клеточной культуры, из клеток-хозяев или из того и другого, используя известные в данной области способы очистки белков, включающие ионнообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафильтрацию,
электрофорез, иммуноаффинную очистку с антителами, специфичными для конкретных эпитопов полипептидов ActRIIa, и аффинную очистку агентом, который связывается с доменом, слитым с полипептидом ActRIIa (например, можно использовать колонку белка А для очистки слитого ActRIIa-Fc). В предпочтительном варианте осуществления полипептид ActRIIa представляет собой слитый белок, содержащий домен, который облегчает его очистку. В предпочтительном варианте осуществления очистку осуществляют последовательными стадиями колоночной хроматографии, включающими, например, три или
больше из следующих стадий в любом порядке: хроматография с белком А, хроматография с использованием Q-сефарозы, хроматография с использованием фенилсефарозы, эксклюзионная хроматография и
катионообменная хроматография. Очистку можно завершать вирусной фильтрацией и буферным обменом. Как показано в настоящем описании, белок ActRIIa-hFc очищали до чистоты >98%, как определено
эксклюзионной хроматографией, и до чистоты >95%, как определено методом SDS PAGE. Этот уровень
чистоты был достаточным для достижения желаемых эффектов на кость у мышей и для приемлемого
профиля безопасности у мышей, крыс и приматов, отличных от человека.
В другом варианте осуществления гибридный ген, кодирующий очищающую лидерную последовательность, такую как последовательность сайта расщепления поли-(His)/энтерокиназы на N-конце желаемого участка рекомбинантного полипептида ActRIIa, дает возможность очистки экспрессируемого
слитого белка методом аффинной хроматографии, используя Ni2+-содержащую смолу. Затем очищающую лидерную последовательность можно последовательно удалять путем обработки энтерокиназой с
получением очищенного полипептида ActRIIa (см., например, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography,
411: 177 and Janknecht et al., PNAS USA, 88: 8972).
Технологии получения гибридных генов общеизвестны. По существу, присоединение разных фрагментов ДНК, кодирующих разные полипептидные последовательности, осуществляют согласно общепринятым технологиям, используя тупоконечные или выступающие концы для лигирования, расщепление ферментами рестрикции для обеспечения подходящих концов, заполнение липких концов в случае
необходимости, обработку щелочной фосфатазой для исключения нежелательного присоединения и
ферментное лигирование. В другом варианте осуществления может быть синтезирован гибридный ген по
общепринятой технологии, включающей автоматические ДНК-синтезаторы. Альтернативно, можно
осуществлять ПЦР-амплификацию генных фрагментов, используя якорные праймеры, что приводит к
возникновению дополнительных липких концов между двумя последовательными генными фрагментами, которые затем можно отжигать для получения химерной генной последовательности (см., например,
Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).
4. Альтернативные антагонисты активина и ActRIIa.
Данные, представленные в настоящем изобретении, показывают, что антагонисты передачи сигналов активин-ActRIIa можно использовать для стимулирования роста кости и минерализации кости. Хотя
растворимые полипептиды ActRIIa и особенно ActRIIa-Fc являются предпочтительными антагонистами,
и хотя такие антагонисты могут воздействовать на кость посредством механизма, отличного от антагонизма к активину (например, ингибирование активина может быть индикатором тенденции агента ингибировать активность ряда молекул, включая, возможно, другие члены суперсемейства TGF-бета, и такое
сочетанное ингибирование может приводить к желаемому эффекту на кость), предполагается, что будут
полезны другие типы антагонистов активина-ActRIIa, включая антитела против активина (например, А,
В, С или Е), анти-ActRIIa-антитела, антисмысловые нуклеиновые кислоты, PHKi или рибозимы, которые
ингибируют продукцию ActRIIa, и другие ингибиторы активина или ActRIIa, особенно те из них, которые нарушают связывание активин-ActRIIa.
Антитело, которое специфично реагирует с полипептидом ActRIIa (например, с растворимым полипептидом ActRIIa) и которое или конкурентно к лиганду связывается с полипептидом ActRIIa, или иным
образом ингибирует ActRIIa-опосредованную передачу сигналов, может быть использовано в качестве
антагониста действия полипептида ActRIIa. Аналогично, в качестве антагониста можно использовать
антитело, которое специфично реагирует с полипептидом активином А и которое нарушает связывание
ActRIIa.
Путем использования иммуногенов, полученных из полипептида ActRIIa или полипептида активина, можно получать антибелковую/антипептидную антисыворотку или моноклональные антитела согласно стандартным протоколам, (см., например, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane
(Cold Spring Harbor Press, 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомяк или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой полипептида ActRIIa, антигенным фрагментом, который способен
вызывать реакцию антител, или слитым белком. Технологии придания иммуногенности белку или пептиду включают технологии конъюгации с носителями или другие технологии, известные в данной области. Иммуногенный участок ActRIIa или полипептида активина можно вводить в присутствии адъюванта.
Развитие иммунизации можно контролировать выявлением титров антител в плазме или сыворотке. Для
- 16 -
018450
оценки уровня антител можно использовать стандартный ELISA или другие иммуноанализы с иммуногеном в качестве антигена.
После иммунизации животного антигенным препаратом полипептида ActRIIa можно получать антисыворотку и, если это желательно, из сыворотки можно выделять поликлональные антитела. Для получения моноклональных антител от иммунизированного животного можно забирать антителопродуцирующие клетки (лимфоциты) и осуществлять слияние согласно стандартным методикам слияния
соматических клеток с иммортализованными клетками, такими как миеломные клетки, с получением
гибридомных клеток. Такие способы известны в данной области и включают, например, гибридомную
технологию (первоначально разработанную Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), технологию
человеческой В-клеточной гибридомы (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), и технологию
EBV-гибридомы для получения человеческих моноклональных антител (Cole et al., (1985) Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96). Можно проводить иммунохимический скрининг клеток гибридомы на продукцию антител, специфично реактивных к полипептиду ActRIIa и к моноклональным антителам, выделенным из культуры, содержащей такие клетки гибридомы.
Предполагается, что термин "антитело", используемый в настоящем описании, включает его фрагменты, которые также являются специфично реактивными к рассматриваемому полипептиду. Антитела
можно фрагментировать, используя общепринятые технологии, и производить скрининг фрагментов на
их применимость таким же образам, как описано выше для целых антител. Например, можно получать
фрагмент F(ab)2 обработкой антитела пепсином. Чтобы получить Fab фрагменты, полученный фрагмент
F(ab)2 можно обработать для уменьшения числа дисульфидных мостиков. Дополнительно предполагается, что антитело настоящего изобретения включает биспецифичные, одноцепочечные, химерные, гуманизированные и полностью человеческие молекулы, обладающие аффинностью к полипептиду ActRIIa
или активину, которым принадлежит по меньшей мере одна гипервариабельная CDR-область антитела.
Антитело может дополнительно содержать присоединенную к нему метку и быть способным к обнаружению (например, метка может представлять собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент
или кофактор фермента).
В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой рекомбинантное антитело,
причем этот термин охватывает любое антитело, частично полученное по технологиям молекулярной
биологии, и включает CDR-трансплантированные или химерные антитела, человеческие или другие антитела, собранные от выбранных библиотекой доменов антител, одноцепочечные антитела и антитела с
единственным доменом (например, человеческие VH белки или верблюжьи VHH белки). В некоторых вариантах осуществления антитело настоящего изобретения представляет собой моноклональное антитело,
и в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет доступ к способам получения новых антител. Например, способ получения моноклонального антитела, которое специфично связывается с полипептидом ActRIIa или полипептидом активином, может включать введение мыши такого
количества иммуногенной композиции, содержащей антигенный полипептид, которое эффективно для
того, чтобы индуцировать определяемый иммунный ответ, получение от мыши антителопродуцирующих
клеток (например, клеток селезенки) и слияние антителопродуцирующих клеток с миеломными клетками
с получением антителопродуцирующих гибридом, и тестирование антителопродуцирующих гибридом
для идентификации гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, которое специфично связывается с антигеном. После получения гибридомы ее можно размножать в клеточной культуре, необязательно в культуральных условиях, при которых клетки гибридомного происхождения продуцируют моноклональное антитело, которое специфично связывается с антигеном. Моноклональное антитело может
быть очищено от клеточной культуры.
