019334 B1 019334 B1 (11) 019334

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
019334
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
(51) Int. Cl. C07C 309/14 (2006.01)
2014.02.28
(21)
Номер заявки
200900802
(22)
Дата подачи заявки
2004.06.21
(54)
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АМИЛОИДНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение относится к соединению формулы V
Конг Ксианки, Мигнол Дэвид, Валяд
Изабелль, Ву Ксинфу, Жерве Франсин
(CA)
Дементьев В.Н. (RU)
или его фармацевтически приемлемой соли, где заместители и индексы имеют значения,
представленные в описании. Описаны способы ингибирования отложения β-амилоида и лечения
или предупреждения заболевания или состояния, связанного с амилоидогенными белками или
пептидами β-амилоида, фармацевтические композиции и применение соединений изобретения для
изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения амилоидных заболеваний.
B1
019334
(56) WO-A2-2000064420
WO-A1-1997023458
WO-A2-2002007781
WO-A1-1996028187
US-A-5716950
US-A-4870078
VON K. LANYI et al., "Piperazin-Derivate
II. Wirkung von Piperazin-Derivaten". ArzneimittelForschung. Drug Research, vol. 18, 1968, pp.
1431-1435, с. 1432, табл. 3, соединение 35
WO-A2-2000071101
019334
60/480,906; 60/512,047; 10/871,514;
10/871,365
(32) 2003.06.23; 2003.10.17; 2004.06.18;
2004.06.18
(33) US
(43) 2010.04.30
(62) 200600078; 2004.06.21
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
БиЭйчАй ЛИМИТЕД ПАТНЕРШИП
(CA)
(31)
019334
Область техники, к которой относится изобретение
Амилоидоз относится к патологическому состоянию, характеризующемуся наличием амилоидных
фибрилл. Амилоид является родовым названием, относящимся к группе разнообразных, но специфичных
белковых отложений (внутриклеточных или внеклеточных), которые наблюдаются при различных заболеваний. Будучи различными по местонахождению, все амилоидные отложения имеют общие морфологические свойства, окрашиваются специфичными красителями (например, Конго красным) и после окрашивания имеют характерное красно-зелёное двойное лучепреломление в поляризованном свете. Они
также имеют общие обычные ультраструктурные признаки и обычные рентгеновские и ИК-спектры.
Заболевания, связанные с амилоидами, могут либо ограничиваться одним органом, либо распространяться на несколько органов. Первый пример называют "локализованным амилоидозом", тогда как
второй называют "системным амилоидозом". Некоторые амилоидные заболевания могут быть идиопатическими, но большинство этих заболеваний проявляются как осложнения предыдущего заболевания.
Например, первичный амилоидоз (AL амилоид) может появиться без какой-либо другой патологии или
может быть последствием дискразии плазматических клеток или множественной миеломы.
Обычно вторичный амилоидоз наблюдается как ассоциированный с хронической инфекцией (такой
как туберкулёз) или хроническим воспалением (таким как ревматоидный артрит). Семейная форма вторичного амилоидоза также наблюдается в других типах семейного амилоидоза, например Семейная Средиземноморская Лихорадка (FMF). Этот семейный тип амилоидоза является генетически наследственной
и обнаруживается в специфичных популяционных группах. Как при первичном, так и при вторичном
амилоидозе отложения обнаруживают в некоторых органах и, следовательно, оба амилоидоза рассматриваются как системные амилоидные заболевания.
"Локализованные амилоидозы" представляют собой такие заболевания, которые включают систему
единичного органа. Различные амилоиды также характеризуются типом белка, присутствующего в отложении. Например, нейродегенеративные заболевания, такие как скрепи, бычий губчатый энцефалит (болезнь коровьего бешенства), болезнь Крейтцфельда-Якоба и т.п., характеризуются появлением и аккумуляцией устойчивой к протеазам формы прионного белка (называемого AScr или PrP-27). Аналогично,
болезнь Альцгеймера, другое нейродегенеративное заболевание, характеризуется нейритными бляшками
и нейрофибриллярными клубками. В данном случае амилоидные бляшки, обнаруживаемые в паренхиме
и кровеносном сосуде, образуются отложением фибриллярного Aβ амилоидного белка. Другие заболевания, такие как диабет взрослых (диабет типа II), характеризуются локализованной аккумуляцией амилоидных фибрилл в поджелудочной железе.
В случае образования амилоидов отсутствует известная, общепринятая терапия, или лечение, в результате которой происходило бы заметное растворение амилоидных отложений in situ, которая предупреждала бы дальнейшие амилоидные отложения или предупреждала инициирование амилоидного отложения.
Каждый амилоидогенный белок способен претерпевать конформационное изменение и создавать βскладки и образовывать нерастворимые фибриллы, которые могут отлагаться вне или внутри клетки. Все
амилоидогенные белки имеют различную аминокислотную последовательность, но одинаковое свойство
образовывать фибриллы и связываться с другими элементами, такими как протеогликан, амилоид Р и
компонент комплемента. Кроме того, все амилоидогенные белки имеют аминокислотные последовательности, которые, будучи различными, имеют сходство, такое как области, способные связываться с гликозаминогликановым (GAC) участком протеогликана (называемым сайт связывания GAC), а также другие
области, которые промотируют образование β-складок. Протеогликаны представляют собой макромолекулы различного размера и различной структуры, которые распространены почти по всему организму.
Их можно обнаружить в межклеточном компартменте, на поверхности клетки и как часть внеклеточной
матрицы. Основная структура всех протеогликанов состоит из ядерного белка и, по меньшей мере, одной, но часто большего числа, полисахаридных цепей (GAC), соединённых с ядерным белком. Открыто
множество различных GAC, включая хондроитин сульфат, дерматан сульфат, кератан сульфат, гепарин и
гиалуронан.
В специфических случаях амилоидные фибриллы, если только они образовались, могут стать токсичными по отношению к окружающим клеткам. Например, показано, что Аβ фибриллы, организованные в виде сенильных бляшек, ассоциируются с мёртвыми нейронными клетками, дистрофическими
нейритами, астроцитозом и микроглиозом у больных болезнью Альцгеймера. При испытании in vitro
показано, что олигомерный (растворимый), а также фибриллярный Аβ пептид способен инициировать
процесс активации микроглии (макрофагов мозга), что объясняет микроглиоз и воспаление мозга, обнаруженные в мозге больных болезнью Альцгеймера. Как олигомерный, так и фибриллярный Аβ пептид
могут также индуцировать гибель нейронных клеток in vitro. См., например, М.Р. Lampert, et. Al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95, 6448- 53 (1998).
Показано, что при другом типе амилоидоза, наблюдаемом у больных диабетом типа II, амилоидогенный белок IAPP, если организован в олигомерные формы или в фибриллы, индуцирует токсичность
островковых β-клеток in vitro. Следовательно, появление IAPP фибрилл в поджелудочной железе боль-1-
019334
ных диабетом типа II способствует утрате островковых β-клеток (клеток Лангерганса) и дисфункции
органа, которая может привести к инсулинемии.
Другой тип амилоидоза связан с β2 микроглобулином и встречается у больных, проходящих длительный курс гемодиализа. У пациентов, проходящих продолжительный курс гемодиализа, появляются
фибриллы из β2-микроглобулина в запястном туннеле и в богатых коллагеном тканях в некоторых суставах. Это вызывает сильные боли, тугоподвижность и опухание суставов.
Амилоидоз также характерен для болезни Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера является заболеванием, разрушающим мозг, которое приводит к прогрессирующей потере памяти, ведущей к слабоумию,
психической нетрудоспособности и смерти через относительно продолжительное время. В процессе старения популяций в развитых странах число больных болезнью Альцгейпера достигает размера эпидемии.
У людей, страдающих болезнью Альцгеймера, развивается прогрессирующее слабоумие в состоянии зрелости, сопровождающееся тремя основными структурными изменениями в мозге: диффузная гибель нейронов во многих участках мозга; аккумуляция внутриклеточных отложений белка, называемых
нейрофибриллярными клубками; и аккумуляция внеклеточных отложений белка, называемых амилоидными или сенильными бляшками, окружённых деформированными нервными окончаниями (дистрофические нейриты) и активированной микроглией (микроглиоз и астроцитоз). Основным составляющим
этих амилоидных бляшек является амилоидный β пептид (Аβ), белок из 39-43 аминокислот, который
образуется расщеплением β-амилоидного белка-предшественника (АРР). Интенсивное исследование
проводилось по изучению релевантности Аβ отложений при болезни Альцгеймера, см., например,
Selkoe, Trends in Cell Biology 8, 447-453 (1998). Аβ легко образуется при метаболическом процессировании амилоидного белка- предшественника ("АРР") в эндоплазматическом ретикулуме ("ER"), аппарате
Гольджи, или в эндосомно- лизосомном метаболическом пути (системе), и, наиболее обычно, секретируется в виде пептида, содержащего 40 ("Аβ 1-40") или 42 ("Аβ-42") аминокислот (Selkoe, Annu. Rev. Cell
Biol. 10, 373- 403 (1994)). Роль Аβ как основной причины болезни Альцгеймера подтверждается присутствием внеклеточных отложений Аβ в сенильных бляшках, характерных для болезни Альцгеймера, повышенным продуцированием Аβ в клетках, содержащих мутантные гены, ассоциированные с болезнью
Альцгеймера, например, амилоидного белка-предшественника, пресенилина I и пресенилина II; и токсичность растворимого (олигомерного) или фибриллярного Аβ в отношении клеток в культуре. См., например, Gervais, Eur. Biopharm. Review, 40-42 (Autumn 2001); May, DDT, 459-62 (2001). Хотя существует
симптоматическое лечение болезни Альцгеймера, в настоящее время это заболевание нельзя предупредить или лечить.
Болезнь Альцгеймера характеризуется диффузными и нейритными бляшками, церебральной ангиопатией и нейрофибриллярными клубками. Полагают, что амилоид бляшек и кровеносных сосудов образуется за счёт отложения нерастворимого Аβ амилоидного белка, который можно описать как диффузный или фибриллярный. Полагают также, что как растворимый олигомерный Аβ, так и фибриллярный
Аβ являются нейротоксическими и воспалительными.
Другим типом амилоидоза является церебральная амилоидная ангиопатия (САА). САА представляет собой специфичное отложение амилоидных β-фибрилл на стенках липтоменингеальной и корковой
артерий, артериол и вен. Она обычно ассоциируется с болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна и нормальным старением, а также с различными семейными состояниями, связанными с ударом или деменцией (см. Frangione et al., Amiloid: J. Protein Folding Disord. 8, Suppl.l, 36- 42 (2001)).
Общедоступные в настоящее время методы лечения β-амилоидных заболеваний, почти все, являются лишь симптоматическими, дающими лишь временное или частичное клиническое улучшение. Хотя
описаны некоторые фармацевтические агенты, которые предлагают ослабление симптомов, в настоящее
время отсутствует комплексная фармакологическая терапия для предупреждения или лечения, например,
болезни Альцгеймера.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению некоторых соединений для лечения амилоидных
заболеваний. В частности, данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения амилоидного заболевания у субъекта, заключающемуся во введении субъекту терапевтического количества
соединения по изобретению. Изобретение также относится к каждому из новых соединений по изобретению, представленных в данном описании. Среди соединений для применения по изобретению соединения нижеприведённых формул, при введении которых уменьшается или ингибируется образование амилоидных фибрилл, специфичную дисфункцию органов (например, нейродегенерацию) или клеточную
токсичность.
Изобретение относится к соединениям формулы V
-2-
019334
где
А обозначает азот или кислород;
R11 обозначает водород, группу, образующую сложный С1-С6алкиловый эфир, -(CH2)x-Q, или, если
А обозначает азот, то А и R11 вместе образуют остаток природной или неприродной аминокислоты или
её метиловый или этиловый сложный эфир;
Q обозначает водород, тиазолил, триазолил, имидазолил, бензотиазолил или бензимидазолил;
x обозначает 0, 1, 2, 3 или 4;
n обозначает 3 или 4;
аа обозначает остаток природной или неприродной аминокислоты, присоединенный через его карбонильную группу, причем указанный остаток аминокислоты находится в L-конфигурации;
m обозначает 1, 2 или 3;
R14 обозначает водород или или трет-бутилоксикарбонильную защитную группу;
R15 обозначает водород, незамещенный С1-С6алкил, С1-С6алкильную группу, замещенную
С6арилом, или С6арил,
и их фармацевтически приемлемым солям.
В одном варианте изобретения соединения по данному описанию предупреждают или ингибируют
сборку амилоидного белка в нерастворимые фибриллы, которые, in vivo, отлагаются в различных органах, или они способствуют клиренсу ранее образовавшихся отложений или замедляют отложение у пациентов, уже имеющих отложения. В другом варианте изобретения соединение может также предупреждать связывание амилоидного белка, в его растворимой, олигомерной форме или в его фибриллярной
форме, с клеточной поверхностью или адгезию этого белка к клеточной поверхности. Ещё в одном варианте изобретения соединение может блокировать вызванные амилоидами клеточную токсичность или
активацию макрофага. В другом варианте изобретения соединение может блокировать вызванные амилоидами нейротоксичность или микроглиальную активацию. В другом варианте изобретения соединение
защищает клетки от вызванной амилоидом цитотоксичности островковых В- клеток. В другом варианте
изобретения соединение может повышать клиренс из конкретного органа, например, мозга, или оно понижает концентрацию амилоидного белка таким образом, в нацеленном органе предупреждается образование фибрилл.
Соединения по изобретению можно применять терапевтически или профилактически для лечения
заболеваний, ассоциированных с образованием, агрегацией или отложением амилоидных фибрилл. Соединения по изобретению могут действовать, облегчая течение амилоидного заболевания, по любому из
приведённых ниже механизмов (предполагается, что этот перечень является иллюстративным и не лимитирующим): замедление скорости образования или отложения амилоидных фибрилл; уменьшение степени амилоидного отложения; ингибирование, уменьшение или предупреждение образования амилоидных
фибрилл; ингибирование нейродегенерации или клеточной токсичности, вызванной амилоидом; ингибирование воспаления, индуцированного амилоидом; повышение клиренса амилоида; или содействие расщеплению (разрушению) амилоидного белка до его объединения в фибриллы.
Соединения по изобретению можно применять терапевтически или профилактически для лечения
заболеваний, ассоциированных с образованием, агрегацией или отложением фибрилл β-амилоида. Соединения по изобретению могут действовать, облегчая течение заболевания, связанного с β-амилоидом,
по любому из приведённых ниже механизмов (предполагается, что этот перечень является иллюстративным и не лимитирующим): замедление скорости образования или отложения β-амилоидных фибрилл;
уменьшение степени β-амилоидного отложения; ингибирование, уменьшение или предупреждение образования β-амилоидных фибрилл; ингибирование нейродегенерации или клеточной токсичности, вызванной β-амилоидом; ингибирование воспаления, индуцированного β-амилоидом; повышение клиренса βамилоида из мозга; или содействие расщеплению (разрушению) β-амилоидного белка до его объединения в фибриллы.
Терапевтические соединения по изобретению могут быть эффективны при контроле β-амилоидного
отложения либо после их проникновения в мозг (после прохождения через гематоэнцефалический барьер), либо с периферии. При действии с периферии соединение может изменять равновесие Аβ между
мозгом и плазмой таким образом, который содействует удалению Аβ из мозга. Оно может также повышать катаболизм нейронного Аβ и изменять скорость удаления из мозга. Увеличение выхода Ар из мозга
приводит к понижению концентрации Аβ в мозге и в спинномозговой жидкости (CSF) и, следовательно,
способствует уменьшению Аβ отложения. Или же, соединения, которые проникают в мозг, могли бы
регулировать отложение, действуя непосредственно на Аβ в мозге, например, сохраняя его в нефибриллярной форме, способствуя его клиренсу из мозга или замедляя процессирование АРР. Эти соединения могли бы также предупреждать взаимодействие Аβ в мозге с клеточной поверхностью и, следовательно, предупреждать нейротоксичность, нейродегенерацию и воспаление. Они также могут снижать продуцирование Аβ активированной микроглией. Эти соединения могут также повышать разрушение при использовании макрофагов или нейронных клеток.
В одном варианте изобретения применяется способ лечения болезни Альцгеймера (например, спо-3-
019334
радической формы, семейной или ранней AD). Способ также можно применять профилактически или
терапевтически для лечения других случаев β-амилоидного отложения, таких как у больных с синдромом Дауна или у больных церебральной амилоидной ангиопатией ("САА") или у больных с наследственной церебральной геморрагией.
В другом варианте изобретения применяют способ лечения лёгкой когнитивной недостаточности.
Лёгкая когнитивная недостаточность ("MCI") представляет собой состояние, характеризующееся лёгкой,
но заметной утратой мыслительного навыка, квалификации, умения, которая необязательно связана с
наличием деменции. MCI часто, но не всегда, предшествует болезни Альцгеймера.
Кроме того, аномальная аккумуляция АРР и β-амилоидного белка в мышечных волокнах влечёт за
собой патологию случайного миозита телец включений (IBM) (Askanas et al., Pros. Natl. Acad. Sci. USA
93, 1314-1319 (1996); Askanas et al., Current Opinion in Rheumathology 7, 486-496 (1995)). Соответственно,
соединения по изобретению можно применять профилактически или терапевтически при лечении нарушений, при которых бета-амилоидный белок аномально отлагается в не-нейрологических участках, например, для лечения IBM доставкой соединений к мышечным волокнам.
Кроме того, было показано, что Ар ассоциируется с аномальными внеклеточными отложениями,
известными как друзы, которые аккумулируются вдоль базальной поверхности ретинального пигментированного эпителия у субъектов с возрастной дегенерацией жёлтого пятна (AMD). AMD является причиной необратимой потери зрения у людей старшего возраста. Полагают, что отложение Аβ может являться важным компонентом локальных воспалительных событий, которые способствуют атрофии ретинального пигментированного эпителия, биогенезу друз и патогенезу AMD (Johnson, et al., Pros. Natl.
Acad. Sci. USA 99(18), 11830-5 (2002)).
Следовательно, настоящее изобретение относится к применению соединений Формулы V или других по данному описанию для предупреждения или лечения амилоидных заболеваний, включая, среди
прочих, болезнь Альцгеймера, церебральную амилоидную ангиопатию, лёгкую когнитивную недостаточность, миозит телец включений, синдром Дауна, дегенерацию жёлтого пятна, а также другие типы
амилоидоза, обусловленного IAPP (например, диабет), первичный (AL) амилоидоз, вторичный (АА)
амилоидоз и амилоидозы, обусловленные β2 микроглобулином (диализные).
При амилоидозе, связанном с диабетом Типа II (диабетическом) (IAPP), амилоидогенный белок
IAPP индуцирует токсичность островковых β клеток при объединении в олигомерные формы или в фибриллы. Следовательно, появление IAPP фибрилл в поджелудочной железе больных диабетом типа II способствует утрате островковых β клеток (Лангерганса) и дисфункции органа, которая ведёт к инсулинемии.
Известно, что обычно первичный амилоидоз (AL амилоид) ассоциирован с дискразией плазматических клеток и множественной миеломой. Его также можно наблюдать в качестве идиопатического заболевания.
Вторичный (АА) амилоидоз обычно наблюдается в связи с хронической инфекцией (такой как туберкулёз) или хроническим воспалением (таким как ревматоидный артрит).
Семейную форму вторичного амилоидоза наблюдают также при Семейной средиземноморской лихорадке (FMF).
Амилоидоз, обусловленный β2 микроглобулином (диализный), наблюдают у пациентов при продолжительном курсе гемодиализа. У больных, проходящих длительный курс гемодиализа, появляются
фибриллы из β2 микроглобулина в запястном туннеле и в тканях, обогащенных коллагеном, в некоторых
суставах. Это вызывает сильные боли, тугоподвижность и опухание суставов. Эти отложения вызваны
неспособностью сохранять низкие уровни β2М в плазме больных, подвергающихся гемодиализу. Повышенные концентрации белка β2М вызывают структурные изменения и могут привести к отложению модифицированного β2М в суставах в виде нерастворимых фибрилл.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению соединений Формулы V или других по данному
описанию для лечения амилоидных заболеваний. Для удобства некоторые определения или термины, на
которые есть ссылки в данном описании, представлены ниже.
Амилоидные заболевания
АА (Реактивный) амилоидоз
Обычно АА амилоидоз представляет собой проявление ряда заболеваний, которые вызывают продолжительную реакцию в острой фазе. Такие заболевания включают хронические воспалительные нарушения, хронические местные или системные микробные инфекции и злокачественные новообразования.
Наиболее обычную форму реактивного или вторичного (АА) амилоидоза наблюдают в результате продолжительных воспалительных состояний. Например, у больных ревматоидным артритом или семейной
средиземноморской лихорадкой (которая является генетическим заболеванием) может развиться АА
амилоидоз. Термины "АА амилоидоз" и "вторичный (АА) амилоидоз" применяются поочерёдно (взаимозаменяемо).
АА фибриллы обычно состоят из фрагментов размером 8000 Да (АА пептид или белок), образую-4-
019334
щихся при протеолитическом расщеплении сывороточного амилоидного протеина A (ApoSAA), циркулирующего аполипопротеина, который синтезируется, главным образом, в гепатоцитах в ответ на такие
цитокины, как IL-1, IL-6 и TNF. Секретированный ApoSAA образует комплексы с HDL. Отложение АА
фибрилл может быть распространено в организме, преимущественно в паренхимных органах. Обычно
местом, где находятся отложения, являются почки, также могут быть задеты печень и селезёнка. Отложение также наблюдают в сердце, желудочно- кишечном тракте и коже.
Основные заболевания, которые могут привести к развитию АА амилоидоза, включают, но без ограничения, воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, анкилоизирующий спондилоартрит, псориаз, псориатическая артропатия, синдром Рейтера, болезнь
Стилла у взрослых, синдром Бехчета и болезнь Крона. АА отложения также могут возникать в результате хронических микробных инфекций, таких как проказа, туберкулёз, бронхоэктаз, декубитальные язвы,
хронический пиелонефрит, остеомиелит и болезнь Уиппла. Некоторые злокачественные новообразования также могут вызвать отложения АА фибриллярного амилоидного белка. Эти злокачественные новообразования включают лимфому Ходжкина, рак почки, рак кишки, лёгкого и мочеполовой системы, базалиому и вилосистоклеточную лейкемию. Другими основными состояниями, которые могут обусловливать АА амилоидоз, являются болезнь Кастльмана и синдром Шнитцлера.
AL Амилоидоз (Первичный амилоидоз)
Отложение AL амилоида обычно связано почти с любой дискразией линии В лимфоцитов, от злокачественного развития плазматических клеток (множественная миелома) до доброкачественной моноклональной гаммапатии. Иногда присутствие амилоидных отложений может быть непосредственным
показателем основной дискразии. AL амилоидоз также подробно описан в Current Drug Targets, 2004, 5
159-171.
Фибриллы AL амилоидных отложений состоят из лёгких цепей моноклонального иммуноглобулина
или их фрагментов. Более конкретно, фрагменты образованы из N-концевого участка лёгкой цепи (каппа
или лямбда) и содержат целый вариабельный домен (VL) или его часть. Отложения встречаются, главным образом, в мезенхимных тканях, вызывая периферическую и автономную нейропатию, туннельный
запястный синдром, макроглоссию, рестриктивную кардиомиопатию, артропатию больших суставов,
иммунные дискразии, миеломы, а также дискразии неизвестного происхождения. Однако следует отметить, что могут быть затронуты почти все ткани, в особенности внутренние органы, такие как почка, печень, селезёнка и сердце.
Наследственные системные амилоидозы
Существует множество форм наследственного системного амилоидоза. Хотя они являются относительно редко встречающимися состояниями, симптомы у взрослых и характер их наследования (обычно
аутосомно-доминантный) приводят к закреплению (устойчивости) таких нарушений в целой популяции.
Синдромы вызваны, главным образом, точковыми мутациями в белке-предшественнике, которые приводят к вариантным амилоидогенным пептидам или белкам. В табл. 1 дан состав фибрилл типичных форм
таких нарушений.
-5-
019334
Таблица 1. Состав фибрилл типичных амилоидных заболеваний
Данные взяты из Tan SY, Pepys MB. Amyloidosis. Histopathology, 25(5), 403-414 (Nov 1994),
WHO/IUIS Nomenclature Subcommittee, Nomenclature of Amyloid and Amyloidosis. Bulletin of the World
Health Organization 1993; 71: 10508; и Merlini et. al., Clin Chem Lab Med 2001; 39(11): 1065-75
Данные в табл. 1 приведены в качестве примеров и не претендуют на ограничение объёма изобретения. Например, описано более 40 отдельных точковых мутаций в гене транстиретина, каждая из которых даёт клинически сходные формы семейной амилоидной полинейропатии.
Как правило, любое наследственное амилоидное нарушение может встречаться также в спорадической форме, и как наследственная, так и спорадическая (случайная) форма заболевания имеют одинаковые особенности в том, что касается амилоида. Например, наиболее распространённая форма вторичного
АА амилоидоза встречается случайно, например, как результат постоянного воспаления, и не связан с
-6-
019334
семейной средиземноморской лихорадкой. Таким образом, общие сведения, касающиеся наследственных
амилоидных нарушений, можно также отнести к спорадическим (случайным) амилоидозам.
Транстиретин (TTR) представляет собой белок протяжённостью 14 кДа, который иногда называют
преальбумин. Он продуцируется печенью и сосудистым сплетением и функционирует в процессе транспорта тироидных гормонов и витамина А.
По меньшей мере 50 вариантных форм белка, каждый из которых характеризуется единственной
аминокислотной заменой, ответственны за различные формы семейной амилоидной полинейропатии.
Например, замена пролин вместо лейцина в положении 55 приводит, главным образом, к прогрессирующей форме нейропатии; замена лейцина на метионин в положении 111 вызывает тяжёлую кардиопатию у
голландских пациентов.