Понятие "специфично реактивное к", используемое со ссылкой на антитело, означает, как обычно
считается в данной области, что антитело является достаточно селективным в отношении представляющего интерес антигена (например, полипептида ActRIIa) по сравнению с другими, не представляющими
интерес антигенами, что антитело полезно, как минимум, для обнаружения присутствия представляющего интерес антигена в конкретном типе биологического образца. В некоторых способах с использованием указанного антитела, таких как терапевтические области применения, может быть желаемой более
высокая степень специфичности в связывании. Моноклональные антитела, как правило, имеют более
сильную склонность (по сравнению с поликлональными антителами) эффективно выявлять различие
между желаемыми антигенами и перекрестно-реагирующими полипептидами. Одним из свойств, которые влияют на специфичность взаимодействия антитело-антиген, является аффинность антитела к антигену. Хотя желаемой специфичности можно достичь с диапазоном разной аффинности, как правило,
предпочтительные антитела будут иметь аффинность (константу диссоциации) примерно 10-6, 10-7, 10-8,
10-9 или меньше. Учитывая чрезвычайно плотное связывание между активином и ActRIIa, предполагается, что нейтрализующее антитело против активина или против ActRIIa обычно будет иметь константу
диссоциации 10-10 или меньше.
Кроме того, технологии, используемые при скрининге антител для идентификации желаемого антитела, могут влиять на свойства полученного антитела. Например, если антитело должно использоваться
для связывания антигена в растворе, то может быть желательным тестирование растворов связывания.
- 17 -
018450
Ряд различных технологий доступен для тестирования взаимодействия между антителами и антигенами с
целью идентификации особенно желаемых антител. Такие технологии включают ELISA, анализы связывания на основе поверхностного плазмонного резонанса (например, анализ связывания Biacore™, Biacore
AB, Uppsala, Sweden), сэндвич-анализы (например, система парамагнитных шариков IGEN International,
Inc, Gaithersburg, Maryland), вестерн-блоттинги, анализы иммунопреципитации и иммуногистохимические исследования.
Примеры категорий соединений нуклеиновых кислот, которыми являются активин или антагонисты
ActRIIa, включают антисмысловые нуклеиновые кислоты, PHKi конструкции и каталитические конструкции нуклеиновых кислот. Соединение нуклеиновой кислоты может иметь единственную цепь или
двойную цепь. Соединение с двойной цепью также может включать липкие или некомплементарные области, в которых одна или другая цепь является одноцепочечной. Соединение с единственной цепью может включать области самокомплементарности, означая, что соединение образует так называемую
структуру "шпильки" или "стебля-петли" с областью двойной спиральной структуры. Соединение нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную последовательность, которая комплементарна области, состоящей из не более 1000 нуклеотидов, не более 500, не более 250, не более 100 или не более 50, 35,
30, 25, 22, 20 или 18 нуклеотидов полноразмерной последовательности нуклеиновой кислоты ActRIIa или
последовательности нуклеиновой кислоты активина βA или активина βB. Область комплементарности
предпочтительно будет составлять по меньшей мере 8 нуклеотидов, необязательно по меньшей мере 10
или по меньшей мере 15 нуклеотидов и, необязательно, 15-25 нуклеотидов. Область комплементарности
может находиться в пределах интрона, кодирующей последовательности или некодирующей последовательности транскрипта-мишени, такого как участок кодирующей последовательности. Как правило, соединение нуклеиновой кислоты будет иметь длину от примерно 8 до примерно 500 нуклеотидов или пар
оснований, и, необязательно, его длина будет составлять от примерно 14 до примерно 50 нуклеотидов.
Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК (особенно для применения в качестве антисмысловой), РНК или гибрид РНК:ДНК. Любая из цепей может включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые невозможно легко классифицировать как ДНК или как РНК. Аналогично, соединение с двойной цепью может представлять собой ДНК:ДНК, ДНК:РНК или РНК:РНК, и любая из
цепей может также включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые невозможно легко классифицировать как ДНК или как РНК. Соединение нуклеиновой кислоты может включать
любое множество модификаций, включая одну или несколько модификаций в скелете (сахар-фосфатный
участок в природной нуклеиновой кислоте, включающий межнуклеотидные связи) или участок основания (участок пурина или пиримидина в природной нуклеиновой кислоте). Соединение антисмысловой
нуклеиновой кислоты будет предпочтительно иметь длину от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов,
и будет часто содержать одну или несколько модификаций для улучшения таких свойств, как устойчивость в сыворотке, в клетке или в месте вероятной доставки соединения, таком как желудок в случае перорально доставляемых соединений и легкие для ингаляционных соединений. В случае конструкции
PHKi, цепью, комплементарной к транскрипту-мишени, обычно будет РНК или ее модификации. Другой
цепью может быть РНК, ДНК или любые другие варианты. Сдвоенный участок двойной цепи или одноцепочечной "шпильки" конструкции PHKi предпочтительно будет иметь длину от 18 до 40 нуклеотидов
и, необязательно, примерно от 21 до 23 нуклеотидов в длину, при условии, что он является дайсер субстратом. Каталитические или ферментативные нуклеиновые кислоты могут быть рибозимами или ферментами ДНК и также могут содержать модифицированные формы. Соединения нуклеиновой кислоты
могут ингибировать экспрессию мишени примерно на 50, 75, 90% или больше в случае контакта с клетками при физиологических условиях и при концентрации, где несмысловой или смысловой контроль
имеет небольшой эффект или не имеет эффекта. Предпочтительные концентрации для тестирования действия соединений нуклеиновой кислоты составляет 1, 5 и 10 мкмоль. Также соединения нуклеиновой
кислоты можно тестировать на эффекты, например на рост и минерализацию кости.
5. Скрининговые анализы.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к применению полипептидов ActRIIa (например, растворимых полипептидов ActRIIa) и полипептидов активина для идентификации соединений
(веществ), которые являются агонистами или антагонистами сигнального пути активин-ActRIIa. Можно
тестировать соединения, идентифицированные посредством такого скрининга, на оценку их способности
модулировать рост или минерализацию кости in vitro. Необязательно, эти соединения можно дополнительно тестировать на моделях животных для оценки их способности модулировать рост тканей in vivo.
Существуют многочисленные подходы к скринингу терапевтических средств для модуляции тканевого роста путем направленного транспорта активина и полипептидов ActRIIa. В некоторых вариантах
осуществления может быть проведен высокопроизводительный скрининг соединений для идентификации веществ, которые нарушают действия на кость, опосредуемые активином или ActRIIa. В некоторых
вариантах осуществления выполняют анализ для скрининга и идентификации соединений, которые специфично ингибируют или уменьшают связывание полипептида ActRIIa с активином. Альтернативно,
можно применять анализ для идентификации соединений, которые увеличивают связывание полипептида ActRIIa с активином. В дополнительном варианте осуществления могут быть идентифицированы со- 18 -
018450
единения по их способности взаимодействовать с активином или полипептидом ActRIIa.
В свете настоящего изобретения несколько видов анализа будет достаточным, и даже не описанные
явно в настоящем изобретении анализы будут, вместе с тем, очевидны для рядового специалиста в данной области. Как описано в настоящем изобретении, тестовые соединения (агенты) настоящего изобретения могут быть получены любым комбинаторным химическим способом. Альтернативно, рассматриваемые соединения могут быть природными биомолекулами, синтезируемыми in vivo или in vitro. Соединения (агенты), которые будут тестироваться на их способность действовать в качестве модуляторов
роста тканей, могут продуцироваться, например, бактериями, дрожжами, растениями или другими организмами (например, природными продуктами), могут быть получены химически (например, малые молекулы, включающие пептидомиметики) или получены с помощью рекомбинантной технологии. Тестовые соединения, рассматриваемые согласно настоящему изобретению, включают непептидильные органические молекулы, пептиды, полипептиды, пептидомиметики, сахара, гормоны и молекулы нуклеиновых кислот. В конкретном варианте осуществления тестовым агентом является малая органическая молекула, молекулярная масса которой меньше чем примерно 2000 Да.
Тестовые соединения настоящего изобретения могут быть предусмотрены в виде единственной,
дискретной единицы или предусмотрены в семействах большего уровня сложности, например, получаемых комбинаторной химией. Эти семейства могут содержать, например, спирты, алкилгалогениды, амины, амиды, сложные эфиры, альдегиды, простые эфиры и другие классы органических соединений.
Представление тестовых соединений в тестовую систему может быть или в выделенной форме, или в
виде смеси соединений, особенно на начальных стадиях скрининга. Необязательно, соединения могут
быть необязательно дериватизированы другими соединениями и иметь дериватизационные группы, которые облегчают выделение соединений. Неограничивающие примеры дериватизационных групп включают биотин, флуоресцеин, дигоксигенин, зеленый флуоресцентный белок, изотопы, полигистидин, магнитные ширики, глутатион-S-трансферазу (GST), фотоактивируемые сшиватели или их любые комбинации.
Во многих программах скрининга лекарственных средств, которые тестируют семейства соединений и природные экстракты, желаемыми являются высокопроизводительные анализы, чтобы максимизировать количество соединений, обследованных за данный промежуток времени. Анализы, которые проводят в бесклеточных системах, такие как анализы, которые могут быть проведены с очищенными или
полуочищенными белками, часто являются предпочтительными в качестве "первичного" скрининга, который можно осуществлять для возможности быстрого исследования и относительно легкого обнаружения изменения в молекулярной мишени, которое опосредовано тестовым соединением. Кроме того, эффекты клеточной токсичности или биодоступность тестового соединения можно, как правило, игнорировать в системе in vitro, вместо этого направив анализ, в первую очередь, на действие лекарственного
средства на молекулярную мишень, что может проявляться в изменении связывающей аффинности между полипептидом ActRIIa и активином.
Просто в качестве примера, в скрининговом анализе настоящего изобретения рассматриваемое соединение контактирует с выделенным и очищенным полипептидом ActRIIa, который обычно способен к
связыванию с активином. Затем к смеси соединения и полипептида ActRIIa добавляют композицию, содержащую лиганд ActRIIa. Обнаружение и количественное определение комплексов ActRIIa/активин
обеспечивают средство для определения эффективности соединения в ингибировании (или потенцировании) образования комплекса между полипептидом ActRIIa и активином. Эффективность соединения может быть оценена путем выведения кривых доза-ответ, используя данные, полученные при разных концентрациях тестового соединения. Кроме того, также можно проводить контрольный анализ, чтобы
обеспечить исходный уровень для сравнения. Например, в контрольном анализе выделенный и очищенный активин добавляют к композиции, содержащей полипептид ActRIIa, и количественно определяют
образование комплекса ActRIIa/активин в отсутствие тестового соединения. Подразумевается, что порядок смешивания реагентов, как правило, может варьировать, и они могут быть смешаны одновременно.
Кроме того, вместо очищенных белков можно использовать клеточные экстракты и лизаты, чтобы предоставить для анализа подходящую бесклеточную систему.
Образование комплекса между полипептидом ActRIIa и активином можно обнаружить рядом способов. Например, можно количественно определять модуляцию образования комплексов, используя, например, определяемые меченые белки, такие как радиоизотопные метки (например, 32Р, 35S, 14C или 3Н),
флуоресцентные метки (например, FITC), или ферментно-меченный полипептид ActRIIa или активин,
путем иммунологического анализа или хроматографическим обнаружением.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение рассматривает применение анализов
поляризации флуоресценции и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) для измерения как
прямой, так и опосредованной, степени взаимодействия между полипептидом ActRIIa и связывающим
его белком. Кроме того, со многими вариантами осуществления настоящего изобретения совместимы
другие методики обнаружения, такие как методики на основе оптических волноводов (опубликованная
заявка РСТ WO 96/26432 и патент США № 5677196), на основе поверхностного плазмонного резонанса
(SPR), детекторы поверхностного заряда и детекторы поверхностной силы.
- 19 -
018450
Кроме того, настоящее изобретение рассматривает применение анализа взаимодействия с ловушкой, также называемого "анализом двойных гибридов", для идентификации агентов, которые нарушают
или потенцируют взаимодействие между полипептидом ActRIIa и связывающим его белком; см., например, патент США № 5283317; Zervos et al. (1993) Cell, 72: 223-232; Madura et al. (1993) J Biol. Chem, 268:
12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques, 14: 920-924 и Iwabuchi et al. (1993) Oncogene, 8: 16931696). В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение рассматривает применение обратных систем двойных гибридов для идентификации соединений (например, малых молекул или пептидов), которые разъединяют взаимодействия между полипептидом ActRIIa и связывающим его белком;
см., например, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res, 27: 919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends
Biotechnol, 17: 374-81 и патенты США №№ 5525490; 5955280 и 5965368.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемые соединения идентифицируют по их способности взаимодействовать с полипептидом ActRIIa или активином настоящего изобретения. Взаимодействие между соединением и полипептидом ActRIIa или активином может быть ковалентным или нековалентным. Например, такое взаимодействие можно идентифицировать по содержанию белка, используя биохимические способы in vitro, включающие фотосшивание, лигандное связывание с радиоактивным мечением и аффинную хроматографию (Jakoby W.B. et al., 1974, Methods in Enzymology, 46: 1). В
некоторых случаях можно проводить скрининг соединения на основе анализа механизма, такого как анализ обнаружения соединений, которые связываются с активином или полипептидом ActRIIa. Такой анализ может включать случай твердофазного или жидкофазного связывания. Альтернативно, ген, кодирующий активин или полипептид ActRIIa, может быть трансфицирован репортерной системой (например, β-галактозидазой, люциферазой или зеленым флуоресцентным белком) в клетку и подвергнут скринингу по сравнению с библиотекой, предпочтительно высокопроизводительному скринингу, или скринингу с отдельными членами библиотеки. Можно использовать анализы на основе другого механизма
связывания, например анализы связывания, обнаруживающие изменения свободной энергии. Можно
проводить анализы связывания с мишенью, фиксированной в лунке, на шарике или чипе, или захваченной иммобилизованным антителом, или с разделением капиллярным электрофорезом. Связанные соединения обычно могут быть выявлены с использованием колориметрии или флуоресценции или поверхностного плазмонного резонанса.
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы и средства модуляции (стимуляции или ингибирования) остеогенеза и увеличения костной массы. Поэтому любое идентифицированное соединение можно тестировать на целых клетках или тканях, in vitro или in vivo, для подтверждения
их способности модулировать рост или минерализацию кости. С этой целью можно применять различные способы, известные в данной области.
Например, можно определять действие полипептидов ActRIIa или активина, или тестовых соединений на рост кости или хряща путем измерения индукции Msx2 или дифференцировки клетокпредшественников остеобластов в остеобласты в анализах на клеточной основе (см., например, Daluiski
et al., Nat Genet., 2001, 27(1): 84-8; Hino et al., Front Biosci., 2004, 9: 1520-9). Другой пример анализов на
клеточной основе включает анализ остеогенной активности рассматриваемых полипептидов ActRIIa или
активина и тестовых соединений в мезенхимальных клетках-предшественниках и остеобластах. В качестве иллюстрации можно конструировать рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие полипептид
ActRIIa или активин, для инфицирования полипотентных мезенхимальных клеток-предшественников
С3Н10Т1/2, преостеобластических клеток С2С12 и остеобластических клеток ТЕ-85. Затем определяют
остеогенную активность, измеряя индукцию щелочной фосфатазы, остеокальцина и матричную минерализацию (см., например, Cheng et al., J bone Joint Surg Am., 2003, 85-A(8): 1544-52).
В настоящем изобретении также рассмотрены исследования in vivo по измерению роста хряща или
кости. Например, в публикации Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001)) описана модель остеопороза крысы, на которой изучали репарацию кости в раннем периоде после перелома. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202 (1999) также описывают модель остеопороза крысы, на которой изучали репарацию кости в позднем периоде после перелома. Andersson et al., J. Endocrinol. 170: 529537 описывают модель остеопороза мыши, в которой мыши овариэктомированы, что вызывает у мышей
значительную потерю содержания минералов в костях и снижение минеральной плотности костей, при
потере около 50% минеральной плотности в трабекулярной кости. Можно увеличивать плотность костей
у овариэктомированных мышей путем введения таких факторов, как паратиреоидный гормон. В некоторых аспектах в настоящем изобретении используются известные в данной области исследования излечения переломов. Эти исследования включают технологию переломов, гистологический анализ и биомеханический анализ, которые описаны, например, в патенте США № 6521750, полностью включенном путем ссылки в отношении раскрытия в нем протоколов экспериментов по выполнению переломов, а также
по измерению распространения переломов и процесса репарации.
6. Примеры терапевтического применения.