На амилоидных отложениях, выделенных из тканей сердца пациентов с системным амилоидозом,
видно, что отложения состоят из гетерогенной смеси TTR и его фрагментов, в целом называемых ATTR,
полноразмерные последовательности которых охарактеризованы. Компоненты ATTR фибрилл можно
извлечь (экстрагировать) из таких бляшек и методами, известными в уровне техники, можно определить
их структуру и последовательность (например, Gustavson A., et al., Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995;
Kametani F., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 22-628, 1984; Pras, M., et al., PNAS 80: 539-42,
1983).
У людей с точковыми мутациями в молекуле аполипопротеина А1 (например, Gly→Arg26;
Trp→Arg50; Leu→Arg60) наблюдается форма амилоидоза ("тип Östertag"), характеризующаяся отложениями белка аполипопротеина AI или его фрагментов (AapoAI). У этих больных наблюдаются низкие
уровни липопротеина высокой плотности (HDL) и периферическая нейропатия или почечная недостаточность.
Мутация в альфа цепи фермента лизоцима (например, Ile→Thr56 или Asp→His57) лежит в основе
другой формы не-нейропатического наследственного амилоида типа Östertag, наблюдаемого в английских семьях. В данном случае отлагаются фибриллы мутантного белка лизоцима (Alys), и у пациентов,
как правило, наблюдается недостаточность почечной функции. Этот белок, в отличие от большинства
белков, образующих фибриллы, по данному описанию, обычно присутствует в полной (нефрагментированной) форме (Benson M. D., et al. CIBA Fdn. Symp. 199: 104-131, 1996).
Лёгкие цепи иммуноглобулинов имеют тенденцию образовывать агрегаты различной морфологии,
включая фибриллярную (например, AL амилоидоз и АН амилоидоз), гранулярную (например, болезнь
лёгких цепей (БЛЦ, LCDD), болезнь тяжёлых цепей (БТЦ, HCDD) и болезнь лёгких-тяжёлых цепей
(БЛТЦ, LHCDD)), кристаллическую (например, приобретённый синдром Фаркони) и микротубулярную
(например, криоглобулинемия). Образование нерастворимых фибрилл лёгких цепей и тяжёлых цепей
иммуноглобулинов и/или их фрагментов является показателем AL и АН амилоидоза, соответственно. В
AL фибриллах лямбда (λ) цепи, такие как λ VI цепи (λ6 цепи), обнаружены в более высоких концентрациях, чем каппа (κ) цепи. Merlini et al., Clin Chem Lab Med 39(11): 1065-75 (2001). Амилоидоз тяжёлых
цепей (АН) характеризуется агрегатами амилоидных белков гамма цепи IgGl подкласса. Eulitz et al., Proc
Natl Acad Sci USA 87: 6542-46 (1990).
Сравнение амилоидогенных лёгких цепей с неамилоидогенными показало, что первые могут включать замены, которые, по-видимому, дестабилизируют скручивание белка или стимулируют агрегацию.
AL и LCDD были определены из других амилоидных заболеваний благодаря их относительно малой популяции моноклональных лёгких цепей, которые образуются за счёт неопластического роста продуцирующей антитело В клетки. Как правило, AL агрегаты представляют собой хорошо организованные
фибриллы лямбда цепей. Агрегаты LCDD являются относительно аморфными агрегатами как каппа, так
и лямбда цепей, в основном каппа, иногда κIV. Bellotti et al., Journal of Structural Biology 13: 280-89
(2000). Сравнение амилоидогенных и не- амилоидогенных тяжёлых цепей у пациентов с АН амилоидозом выявило недостающие и/или изменённые компоненты. Eulitz et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 654246 (1990) (патогенные тяжёлые цепи, отличающиеся значительно более низкой молекулярной массой,
чем не-амилоидогенные тяжёлые цепи); и Solomon et al., Am J Hemat 45(2) 171-6 (1994) (амилоидогенные
тяжёлые цепи, отличающиеся тем, что состоят исключительно из VH-D участка не-амилоидогенной тяжёлой цепи).
Следовательно, возможные способы обнаружения и мониторинга лечения субъектов с повышенным
риском наличия AL, LCDD, АН и т.п. включают, но без ограничения, иммуноанализ плазмы или мочи на
присутствие или пониженное отложение амилоидогенных лёгкой или тяжёлой цепей, например амилоида λ, амилоида κ, амилоида κVI, амилоида γ или амилоида γ1.
Амилоидоз мозга
Наиболее часто встречающийся тип амилоида в мозге состоит, главным образом, из Аβ пептидных
фибрилл, приводящих к деменции, ассоциированной со случайной (не наследственной) болезни Альцгеймера. На самом деле, частота спорадической (случайной) болезни Альцгеймера значительно превышает формы, которые, как показано, являются наследственными. Тем не менее, фибриллярные пептиды,
образующие бляшки, у обоих типов очень похожи. Амилоидоз мозга включает такие заболевания, со-7-
019334
стояния, патологии и другие аномалии структуры или функции мозга, включая его компоненты, причиной которых является амилоид. Областью мозга, поражённой амилоидным заболеванием, может быть
строма, включающая сосудистую сеть, или паренхима, включающая функциональные или анатомические области, или их нейроны. Больному необязательно поставлен точный диагноз конкретного определённого амилоидного заболевания. Термин "амилоидное заболевание (заболевание, связанное с амилоидом)" включает амилоидоз мозга.
β-амилоидный пептид ("АР") представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, образующийся протеолизом большого белка, известного как бета- амилоидный белок-предшественник ("РАРР"). Мутации в
РАРР вызывают семейные формы болезни Альцгеймера, синдром Дауна, церебральную амилоидную
ангиопатию и старческую деменцию, характеризующуюся церебральным отложением бляшек, состоящих из Аβ фибрилл и других компонентов, которые более подробно описаны ниже. Известные мутации в
АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, происходят непосредственно близ сайтов расщепления
β или γ секретазой или в Аβ. Например, положение 717 - ближайшее к сайту расщепления гаммасекретазой АРР при его процессировании в Аβ, а положения 670/671 - ближайшие к сайту расщепления
β-секретазой. Мутации в любом из этих остатков могут привести к болезни Альцгеймера, предположительно, за счёт повышение количества формы Аβ из 42/43 аминокислот, образующейся из АРР. Семейная форма болезни Альцгеймера составляет только 10% испытуемой популяции. Большинство случаев
болезни Альцгеймера являются спорадическими, в которых АРР и Аβ не содержат никакой мутации.
Структура и последовательность Аβ пептидов различной длины общеизвестны в уровне техники. Такие
пептиды можно получать методами, известными в технике, или можно выделить из мозга известными
методами (например, Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129, 885-90 (1984); Glenner and
Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 122, 1131-35 (1984). Кроме того, различные формы пептидов являются продажными. АРР экспрессируется и конститутивно катаболизируется в большинстве клеток. Повидимому, доминантный катаболитический путь представляет собой расщепление АРР внутри последовательности Аβ ферментом, предварительно названным α-секретазой, который приводит к высвобождению растворимого фрагмента эктодомаина, известного как APPsα. Это расщепление мешает образованию Аβ пептида. В отличие от этого не-амилоидогенного каскада реакций АРР может также расщепляться ферментами, известными как β- и γ-секретаза, по N- и С-концам Аβ, соответственно, с последующим выделением Аβ во внеклеточное пространство. К настоящему времени ВАСЕ идентифицирован как
β-секретаза (Vasser, et al. Science 286: 735- 741, 1999), а пресенилины связаны с активностью γ-секретазы
(De Strooper et al., Nature 391, 387-90 (1998)). Аβ пептид, содержащий 39-43 аминокислоты, продуцируется при последовательном протеолитическом расщеплении амилоидного белка- предшественника (АРР)
β- и γ-секретазами. Хотя преимущественно продуцируется Аβ40 форма, 5-7% тотального Аβ существует
в виде Аβ42 (Cappai et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 31. 885-89 (1999)).
По-видимому, длина Аβ-пептида решающим образом изменяет его биохимические/биофизические
свойства. Конкретно, дополнительные две аминокислоты на С-конце Аβ42, являясь сильно гидрофобными, по-видимому, повышают предрасположенность Аβ42 к агрегации. Например, Jarrett, et al. показали,
что Аβ42 агрегируется очень быстро in vitro по сравнению с Аβ40, это наводит на мысль, что более протяжённые формы Аβ могут быть важными патологическими белками, которые участвуют в начальном
посеве нейритных бляшек при болезни Альцгеймера (Jarrett et al., Biochemistry 32, 4693-97 (1993); Jarrett,
et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 695, 144-48 (1993)). Эта гипотеза дополнительно подтверждается недавними
анализами вклада конкретных форм Аβ в генетических семейных формах болезни Альцгеймера ("FAD").
Например, мутантная форма АРР (APPV7171) "Лондон", связанная с FAD, селективно повышает продуцирование Аβ 42/43 форм по сравнению с Аβ 40 (Suzuki et al., Science 264, 1336-40 (1994)), тогда как мутантная форма АРР "Шведский" (APPK670N/M671L) повышает уровни как Аβ40, так и Аβ42/43 (Citron
et al., Nature 360, 672-674 (1992); Cai et al., Science 259, 514-16, (1993)). Также наблюдали, что FADсвязанные мутации в генах пресенилин-1 ("PS1) или пресенилин-2 ("PS2") приводит к селективному повышению продуцирования Аβ42/43, но не Аβ40 (Borchelt, et al., Neuron 17, 1005-13 (1996)). Это открытие
подтверждено на трансгенных мышиных моделях, экспрессирующих PS мутанты, которые демонстрируют селективное увеличение в мозге Аβ42 (Borchelt, см. выше; Duff, et al., Neurodegeneration 5(4), 29398 (1996)). Таким образом, основной гипотезой об этиологии болезни Альцгеймера является то, что увеличение концентрации Аβ42 в мозге вследствие повышенного продуцирования и выделения Аβ42, либо
пониженного клиренса (расщепление или клиренс из тканей мозга) - событие, являющееся причиной
патологии заболевания.
Многие сайты мутации либо в Аβ, либо в АРР гене были идентифицированы и клинически ассоциированы либо с деменцией, либо с церебральной геморрагией.
Типичные САА нарушения включают, но без ограничения, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом исландского типа (HCHWA-I); голландский вариант HCHWA (HCHWA-D; мутация в
Аβ); фламандскую мутацию Аβ; арктическую мутацию Аβ; итальянскую мутацию Аβ; мутацию Аβ вариант Айова; семейную британскую деменцию; и семейную датскую деменцию. САА также может быть
-8-
019334
спорадическим (случайным).
Применяемые в данном описании термины "β амилоид", "амилоид-β" и т.п., если не указано иначе,
относятся к белкам и пептидам β амилоида, амилоидным β белкам- или пептидам-предшественникам, их
интермедиатам и модификациям и фрагментам. В частности, "Аβ" относится к любому пептиду, продуцированному протеолитическим процессированием генного продукта АРР, особенно к пептидам, которые ассоциированы с амилоидными патологиями, включая Аβ1-39, Аβ1-40, Аβ1-41, Аβ1-42 и Аβ1-43.
Для удобства номенклатуры "Аβ1-42" может в данном описании называться "Аβ(1-42)" или просто
"Аβ42" или "Аβ42" (и аналогично для любых других амилоидных пептидов, обсуждаемых в данном описании). Применяемые в данном описании термины "β амилоид", "амилоид-β" и "аβ" являются синонимами.
Если не указано иначе, термин "амилоид" относится к амилоидогенным белкам, пептидам или их
фрагментам, которые могут быть растворимыми (например, мономерными или олигомерными) или нерастворимыми (например, имеющими фибриллярную структуру или находящимися в виде амилоидных
бляшек). См, например, М. Р. Lampert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6448-53 (1998). "Амилоидоз"
или "амилоидное заболевание" или "заболевание, связанное с амилоидом" относится к патологическому
состоянию, отличающемуся присутствием амилоидных волокон. "Амилоид" является родовым термином, относящимся к группе различных, но специфичных белковых отложений (внутриклеточных или
внеклеточных), которые наблюдаются при многих различных заболеваниях. Встречаясь в различных
местах, все амилоидные отложения имеют общие морфологические свойства, окрашиваются специфичными красителями (например, Конго красным) и после окрашивания имеют характерное красно- зелёное
двойное лучепреломление в поляризованном свете. Они также имеют общие обычные ультраструктурные признаки и обычные рентгеновские и ИК-спектры.
Гельсолин является связывающим кальций белком, который связывается с фрагментами и филаментами актина. Мутации в положении 187 (например, Asp→Asn; Asp→Tyr) белка приводят к форме
наследственного системного амилоидоза, обычно обнаруживаемого у пациентов из Финляндии, а также
у выходцев из Голландии и Японии. У поражённых болезнью людей фибриллы, образованные из фрагментов гельсолина (Agel), обычно состоят из аминокислот 173-243 (карбоксиконцевой фрагмент длиной
68 кДа) и отлагаются в кровеносных сосудах и базальных мембранах, вызывая корнеальную дистрофию
и краниальную нейропатию, которая прогрессирует в периферическую нейропатию, дистрофические
кожные изменения и отложения в других органах (Kangas, H., et al. Human Mol. Genet. 5(9): 1237-1243,
1996).
Другие мутантные белки, такие как мутантная альфа цепь фибриногена (AfibA) и мутантный цистатин С (Acys), также образуют фибриллы и вызывают характерные наследственные нарушения. Фибриллы AfibA образуют отложения, характерные для наследственной церебральной амилоидной ангиопатии,
обнаруженной в Исландии (Isselbacher, Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson et al.). Показано, что, по меньшей мере, в нескольких случаях у пациентов с церебральной амилоидной ангиопатией (САА) имеются амилоидные фибриллы, содержащие не- мутантную
форму цистатина С, связанную с бета-амилоидным белком (Nagai A., et al. Molec. Chem. Neuropathol. 33:
63-78, 1998).
В настоящее время считают, что некоторые формы прионного заболевания, которые ранее полагали
преимущественно инфекционными по своей природе, являются наследственными, насчитывающими до
15% случаев. (Baldwin, et al., в Research Advances in Alzheimer Disease and Related Disorders, John Wiley
and Sons, New York, 1995). При наследственных и случайных (спорадических) прионных заболеваниях у
больных появляются бляшки, состоящие из аномальных изоформ нормального прионного белка (PrPSc).
Преимущественная мутантная изоформа, PrPSc, также называемая AScr, отличается от нормального
клеточного белка своей резистентностью к расщеплению протеазой, нерастворимостью после экстракции
детергентом, отложением во вторичных лизосомах, пост- трансляционным синтезом и высоким содержанием β-складок. Генетическая связь установлена, по меньшей мере, для пяти мутаций, вызывающих
болезнь Крейтцфельда-Якоба (CJD), синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (GSS) и летальную
семейную бессонницу (FFI). (Baldwin, см. выше). Способы извлечения фибриллярных пептидов из фибрилл скрепи, определение последовательностей и получение таких пептидов известны в технике (например, Beekes, M., et al. J. Gen. Virol. 76: 2567-76, 1995).
Например, одна форма GSS связана с PrP мутацией в кодоне 102, тогда как GSS конечного мозга
отличается мутацией в кодоне 117. Мутации в кодонах 198 и 218 приводят к появлению формы GSS, при
которой нейритные бляшки, характерные для болезни Альцгеймера, содержат PrP вместо Аβ пептида.
Некоторые формы семейной CJD ассоциируются с мутациями в кодонах 200 и 210; мутации в кодонах
129 и 178 обнаружены как при семейной CJD, так и при FFI. (Baldwin, см. выше).
Церебральный амилоидоз (амилоидоз мозга)
Локальное отложение амилоида обычно встречается в мозге, в частности, у людей старшего возраста. Наиболее часто встречающийся тип амилоида в мозге состоит, главным образом, из Аβ-пептидных
фибрилл, которые вызывают деменцию или спорадическую (случайную, ненаследственную) болезнь
-9-
019334
Альцгеймера. Наиболее часто встречаются случаи спорадического, а не наследственного церебрального
амилоидоза. Например, частота случайной болезни Альцгеймера и случайной САА значительно превышает частоту семейной AD и семейной САА. Кроме того, случайные и семейные формы заболевания
нельзя отличить друг от друга (они отличаются только наличием или отсутствием наследственной генетической мутации); например, клинические симптомы и амилоидные бляшки, образующиеся как при
случайной, так и при семейной AD, очень похожи, если не идентичны.
Церебральная амилоидная ангиопатия (САА) относится к специфичному отложению амилоидных
фибрилл на стенках лептоменингеальной и кортикальной артерий, артериол и вен. Её обычно ассоциируют с болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна и обычным старением, а также с рядом семейных состояний, связанных с ударом или деменцией (см. Frangione et al., Amiloid: J. Protein Folding Disord. 8,
Suppl. 36-42 (2001)). САА может быть спорадической (случайной) или семейной.
Старческий(сенильный) системный амилоидоз
Амилоидные отложения, либо системные, либо очаговые, увеличиваются с возрастом. Например,
фибриллы транстиретина (TTR) дикого типа обычно обнаруживают в тканях сердца старых людей. Они
могут быть бессимптомными, клинически скрытыми, или могут вызывать сердечную недостаточность.
Бессимптомные фибриллярные очаговые отложения могут находиться в мозге (Аβ), крахмалистом теле
простаты (β2 микроглобулин), суставах и семенных пузырьках.
Диализный амилоидоз
Бляшки, состоящие из фибрилл β2 микроглобулина (β2М), обычно появляются у пациентов, проходящих длительный курс гемодиализа или перитонеального диализа. β2 микроглобулин представляет собой полипептид длиной 11.8 кДа и является лёгкой цепью антигенов Класса I MHC, которые присутствуют во всех ядерных клетках. В нормальных обстоятельствах β2М обычно находится во внеклеточном
пространстве, если нет почечной недостаточности, в этом случае β2М переносится в ткани, где он полимеризуется с образованием амилоидных фибрилл. Недостаточный клиренс, как в случае почечной недостаточности, приводит к отложению в запястном туннеле и других местах (главным образом, в богатых
коллагеном тканях суставов). В отличие от других фибриллярных белков молекулы β2М не продуцируются при расщеплении более протяжённого белка-предшественника и обычно присутствуют в нефрагментированной форме в фибриллах. (Benson, см. выше). Показано, что сохранение и аккумуляция этого
амилоидного белка-предшественника является основным патогенным процессом, лежащим в основе
DRA. DRA характеризуется остеоартропатией периферических суставов (например, тугоподвижностью
суставов, болью, опуханием и т.д.). Изоформы β2М, гликированный β2М или полимеры β2М в ткани являются наиболее амилоидогенной формой (в противоположность нативному β2М). В отличие от других
типов амилоидоза β2М в основном ограничивается костно-суставными тканями. Висцеральные отложения наблюдаются редко. Изредка эти отложения могут находиться в кровеносных сосудах и других важных анатомических положениях.
Несмотря на усовершенствованные с точки зрения удаления β2М методы диализа, у большинства
пациентов наблюдаются высокие концентрации β2М в плазме, которые остаются значительно выше нормы. Эти повышенные концентрации β2М обычно вызывают диабетический амилоидоз (DRA) и сопутствующее распространение заболевания, ведущее к смерти.
Островковый амилоидный полипептид и диабет
Гиалиноз островков (амилоидное отложение) описан впервые более века назад как присутствие агрегатов фиброзного белка в поджелудочной железе больных тяжёлой гипергликемией (Opie E. L., J. Exp.
Med. 5: 397-428, 1901). В настоящее время островковый амилоид, состоящий преимущественно из островкового амилоидного полипептида (IAPP), или амилина, является характерным гистопатологическим
маркёром более чем в 90% случаев диабета типа II (также известного как инсулиннезависимый диабет,
или NIDDM). Эти фибриллярные скопления возникают в результате агрегации островкового амилоидного полипептида (LAPP), или амилина, который представляет собой пептид из 37 аминокислот, образующийся из более протяжённого пептида- предшественника, называемого (про)Pro-IAPP.
IAPP секретируется вместе с инсулином в ответ на стимуляторы секреции β-клетками. Этот патологический признак не ассциирован с инсулинзависимым (Типа I) диабетом и является общим (объединяющим) характерным признаком для гетерогенных клинических фенотипов, диагностированных как
NIDDM.
Продолжительные исследования на кошках и иммуноцитохимические исследования на обезьянах
показали, что прогрессирующее увеличение островкового амилоида связано с резким уменьшением популяции секретирующих инсулин β-клеток и увеличивает тяжесть заболевания. Поздние трансгенные
исследования подтвердили связь между образованием IAPP бляшек и апоптозом β-клеток и дисфункцией, это показывает, что амилоидное отложение является главным фактором, определяющим повышение
тяжести диабета Типа II.
Также было показано, что IAPP индуцирует токсичность островковых β-клеток in vitro, указывая,
что появление IAPP фибрилл в поджелудочной железе больных диабетом Типа II и Типа I (пост- 10 -
019334
трансплантация островков) может способствовать утрате островковых β-клеток (Лангерганса) и дисфункции органа. У больных диабетом Типа II накопление IAPP в поджелудочной железе вызывает образование олигомерного IAPP, приводя к созданию IAPP- амилоида в виде нерастворимых отложений, которые в конечном счёте разрушают продуцирующие инсулин β-клетки островков, вызывая истощение и
недостаточность β клеток. (Westermark, P., Grimelius, L., Acta Path. Microbiol. Scand., sect. A. 81: 291- 300,
393; de Koning, EJP., et al., Diabetologia 36: 378-384, 1993; и Lorenzo, A., et al., Nature 368: 756-760, 1994).
Аккумуляция IAPP в виде фиброзных отложений также может оказывать влияние на обычное отношение
про-IAPP к IAPP в плазме, повышая это отношение за счёт попадания (захвата) IAPP в отложения.
Уменьшение массы β клеток может проявляться в виде гипергликемии и инсулинемии. Эта потеря массы
β- клеток может привести к необходимости лечения инсулином.
Заболевания, вызванные гибелью или недостаточным функционированием конкретного типа или
конкретных типов клеток можно лечить трансплантацией пациенту здоровых клеток релевантного типа.
Этот метод был использован для лечения больных диабетом Типа I. Часто островковые клетки поджелудочной железы донора выращивают in vitro перед трансплантацией для того, чтобы использовать их после выделения для лечения, или для того, чтобы уменьшить их иммуногенность. Однако во многих случаях трансплантация островковых клеток не является успешной вследствие гибели трансплантированных
клеток. Одной из причин такой малой доли успешных попыток является IAPP, который объединяется в
токсические олигомеры. Токсическое действие может возникать вследствие внутриклеточной и внеклеточной аккумуляции фибриллярных олигомеров. Олигомеры IAPP могут образовывать фибриллы и становиться токсическими в отношении клеток in vitro. Кроме того, IAPP фибриллы, по-видимому, продолжают расти после трансплатации клеток и вызывают гибель или дисфункцию клеток. Это может происходить даже когда в клетках здорового донора и у получающего трансплантат пациента не наблюдается
болезнь, характеризующаяся присутствием фибрилл. Например, соединения по настоящему изобретению
можно использовать для получения тканей или клеток для трансплантации по методу, описанному в
Международной заявке (РСТ) WO 01/003680.
Соединения по изобретению могут также стабилизировать отношение концентраций ProIAPP/IAPP, проинсулин/инсулин и уровни С-пептида. Помимо этого в качестве биологических маркёров
эффективности, результатов различных тестов, таких как тест секреции аргинина- инсулина, тест переносимости глюкозы и тесты чувствительности, все могут использоваться в качестве маркёров пониженной массы β-клеток и/или аккумуляции амилоидных отложений. Такой класс лекарственных препаратов
можно использовать вместе с другими лекарственными веществами, нацеленными на резистентность к
инсулину, продуцирование печёночной глюкозы. Такие соединения могут предупреждать терапию инсулином, сохраняя функцию β-клеток, и могут применяться для сохранения трансплантантов островков.
Амилоидоз гормонального происхождения
Эндокринные органы могут накапливать амилоидные отложения, в особенности у старых людей.
Опухоли, секретирующие гормоны, могут также содержать амилоидные бляшки гормонального происхождения, фибриллы которых состоят из полипептидных гормонов, таких как кальцитонин (медуллярный рак щитовидной железы) предсердный натриуретический пептид (выделенный амилоидоз предсердий). Последовательности и структуры этих белков хорошо известны в уровне техники.
Смешанный амилоидоз
Существует множество других форм амилоидного заболевания, которые обычно проявляются как
локализованные отложения амилоида. Эти заболевания являются результатом, главным образом, локализованным продуцированием или отсутствием катаболизма конкретных фибриллярных предшественников
или предрасположением конкретной ткани (такой как суставная) к фибриллярному отложению. Примеры
такого идиопатического отложения включают узелковый AL амилоид, кожный амилоид, эндокринный
амилоид и амилоид, связанный с опухолью. Другие заболевания, связанные с амилоидом, включают заболевания, описанные в табл. 1, такие как семейная амилоидная полинейропатия (FAP), старческий (сенильный) системный амилоидоз, тендовагинит, семейный амилоидоз, типа Остертаг, ненейропатический амилоидоз, краниальную нейропатию, наследственную церебральную геморрагию,
семейную деменцию, хронический диализ, семейную болезнь Крейтцфельда-Якоба; синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, наследственный губчатый энцефалит, прионные заболевания, семейную средиземноморскую лихорадку, синдром Макла-Уэльса, нефропатию, глухоту, крапивницу, боль в конечностях, кожные отложения, множественную миелому, доброкачественную моноклональную гаммапатию,
макроглобулинемию, амилоидоз, обусловленный миеломой, медуллярный рак щитовидной железы, изолированный амилоидоз предсердий и диабет.