В некоторых вариантах осуществления антагонисты активина-ActRIIa (например, полипептиды ActRIIa) настоящего изобретения можно использовать для лечения или предотвращения заболевания или
состояния, которое ассоциировано с повреждением кости, возникающего, например, по причине перело- 20 -
018450
ма, потери или деминерализации. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения повреждения кости у нуждающегося в этом индивидуума
посредством введения индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста активинаActRIIa, в частности полипептида ActRIIa. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы стимулирования роста или минерализации кости у нуждающегося в этом индивидуума путем введения индивидууму терапевтически эффективного количества антагониста активина-ActRIIa, в частности полипептида ActRIIa. Эти способы предпочтительно направлены на терапевтическое и профилактическое лечение животных, а более предпочтительно людей. В некоторых вариантах
осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение антагонистов активина-ActRIIa (особенно растворимых полипептидов ActRIIa и нейтрализирующих антител, направленных против активина
или ActRIIa) для лечения нарушений, ассоциированных с низкой плотностью кости или уменьшенной
прочностью кости.
Используемое в настоящем изобретении терапевтическое средство, которое "предотвращает" нарушение или состояние, относится к соединению, которое в статистической выборке уменьшает частоту
возникновения нарушения или состояния у подвергнутого лечению субъекта по сравнению с не подвергнутым лечению контрольным субъектом или задерживает появление или уменьшает тяжесть одного или
нескольких симптомов нарушения или состояния по сравнению с не подвергнутым лечению контрольным субъектом. Термин "лечение", используемый в настоящем описании, включает профилактику указанного состояния либо улучшение или устранение состояния после его диагностирования. В обоих случаях профилактика или лечение может определяться диагнозом, предоставляемым врачом, и предполагаемым результатом введения терапевтического средства.
Настоящее изобретение обеспечивает способы индуцирования образования кости и/или хряща,
предотвращения потери костной массы, увеличения минерализации кости или предотвращения деминерализации кости. Например, рассматриваемые антагонисты активина-ActRIIa применяют для лечения
остеопороза и излечения переломов кости и дефектов хряща у людей и других животных. Полипептиды
ActRIIa или активин могут быть полезными для пациентов, у которых диагностировано субклиническое
снижение плотности кости в качестве средства, защищающего от развития остеопороза.
В одном конкретном варианте осуществления можно найти медицинскую применимость способов и
композиций настоящего изобретения для заживления переломов кости и дефектов хряща у людей и других животных. Рассматриваемые способы и композиции также могут иметь профилактическое применение для уменьшения как закрытых, так и открытых переломов, а также для улучшения фиксации искусственных суставов. Образование кости de novo, вызванное остеогенным средством, способствует репарации при черепно-лицевых дефектах врожденного, травматического происхождения или вызванных онкологической резекцией, а также является полезным в косметической пластической хирургии. В некоторых
случаях рассматриваемые антагонисты активина-ActRIIa могут обеспечить среду для притягивания клеток, образующих кость, стимулировать рост образующих кость клеток или индуцировать дифференцировку клеток-предшественников образующих кость клеток. Антагонисты активина-ActRIIa настоящего
изобретения также могут быть полезны для лечения остеопороза.
Способы и композиции настоящего изобретения можно применять в условиях, характеризуемых
или вызванных потерей костной массы, таких как остеопороз (включая вторичный остеопороз), гиперпаратиреоз, болезнь Кушинга, болезнь Педжета, тиреотоксикоз, состояние хронической диареи или малабсорбции, почечный канальцевый ацидоз или нервная анорексия.
Остеопороз может быть вызван различными факторами или ассоциирован с различными факторами. Факторами риска для остеопороза (потеря минеральной плотности костей, приводящая к риску переломов) является женский пол, особенно, если женщина находится в постклимактерическом периоде, имеет малую массу тела и ведет сидячий образ жизни, и все из перечисленного являются факторами риска.
Люди, имеющие любой из следующих статусов, могут быть кандидатами для лечения антагонистом ActRIIa: женщина в постклимактерическом периоде, не принимающая эстроген или другую гормонозаместительную терапию; человек, имеющий в личном или семейном анамнезе перелом бедра или курящий;
женщина в постклимактерическом периоде с высоким ростом (выше 5 футов 7 дюймов (170,28 см)) или
малым весом (меньше 125 фунтов (56,750 кг)); мужчина с клиническими состояниями, ассоциированными с потерей костной массы; человек, принимающий лекарственные средства, известные как вызывающие потерю костной массы, включая кортикостероиды, такие как Преднизон, различные противосудорожные лекарственные средства, такие как Дилантин и некоторые барбитураты, или высокие дозы лекарственных средств для заместительной терапии тиреоидными гормонами; человек, страдающий диабетом 1 типа, болезнями печени, болезнями почек или имеющий в семейном анамнезе остеопороз; человек,
имеющий высокое ремоделирование кости (например, избыток коллагена в анализах мочи); человек с
нарушением щитовидной железы, таким как гипертиреоз; человек, перенесший перелом после незначительной травмы; человек, имеющий рентгеновские признаки перелома позвоночника или другие симптомы остеопороза.
Как отмечено выше, к остеопорозу также может приводить состояние, ассоциированное с другим
- 21 -
018450
нарушением, или применение некоторых лекарственных препаратов. Остеопороз, вызванный лекарственными средствами или другим клиническим состоянием, известен как вторичный остеопороз. При заболевании, таком как болезнь Кушинга, избыточное количество продуцируемого в организме кортизола
приводит к остепорозу и переломам. Наиболее распространенными лекарственными препаратами, ассоциированными с вторичным остеопорозом, являются кортикостероиды, класс лекарственных средств,
которые действуют подобно кортизолу, гормону, который естественно вырабатывается надпочечниками.
Хотя для развития скелета необходимы адекватные уровни тиреоидных гормонов (которые вырабатываются щитовидной железой), избыток тиреоидного гормона может с течением времени уменьшать костную массу. Прием антацидов, содержащих алюминий, может приводить к потере костной массы, если их
применяют в больших дозах люди с нарушениями почек, особенно больные, проходящие диализ. Другие
лекарственные препараты, которые могут вызывать вторичный остеопороз, включают фенитоин (дилантин) и барбитураты, которые применяют для предотвращения судорожных приступов; лекарственное
средство для некоторых форм артрита, рака и иммунных нарушений метотрексат (ревматрекс, иммунекс,
фолекс PFS); циклоспорин (сандиммун, неорал), лекарственное средство, применяемое для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и иммуносупрессии у пациентов после трансплантации органов;
агонисты лютеинизирующего рилизинг-гормона (лупрон, золадекс), применяемый для лечения рака простаты и эндометриоза; гепарин (кальципарин, Liquaemin), лекарственный препарат, препятствующий
свертыванию крови; и холестирамин (квестран) и колестипол (колестид), применяемые для лечения высокого уровня холестерина. Потеря костной массы при противораковой терапии является общепризнанной и называется "потерей костной массы, вызванной противораковой терапией" (CTIBL). Костные метастазы могут создавать костные полости, которые можно корригировать лечением антагонистами активина-ActRIIa.
В предпочтительном варианте осуществления антагонисты активина-ActRIIa, особенно растворимые ActRIIa, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть использованы для раковых больных.
Больные с некоторыми опухолями (например, простаты, молочной железы, с множественной миеломой
или с любой опухолью, вызывающей гиперпаратиреоз), являются группой высокого риска по потере костной массы за счет опухолевой индукции потери костной массы, а также метастазов в костях и терапевтических средств. Таких больных можно лечить антагонистами активина-ActRIIa даже при отсутствии
симптомов потери костной массы или костных метастазов. Больные могут также подвергаться контролю
на симптомы потери костной массы или костных метастазов и могут получать лечение антагонистами
активина-ActRIIa при выявлении признаков, свидетельствующих о повышенном риске. Обычно для
оценки изменения плотности кости используют изображения DEXA, тогда как индикаторы ремоделирования кости можно использовать для оценки вероятности костных метастазов. Можно контролировать
сывороточные маркеры. Костеспецифичная щелочная фосфатаза (BSAP) является ферментом, присутствующим в остеобластах. У больных с костными метастазами и другими состояниями, которые приводят
к повышенному ремоделированию кости, выявляют увеличенный уровень BSAP в крови. Пептиды остеокальцин и проколлаген также ассоциированы с остеогенезом и костными метастазами. Увеличенные
уровни BSAP выявляют у больных с костными метастазами, вызванными раком простаты, и реже у
больных с костными метастазами по причине рака молочной железы. Уровни костного морфогенетического белка 7 (BMP-7) являются высокими при наличии костных метастазов, обусловленных раком простаты, в отличие от костных метастазов, вызванных раком мочевого пузыря, кожи, печени или рака легкого. Карбокситерминальный телопептид 1 типа (ICTP) является сшитым и обнаруживается в коллагене,
который образуется в процессе резорбции кости. Поскольку кость постоянно подвергается разрушению и
восстановлению, ICTP будет выявляться во всем организме. При этом на участке костного метастаза его
уровень будет значительно выше, чем в зоне нормальной кости. Высокие уровни ICTP обнаруживают в
костных метастазах при раке простаты, раке легкого и рака молочной железы. Другой сшитый коллаген,
N-терминальный телопептид 1 типа (NTx), наряду с ICTP вырабатывается в процессе ремоделирования
кости. Количество NTx увеличивается в костных метастазах, обусловленных рядом различных типов
рака, включая рак легкого, простаты и рак молочной железы. Также уровни NTx повышаются при прогрессировании костных метастазов. Следовательно, этот маркер можно использовать как для выявления
метастаза, так и для измерения распространенности заболевания. Другие маркеры резорбции включают
пиридинолин и дезоксипиридинолин. Любое повышение уровней маркеров резорбции или маркеров костных метастазов указывает на потребность больного в терапии антагонистами активина-ActRIIa.