Соединения по изобретению можно применять терапевтически или профилактически для лечения
заболеваний, ассоциированных с образованием, агрегацией или отложением амилоидных фибрилл, вне
зависимости от клинической картины. Соединения по изобретению могут облегчать течение амилоидного заболевания по любому из приведённых ниже механизмов, но без ограничения: замедление скорости
образования или отложения амилоидных фибрилл; уменьшение степени амилоидного отложения;
уменьшение степени амилоидного образования; ингибирование, уменьшение или предупреждение обра- 11 -
019334
зования амилоидных фибрилл; ингибирование воспаления, индуцированного амилоидом; повышение
клиренса амилоида, например, из мозга; или защита клеток от индуцированной амилоидом (олигомерным или фибриллярным) токсичности.
В одном варианте изобретения соединения по изобретению можно применять терапевтически или
профилактически для лечения заболеваний, ассоциированных с образованием, агрегацией или отложением β-амилоидных фибрилл. Соединения по изобретению могут облегчать течение заболевания, связанного с β-амилоидом, по любому из приведённых ниже механизмов (предполагается, что этот перечень является иллюстративным и не лимитирующим): замедление скорости образования или отложения βамилоидных фибрилл; уменьшение степени β-амилоидного отложения; ингибирование, уменьшение или
предупреждение образования β-амилоидных фибрилл; ингибирование нейродегенерации или клеточной
токсичности, вызванной β-амилоидом; ингибирование воспаления, индуцированного β-амилоидом; повышение клиренса β-амилоида из мозга; или содействие расщеплению (разрушению) Аβ.
Соединения по изобретению могут быть эффективны при контроле β-амилоидного отложения либо
после их проникновения в мозг (после прохождения через гематоэнцефалический барьер), либо с периферии. При действии с периферии соединение может изменять равновесие Аβ между мозгом и плазмой
таким образом, чтобы содействовать удалению Аβ из мозга. Увеличение выхода Аβ из мозга приводит к
понижению концентрации Аβ в мозге и, следовательно, способствует уменьшению Аβ отложения. Кроме
того, соединения, которые проникают в мозг, могут регулировать отложение, действуя непосредственно
на Аβ в мозге, например, сохраняя его в нефибриллярной форме или способствуя его клиренсу из мозга.
Соединения могут замедлять процессирование АРР; могут увеличивать расщепление при использовании
макрофагов или нейронных клеток; или могут снижать продуцирование Аβ активированной микроглией.
Эти соединения могли бы также предупреждать взаимодействие Аβ в мозге с клеточной поверхностью и,
следовательно, предупреждать нейротоксичность, нейродегенерацию и воспаление.
В предпочтительном варианте изобретения применяется способ лечения болезни Альцгеймера (например, спорадической или семейной AD). Способ также можно применять профилактически ли терапевтически для лечения других клинических случаев β-амилоидного отложения, таких как у больных с
синдромом Дауна и у больных церебральной амилоидной ангиопатией ("САА") или у больных с наследственной церебральной геморрагией, или больных ранней болезнью Альцгеймера.
В другом варианте изобретения применяют способ лечения лёгкой когнитивной недостаточности.
Лёгкая когнитивная недостаточность ("MCI") представляет собой состояние, характеризующееся лёгкой,
но заметной утратой мыслительных способностей, которая необязательно связана с наличием деменции.
MCI часто, но не всегда, предшествует болезни Альцгеймера.
Кроме того, аномальная аккумуляция АРР и β-амилоидного белка в мышечных волокнах влечёт за
собой патологию случайного миозита телец включений (IBM) (Askanas et al., Pros. Nail. Acad. Sci. USA
93, 1314-1319 (1996); Askanas et al., Current Opinion in Rheumathology 7, 486-496 (1995)). Соответственно,
соединения по изобретению можно применять профилактически или терапевтически при лечении нарушений, при которых бета-амилоидный белок аномально отлагается в ненейрологических участках, например, для лечения IBM доставкой соединений к мышечным волокнам.
Кроме того, было показано, что Аβ ассоциируется с аномальными внеклеточными отложениями,
известными как друзы, которые аккумулируются вдоль базальной поверхности ретинального пигментированного эпителия у субъектов со старческой дегенерацией жёлтого пятна (ARMD). ARMD является
причиной необратимой потери зрения у людей старшего возраста. Полагают, что отложение Аβ может
являться важным компонентом локальных воспалительных событий, которые способствуют атрофии
ретинального пигментированного эпителия, биогенезу друз и патогенезу ARMD (Johnson, et al., Pros.
Natl. Acad. Sci. USA 99(18), 11830-5 (2002)).
В другом варианте изобретение относится к способу лечения или предупреждения амилоидного заболевания у субъекта (предпочтительно, у человека), заключающемуся в введении субъекту терапевтического количества соединения формулы V или иным образом представленного в данном описании, так
что уменьшается или ингибируется образование или отложение фибрилл, нейродегенерация или клеточная токсичность. В другом варианте изобретение относится к способу лечения или предупреждения амилоидного заболевания у субъекта (предпочтительно, у человека), заключающемуся в введении субъекту
терапевтического количества соединения формулы V или иным образом представленного в данном описании, так что у пациентов с амилоидозом мозга, например, у больных болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна или церебральной амилоидной ангиопатией, когнитивная функция повышается или стабилизируется или дальнейшее ухудшение когнитивной функции предупреждается, замедляется или прекращается. Эти соединения могут также повысить качество повседневной жизни этих субъектов.
Терапевтические соединения по изобретению могут лечить амилоидоз, связанный с диабетом типа
II, например, стабилизируя гликемию, предупреждая или уменьшая потерю Р-клеточной массы, снижая
или предупреждая гипергликемию вследствие потери β-клеточной массы, и модулируя (например, повышая или стабилизируя) продуцирование инсулина. Соединения по изобретению могут также стабили- 12 -
019334
зировать отношение концентраций про-IAPP/IAPP.
Терапевтические соединения по изобретению могут лечить АА (вторичный) амилоидоз и/или AL
(первичный) амилоидоз, стабилизируя почечную функцию, снижая протеинурию, повышая клиренс
креатинина (например, по меньшей мере на 50% и более или по меньшей мере на 100% и более), способствуя ремиссии хронической диареи или прибавке в весе (например, на 10% или более) или снижая сывороточный креатинин. Можно также уменьшить висцеральное содержание амилоида, определяемое,
например, SAP сцинтиграфией.
Соединения по изобретению
Настоящее изобретение относится, по меньшей мере, частично, к применению некоторых химических соединений (и их фармацевтических препаратов) для предупреждения или лечения амилоидных
заболеваний, включая, среди прочего, болезнь Альцгеймера, церебральную амилоидную ангиопатию,
миозит телец включений, синдром Дауна, амилоидоз, связанный с диабетом, амилоидоз, связанный с
гемодиализом β2М), первичный амилоидоз (например, связанный с λ или κ цепью), семейную амилоидную полинейропатию (FAP), старческий (сенильный) системный амилоидоз, семейный амилоидоз, типа
Остертаг не- нейропатический амилоидоз, краниальную нейропатию, наследственную церебральную
геморрагию, семейную деменцию, хронический диализ, семейную болезнь Крейтцфельда-Якоба; синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, наследственный губчатый энцефалит, прионные заболевания,
семейную средиземноморскую лихорадку, синдром Макла-Уэльса, нефропатию, глухоту, крапивницу,
боль в конечностях, кардиомиопатию, кожные отложения, множественную миелому, доброкачественную
моноклональную гаммапатию, макроглобулинемию, амилоидоз, обусловленный миеломой, медуллярный
рак щитовидной железы и изолированный амилоидоз предсердий.
Химические структуры по данному описанию изображены в соответствии с известными в технике
стандартами. Поскольку атом, такой как углеродный атом, так как он изображён, имеет недостающую
валентность, предполагается, что эта валентность связана с водородом, даже если этот атом водорода не
обязательно изображён. Структуры некоторых соединений по данному изобретению включает стереогенные атомы углерода. Следует отдавать отчёт, что изомеры, возникающие вследствие такой асимметрии (например, все энантиомеры и диастереомеры), входят в объём настоящего изобретения, если не указано иначе. Т.е., если не указано иначе, любой хиральный углеродный центр может иметь либо (R)- или
(S)-стереохимию. Такие изомеры можно получать в практически чистом виде классическими методами
разделения или с помощью стереохимически контролируемого синтеза. Кроме того, когда это целесообразно, алкены могут иметь либо Е-, либо Z-геометрию. Помимо этого, соединения по настоящему изобретению могут существовать в несольватированной, а также в сольватированной с помощью соответствующих растворителей, таких как вода, ТГФ, этанол и т.п., форме. В целом сольватированные формы
считаются эквивалентными несольватированным формам для целей настоящего изобретения.
Термин "малая молекула" относится к соединению, которое, само по себе, не является продуктом
генной транскрипции или трансляции (например, белком, РНК или ДНК) и предпочтительно имеет низкую молекулярную массу, например менее примерно 2500 а.е.м.
Термин "нуклеофил" является обычно общепринятым в технике термином для обозначения химической группы, содержащей реакционноспособную пару электронов, которая реагирует с соединением,
замещая уходящую группу (обычно другой нуклеофил), как это обычно происходит в химии алифатических соединений по мономолекулярному (известному как "SN1") ИЛИ бимолекулярному ("SN2") механизму. Примеры нуклеофилов включают не несущие заряд соединения, такие как амины, меркаптаны и
спирты, и группы, имеющие заряд, такие как алкоксиды, тиолаты, карбанионы и ряд органических и неорганических анионов. Примеры анионных нуклеофилов включают, среди прочих, простые анионы, такие как азид, цианид, тиоцианат, формиат или хлорформиат и бисульфит. Металлоорганические реагенты, такие как медьорганические, цинкорганические, литийорганические соединения, реагенты Гриньяра,
еноляты и ацетилиды, которые в соответствующих условиях являются подходящими нуклеофилами.
Аналогично, термин "электрофил" означает атом, молекулу или ион, способные принимать электронную пару, в частности пару электронов от нуклеофила, как это обычно происходит в реакции электрофильного замещения. В реакции электрофильного замещения электрофил связывается с субстратом с
удалением другого электрофила, например, замещение протона на другой электрофил, такой как ион
нитрония, в ароматическом субстрате (например, бензоле). Электрофилы включают циклические соединения, такие как эпоксиды, азиридины, эписульфиды, циклические сульфаты, карбонаты, лактоны и лактамы; а нециклические электрофилы включают сульфаты, сульфонаты (например, тозилаты), хлориды,
бромиды и йодиды. Электрофил, как правило, может быть насыщенным углеродным атомом (например,
метиленовая группа), связанным с уходящей группой; однако электрофил может также быть ненасыщенной группой, такой как альдегидная, кето-, сложноэфирная группа, или их сопряжённый (α,β - ненасыщенный) аналог, который при реакции с нуклеофилом образует аддукт.
Термин "уходящая группа", как правило, относится к группе, которая легко вытесняется и замещается нуклеофилом (например, амином, тиолом, спиртом или цианидом). Такие уходящие группы общеизвестны и включают карбоксилаты, N-гидроксисукцинимид ("NHS"), N-гидроксибензотриазол, галоген
- 13 -
019334
(фтор, хлор, бром или йод), алкоксиды и тиоалкоксиды. Обычно в химическом синтезе используют ряд
серосодержащих уходящих групп, включая алкансульфонилоксигруппы (например, C1-C4 алкан, такие
как метансульфонилокси, этансульфонилокси, пропансульфонилокси и бутансульфонилоксигруппы) и
галогенированные аналоги (например, галогено(C1-C4 алкан)сульфонилоксигруппы, такие как трифторметансульфонилокси
(т.е.
трифлат),
2,2,2-трихлорэтансульфонилокси,
3,3,3-трибромпропансульфонилокси- и 4,4,4-трифторбутансульфонилоксигруппы), а также арилсульфонилоксигруппы (например, С6-C10 арил, необязательно замещённый 1-3 C1-C4 алкильными группами, такие как бензолсульфонилокси, α-нафтилсульфонилокси, β-нафтилсульфонилокси, п-толуололсульфонилокси- (т.е. тозилаты), 4-трет-бутилбензолсульфонилокси, мезитиленсульфонилокси и 6-этил-α-нафтилсульфонилоксигруппы).
"Активированные сложные эфиры"можно представить формулой -COL, где L обозначает уходящую
группу, типичные примеры которой включают N-гидроксисульфосукцинимидильную и Nгидроксисукцинимидильную группы; группы, замещённые электроноакцепторными группами (например, пнитро, пентафтор, пентахлор, п-циано или п-трифторметил); и карбоновые кислоты, активированные карбодиимидом с образованием ангидрида или смешанного ангидрида, например -OCORa или -OCNRaNHRb, где
Ra и Rb,независимо, обозначают C1-C6 алкильная, C5-C8 алкильная (например, циклогексильная), C1-C6 перфторалкильная или C1-C6 алкоксильная группы. Активированный сложный эфир можно получать in situ или
может быть отдельным реагентом. Сульфосукцинимидиловые сложные эфиры, пентафтортиофеноловые
сложные эфиры и сульфотетрафторфеноловые сложные эфиры являются предпочтительными активированными сложными эфирами. Однако сложноэфирной уходящей группой может быть, например, замещённая или незамещённая C1-C6 алкильная (такая как метильная, этильная, пропильная, изопропильная,
бутильная, изобутильная, вт.-бутильная, трет-бутильная, пентильная или гексильная) группа, или замещённая C6-C14 арильная или гетероциклическая группа, такая как 2-фторэтильная, 2-хлорэтильная, 2бромэтильная, 2,2-дибромэтильная, 2,2,2-трихлорэтильная, 3- фторпропильная, 4-хлорбутильная, метоксиметильная, 1,1-диметил-1-метоксиметильная, этоксиметильная, N-пропоксиметильная, изопропоксиметильная, N-бутоксиметильная, трет-бутоксиметильная, 1-этоксиэтильная, 1-метил-1-метоксиэтильная,
1-(изопропокси)этильная,
3-метоксипропил-4-метоксибутильная,
фторметоксиметильная,
2,2,2трихлорэтоксиметильная,
бис(2-хлорэтокси)метильная,
3-фторпропоксиметильная,
4-хлорбутоксиэтильная, дибромметоксиэтильная, 2-хлорэтоксимпропильная, фторметоксибутильная, 2метоксиэтоксиметильная, этоксиметоксиэтильная, метоксиэтоксипропильная, метоксиэтоксибутильная,
бензильная, фенетильная, 3-фенилпропильная, 4-фенилбутильная, α-нафтилметильная, β-нафтилметильная, дифенилметильная, трифенилметильная, α-нафтилдифенилметильная, 9-антранилметильная,
4-метилбензильная, 2,4,6-триметилбензильная, 3,4,5- триметилбензильная, 4-метоксибензильная, 4метоксифенилдифенилметильная, 2-нитробензильная, 4-нитробензильная, 4-хлорбензильная, 4бромбензильная, 4-цианобензильная, 4-цианобензилдифенилметильная или бис(2-нитрофенил)метильная
группы.
Термин "электроноакцепторная группа" является общепринятой в уровне техники и описывает способность заместителя оттягивать на себя валентные электроны (например, π (пи) электроны) от соседних
атомов, например заместитель является более электроотрицательным, чем соседние атомы, или он оттягивает на себя электроны сильнее, чем атом водорода в том же самом положении. Величина константы
Гаммета сигма (а) является общепринятой мерой электронодонорной и электроноакцепторной способности группы, особенно значение сигма пара (σр). См., например, "Advanced Organic Chemistry" by J. March,
5th Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp.368-75 (2001). Значения константы Гаммета обычно отрицательны для электронодонорных групп (σр=-0,66 для NH2) и положительны для электроноакцепторных
групп (σр=0,78 для нитрогруппы), причём σр указывает на замещение в пара положении. Примеры электроноакцепторных групп включают, среди прочих, нитро, ацильную (кетон), формильную (альдегид),
сульфонильную, трифторметильную, галогено (например, хлор или фтор) и цианогруппы. Напротив,
"электронодонорная группа" обозначает заместитель, который отдаёт электроны легче, чем водород, в
случае, если он занимает то же самое положение в молекуле. Примеры включают, среди прочих, амино
(включая алкиламино и диалкиламино), арильную, алкокси (включая аралкокси), арилокси, меркапто и
алкилтио и гидроксильные группы.
Применяемое в данном описании понятие "арильные" группы включает насыщенные углеводороды, содержащие один или более углеродный атом, включая линейные алкильные группы (например, метальную, этильную, пропильную, бутильную, пентильную, гексильную, гептильную, октильную, нонильную, децильную и т.д.), циклические алкильные группы (или "циклоалкильные", или "алициклические", или "карбоциклические" группы) (например, циклопропильную, циклопентильную, циклогексильную, циклогептильную, циклооктильную и т.д.), разветвлённые алкильные группы (изопропильную,
трет-бутильную, вт.-бутильную, изобутильную и т.д.) и алкилзамещённые алкильные группы (например,
алкилзамещённые циклоалкильные группы и циклоалкилзамещённые алкильные группы). Термин "алифатическая группа" включает органические частицы (фрагменты), для которых характерны линейные
или разветвлённые цепи, содержащие, как правило, 1-22 атома углерода. В сложных структурах цепи
- 14 -
019334
могут быть разветвлёнными, мостиковыми или сшитыми. Алифатические группы включают алкильные
группы, алкенильные группы и алкинильные группы.
В некоторых вариантах изобретения линейная или разветвлённая алкильная группа может содержать в основной цепи30 или меньше углеродных атомов, например, С1-С30 для линейной цепи или С3-С30
для разветвлённой цепи. В некоторых вариантах изобретения линейная или разветвлённая алкильная
группа может содержать 20 или менее углеродных атомов в основной цепи, например, С1-C20 для линейной цепи или С3-С20 для разветвлённой цепи, и более предпочтительно, 18 углеродных атомов или менее.
Аналогично, предпочтительные циклоалкильные группы содержат 4-10 углеродных атомов в циклической структуре, и, более предпочтительно, 4-7 углеродных атомов в циклической структуре. Термин
"низший алкил" относится к алкильным группам, содержащим 1-6 углеродных атомов в цепи, и к циклоалкильным группам, содержащим 3-6 углеродных атомов в циклической структуре.
Если число углеродных атомов иначе не указано, "низший", как в "низший алифатический", "низший алкил", "низший алкенил" и т.д., по данному описанию означает, что группа (фрагмент) содержит
по меньшей мере один и примерно менее 8 углеродных атомов. В некоторых вариантах изобретения линейная или разветвлённая низшая алкильная группа содержит 6 или менее углеродных атомов в основной цепи (например, C1-C6 для линейной цепи, С3-С6 для разветвлённой цепи), и более предпочтительно
4 или менее. Аналогично, предпочтительные циклоалкильные группы содержат 3-8 углеродных атомов в
циклической структуре и более предпочтительно 5-6 углеродных атомов в циклической структуре. Термин "C1-C6", как в "C1-C6 алкил", означает алкильные группы, содержащие 1-6 углеродных атомов.
Кроме того, если не указано иначе, термин "алкил" включает как "незамещённые алкилы", так и
"замещённые алкилы", последний термин относится к алкильным группам, содержащие заместители,
замещающие один или более атомов водорода при одном или более углеродных атомов в основной цепи
углеводорода. Такие заместители могут включать, например, алкенильную, алкинильную, галогено, гидроксильную группы, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилатную, алкилкарбонильную, арилкарбонильную, алкоксикарбонильную, аминокарбонильную, алкиламинокарбонильную, диалкиламинокарбонильную, алкилтиокарбонильную, алкоксильную, фосфатную, фосфонато, фосфинато, циано, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), имино, сульфгидрильную, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилатную, сульфатную
алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметильную, циано, азидо, гетероциклическую, алкиларильную или ароматическую (включая гетероароматическую) группы.
"Арилалкильная" группа обозначает алкильную группу, замещённая арильной группой (например,
фенилметильной (т.е. бензильной)). "Алкиларильная" группа обозначает арильную группу, замещённую
алкильной группой (например, п-метилфенильной (т.е. п-толильной)). Термин "н-алкил" означает линейную (т.е. неразветвлённую) незамещённую алкильную группу. "Алкиленовая" группа обозначает двухвалентный аналог соответствующей алкильной группы. Термины "алкенил" и "алкинил" относятся к ненасыщенным алифатическим группам, аналогичным алкила, но содержащим по меньшей мере одну двойную или тройную углерод-углеродную связь, соответственно. Соответствующие алкенильная и алкинильная группы включают группы, содержащие около 2-12 углеродных атомов, предпочтительно от 2,
примерно до 6 углеродных атомов.
Термин "ароматическая группа" или "арильная группа" включает ненасыщенные и ароматические
циклические углеводороды, а также ненасыщенные и ароматические гетероциклы, содержащие один или
более циклов. Арильные группы могут быть также конденсированными или мостиковыми с алициклическими или гетероциклическими циклами, которые не являются ароматическими, так что образуется полициклическая система (например, тетралин). "Ариленовая" группа является двухвалентным аналогом
арильной группы. Арильные группы могут быть также конденсированными или мостиковыми с алициклическими или гетероциклическими циклами, которые не являются ароматическими, так что образуется
полициклическая система (например, тетралин).
Обычной углеводородной арильной группой является фенильная группа, имеющая один цикл.
"Сульфонатная" группа обозначает группу -SO3H или -SO3-X+, связанную с углеродным атомом, где
+
Х обозначает катионную противоионную группу. Аналогично, "сульфоновая кислота" содержит группу
-SO3H или -SO3-X+, связанную с углеродным атомом, где Х+ обозначает катионную группу. Термин
"сульфат" по данному описанию обозначает группу -OSO3H или -OSO3-X+, связанную с углеродным атомом, а "сульфокислота" обозначает группу -OSO3H или -OSO3-X+, связанную с углеродным атомом, где
Х+ обозначает катионную группу. Согласно данному изобретению подходящей катионной группой может быть атом водорода. В некоторых случаях катионная группа на самом деле может быть иной группой в терапевтическом соединении, которая положительно заряжена при физиологическом рН, например
аминогруппой.
"Противоион" требуется для сохранения нейтрального общего заряда. Примеры анионных противоионов включают галоген, трифлат, сульфат, нитрат, гидроксид, карбонат, бикарбонат, ацетат, фосфат,
оксалат, цианид, алкилкарбоксилат, N-гидроксисукцинимид, N-гидроксибензотриазол, алкоксид, тиоалкоксид, алкансульфонилокси, галогенированный алкансульфонилокси, арилсульфонилокси, бисульфат,
- 15 -
019334
оксалат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, борат, бензоат, лактат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат мезилат, глюкогептонат или лактобионат. Соединения, содержащие катионную
группу, ковалентно связанную с анионной группой, можно называть "внутренними солями".
Изобретение относится к соединениям формулы V
где
А обозначает азот или кислород;
R11 обозначает водород, группу, образующую сложный С1-С6алкиловый эфир, -(CH2)X-Q, или, если
А обозначает азот, то А и R11 вместе образуют остаток природной или неприродной аминокислоты или
её метиловый или этиловый сложный эфир;
Q обозначает водород, тиазолил, триазолил, имидазолил, бензотиазолил или бензимидазолил;
х обозначает 0, 1, 2, 3 или 4;
n обозначает 3 или 4;
аа обозначает остаток природной или неприродной аминокислоты, присоединенный через его карбонильную группу, причем указанный остаток аминокислоты находится в L-конфигурации;
m обозначает 1, 2 или 3;
R14 обозначает водород или трет-бутилоксикарбонильную защитную группу;
R15 обозначает водород, незамещенный С1-С6алкил, С1-С6алкильную группу, замещенную
С6арилом, или С6арил,
и их фармацевтически приемлемым солям.
В одном варианте изобретения n обозначает 3. В некоторых вариантах изобретения m обозначает 1.
В другом варианте изобретения m обозначает 2. В некоторых вариантах изобретения A-R11 обозначает
остаток фенилаланина, присоединенный по его аминогруппе. Примеры аминокислотных остатков включают, но без ограничения, остатки лейцина или фенилаланина и их фармацевтически приемлемые соли и
сложные эфиры. Примеры возможных сложных эфиров включают метиловый и этиловый. В другом варианте изобретения m обозначает 1. Примеры аа включают остатки природных и неприродных аминокислот, таких как фенилаланин, глицин и лейцин.
В другом варианте изобретения (аа)m обозначает phe-phe или её сложный эфир.
В некоторых вариантах изобретения R15 обозначает водород или С1-С6алкил.
Термин "неприродная аминокислота" относится к любому производному природной аминокислоты,
включая D формы, и производным α и β-аминокислот. Отмечают, что некоторые аминокислоты, например гидроксипролин, которые классифицируются как неприродные аминокислоты по данному описанию, можно найти в природе в определённом организме или конкретном белке. Аминокислоты со многими различными защитными группами, пригодные для непосредственного применения в твердофазном
синтезе пептидов, выпускаются промышленностью. Помимо двадцати основных наиболее обычных природных аминокислот, следующие примеры неприродных аминокислот и аминокислотных производных
можно применять по изобретению (общепринятые сокращения даны в скобках): β-аланин (β-ALA), γаминомасляная кислота (GABA), 2-аминомасляная кислота (2-Abu), α,β-дегидро-2-аминомасляная кислота (8AU), 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота (АСРС), аминоизомасляная кислота (Aib), 2аминотиазолин-4-карбоновая кислота, 5-аминовалериановая кислота (5-Ava), 6-аминогексановая кислота
(6-Ahx), 8-аминооктановая кислота (8-Аос), 11-аминоундекановая кислота (11-Aun), 12аминододекановая кислота (12-Aido), 2-аминобензойная кислота (2-Abz), 3- аминобензойная кислота (3Abz), 4-аминобензойная кислота (4-Abz), 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановая кислота (Статин,
Statine, Sta), аминооксиуксусная кислота (Аоа), 2-аминотетралин-2-карбоновая кислота (АТС), 4-амино5-циклогексил-3-гидроксипентановая кислота (АСНРА), пара-аминофенилаланин (4-NH2-Phe), бифенилаланин (Bip), пара-бромфенилаланин (4-Br-Phe), орто-хлорфенилаланин (2-Cl-Phe), метахлорфенилаланин (3-Cl-Phe), пара-хлорфенилаланин (4-Cl-Phe), мета- хлортирозин (3-Cl-Tyr, парабензоилфенилаланин (Вра), трет-бутилглицин (TLG), циклогексилаланин (Cha), циклогексилглицин
(Chg), 2,3-диаминопропионовая кислота (Dpr), 2,4-диаминомасляная кислота (Dbu), 3,4дихлорфенилаланин (3,4-Cl2-Phe), 3,4-дифторфенилаланин (3,4-F2-Phe), 3,5-дийодтирозин (3,5-I2-Tyr),
орто-фторфенилаланин (2-F-Phe), мета-фторфенилаланин (3-F-Phe), пара-фторфенилаланин (4-F-Phe),
мета-фтортирозин (3-F-Tyr), гомосерин (Hse), гомофенилаланин (Hfe), гомотирозин (Htyr), 5гидрокситриптофан (5-ОН-Trp), гидроксипролин (Hyp), пара-йодфенилаланин (4-I-Phe), 3-йодтирозин (31-Tyr), индолин-2-карбоновая кислота (Idc), изонипекотиновая кислота (Inp), мета-метилтирозин (3-МеTyr), 1-нафтилаланин (1-Nal), 2- нафтилаланин (2-Nal), пара- нитрофенилаланин (4-NO2-Phe), 3- нитротирозин (3-NO2-Tyr), норлейцин (Nle), норвалин (Nva), орнитин (Orn), орто-фосфотирозин (H2PO3-Tyr),
октагидроиндол-2-карбоновая кислота (Oic), пеницилламин (Pen), пентафторфенилаланин (F5-Phe), фенилглицин (Phg), пипеколиновая кислота (Pip), пропаргилглицин (Pra), пироглутаминовая кислота
- 16 -
019334
(PGLU), саркозин (Sar), тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота (Tic), тиенилаланин и тиазолидин4-карбоновая кислота (тиопролин, Th). Кроме того, можно применять N-алкилированные аминокислоты,
а также аминокислоты с аминсодержащими боковыми цепями (такие как Lys и Orn), в которых амин
ацилирован или алкилирован. Примеры соединений по изобретению включают, но без ограничения:
и их фармацевтически приемлемые соли.
Изобретение относится как к солям, так и к кислым/основным формам соединений по изобретению.
Например, изобретение относится не только к конкретным солям соединений, изображённых в данном
описании в виде солей, но изобретение также включает другие фармацевтически приемлемые соли и
кислую и/или основную форму соединения. Изобретение относится также к солям соединений, показанных в данном описании.
Соединения по изобретению представлены также ниже в табл. 2.
Таблица 2
Следует отметить, что в вышеприведённой таблице и на протяжении всей заявки, если при атоме не
изображены атомы водорода, но атомы водорода требуются или необходимы с химической точки зрения
- 17 -
019334
для образования устойчивого соединения, то подразумевается, что эти атомы водорода присутствуют в
соединении.
В одном варианте данное изобретение не относится к соединениям, описанным в Международных
заявках WO 00/64420 и WO 96/28187. В этом варианте изобретение не относится к способам применения
соединений, описанных в Международных заявках WO 00/64420 и WO 96/28187, для лечения заболеваний или нарушений, описанных в этих заявках. В другом варианте изобретение относится к способам
применения соединений, описанных в Международных заявках WO 00/64420 и WO 96/28187, для способов, описанных в данной заявке, которые не описаны в Международных заявках WO 00/64420 и WO
96/28187. Как Международная заявка WO 00/64420, так и в Международная заявка WO 96/28187 вводятся ссылкой в данное описание во всей полноте.
Следует понимать, что применение любого из соединений по данному описанию или соединений,
описанных в заявках, идентифицированных в разделе "Родственные заявки", входит в объём настоящего
изобретения и, как предполагается, охватывается настоящим изобретением, и каждая из заявок специально (однозначно) вводится в данное описание, по меньшей мере, для этих целей, и, кроме того, специально (однозначно) вводятся для всех других целей.
Субъекты и популяции пациентов
Термин "субъект" включает живые организмы, в которых может встречаться амилоидоз или которые подвержены амилоидным заболеваниям, например, болезни Альцгеймера, синдрому Дауна, САА,
диализный (β2М) амилоидоз, вторичный (АА) амилоидоз, первичный (AL) амилоидоз, наследственный
амилоидоз, диабет и т.д. Примеры субъектов включают человека, цыплят, уток, пекинских уток, гусей,
обезьян, оленей, коров, кроликов, овец, коз, собак, кошек, мышей, крыс и их трангенные виды. Введение
пролечиваемому субъекту композиций по данному описанию можно осуществлять известными методами
в таких дозах и в течение такого времени, которые позволяют эффективно модулировать агрегацию вызванной амилоидом токсичности у субъекта, как далее представлено в данном описании. Эффективное
количество терапевтического соединения, необходимое для достижения терапевтического эффекта, может меняться в зависимости от таких факторов как уже имеющееся количество амилоидных отложений в
организме больного, возраст, пол, вес субъекта и способность терапевтического соединения модулировать агрегацию амилоида в организме субъекта. Схему приёма лекарственного вещества можно коррелировать таким образом, чтобы вызвать оптимальный терапевтический ответ. Например, можно принимать
ежедневно в виде нескольких разделённых доз или, в зависимости от показаний, дозу можно пропорционально уменьшить.
В некоторых вариантах изобретения субъект нуждается в лечении способами по данному изобретению и выбирается для лечения с учётом такой необходимости. Субъекты, нуждающиеся в таком лечении, общеизвестны в уровне техники и включают субъектов, которые определяются как имеющие заболевание или нарушение, с амилоидным отложением или амилоидозом, имеют симптом такого заболевания или нарушения или субъекты с повышенным риском такого заболевания или нарушения, и у которых, на основании диагноза, например, медицинского диагноза, следует ожидать улучшения вследствие
терапии (например, излечения, заживления, предупреждения, смягчения, облегчения, лечения, ослабления, положительной динамики или воздействия на заболевание или нарушение, симптом заболевания
или нарушение или повышенный риск заболевания или нарушения).
В типичном аспекте изобретения субъектом является человек. Например, субъектом может быть
человек старше 30 лет, человек старше 40 лет, человек старше 50 лет, человек старше 60 лет, человек
старше 70 лет, человек старше 80 лет, человек старше 85 лет, человек старше 90 лет или человек старше
95 лет. Субъект может быть женщиной, в том числе женщиной в период менопаузы, которая получает
гормональную (эстрогенную) заместительную терапию. Субъектом может быть мужчина. В другом варианте изобретения субъект моложе 40 лет.
Субъект может является человеком с повышенным риском заболевания болезнью Альцгеймера, например, будучи старше 40 лет или имея предрасположенность к болезни Альцгеймера. Факторы предрасположенности к болезни Альцгеймера, идентифицированные или предположенные в научной литературе, включают, среди других, генотип, предрасполагающий субъекта к болезни Альцгеймера; экологические факторы, предрасполагающие к болезни Альцгеймера; инфекция вирусными и бактериальными
агентами, предрасполагающими к болезни Альцгеймера, в анамнезе; и сосудистые факторы, предрасполагающие субъекта к болезни Альцгеймера. У субъекта также может быть один или более факторов повышенного риска заболевания сердечно-сосудистым заболеванием (например, атеросклероз коронарных
артерий, стенокардия и инфаркт миокарда) или церебрально-васкулярным заболеванием (например, атеросклероз интракраниальной или экстракраниальной артерий, удар, обморок и преходящие нарушения
мозгового кровообращения), таким как гиперхолестеринемия, гипертензия, диабет, курение, или заболевание коронарной артерии, церебро-васкулярное заболевание и сердечно-сосудистое заболевание в
анамнезе или в семейном анамнезе. Обычно гиперхолестеринемию определяют как сывороточную концентрацию тотального холестерина выше примерно 5.2 ммоль/л (около 200 мг/дл).
Полагают, что некоторые генотипы предрасполагают к болезни Альцгеймера. Эти генотипы включают такие как миссенс-мутации в пресенилине-1, пресенилине-2 и амилоидном белке-предшественнике
- 18 -
019334
(АРР), ассоциированные с болезнью Альцгеймера, и генотипы α-2-макроглобулина и LRP-1, которые,
как полагают, повышают риск заболевания случайной (спорадической) (поздней) болезнью Альцгеймера.
Е. van Uden, et al., J. Neurosci. 22(21), 9298-304 (2002); J. J. Goto et al., J. Mol. Neurosci. 19(1-2), 37-41
(2002). Другим генетическим фактором риска развития болезни Альцгеймера являются варианты АроЕ,
гена, который кодирует аполипопротеин Е (в особенности ароЕ4 генотип), компонент частиц липопротеинов низкой плотности. W. J. Strittmatter et al., Annu. Rev. Neurosci. 19, 53-77 (1996). Молекулярные
механизмы, по которым различные аллели АроЕ меняют вероятность развития болезни Альцгеймера,
неизвестны, однако роль АроЕ в метаболизме холестерина согласуется с растущим числом данных, связывающих метаболизм холестерина с болезнью Альцгеймера. Например, постоянное применение лекарственных препаратов, снижающих уровень холестерина, таких как статины, недавно было связано с более низкой частотой болезни Альцгеймера, и было показано, что лекарственные препараты, снижающие
уровень холестерина, снижают патологию у АРР трансгенных мышей. Эти и другие исследования наводят на мысль, что холестерин может влиять на процессирование АРР. Было предположено, что АроЕ4
изменяет направленную миграцию Аβ (в мозг и из мозга) и способствует удерживанию Аβ в мозге. Также предполагалось, что АроЕ4 способствует процессированию АРР с образованием Аβ. Полагают, что
экологические факторы предрасполагают субъекта к болезни Альцгеймера, включая экспозицию с алюминием, хотя эпидемиологические данные не являются чёткими. Кроме того, более ранняя инфекция
некоторыми вирусными или бактериальными агентами, включая вирус герпеса и chlamydia pneumoniae,
может предрасположить субъекта к болезни Альцгеймера. Наконец, другие факторы, предрасполагающие к болезни Альцгеймера, могут включать факторы риска сердечно-сосудистого или цереброваскулярного заболевания, включая курение сигарет, гипертензию и диабет. "Риск болезни Альцгеймера"
также охватывает любые другие предрасполагающие факторы, не перечисленные выше или уже определённые, и включает повышенный риск болезни Альцгеймера, вызванный травмой головы, лекарственной
терапией, диетой или образом жизни.
Способы по настоящему изобретению можно применять для одной или более нижеприведённых
целей: для предупреждения болезни Альцгеймера, для лечения болезни Альцгеймера, для ослабления
симптомов болезни Альцгеймера или для регуляции продуцирования или уровней амилоидных β (Аβ)
пептидов. В одном варианте изобретения человек несёт одну или более мутаций в генах, которые кодируют β-амилоидный белок-предшественник, пресенилин-1 или пресенилин-2. В другом варианте изобретения человек несёт ген Аполипопротеин ε4. В другом варианте у человека в семейном анамнезе имеется
болезнь Альцгеймера или деменция. В другом варианте изобретения у человека наблюдается трисомия
21 (синдром Дауна). В другом варианте изобретения у субъекта наблюдается нормальный или низкий
уровень тотального сывороточного холестерина крови. В другом варианте изобретения уровень тотального сывороточного холестерина крови ниже примерно 200 мг/дл или ниже примерно 180 мг/дл, и он
может быть в интервале примерно 150-200 мг/дл. В другом варианте изобретения уровень тотального
LDL холестерина ниже примерно 100 мг/дл или ниже примерно 90 мг/дл и может быть в примерном интервале 30-100 мг/дл. Способы измерения сывороточного тотального холестерина крови и тотального
LDL холестерина хорошо известны специалистам в данной области техники и, например, могут включать способы, описанные в Международной заявке WO 99/38498 на стр. 11, вводимой в данное описание
в качестве ссылки. Способы определения уровней других стеринов (стеролов, стероидных спиртов) в
сыворотке описаны в Н. Gylling et al., "Serum Sterols During Stanol Ester Feeding in a Mildly Hypercholesterolemic Population", J. Lipid Res. 40: 593- 600 (1999).
В другом варианте изобретения у субъекта наблюдается повышенный уровень сывороточного тотального холестерина крови. В другом варианте изобретения уровень сывороточного тотального холестерина крови составляет по меньшей мере около 200 мг/дл или по меньшей мере около 200 мг/дл и может быть в примерном интервале 200-1000 мг/дл. В другом варианте изобретения у субъекта повышенный уровень тотального LDL холестерина. В другом варианте изобретения уровень тотального LDL холестерина выше примерно 100 мг/дл или даже выше примерно 110 мг/дл и может быть в примерном интервале 100-1000 мг/дл.
В другом варианте изобретения человек находится в возрасте по меньшей мере около 40 лет. В другом варианте изобретения человек находится в возрасте по меньшей мере около 60 лет. В другом варианте изобретения человек находится в возрасте по меньшей мере около 70 лет. В другом варианте изобретения человек находится в возрасте по меньшей мере около 80 лет. В другом варианте изобретения человек находится в возрасте по меньшей мере около 85 лет. В другом варианте изобретения человек находится в возрасте примерно 60-100 лет.
Ещё в одном варианте изобретения, как показано, у субъекта имеется риск по показаниям диагностического метода визуализации мозга, например метода измерения активности мозга, отложения бляшек или атрофии мозга.
Ещё в одном варианте изобретения показано, что у субъекта риск, определённый когнитивным тестом, таким как Клинический Рейтинг Деменции ("CDR"), Когнитивная Шкала Оценки Болезни Альцгеймера ("ADAS-Cog") или Мини-исследование Ментального Статуса ("MMSE"). У субъекта может быть
- 19 -
019334
оценка ниже средней по шкале когнитивного теста по сравнению с контрольным для аналогичного возраста и с известными данными. У субъекта также наблюдаться снижение оценки по сравнению с предыдущими оценками этого субъекта в том же самом или аналогичных тестах.
При определении CDR субъекта обычно оценивают и определяют показатель в каждой из шести
когнитивных и поведенческих категорий: память, ориентация, оценка и разрешение проблем, общественное поведение, дом и увлечения и уход за собой. Оценка может включать информацию о прошлом,
предоставленную субъектом, или, предпочтительно, свидетеля (corroborator), который хорошо знает
субъекта. Субъекта оценивают и определяют показатели в каждой из этих областей и определяют общий
балл (рейтинг) (0, 0,5, 1,0, 2,0 или 3,0). Нормальным считают рейтинг (квалификационная оценка, балл)
0. Рейтинг 1 считают соответствующим лёгкой деменции. Субъект с CDR 0,5 характеризуется лёгкой
стойкой забывчивостью, частичной памятью о событиях и "слабой, доброкачественной" забывчивостью.
В одном варианте изобретения субъекта оценивают с рейтингом по CDR выше 0, выше примерно 0,5,
выше примерно 1,0, выше примерно 1,5, выше примерно 2,0, выше примерно 2,5 или примерно 3,0,
Другим тестом является мини-исследование Ментального Статуса ("MMSE"), описанное Folstein
"Mini-mental state. A practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician". J. Psychiatr.
Res. 12: 189-198, 1975. MMSE оценивает наличие умственной отсталости (ухудшения). См. также Folstein
"Differential diagnosis of dementia. The clinical process" Psychiatr Clin North Am. 20: 45-57, 1997. MMSE
является способом оценки начала деменции и наличия общего ухудшения умственной деятельности (общей умственной отсталости), наблюдаемых при болезни Альцгеймера и при деменции в случае множественного инфаркта. MMSE оценивается от 1 до 30. MMSE не оценивает основной когнитивный потенциал, как, например, так называемый IQ тест. Вместо этого он проверяет умственные способности. Человек
с "нормальными" умственными способностями получает "30" в MMSE объективном, беспристрастном
тесте (однако, человек с оценкой 30 в тесте MMSE может получить оценку много ниже в IQ тесте). См.,
например, Kaufer, J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. 10: 55- 63, 1998; Alzheimer Dis Assoc Disord. 12: 5457, 1998; Ellis, Arch. Neurol. 55:360-365, 1998; Magni, Int. Psychogeriatr. 8: 127-134, 1996: Monsh, Acta Neurol. Scand. 92: 145-150, 1995. В одном варианте изобретения оценки субъекта ниже 30 по MMSE, по
меньшей мере, один раз. В другом варианте изобретения субъект получает баллы ниже примерно 28, ниже примерно 26, ниже примерно 24, ниже примерно 22, ниже примерно 20, ниже примерно 18, ниже
примерно 16, ниже примерно 14, ниже примерно 12, ниже примерно 10, ниже примерно 8, ниже примерно 6, ниже примерно 4, ниже примерно 2 или ниже примерно 1.
Другим способом оценки познавательной способности, в частности болезни Альцгеймера, является
Когнитивная Шкала Оценки Болезни Альцгеймера (ADAS-Cog) или её вариант, называемый Стандартизованной Шкалой Оценки Болезни Альцгеймера (SADAS). Она обычно используется как мера эффективности при клинических испытаниях лекарственных препаратов для лечения болезни Альцгеймера и родственных нарушений, характеризующихся ухудшением когнитивных способностей. SADAS и ADAS-Cog
не предназначены для диагностики болезни Альцгеймера; они применимы для характеристики симптомов деменции являются сравнительно чувствительным индикатором прогрессирования деменции (См.,
например, Doraiswamy, Neurology 48: 1511- 1517, 1997; и Standish, J. Am. Geriatr. Soc. 44: 712-716, 1996).
Ежегодное ухудшение у непролеченных пациентов с болезнью Альцгеймера составляет примерно 8
пунктов (баллов) в год (См., например, Raskind, M Prim. Care Companion J Clin Psychiatry 1000 Aug; 2(4):
134-138).
ADAS-Cog рассчитана для определения, с помощью анкет, прогрессирования и тяжести когнитивного ухудшения, наблюдаемого при AD, по 70-балльной шкале. Шкала ADAS-Cog количественно определяет число неправильных ответов. Соответственно, высокий балл по шкале указывает на более тяжёлый случай когнитивного ухудшения. В одном варианте изобретения у субъекта балл выше 0, выше примерно 5, выше примерно 10, выше примерно 15, выше примерно 20, выше примерно 25, выше примерно
30, выше примерно 35, выше примерно 40, выше примерно 45, выше примерно 50, выше примерно 55,
выше примерно 60, выше примерно 65, выше примерно 68 или примерно 70.
В другом варианте изобретения у субъекта не проявляются симптомы болезни Альцгеймера. В другом варианте изобретения субъектом является человек в возрасте по меньшей мере 40 лет, у которого
наблюдаются симптомы болезни Альцгеймера. В другом варианте изобретения субъектом является человек в возрасте по меньшей мере 40 лет, у которого наблюдаются один или более симптомов болезни
Альцгеймера.
В другом варианте изобретения у субъекта наблюдается лёгкая когнитивная недостаточность. Ещё
в одном варианте изобретения рейтинг CDR субъекта составляет 0,5. В другом варианте изобретения у
субъекта наблюдается ранняя болезнь Альцгеймера. В другом варианте изобретения у субъекта церебральная амилоидная ангиопатия.
Применяя способы по данному изобретению, можно понизить уровни амилоидных β пептидов в
плазме или спинномозговой жидкости (CSF) субъекта по сравнению с уровнями перед лечением примерно на 10-100% или даже примерно на 50-100%.
В альтернативном варианте изобретения у субъекта перед лечением может быть повышенный уро- 20 -
019334
вень амилоидного Аβ40 или Аβ42 пептида в крови и CSF, согласно способам по настоящему изобретению
выше примерно 10 пг/мл или выше примерно 20 пг/мл, или выше примерно 35 пг/мл, или даже выше
примерно 40 пг/мл. В другом варианте изобретения повышенный уровень амилоидного Аβ42 пептида
может быть в примерном интервале от 30 до 200 пг/мл или даже примерно до 200 пг/мл. Специалист в
данной области техники понимает, что по мере прогрессирования болезни Альцгеймера измеряемые
уровни амилоидного β пептида в CSF могут падать по сравнению с повышенными уровнями до начала
заболевания. Этот эффект относят за счёт повышенного отложения, т.е. улавливания Аβ пептида в мозге
вместо нормального клиренса из мозга в CSF.
В альтернативном варианте изобретения субъект может иметь повышенный уровень амилоидного
Аβ40 пептида в крови и CSF перед лечением согласно способам по настоящему изобретению, более примерно 5 пг Аβ42/мл или больше, примерно 50 пг Аβ40/мл или более примерно, 400 пг/мл. В другом варианте изобретения повышенный уровень амилоидного Аβ40 пептида может быть в интервале примерно от
200 пг/мл примерно до 800 пг/мл, даже примерно до 1000 пг/мл.
В другом варианте изобретения субъект может иметь повышенный уровень амилоидного Аβ42 пептида в CSF перед лечением, согласно способам по настоящему изобретению более примерно 5 пг/мл или
больше, примерно 10 пг/мл или более, примерно 200 пг/мл или более, примерно 500 пг/мл. В другом варианте изобретения уровень амилоидного β пептида может быть в интервале примерно от 10 до 1000
пг/мл, или даже примерно от 100 до 1000 пг/мл.
В другом варианте изобретения субъект может иметь повышенный уровень амилоидного Аβ40 пептида в CSF перед лечением согласно способам по настоящему изобретению более примерно 10 пг/мл или
больше, примерно 50 пг/мл или даже более, примерно 100 пг/мл. В другом варианте изобретения уровень
амилоидного β пептида может быть в интервале примерно от 10 до 1000 пг/мл.
Количество амилоидного β пептида в мозге, CSF, крови или плазме субъекта можно определить
твердофазным иммуноферментным анализом ("ELISA") или количественными методами иммуноблоттинга, или количественным SELDI-TOF, хорошо известными специалистам в данной области техники,
такими как раскрываемые Zhang, et al., J. Biol. Chem. 274, 8966-72 (1999) и Zhang, et al., Biochemistry 40,
5049- 55 (2001). См. также А. К. Vehmas, et al., DNA Cell Biol. 20(11), 713-21 (2001); P. Lewczuk, et al.,
Rapid Commun. Mass Spectrom. 17(12), 1291-96 (2003); B.M. Austen, et al., J. Peptide Sci. 6, 459-69 (2000); и
Davis, et al., BioTechniques 27, 1258-62 (1999). Эти тесты проводят на образцах мозга или крови, которые
готовят хорошо известным специалисту в данной области техники способом. Другим примером применяемого способа определения уровней амилоидных Аβ пептидов является иммуноанализ с меткой европием (EIA). См., например, Международную заявку WO 99/38498 стр.11.
Способы по изобретению можно применять в качестве терапии субъекта с болезнью Альцгеймера
или деменцией, или способы по изобретению можно применять в качестве профилактики болезни Альцгеймера или деменции у субъекта, предрасположенного к ним, как в том случае, если субъекта, например, мутация в гене АРР, гене АроЕ или гене пресенилина. У субъекта может быть (или он может быть
предрасположен к развитию, или можно подозревать у него) сосудистая деменция, сенильная деменция
(старческое слабоумие), лёгкая когнитивная недостаточность или ранняя болезнь Альцгеймера (или он
может быть предрасположен к развитию этих заболеваний, или их можно у него подозревать). Помимо
болезни Альцгеймера, субъект может иметь другой амилоидное заболевание, такое как церебральная
амилоидная ангиопатия, или у субъекта могут быть амилоидные отложения, в особенности амилоидные
β-отложения в мозге.
Лечение амилоидных заболеваний
Настоящее изобретение относится к способам применения соединений и их фармацевтических
композиций для лечения и предупреждения амилоидных заболеваний. Фармацевтические композиции по
изобретению можно применять терапевтически или профилактически для лечения заболеваний, ассоциированных с образованием, агрегацией или отложением амилоидных фибрилл (например, AL амилоидного белка (λ или κ-цепи, например, амилоида λ, амилоида κ, амилоида κIV, амилоидаλVI, амилоида γ,
амилоида γ1), Аβ, IAPP, β2M, AA или АН амилоидного белка).
Фармацевтические композиции по изобретению могут действовать, облегчая течение амилоидного
заболевания, по любому из приведённых ниже механизмов (предполагается, что этот перечень является
иллюстративным, а не лимитирующим): замедление скорости образования или отложения амилоидных
фибрилл; уменьшение степени амилоидного отложения; ингибирование, уменьшение или предупреждение образования амилоидных фибрилл; ингибирование нейродегенерации или клеточной токсичности,
вызванной амилоидом; ингибирование воспаления, индуцированного амилоидом; повышение клиренса
амилоида из мозга; повышение расщепления Аβ в мозге; или содействие клиренсу амилоидного белка до
его объединения в фибриллы.
"Модуляция" амилоидного отложения включает как ингибирование по определению выше, так и
увеличение амилоидного отложения или образования фибрилл. Таким образом, предполагается, что термин "модуляция" охватывает предупреждение или прекращение образования или аккумуляции амилоида, ингибирование или замедление дальнейшего образования или аккумуляции амилоида у субъекта,
- 21 -
019334
больного амилоидозом, например, уже имеющего амилоидное отложение, и уменьшение или реверсию
образования или аккумуляции амилоида у субъекта, больного амилоидозом; и увеличение амилоидного
отложения, например, повышение скорости или количества амилоидного отложения in vivo или in vitro.
Соединения, повышающие содержание амилоида, можно применять на животных моделях амилоидоза,
например, для того, чтобы можно было создать амилоидные отложения у животных в течение более короткого периода времени, или увеличить амилоидные отложения в течение нужного периода времени.