Антагонисты активина-ActRIIa можно вводить совместно с другими фармацевтическими средствами. Можно осуществлять совместное введение путем введения единственной ссовместной рецептуры,
путем одновременного введения или введением в разное время. Антагонисты активина-ActRIIa могут
обладать особым преимуществом при введении с другими действующими на кость средствами. Пациент
может получать пользу от совместного приема антагониста активина-ActRIIa и кальциевых добавок, витамина D, применения подходящих физических упражнений и/или, в некоторых случаях, от другого лечения. Примеры других лекарственных средств включают бифосфонаты (алендронат, ибандронат и ризедронат), кальцитонин, эстрогены, паратгормон и ралоксифен. Бифосфонаты (алендронат, ибандронат и
ризедронат), кальцитонин, эстрогены и ралоксифен влияют на цикл ремоделирования кости и относятся
- 22 -
018450
к антирезорбтивным лекарственным средствам. Ремоделирование кости состоит из двух отличающихся
стадий: резорбции кости и образования кости. Антирезорбтивные лекарственные средства замедляют
или останавливают резорбтивную часть цикла ремоделирования кости, но не замедляют остеогенетическую часть цикла. В результате новый остеогенез происходит с большей скоростью, чем резорбция кости, и с течением времени плотность кости может увеличиваться. Терипаратид, как форма паратиреоидного гормона, увеличивает скорость остеогенеза в цикле ремоделирования кости. Алендронат рекомендован как для профилактики (5 мг в день или 35 мг один раз в неделю), так и для лечения (10 мг в день
или 70 мг один раз в неделю) постклимактерического остеопороза. Алендронат уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и уменьшает риск переломов позвоночника, запястья и бедра.
Алендронат также рекомендован для лечения глюкокортикоид-индуцированного остеопороза у мужчин
и женщин в результате продолжительного применения этих лекарственных средств (то есть преднизона
и кортизона) и для лечения остеопороза у мужчин. Алендронат плюс витамин D рекомендован для лечения постклимактерического остеопороза у женщин (70 мг один раз в неделю плюс витамин D) и для лечения с целью повышения костной массы у мужчин с остеопорозом. Ибандронат рекомендован для профилактики и лечения постклимактерического остеопороза. Ибандронат в виде пилюли (150 мг) для
приема один раз в месяц должен приниматься в один и тот же день каждый месяц. Ибандронат уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и снижает риск переломов позвоночника. Ризедронат рекомендован для профилактики и лечения постклимактерического остеопороза. Ежедневный прием ризедроната (доза 5 мг) или еженедельный прием (доза 35 мг или доза 35 мг с кальцием) замедляет
потерю костной массы, увеличивает плотность кости и уменьшает риск переломов позвоночника и других переломов. Ризедронат также рекомендован для применения у мужчин и женщин с целью предотвращения и/или лечения глюкокортикоид-индуцированного остеопороза, который возникает в результате
продолжительного применения этих лекарственных средств (то есть преднизона или кортизона). Кальцитонин представляет собой природный гормон, вовлеченный в процесс регуляции кальция и метаболизма
кости. У женщин через 5 лет после наступления менопаузы кальцитонин замедляет потерю костной массы, увеличивает плотность позвонков и может уменьшать боль, связанную с переломами костей. Кальцитонин уменьшает риск переломов позвоночника. Кальцитонин доступен в виде раствора для инъекций
(50-100 IU ежедневно) или назального спрея (200 IU ежедневно). Терапия эстрогенами (ЕТ,
ЭТ)/гормональная терапия (НТ, ГТ) рекомендованы для профилактики остеопороза. Показано, что ЭТ
уменьшает потерю костной массы, увеличивает плотность кости и позвоночника и бедра и снижает риск
переломов бедра и позвоночника у женщин в постклимактерическом периоде. ЭТ обычно применяется в
виде пилюли или пластыря, которые доставляют низкую дозу приблизительно 0,3 мг ежедневно или
стандартную дозу приблизительно 0,625 мг ежедневно, и является эффективной, даже если ее начинают
в возрасте старше 70 лет. При приеме только одного эстрогена он может увеличивать у женщин риск
развития рака серозного покрова матки (рак эндометрия). Для устранения этого риска для женщин,
имеющих интактную матку, специалисты здравоохранения назначают гормон прогестин в комбинации с
эстрогеном (гормональная заместительная терапия или ГТ). Показано, что применение ЭТ/ГТ уменьшает
симптомы менопаузы и имеет благоприятное действие на состояние костей. Побочные эффекты могут
включать влагалищное кровотечение, болезненность молочных желез, нарушения настроения и желчнокаменную болезнь. Ралоксифен в дозе 60 мг в день рекомендован для профилактики и лечения постклимактерического остеопороза. Он является представителем класса препаратов под названием селективные
модуляторы эстрогенных рецепторов (SERM), разработанных для обеспечения благоприятных эффектов
эстрогенов без их потенциальных недостатков. Ралоксифен увеличивает костную массу и снижает риск
переломов позвоночника. В настоящее время недостаточно данных для утверждения, что ралоксифен
способен снижать риск переломов бедра и других переломов, кроме переломов позвоночника. Терипаратид, представляющий собой форму паратгормона, рекомендован для лечения остеопороза у женщин в
постклимактерическом периоде и у мужчин, имеющих высокий риск переломов. Этот препарат стимулирует образование новой кости и значительно увеличивает минеральную плотность кости. У женщин в
постклимактерическом периоде было отмечено уменьшение переломов позвоночника, бедра, лодыжек,
ребер и запястья. У мужчин отмечено уменьшение переломов позвоночника, но недостаточно данных
для оценки уменьшения переломов других локализаций. Терипаратид применяют самостоятельным введением в виде ежедневной инъекции в течение 24 месяцев.
7. Фармацевтические композиции.
В некоторых вариантах осуществления антагонисты активина-ActRIIa (например, полипептиды ActRIIa) настоящего изобретения составляют в композицию с фармацевтически приемлемым носителем.
Например, полипептид ActRIIa можно вводить индивидуально или в качестве компонента фармацевтической композиции (терапевтической композиции). Рассматриваемые соединения могут быть составлены
в композицию для введения любым удобным способом для применения в лечении человека или ветеринарии.
В некоторых вариантах осуществления терапевтический способ настоящего изобретения включает
системное введение композиции или локальное введение в виде имплантата или устройства. Вводимая
терапевтическая композиция для использования в настоящем изобретении безусловно имеет апироген- 23 -
018450
ную физиологически приемлемую форму. В состав композиции, необязательно, также можно включать
терапевтически полезные средства, отличные от антагонистов ActRIIa, как описано выше, и их можно
вводить одновременно или последовательно с рассматриваемыми соединениями (например, полипептидами ActRIIa) в способах настоящего изобретения.
Обычно антагонисты ActRIIa вводят парентерально. Фармацевтические композиции, подходящие
для парентерального введения, могут содержать один или несколько полипептидов ActRIIa в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными
или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками,
которые можно восстанавливать в стерильные растворы или дисперсии для инъекций непосредственно
перед применением, и они могут содержать антиоксиданты, буферные вещества, бактериостаты, растворы, которые делают композицию изотоничной с кровью предполагаемого реципиента, или суспендирующие вещества, или загустители. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут
быть использованы в фармацевтических композициях настоящего изобретения, включают воду, этанол,
полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие
смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций,
такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью веществ для
покрытия, таких как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и с
помощью поверхностно-активных веществ.
Дополнительно, композицию можно помещать в капсулы или инъецировать в форме для доставки к
участку ткани-мишени (например, в кость). В некоторых вариантах осуществления композиции настоящего изобретения могут включать матрицу, способную доставлять одно или несколько терапевтических
соединений (например, полипептидов ActRIIa) к участку ткани-мишени (например, в кость), обеспечивая
структуру для растущей ткани и оптимально приспособленную для резорбции в организм. Например,
матрица может обеспечивать медленное высвобождение полипептидов ActRIIa. Такие матрицы могут
быть образованы из материалов, используемых в настоящее время для других внедренных медицинских
областей применения.
Выбор материала матрицы основан на биосовместимости, биодеградируемости, механических
свойствах, косметическом внешнем виде и барьерных свойствах. Подходящая рецептура будет определяться конкретным применением рассматриваемых композиций. Потенциальные матрицы для композиций могут быть биодеградируемыми и с химической точки зрения представлять собой сульфат кальция,
трикальцийфосфат, гидроксиапатит, полимолочную кислоту и полиангидриды. Другие потенциальные
материалы являются биодеградируемыми и биологически четко определенными, такими как кость или
кожный коллаген. Дополнительно матрицы состоят из чистых белков или внеклеточных матриксных
компонентов. Другие потенциальные матрицы не являются биодеградируемыми и четко определенными
химически, такие как спеченный гидроксиапатит, биокерамика, алюминаты или другие керамические
материалы. Матрицы могут состоять из комбинаций любого из вышеупомянутых типов материалов, таких как полимолочная кислота и гидроксиапатит или коллаген и трикальцийфосфат. Биокерамику можно
изменять в композиции, такой как, например, алюмофосфат кальция, и обрабатывать для изменения размера пор, размера частиц, формы частицы и способности к биодеградации.
В некоторых вариантах методы настоящего изобретения могут представлять собой пероральное
введение, например, в виде капсул, саше, пилюль, таблеток, пастилок (с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и камеди или трагаканта), в виде порошков, гранул или в виде раствора
или суспензии в водной или неводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или вода-вмасле, или в виде эликсира или сиропа, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой
как желатин и глицерин, или сахароза и камедь) и/или в виде жидкости для споласкивания полости рта и
тому подобное, и каждая из лекарственных форм будет содержать заданное количество средства в качестве активного ингредиента. Средство также можно вводить в виде болюса, лекарственной кашки или
пасты.
В твердых лекарственных формах для перорального приема (капсулы, таблетки, пилюли, драже,
порошки, гранулы и тому подобное) одно или несколько терапевтических соединений настоящего изобретения можно смешивать с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или любым из следующего: (1) наполнители или экстендеры, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремневая кислота; (2) связывающие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или камедь; (3) смачивающие вещества, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие
вещества, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая
кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) вещества, замедляющие растворение, такие как парафин; (6) катализаторы абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающие вещества, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) лубриканты, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые
полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) красители. В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать буферные вещества. Твердые композиции
- 24 -
018450
подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягких и прессованных желатиновых капсулах, используя такие наполнители, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и тому подобное.
Жидкие лекарственные формы для перорального приема включают фармацевтически приемлемые
эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активному ингредиенту жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в
данной области, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие вещества и эмульгаторы,
такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, масло семени хлопчатника, арахисовое, кукурузное, масло зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры сорбитана и жирных кислот и их смеси.
Помимо инертных разбавителей пероральные композиции могут также включать адъюванты, такие как
смачивающие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подсластители, ароматизаторы,
красители, отдушки и консерванты.
Суспензии в дополнение к активным соединениям могут содержать суспендирующие вещества, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана,
микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант и их смеси.
Композиции настоящего изобретения могут также содержать адъюванты, такие как консерванты,
смачивающие вещества, эмульгирующие и диспергирующие вещества. Предотвращение воздействия
микроорганизмов может быть обеспечено включением в состав композиции различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и тому подобное. Также может быть желательным включение в композиции изотонических веществ, таких
как сахара, хлорид натрия и тому подобное. Кроме того, можно достичь замедленной абсорбции лекарственной формы для инъекций путем включения в нее веществ, которые замедляют абсорбцию, таких как
моностеарат алюминия и желатин.
Подразумевается, что схему введения будет определять лечащий врач с учетом различных факторов, которые модифицируют действие рассматриваемых соединений настоящего изобретения (например,
полипептиды ActRIIa). Эти различные факторы включают, но не ограничиваются ими, количество костной массы, которое желательно образовать, степень потери плотности кости, локализацию костного повреждения, состояние поврежденной кости, возраст больного, пол и пищевой рацион, степень тяжести
какого-либо заболевания, которое может обуславливать потерю костной массы, время введения и другие
клинические факторы. Необязательно, доза может варьировать в зависимости от типа матрикса, используемого для реконституции, и типов соединений в композиции. Также на дозу может влиять добавление
к конечной композиции других известных факторов роста. Можно осуществлять контроль динамики путем периодической оценки роста кости и/или репарации, например, путем рентгеновского исследования
(включая DEXA), гистоморфометрических определений и мечения тетрациклином.
Эксперименты с мышами показали, что действие ActRIIa-Fc на кость поддается обнаружению, когда соединения дозируют в интервалах и количествах, достаточных для достижения уровней концентраций в сыворотке 0,2 мкг/кг или больше, и для достижения значительных эффектов на плотность и прочность кости желательны уровни в сыворотке, составляющие 1 или 2 мкг/кг либо больше. Хотя отсутствуют какие-либо указания на то, что более высокие дозы ActRIIa-Fc нежелательны в силу побочных эффектов, можно разработать такие схемы дозирования, чтобы уровни концентраций в сыворотке достигали диапазона от 0,2 до 15 мкг/кг и, необязательно, диапазона от 1 до 5 мкг/кг. Для людей можно достичь
уровня в сыворотке 0,2 мкг/кг единственной дозой 0,1 мг/кг или больше и уровня в сыворотке, составляющего 1 мкг/кг, можно достичь единственной дозой 0,3 мг/кг или больше. Наблюдаемый период полувыведения молекулы из сыворотки находится в диапазоне примерно от 20 до 30 дней, что значительно
дольше, чем большинство слитых Fc-белков, и, таким образом, можно достичь постоянного эффективного уровня в сыворотке, например, введением дозы 0,2-0,4 мг/кг еженедельно или каждые две недели, или
можно использовать более высокие дозы с более продолжительными интервалами между введением дозы. Например, дозы 1-3 мг/кг можно использовать один раз в месяц или один раз в два месяца, и действие на кость может быть настолько длительным, что введение дозы будет необходимо только однократно
каждые 3, 4, 5, 6, 9, 12 или больше месяцев.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает генную терапию
для продукции полипептидов ActRIIa in vivo. Такая терапия будет достигать своего терапевтического
эффекта путем введения полинуклеотидных последовательностей ActRIIa в имеющие нарушения клетки
или ткани, как указано выше. Можно осуществлять доставку полинуклеотидных последовательностей
ActRIIa, используя рекомбинантный вектор экспрессии, такой как химерный вирус или коллоидная дисперсная система. Предпочтительным для терапевтической доставки полинуклеотидных последовательностей ActRIIa является использование направленных липосом.
Различные вирусные векторы, которые можно использовать для генной терапии согласно идее настоящего изобретения, включают аденовирус, вирус герпеса, вирус осповакцины или предпочтительно
- 25 -
018450
вирус РНК, такой как ретровирус. Предпочтительно ретровирусный вектор является производным мышиного или птичьего ретровируса. Примеры ретровирусных векторов, в которые может быть вставлен
единственный чужеродный ген, включают, но не ограничиваются ими: вирус лейкоза мышей Молони
(MoMuLV), вирус саркомы мышей Харви (HaMuSV), вирус опухоли молочной железы мышей (MuMTV)
и вирус саркомы Роуса (RSV). Ряд дополнительных ретровирусных векторов может включать множественные гены. Все эти векторы могут переносить или включать ген для выбираемого маркера с тем, чтобы
существовала возможность идентифицировать и продуцировать трансдуцированные клетки. Ретровирусные векторы можно делать специфично направленными, например, путем присоединения сахара, гликолипида или белка. Предпочтительного нацеливания достигают использованием антитела. Специалистам
в данной области известно, что определенные полинуклеотидные последовательности могут быть вставлены в ретровирусный геном или присоединены к оболочке вируса, чтобы позволить специфично направленный транспорт ретровирусного вектора, содержащего полинуклеотид ActRIIa. В предпочтительном варианте осуществления вектор направлен на кость или хрящ.