Соединения, повышающие содержание амилоида, могут применяться при скрининге на соединения, которые ингибируют амилоидоз in vivo, например, на животных моделях, в клеточных анализах и в in vitro
анализах на амилоидоз. Такие соединения можно применять, например, для проведения более быстрых и
более точных (чувствительных) анализов на соединения. Модуляцию амилоидного отложения определяют по сравнению с непролеченным субъектом или по сравнению с пролеченным субъектом до лечения.
"Ингибирование"амилоидного отложения включает предупреждение или прекращение амилоидного образования, например, фибриллогенеза, клиренс амилоида, например, растворимого Аβ, из мозга,
ингибирование или замедление дальнейшего отложения амилоида у субъекта с амилоидозом, например,
уже имеющего амилоидные отложения, и уменьшение или реверсию амилоидного фибриллогенеза или
отложений у субъекта, уже имеющего амилоидоз. Ингибирование амилоидного отложения определяют в
сравнении с непролеченным субъектом или в сравнении с пролеченным субъектом перед лечением, или,
например, определяют клинически (измеряемым) значимым улучшением, или, например, если у субъекта
амилоидоз мозга, например, болезнь Альцгеймера или церебральная амилоидная ангиопатия, стабилизацией когнитивной функции или предупреждением дальнейшего ухудшения когнитивной функции (т.е.
предупреждение, замедление или прекращение прогрессирования заболевания) или улучшением показателей, таких как концентрация Аβ или тау в CSF.
"Лечение, терапия" субъекта по данному описанию включает применение композиции по данному
изобретению в отношении субъекта или введение её субъекту, или применение композиции по данному
изобретению в отношении клетки или ткани субъекта или введение её в клетку или ткань субъекта с
амилоидным заболеванием или состоянием, с симптомом такого заболевания или состояния или с повышенным риском такого заболевания или состояния (или предрасположенным к такому заболеванию или
состоянию), с целью излечения, заживления, смягчения, облегчения, изменения, вылечивания, ослабления, положительной динамики или воздействия на заболевание или нарушение, симптом заболевания
или нарушение или повышенный риск заболевания или нарушения (или предрасположенность к заболеванию или нарушению). Термин "лечение" относится к любому признаку успеха в терапии или к уменьшению интенсивности поражения, патологии или состояния, включая любой объективный или субъективный показатель, такой как ослабление боли; ремиссия; ослабление симптомов, или то, что делает поражение, патологию или состояние более приемлемыми для субъекта (позволяет их легче переносить);
замедление скорости ухудшения или прогрессирования заболевания; то, что способствует менее изнурительному последнему мигу дистрофии; улучшение физического или умственного состояния; или, в некоторых ситуациях, предупреждение начала деменции. Лечение или облегчение симптомов можно проводить с учётом объективных или субъективных показателей; включая результаты физического обследования, психиатрической оценки или теста, определяющего познавательные способности, такого как CDR,
MMSE, ADAS-Cog или другого известного в уровне техники теста. Например, способы по изобретению
позволяют успешно лечить деменцию, замедляя скорость или уменьшая степень когнитивного ухудшения.
В одном варианте изобретения термин "лечение" включает сохранение начального CDR рейтинга
субъекта или на нулевом уровне. В другом варианте изобретения термин "лечение" включает снижение
рейтинг CDR субъекта примерно на 0,25 или более, примерно на 0,5 или более, примерно на 1,0 или более, примерно на 1,5 или более, примерно на 2,0 или более, примерно на 2,5 или более, или примерно на
3,0 или более. В другом варианте изобретения термин "лечение" также включает уменьшение скорости
повышения рейтинга CDR субъекта по сравнению с контрольными предыдущими данными. В другом
варианте изобретения термин включает уменьшение скорости повышения рейтинга CDR субъекта, примерно на 5% или более, примерно на 10% или более, примерно на 20% или более, примерно на 25% или
более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно,
на 60% или более, примерно на 70% или более, примерно на 80% или более, примерно на 90% или более,
или примерно на 100% или более, по сравнению с контрольными предыдущими данными повышения
или с контрольными данными повышения в отсутствие лечения.
В другом варианте изобретения термин "лечение" также включает сохранение оценки MMSE субъекта. Термин "лечение" включает увеличение числа баллов MMSE примерно на 1, примерно на 2, примерно на 3, примерно на 4, примерно на 5, примерно на 7,5, примерно на 10, примерно на 12,5, примерно
на 15, примерно на 17,5, примерно на 20 или примерно на 25 баллов. Термин также включает снижение
скорости уменьшения оценки MMSE субъекта по сравнению с предыдущими контрольными. В другом
варианте изобретения термин включает снижение скорости уменьшения оценки MMSE субъекта, при- 22 -
019334
мерно на 5% или менее, примерно на 10% или менее, примерно на 20% или менее, примерно на 25% или
менее, примерно на 30% или менее, примерно на 40% или менее, примерно на 50% или менее, примерно
на 60% или менее, примерно на 70% или менее, примерно на 80% или менее, примерно на 90% или менее, примерно на 100% или менее, по сравнению с контрольными предыдущими данными уменьшения
или с контрольными данными уменьшения в отсутствие лечения.
Ещё в одном варианте изобретения термин "лечение" включает сохранение оценки ADAS-Cog
субъекта. Термин "лечение" включает снижение оценки ADAS-Cog субъекта, примерно на 1 пункт или
более, примерно на 2 пункта или более, примерно на 3 пункта или более, примерно на 4 пункта или более, примерно на 5 пунктов или более, примерно на 7,5 пунктов или более, примерно на 10 пунктов или
более, примерно на 12,5 пунктов или более, примерно на 15 пунктов или более, примерно на 17,5 пунктов или более, примерно на 20 пунктов или более, или примерно на 25 пунктов или более. Термин также
включает снижение скорости увеличения оценки ADAS-Cog субъекта по сравнению с предыдущими
контрольными. В другом варианте изобретения термин включает снижение скорости увеличения оценки
ADAS-Cog субъекта примерно на 5% или более, примерно на 10% или более, примерно на 20% или более, примерно на 25% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на
50% или более, примерно на 60% или более, примерно на 70% или более, примерно на 80% или более,
примерно на 90% или более, примерно на 100% или более, по сравнению с контрольными предыдущими
данными увеличения или с контрольными данными увеличения в отсутствие лечения.
В другом варианте изобретения термин "лечение", например АА или AL амилоидоза, включает повышение сывороточного креатинина, например увеличение клиренса креатинина на 10% или более, на
20% или более, на 50% или более, на 80% или более, на 90% или более, на 100% или более, на 150% или
более, на 200% или более.
Термин "лечение" может также включать ремиссию нефротического синдрома (NS). Он может также включать ремиссию хронической диареи и/или прибавку в весе, например, на 10% или более, 15%
или более или 20% или более.
Без всякой связи с теорией в некоторых аспектах фармацевтические композиции по изобретению
содержат соединение, которое предупреждает или ингибирует образование амилоидных фибрилл либо в
мозге, либо в другом важном органе (действуя локально, местно), либо в организме в целом (действуя
системно). Фармацевтические композиции по изобретению могут эффективно регулировать амилоидное
отложение либо после попадания их (композиций) в мозг (после проникновения через гематоэнцефалический барьер), либо с периферии. При действии с периферии соединение в фармацевтической композиции может изменять равновесие амилоидогенного пептида между мозгом и плазмой таким образом, чтобы способствовать удалению (выходу) амилоидогенного пептида из мозга. Соединение может также способствовать клиренсу (или катаболизму) амилоидного белка (растворимого), а затем предупреждать образование и отложение амилоидных фибрилл вследствие уменьшения пула амилоидного белка в конкретном органе, например, печени, селезёнке, поджелудочной железе, почке, суставах, мозге и т.д. Повышение выхода (удаления) амилоидогенного пептида из мозга приводит к уменьшению концентрации
амилоидогенного пептида в мозге и, следовательно, способствует уменьшению отложения амилоидогенного пептида. В частности, агент может снижать уровни амилоидных β пептидов, например как Аβ40,
так и Аβ42, в CSF и в плазме, или агент может снижать уровни амилоидных р пептидов, например, Аβ40
и Аβ42, в CSF и повышать их в плазме. Или соединения, которые проникают в мозг, могут контролировать отложение, действуя непосредственно на амилоидогенный пептид мозга, например, сохраняя его в
нефибриллярной форме или содействуя его клиренсу из мозга, увеличивая его расщепление в мозге, или
защищая клетки мозга от вредного влияния амилоидогенного пептида. Агент может также вызывать
уменьшение концентрации амилоидогенного белка (т.е. в конкретном органе, таким образом, чтобы не
достигалась опасная (критичная) концентрация, необходимая для стимуляции образования или отложения амилоидных фибрилл). Кроме того, соединения по данному описанию могут ингибировать или
уменьшать взаимодействие между амилоидом и компонентом клеточной поверхности, например, гликозаминогликановой или протеогликановой составляющей базальной мембраны, в результате чего ингибирование или снижение этого взаимодействия вызывает наблюдаемый нейропротективный или клеточнопротективный эффект. Например, соединение может также предупреждать связывание или адгезию амилоидного пептида с клеточной поверхностью, процесс, который, как известно, вызывает поражение или
токсичность клеток. Аналогично, соединение может блокировать индуцированную амилоидом клеточную токсичность, или активацию микроглии, или индуцированную амилоидом нейротоксичность, или
ингибировать вызванное амилоидом воспаление. Соединение может также снижать скорость или количество агрегации амилоида, образования или отложения фибрилл, или соединение уменьшает степень
амилоидного отложения. Вышеприведённые механизмы действия не следует истолковывать как ограничивающие объём изобретения, ввиду того, что изобретение может применяться на практике без такой
информации.
Термин "амилоидное-β заболевание" (или "заболевание, связанное с амилоидом-β", эти термины,
применяемые в данном описании, являются синонимами) можно применять в отношении лёгкой когни- 23 -
019334
тивной недостаточности; сосудистой деменции; ранней болезни Альцгеймера; болезни Альцгеймера,
включая случайную (спорадическую, ненаследственную) болезнь Альцгеймера и семейную (наследственную) болезнь Альцгеймера; возрастного ухудшения когнитивных функций; церебральной амилоидной ангиопатии ("САА"); наследственной церебральной геморрагии; сенильной деменции (старческого
слабоумия); синдрома Дауна; миозита телец включений ("IBM"); или возрастной дегенерации жёлтого
пятна ("ARDM"). Согласно некоторым аспектам изобретения амилоид-β представляет собой пептид, содержащий 39-43 аминокислоты, или амилоид-β представляет собой амилоидогенный пептид, продуцируемый при использовании βАРР.
Лёгкая когнитивная недостаточность ("MCI") представляет собой состояние, характеризующееся
лёгкой, но заметной утратой мыслительного навыка, квалификации, умения, которая необязательно связана с наличием деменции. MCI часто, но не всегда, предшествует болезни Альцгеймера. Это диагноз,
который наиболее часто ассоциируется с небольшими проблемами памяти, но он может также характеризоваться лёгкой недостаточностью других мыслительных навыков, таких как языковые навыки или
навыки планирования. Однако, как правило, у человека с MCI гораздо более значительные проблемы с
памятью, чем можно было бы ожидать от человека в его возрасте или с его образованием. По мере прогрессирования состояния врач может изменить диагноз на "Когнитивное расстройство от лёгкого до умеренного", что является общеизвестным в уровне техники.
Церебральная амилоидная ангиопатия ("САА") относится к специфичному отложению амилоидных
фибрилл на стенках лептомингеальной и кортикальной артерий, артериол и в капиллярах и венах. Её
обычно ассоциируют с болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна и нормальным старением, а также с
различными семейными состояниями, связанными с ударом или деменцией (см. Frangione, et al., Amyloid: J. Protein Folding Disord. 8, Suppl. 1, 36-42 (2001)). САА может быть случайной или наследственной.
Определены и клинически связаны либо с деменцией, либо с церебральной геморрагией многие сайты
мутаций либо в Аβ, либо в АРР гене. Примеры САА нарушений включают, но без ограничения, наследственную церебральную геморрагию с амилоидозом Исландского типа (HCHWA-I); Голландский вариант HCHWA (HCHWA-D; мутация в Аβ); Фламандскую мутацию Аβ; Арктическую мутацию Аβ; Айова
мутацию Аβ; семейную Британскую деменцию. Известно, что церебральная амилоидная ангиопатия связана с церебральной геморрагией (или геморрагическим инсультом).
Кроме того, аномальная аккумуляция АРР и амилоидного-β белка в мышечных волокнах непосредственно связана с патологией случайного миозита телец включений ("IBM") (Askanas et al., Pros. Natl.
Acad. Sci. USA 93, 1314-1319 (1996); Askanas et al., Current Opinion in Rheumathology 7, 486-496 (1995)).
Соответственно, соединения по изобретению можно применять профилактически или терапевтически
при лечении нарушений, при которых бета-амилоидный белок аномально отлагается в ненейрологических участках, например, для лечения IBM доставкой соединений к мышечным волокнам.
Кроме того, было показано, что Аβ ассоциируется с аномальными внеклеточными отложениями,
известными как друзы, которые аккумулируются вдоль базальной поверхности ретинального пигментированного эпителия у людей с возрастной дегенерацией жёлтого пятна (ARMD). ARMD является причиной необратимой потери зрения у людей старшего возраста. Полагают, что отложение Аβ может являться важным компонентом локальных воспалительных событий, которые способствуют атрофии ретинального пигментированного эпителия, биогенезу друз и патогенезу ARMD (Johnson et al., Pros. Natl. Acad.
Sci. USA 99(18), 11830-5 (2002)). Следовательно, изобретение относится также к лечению или предупреждению возрастной дегенерации жёлтого пятна.
Данное изобретение относится также к способу предупреждения или ингибирования амилоидного
отложения у субъекта. Например, такой способ заключается во введении субъекту терапевтически эффективного количества соединения, способного снижать концентрацию амилоида (например, AL амилоидного белка (родственного λ или κ-цепям, например амилоида λ, амилоида κ, амилоида κIV, амилоида
λVI, амилоида γ, амилоида γ1), Аβ, IAPP, β2M, AA, АН амилоидного белка или других амилоидов), так
что предупреждается или ингибируется аккумуляция или отложение амилоида.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу предупреждения, уменьшения или ингибирования амилоидного отложения у субъекта. Например, такой способ заключается во введении субъекту терапевтически эффективного количества соединения, способного ингибировать амилоид (например, AL амилоидный белок (родственный λ или κ-цепям, например амилоид λ, амилоид κ, амилоид κIV,
амилоид XVI, амилоид γ, амилоид γ1), Аβ, IAPP, β2М, AA, АН амилоидный белок или другие амилоиды),
так что предупреждается, уменьшается или ингибируется это амилоидное отложение.
Данное изобретение относится также к способу модуляции, например, минимизации, поражения
клеток, ассоциированного с амилоидом, содержащему стадию введения соединения, способного снижать
концентрацию амилоида (например, AL амилоидного белка (родственного λ или κ-цепям, например амилоида λ, амилоида κ, амилоида κIV, амилоида λVI, амилоида γ, амилоида γ1), Аβ, IAPP, β2M, AA, АН
амилоидного белка или другого амилоида), так что модулируется указанное поражение клеток, обусловленное амилоидом. В некоторых аспектах изобретения способы модуляции обусловленного амилоидом
поражения клеток содержат стадию введения соединения, способного понизить концентрацию амилоида
- 24 -
019334
или уменьшить взаимодействие амилоида с клеточной поверхностью.
Данное изобретение также включает способ непосредственного или опосредованного предупреждения гибели клеток в организме субъекта, причём метод заключается во введении субъекту терапевтически эффективного количества соединения, способного предупреждать опосредованные амилоидом
(например, AL амилоидным белком (родственным λ или κ-цепям, например амилоидом λ, амилоидом κ,
амилоидом κIV, амилоидом λVI, амилоидом γ, амилоидом γ1), Аβ, IAPP, β2M, AA, АН амилоидным белком или другим амилоидом) события, которые приводят, непосредственно или опосредованно, к гибели
клеток.
В одном варианте изобретения применяется способ лечения болезни Альцгеймера (например, случайной или семейной AD). Способ можно также применять профилактически или терапевтически для
лечения других клинических случаев амилоидного-Р отложения, например, пациентов с синдромом Дауна и с церебральной амилоидной ангиопатией ("САА") или наследственной церебральной геморрагией.
Соединения по изобретению можно применять профилактически или терапевтически при лечении
нарушений, при которых амилоидный бета-пептид аномально отлагается в не-нейрологических участках,
например, для лечения IBM доставкой соединений к мышечным волокнам, или для лечения дегенерации
жёлтого пятна доставкой соединения (соединений) по изобретению к базальной поверхности ретинального пигментированного эпителия.
Настоящее соединение также охватывает способ модуляции обусловленного амилоидом поражения
клеток, содержащий стадию введения соединения, способного понизить концентрацию Аβ, или способного минимизировать взаимодействие Аβ (растворимого олигомерного или фибриллярного) с клеточной
поверхностью, так что модулируется указанное обусловленное амилоидом поражение клеток. В некоторых аспектах по изобретению способы модуляции поражения клеток, обусловленного амилоидом, содержат стадию введения соединения, способного понизить концентрацию Аβ или ослабить взаимодействие Аβ с клеточной поверхностью.
Кроме того, согласно данному изобретению охватывается способ предупреждения гибели клеток в
организме субъекта, причём указанный способ заключается во введении субъекту терапевтически эффективного количества соединения, способного предупредить опосредованные Аβ события, которые
приводят, непосредственно или опосредованно, к гибели клеток.
Настоящее изобретение также включает способ модуляции обусловленного амилоидом поражения
клеток, содержащий стадию введения соединения, способного понизить концентрацию IAPP, или способного минимизировать взаимодействие IAPP (растворимого олигомерного или фибриллярного) с клеточной поверхностью, так что модулируется указанное обусловленное амилоидом поражение клеток. В
некоторых аспектах изобретения способы модуляции поражения клеток, обусловленного амилоидом,
содержат стадию введения соединения, способного понизить концентрацию IAPP или ослабить взаимодействие IAPP с клеточной поверхностью.
Согласно данному изобретению далее охватывается способ предупреждения гибели клеток в организме субъекта, причём указанный способ заключается во введении субъекту терапевтически эффективное количество соединения, способное предупредить события, опосредованные IAPP, которые приводят,
непосредственно или опосредованно, к гибели клеток.
Данное изобретение также включает способы и композиции, которые применимы при лечении амилоидоза. Способы по изобретению включают введение субъекту терапевтического соединения, которое
ингибирует амилоидное отложение. Соответственно, композиции и способы по изобретению применимы
для ингибирования амилоидоза при нарушениях, при которых происходит отложение амилоида. Способы по изобретению можно применять терапевтически для лечения амилоидоза или можно применять для
профилактики заболеваний у субъектов, предрасположенных к (наследственному) амилоидозу или с
идентифицированным повышенным риском развития амилоидоза, например, наследственного, или с
идентифицированным повышенным риском развития амилоидоза. В некоторых вариантах изобретение
включает способ ингибирования взаимодействия между амилоидогенным белком и компонентом (составляющим) базальной мембраны с целью ингибирования амилоидного отложения. Компонентом базальной мембраны является гликопротеин или протеогликан, предпочтительно, гепаран сульфат протеогликан. Терапевтическое соединение, применяемое в этом способе, может препятствовать связыванию
компонента базальной мембраны с нацеленным сайтом связывания на амилоидогенном белке, тем самым
ингибируя амилоидное отложение.
В некоторых аспектах способы по изобретению включают введение субъекту терапевтического соединения, которое ингибирует амилоидное отложение. "Ингибирование амилоидного отложения" включает предупреждение образования амилоида, ингибирование дальнейшего амилоидного образования у
субъекта, больного амилоидозом, и уменьшение амилоидных отложений у субъекта, больного амилоидозом. Ингибирование амилоидного отложения определяют по отношению к непролеченному субъекту или
по отношению к пролеченному субъекту до лечения. В одном варианте изобретения отложение амилоида
ингибируется за счёт ингибирования взаимодействия между амилоидогенным белком и компонентом
базальной мембраны. Термин "базальная мембрана" относится к внеклеточной матрице, содержащей
- 25 -
019334
гликопротеины и протеогликаны, включая ламинин, коллаген типа IV, фибронектин, перлекан, агрин,
дерматан сульфат и гепаран сульфат протеогликан (HSPG). В одном варианте изобретения отложение
амилоида ингибируется препятствием взаимодействию между амилоидогенным белком и сульфированным гликозамингликаном, таким как HSPG, дерматан сульфат, перлекан или аргин сульфат. Известно,
что сульфированные гликозаминогликаны присутствуют во всех типах амилоидов (см. Snow et al., Lab.
Invest. 56, 120-23 (1987)), a амилоидное отложение и HSPG отложение встречаются случайно на животных моделях амилоидоза (см. Snow et al., Lab. Invest. 56, 665-75 (1987) и Gervais F. et al. Curr. Med Chem.,
3, 361-370 (2003)). Были описаны консенсусные мотивы сайта связывания с HSPG в амилоидогенных
белках (см., например, Cardin and Weintraub Arteriosclerosis 9, 21-32 (1989)).
Способность соединения предупреждать или блокировать образование или отложение амилоида
может крыться в его способности связываться с нефибриллярным, растворимым амилоидным белком и
сохранять его растворимость.
Способность терапевтического соединения по изобретению ингибировать взаимодействие между
амилоидогенным белком и гликопротеиновой или протеогликановой составляющей базальной мембраны
можно оценивать анализом связывания in vitro, таким как анализ, описанный в Патенте США 5164295,
содержание которого вводится в данное описание в качестве ссылки. Или же способность соединения
связываться с амилоидогенным белком или ингибировать связывание компонента базальной мембраны
(например, HSPG) с амилоидогенным белком (например, Аβ) можно измерять методом масс- спектрометрии, в котором растворимый белок, например Аβ, IAPP, β2М, инкубируют с соединением. Соединение, которое связывается, например, с Аβ, вызывает изменение в масс-спектре белка. Типичные протоколы масс-спектрометрического анализа с применением Аβ и IAPP можно найти в примерах, результаты
приведены в табл. 3. Протокол можно легко модифицировать для корректировки точности данных, например, корректируя количество применяемого белка и/или соединения. Таким образом, например, можно детектировать связывание тестируемых соединений, связывание которых не определяется при применении менее чувствительных протоколов тестирования.
Имеются альтернативные способы скрининга соединений, и опытный практик может легко их применять для получения показателя способности тестируемых соединений связываться, например, с фибриллярным Аβ. Одним из таких анализов скрининга является УФ-спектроскопия. В типичном протоколе
тестируемое соединение (20 мкМ) инкубируют с волокнами 50 мкМ Аβ(1-40) в течение 1 ч при 37°С в
физиологическом растворе, забуференном Tris (20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,4, содержащем 0,01 азида
натрия). После инкубации раствор центрифугируют в течение 20 мин при 21000 g для осаждения нитей
Аβ(1-40) вместе с любым связанным тестируемым соединением. Количество тестируемого соединения,
остающегося в супернатанте, можно затем определить, считывая оптическую плотность. Затем можно
рассчитать фракцию связанного тестируемого соединения, сравнивая количество, остающееся в супернатантах после инкубации с Аβ, с количеством, остающимся при контрольных инкубациях, в отсутствие
волокон Аβ. В качестве позитивного контроля в каждый анализ можно вводить тиофлавин Т и Конго
красный, каждый из которых, как известно, связывается с Аβ волокнами. Перед анализом тестируемое
соединение разводят до 40 мкМ, что вдвое больше концентрации в конечном тесте, а затем сканируют на
спектрофотометре Hewlett Packard 8453 UV/VIS для определения, достаточно ли оптической плотности
для детектирования.
В другом варианте изобретение относится к способу к повышению когнитивной функции у субъекта, страдающего амилоидным заболеванием. Способ включает введение эффективного количества терапевтического соединения по изобретению, так чтобы повышалась когнитивная функция. Когнитивную
функцию субъекта можно тестировать, используя способы, известные в уровне техники, такие как Клинический Рейтинг Деменции ("CDR"), мини-исследование Ментального Статуса ("MMSE") или Когнитивная Шкала Оценки Болезни Альцгеймера ("ADAS-Cog").
В другом варианте изобретение относится к способу лечения субъекта от амилоидного заболевания.
Способ включает когнитивное тестирование субъекта перед введением соединения по изобретению, введение эффективного количества соединения по изобретению субъекту и когнитивное тестирование субъекта после введения соединения, так что осуществляется лечение субъекта, если оценка субъекта в указанном когнитивном тесте улучшается.
Термины "улучшение", "улучшенная" ("повышение", "повышенная") когнитивная (познавательная)
способность (функция) употребляются в контексте настоящего изобретения, если существует статистически значимая разница в нормальном состоянии между поведением субъектов, пролеченных способами
по изобретению, по сравнению с членами группы, принимавшей плацебо, предыдущими контрольными
показателями или между последовательными тестами одного и того же субъекта.
В одном варианте изобретения CDR субъекта сохраняет значение 0. В другом варианте изобретения
CDR субъекта понижается (т.е. улучшается), примерно на 0,25 или более, примерно на 0,5 или более,
примерно на 1,0 или более, примерно на 1,5 или более, примерно на 2,0 или более, примерно на 2,5 или
более, примерно на 3,0 или более. В другом варианте изобретения скорость повышения рейтинга CDR
субъекта уменьшается, примерно на 5% или более, примерно на 10% или более, примерно на 20% или
- 26 -
019334
более, примерно на 25% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно
на 50% или более, примерно на 60% или более, примерно на 70% или более, примерно на 80% или более,
примерно на 90% или более, или примерно на 100% или более, по сравнению с контрольными предыдущими данными повышения или с контрольными данными повышения в отсутствие лечения.