Альтернативно, клетки культуры тканей могут быть непосредственно трансфицированы плазмидами, кодирующими ретровирусные структурные гены gag, pol и env, посредством общепринятой трансфекции фосфатом кальция. Затем эти клетки трансфицируют векторной плазмидой, содержащей рассматриваемые гены. Полученные клетки высвобождают ретровирусный вектор в культуральную среду.
Другая система направленного транспорта для полинуклеотидов ActRIIa представляет собой коллоидную дисперсионную систему. Коллоидные дисперсионные системы включают комплексы макромолекул, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на липидной основе, включающие эмульсии масло-вводе, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой настоящего
изобретения является липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные везикулы,
которые применимы в качестве носителей для доставки in vitro и in vivo. РНК, ДНК и интактные вирионы могут быть инкапсулированы в водной среде и могут быть доставлены в клетки в биологически активной форме (см., например, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Способы эффективного переноса генов с использованием липосомного носителя, известные в данной области, см., например, в
публикации Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. Композиция липосомы обычно представляет собой комбинацию фосфолипидов, обычно в комбинации со стероидами, особенно с холестерином. Также
можно использовать другие фосфолипиды или другие липиды. Физические характеристики липосом зависят от рН, ионной силы и наличия двухвалентных катионов.
Примеры липидов, пригодных для получения липосом, включают соединения фосфатидила, такие
как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды,
цереброзиды и ганглиозиды. Примеры фосфолипидов включают яичный фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Направленный транспорт липосом также возможен
на основе, например, органной специфичности, клеточной специфичности и специфичности органеллы и
является известным в данной области.
Примеры
После общего описания настоящего изобретения далее оно будет легко понято путем ссылки на
следующие примеры, которые включены в него просто в целях иллюстрации некоторых вариантов осуществления и вариантов осуществления настоящего изобретения, и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1. Слитые белки ActRIIa-Fc.
Авторы настоящего изобретения сконструировали растворимый слитый белок ActRIIa, который
имеет внеклеточный домен человеческого ActRIIa, слитый с человеческим или мышиным Fc-доменом с
минимальным линкером между ними. Конструкции названы ActRIIa-hFc и ActRIIa-mFc соответственно.
ActRIIa-hFc показана ниже как очищенная из клеточных линий СНО (SEQ ID NO: 7)
Белки ActRIIa-hFc и ActRIIa-mFc были экспрессированы в клеточных линиях СНО. Были рассмотрены три разные лидерные последовательности:
(i) меллитин пчелиного меда (HBML)
(SEQ ID NO: 8);
(ii) тканевой активатор плазминогена (ТРА)
;
(iii) нативная последовательность
(SEQ ID NO: 10).
В выбранной форме использована лидерная ТРА и она имеет следующую непроцессированную
аминокислотную последовательность:
- 26 -
018450
Указанный полипептид кодируется следующей последовательностью нуклеиновой кислоты:
Как ActRIIa-hFc, так и ActRIIa-mFc были исключительно предрасположены к рекомбинантной экспрессии. Как показано на фиг. 1, белок очищали в виде единственного четкого пика белка. Секвенирование N-конца выявило единственную последовательность ILGRSETQE (SEQ ID NO: 11). Очистки можно
было добиться последовательными стадиями колоночной хроматографии, включающими, например, три
или больше из следующих стадий в любом порядке: хроматография с использованием белка А, хроматография с использованием Q-сефарозы, хроматография с использованием фенилсефарозы, эксклюзионная
хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершать вирусной фильтрацией и
буферным обменом. Белок ActRIIa-hFc очищали до чистоты >98%, как определено эксклюзионной хроматографией, и до чистоты >95%, как определено методом SDS PAGE.
ActRIIa-hFc и ActRIIa-mFc проявляли высокую аффинность к лигандам, в частности к активину A.
GDF-11 или активин А ("ActA") были иммобилизованы на чипе Biacore CM5 с использованием стандартной методики аминного связывания. Белки ActRIIa-hFc и ActRIIa-mFc загружали в систему и проводили измерение связывания. ActRIIa-hFc связывается с активином с константой диссоциации (KD)
5×10-12 и белок связывается с GDF11 с KD 9,96×10-9; см. фиг. 2. Белок ActRIIa-mFc вел себя подобным
образом.
Для оценки действия белков ActRIIa-hFc на передачу сигналов GDF-11 и активина А использовали
анализ гена-репортера А-204. Клеточная линия: человеческая рабдомиосаркома (полученная из мышцы).
Репортерный вектор: pGL3(CAGA)12 (описан у Dennler et al., 1998, EMBO, 17: 3091-3100); см. фиг. 3.
Мотив CAGA12 присутствует в реактивных генах TGF-бета (ген PAI-1), таким образом, этот вектор имеет общее применение для факторов передачи сигнала через Smad2 и 3.
День 1: суспензия клеток А-204 в 48-луночном планшете.
День 2: клетки А-204, трансфицированные 10 мкг pGL3(CAGA)12 или pGL3(CAGA)12 (10 мкг) +
pRLCMV (1 мкг) и Fugene.
День 3: добавляли факторы (разведенные в питательной среде + 0,1% BSA (БСА)). Перед добавлением в клетки ингибиторы необходимо предварительно инкубировать с факторами в течение 1 ч. Через 6
ч клетки споласкивали PBS и осуществляли лизирование клеток.
После этого проводили исследование с люциферазой. Обычно в этом исследовании в отсутствие
каких-либо ингибиторов активин А демонстрирует примерно 10-кратную стимуляцию экспрессии репортерного гена и ED50 составляет примерно 2 нг/мл. GDF-11: 16-кратная стимуляция, ED50: примерно 1,5
- 27 -
018450
нг/мл. GDF-8 проявляет эффект, подобный GDF-11.
Как показано на фиг. 4, ActRIIa-hFc и ActRIIa-mFc ингибируют GDF-8-опосредованную передачу
сигналов в пикомолярных концентрациях. Как показано на фиг. 5, три разных препарата ActRIIa-hFc ингибируют передачу сигналов GDF-11 при IC50 приблизительно 200 пМ.
В фармакокинетических исследованиях ActRIIa-hFc проявлял высокую устойчивость. Крысам давали дозы белка ActRIIa-hFc 1, 3 или 10 мг/кг и измеряли уровни в плазме на время 24, 48, 72, 144 и 168 ч.
В отдельном исследовании крысы получали дозы 1, 10 или 30 мг/кг. У крыс наблюдали период полувыведения из сыворотки ActRIIa-hFc от 11 до 14 дней, и циркулирующие уровни лекарственного средства
были достаточно высокими через две недели (11, 110 или 304 мкг/мл для исходного введения 1, 10 или
30 мг/кг соответственно). У обезьян Cynomolgus период полувыведения из плазмы был существенно
больше 14 дней, и циркулирующие уровни лекарственного средства составляли 25, 304 или 1440 мкг/мл
для исходного введения 1, 10 или 30 мг/кг соответственно. По предварительным результатам у людей
предполагают, что период полувыведения из сыворотки составляет примерно от 20 до 30 дней.
Пример 2. ActRIIa-mFc ускоряет рост кости in vivo.
Нормальные самки мыши (BALB/c) получали дозы ActRIIa-mFc на уровне 1, 3 или 10 мг/кг/дозы
при введении доз два раза в неделю. Минеральную плотность кости и содержание минералов в кости
определяли с помощью DEXA, см. фиг. 6.
У самок мышей BALB/c в результате лечения изображения DEXA показывали значительное увеличение (>20%) минеральной плотности кости и содержании ActRIIa-mFc; см. фиг. 7 и 8.
Таким образом, антагонизм ActRIIa вызывает увеличение плотности кости и содержания костной
массы у нормальных самок мышей. Как следующая стадия, на мышиной модели остеопороза тестировали действие ActRIIa-mFc на кость.
Andersson et al. (2001) установили, что у овариэктомированных мышей наблюдается значительная
потеря костной массы (примерно потеря 50% в трабекулярной кости через шесть недель после операции)
и что потерю костной массы у этих мышей можно корригировать предлагаемыми терапевтическими
средствами, такими как паратгормон.
Авторы настоящего изобретения использовали самок мышей C57BL6 в возрасте 4-5 недель, которые были овариэктомированы (OVX) или ложнооперированы (SHAM). Через восемь недель после операции начинали лечение с ActRIIa-mFc (10 мг/кг, два раза в неделю) или с контролем (PBS). Плотность
кости измеряли СТ (КТ)-сканированием.
Как показано на фиг. 9, у овариэктомированных мышей без лечения через шесть недель выявляли
значительную потерю плотности трабекулярной кости по сравнению с контрольными группами SHAM.
Лечение ActRIIa-mFc восстанавливало плотность кости до уровня плотности у ложнооперированных
мышей. На 6 и 12 неделях лечения ActRIIa-mFc вызывал значительное увеличение плотности трабекулярной кости у мышей OVX; см. фиг. 10. Через 6 недель лечения плотность кости увеличивалась на 24%
относительно контрольных групп PBS. Через 12 недель это увеличение составляло 27%.
У ложнооперированных мышей ActRIIa-mFc также вызывал значительное увеличение плотности
трабекулярной кости; см. фиг. 11. Через 6 и 12 недель лечение вызывало увеличение на 35% относительно контрольных групп.
В дополнительной серии экспериментов овариэктомированные (OVX) или ложнооперированные
мыши, как описано выше, получали лечение ActRIIa-mFc (10 мг/кг, два раза в неделю) или контроль
(PBS) в течение двенадцати недель. Подобно результатам, описанным выше для ActRIIa-mFc, мыши
OVX, получавшие ActRIIa-mFc, показывали увеличение плотности трабекулярной кости на 15% уже через четыре недели и на 25% через 12 недель лечения (фиг. 12). Ложнооперированные мыши, получавшие
ActRIIa-mFc подобным образом, показывали увеличение плотности трабекулярной кости на 22% уже
через четыре недели и на 32% через 12 недель лечения (фиг. 13).
Через двенадцать недель лечения с ActRIIa-mFc исследование DEXA тела полностью и ex vivo бедренной кости показало, что лечение вызывает увеличение плотности кости и у овариэктомированных, и у
ложнооперированных мышей (фиг. 14А и 14В соответственно). Эти результаты также подтверждены
исследованием ex vivo pQCT середины диафиза бедренной кости, в котором показано значительное увеличение и общей, и кортикальной плотности кости через двенадцать недель лечения ActRIIa-mFc. У контрольных овариэктомированных мышей, леченных носителем, выявлены показатели плотности кости,
которые были сопоставимы с показателями контрольных ложнооперированных мышей, получавших лечение носителем (фиг. 15). В дополнение к плотности кости увеличивалось содержание костной массы
после лечения ActRIIa-mFC. Ex vivo pQCT исследование средней части диафиза бедренной кости выявило значительное увеличение и общего, и кортикального содержания костной массы через двенадцать
недель лечения ActRIIa-mFc, тогда как контрольные и овариэктомированные, и ложнооперированные
мыши, леченные носителем, показывали сопоставимое содержание костной массы (фиг. 16). Ex vivo исследование pQCT средней части диафиза бедренной кости также показало, что у мышей, леченных ActRIIa-mFc, не выявлено изменения периостальной окружности; вместе с тем, лечение ActRIIa-mFc приводило к уменьшению эндостальной окружности, указывая на увеличение кортикальной толщины за счет
роста внутренней поверхности бедренной кости (фиг. 17).
- 28 -
018450
При механическом тестировании бедренных костей было определено, что ActRIIa-mFc способен
повысить внешние характеристики кости (максимальную нагрузку, прочность и усилие для перелома),
которые обуславливают значительное повышение внутренних характеристик (предельную прочность)
костей. Овариэктомированные мыши, леченные ActRIIa-mFc, проявляли повышенную прочность кости
на уровне, превосходящем уровни у ложнооперированных мышей и контрольных групп, леченных носителем, указывая на полное исчезновение остеопорозного фенотипа (фиг. 18).
Эти данные показывают, что антагонист активина-ActRIIa способен увеличивать плотность кости у
нормальных самок мышей и, кроме того, на мышиной модели остеопороза корригировать нарушения в
плотности кости, содержание костной массы и, в конечном счете, нарушение прочности кости.
В дополнительной серии экспериментов были овариэктомированы или ложнооперированы мыши в
возрасте 4 недель, которые, начиная с 12 недель, получали в течение дополнительного периода 12 недель
или плацебо, или ActRIIa-mFc (2 раза в неделю, по 10 мг/кг) (также называемый RAP-11 на фиг. 19-24).
Проводили оценку ряда параметров кости. Как показано на фиг. 19, ActRIIa-mFc увеличивал отношение
объема трабекулярной позвоночной кости к общему объему (BV/TV) как у мышей OVX, так и у ложнооперированных мышей. ActRIIa-mFc также улучшал трабекулярную архитектуру (фиг. 20), увеличивал
кортикальную толщину (фиг. 21) и улучшал прочность кости (фиг. 22). Как показано на фиг. 23, ActRIIamFc оказывал желаемое действие в диапазоне доз от 1 до 10 мг/кг.
У ложнооперированных мышей на 2 неделе эксперимента проводили гистоморфометрию кости.
Эти данные, представленные на фиг. 24, показывают, что ActRIIa-mFc обладает двойным действием, как
ингибируя резорбцию кости, так и стимулируя рост кости. Таким образом, ActRIIa-mFc стимулирует
рост кости (анаболический эффект) и ингибирует резорбцию кости (антикатаболический эффект).
Пример 4. Альтернативные белки ActRIIa-Fc.
Альтернативная конструкция может иметь делецию С-концевого хвоста (последних 15 аминокислот
внеклеточного домена ActRIIa). Последовательность для такой конструкции представлена ниже (участок
Fc подчеркнут) (SEQ ID NO: 12)
Включение ссылок
Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в него полностью путем
ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и отдельно обозначены,
как включенные в него путем ссылки.
Поскольку рассмотрены конкретные варианты осуществления объекта изобретения, вышеупомянутое описание является иллюстративным и не ограничивающим. Многие варианты будут очевидными для
специалиста в данной области после ознакомления с настоящим описанием и нижеприведенной формулой изобретения. Полный объем настоящего изобретения необходимо определять, учитывая формулу
изобретения, наряду с полным объемом эквивалентов, и описание, наряду с указанными вариантами.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Растворимый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 7, где N-конец полипептида представляет собой ILGRSETQE
(SEQ ID NO: 11), где полипептид не является SEQ ID NO: 7 и где полипептид связывает активин А.
2. Полипептид по п.1, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на
97% идентичную SEQ ID NO: 7.
3. Полипептид по п.2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99%
идентичную SEQ ID NO: 7.
4. Полипептид по п.1, который является антагонистом активина А.
5. Полипептид по п.1, который стимулирует рост кости in vivo.
6. Полипептид по п.5, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 97%
идентичную SEQ ID NO: 7.
7. Полипептид по п.6, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99%
идентичную SEQ ID NO: 7.
8. Полипептид по п.1, который имеет период полувыведения из сыворотки, составляющий более
двух недель.
9. Полипептид по п.8, который имеет период полувыведения из сыворотки, составляющий от 20 до
30 дней.
10. Полипептид по п.1, который является гликозилированным и имеет характер гликозилирования,
- 29 -
018450
присущий млекопитающему.
11. Полипептид по п.10, который имеет характер гликозилирования, получаемый из клеточной линии яичника китайского хомячка (СНО).
12. Композиция, содержащая полипептид по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, где полипептид имеет чистоту по меньшей мере 98%, как определено эксклюзионной хроматографией.
13. Композиция по п.12, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 97% идентичную SEQ ID NO: 7.
14. Композиция по п.13, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 7.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 30 -
018450
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
- 31 -
018450
Фиг. 9
Фиг. 10
Фиг. 11
Фиг. 12
- 32 -
018450
Фиг. 13
Фиг. 14
Фиг. 15
Фиг. 16
- 33 -
018450
Фиг. 17
Фиг. 18
Фиг. 19
Фиг. 20
- 34 -
018450
Фиг. 21
Фиг. 22
Фиг. 23
Фиг. 24
- 35 -
018450
Список последовательностей
- 36 -
018450
- 37 -
018450
- 38 -
018450
- 39 -
018450
- 40 -
018450
- 41 -
018450
- 42 -
018450
- 43 -
018450
- 44 -
018450
- 45 -
018450
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 46 -