В одном варианте изобретения оценка MMSE субъекта сохраняется. Или же оценка MMSE может
повышаться примерно на 1, примерно на 2, примерно на 3, примерно на 4, примерно на 5, примерно на
7,5, примерно на 10, примерно на 12,5, примерно на 15, примерно на 17,5, примерно на 20 или примерно
на 25 баллов. В другом варианте изобретения скорость уменьшения оценки MMSE субъекта снижается
по сравнению с предыдущими контрольными данными. Например, скорость уменьшения оценки MMSE
субъекта снижается примерно на 5% или более, примерно на 10% или более, примерно на 20% или более,
примерно на 25% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50%
или более, примерно на 60% или более, примерно на 70% или более, примерно на 80% или более, примерно на 90% или более, примерно на 100% или более, по сравнению с контрольными предыдущими
данными уменьшения или с контрольными данными уменьшения в отсутствие лечения.
В одном варианте изобретение относится к способу лечения, замедления или прекращения амилоидного заболевания, ассоциированного с когнитивной недостаточностью (когнитивным расстройством),
путём введения субъекту эффективного количества терапевтического соединения, причём ежегодное
ухудшение когнитивной функции субъекта по шкале ADAS-Cog составляет менее 8 пунктов в год, менее
6 пунктов в год, менее 5 пунктов в год, менее 4 пунктов в год или менее 3 пунктов в год. Ещё в одном
варианте изобретение относится к способу лечения, замедления или прекращения амилоидного заболевания, ассоциированного с когнитивной функцией, путём введения субъекту эффективного количества
терапевтического соединения, так чтобы когнитивная функция субъекта по шкале ADAS-Cog оставалась
постоянной в течение года. Термин "постоянная" включает флуктуации (отклонения) не более 2 пунктов.
"Оставаться постоянным" включает флуктуации два пункта или менее в любом направлении. Ещё в одном варианте изобретения когнитивная функция субъекта улучшается на 2 пункта или более в год, на 3
пункта или более в год, на 4 пункта или более в год, на 5 пунктов или более в год, на 6 пунктов или более
в год, на 7 пунктов или более в год, на 8 пунктов или более в год, и т.д. по шкале ADAS-Cog. В другом
альтернативном варианте скорость увеличения оценки ADAS-Cog субъекта по сравнению с предыдущими контрольными снижается. Например, скорость увеличения оценки ADAS-Cog субъекта может снижаться примерно на 5% или более, примерно на 10% или более, примерно на 20% или более, примерно
на 25% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более,
примерно на 60% или более, примерно на 70% или более, примерно на 80% или более, примерно на 90%
или более, примерно на 100% или более, по сравнению с контрольными предыдущими данными увеличения или с контрольными данными увеличения в отсутствие лечения.
В другом варианте изобретения отношение Аβ42:Аβ40 в CSF или плазме субъекта снижается примерно на 15% или более, примерно на 20% или более, примерно на 25% или более, примерно на 30% или
более, примерно на 35% или более, примерно на 40% или более, примерно на 45% или более или примерно на 50% или более. В другом варианте изобретения уровни Аβ в спинномозговой жидкости субъекта снижаются примерно на 15% или более, примерно на 25% или более, примерно на 35% или более,
примерно на 45% или более, примерно на 55% или более, примерно на 75% или более или примерно на
90% или более.
Следует понимать, что повсюду, где в данном описании представлены величины и интервалы величин, например, возраст популяций субъектов, доза и уровни в крови, предполагается, что все значения и
интервалы, охватываемые этими величинами и интервалами, входят в объём настоящего изобретения.
Кроме того, все значения и интервалы могут также быть выше или ниже пределов интервала.
Кроме того, изобретение относится к любому новому химическому соединению по данному описанию. То есть, изобретение относится к новым соединениям и новым способам их применения по данному описанию, которые входят в объём раскрываемой в данном описании формулы изобретения и которые не раскрываются в цитированных патентах и патентных заявках.
Синтез соединений по изобретению
Обычно соединения по настоящему изобретению можно получать способами, проиллюстрированными на общих схемах реакций, например, описанных ниже, или модификациями этих способов, применяя легко доступные исходные, реагенты и обычные методы синтеза. В этих реакциях также возможно
использовать варианты, которые известны сами по себе, но не упоминаются здесь. Также включены
функциональные и структурные эквиваленты соединений по данному описанию, которые имеют одинаковые общие свойства, при этом получены один или более простых вариантов заместителей, которые не
оказывают вредного влияния на основные свойства или полезность соединения.
Соединения по настоящему изобретению можно легко получать по схемам и протоколам синтезов
по данному описанию, проиллюстрированным представленными конкретными методиками. Однако специалисты в данной области техники понимают, что можно использовать другие синтетические методы
получения соединений по данному изобретению и что нижеприведённые методы даны лишь в качестве
- 27 -
019334
примера и не являются ограничивающими данное изобретение. См., например, "Comprehensive Organic
Transformations" by R. Larock, VCH Publishers (1989). Также понятно, что применяется различная стандартная в уровне техники стратегия введения и снятия защитных групп (См., например, "Protective
Groups in Organic Synthesis" by Greene and Wuts). Специалисты в релевантной области техники знают,
что выбор любой конкретной защитной группы (например, защитной амино или карбоксильной группы)
зависит от устойчивости защитного фрагмента в условиях последующих реакций и поймут, какой выбор
надо сделать.
Ниже выборочно представлены образцы обширной химической литературы в качестве иллюстрации знаний специалистов в данной области техники: "Chemistry of the Amino Acids" by J. P. Greenstein
and M. Winitz, John Wiley & Sons, Inc., New York (1961); "Comprehensive Organic Transformations" by R.
Larock, VCH Publishers (1989); T.D. Ocain et al., J. Med. Chem. 31, 2193-99 (1988); E.M. Gordon, et al., J.
Med. Chem. 31, 2199- 10 (1988); "Practice of Peptide Synthesis" by M. Bodansky and A. Bodanszky, SpringerVerlag, New York (1984); "Protective Groups in Organic Synthesis" by T. Greene and P. Wuts (1991); "Asymmetric Synthesis: Construction of Chiral Molecules Using Amino Acids" by G. M. Coppola and H.F. Schuster,
John Wiley & Sons, Inc., New York (1987), "The Chemical Synthesis of Peptides" by J. Jones, Oxford University Press, New York (1991); и "Introduction of Peptide Chemistry" by P. D. Bailey, John Wiley & Sons, Inc.,
New York (1992).
Синтез соединений по изобретению проводят в растворителе. Подходящими растворителями являются вещества, жидкие при комнатной температуре и при обычном давлении или остающиеся в жидком
состоянии при температуре и давлении реакции. Подходящие растворители конкретно не ограничиваются при условии, что они не препятствуют самой реакции (т.е., предпочтительно, они являются инертными растворителями) и они растворяют определённое количество реагентов. В зависимости от обстоятельств растворители могут быть перегнанными или дегазированными. Растворителями могут быть, например, алифатические углеводороды (например, смесь гексанов, гептанов, лигроин, петролейный эфир,
циклогексан или метилциклогексан) и галогенированные углеводороды (например, хлористый метилен,
хлороформ, четырёххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол, или дихлорбензол); ароматические углеводороды (например, бензол, толуол, тетрагидронафталин (тетралин), этилбензол или ксилол); простые эфиры (например, диглим, метил- трет- бутиловый эфир, этил-трет-бутиловый эфир, диэтиловый
эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран или метилтетрагидрофураны, диоксан, диметоксиэтан
или диметиловый эфир диэтиленгликоля); нитрилы (например, ацетонитрил); кетоны (например, ацетон);
сложные эфиры (например, метилацетат или этилацетат) и их смеси.
Как правило, после окончания реакции продукт выделяют из реакционной смеси обычными методами. Например, растворитель удаляют упариванием или фильтрованием, если продуктом является твёрдое вещество, необязательно в вакууме. По завершении реакции к остатку можно добавлять воду, подкислять или подщелачивать водный слой и отфильтровывать, но следует быть осторожными при работе с
неустойчивыми в воде веществами. Аналогично, к реакционной смеси можно добавлять воду с гидрофобным растворителем для экстракции нацеленного соединения. Органический слой можно промывать
водой, сушить безводным сульфатом магния или сульфатом натрия и упаривать растворитель, получая
заданное соединение. Полученное таким образом заданное соединение можно, при необходимости, очищать, например, перекристаллизацией, повторным осаждением (репреципитацией), хроматографией, или
превращая в соль добавлением кислоты или основания.
Соединения по изобретению могут поставляться в растворе в подходящем растворителе или не содержащей растворителя форме (например, в лиофилизированном виде). В другом аспекте изобретения
соединения и буферы, необходимые для осуществления способов по изобретению, могут быть упакованы в виде набора, необязательно включающего контейнер. Набор может применяться для лечения или
предупреждения амилоидного заболевания в соответствии со способами по данному описанию и может
содержать инструкции по применению в способе по изобретению. Дополнительные компоненты набора
могут включать кислоты, основания, буферизующие агенты, неорганические соли, растворители, антиоксиданты, консерванты или хелаторы металлов. Дополнительные компоненты набора присутствуют в
виде чистых композиций или в виде водных растворов или растворов в органических растворителях, которые содержат один или более дополнительных компонентов набора. Кроме того, любой компонент или
все компоненты набора, необязательно, содержат буферы.
Термин "контейнер" включает любую тару для хранения терапевтического соединения. Например,
в одном варианте изобретения контейнер представляет собой упаковку, которая содержит соединение. В
других вариантах изобретения контейнер не представляет собой упаковку, содержащую вещество, т.е.
контейнер представляет собой тару, такую как коробка или склянка (флакон), которая содержит упакованное соединение или неупакованное соединение и инструкции по применению соединения. Кроме того, методы упаковки общеизвестны в уровне техники. Следует понимать, что инструкции по применению терапевтического соединения могут быть в упаковках, содержащих терапевтическое соединение,
что помогает при работе с этим соединением.
Фармацевтические препараты
В другом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержа- 28 -
019334
щим агенты формулы V по данному описанию для лечения амилоидного заболевания, а также способы
производства таких фармацевтических композиций.
Обычно агенты по настоящему изобретению можно получать способами, проиллюстрированными
на общих схемах реакций, например, в патентах и патентных заявках, указанных в данном описании, или
модификацией этих способов, с применением легкодоступных исходных, реагентов и обычных методов
синтеза. В этих реакциях можно также применять варианты, которые известны сами по себе, но не упоминаются в данном описании. Также включены функциональные и структурные эквиваленты агентов по
данному описанию, которые имеют одинаковые общие свойства, при этом получены один или более
простых вариантов заместителей, которые не оказывают вредного влияния на основные свойства или
полезность соединения.
Агенты по изобретению могут поставляться в растворе в подходящем растворителе или в не содержащей растворителя форме (например, в лиофилизированном виде). В другом аспекте изобретения агенты и буферы, необходимые для осуществления способов по изобретению, могут быть упакованы в виде
набора. Набор может применяться в соответствии со способами по данному описанию и может содержать инструкции по применению в способе по изобретению. Дополнительные компоненты набора могут
включать кислоты, основания, буферизующие агенты, неорганические соли, растворители, антиоксиданты, консерванты или хелаторы металлов. Дополнительные компоненты набора присутствуют в виде чистых композиций или в виде водных растворов или растворов в органических растворителях, которые
содержат один или более дополнительных компонентов набора. Кроме того, любой компонент или все
компоненты набора, необязательно, содержат буферы.
Терапевтический агент можно также вводить парентерально, интраперитонеально, интраспинально
или интрацеребрально. Можно приготовить дисперсии в глицерине, жидкие полиэтиленгликоли и их
смеси, и в маслах. В обычных условиях хранения эти препараты могут содержать консервант для предупреждения роста микроорганизмов.
Для введения терапевтического агента другим методом, нежели парентаральный, необходимо покрыть агент материалом для предупреждения его инактивации или ввести агент вместе с этим материалом. Например, терапевтический агент можно вводить субъекту в подходящем носителе, например, в
липосомах, или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический
раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают CGF эмульсии вода в-масле в воде, а также
обычные липосомы (Stejan et al., J. Neuroimmunol. 7,27 (1984)).
Фармацевтические композиции, пригодные для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (если они растворимы в воде) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления инъецируемых растворов или дисперсии. Во всех случаях композиция должна
быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы её можно было легко набирать шприцем. Она должна быть устойчивой в условиях производства и хранения и должна сохраняться от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибки.
Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, любые неиммуногенные фармацевтические адъюванты, пригодные для орального, парентерального, назального, "мукозного", трансдермального, интраваскулярного (внутрисосодистого) (IV), внутриартериального (IA),
внутримышечного (IM) и подкожного (SC) применения, такие как фосфатно-солевой буферный раствор
(PBS).
Носитель может быть растворителем или средой для дисперсии, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие
смеси и растительные масла. Соответствующую текучесть можно сохранять, применяя, например, покрытие, такое как лецитин, поддерживая нужный размер частиц в случае дисперсии и применяя поверхностно-активные вещества. Предупреждать действие микроорганизмов можно с помощью различных
антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях в состав композиции входят изотонические агенты,
например, сахара, хлорид натрия или многоатомные спирты, такие как маннит и сорбит. Пролонгированное всасывание инъецируемых композиций можно осуществить, вводя в композицию агент, который
замедляет всасывание, например моностеарат алюминия или желатин.
Стерильные инъецируемые растворы можно приготовить, вводя нужное количество терапевтического агента в подходящий растворитель с одним или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, если требуется, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят, вводя
терапевтический агент в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и
требуемые другие вышеперечисленные ингредиенты. В случае стерильных порошков для приготовления
стерильных инъецируемых растворов способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, при этом получают порошок активного ингредиента (т.е. терапевтический агент) плюс дополнительный нужный ингредиент из его раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.
Терапевтический агент можно вводить (пер)орально, например, с инертным разбавителем или усвояемым пищевым носителем. Терапевтический агент и другие ингредиенты могут быть также заключены в твёрдую или мягкую желатиновую капсулу, спрессованы в таблетки или вводиться непосредствен- 29 -
019334
но в пищу субъекта. Для орального терапевтического применения терапевтический агент можно вводить
с эксципиентами и применять в виде таблеток для проглатывания, трансбуккальных таблеток, пастилок,
капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Процентное содержание терапевтического агента в
композициях и препаратах, естественно, может меняться.
Количество терапевтического агента в таких композициях для применения в терапии таково, что
получают нужную дозу.
Для простоты применения и однородности дозировки особенно предпочтительно готовить парентеральные композиции в виде стандартных лекарственных форм. Стандартная лекарственная форма по
данному описанию относится к физически дискретным единицам, применимым в качестве однократных
доз для проходящих лечение людей; причём каждая единица содержит заданное количество терапевтического агента, которое, вместе с требуемым терапевтическим носителем, по расчётам, вызывает нужный
терапевтический эффект. Технические требования к стандартным лекарственным формам по изобретению диктуются и непосредственно определяются (зависят от): (а) индивидуальными особенностями (характеристиками) терапевтического агента и конкретным ожидаемым терапевтическим эффектом и б)
ограничениями, свойственными технике приготовления смесей данного терапевтического агента для лечения амилоидного отложения у субъектов.
Следовательно, настоящее изобретение включает фармацевтические препараты, содержащие агенты по формуле V данного описания, в том числе их фармацевтически приемлемые соли, в фармацевтически приемлемых носителях для аэрозоля, орального и парентерального применения. Также настоящее
изобретение включает такие агенты или их соли, которые лиофилизированы и которые могут быть восстановлены с образованием фармацевтически приемлемых препаратов для внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции. Введение может также быть интрадермальным или трансдермальным
(внутрикожным и чрескожным). Согласно настоящему изобретению агент формулы V данного описания
и его фармацевтически приемлемые соли можно вводить орально или ингаляцией в виде твёрдого вещества или можно вводить внутримышечно или внутривенно в виде раствора, суспензии или эмульсии. Или
же агенты или соли можно также вводить ингаляцией, внутривенно или внутримышечно в виде липосомной суспензии.
Также охватываются фармацевтические препараты, пригодные для применения в виде аэрозоля, ингаляцией. Эти препараты содержат раствор или суспензию нужного агента формулы V данного описания
или его соли, или множество твёрдых частиц агента или соли. Заданный препарат можно помещать в
небольшую камеру и распылять. Распыление можно осуществлять с помощью сжатого воздуха или ультразвука, при этом образуется множество капелек жидкости или твёрдых частиц, содержащих агент или
соли. Капельки жидкости или твёрдые частицы должны иметь размер примерно 0,5-5 мкм.
Твёрдые частицы можно получать, обрабатывая твёрдый агент формулы V данного описания, или
его соль, любым подходящим способом, известным в уровне техники, например очень тонким измельчением. Например, размер твёрдых частиц или капелек составляет около 1-2 мкм. Для того, чтобы достичь
этого, применяют промышленные распылители (небулайзеры).
Фармацевтический препарат, пригодный для применения в аэрозоле, может быть в виде жидкости,
препарат содержит водорастворимый агент формулы V данного описания или его соль в носителе, содержащем воду. Может присутствовать поверхностно-активное вещество, которое уменьшает поверхностное натяжение препарата в достаточной степени, чтобы при распылении образовывались капельки
нужного размера.
Композиции для перорального применения включают также жидкие растворы, эмульсии, суспензии
и т.п. Фармацевтически приемлемые носители, пригодные для приготовления таких композиций, общеизвестны в уровне техники. Типичные компоненты носителей для сиропов, эликсиров, эмульсий и суспензий включают этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, жидкую сахарозу, сорбит и
воду. Типичные суспендирующие агенты для приготовления суспензий включают метилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу, трагакант и альгинат натрия; типичные поверхностно-активные вещества
включают лецитин и полисорбат 80, и типичные консерванты включают метилпарабен и бензоат натрия.
Пероральные жидкие композиции могут также содержать один или более компонентов, таких как подсластители, агенты, придающие вкус и запах, и красители, раскрываемые выше.
Фармацевтические композиции можно также покрывать обычными способами, как правило, покрытиями, зависящими от рН или от времени, так что агент по изобретению высвобождается в желудочнокишечном тракте вблизи заданного места применения или в различное время, чтобы достичь нужного
действия. Такие лекарственные формы обычно включают, но без ограничения, один из следующих агентов: ацетат фталат целлюлозы, фталат поливинилацетата, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, этилцеллюлозу, воски и шеллак.
Другие композиции, применимые для системной доставки агентов по изобретению, включают
подъязычные, трансбуккальные и назальные лекарственные формы. Такие композиции, как правило, содержат один или более наполнителей, таких как сахароза, сорбит и маннит; и связующие, такие как смола акации аравийской, микрокристаллическая целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза. Также в состав могут входить раскрываемые выше вещества, способствующие прогла- 30 -
019334
тыванию, смазки, подсластители, красители, антиоксиданты и вещества, придающие вкус и запах.
Также возможно топическое (местное) применение композиций по данному изобретению, например, путём непосредственного нанесения слоя или распределения композиции на эпидермальную или
эпителиальную ткань субъекта, или трандермальное применение с помощью "пластыря". Такие композиции включают, например, лосьоны, кремы, растворы, гели и твёрдые вещества. Эти топические композиции могут содержать эффективное количество обычно по меньшей мере около 0,1% или даже около 15% агента по изобретению. Подходящие носители для топического (местного) применения обычно остаются на коже в виде сплошной плёнки и нелегко удаляется под действием кожного дыхания или воды.
Обычно носитель является по природе органическим соединением и может диспергировать или растворять терапевтический агент. Носитель может содержать фармацевтически приемлемые эмольенты,
эмульгаторы, загустители, растворители и т.п.
В одном варианте изобретения активный агент применяют в терапевтически эффективной дозе,
достаточной для ингибирования амилоидного отложения в организме субъекта. Например, "терапевтически эффективная" доза ингибирует отложение по меньшей мере приблизительно на 20% или по меньшей
мере приблизительно на 40%, или даже по меньшей мере приблизительно на 60%, или по меньшей мере
приблизительно на 80% по сравнению с непропеченными субъектами. У пациента с болезнью Альцгеймера "терапевтически эффективная" доза стабилизирует когнитивную функцию или предупреждает
дальнейшее ухудшение когнитивной функции (т.е., предупреждение, замедление или прекращение прогрессирования заболевания). Соответственно настоящее изобретение охватывает терапевтические лекарственные вещества. Под "лекарственным средством" или "лекарственным веществом" понимают агент,
оказывающий благотворное целебное или профилактическое действие на конкретное заболевание или
состояние человека или животного.
В случае АА и AL амилоидоза агент может улучшить или стабилизировать конкретную функцию
органа. В качестве примера почечную функцию можно стабилизовать или улучшить на 10% или выше,
на 20% или выше, на 30% или выше, на 40% или выше, на 50% или выше, на 60% или выше, на 70% или
выше, на 80% или выше, или выше чем на 90%.
В случае IAPP агент может сохранять или улучшать функцию островковых β-клеток, определяемую
концентрацией инсулина или отношением Рro-IAPP/IAPP. В другом варианте изобретения отношение
Pro-IAPP/APP повышается примерно на 10% или больше, примерно на 20% или больше, примерно на
30% или больше, примерно на 40% или больше или примернона 50%. В другом варианте изобретения
отношение повышается до 50%. Кроме того, терапевтически эффективное количество агента может эффективно улучшать уровни гликемии или инсулина.
В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе,
достаточной для лечения АА (вторичного) амилоидоза и/или AL (первичного) амилоидоза, с помощью
стабилизации почечной функции, снижения протеинурии, повышения клиренса креатинина (например,
по меньшей мере на 50% или больше или по меньшей мере на 100% или больше), ремиссии хронической
диареи или увеличения веса (например, на 10% или больше). Кроме того, агенты можно применять в терапевтически эффективной дозе, достаточной для положительной динамики при нефротическом синдроме.
Кроме того, активные агенты можно вводить в терапевтически эффективной дозе, достаточной для
уменьшения у субъекта отложения амилоидного белка, например Аβ40 или Аβ42. Например, терапевтически эффективная доза уменьшает амилоидное отложение по меньшей мере приблизительно на 15%,
или по меньшей мере приблизительно на 40%, или даже по меньшей мере приблизительно на 60%, или
по меньшей мере приблизительно на 80% относительно непролеченных субъектов.
В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе,
достаточной для увеличения амилоидного белка, например Аβ40 или Аβ42 в крови, CSF или плазме
субъекта. Например, терапевтически эффективная доза повышает концентрацию по меньшей мере приблизительно на 15%, или по меньшей мере приблизительно на 40%, или даже по меньшей мере приблизительно на 60%, или по меньшей мере приблизительно на 80% относительно непролеченных субъектов.
Ещё в одном варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы сохранить рейтинг CDR субъекта на уровне исходного или на уровне 0.
В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы понизить рейтинг CDR субъекта, примерно на 0,25 или более, примерно на 0,5
или более, примерно на 1,0 или более, примерно на 1,5 или более, примерно на 2,0 или более, примерно
на 2,5 или более, или 3,0 или более. В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы понизить скорость увеличения рейтинга
CDR субъекта по сравнению с контрольными предыдущими данными или с контрольными данными,
полученными на непролеченных пациентах. В другом варианте изобретения терапевтически эффективной дозы достаточно для того, чтобы понизить скорость увеличения рейтинга CDR (относительно непролеченных субъектов) примерно на 5% или более, примерно на 10% или более, примерно на 20% или более, примерно на 25% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на
- 31 -
019334
50% или более, примерно на 60% или более, примерно на 70% или более, примерно на 80% или более,
примерно на 90% или более или, примерно на 100% или более.
Ещё в одном варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы сохранить оценки MMSE субъекта. В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы увеличить
число баллов MMSE примерно на 1, примерно на 2, примерно на 3, примерно на 4, примерно, на 5, примерно на 7,5, примерно на 10, примерно на 12,5, примерно на 15, примерно на 17,5, примерно на 20 или
примерно на 25 баллов. В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически
эффективной дозе, достаточной для того, чтобы снизить скорость уменьшения оценки MMSE субъекта
по сравнению с предыдущими контрольными. В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы можно было снизить скорость
уменьшения оценки MMSE субъекта примерно на 5% или менее, примерно на 10% или менее, примерно
на 20% или менее, примерно на 25% или менее, примерно на 30% или менее, примерно на 40% или менее, примерно на 50% или менее, примерно на 60% или менее, примерно на 70% или менее, примерно на
80% или менее, примерно на 90% или менее, примерно на 100% или менее, по сравнению с контрольными предыдущими данными уменьшения или с контрольными данными уменьшения в отсутствие лечения.
Ещё в одном варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы сохранить оценки ADAS-Cog субъекта. В другом варианте изобретения
активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе, достаточной для того, чтобы снизить
оценки ADAS-Cog субъекта примерно на 2 пункта или более, примерно на 3 пункта или более, примерно
на 4 пункта или более, примерно на 5 пунктов или более, примерно на 7,5 пунктов или более, примерно
на 10 пунктов или более, примерно на 12,5 пунктов или более, примерно на 15 пунктов или более, примерно на 17,5 пунктов или более, примерно на 20 пунктов или более, или примерно на 25 пунктов или
более. В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе,
достаточной для того, чтобы снизить скорость увеличения оценки ADAS-Cog субъекта по сравнению с
предыдущими контрольными или с контрольными данными, полученными в отсутствие лечения. В другом варианте изобретения терапевтически эффективной дозы достаточно для того, чтобы снизить скорость увеличения оценки ADAS-Cog субъекта (относительно непролеченных субъектов), примерно на
5% или более, примерно на 10% или более, примерно на 20% или более, примерно на 25% или более,
примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60%
или более, примерно на 70% или более, примерно на 80% или более, примерно на 90% или более, примерно на 100% или более.
В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе,
достаточной для того, чтобы понизить отношение Аβ42:Аβ40 в CSF или плазме субъекта примерно на
15% или более, примерно на 20% или более, примерно на 25% или более, примерно на 30% или более,
примерно на 35% или более, примерно на 40% или более, примерно на 45% или более или примерно на
50% или более.
В другом варианте изобретения активные агенты применяют в терапевтически эффективной дозе,
достаточной для того, чтобы понизить уровень Аβ в CSF или плазме субъекта примерно на 15% или более, примерно на 25% или более, примерно на 35% или более, примерно на 45% или более, примерно на
55% или более, или примерно на 75% или более или примерно на 95% или более.
Токсичность и терапевтическую эффективность таких агентов можно определить стандартными
фармацевтическими методами на клеточных культурах или на подопытных животных, например, с целью определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной в 50% популяции). Отношение доз, вызывающих токсический и терапевтический эффект, есть терапевтический индекс, оно может быть также выражено в виде отношения LD50/ED50 и обычно чем больше терапевтический индекс, тем выше эффективность. Когда применяются агенты, которые обладают
побочным действием, следует с осторожностью подходить к созданию системы доставки, которая нацеливает такие агенты на поражённую ткань, чтобы свести к минимуму возможное поражение непоражённых клеток и, тем самым, уменьшить побочный эффект.
Ясно, что соответствующие дозы зависят от ряда факторов, известных рядовому врачу, ветеринару
или исследователю. Доза(ы) низкомолекулярного вещества меняются, например, в зависимости от особенностей, размера (габаритов) и состояния подлежащего лечению субъекта или обрабатываемого образца, кроме того, они зависят от способа введения композиции, если он применим, и от действия, которое, по предположению практикующего врача, низкомолекулярное вещество должно оказать на субъекта. Типичные дозы включают миллиграммы или микрограммы низкомолекулярного вещества на килограмм веса субъекта или образца (например, около 1-500 мкг/кг, примерно от 100 мкг/кг до 5 мг/кг или
около 1-50 мкг/кг). Понятно, кроме того, что соответствующие дозы зависят от активности (вещества).
Такие подходящие дозы можно определить методами анализа по данному описанию. Если животному
(например, человеку) нужно вводить одно или более таких соединений, врач, ветеринар или исследова- 32 -
019334
тель предписывает сравнительно низкую дозу, последовательно её повышая до тех пор, пока не будет
получен нужный ответ. Кроме того, понятно, что специфичный уровень дозы для любого конкретного
животного субъекта зависит от многих факторов, включая активность конкретного применяемого агента,
возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол и питание субъекта, время введения, способ применения, скорость экскреции и любую комбинацию лекарственных веществ.
Способность агента ингибировать амилоидное отложение можно оценивать на животной модельной системе, которая помогает прогнозировать эффективность ингибирования амилоидного отложения
при болезнях человека, например, на трансгенной мыши, экспрессирующей человеческий АРР, или на
других животных моделях, в которых наблюдается отложение Аβ, или, например, на животной модели
АА амилоидоза. Аналогично, способность агента предупреждать или уменьшать когнитивную недостаточность (когнитивное расстройство) в модельной системе может быть показателем эффективности у
людей. Или же, способность агента можно оценивать, изучая способность агента ингибировать образование амилоидных фибрилл in vitro, например, анализ фибриллогенеза, например, по данному описанию,
включая анализ ThT, CD или ЕМ. Также можно определять (измерять) связывание агента с амилоидными
фибриллами MS анализом по данному описанию. Способность агента защищать клетки от индуцированной амилоидом токсичности оценивают in vitro биохимическими анализами, определяя процент гибели
клеток, вызванной амилоидным белком. Способность агента модулировать почечную функцию можно
также оценивать на подходящей животной модельной системе.
Терапевтический агент по изобретению можно также применять in vivo для ингибирования амилоидного отложения или лечения некоторых амилоидных заболеваний, таких как β2М амилоидоз и другие
диализные амилоидозы. Ex vivo применение терапевтических агентов по изобретению можно осуществлять при контакте жидкости организма (например, крови, плазмы) с терапевтическим соединением по
данному изобретению, так что терапевтическое соединение может осуществлять свою предполагаемую
функцию, а затем вводить эту жидкость из организма субъекту. Терапевтическое соединение по изобретению может осуществлять свою функцию ex vivo (например, диализный фильтр), in vivo (например,
вводимое с жидкостью организма) или обоими способами. Например, терапевтическое соединение по
изобретению можно применять для снижения уровней β2М в плазме и/или сохранения β2М в растворимой форме ex vivo, in vivo или как ex vivo, так и in vivo.
Гематоэнцефалический барьер
Вне зависимости от конкретного механизма, по которому соединение проявляет своё биологическое действие, это соединение предупреждает или лечит амилоидные заболевания, например такие, как
болезнь Альцгеймера, САА, обусловленный диабетом амилоидоз, AL амилоидоз, синдром Дауна или
β2М амилоидоз. Соединение может реверсировать отложение амилоида или способствовать отложению
амилоида, или соединение может способствовать клиренсу бляшек, или замедлять (затруднять) отложение. Например, соединение может уменьшать концентрацию амилоида в мозге субъекта по сравнению с
непролеченным субъектом. Соединение может проникать в мозг через гематоэнцефалический барьер
("ВВВ") для проявления своего биологического действия. Соединение может сохранять амилоид в нефибриллярной форме, или же соединение может повышать скорость клиренса растворимого амилоида из
мозга субъекта по сравнению с непролеченным субъектом. Соединение может также повышать скорость
расщепления Аβ в мозге до объединения в фибриллы. Соединение может также действовать на периферии, вызывая изменение равновесия концентрации амилоидного белка в двух компартментах (т.е. системный против (vs) центрального), в этом случае соединение не обязательно должно проникать в мозг
для того, чтобы снизить концентрацию Аβ в мозге ("синк"- эффект, эффект проникновения, просачивания).
Агенты по изобретению, которые проявляют физиологическое действие in vivo в мозге, могут быть
более применимы, если им облегчается доступ к клеткам-мишеням в мозге. Не ограничивающими примерами клеток мозга являются нейроны, глиальные клетки (астроциты, олигодендроциты, микроглия),
клетки сосудов мозга (мышечные клетки, эндотелиальные клетки) и клетки, которые содержат оболочки
мозга. Гематоэнцефалический барьер ("ВВВ") обычно ограничивает доступ к клеткам мозга, действуя
как в качестве физической, так и в качестве функциональной блокады, которая отделяет паренхиму мозга
от системного кровотока (см., например, Partridge et al., J. Neurovirol. 5(6), 556-69 (1999); Rubin et al., Rev.
Neurosci. 22, 11- 28 (1999)). Молекулам (вещества) в кровотоке обычно облегчён доступ к клеткам мозга
по одному из двух способов: опосредованный липидами перенос (транспорт) через ВВВ с помощью свободной диффузии или активный (или катализируемый) транспорт.
Агенты по изобретению можно готовить таким образом, чтобы улучшить распределение in vivo,
например, в виде порошковых или жидких таблеток или раствора для орального применения или в виде
назального спрея, капель в нос, геля или мази, с помощью трубки или катетера, шприцем, коктейлем,
тампоном (компрессом) или в виде инфузии под слизистую оболочку. Например, гематоэнцефалический
барьер (ВВВ) исключает множество высокогидрофильных агентов. Для того, чтобы гарантировать проникновение более гидрофильных терапевтических агентов по изобретению через ВВВ, их можно готовить, например, в липосомах. О способах производства липосом см., например, патенты США 4522811;
- 33 -
019334
5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать один или более частей, фрагментов, которые селективно
переносятся в конкретные (специфичные) клетки или органы ("нацеливающие (направляющие) частицы
(фрагменты)", или "наводящие группы, группы наведения", или "векторы транспорта"), тем самым обеспечивая доставку нацеленного лекарственного вещества (см., например, V.V. Ranade J. Clin. Pharmacol.
29, 685 (1989)). Аналогично, агенты могут быть связаны с нацеливающими группами, которые облегчают
проникновение через гематоэнцефалический барьер. В одном варианте в способе по настоящему изобретению применяется полиамин, связанный с агентом, который является низкомолекулярным соединением
и применим для ингибирования, например, Аβ отложения.
Для облегчения транспорта (переноса) агентов по изобретению через ВВВ их можно соединить с
вектором транспорта через ВВВ (обзор о векторах и механизмах транспорта через ВВВ см., Bickel et al.,
Adv. Drug Delivery Reviews 46, 247-79 (2001)). Типичные векторы транспорта включают катионы альбумина или ОХ26 моноклональное антитело к рецептору трансферрина; эти белки претерпевают опосредованный всасыванием и рецептор-опосредованный, соответственно, трансцитоз через ВВВ. Природные
метаболиты клеток, которые можно применять в качестве нацеливающих групп, включают, среди прочих, путресцин, спермидин, спермин или DHA. Другие типичные нацеливающие группы включают фолат или биотин (см., например, Патент США 5416016); маннозиды (Umezawa et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 153, 1038 (1988)); антитела (P.G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357, 140 (1995); M. Owais, et al.,
Antimicrob. Agents Chemother. 39, 180 (1995)); рецептор сурфактантного протеина A (Briscoe, et al., Am. J.
Physiol 1233, 134 (1995)); gpl20 (Schreier, et al., J. Biol. Chem. 269, 9090 (1994); см также K. Keinanen and
M. L. Laukkanen, FEBS Lett. 346, 123 (1994); J. J. Killon and I. J. Fidler, Immunomethods 4, 273 (1994).
Примеры других векторов транспорта через ВВВ, которые нацеливают системы рецептор- опосредованного транспорта в мозг, включают факторы, такие как инсулин, инсулиноподобный фактор роста
("IGF-I" и "IGF-II"), ангиотензин II, предсердный и мозговой натрийуретический пептид ("ANP" и
"BNP") и трансферрин. Моноклональные антитела к рецепторам, которые связывают эти факторы, могут
также применяться в качестве векторов транспорта через ВВВ. Механизмы нацеливания векторов транспорта через ВВВ в случае обусловленного всасыванием трансцитоза включают катионные фрагменты,
такие как катионный LDL, альбумин или пероксидаза хрена, соединённая с полилизином, катионный
альбумин или катионные иммуноглобулины. Низкомолекулярные основные олигопептиды, такие как
аналог динорфина Е-2078 и аналог АСТН эбиратид, также могут проникать в мозг с помощью опосредованного всасыванием трансцитоза и потенциальных векторов транспорта.
Другие векторы транспорта через ВВВ нацеливают системы на перенос питательных веществ в
мозг. Примеры таких ВВВ векторов транспорта включают гексозные частицы, например, глюкозу, и монокарбоновые кислоты, например, молочную кислоту и нейтральные аминокислоты, например, фенилаланин и амины, например, холин, и основные аминокислоты, например, аргинин, нуклеозиды, например,
аденозин, и пуриновые основания, например, аденин, и тиреоидный гормон, например, трийодтиридин.
Антитела к внеклеточному домену переносчиков питательных веществ также можно применять в качестве векторов транспорта. Другие возможные векторы включают ангиотензин II и ANP, которые могут
участвовать в регуляции проницаемости ВВВ.
В некоторых случаях связь, соединяющая терапевтический агент с вектором транспорта, можно
расщепить после переноса (транспорта) в мозг для того, чтобы освободить биологически активный агент.
Типичные линкеры включают дисульфидные связи, сложноэфирные связи, тиоэфирные связи, амидные
связи, связывание в виде слабых кислот и связывание в виде оснований Шиффа. Также можно использовать авидин/биотиновые линкеры, в которых авидин ковалентно связан с вектором транспорта лекарственного вещества через ВВВ. Авидин сам по себе может являться вектором транспорта лекарственного
вещества.
Трансцитоз, включающий рецептор-опосредованный транспорт композиций через гематоэнцефалический барьер, также может быть применим для агентов по изобретению. Доставка, опосредованная рецептором трансферрина, раскрывается в патентах США 5672683; 5383988; 5527527; 5977307 и 6015555.
Также известен трансферрин-опосредованный транспорт. P. M. Friden et al., Pharmacol. Exp. Ther. 278,
1491-98 (1996); H. J. Lee, J. Pharmacol. Exp. Ther. 292, 1048-52 (2000). Доставка, опосредованная EGF рецептором, раскрывается в Y. Deguchi et al., Bioconjug. Chem. 10, 32-37 (1999), a трансцитоз описан в A.
Cerletti et al., J. Drug Target. 8, 435-46 (2000). В качестве носителей для доставки через гематоэнцефалический барьер также применяли фрагменты инсулина. М. Fukuta et al., Pharm. Res. 11, 1681-88 (1994).
Также описана доставка агентов с помощью конъюгата нейтрального авидина и катионного человеческого альбумина. Y.S. Kang et al., Pharm. Res. 1, 1257-64 (1994).
Для повышения пенетрации агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер можно
осуществить другие модификации, используя методы и производные известные в уровне техники. Например, патент США 6024977 раскрывает ковалентные полярные липидные конъюгаты для нацеливания
на мозг и центральную нервную систему. Патент США 5017566 раскрывает производные циклодекстрина, содержащие комплексы включения липоидных форм окислительно-восстановительных (редокс) нацеленных (нацеливающих) частиц дигидропиридина. Патент США 5023252 раскрывает применение
фармацевтических композиций, содержащих нейрологически активное лекарственное вещество и соеди- 34 -
019334
нение, облегчающее транспорт лекарственного вещества через гематоэнцефалический барьер, включая
макроциклический сложный эфир, сложный диэфир, амид, диамид, амидин, диамидин, тиоэфир, дитиоэфир, тиоамид, кетон или лактон. Патент США 5024998 раскрывает растворы нерастворимых в воде лекарственных веществ с производными циклодекстрина для парентерального применения. Патент США
5039794 раскрывает применение фактора выхода метастатических опухолей для облегчения транспорта
соединений через гематоэнцефалический барьер. Патент США 5112863 раскрывает применение N- ациламино производных кислот в качестве антипсихотических лекарственных веществ для доставки через
гематоэнцефалический барьер. Патент США 5124146 раскрывает способ для доставки терапевтических
агентов через гематоэнцефалический барьер местах повышенной проницаемости, обусловленных поражениями мозга. Патент США 5153179 раскрывает ацилированный глицерин и производные для применения в лекарственном препарате для повышенной пенетрации через клеточные мембраны. Патент США
5177064 раскрывает применение липоидных фосфонатных производных нуклеозидных антивирусных
агентов для доставки через гематоэнцефалический барьер. Патент США 5254342 раскрывает рецепторопосредованный трансцитоз через гематоэнцефалический барьер с применением рецептора транферрина
в сочетании с фармацевтическими соединениями, которые интенсифицируют или ускоряют этот процесс. Патент США раскрывает лечение эпилепсии имидатами противосудорожного сульфамата. Патент
США 5270312 раскрывает замещённые пиперазины в качестве агентов для центральной нервной системы. Патент США 5284876 раскрывает конъюгаты лекарственных веществ на основе допамина с жирными кислотами. Патент США 5389623 раскрывает применение липидных дигидропиридиновых производных противовоспалительных стероидов или стероидных половых гормонов для доставки через гематоэнцефалический барьер. Патент США 5405834 раскрывает пролекарства - производные тиреотропин- высвобождающего гормона. Патент США 5413996 раскрывает конъюгаты ацилоксиалкилфосфонатов с
нейрологически активными лекарственными веществами для анионной изоляции таких лекарственных
веществ в ткани мозга. Патент США 5434137 раскрывает способы селективного открытия аномальных
капилляров мозга, применяя инфузию брадикинина в каротидную артерию. Патент США 5442043 раскрывает пептидный конъюгат, а именно, конъюгат пептида с биологической активностью, не способного
проникать через гематоэнцефалический барьер, и пептида, не проявляющего биологическую активность,
но способного проходить через гематоэнцефалический барьер за счёт рецептор- опосредованного эндоцитоза. Патент США 5466683 раскрывает водорастворимые аналоги противосудорожного соединения
для лечения эпилепсии. Патент США 5525727 раскрывает композиции для раздельного всасывания и
удерживания в ткани мозга, представляющие собой конъюгат наркотических аналгетиков и их агонистов
и антагонистов с липидной формой дигидропиридина, который образует редокс соль при всасывании
через гематоэнцефалический барьер, что препятствует раздельному возвращению обратно в системный
кровоток.
Оксид азота является сосудорасширяющим фактором периферической сосудистой сети в нормальной ткани организма. Увеличение образования оксида азота под действием синтазы оксида азота вызывает вазодилатацию, не уменьшая давление крови. Увеличение тока крови через мозг, независимое от
давления крови, повышает церебральную биодоступность образуемых в крови композиций. Это увеличение количества оксида азота можно стимулировать, вводя L-аргинин. По мере увеличения количества
оксида азота церебральный кровоток соответственно увеличивается и лекарственные вещества в токе
крови уносятся увеличенным током в ткани мозга. Следовательно, L-аргинин можно применять в фармацевтических композициях по изобретению для увеличения доставки агентов в ткани мозга после введения фармацевтической композиции в ток крови субъекта практически одновременно с увеличивающим
кровоток количеством L-аргинина, как описано в Международной заявке WO 00/56328.
Другие примеры модификаций, которые повышают пенетрацию через гематоэнцефалический барьер, описаны в опубликованной Международной (РСТ) заявке WO 85/02342, которая раскрывает композицию лекарственного вещества, содержащую глицеролипид или его производное. Опубликованная заявка РСТ WO 089/11299 раскрывает химический конъюгат антитела с ферментом, который доставляется
конкретно к месту поражения мозга для активации вводимого отдельно нейрологически активного пролекарства. Опубликованная заявка РСТ WO 91/04014 раскрывает способы доставки терапевтических и
диагностических агентов через гематоэнцефалический барьер инкапсулированием лекарственных веществ в липосомы, нацеленные на ткань мозга, с применением транспорт-специфичных рецепторных
лигандов или антител. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 91/04745 раскрывает перенос
(транспорт) через гематоэнцефалический барьер с помощью молекул адгезии клеточной поверхности и
их фрагментов для повышения проницаемости при тесном контакте с эндотелием сосудов. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 91/14438 раскрывает применение модифицированного химерного моноклонального антитела для облегчения транспорта веществ через гематоэнцефалический барьер.
Опубликованная Международная заявка РСТ WO 94/01131 раскрывает "липидоизированные" белки,
включая антитела. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 94/03424 раскрывает применение
производных аминокислот в качестве конъюгатов с лекарственными веществами для облегчения транспорта через гематоэнцефалический барьер. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 94/06450
раскрывает конъюгаты нейрологически активных лекарственных веществ с нацеленной редокс-частицей
- 35 -
019334
типа дигидропиридина и содержащие аминокислотную связь и алифатический остаток. Опубликованная
Международная заявка РСТ WO 94/02178 раскрывает нацеленные на антитела липосомы для доставки
через гематоэнцефалический барьер. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 95/07092 раскрывает применение конъюгатов лекарственное вещество- фактор роста для доставки лекарственных веществ через гематоэнцефалический барьер. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 96/00537
раскрывает полимерные микросферы в качестве инъецируемых частиц лекарственное вещество- носители для доставки с целью доставки биоактивных агентов к сайтам (местам) в центральной нервной системе. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 96/04001 раскрывает омега-3-конъюгаты жирных
кислот с нейрологически активными лекарственными веществами для доставки через гематоэнцефалический барьер. Опубликованная Международная заявка РСТ WO 96/22303 раскрывает конъюгаты жирной
кислоты и глицеролипида нейрологически активными лекарственными веществами для доставки через
гематоэнцефалический барьер.
Обычно рядовой специалист в данной области техники может легко получить сложный эфир, амид
или гидразид агента по изобретению, например, из соответствующей карбоновой кислоты и подходящего реагента. Например, соединение, содержащее карбоксильную группу или её реакционноспособный
эквивалент, может реагировать с гидроксилсодержащим соединением или его реакционноспособным
эквивалентом таким образом, чтобы получился соответствующий сложный эфир. См., например, "Comprehensive Organic Transformations", 2nd Ed., by R.C. Larock, VCH Publishers John Wiley & Sons, Ltd.
(1989); "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., by M.B. Smith and J. March, John Wiley & Sons, Ltd.
(2000).
Фармацевтически приемлемые соли
Некоторые варианты агентов по настоящему изобретению могут содержать основную функциональную группу, такую как амино или алкиламино, и, следовательно, они способны образовывать фармацевтически приемлемые соли с фармацевтически приемлемыми кислотами. В этом случае термин
"фармацевтически приемлемые соли" относится к относительно нетоксическим солям присоединения
неорганических и органических кислот к агентам по настоящему изобретению. Эти соли можно получать
in situ в процессе окончательного выделения и очистки агентов по изобретению, или при отдельной реакции очищенного агента по изобретению в форме свободного основания с подходящей органической
или неорганической кислотой, выделяя образующуюся при этом соль.
Типичные соли включают гидрогалогениды (включая гидробромид и гидрохлорид), сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, валераты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бензоаты, лактаты, фосфаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, нафтилаты, мезилаты,
глюкогептонаты, 2- гидроксиэтансульфонаты и лаурилсульфонаты и т.п. См., например, Berge et al.,
"Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66, 1-19(1977).
В других случаях агенты по настоящему могут содержать одну или более кислых функциональных
групп и, следовательно, способны образовывать фармацевтически приемлемые соли с фармацевтически
приемлемыми основаниями. Термин "фармацевтически приемлемые соли" в этих примерах относится к
относительно нетоксическим солям присоединения неорганических и органических оснований к агентам
по настоящему изобретению.
Эти соли можно также получать in situ в процессе окончательного выделения и очистки агентов по
изобретению, или при отдельной реакции очищенного агента по изобретению в форме свободной кислоты с подходящим основанием, таким как гидроксид, карбонат или бикарбонат фармацевтически приемлемого катиона металла, с аммиаком, или с фармацевтически приемлемым органическим первичным,
вторичным или третичным амином. Типичные соли щелочных или щелочно-земельных металлов включают соли лития, натрия, калия, кальция, магния и алюминия. Типичные органические амины, пригодные для образования солей присоединения оснований, включают этиламин, диэтиламин, этилендиамин,
этаноламин, диэтаноламин, пиперазин и т.п.
"Фармацевтически приемлемые соли" включают также, например, производные агентов, модифицированных с помощью получения из них кислых и основных солей, как подробнее описано ниже и в
другом месте в данной заявке. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают соли минеральных и органических кислот с основными остатками, таким как аминогруппы; и органические соли щелочей с кислыми остатками, такими как карбоксильные группы. Фармацевтически приемлемые соли включают обычные нетоксические соли или соли четвертичных аммониевых оснований исходных агентов,
полученные, например, при действии неорганических или органических кислот. Такие обычные нетоксические соли включают соли, полученные при действии неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, сульфаминовая, фосфорная и азотная кислота; и соли, полученные при действии органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, пальмовая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глутаминовая, бензойная, салициловая, сульфанилиновая, 2-ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая и изетионовая кислота.
Фармацевтически приемлемые соли можно синтезировать обычными химическими методами из исходного агента, который содержит основную и кислую группы. Обычно такие соли можно получать по ре- 36 -
019334
акции этих агентов в форме свободной кислоты или свободного основания со стехиометрическим количеством подходящего основания или подходящей кислоты в воде или в органическом растворителе или в
их смеси.
Все кислые, солевые, основные или другие ионные и неионные формы описанных соединений
включаются в качестве соединений по данному изобретению. Например, если соединение в данном соединении представлено в виде кислоты, солевые формы соединения также охватываются. Аналогично,
если соединение показано в виде соли, также охватываются кислая и/или основная формы.
Специалисты в данной области техники знают или смогут определить с помощью лишь обычных
экспериментов, многочисленные эквиваленты конкретных методик, вариантов изобретения, пунктов
Формулы изобретения и примеров по данному описанию. Считается, что такие эквиваленты входят в
объём данного изобретения и охватываются прилагаемой формулой изобретения. Содержание всех ссылок, выданных патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных в данной публикации, и,
тем самым, вводимых ссылкой в данное описание. Изобретение дополнительно иллюстрируются следующими примерами, которые не следует рассматривать как дополнительное ограничение.
Примеры
Анализ связывания и антифибриллогенный анализ
Тестируемые соединения синтезируют и подвергают скринингу масс-спектрометрией ("MS"), за исключением выбранных соединений, которые получают промышленно. MS анализом получают данные о
способности соединений связываться с белками, в данном случае с β-амилоидом и IAPP.
В MS анализе на Аβ40 образцы готовят в водных растворах (добавляя 20% этанол, если необходимо
солюбилизировать в воде), 200 мкМ тестируемого соединения и 20 мкМ солюбилизированного Аβ40,
или 400 мкМ тестируемого соединения и 40 мкМ солюбилизированного Аβ40. рН каждого образца доводят до 7.4 (±0.2), добавляя 0,1% водный раствор гидроксида натрия. Затем растворы анализируют массспектрометрией с ионизацией электрораспылением на масс-спектрометре Waters ZQ 4000. Образцы непосредственно вводят (вливают) при скорости потока 25 мкл/мин в течение 2 ч после приготовления образца. Температуру в датчике поддерживают при 70°С, а напряжение конуса 20 В во всех анализах. Данные получают, используя программу Masslynx 3.5. Методом масс-спектрометрии получают данные о
способности соединений связываться с растворимым Ар, тогда как анализы ThT, EM и CD позволяют
получают данные об ингибировании фибриллогенеза
Анализ на IAPP проводят в тех же условиях, за исключением того, что используют 200 мкМ тестируемого соединения и 20 мкМ солюбилизированного IAPP.
Эффект кратковременного лечения у взрослых трансгенных CNRD 8, сверхэкспрессирующих
βAPP
У трансгенных мышей, TgCRND8, экспрессирующих человеческий амилоидный белокпредшественник (hAPP), развивается патология, напоминающая болезнь Альцгеймера. В частности, высокие уровни Аβ40 и Аβ42 получены в плазме и мозгу этих 8-9-недельных животных с последующей
ранней аккумуляцией амилоидных бляшек, аналогичных сенильным бляшкам, наблюдающимся у больных AD. У этих животных также проявляется прогрессирующая когнитивная недостаточность, соответствующая проявлению дегенеративных изменений. См., например, (Chishti, et al., J. Biol. Chem. 276,
21562-70(2001)).
Изучают терапевтический эффект кратковременного действия 19 соединений по изобретению, как
описано далее. Соединения вводят в течение 14- или 28-дневного периода, в конце каждого из них определяют уровни Аβ пептидов в плазме и мозгу TgCRND8 животных.
Способы
В данном примере используют самок и самцов трансгенных мышей B6C3F1 3его и 4ого поколений,
им ежедневно вводят подкожно или дают перорально одно из трех серий соединений в течение 14-28
дней. В настоящем протоколе используются следующие сокращения для обозначения этих животных 3его
и 4ого поколений обратного скрещивания: TgCRND8- 2.B6C3F1(N3); TgCRND8- 2.B6C3F1(N4).
Группа контрольных животных (Группа 1) состоит из нативных TgCRND8-2.B6C3F1(N3) в возрасте
11±1 недель. Этих мышей используют для определения уровней Аβ в плазме и мозгу ранее не обрабатывавшихся животных в начале лечения.
Начиная с 11-недельного возраста (±1 неделя) животные получают ежедневно соответствующее лечение в течение 14 или 18 дней (группы 2- 21) в дозе 250 мг/кг при 10 мл/кг, или только носитель (вода;
группа 2), или только 1% метилцеллюлозу (группа 21). Способ введения является подкожным для водорастворимых соединений и оральным для соединений, солюбилизированных в 1% метилцеллюлозе (МС
1%). В конце периода лечения плазму и мозг после перфузии собирают для количественного определения уровней Аβ.
- 37 -
019334
Таблица 4. Тест-система
Мыши, используемые в исследовании, берутся из колонии, разводимой в Institut Armand Frappier, и
перед началом исследования их акклиматизируют к окружающей среде.
Мониторинг здоровья животных
Всех животных ежедневно проверяют на признаки болезненности, когда утром дают ежедневную
дозу, и дважды в день проверяют контроль смертности (один раз в день в течение уик-эндов и праздников). Подробное обследование проводят в начале лечения, ежедневно в течение курса исследования и
один раз перед последними процедурами. При необходимости обследование проводят чаще. Отдельно
регистрируют смерть и все индивидуальные клинические признаки. Индивидуальный вес тела регистрируют при рандомизации, один раз в неделю в течение исследования и один раз перед последними процедурами.
Отбор образцов
В контрольной группе, возраст 11±1 недель, и в конце периода лечения (14 или 28 дней) в группах
2-21 через 24 ч после последнего введения соединения животных умерщвляют и собирают пробы. Собирают примерно 500 мкл крови из орбитального синуса и хранят на льду до момента центрифугирования,
центрифугируют при 4°С при минимальной скорости 3000 об./мин в течение 10 мин. Образцы плазмы
сразу же замораживают и вплоть до анализа хранят при -80°С. Мозг удаляют, замораживают и вплоть до
анализа хранят при -80°С.
Измерение уровней Aβ
β
Мозг взвешивают в замороженном состоянии и гомогенизируют с 4 объёмами ледяного буфера 50
мМ Tris-Cl рН 8.0 с коктейлем ингибиторов протеаз (4 мл буфера на 1 г влажного мозга). Образцы центрифугируют при 15000g в течение 20 мин и супернатанты переносят в новые пробирки. Сто пятьдесят
(150) мкл каждого супернатанта смешивают с 250 мкл 8 М гуанидин-HCl/50 мМ Tris-Cl рН 8.0 (в соотношении 0.6 объёмов супернатанта: 1 объём 8 М гуанидин/50 мМ Tris-Cl рН 8.0) и прибавляют 400 мкл 5
М гуанидин/50 мМ Tris-Cl pH 8.0. Пробирки встряхивают в течение 30 с и замораживают при -80°С. Параллельно осадок (пеллеты) обрабатывают 7 объёмами 5 М гуанидин/50 мМ Tris-Cl pH 8.0 (7 мл гуанидина на 1 г влажного мозга), встряхивают 30 с и замораживают при -80°С. Образцы размораживают при
комнатной температуре, разрушают ультразвуком при 80°С в течение 15 мин и снова замораживают.
Этот цикл повторяют 3 раза, чтобы гарантировать гомогенность, и образцы снова охлаждают до -80°С и
хранят при этой температуре вплоть до анализа.
Уровни Аβ в образцах плазмы и мозга определяют методом ELISA, используя наборы человеческого Аβ40 и Аβ42 Fluorometric ELISA от Biosource (Cat. No. 89-344 и 89-348) в соответствии с рекомендациями производителя. Коротко говоря, образцы размораживают при комнатной температуре, действуют
ультразвуком в течение 5 мин при 80°С (разрушают ультразвуком гомогенаты мозга, но не образцы
плазмы) и хранят на льду. Аβ пептиды наносят на планшет, используя 100 мкл разведённого образца, и
инкубируют, не встряхивая, инкубируют при 4°С в течение ночи. Образцы (жидкость) отсасывают (аспирация) и лунки 4 раза отмывают водным буфером из набора Biosource ELISA. Добавляют поликлональную кроличью антисыворотку к Аβ40 или Аβ42 (специфичную в отношении Аβ40 или Аβ42 пептида) (100 мкл) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч при встряхивании. Жидкость из лунок отсасывают и лунки 4 раза отмывают, добавляют 100 мкл антитела к кроличьему иммуноглобулину, меченому щелочной фосфатазой, и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч
при встряхивании. Затем плашки отмывают 5 раз и в плашку добавляют флуоресцентный субстрат (100
- 38 -
019334
мкл). Планшет инкубируют в течение 35 мин при комнатной температуре и планшет считывают на фотометре для микротитровальных планшетов (ридере) при длине волны возбуждения 460 нм и излучения
560 нм.
Соединения оценивают на основании их способности модулировать уровни Аβ пептидов в плазме и
уровни церебрального растворимого/нерастворимого Аβ в мозге. Уровни Аβ, наблюдаемые в плазме и
мозге пролеченных животных, нормализуют по значениям, полученным в контрольных группах, получавших носитель (воду) или метилцеллюлозу, и располагают в ряд в соответствии с интенсивностью
фармакологического действия (эффекта).
Действие продолжительного лечения на взрослых трансгенных мышей CRND 8,
сверхэкспрессирующих β APP
Трансгенные мыши, TgCRND8, те, которых используют при кратковременном лечении, сверхэкспрессируют человеческий АРР ген со шведской мутацией или мутацией Индиана, что приводит к образованию высоких уровней амилоидных пептидов и к развитию раннего активно прогрессирующего амилоидоза мозга. Полагают, что высокие уровни Аβ пептидов и относительный избыток Аβ42 по сравнению
с Аβ40 связаны с наблюдаемой тяжёлой и ранней дегенеративной патологией. Характер амилоидного
отложения, присутствие дистрофических нейритов и когнитивная недостаточность в этой линии трансгенных мышей хорошо изучены и описаны. Уровни Аβ пептидов в мозге этих мышей с возрастом резко
увеличивается. В ходе исследования тотальные уровни амилоидных пептидов увеличиваются от ∼ 1.6 ×
105 пг/г мозга до ∼ 3.8 × 106 за время от 9 до 17 недель.
В то время как раннее отложение амилоида в этой модели позволяет быстро тестировать соединения в относительно коротких временных рамках, активность (агрессивность) этой модели и высокие
уровни Аβ пептида делают терапевтическую оценку в более длительном эксперименте более трудной
задачей.
Изучают продолжительное терапевтическое действие соединений по настоящему изобретению на
церебральное амилоидное отложение и уровни β-амилоида (Аβ) в плазме и мозге трансгенных мышей,
TgCRND8, экспрессирующих человеческий амилоидный белок-предшественник (hAPP), как описано
ниже. Соединения вводят в течение 8 или 16 недельного периода, по окончании которого определяют
уровни Аβ пептидов в плазме и мозге TgCRND8 животных. Целью этого исследования является оценка
эффективности соединений при модулировании прогрессирования амилоидогенного процесса в мозге и в
плазме трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера (AD).
Способы
Мыши, используемые в исследовании, состоят из животных, несущих одну копию hAPP гена (+/-)
от 2ого и 3его поколений от прародителей (N2 и N3), полученных путём обратного скрещивания от
TgCRND8.FVB(N2)AJ(N3) с B6AF/J гибридных животных.
N1 = TgCRND8.FVB(N2)AJ(N3) × B6AF/J
N2 = TgCRND8.FVB(N2)AJ(N3).B6AF/J(N1) × B6AF/J
N3 = TgCRND8.FVB(N2)AJ(N3). B6AF/J(N2) × B6AF/J
Для обозначения этих животных в настоящем исследовании применяются следующие сокращения:
TgCRND8.B6AF/J(N2); TgCRND8.B6AF/J(N3).
Самцам и самкам трансгенных мышей ежедневно вводят подкожно (соединение ВХ) или дают перорально (соединения BW и BZ) соответствующие соединения в течение 8 или 16 недель.
Исходные (базовые) животные представляют собой 9±1-недельных, не лечившихся ранее
TgCRND8.B6AF/J животных 2ого и 3его поколений. Этих мышей используют для определения степени
(величины) церебральных амилоидных отложений и уровней Аβ в плазме и мозге не лечившихся ранее
трансгенных животных в начале лечения.
Начиная с 9-недельного возраста (±1 неделя) животные получают ежедневно соответствующее лечение в течение 8 или 16 недель в дозе 30 или 100 мг/кг при 10 мл/кг. Способ введения является подкожным для водорастворимых соединений (Соединение ВХ) и оральным для соединений, солюбилизированных в 1% метилцеллюлозе (МС 1%) (Соединения BW и BZ). В конце периода лечения плазму и мозг после перфузии собирают для количественного определения уровней Аβ.
Состояние здоровья животных контролируют, образцы собирают и определяют уровни Аβ как описано выше при описании исследования кратковременного лечения. Соединения оценивают на основании
их способности модулировать уровни Аβ пептидов в плазме и уровни церебрального растворимого/нерастворимого Аβ в мозге. Уровни Аβ, наблюдаемые в плазме и мозге пролеченных животных, сравнивают с уровнями, полученными в контрольных группах, получавших носитель (воду) или метилцеллюлозу, и располагают в ряд в соответствии с интенсивностью фармакологического действия (эффекта).
Настоящее изобретение также относится к новым соединениям и их синтезу. Поэтому ниже представлены следующие примеры для иллюстрации получения некоторых из этих соединений.
- 39 -
019334
Синтез соединений по изобретению
Получение изобутилового эфира L-(N-Boc)-Phe-L-Phe-гомотаурина
Компонент 1: L-(N-Boc) Phe-L-Phe
К охлаждённому (0°С) раствору ди-L-Phe-Phe (1 г, 3.20 ммоль) в 1,4-диоксане (6 мл) и 1 N NaOH
(3,3 мл) прибавляют раствор (Вос)2О (800 мг, 3,5 ммоль) в 1,4-диоксане (5 мл). Смесь перемешивают при
0-5°С в течение 2 ч. Прибавляют новую порцию (Вос)2О (100 мг) и смесь перемешивают ещё в течение
60 мин при 0-5°С, а затем в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь упаривают досуха.
Растворяют остаток в смеси вода/EtOAc и, прибавляя 2N HCl, доводят рН до 2. Водный слой 3 раза экстрагируют EtOAc. Объединённые органические вытяжки сушат рассолом и растворитель упаривают.
Часть твёрдого вещества, не растворяющуюся в смеси EtOAc/CHCl3, отфильтровывают. Нужный L-(NBoc)-Phe-L-Phe 1 получают в виде белой пены (выход 913,7 мг, 2,215 ммоль, 71%).
Компонент 2: изобутиловый эфир 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты
Стадия 1: Натриевая соль 3-азидо-1-пропансульфоновой кислоты (5)
К смеси азида натрия (3,22 г, 49,1 ммоль) в растворителе вода/ацетон (70 мл, 20 к 50) прибавляют
раствор 1,3- пропансультона 4 (6,12 г, 49,1 ммоль) в ацетоне (30 мл). Прозрачный раствор перемешивают
при комнатной температуре. Реакция заканчивается через 1 ч. Растворитель упаривают в вакууме. Твёрдый остаток промывают горячим эфиром (50 мл), а затем эфиром при комнатной температуре (150 мл).
Сушат в вакуум-шкафу при 40°С в течение ночи. Титульное соединение 5 получают в виде твёрдого вещества белого цвета (выход 8,69 г, 46,4 ммоль, 95%).
Стадия 2: 3-азидо-1-пропансульфонилхлорид
Натриевую соль 3-азидо-1-пропансульфоновой кислоты 5 (1,87 г, 10,0 ммоль) суспендируют в сухом бензоле (20 мл) и к суспензии прибавляют PCl5 (2,3 г, 10,5 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, затем в течение 1 ч нагревают при слабом кипении. Бензол и
P(O)Cl3 упаривают в вакууме. К сырой смеси прибавляют бензол и растворитель снова отгоняют в вакууме. Остаток сушат в вакууме. Высушенный остаток растворяют в хлористом метилене (безводный, 15
мл) и охлаждают до -10°С на бане лёд/ацетон.
Стадия 3: 3-азидо-1-пропансульфоновая кислота
К охлаждённому раствору сульфонилхлорида медленно прибавляют раствор изобутанола (1,00 мл,
10,8 ммоль) и 2,6-лутидина (1,3 мл, 11,2 ммоль) в хлористом метилене (10 мл). Смесь перемешивают при
-10°С в течение 5 мин, затем при комнатной температуре в течение 2 ч. К реакционной смеси прибавляют воду (для прекращения реакции), а затем хлористый метилен для экстракции продукта. Органический
слой промывают один раз водой, насыщенным водным раствором NaHCO3, рассолом, а затем сушат
сульфатом магния. Растворитель упаривают в слабом вакууме, а остаток сушат в вакууме. Оставшийся
2,6-лутидина гидрохлорид удаляют, промывая остаток эфиром. Полученное масло (1,78 г) переносят на
колонку для флеш-хроматографии (силикагель, EtOAc в смеси гексанов от 15 до 20%), получают заданный сложный эфир в виде масла (790 мг, 35%).
Стадия 4: изобутиловый эфир 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты
К суспензии Pd/C (10%, 200 мг) в изобутаноле (4 мл), насыщенном Н2, в атмосфере H2 через полую
- 40 -
019334
иглу вводят раствор изобутил-3-азидопропансульфоната (1,13 г, 5,11 ммоль). Затем смесь перемешивают
в атмосфере Н2 (40 psi, 275,79 кПа) при комнатной температуре в течение ночи. Осадок отфильтровывают. Фильтрат упаривают досуха. Остаток сушат в вакууме. Титульное соединение 2, изобутиловый эфир
гомотаурина, получают в виде коричневого масла (808,7 мг, 81%).
Реакция компонента 1 с компонентом 2
К охлаждённому (0-5°С) раствору N-Boc-L-Phe-L-Phe 1 (913,7, 2,215 ммоль) и изобутилового эфира
гомотаурина 2 (423 мг, 2.21 ммоль) в хлористом метилене (безводный, 30 мл) прибавляют НОВТ (340 мг,
2.215
ммоль).
Через
5
мин
по
каплям
прибавляют
раствор
1-циклогексил-3-(2морфолиноэтил)карбодиимид мето-патолуолсульфоната (982 мг, 2.215 ммоль) в хлористом метилене (10
мл). Раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. К смеси прибавляют хлористый
метилен (50 мл) и органический слой последовательно промывают 1 N NaHSO4, насыщенным водным
раствором NaHCO3 и рассолом и сушат сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме. ТСХ показывает присутствие трёх веществ. Так как примеси менее растворимы в метаноле, повторной обработкой метанолом с последующим фильтрованием удаляют основную часть примесей. Колоночной хроматографией на силикагеле (2% МеОН в CHCl3) получают трипептид 3 в виде янтарного стекловидного
твёрдого вещества (156,1 мг, 12%).
Получение изобутилового эфира L-Phe-L-Phe-гомотаурина
К охлаждённому (0°С) раствору изобутилового эфира N-Boc-L-Phe-L-Phe-гомотаурина (202 мг,
0,343 ммоль) в метаноле прибавляют концентрированную HCl (0,7 ммоль), смесь перемешивают при
комнатной температуре в течение 2 ч, а затем оставляют на ночь в холодильнике. Растворитель упаривают в вакууме, твёрдый остаток сушат в вакууме, получают изобутиловый эфир L-Phe-L-Phe-гомотаурина
в виде твёрдого вещества белого цвета (171,8 мг, 95%).
Получение этилового эфира N-Вос-L-Phe-(3-аминопропан-1-сульфонил)-L-Phe (Соединение Y)
К охлаждённому (0°С) раствору 3-аминопропан-1-сульфонил-L-Phe-OEt (2.66 ммоль, 839 мг) в хлористом метилене (10 мл) прибавляют раствор N-трет-BOC-L-Phe N-гидроксисукцинимидоэфира (280
ммоль, 1,01 г) в хлористом метилене (12 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Прибавляют хлористый метилен и промывают 2N HCl, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Органический слой сушат сульфатом магния и растворитель удаляют в вакууме. Остаток наносят на колонку для флеш- хроматографии с силикагелем (2% МеОН в CHCl3). Выделяют порцию
чистого требуемого вещества (600 мг). Остальной продукт смешивают с 40% сукцинимида. К растворённой в хлористом метилене (8 мл) и охлаждённой до 0°С смеси добавляют немного 3-аминопропанола (70
мкл). Смесь перемешивают 1 ч при комнатной температуре. Прибавляют хлористый метилен и промывают 2N HCl, насыщенным водным раствором NaHCO3 и рассолом. Органический слой сушат сульфатом
магния и растворитель удаляют в вакууме. Продукт очищают колоночной флеш-хроматографией на силикагеле (2% МеОН в CHCl3). Выделяют ещё одну порцию чистого требуемого вещества (432,4 мг) наряду с аддуктом сукцинимида и 3-аминопропанола (220,6 мг, 0,684 ммоль). Соединение Y получают в
виде белой кристаллической пены (1030 мг, 1,83 ммоля, 65%). 1Н и 13С ЯМР спектры соответствуют
структуре.
Получение этилового эфира L-Phe-(3-аминопропан-1-сульфонил)-L-Phe (Соединение Z)
К охлаждённому (0°С) раствору этилового эфира N-Boc-L-Phe-(3-аминопропан-1-сульфонил)-L-Phe
(197 мг, 0,350 ммоль) в этаноле (8 мл) прибавляют концентрированную HCl (0,8 мл). Смесь охлаждают в
бане лёд/вода и перемешивают в течение 45 мин, а затем 3 ч при комнатной температуре. В течение уикэнда (сб., вскр.) смесь хранят в морозильнике (-20°С). Растворитель отгоняют в вакууме. Остаток этанола удаляют трёхкратным совместным упариванием в вакууме с хлороформом. Остаток сушат в вакууме,
получают кристаллы не чисто-белого цвета (175,3 мг) с количественным выходом. 1Н и 13С ЯМР спектры
соответствуют структуре соединения Z.
- 41 -
019334
Получение натриевой соли L-(N-Вос)-Phe-(3-аминопропан-1-сульфонил)-L- Phe (Соединение АА)
К раствору этилового эфира L-(N-Вос)-Phe-(3-аминопропан-1-сульфонил)-L-Phe (110 мг, 0,197
ммоль) в метаноле (2 мл)1 прибавляют один эквивалент 1N NaOH (202 мкл). Смесь перемешивают при
комнатной температуре в течение ночи. Образуется белая суспензия. Прибавляют МеОН (1 мл), воду (1
мл) и 1N NaOH (10 мкл). Смесь перемешивают на тёплой водяной бане около 2 ч. Метанол отгоняют в
вакууме. Влажный остаток лиофилизируют, получают соединение АА в виде белого порошка с количественным выходом (110,2 г). 1Н и 13С ЯМР спектры соответствуют структуре.
Получение метилового эфира L-Phe-(3-аминопропан-1-сульфонил)-L-Phe (Соединение АВ)
Гидролиз проводят обычным методом с применением LiOH/MeOH. Продукт очищают перекристаллизацией из EtOAc и смеси гексанов.
L-Phe-(3-аминопропан-1-сульфонил)-L-Phe-ОН (203 мг, 0,382 ммоля) растворяют в метаноле (4 мл)
и раствор охлаждают до 0°С. Прибавляют концентрированную HCl (0,35 мл) и смесь перемешивают в
течение 2 ч при 0°С и в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Летучие отгоняют в вакууме. Водный
остаток лиофилизируют, получают продукт в виде твёрдого вещества белого цвета (171,4 мг). Спектры
ЯМР и MS показывают, что продукт является смесью свободной кислоты и метилового эфира. Массспектр также показывает сильную ассоциацию пептида. Пик димера в масс-спектре является основным.
Твёрдый продукт растворяют в метаноле и выдерживают с HCl при комнатной температуре в течение
ночи. Растворитель упаривают и остаток сушат в вакууме. Продукт получают в виде белого пенистого
твёрдого вещества (180,4 мг, 97%). 1Н и 13С ЯМР спектры соответствуют структуре соединения АВ.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение формулы V
где
А обозначает азот или кислород;
R11 обозначает водород, группу, образующую сложный С1-С6алкиловый эфир, -(CH2)x-Q или, если
А обозначает азот, то А и R11 вместе образуют остаток природной или неприродной аминокислоты или
её метиловый или этиловый сложный эфир;
Q обозначает водород, тиазолил, триазолил, имидазолил, бензотиазолил или бензимидазолил;
х равно 0, 1, 2, 3 или 4;
n равно 3 или 4;
аа обозначает остаток природной или неприродной аминокислоты, присоединенный через его карбонильную группу, причем указанный остаток аминокислоты находится в L-конфигурации;
m равно 1, 2 или 3;
R14 обозначает водород или трет-бутилоксикарбонильную защитную группу;
R15 обозначает водород, незамещенный С1-С6алкил, С1-С6алкильную группу, замещенную
С6арилом, или С6арил,
и его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что n равно 3.
3. Соединение по п.1 или 2, отличающееся тем, что m равно 1 или 2.
4. Соединение по п.3, отличающееся тем, что m равно 1.
5. Соединение по п.3, отличающееся тем, что m равно 2.
6. Соединение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что A-R11 обозначает остаток фенилаланина, присоединенный по его аминогруппе.
7. Соединение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что А представляет собой кислород, a R11
представляет собой водород.
8. Соединение по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что аа обозначает остаток природной Lаминокислоты.
9. Соединение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что (аа)m обозначает остаток Lфенилаланина, L-глицина или L-Phe-L-Phe.
- 42 -
019334
10. Соединение по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что аа обозначает остаток неприродной Lаминокислоты.
11. Соединение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что R15 обозначает водород или C1С6алкил.
12. Соединение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что R15 обозначает С1-С6алкильную
группу, замещенную С6арилом.
13. Соединение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что R15 обозначает водород.
14. Соединение по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что R14 и R15 оба обозначают водород.
15. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно выбрано из группы, состоящей из
или его фармацевтически приемлемых солей.
16. Фармацевтическая композиция для ингибирования отложения β-амилоида, содержащая соединение по любому из пп.1-15 вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
17. Способ ингибирования отложения β-амилоида, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-15 субъекту, нуждающемуся в этом.
18. Способ лечения или предупреждения заболевания или состояния, выбранного из болезни Альцгеймера, легкого когнитивного расстройства, когнитивного расстройства от легкого до умеренного, возрастного ухудшения когнитивных функций, старческого слабоумия, сосудистого слабоумия, церебральной амилоидной ангиопатии, миозита телец включения, возрастной дегенерации желтого пятна или синдрома Дауна, где указанные болезнь Альцгеймера, легкое когнитивное расстройство, когнитивное расстройство от легкого до умеренного, возрастное ухудшение когнитивных функций, старческое слабоумие, сосудистое слабоумие, церебральная амилоидная ангиопатия, миозит телец включения, возрастная
дегенерация желтого пятна или синдром Дауна связаны с амилоидогенными белками или пептидами βамилоида, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения по любому из
пп.1-15 субъекту, нуждающемуся в этом.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанное заболевание или состояние выбрано из болезни Альцгеймера, легкого когнитивного расстройства, когнитивного расстройства от легкого до умеренного, возрастного ухудшения когнитивных функций и старческого слабоумия.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанное заболевание или состояние представляет собой болезнь Альцгеймера.
21. Применение соединения по любому из пп.1-15 для изготовления лекарственного средства для
ингибирования отложения β-амилоида.
22. Применение соединения по любому из пп.1-15 для изготовления лекарственного средства для
лечения или предупреждения заболевания или состояния, выбранного из болезни Альцгеймера, легкого
когнитивного расстройства, когнитивного расстройства от легкого до умеренного, возрастного ухудшения когнитивных функций, старческого слабоумия, сосудистого слабоумия, церебральной амилоидной
ангиопатии, миозита телец включения, возрастной дегенерации желтого пятна или синдрома Дауна, где
указанные болезнь Альцгеймера, легкое когнитивное расстройство, когнитивное расстройство от легкого
до умеренного, возрастное ухудшение когнитивных функций, старческое слабоумие, сосудистое слабоумие, церебральная амилоидная ангиопатия, миозит телец включения, возрастная дегенерация желтого
- 43 -
019334
пятна или синдром Дауна связаны с амилоидогенными белками или пептидами β-амилоида.
23. Применение по п.22, отличающееся тем, что указанное заболевание или состояние выбрано из
болезни Альцгеймера, легкого когнитивного расстройства, когнитивного расстройства от легкого до
умеренного, возрастного ухудшения когнитивных функций и старческого слабоумия.
24. Применение по п.23, отличающееся тем, что указанное заболевание представляет собой болезнь
Альцгеймера.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 44 -